Автореферат и диссертация по медицине (14.00.46) на тему:Диагностическое и прогностическое значение нарушений цитокинового статуса в развитии ангиопатий при сахарном диабете второго типа

На правах рукописи

НЕФЁД ВИКТОРИЯ ЛЕОНИДОВНА

ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ И ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ НАРУШЕНИЙ ЦИТОКИНОВОГО СТАТУСА В РАЗВИТИИ АНГИОПАТИЙ ПРИ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ ВТОРОГО ТИПА

14.00 46 - клиническая лабораторная диагностика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Саратов - 2008

003448715

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Наталия Борисовна Захарова

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Даниил Миронович Пучиньян

доктор медицинских наук, профессор Зураб Леванович Девдариани

Ведущая организация - Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Росздрава»

Защита состоится «/О 2008 г. в Часов на засе-

дании диссертационного совета Д 208 094.04 при ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава» по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Большая Казачья, д. 112.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава».

Автореферат разослан «

2008 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор

Бородулин В.Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Помимо высокой распространенности сахарный диабет (СД) яшме гея одно!} из частых причин инвалидизации и летальности, что обусловлено его сосудистыми осложнениями - микро- и макроангио-патиями (Дедов И И., 2000) Нарастание частоты данных осложнений СД, прежде всего при СД 2-го пша, связано с другой важной тенденцией - увеличением продолжительности жизни не только в развитых странах, но и в других регионах земного шара В связи с этим лечение больных СД с микро- и макроан-гиопатиями и ранняя диагностика этих осложнений приобретают медико-социальное значение

Установлено, что почти у 50% больных СД 2-го типа к моменту клинической манифестации заболевания имеются такие сосудистые осложнения, как диабетическая ретинопатия (ДР) и синдром диабетической стопы (СДС) (Дедов И И, Удовиченко О В., Галстян Г Р , 2005)

ДР становится основной причиной слепоты среди лиц трудоспособного возраста, до 80-90% всей инвалидности по зрению обусловлено СД 2-го типа (Дедов И И , Шестакова М В , 2003)

Распространенность язв стоп среди больных диабетом в развитых странах составляет приблизительно 4-10%, ежегодный прирост - 2,2-5,9% Каждый год 0,6-0,8% пациентов, страдающих СД, подвергаются ампутациям нижних конечностей на различных уровнях (Балаболкин М И, Клебанова Е М, Кремип-ская В М., 1999, Анциферов М Б., Галстян Г Р , Токмакова А Ю , 2001)

Вместе с тем, в исследованиях, посвященных изучению патогенеза ДР и СДС, практически не рассматривались вопросы участия иммунорегуляторных механизмов в развитии ангиопатий Раскрытие молекулярных механизмов, лежащих в основе нарушений межклеточного взаимодействия на уровне системы иммунорегуляции организма, может явиться основой для поиска новых путей патогенетического лечения ангиопатий при СД 2-го типа (Брискин Б С , Тарта-ковский Е.А, Гвоздев НА. и соавт, 1999, Гостшцев В К, Афанасьев АН, 2001)

В настоящее время к наиболее перспективным маркерам нарушения процессов иммунорегуляции при воспалительных заболеваниях относят шетогор-моны белковой природы - цитокииы (Гогина И Ф , 1991, Бунятян К Н, 2000, Каспарова Е А, 2002) Продукция цитокинов носит активационный характер и обеспечивает информационный обмен между клетками, вовлеченными в воспалительный процесс Особенность генеза цитокинемии при СД 2-го типа заключается в том, что у пациентов по мере развития заболевания нарастает количество клеточных структур с высокой продукцией цитокинов Исследование роли цитокинемии и нарушения баланса между про- и противовоспалительными цитокинами в процессе развития таких тяжелых осложнений СД 2-ш типа, как ДР и СДС, позволит получить дополнительные лабораторные критерии оценки

тяжести, характера течения, прогнозирования исходов заболевания, станет основой для поиска новых методик, более эффективных схем и подходов к лечению (Дедов И И , Шестакова М В., Максимова М А , 2002)

Цель исследования — установить диагностическое и прогностическое значение нарушений цигокинового статуса в развитии ангиопатий при сахарном диабете 2-го типа

Задачи исследования

1 Выявить изменения уровня цитокинов (ИЛ 10, ИЛ6, ИЛ4, ИЛ8, ФНОа, уИНФ) в сыворотке крови у больных СД 2-го типа на этапе формирования микро- и макроангиопатий

2 Установить последовательность изменения цигокинового и липидного составов сыворотки крови у больных СД 2-го типа на этапе формирования микро- и макроангиопатий

3 Установить взаимосвязи между изменениями продукции цитокинов мононуклеарами крови и нарушением цитокинового статуса сыворотки крови у больных СД 2-го типа на этапе формирования микро- и макроангиопатий

4 Показать диагностическое и прогностическое значение изменения уровня цитокинов крови у больных СД 2-го типа на этапе формирования микро- и макроангиопатий

5 Оценить влияние препаратов с антиоксидантным и антиапоптотиче-ским действием (берлитион и кортексин) на продукцию мононуклеарами цитокинов у больных СД 2-го типа на этапе формирования микро- и макроангиопатий

Научная повшна исследовании

Установлено, что у больных СД 2-го типа на этапе формирования ангиопатий повышенный уровень глюкозы, НвА1с, изменение липидного профиля сочетаются с подъемом содержания в сыворотке крови цитокинов, а также с активацией выработки ключевых провоспалительных цитокинов (ИЛ6,ФНОа,7ИИФ) моноцитами и лимфоцитами в процессе инкубации

Показано, что цитокиновый статус у больных СД 2-ш типа зависит от наличия микро- и макроангиопатий. при развитии ДР регистрируется умеренный подъем провоспалительных цитокинов, при возникновении СДС - выраженная цитокинемия

На основе оценки содержания провоспалительных цитокинов и их выделении мононуклеарами крови при ФГА - стимуляции выделены 3 стадии развития иммунного ответа организма у больных СД 2-го типа с микро- и макроангиопатиями

• 1-я стадия — нарастание содержания провоспалигелышх циюкинов,

• 2-я стадия — цшокинемия,

• 3-я стадия — снижение цитокшшродуцирующей способности клеток иммунной системы

Количественное содержание ключевых провоспалительных циокинов (ИЛ6, ФНОа, уИНФ) и способность мононуклеаров крови их вырабатывать отражают тяжесть аигиопатий и развитие системного воспалительного ответа

Практическая значимое!ь работы

У больных СД 2-го типа в процессе развития аигиопатий исследование цитокинового профиля сыворотки крови позволяет оценить степень нарушения иммунной регуляции и прогнозировать развитие системного воспалительного ответа в процессе лечения

Исследование цитокинового профиля сыворотки крови у больных СД 2-ш типа с анпюпатиями повышает эффективность ранней диагностики стадии недостаточности иммунорегуляторных систем организма и развития СВО. Предложено выделить стадии развития иммунной супрессии у больных СД 2-ш типа

• 1-я стадия — нарастание содержания провоспалительных цитокинов,

• 2-я стадия — цитокинемия,

• 3-я стадия -— снижение цитокшшродуцирующей способности клеток иммунной системы

Показано,что изменение цитокшшродуцирующей активности мононуклеаров при инкубации (in vitro) с введением ФГА и препаратов с антиок-сидантным и антиапоптотическим действием (берлитион и кортексин) позволяет оценить степень нарушения иммунорегуляторных процессов нарастание содержания цитокинов в инкубационной среде свидетельствует о включении мононуклеаров в формирование цитокинового провоспалительного сдвига, снижение их выработки характеризует развитие иммуносупрессии.

Доказана в эксперименте in vitro целесообразность назначения больным СД 2-го типа с ДР и СДС препаратов, обладающих антиоксидантным и антиапоптотическим действием (берлитион и кортексин) Данные препараты способствуют снижению выработки мононуклеарами крови провоспалительных цитокинов

Внедрение результатов исследования

Результаты исследований внедрены в работу 2-го хирургического отделения ММУ «2-я Городская больница имени В И Разумовского»; клиники глазных болезней ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава», в учебный про-

цесс кафедр клинической лабораторной диагностики и глазных болезней ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава

Апробация диссертации

Материалы диссертационной работы доложены на заседаниях кафедры клинической лабораторной диагностики ЦНИЛ ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава» (Саратов, 2006, 2007, 2008), на научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань-Волплрад-Москва, 2006), III Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы диагностики и лечения метаболического синдрома» (Москва, 2006), Всероссийской научно-практической конференции биохимиков и специалистов по лабораторной медицине, посвященной 20-летию Кировской государственной медицинской академии «Актуальные вопросы современной биохимии» (Киров, 2007)

Публикации

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 4 в журналах, рекомендованных ВАК для публикации результатов диссертационных исследований

Основные положения, выносимые на защиту

1 У больных СД 2-го типа с ДР формирование ангиопатий сопровождается подъемом содержания в сыворотке крови провосиалительных цитокинов (ИЛ6, ФНОа, уИНФ) и усилением цигокинпродуцирующей активности моно-нуклеаров крови

2 Увеличение содержания провоспалительных цитокинов у больных СД 2-го типа при ДР происходит одновременно с изменениями липидного состава и уровня СРБ сыворотки крови

3 У больных СД 2-го типа при СДС развивается цитокинемия, основой которой является нарастание содержания провоспалительных цитокинов (ИЛ6, ФНОа, уИНФ), в меньшей степени - противовоспалительных цитокинов (ИЛ4) и усиление цитокинсинтезирующей функции фракции моноиуклеаров крови.

4. Степень подъема содержания провоспалительных цитокинов сыворотки крови отражает тяжесть клинического течения ангиопатий при СД 2-го типа

5 Для оценки степени нарушения иммунорегуляторных систем организма у больных СД 2-го типа с микро- и макроангиопатиями необходимы количественное определение содержания ключевых провоспалительных ци-

токипов (ИЛ6, ФНОа, уИНФ) и исследование их выработки моиоиуклеарами крови

б Препараты с антиоксидантным и аптиапоптотическим действием (бер-лшион и кортексин) могут быть использованы для снижения активности по-цессов, приводящих к развитию провоспалителыюго цнтокинового сдвига у больных СД 2-го типа на этане формирования микро - и макроангионатий

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», 3 глав собственных исследовании, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 243 источника, из них 129 иностранных Работа иллюстрирована 28 таблицами и 24 рисунками

Материалы и методы исследования

Обследованы 65 больных СД 2-го типа с синдромом диабетической стопы, находившиеся на лечении во 2-м хирургаческом отделении ММУ «2-я Городская больница», и 50 пациентов с ДР, получивших лечение в клинике глазных болезней ГОУ ВПО «Саратовский ЕМУ Роездрава» Контрольную группу составили 30 практически здоровых лиц в возрасте от 40 до 62 лет Всего обследованы 145 человек, 115 из которых больные СД 2-го тина

Отбор больных с СДС проведен в соответствии с клиническими критериями включения и исключения в исследование

Критерии включения 1) СД 2-го типа, 2) тяжелое течение СД 2-го типа, 3) наличие СДС (нейропатическая, ишемическая и смешанная формы), 4) 2-я, 3-я и 4-я степени (глубина) повреждения тканей стопы при гнойно-некротических осложнениях СДС по классификации Wagner (1979)

Критерии исключения: 1) СД 1-го типа, 2) легкая степень тяжести течения СД 1-го и 2-го типов, 3) неотложные состояния (острый инфаркт миокарда, острое нарушение мозгового кровообращения, тромбоэмболия легочной артерии)

Больные с СДС имели наибольший срок длительности СД 2-го типа, его максимальная продолжительность достигала 20 лет, средняя продолжительность составила 12+2,8 года Возраст пациентов, находящихся под наблюдением, составлял от 50 до 82 лет (в среднем - 68,3+2,9 года). Среди обследованных - 53 (82,3%) мужчины и 12 (17,6%) женщин

Степень компенсации диабета у каждого больного оценивалась эндокринологом У всех пациентов установлена тяжелая степень диабета Артериальная шпертензия 2-й степени была у 18 больных (27,5%), 3-й степени — у 47

(72,5%) Ишемическая болезнь сердца выявлена у всех обследованных больных Диабетическая нефропатия имелась у 21 больного (32,2%) У всех больных при проведении офтальмологических методов исследования выявлена диабетическая ретинопатия в разных стадиях

Длительность возникновения гнойно-некротических осложнений СДС была от 2 суток до 3-4 месяцев У 25 больных с СДС (38,5%) язвенно-нскротические процессы на стопе возникли в течение последних 2 месяцев до поступления в стационар, у 40 больных (61,5%) в более отдаленные сроки Все пациенты по поводу СД ранее неоднократно лечились в эндокринологических отделениях городских больниц, длительное время находились на поддерживающей терапии без значимого положительного эффекта

Среди больных с СДС, находившихся под нашим наблюдением, наибольшее количество было с трофическими язвами (30%), флегмоной мягких тканей (27,5%>) и длительно незаживающими ранами (22,5%)

В дооперационном периоде проведен комплекс неинвазивной оценки поражений магистральных артерий нижних конечностей, включающий в себя ультразвуковую дошшерографию с многоуровневой манометрией (аппарат «У1гщтс<1» фирмы «Мес1а1а», Швеция) Ангиография выполнялась у 30% пациентов Функциональные возможности нижних конечностей пациентов оценивали с помощью проб с нагрузками па мышцы нижних конечностей (велозрго-метр КЕ-12 фирмы «МесЬсог», Венгрия)

При оценке степени нарушения кровообращения в нижних конечностях использовали результаты клинического обследования (наличие и характер пульсации магистральных сосудов, цвет кожных покровов и их температура) и инструментальных методов С помощью последних устанавливали тип кровотока, наличие и уровень стенозов и окклюзии артерий Выявляли расположение атеросклеротических бляшек, их размеры, степень сужения артерий, ригидность стенок артерий нижних конечностей, распространенность поражения У всех больных с СДС выявлены утолщение и повышение эхогенности стенки дистальных артерий в связи с кальцииозом, диффузное утолщение комплекса интима-медиа с утратой дифференцировки на слои Окклюзия подвздошно-бедренного сегмента выявлена у 4 больных (6,2%), бедренпо-подколепного сегмента — у 36 (55,4%), подколенно-берцового сегмента — у 21 (32,2%) и в области стопы — у 4 больных (6,2%)

Ишемические поражения нижних конечностей у пациентов с СДС соответствовали Шв-1Ув степени, согласно классификации Фонтейна-Покровского (табл 1), и сопровождались развитием критической ишемии нижних конечностей (КИНК)

Таблица 1

Степень ишемических поражений стопы по Фонтейну-Покровскому у больных СД 2-го типа с СДС

Степень поражения Количество больных

Шв 10(15%)

1Уа 20 (31%)

1Ув 35 (54%)

Больным проводилась терапия, направленная на компенсацию углеводного обмена, подавление микрофлоры с учетом её чувствительности к антибиотикам и купирование явлений критической ишемии стопы.

У 34 больных с СДС с трофическими язвами и длительно незаживающими ранами (с язвенно-некротическими поражениями тканей нижних конечностей) консервативная терапия была дополнена поэтапной некрэктомией, с последующими перевязками и с использованием протеолитических ферментов, гипертонического 10% - ного раствора хлорида натрия, мази «Левомеколь».

8 больным с СДС, осложненным гангреной пальцев, на фоне консервативного лечения была выполнена ампутация пальцев с резекцией головок плюсневых костей с обязательным удалением сухожилий.

У 7 больных с СДС с флегмонами стоп и голени было проведено срочное вскрытие гнойников и затеков с последующими неокклюзивными перевязками.

16 больным с СДС при отсутствии кровотока в одной из магистральных артерий нижних конечностей по поводу гнойно-некротических процессов были произведены ампутации на уровне верхней трети бедра.

У 15 больных с СДС с гнойно-некротическими поражениями тканей нижних конечностей и гангрены, на фоне нарушения кровотока в сосудах нижних конечностей, выявлены основные клинико-лабораторные параметры системного воспалительного ответа (СВО): 1 )температура более 38°С; 2) частота сердечных сокращений более 90 ударов /мин; 3) частота дыхания более 20 дыхательных движений/мин или РаС02 менее 32 мм рт. ст.; 4) лейкоциты периферической крови более 12х109/л.

В группу больных с ДР вошли 50 пациентов, проходивших лечение в клинике глазных болезней ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава».

По данным эндокринологического обследования, все больные были с субкомпенсацией углеводного обмена. Легкое течение диабета отмечено у

14 больных, среднетяжелое - у 27, тяжелое - у 9.

Больные СД 2-го типа с ДР имели срок длительности сахарного диабета от 5 до 15 лет. Максимальная продолжительность заболевания составляла

15 лет и отмечена у 10% пациентов. Средняя продолжительность заболевания

составила 8,5+2,4 года. Следует отметить, что не всегда удавалось установить точное время начала заболевания.

Возраст пациентов, находящихся под наблюдением, составил от 40 до 62 лет (в среднем — 48,3±3,9 года). Среди обследованных были 21 мужчина (42,3%) и 29 женщин (57,5%).

Степень компенсации диабета у каждого больного оценивалась эндокринологом. Компенсация углеводного обмена была у 36 больных, субкомпенсация углеводного обмена — у 5, декомпенсация — у 9 пациентов. Легкое течение диабета отмечено у 24 больных, среднетяжелое — у 15, тяжелое — у 11 пациентов.

У больных СД 2-го типа с ДР отмечены следующие сопутствующие заболевания: артериальная гипертония (у 16 человек), хронический бронхит (у 3 человек), ишемическая болезнь сердца (у 5 человек). Диабетические осложнения отмечены у 7 больных: диабетическая энцефалопатия — у 4 человек, диабетическая нефропатия — у 3. Офтальмологические методы исследования включали: визометрию, биомикроскопию, офтальмоскопию и осмотр трехзер-кальной линзой Гольдмана, пневмотонометрию, компьютерную периметрию с помощью периметра «Периком», ультразвуковую допплерографию, лазерную сканирующую НЯТ-ретинотомографию, электрофизиологические исследования (электроретинографию локальную и общую, электроэнцефалографию с регистрацией корковых вызванных потенциалов в ответ на световые стимулы), компьютерную колориметрию диска зрительного нерва и калиброметрию рети-нальных сосудов.

Все обследованные больные СД 2-го типа и практически здоровые лица были разделены на группы:

• группа практически здоровых лиц из числа доноров или группа сравнения (п = 30);

• группа больных СДС с Шв-1Уа ишемическими поражениями тканей нижних конечностей по Фонтейну-Покровскому и КИНК (п = 30);

• группа больных СДС с Шв-1Уа ишемическими поражениями тканей нижних конечностей по Фонтейну-Покровскому и КИНК на 7-14-е сутки после некрэктомии (п = 41);

• группа больных СДС с ГУв ишемическими поражениями тканей нижних конечностей по Фонтейну-Покровскому и КИНК (п = 35);

• группа больных СДС с 1Ув ишемическими поражениями тканей нижних конечностей по Фонтейну-Покровскому и КИНК на 7-14-е сутки после ампутации на уровне верхней трети бедра (п = 24);

• группа больных СДС с 1Ув ишемическими поражениями тканей нижних конечностей по Фонтейну-Покровскому и КИНК с клинико-лабораторными признаками СВО (п = 15);

• группа больных с непролиферативной диабетической ретинопатией

(п = 16);

• группа больных с препролиферативной диабетической ретинопатией (п=17);

• группа больных с пролиферативной диабетической ретинопатией (п = 17).

Обследованным больным были проведены общеклинические методы исследования. Определяли лейкоцитарный индекс интоксикации (ЛИИ) по формуле Я.Я. Кальф—Калифа (1941). При изучении степени нарушения метаболизма и иммунорегуляторных систем была использована периферическая кровь, полученная из кубитальной вены. Проведено исследование состояния углеводного обмена (глюкоза крови, HbAlc (гликолизированный гемоглобин)), липидного профиля крови, уровня СРБ, цитокинового профиля сыворотки крови, спонтанной и индуцированной фитогемагглютинином (ФГА) выработки цитокинов мононуклеарами крови (Кетлинский С.А., 1998).

Для выделения и исследования продукции цитокинов мононуклеарами из крови использовали пробирки с 0,1 М цитратом натрия, разделительным гелем и раствором фикола для создания градиента плотности (BD Vacutainer СРТ). Для выделения фракции мононуклеаров в плазме крови после взятия крови проводили центрифугирование в течение 20 минут при 1500-1800 х g.

Определение содержания глюкозы крови проводили с помощью глюко-зооксидазного метода, HbAlc — методом «ion exchange batch», Biocon Diagnostik. Содержание липидов и липопротеидов сыворотки крови определяли на биохимическом анализаторе Stat Fax на общий холестерин (ОХС) - «Холестерин ФС», Diasys Diagnostic Systems GmbH, на триглицериды (ТГ) - «Триг-лицериды ФС», Diasys Diagnostic Systems GmbH, на холестерин липопротеидов высокой плотности (ХСЛПВП) — «HDL-C Immuno FS», Diasys Diagnostic Systems GmbH. Полученные данные использованы при расчетах содержания холестерина липопротеидов низкой плотности (ХСЛПНП), холестерина липопротеидов очень низкой плотности (ХСЛПОНП), коэффициента атерогенности (Ка).

Определение СРБ в сыворотке крови осуществляли посредством фотометрического измерения реакции антиген—антитело между антителами к человеческому СРБ и СРБ, находящемуся в образце, с использованием наборов фирмы DiaSys Diagnostic Systems GmbH.

Определение содержания цитокинов в сыворотке крови проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием наборов реактивов фирмы «Вектор-Бест» (Новосибирск, РФ): гамма-интерферон (уИНФ), интерлейкин-4 (ИЛ4), фактор некроза опухоли альфа (ФНОа), интерлейкин-6 (ИЛ6), интерлейкин-8 (ИЛ8), интерлейкин-1бета (ИЛ lß).

Исследование спонтанной и индуцированной ФГА продукции цитокинов (ИЛ6, уИНФ, ФНОа) мононуклеарами (моноцитами и лимфоцитами) крови проведено при инкубации их взвеси in vitro,а также при добавлении в среду кортексина и берлитиона (Кетлинский С.А., 1998).

Статистическую обработку результатов исследования проводили на персональном компьютере с помощью набора инструментов статистической макрофункции «описательной статистики» (Microsoft Excel for Windows XP), о

достоверности результатов судили по критерию Стьюдента. Достоверными считались различия Р < 0,05.

Результаты исследования

Анализ полученных данных показал, что у всех обследованных больных СД 2-го типа с ангиопатиями имеют место значительные изменения показателей липидного, углеводного обменов и цитокинового статуса. У больных с ДР на этапе формирования микроангиопатий имелись недостаточная компенсация уровня гликемии и высокое содержание НЬА1с. Нарастание микрососудистых изменений у больных с ДР сопровождалось значимым подъемом содержания ТГ и ХС. Эти изменения липидного обмена сопровождались подъемом содержания ХСЛПОНП (от 155 до 245% от уровня нормы), ХСЛПНП (от 124 до 155 % от уровня нормы) и повышенным Ка (от 114 до 134% от уровня нормы).

Дислипопротеидемия у больных с ДР сочеталась со значимым подъемом медиаторов межклеточного взаимодействия - цитокинов (рис.1). Формирование микрососудистых изменений на уровне глазного дна у больных с ДР связано с подъемом содержания таких цитокинов, как ИЛ1р, ИЛ6, ИЛ8, ФНОа, уИНФ, и незначительным увеличением содержания ИЛ4 и ИНФа.

_

I

□ ИНФ-гамма

□ ИНФ-альфа

□ ФНО-альфа

□ ИЛ1в ОИЛ4

□ ИЛ6

□ ИЛ8

558

I 232

тт

204

I п

группа1 группа2 группаЗ

группа обследованных больных

Рис.1 Изменение содержания цитокинов в сыворотке крови у больных СД 2-го типа с ДР. Группа 1 — больные с непролиферативной ДР; группа 2 — больные с препроли-феративной ДР; группа 3 — больные с пролиферативной ДР.

Накопление в кровотоке противовоспалительных цитокинов у больных с ДР значительно отстает от выработки провоспалительных медиаторов.

На фоне подъема содержания провоспалительных цитокинов у больных СД 2-го типа увеличивалось содержание в крови СРБ.

Подъем уровня СРБ у больных с ДР характеризует степень микрососудистых нарушений на уровне сосудистого русла глазного дна, характерных для стадий развития заболевания:

• непролиферативная ретинопатия - 3,15-5,45 мг/л;

• препролиферативная ретинопатия — 4,1 до 6,3мг/л;

• пролиферативная ретинопатия - 4,3-8,1 мг/л.

Таким образом, уровень СРБ можно рекомендовать для оценки тяжести м икр о сосудистых нарушений у больных с ДР и для прогноза вероятности развития таких осложнений, как тромбоз, кровоизлияние в сетчатку .

Все обследованные больные с СДС на момент обследования имели неудовлетворительный уровень гликемии.

Одновременно с высоким уровнем глюкозы и НвА1с у больных с СДС до оперативного вмешательства выявлено увеличение таких показателей, как ЛИИ и СРБ. После оперативного вмешательства у больных СДС с Шв-1Уа стадиями ишемических поражений конечностей величины ЛИИ и СРБ, несколько снижаясь, оставались выше величин нормы. Сохранение высокого уровня СРБ и ЛИИ у больных с СДС в послеоперационном периоде можно объяснить высокой активностью иммуновоспалительного ответа организма на поврежденные белки, поступающие из пораженных и ишемизиро-ванных тканей нижних конечностей.

Нарушения липидного обмена у больных с СДС были обусловлены изменениями содержания в сыворотке крови ТГ. У больных с СДС до оперативных вмешательств выявлены незначительное снижение уровня ХС и подъем концентрации ТГ. Несмотря на низкий уровень ХС и ХСЛПНП, у всех обследованных больных отмечено увеличение содержания до операции ХСЛПОНП.

После оперативных вмешательств у больных с СДС значимых изменений липидного состава сыворотки крови не зафиксировано.

До оперативных вмешательств вне зависимости от степени поражения тканей нижних конечностей у больных с СДС в сыворотке крови выявлены высокое содержание провоспалительных цитокинов (рис 2) и незначительный подъем уровня ИЛ4.

Ведущая роль в развитии провоспалительного цитокинового каскада принадлежала таким цитокинам, как ИЛ6, уИНФ и ФНОа.

группаз группаЗ

группа обследованных больных

Рис.2, Изменение содержания цитокинов в сыворотке крови у больных СД 2-го типа с СДС. Группа 1 — больные СДС с Шв-1Уа стадиями ишемии нижних конечностей; группа 2 — больные СДС с Шв-1Уа стадиями ишемии нижних конечностей после некрэктомии; группа 3 — больные СДС с 1Ув стадией ишемии нижних конечностей; группа 4 — больные СДС с 1Ув стадией ишемии нижних конечностей после ампутации.

Оперативные вмешательства у больных с СДС способствовали снижению содержания провоспалительных цитокинов и подъему уровня ИЛ4. Так, наиболее значимое увеличение ИЛ4 наблюдалось у больных с 1Ув стадией ишемиче-ских поражений нижних конечностей. Оно составляло 890% от уровня нормы (р<0,001) до операции и 1537% от уровня нормы (р<0,001) после операции. Это происходило на фоне снижения содержания ключевых провоспалительных цитокинов.

Данные изменения цитокинового статуса в послеоперационном периоде у больных СД 2-го типа с СДС характеризуют усиление активности ТЬ-2 клеточного звена иммунного ответа. Такие клетки, как фагоциты, лимфоциты, анти-генпрезентирующие, снижая активность продукции цитокинов, прекращают свое участие в межклеточных взаимодействиях и осуществлении эффекторных функций.

Таким образом, дисбаланс цитокинов в послеоперационном периоде у больных с СДС характеризует низкую активность иммунокомпетентных клеток, высокую активность их апоптотической гибели и преждевременное формирование гуморальной фазы воспалительного ответа. Можно считать, что нарастание уровня противовоспалительных цитокинов и понижение содержания провоспалительных медиаторов у больных с СДС в послеоперационном периоде является следствием развития иммуносупрессии и её перехода в иммунную недостаточность. Это определяет высокую частоту осложнений и неблагоприятные исходы в послеоперационном периоде у больных СД 2-го типа с СДС.

Одновременное исследование цито-кинового состава сыворотки крови и взвеси мононуклеаров в плазме, цитокинсинтези-рующей активности мононуклеаров крови (спонтанной, индуцированной ФГА, без и с добавлением кортексина или берлитиона в дозах, соответствующих терапевтическим) in vitro, проведенное у 15 лиц контрольной группы, 15 больных с пролиферативной ретинопатией, 15 больных с синдромом диабетической стопы и Шв-lVa стадиями ишемии нижних конечностей, 15 больных с синдромом диабетической стопы и IVb стадией ишемии нижних конечностей на фоне появления основных клинико-лабораторных параметров СВО, подтвердило полученные выше результаты (рис. 3,4,5,6).

Установлено, что значительный про-воспалительный цитокиновый сдвиг в крови у всех больных с СД 2-го типа и ан-гиопатиями не связан с методом выделения сыворотки крови или получения взвеси мононуклеаров в плазме. В выделенных сыворотке крови, в плазменной взвеси мононуклеаров преобладало количество таких провоспалительных цитокинов, как ИЛ1р, ИЛ6, ИЛ8, уИНФ, ФНОа. Несмотря на исключение дополнительного стимула для выработки цитокинов (тромбообразование в пробирках при выделении сыворотки крови), подъем содержания ключевых провоспалительных медиаторов отмечен и в сыворотке крови, и во взвеси мононуклеаров в плазме.

Провоспалительный цитокиновый сдвиг у больных СД 2-го типа с ангиопа-тиями сочетался с повышенной спонтанной продукцией ключевых провоспалительных медиаторов (уИНФ, ИЛ6, ФНОа) мононук-леарами крови. Снижение спонтанной продукции провоспалительных цитокинов вы-

Рис.З. Цитокиновый состав плазменной взвеси мононуклеаров и сыворотки крови у практически здоровых людей.

I

I

Рис.4. Цитокиновый состав плазменной взвеси мононуклеаров и сыворотки крови у пациентов с ДР.

Рис.5. Цитокиновый состав плазменной взвеси мононуклеаров и сыворотки крови у пациентов СДС с Шв-1Уа стадиями ишемии нижних конечностей.

и

й

Рис.6. Цитокиновый состав плазменной взвеси мононуклеаров и сыворотки крови у пациентов СДС с 1Ув стадией ишемии нижних конечностей и клинико-лабораторными проявлениями СВО

явлено только в группе пациентов СДС с IVb стадией ишемии нижних конечностей и клинико-лабораторными проявлениями СВО. Взвесь мононуклеаров, за исключением данной группы пациентов, отвечала усилением выработки цитоки-нов в ответ на введение в среду инкубации ФГА. Это подтверждает достаточно высокую цитокинсинтезирующую способность мононуклеаров крови и их активное участие в формировании провоспалительного цитокинового сдвига.

Снижение спонтанной и индуцированной продукции цитокинов in vitro у больных СДС с IVb стадией ишемии нижних конечностей и клинико-лабораторными признаками СВО можно считать следствием иммунной недостаточности, переходящей в ее несостоятельность.

При введении в среду инкубации вместе с ФГА лекарственных препаратов - берлитиона и кортексина развивалось снижение цитокинсинтезирующей активности мононуклеаров. Это связано с влиянием данных препаратов на наиболее измененные звенья клеточного метаболизма у больных СД 2-го типа или с их антиоксидантным и антиапоптотическим действием. У больных СДС с IVb стадией ишемии нижних конечностей и клинико-лабораторными проявлениями СВО не выявлено значимых изменений продукции всей исследованной группы провоспалительных цитокинов. Это является дополнительным подтверждением снижения функциональных свойств циркулирующих в кровотоке им-мунокомпетентных клеток у данной группы больных СД 2-го типа или имму-носупрессии.

На этапе развития микро- и макроангиопатий у больных СД 2-го типа гипергликемия, высокий уровень НвА1с, дислипопротеидемия, связанная с подъемом содержания ХС и ХСЛПНП, сочетаются с высоким содержанием провоспалительных цитокинов - ИЛ1Р, ИЛ6, ИЛ8, уИНФ, ФНОа. Это можно считать следствием активации моноцитарно-макрофагальной системы. У больных СД 2-го типа прогрессирование ДР имеет в своей основе перепрограммирование работы эндотелиальной выстилки сосудов с одновременной активацией Т-клеточного звена и преобладанием Thl клеточного иммунного ответа. Цитоки-новый провоспалительный каскад у больных с ДР также можно считать одним из факторов формирования таких микрососудистых расстройств, как повреждение эндотелия, уменьшение способности эритроцитов к деформации, усиление агрегации тромбоцитов, окклюзия капилляров, затем артериол с последующей ишемией сетчатки.

По-видимому, постоянно идущее обострение воспалительного процесса у больных с ДР сопровождается рекрутированием в интиму сосудов Thl-лимфоцитов и активированных макрофагов, которые также способствуют повышению продукции цитокинов воспаления и определяют дальнейшее их появление при макрососудистых осложнениях.

У больных с СДС общая активация иммунореактивности и адаптационного ответа организма формируется уже на фоне провоспалительного цитокинового сдвига.

Значимый подъем уровня ИЛ4 у больных с СДС и IVb стадией ишемиче-ских поражений нижних конечностей после оперативных вмешательств на фоне снижения содержания ключевых провоспалительных цитокинов свидетельствует о жизнеугрожшощей недостаточности иммунорегуляюрных систем организма У данной группы иацпешов в послеоперационном периоде в 46% случаев выполнялись повторные оперативные вмешательства, в 18% случаев в течение 30 суток после оперативного вмешательства наступала cMepib от полиорганной недостаточности

Анализ полученных данных позволяет выделить три стадии нарушения иммунорегуляторных процессов при формировании микро- и макроангиопа-тий у больных СД 2-го типа

I стадия —провоспалительный цитокиновый сдвиг, возникающий на этапе формирования микроангиопатий, выявлен у пациентов с ДР Механизм развития нарушение углеводного обмена, накопление гликолизиро-ванных белков, оксидативный стресс, приводящий к подъему окисленных ЛПНП Эти изменения у больных СД 2-го типа становятся факторами, инициирующими иа уровне эндотелиальной выстилки сосудистого русла организма комплекс иммуновоспалительных реакций Усиливается активность моноцитов и нейтрофилов, увеличивается продукция ими провоспалительных цитокинов, развивается провоспалительный цитокиновый каскад, и происходит усиленный выброс белков острой фазы

II стадия — цитокинемия, развивается на этапе формирования мак-роангиопатий у больных с СДС Механизм развития неконтролируемый выброс из макрофагов, лимфоцитов и эндотелия целого комплекса медиаторов, важнейшими из которых являются цитокины Ведущую роль в развитии генерализованного воспалительного каскада играют такие цитокины, как ФНОа, ИЛ6, уИНФ Кроме цитокинового каскада активизируется свертывающая система крови, нарастают микроциркуляторпые нарушения

III стадия - снижение цитокшшродуцирующей способности клеток иммунной системы на фоне выраженной органной дисфункции возникает в послеоперационном периоде у больных СДС с IVb стадией ишемии нижних конечностей Механизм развития взаимодействие эндогенных медиаторов воспаления с различными клетками макроорганизма, - приводит к появлению СВО и потере клетками иммунной системы способности вырабатывать провоспалительные цитокины Можно считать, что дисбаланс выработки цитокинов клетками организма у больных СД 2-го типа является основной причиной общеорганизменных изменений адаптивных процессов

На основании полученных данных предложены алгоритмы и показания к консервативному лечению и лазеркоагуляции больных СД 2-го типа с ДР (табл 2) и к консервативному и хирургическому лечению больных с СДС (табл 3)

Таблица 2

АЛГ ОРИТМЫ II ПОКАЗАНИЯ К КОНСЕРВАТИВНОМУ ЛЕЧЕНИЮ II ЛАЗЕРОКОАГУЛЯЦПИ БОЛЬНЫХ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 2 -ГО ТИПА С ДИАБЕТИЧЕСКОЙ РЕТИНОПАТИЕЙ

Показания к консервативному лечению Показания к панретиналыюй лазеркоагуляции сетчатки

Стадия Непролиферативная и препролиферативная Пролиферативная стадия

НЬ А 1с,Го До 7.1 Выше 7,2

ХС, моль/л До 7,2 Выше 7,3

ИЛ1Р, пг/мл сыворотки От 6 до 16 Выше 17

ИЛ-6, ш/мл сыворотки До 36 Выше 37

СРВ, мг/л сыворотки До 4,3 Выше 4,4

ФНОа, пг/мл сыворотки До 70 Выше 70

Таблица 3

АЛГОРИТМЫ II ПОКАЗАНИЯ К КОНСЕРВАТИВНОМУ II ХИРУРГИЧЕСКОМУ ЛЕЧЕНИЮ БОЛЬНЫХ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 2 -ГО ТИНА С СДС

Показания к консервативном)' лечению Показания к некрэкто-мии и малым ампутацям Показания к ампутации конечности

Стадия Шв-1Уа с ишемически-ми поражения™ тканей нижних конечностей по Фонтейну-Покровскому и КИНК Шв-1Уа с ишемически-ми поражениями тканей нижних конечностей по Фонтейну-Покровскому и КИНК IVb с ишемическими поражениями тканей нижних конечностей по Фонтейну-Покровскому и КИНК

НЬ А1С,% До 12% До 12% Выше 13%

ЛИИ,ед До 6,1 Выше 6,2 Выше 6,2

ИЛ8, пг/мл сыворотки До 52 Выше 53 Выше 53

ИЛ-6, пг/мл сыворотки До 173 От 173 до 220 221 и выше

ФНОа, пг/мл сыворотки До 107,4 Выше 107,5 Выше 107,5

выводы

1 Развитие микро- и макроаигиопатий у больных СД 2-го типа возникает на фоне нарушения углеводного и лшшдного обменов, сочетающихся с высоким уровнем провоспалительных цитокинов в сыворотке крови (Ил lß, ФНОа, уИНФ, ИЛ6, ИЛ8)

2 Изменение содержания нровоспалителышх цитокинов сыворотки крови у больных СД 2-го типа с микро- и макроангиопатиями позволяет выделить следующие стадии нарушили иммунорегуляторных процессов 1-я стадия — impacianne содержания провоспалительных цитокинов, 2-я стадия — цитоки-нсмия, 3-я стадия - снижение цитокинпродуцирующей способности клеток иммунной системы

3. Нарастание содержания провоспалительных цитокинов сыворотки крови сочетается с увеличением цитокинпродуцирующей активности мононуклеаров и является одной из характеристик нарушения иммунорегуляторных процессов больных СД 2-го типа с микро- и макроангиопатиями Снижение цитокинпродуцирующей активности мононуклеаров свидетельствует о развитии нммупо-супрессии и формировании СВО

4 Препараты с антиоксидантным и антиапоптотическим действием (берли-тион и кортексин) приводят к снижению цигокинпродуцирующей активности мононуклеаров крови у больных СД 2-го типа на этапе формирования микро- и макроангиопатий

5 Дополнительными диагностическими признаками прогноза развития СВО и cienerai нарушения иммунорегуляторных систем организма у больных СД 2-го типа с микро- и макроангиопатиями являются количественное определение содержания ключевых провоспалительных цитокинов - ИЛб, ФНОа, уИНФ и исследование их выработки при инкубации мононуклеаров крови

Практические рекомендации

1 Предложены алгоритмы и показания к консервашвному лечению и ла-зерокоагуляции больных сахарным диабетом 2-го типа с диабетической ретинопатией и алгоритмы и показания к консервативному и хирургическому лечению больных сахарным диабетом 2-го типа с СДС, основанные на результатах исследования содержания провоспалительных цитокинов и уровня СРБ сыворотки крови.

2 У больных СД 2-го типа на этапе формирования ДР определение уровня СРБ можно рекомендовать для прогноза риска развития таких осложнений, как тромбоз, кровоизлияние в сетчатку Уровень СРБ 3,15 - 4,1 мг/л - низкий риск, 4,3 - 8,3 мг/л - высокий риск развития осложнений

3 Для оценки тяжести нарушения иммунорегуляторных систем организма у больных СД 2-го типа на этапе формирования микроангиопатий целесообразно определение содержания провосггалительных цитокинов — ИЛ lß (от б до 17,5 пг/мл), ИЛ6 (от 30 до 42,5 пг/мл), ФНОа (от 57,5 до 85,5 пг/мл) и СРБ (от 4,3 до 6,2 пг/мл), на этапе развития макроангиопатий - ИЛ6 (от 78,5 до 248 пг/мл), ИЛ8 (от 23 до 52 пг/мл), ФНОа (от 55 до 125 пг/мл), исследование выработки ИЛ6 и ФНОа основными эффекторными иммунокомпетептшлми клетками крови при инкубации, без и с введением в инкубационную среду препаратов, обладающих антиоксидантным и аитиапоптотическим действием (берли-тион и кортексин)

4 В опытах in vitro доказана целесообразность использования препаратов с антиоксидантным и антиапоптотичсским действием (берлитион и кортексин) в качестве средств, тормозящих развитие ангаопатий у больных СД 2-го типа

Список: работ, опубликованных но теме диссертации

1 Дашкова, В Л (Нефед, В Л ) Показатели некоторых про- и противовоспалительных цитокинов у больных облитерирующим атеросклерозом сосудов нижних конечностей в зависимости от состояния углеводного обмена / В.Г. Чобитько, Н Б Захарова, В Л Дашкова // Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины Материалы научно-практической конференции с международным участием - Астрахань, 2006 -С 179-171

2 Дашкова, В Л (Нефед, В Л ) Роль провоспалительной цитокиновой программы в развитии и прогрессировании диабетической ретинопатии у больных сахарным диабетом 2-го типа / Т Г Каменских, Н Б Захарова, В Л Дашкова // Актуальные вопросы диагностики и лечения метаболического синдрома Материалы Ш Всероссийской научно-практической конференции -М, 2006 -С 53

3 Дашкова, В Л (Нефед, В Л ) Про- и противовоспалительные цитокины при сахарном диабете 2-го типа, осложненном макроангиоиатией нижних конечностей / В Г Чобитько, Н Б Захарова, В Л Дашкова // Актуальные вопросы диагностики и лечения метаболического синдрома. Материалы III Всероссийской научно-практической конференции -М,2006 - С 113

4 Дашкова, В Л (Нефед, В Л ) Лабораторное обеспечение консервативного и хирургического лечения больных сахарным диабетом 2-го типа с синдромом диабетической стопы в условиях специализированной клиники / Н Б Захарова, В Г Чобитько, В Л Дашкова // Клиническая лабораторная диагностика - 2007 - № 9 - С 62

5 Дашкова, В Л (Нефед, В Л ) Лабораторное обеспечение современных технологий лечения диабетической ретинопатии в условиях специализирован-

ной клиники глазных болезней / Т Г Каменских, Н Б Захарова, В Л Лашкова, // Клиническая лабораторная диагностика - 2007. - № 9 - С 62

6 Лашкона, В Л (Нефед, В Л.) Иммунопатофизиологичсские особенности развития диабетической ретинопатии / Т.Г. Каменских, Н.Б Захарова, В Л. Лашкова, ¡1 Актуальные вопросы современной биохимии- Всероссийская научно-практическая конференция биохимиков и специалистов по лабораторной медицине, посвященная 20-летию Кировской государственной медицинской академии. - Киров, 2007. - С 67-70

7. Лашкова, В Л (Нефед, В Л ) Молекулярные маркеры морфологических и функциональных изменений сетчатки и зрительного нерва у больных проли-феративной диабетической ретинопатией / Т Г. Каменских, Н Б Захарова, В.Л Лашкова, VI I Всероссийская школа офтальмолога Сб науч тр - М , 2008 - С 314-323.

8. Лашкова, В.Л. (Нефед, В Л) Молекулярные маркеры развития проли-феративной ретинопатии у больных сахарным диабетом / Н Б Захарова, Т Г Каменских, В Л Лашкова // Российский иммунологический журнал. - 2008 -том 2 (11), № - 2-3 - С 117-118

9 Лашкова, В Л (Нефед, В Л.) Новые клеточные технологии исследования роли цитокинов в развитии иммунопатологических процессов / Н Б Захарова, В Л Лашкова, Т И Спиридонова // Инновационные технологии в трансплантации органов, тканей и клеток' Материалы Всероссийской конференции с между народный участием - Самара, 2008.-С 174-177.

10 Лашкова, В Л. (Нефед, В Л ) Предикторы развития пролиферативной ретинопатии у больных сахарным диабетом / Н Б Захарова, Т Г. Каменских, В Л Дашкова // Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов -Новосибирск, 2008. - С. 417-418

11. Лашкова, В Л (Нефед, В Л ) Клинико-диагностическое значение факторов роста и маркеров апоптоза у больных сахарным диабетом с диабетической ретинопатией / Н Б Захарова, Т Г Каменских, В Л Лашкова // Клиническая лабораторная диагностика - 2008 № 9. - С 45

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

HbAlc - гликолизированный гемоглобин

уИНФ - интерферон-гамма

ДР - диабетическая ретинопатия

HJIlß - интерлейкин 1бета

ИЛ4 - интерлейкин 4

ИЛ8 - интерлейкин 8

ИЛб - интерлейкин б

ИФА - иммуноферментный анализ

Ка - коэффициент атерогенности

КИНК - критическая ишемия нижних конечностей

ЛИИ - лейкоцитарный индекс интоксикации

ЛП - липопротеиды

ХСЛПВП - липопротеиды высокой плотности

ХСЛПНП - липопротеиды низкой плотности

ХСЛПОНП - липопротеиды очень низкой плотности

СВО - системный воспалительный ответ

СД - сахарный диабет

СДС - синдром диабетической стопы

СРБ - С-реактшшый белок

ФГА - фитогемоагглютинин

ФНОа - фактор некроза опухоли альфа

Подписано к печати 24.09.08 Объем - 1 печ л. Тираж 100. Заказ № 313 Отпечатано в типографии ООО «Правильный вывод», 410071, Саратов, ул Шелковичная, 186.

Актуальность проблемы

Помимо высокой распространенности, сахарный диабет (СД) является одной из частых причин инвалидизации и летальности, что обусловлено его сосудистыми осложнениями, микро — и макроангиопатиями [21]. Нарастание частоты данных осложнений СД, прежде всего при СД 2-го типа, связано с другой важной тенденцией — увеличением продолжительности жизни не только в развитых странах, но и в других регионах земного шара. В связи с этим повсеместно возникает проблема социального обеспечения больных СД, которые не могут обходиться без посторонней помощи вследствие таких осложнений СД как микро- и макроангиопатии. Установлено, что почти у 50% больных СД к моменту клинической манифестации заболевания имеются такие сосудистые осложнения, как диабетическая ретинопатия (ДР) и синдром диабетической стопы (СДС) [85].

ДР становится основной причиной слепоты среди лиц трудоспособного возраста; 80-90% всей инвалидности по зрению обусловлены СД [18].

Распространенность язв стоп среди больных диабетом в развитых странах составляет приблизительно 4-10%, ежегодный прирост составляет 2,25,9%. Каждый год 0,6-0,8% пациентов, страдающих СД, подвергаются ампутациям нижних конечностей на различных уровнях [1, 62].

Однако в исследованиях, посвященных изучению патогенеза ДР' и СДС, практически не рассматривались вопросы участия иммунорегуля-торных механизмов в развитии ангиопатий. Раскрытие молекулярных механизмов, лежащих в основе нарушений межклеточного взаимодействия на уровне системы иммунорегуляции организма может явиться основой для поиска новых путей патогенетического лечения ангиопатий при СД 2-го типа. Высокий уровень ампутаций при СДС, случаев затяжных форм течения заболевания указывает на недостаточную эффективность имеющихся методов терапии [15, 53].

В настоящее время к наиболее перспективным маркерам нарушения процессов иммунорегуляции при воспалительных заболеваниях относят гистогормоны белковой природы — цитокины [14, 100]. Продукция цитокинов носит активационный характер и обеспечивает информационный обмен между клетками, вовлечёнными в воспалительный процесс. Особенность генеза цитокинемии при СД заключается в том, что у пациентов по мере развития заболевания нарастает количество клеточных структур с высокой продукцией цитокинов. Исследование роли цитокинемии и нарушения баланса между провоспалительными и противовоспалительными цитокинами в процессе развития таких тяжелых осложнений СД, как ДР и СДС, позволит получить дополнительные лабораторные критерии оценки тяжести, характера течения, прогнозирования исходов заболевания, станет основой для поиска новых методик, более эффективных схем и подходов к лечению [23].

Цель исследования — установить диагностическое и прогностическое значение нарушений цитокинового статуса в развитии ангиопатий при СД 2-го типа.

Задачи исследования

1. Выявить изменения уровня цитокинов (ИЛ 10, ИЛ6, ИЛ4, ИЛ8, ФНОа, уИНФ) в сыворотке крови у больных СД 2-го типа на этапе формирования микро- и макроангиопатий.

2. Установить последовательность изменения цитокинового и липидного составов сыворотки крови у больных СД 2-го типа на этапе формирования микро- и макроангиопатий.

3. Установить взаимосвязи между изменениями продукции цитокинов мононуклеарами крови и нарушением цитокинового статуса сыворотки крови у больных СД 2-го типа на этапе формирования микро- и макроангиопатий.

4. Показать диагностическое и прогностическое значение изменения уровня цитокинов крови у больных СД 2-го типа на этапе формирования микро- и макроангиопатий.

5. Оценить влияние препаратов с . антиоксидантным и антиапоптотическим действием (берлитион и кортексин) на продукцию мононуклеарами цитокинов у больных СД 2-го типа на этапе формирования микро- и макроангиопатий.

Научная новизна

Установлено, что у больных СД' 2-го типа на этапе формирования ангиопатий повышенный уровень глюкозы, НвА1с, изменение липидного профиля сочетаются с подъемом содержания в сыворотке крови цитокинов, а также с активацией выработки ключевых провоспалительных цитокинов (ИЛ6, ФНОа, уИНФ) моноцитами и лимфоцитами в процессе инкубации.

Показано, что цитокиновый статус у больных СД 2-го типа зависит от наличия микро- и макроангиопатий: при развитии ДР регистрируется умеренный подъем провоспалительных цитокинов, при возникновении СДС — выраженная цитокинемия.

На основе оценки содержания провоспалительных цитокинов и их выделении мононуклеарами крови, при ФГА — стимуляции выделены 3 стадии развития иммунного ответа организма у больных СД 2-го типа с микро- и макроангиопатиями:

• 1-я стадия — нарастание содержания провоспалительных цитокинов;

• 2-я стадия — цитокинемия;

• 3-я стадия — снижение цитокинпродуцирующей способности клеток иммунной системы.

Количественное содержание ключевых провоспалительных цитокинов (ИЛ6, ФНОа, уИНФ) и способность мононуклеаров крови их вырабатывать отражают тяжесть ангиопатий и развитие системного воспалительного ответа (СВО).

Практическая значимость

У больных СД 2-го типа в процессе развития ангиопатий исследование цитокинового профиля сыворотки крови позволяет оценить степень нарушения иммунной регуляции и прогнозировать развитие СВО в процессе лечения.

Исследование цитокинового профиля сыворотки крови у больных СД 2-го типа с ангиопатиями повышает эффективность ранней диагностики стадии недостаточности иммунорегуляторных систем организма и развития СВО. Предложено выделить стадии развития иммунной супрессии у больных СД 2-го типа:

• 1-я стадия — нарастание содержания провоспалительных цитокинов;

• 2-я стадия — цитокинемия;

• 3-я стадия — снижение цитокинпродуцирующей способности клеток иммунной системы.

Показано, что изменение цитокинпродуцирующей активности мононуклеаров при инкубации (in vitro) с введением ФГА и препаратов с антиоксидантным и антиапоптотическим действием (берлитион и кортексин) позволяет оценить степень нарушения иммунорегуляторных процессов: нарастание содержания цитокинов в инкубационной среде свидетельствует о включении мононуклеаров в формирование цитокинового провоспалительного сдвига; снижение их выработки характеризует развитие иммуносупрессии.

Доказана в эксперименте in vitro целесообразность назначения больным СД 2-го типа с ДР и СДС препаратов, обладающих антиоксидантным и антиапоптотическим действием (берлитион и кортексин). Данные препараты способствуют снижению выработки мононуклеарами крови провоспалительных цитокинов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. У больных СД 2-го типа с ДР формирование ангиопатий сопровождается подъемом. содержания в сыворотке крови провоспалительных цитокинов (ИЛ6, ФНОа, уИНФ) и усилением цитокинпродуцирующей активности мононуклеаров крови.

2. Увеличение содержания провоспалительных цитокинов у больных СД 2-го типа при ДР происходит одновременно с изменениями липидного состава и уровня СРБ сыворотки крови.

3. У больных СД 2-го типа при СДС развивается цитокинемия, основой которой является нарастание содержания провоспалительных цитокинов (ИЛ6, ФНОа, уИНФ), в меньшей степени - противовоспалительных цитокинов (ИЛ4) и усиление цитокинсинтезирующей функции фракции мононуклеаров крови.

4. Степень подъема содержания провоспалительных цитокинов сыворотки крови отражает тяжесть клинического течения ангиопатий при СД 2-го типа.

5. Для оценки степени нарушения иммунорегуляторных систем организма у больных СД 2-го типа с микро- и макроангиопатиями необходимы количественное определение содержания ключевых провоспалительных цитокинов (ИЛ6, ФНОа, уИНФ) и исследование их выработки мононуклеарами крови.

6. Препараты с антиоксидантным и антиапоптотическим действием (берлитион и кортексин) могут быть использованы для снижения активности процессов, приводящих к развитию провоспалительного цитокинового сдвига у больных СД 2-го типа на этапе формирования микро-и макроангиопатий.

Внедрение

Результаты исследований внедрены в работу 2-го хирургического отделения ММУ «2-я Городская больница имени В.И. Разумовского»; клиники глазных болезней ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава»; в учебный процесс кафедр клинической лабораторной диагностики и глазных болезней ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава».

Апробация работы

Материалы диссертационной работы доложены на заседаниях кафедры клинической лабораторной диагностики ЦНИЛ ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава» (Саратов, 2006, 2007, 2008); на научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань-Волгоград-Москва, 2006); III Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы диагностики и лечения метаболического синдрома»

Москва, 2006); Всероссийской научно-практической конференции биохимиков и специалистов по лабораторной медицине, посвященной 20-летию Кировской государственной медицинской академии «Актуальные вопросы современной биохимии» (Киров, 2007). По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 4 в журналах, рекомендованных ВАК для публикации результатов диссертационных исследований.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 242 источника, из них 129 иностранных. Работа иллюстрирована 28 таблицами и 24 рисунками.

ВЫВОДЫ

1. Развитие микро- и макроангиопатий у больных СД 2-го типа возникает на фоне нарушения углеводного и липидного обменов, сочетающихся с высоким уровнем провоспалительных цитокинов в сыворотке крови (ИЛ1Р, ФНОа, уИНФ, ИЛ6, ИЛ8).

2. Изменение содержания провоспалительных цитокинов сыворотки крови у больных СД 2-го типа с микро- и макроангиопатиями позволяет выделить следующие стадии нарушения иммунорегуляторных процессов: 1-я стадия — нарастание содержания провоспалительных цитокинов; 2-я стадия — цитокинемия; 3-я стадия - снижение цитокинпродуцирующей способности клеток иммунной системы.

3. Нарастание содержания провоспалительных цитокинов сыворотки крови t сочетается с увеличением цитокинпродуцирующей активности мононуклеаров и является одной из характеристик нарушения иммунорегуляторных процессов у больных СД 2-го типа с микро- и макроангиопатиями. Снижение цитокинпродуцирующей активности мононуклеаров свидетельствует о развитии иммуносупрессии и формировании СВО.

4. Препараты с антиоксидантным и антиапоптотическим действием (берлитион и кортексин) приводят к снижению цитокинпродуцирующей активности мононуклеаров крови у больных СД 2-го типа на этапе формирования микро- и макроангиопатий .

5. Дополнительными диагностическими признаками прогноза развития СВО и степени нарушения иммунорегуляторных систем организма у больных СД' 2-го типа с микро- и макроангиопатиями являются количественное определение содержания ключевых провоспалительных цитокинов — ИЛ6, ФНОа, уИНФ и исследование их выработки при инкубации мононуклеаров крови.

Практические рекомендации

1. Предложены алгоритмы и показания к консервативному лечению и лазеркоагуляции больных СД 2-го типа с ДР и алгоритмы и показания к консервативному и хирургическому лечению больных СД 2-го типа с СДС, основанные на результатах исследования содержания провоспалительных цитокинов и уровня СРБ сыворотки крови.

2. У больных СД 2-го типа на этапе формирования ДР определение уровня СРБ можно рекомендовать для прогноза риска развития таких осложнений, как тромбоз, кровоизлияние в сетчатку. Уровень СРБ 3,15 — 4,1 мг/л — низкий риск; 4,3 — 8,3 мг/л — высокий риск развития осложнений.

3. Для оценки тяжести нарушения иммунорегуляторных систем организма у больных СД 2-го типа на этапе формирования микроангиопатий целесообразно определение содержания провоспалительных цитокинов — ИЛ 1(3 (от 6 до 17,5 пг/мл), ИЛ6 (от 30 до 42,5 пг/мл), ФНОа (от 57,5 до 85,5 пг/мл) и СРБ (от 4,3 до 6,2 пг/мл), на этапе развития макроангиопатий — ИЛ6 (от 78,5 до 248 пг/мл), ИЛ8 (от 23 до 52 пг/мл), ФНОа (от 55 до 125 пг/мл), исследование выработки ИЛ6 и ФНОа основными эффекторными иммунокомпетентными клетками крови при инкубации, без и с введением в инкубационную среду препаратов, обладающих антиоксидантным и антиапоптотическим действием (берлитион и кортексин).

4. В опытах in vitro доказана целесообразность использования препаратов с антиоксидантным и антиапоптотическим действием (берлитион и кортексин) в качестве средств, тормозящих развитие ангиопатий у больных СД 2-го типа.