Автореферат и диссертация по медицине (14.00.20) на тему:Нарушения системы глутатиона и их роль в патогенезе острых интоксикаций ксенобиотиками с различными механизмами токсического действия

На правах рукописи

□ОЗОБ7487

ГЛУШКОВ Сергей Иванович

НАРУШЕНИЯ СИСТЕМЫ ГЛУТАТИОНА И ИХ РОЛЬ В ПАТОГЕНЕЗЕ ОСТРЫХ ИНТОКСИКАЦИЙ КСЕНОБИОТИКАМИ С РАЗЛИЧНЫМИ МЕХАНИЗМАМИ ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ

14.00.20 - токсикология, 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации иа соискание ученой степени доктора медицинских наук

Санкт-Петербург 2006

003067487

Работа выполнена в Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова Научные консультанты:

доктор медицинских наук профессор Куценко Сергей Алексеевич доктор медицинских наук профессор Карпшценко Анатолий Иванович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор Головко Александр Иванович доктор медицинских наук профессор Луковникэва Любовь Владимировна доктор медицинских наук профессор Долго-Сабуров Валерий Борисович

Ведущая организация:

Федеральное государственное предприятие «НИИ гигиены, профпатологии и экологии человека» Федерального медико-биологического агентства России

Защита диссертации состоится " февраля 2007 года в ^ часов на заседании диссертационного совета Д 215.002.11 в Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова (194044, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, дом 6)

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова

Автореферат разослан " года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук профессор Ищенко Борис Ионович

Актуальность. Количество острых отравлений в развитых странах мира (например, в США около 600 ООО случаев в год) и Российской Федерации ежегодно возрастает, не снижается существенно и число их летальных исходов (Литвинов H.H., 1997; Лужников Е.А., 1994), все это указывает на необходимость совершенствования мероприятий по оказанию помощи отравленным.

Действие многочисленных, химических веществ на организм человека сложно и многообразно. Существенно различаются механизмы токсического действия ксенобиотиков, патогеяез и проявления интоксикации. Поэтому решение задачи совершенствования оказания помощи отравленным сопряжено с необходимостью разработки новых многочисленных этиотропных препаратов (антидотов), а также средств патогенетической и симптоматической терапии острых интоксикаций. Организм человека и животных располагает целым рядом сложных биохимических систем (метаболизма ксенобиотиков, антирадикальной защиты, репарации поврежденных биологических молекул и т.д.), во многом определяющих чувствительность к действию токсикантов разного строения. К их числу относится и система глутатиона. Она принимает участие в реализации целого ряда важнейших физиологических процессов: детоксика-ции и антиоксидантной защиты; в биохимических превращениях витаминов С, Б, липоевой кислоты и убихинона; в регуляции тиол-дисульфидного равновесия; в процессе транспорта аминокислот; в поддержании восстановленной среды клетки; в регуляции углеводного, липидного, белкового и нуклеинового обменов; в поддержании гемоглобина эритроцитов в восстановленном состоянии; в поддержании оптимального состояния и функций биологических мембран; в регуляции клеточной пролиферации; в обмене ряда эйкозаноидов — простагландинов и лейкотриенов; глутатион выступает и в качестве резерва цистеина в клетке; участвует в регуляции функциональной активности лимфоцитов и обеспечении иммунного ответа организма; оказывает регулирующее влияние на синтез белков теплового шока; принимает участие в реализации механизмов программируемой клеточной гибели (Кулинский В.И., 1990; Мап-nervik В., 1989; Meister А., 1983).

Все это позволяет, по мнению Л.А.Тиунова (1988, 1995), рассматривать обмен глутатиона в качестве механизма обеспечения неспецифической резистентности организма к действию широкого круга токсикантов. В настоящее время синтезированы новые фармакологические препараты на основе глутатиона, в том числе, для профилактики и лечения токсического повреждения тканей при действии ипритов, цитостатиков и других цитото'ксических агентов' (Саватеев Н.В., 1984; КуценкоС.А., 2004).

В системе диагностики риска развития поражений тканей внутренних органов при воздействии цитотоксических агентов прослеживаются сухцественные недостатки: выявляемые современными лабораторными и инструментальными методами изменения часто указывают на глубокий, мало обратимый характер повреждений тканей. В то же время имеются данные о перспективности определения содержания концентрации восстановленного глутатиона в клетках крови

при оценки тяжести отравлений различными токсикантами (Карпищенко А.И., 1997; Ливанов Г.А., 2001).

По мере накопления фактического материала становится очевидным, что роль нарушений системы глутатиона в патогенезе интоксикаций веществами с различными механизмами действия далеко не одинакова. Подтверждением этого может служить и низкая эффективность цитопротекторных препаратов, которые назначаются порой без должных на то показаний.

Таким образом, выявление закономерностей реагирования системы глутатиона на острое воздействие химических веществ с различными механизмами токсического действия является важной проблемой современной токсикологии, решение которой может способствовать существенному росту эффективности оказания помощи отравленным, благодаря целенаправленному совершенствованию средств фармакологической коррекции, точного определения показаний к их назначению.

В связи с этим целью нашего исследования явилось выявление основных закономерностей реакций системы глутатиона на острое воздействие химических веществ с различными механизмами токсического действия и на их основе разработка путей оптимизации диагностики и тактики оказания помощи отравленным при острых интоксикациях.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи исследования:

- изучить в динамике изменения системы глутатиона при однократном и повторном воздействии в разных дозах веществ с различными механизмами токсического действия (циклофосфан, 1,2-дихлорэтан, [3-хлорвинил-дихлорарсин, доксорубицин, паракват, фенилгидразин, тиопентал натрия, этанол, азалсптин, 1,1-диметилгидразин, диалкилпроизводное фосфорил-тиохолина) в ряде органов (печень, почки, сердце, головной мозг, эритроциты) экспериментальных животных;

- исследовать влияние на состояние системы глутатиона и сопряженных биохимических систем в тканях отравленных лабораторных животных принятых на снабжение и перспективных лекарственных средств различных фармакологических групп (антиоксиданты, антигипоксанты, ноотропные препараты, производные глутатиона и предшественники его синтеза, индукторы белкового синтеза, хелаторные агенты), предназначенных для защиты клеток от повреждающего действия ядов;

- определить возможность использования показателей состояния системы глутатиона в клетках периферической крови с целью диагностики степени тяжести интоксикации, эффективности проводимого лечения и прогноза исхода интоксикации.

Основные положения, выносимые на защиту: 1. Острые отравления ксенобиотиками с различными механизмами токсического действия вызывают существенные изменения состояния системы глутатиона в тканях отравленных животных. Их направленность, вы-

раженность и длительность определяются величиной введенной дозы токсиканта, его токсико-кинетическими и токсяко-динамическими параметрами (распределением в организме и преимущественным накоплением в тканях, особенностями метаболических превращений, наличием специфических механизмов токсического действия и т.д.), тканевыми особенностями обмена глутатиона.

2. В основе нарушений рбмена глутатиона в органах и тканях отравленных животных лежит реализация цитотоксических эффектов действия ксенобиотиков. Возможно существование ряда независимых самостоятельны): пусковых механизмов повреждения системы глутатиона и связанных с этим путей реализации цитотоксического действия токсикантов.

3. При разработке новых препаратов цитопротекции и изучении их эффективности в экспериментальных условиях и в клинике может использоваться оценка динамики изменений системы глутатиона в тканях различных органов отравленных животных и в эритроцитах пациентов.

4. Динамическое исследование показателей системы глутатиона в эритроцитах отравленных лиц может быть включено в систему лабораторной диагностики тяжести цитотоксического поражения тканей, эффективности проводимого лечения и прогноза исхода интоксикации.

Научная новизна. Впервые проведена комплексная оценка изменений состояния системы глутатиона и сопряженных биохимических процессов в различных тканях экспериментальных животных (печень, почки, сердце, легкие, головной мозг, эритроциты) при острых отравлениях токсикантами с различными механизмами токсического действия. Показана взаимосвязь между направленностью и глубиной изменений состояния естественной системы цитопротекции и выраженностью цитотоксических свойств ксенобиотиков — активация ферментов обмена глутатиона (ГП, ГР, Г-6-Ф-ДГ) на фоне обратимого снижения содержания ВГ на 20-40 % при острых интоксикациях регулятор-нымй ядами; уменьшение уровня ВГ в 2—10 раз ниже контроля, угнетение активности ферментов обмена глутатиона, срыва гомеостатических функций этой биохимической системы в тканях животных с острыми отравлениями веществами с выраженными цитотоксическими свойствами. Проведен анализ причин, вызывающих нарушения состояния системы глутатиона при острых отравлениях, выявлены механизмы развития данных изменений (истощение запасов ВГ при осуществлении глутатионовой конъюгации; повышенная наработка активных форм кислорода при относительной недостаточности резервов активности глутатионпероксидазы и ферментов восстановления глутатиона^ образование в организме свободнорадикальных промежуточных продуктов метаболизма ксенобиотиков и критическое снижение уровня восстановленного глутатиона; развитие нарушений энергетического метаболизма клеток и тканей; прямое повреждение ферментов обмена глутатиона или нарушения процессов их биосинтеза; критическое расходование ВГ на поддержание нативной структуры биологически значимых макромолекул) и их роль в формировании

»

!

цитотоксических эффектов действия широкого круга ксенобиотиков. Показана возможность использования показателей системы глутатиона в тканях отравленных животных при разработке новых направлений поиска средств фармакологической коррекции цитотоксических эффектов действия ксенобиотиков и оценке их эффективности. Обоснованы некоторые патогенетические направления цитопротекции (синтез антиоксидантов., антигипоксантов, комплексооб-разующих соединений, препаратов экзогенного глутатиона и предшественников его синтеза, индукторов белкового синтеза), связанные с восстановлением состояния обмена глутатиона. Покг.зана принципиальная возможность использования показателей системы глутатиона в эритроцитах пациентов для установления степени тяжести интоксикации, эффективности проводимого лечения и прогноза исхода интоксикации. Разработаны диагностические схемы использования показателей системы глутатиона в эритроцитах пациентов с острыми отравлениями седативно-гиннотическими препаратами, включающие в себя динамическое определение (в течение 1-3 суток) содержания восстановленного глутатиона, сульфгидрильных групп белков, малонового диальдегида, активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, глутатионредуктазы, глутатион-8-трансферазы, глутатионпероксидазы и каталазы.

Практическая значимость работы заключается в том, что полученные в ходе диссертационного исследования данные о динамике изменений состояния системы глутатиона в тканях человека и лабораторных животных в условиях острых отравлений ксенобиотиками с различными механизмами токсического действия позволяют сформулировать представление об общих механизмах цитотоксического действия ксенобиотиков, связанных с повреждениями указанной биохимической системы. Представления о механизмах нарушений состояния естественной системы цитопротекции могут быть положены в основу поиска новых лекарственных препаратов (антиоксидантов, антигипоксантов, комплексообразующих соединений, препаратов экзогенного глутатиона, индукторов белкового синтеза), обладающих цигопротекторными свойствами. Оценка состояния системы глутатиона в биосредах пациентов может использоваться в качестве метода установления степени тяжести интоксикации, эффективности проводимого лечения и прогноза течения интоксикации седатив-н'о-гипнотическими препаратами, цитостатиками (циклофосфан, докс.оруби-цин). Определение параметров системы глутатиона и сопряженных биохимических процессов (концентрация восстановленного глутатиона, сульфгидрильных групп белков, малонового диальдегида, диеновых конъюгат, активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, глутатионре.пуктазы, глутатионпероксидазы, глутатион-Б-трансферазы, каталазы) может использоваться при проведении доклинических и клинических испытаний новых фармакологических препаратов для скриниговой оценки их цитопротекторкых свойств.

Реализация результатов исследования. Рекомендации, разработанные на основании полученных в ходе диссертационного исследования данных, используются в научной работе и учебном процессе на кафедре военной токси-

кологии и медицинской защиты и кафедре клинической биохимии и лабораторной диагностики Военно-медицинской академии, в лечебно-диагностическом процессе в Центре лечения острых отравлений Научно-исследовательского института Скорой Помощи им. И.И.Джанелидзе, были учтены при разработке и внедрении в клиническую практику отечественных препаратов «Реамберин», «Цитофлавин», «Мексидол».

В процессе выполнения диссертационного исследования подано и принято к использованию в Военно-медицинской академии 14 рационализаторских предложений.

Апробация работы проведена на национальных днях лабораторной медицины России (Москва, 1997, 2002), на международном симпозиуме "Биоан-тиоксидант" (Тюмень, 1997), на V научно-практической конференции по созданию и апробации новых лекарственных средств «Лекарства - человеку» (Харьков, 1998), на международной конференции "Медицинские последствия экстремальных воздействий на организм» (Санкт-Петербург, 2000), на международном симпозиуме «Здоровье и химическая безопасность на пороге XXI века» (Санкт-Петербург, 2000), на юбилейной научной конференции с международным участием, посвященной 140-летию кафедры душевных и нервных болезней Военно-медицинской академии (Санкт-Петербург, 2000), на Российской научной конференции «Медицинские аспекты радиационной и химической безопасности» (Санкт-Петербург, 2001), на VIII, IX и X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2001, 2002, 2003), на Всероссийской научной конференции «Биохимия - Медицине» (Санкт-Петербург, 2002), на III съезде Российского биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), на международном симпозиуме «Медицинские и биологические проблемы, связанные с уничтожением химического оружия» (Волгоград, 2003), на 2-ом съезде токсикологов России (Москва, 2003), на Российской научной конференции «Медико-биологические проблемы противолучевой и противохимической защиты» (Санкт-Петербург, 2004), на Российском национальном конгрессе кардиологов (Томск, 2004), на Всероссийской научной конференции «Фармакотерапия гипоксии и ее последствий при критических состояниях» (Санкт-Петербург, 2004), на XXXVI World Congress on Military Medicine (Санкт-Петербург, 2005).

Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 88 работ, в том числе 27 статей в отечественных научных журналах.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, 7 глав, включающих обзор литературы, общую характеристику материалов и методов исследования, 4 глав полученных результатов, их обсуждение, заключение и выводы. Работа изложена на 451 странице машинописного текста, содержит 7 рисунков, 145 таблиц (23 в тексте и 122 в приложении) и 1 схему. Список литературы состоит из 454 источников, из них 194 отечественных И 260 иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для достижения цели исследования и решения поставленных задач работа проводилась по двум основным направлениям - экспериментальному и

■ клиническому.

Таблица 1

_Схема проведения экспериментального исследования___

Токсиканты Дозы Сроки исследования Фармакологические препараты Кол-во особей

1 Дихлорэтан 2,5 ЬЛЭзо, 0,5 1ЛЭ50 1,5,3,6, 12, 24 ч Аскорбиновая кислота, сук-цинат натрия, этомерзол 333

2 Циклофосфан 2 ЬО50, иэ50, 0,3 1Л550 3,6, 12, 24 ч Изопропиловый эфир глута-' тиона, мексидол, ремаксол, трисан 240

3 Паракват ЬО50, 0,3 ЬО:о 3, 12, 24 ч; 3, 5 сут - 110

4 Доксорубицин ЬБзо, 0,3 1Л)50 3,6,12,24 ч; 3,5,7 суг, повторно Ацетилцистеин, изопропил-глутатион, кардиоксан, мексидол, цитофлавин 360

5 Фенилгидразин ьв50, 0,3 ЬБ50 1,3,6, 24 ч - 80

6 р-хлорвинил-дихлорарсин иэ50, 0,3 иэ5„ 3,6, 12, 24 ч, 3 сут Унитиол 130

1 Тиопентал г натрия ьо50, 0,3 1£>5о 3,6, 12 ч Аскорбиновая кислота, пир-ацетам, цитофлавин, кислород 460

8 Этанол и^о, 0,3 1ЛЭ50 3,6, 12 ч Цитофлавин

9 Азалептин ЬБзо, 0,3 ЬБ5О 3,6, 12 ч Цитофлавин

10 Фосфорил-тиохолин 0,75 1ЛЭ50, 0,3 ЬБ50 3,6,.12, 24 ч - 90

11 1,1-димешл-щдразин 0,3 1Л)50 1,3,6, 24 ч - 80

Экспериментальный раздел работы выполнен на 1883 белых беспородных крысах-самцах массой 180-220 г из питомника РАМН «Рапполово», общая схема проведения которого представлена в табл. 1.

Пути, способы и значения и}50 изучаемых токсикантов, полученные с использованием «табличного экспресс-метода» по В.Б.Прозоровскому (1994), приведены в табл. 2.

Таблица 2;

Способы, пути введения и значения ЬР50 исследуемых токсикантов_

Токсикант Способ и пути введения ld50

1 Дихлорэтан Внутрижелудочно без разведения с использованием зонда 600 мг/кг

2 Циклофосфан Внутрибрюшинно в виде 4 % водного раствора 200 мг/кг

3 Паракват Внутрибрюшинно в виде 5 % водного раствора 27,6 мг/кг

4 Доксорубицин Внутривенно в виде 0,2 % вводного раствора 7,47 мг/кг

5 Фенилгидразин Внутрибрюшинно в виде 5 % раствора (на 0,1 М калий-фосфатном буфере рН 7,4) 170 мг/кг

6 ß-хлорвинилдихлор-арсин Внутрибрюшинно в виде 0,15 % раствора (на 0,5 % растворе этанола) 7,14 мг/кг

7 Тиопентал натрия Внутрибрюшинно в виде 1 % водного раствора 75 мг/кг

8 Этанол Внутрибрюшинно в виде 33 % водного раствора 4,76 г/кг

9 Азалептин Внутрижелудочно с использованием зонда в виде 2 % водного раствора 200 мг/кг

10 Фосфорилтиохолин Внутрибрюшинно в виде 0,0003 % раствора (на 0,5 % растворе этанола) 18,2 мкг/кг

11 1,1 -диметилгидразин Внутрибрюшинно в виде 5 % раствора (на 0,1 М калий-фосфатном буфере рН 7,4) 104,5 мг/кг

Оценку влияния фармакологических препаратов на состояние системы гдутатиона в тканях отравленных животных проводили в условиях их внутри-брюшинного введения через 30 мин после применения ксенобиотиков в следующих дозах: аскорбиновая кислота - в виде 5 % официнального раствора, для инъекций (60 мг/кг), ацетилцистеин - в виде 3 % официнального раствора (150 мг/кг), изопропиловый эфир глутатиона - в виде 5 % водного раствора (500 мг/кг), кардиоксан - в виде 0,8 % раствора (на растворе Хартмана) (48 мг/кг), мексидол - в виде"1 % водного раствора (50 мг/кг), пирацетам - в виде 20 % официнального раствора (100 мг/кг), ремаксол - в виде 10 % водного раствора (по янтарной кислоте) (118 мг/кг), сукцинат натрия - в виде 7,5 % раствора (на физиологическом растворе) (150 мг/кг), трисан - виде 1 % официнального раствора (15 мг/кг), унитиол - в виде 5 % официнального раствора (100 мг/кг), цитофлавин - в виде 10 % официнального раствора (118 мг/кг), это -мерзол - в виде 2,5 % водного раствора (25 мг/кг). Оксигенотерапию отравленным лабораторным животным проводили путем помещения крыс в количестве 20 особей в камеру объемом 0,5 м3 с непрерывной подачей кисяородо-воздушной смеси с содержанием 02 в концентрации 40-60 об %.

Таблица 3

Характеристика исследуемых групп пациентов и доноров_

Показатель Здоровые доноры Выжившие Умершие

Муж. Жен. Муж. Жен. Муж. Жен.

Кол-во чел 37 28 23 21 6 4

Возраст, лет 28,5 ±1,9 28,7 ±23 31,912,2 32,4 ±2,5 29,0 ±3,4 41,5 ±93

§ € Здоров (а) Острое ток опиатами-12, азалсгпином-2, барбшура-тами-1, амитрип-тилином—2, этанолом-3, смесью препаратов- 3 елое отравление опиатами-3, азалегпином-6, барбитуратами-1, амилрити-лином-3, смесью препаратов- 8 (вещесгво/колич опиатами-4, азалепгином-1, смесью препаратов- 1 гсгво человек): азалегаином-2, барбигурагами-2

Длит. ИВЛ, часы Нет 33,9+53*" 32,6+4,9*" 138,0 + 61,9*" 88,0 + 8,0**

К Н Нет Традиционная -12 человек (27,3%); С использованием препаратов янтарной кислоты - 32 человека (72,7%) Традиционная - 5 человек (50,0%); С использованием препаратов янтарной кислоты - 5 человек (50,0%)

* - достоверность отличия р<0,05 при сравнении с показателями группы здоровых доноров, "-достоверность отличия р<0,05 при сравнении показателей групп выживших и умерших пациентов.

В процессе клинического исследования проводили оценку влияния острых тяжелых отравлений препаратами седативно-гипнотического действия на состояние системы глутатиона и динамику интенсивности процессов перекис-ного окисления липидов в эритроцитах пациентов в различные сроки нахождения в стационаре (1, 2 и 3 сутки). Исследование проводили на базе отделения реанимации Центра лечения острых отравлений НИИ Скорой помощи имени И.И.Джанелидзе в процессе лечения 54 пациентов (29 мужчин и 25 женщин), поступивших с острыми отравлениями в тяжелом и крайне тяжелом состоянии (табл. 3). Все больные находились в отделении реанимации в связи с нарушением витальных функций: угнетением сознания до комы II—III степени и нарушением функции внешнего дыхания. Всем больным проводилась

ИВЛ. Возраст обследованных пациентов находился в диапазоне от 16 до 63 лет. Летальность составила 18,5 %.

Из исследования исключались больные с закрытыми и открытыми черепно-мозговыми травмами, с наличием хронической неврологической патологии, с наличием искусственного водителя ритма, с гиперчувствительностью к препаратам фармакологической коррекции. Клиническая характеристика пациентов приведена в табл. 3.

В процессе лечения пациенты получали различное терапевтическое пособие. Наряду с группой больных, получавших интенсивную терапию по традиционной схеме, были выделены 2 группы пациентов, лечение которых дополнялось препаратами на основе янтарной кислоты: в I группе отравленных — инфузия реамберина; во II группе - инфузия цитофлавина. 1,5 % Раствор ре-амберина вводили 1 раз в сутки внутривенно капельно со скоростью 3—4 мл/мин в объеме 400 мл в течение всего периода пребывания в реанимационном отделении. Цитофлавин (10% раствор по янтарной кислоте) в объеме 10 мл растворяли в 400 мл 5-10% раствора глюкозы и вводили внутривенно капельно со скоростью 3-4 мл/мин в течение всего периода пребывания в реанимационном отделении. Назначение препаратов осуществляли методом случайной выборки.

При выполнении клинического раздела работы анализировали анамнез заболевания, медицинскую документацию догоспитального этапа, данные объективного исследования при поступлении в лечебное учреждение и в динамике, результаты общеклинического обследования (анализы крови, мочи, биохимическое исследование крови, ЭКГ, данные рентгенологического исследования).

Контрольную' группу исследования составили здоровые доноры (37 мужчин и 28 женщин) в возрасте от 19 до 39 лет.

У экспериментальных животных в тканях головного мозга, печени, почек и эритроцитах, а также в эритроцитах пациентов определяли содержание восстановленного глутатиона (ВГ), уровень свободных сульфгидрильных групп белков (СГ) и активность ферментов системы глутатиона и сопряженных систем - глутатионрецуктазы (ГР), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-Ф-ДГ), глутатионпероксидазы (ГП) и каталазы, а в материалах, полученных от животных, и глутатион-8-трансферазы (ГТ). Для оценки интенсивности процессов перекиспого окисления липидов (ПОЛ) в эритроцитах человека и тканях животных определяли концентрацию малонового диальдегида (МДА), в тканях животных, кроме того, и содержание диеновых кокъюгат (ДК).

Концентрацию ВГ определяли методом ОХ.ЕПтап (1959) в нашей модификации, заключавшейся в осаждении белка 20% раствором сульфосалици-ловой кислоты. Содержание О Г определяли согласно методике О.Ве11ото et а1. (1990). Определение концентрации ДК проводили по методике И.Д.Стальной (1977). Концентрацию МДА определяли по методу М.исЫуата (1978). Определение активности ферментов системы глутатиона проводили в гемолизате

эритроцитов или в цитозольной фракции, полученной после центрифугирования гомогенатов тканей в течение часа при 150000 g на ультрацентрифуге L8-M («Весктап», США). .Активность глутатионредуктазы определяли по методу I.Garlberg, B.Mannervik (1985), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы ■- по A.Kornberg et al. (1955), глутатионпероксидазы - по методу А.Н.Гавриловой и Н.Ф.Хмары (1986) с использованием в качестве субстрата гидроперекиси трет-бутила, каталазы - по М.А.Королюку (1988), глутатйон-8-трансферазы - методом W.H.Habig, W.BJakoby (1981). Расчет активности ферментов производили на грамм белка или гемоглобина (в гемолизате эритроцитов). Концентрацию белка определяли методом Лоури в модификации G.L.Peterson (1977),'гемоглобина - гемиглобинцианидным методом.

Влияние интоксикации веществами седативно-гипнотического действия и использовавшихся средств фармакологической коррекции на развитие и тяжесть синдрома полиорганной недостаточности, а также на процессы углеводного обмена в органах и тканях оценивали по следующим биохимическим показателям, определяемым в сыворотке крови лабораторных животных: состояние клеточной мембраны гепатоцита - по активности аспартатаминотрансфе-разы (ACT) и аланинаминотрансферазы (АЛТ); мочевыделительная функция почек и состояние азотистого обмена - по концентрации креатинина и мочевины; состояние углеводного обмена - по содержанию глюкозы. Активность аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы определяли по методу S.Reitman, S.Frankel в модификации В.В.Меньшикова (1987). Концентрацию креатинина в сыворотке крови определяли псевдокинетическим двухточечным методом на основе реакции Яффе без депротеинизации по A.R.Butler (1976). Концентрацию мочевины в сыворотке крови определяли ферментативным уреазным-глутаматдегидрогеназным кинетическим методом по E.J.Sampson et al. (1980). Концентрацию глюкозы в сыворотке крови лабораторных животных определяли ферментативным гексокиназным-глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ-ным методом по J.W.Neese (1982).

Статистическую обработку полученных результатов проводили на персональном компьютере с помощью пакета прикладных программ «Microsoft Excel». В каждой группе рассчитывали средние значения и ошибку среднего. Достоверность различий с соответствующей контрольной группой оценивали по t—критерию Стьюдента. Приведенные в тексте и таблицах значения представляли в виде Хср ±

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние острых отравлений на состояние системы глутатиона в тканях лабораторных животных

Проведенное экспериментальное исследование, направленное на изучение состояния системы глутатиона и сопряженных биохимических процессов

в различных тканях лабораторных животных при острых отравлениях веществами с различными механизмами токсического действия и выраженностью цитотоксических свойств подтвердили мнение о том, что указанной биохимической системе принадлежит одно из ведущих мест в механизмах естественной цитопротекции, а нарушения ее функционирования приобретают существенное значение в патогенезе реализации цитотоксических эффектов. В связи с этим изучение состояния системы глутатиона в условиях острых интоксикаций ксенобиотиками, обладающими цитотоксическими свойствами, становится особенно важным, так как новые подходы к профилактике и лечению цитотоксических поражений тканей ряда органов могут быть основаны на использовании препаратов, нормализующих состояние естественной системы цитопротекции - системы глутатиона.

В то же время существенной сложностью при анализе полученных данных явилось то, что на направленность и глубину изменений системы глутатиона существенно влияли параметры токсиканта (дозовая нагрузка, временной фактор, токсикокинетические и токсикодинамические особенности), характер исследуемой ткани и тканевые особенности обмена глутатиона.

Выполненное исследование позволило установить, что глубина нарушений системы глутатиона в тканях «критического органа» (т.е. того органа, где наиболее ярко проявляются морфологические и функциональные нарушения, а также специфические эффекты действия токсикантов) в условиях острых интоксикаций в полулетальных дозах соответствует выраженности цитотоксических эффектов действия у достаточно широкого круга ксенобиотиков (табл. 4).

При этом интегральным показателем состояния обмена глутатиона в тканях, с учетом сложности и порой даже разнонаправленности всех происходящих изменений изучаемой биохимической системы, может служить степень снижения концентрации восстановленной формы глутатиона, так как система глутатиона является специфической саморегулирующейся биохимической системой, показателем деятельности которой может служить поддержание равновесия между окисленной и восстановленной формами глутатиона (Ку-линский В.И., 1990; Mannervik В., 1989; Meister А., 1983).

Распределение токсикантов по степени влияния на уровень ВГ в тканях (от доксорубицина до фосфорилтиохолина) принципиально совпадало с имеющимися представлениями о выраженности у них цитотоксических свойств (Куценко С.А., 2004). Так, максимальное по глубине снижение концентрации ВГ отмечалось в тканях сердца при отравлении кардиотоксическим агентом доксоруб'ицином (более чем 10-кратное), в тканях печени - при интоксикациях циклофосфаном и дихлорэтаном (в 3,38 и 3,82 раза, соответственно), в тканях легких - при отравлении паракватом (в 2,81 раза). Таким образом, наиболее существенные нарушения обмена глутатиона отмечались в тех тканях, которые максимально повреждаются при действии классических цитотоксикантов. При этом сроки максимального снижения концентрации восстановленной формы глутатиона в «критической» ткани в условиях отрав-

лений ксенобиотиками с высокой цитотоксичноетыо (циклофосфан, дихлорэтан, доксорубицин, паракват, р-хлорвинилдихлорарсин), даже несмотря на временные особенности их токсического действия, совпадали с моментом реализацией их гепато-, пульмоно- или кардиотоксических эффектов. При интоксикации доксорубицином снижение массового коэффициента сердца, развитие отеков у лабораторных животных и наиболее выраженное снижение уровня ВГ происходило на 5 сут, при отравлении пара.кватом наиболее отчетливые морфологические (макро- и микроскопические) признаки отека легких и нарушения обмена глутатиона - на 3 сут, при интоксикации ЦФ гистологические изменения тканей печени и снижение содержания трипептида в этом органе -в первые 3-12 ч.

Таблица 4

Влияние острых интоксикаций ксенобиотиками в дозах Ы350 на

уровень восстановленного глутатиона в «критических» тканях

Токсикант Орган Максимальное снижение Сроки проявления специфических эффектов интоксикации

Сроки Выраженность Длительность

Доксорубицин Сердце 5 сут 90,4 % > 7 сут 5 сут

Циклофосфан Печень Зч 70,4 % >24 ч < 1 сут

1,2-дихлорэтан Печень 3 ч 73,8 % 24 ч 20 мин

Паракват Легкие 3 ч 64,3 % 3 сут < 1 сут

Р-хлорвинилдихлорарсин Печень 3 ч 44,1 % 12 ч < 1 ч

Фенилгидразин Эритроциты 1 ч 3 ч 59,1 % >24 ч 1 ч

Тиопентал натрия Мозг 54,2 % 24 ч 10 мин

Этанол Печень 3 ч 54,5 % 24 ч 20 мин

Мозг 3 ч 40,5 %

Азалептин Мозг 3 ч 24,5 % 12ч 1 ч

1,1-диметилгидразин Печень 3 ч 22,2 % 6ч 4 ч

Фосфорилтиохолин Почки 3 ч 19,9% 24 ч 10 мин

Минимальное влияние на уровень глутатиона, напротив, отмечалось при острых интоксикациях медиаторными ядами и веществами, вызывающих угнетение функций ЦНС. Степень снижения концентрации ВГ' в тканях лабораторных животных при интоксикации этими агентами, как правило, не превышала 20-30 %, т.е. того уровня, который, по мнению ряда авторов, соответствует изменениям, характерным для адаптивного ответа со стороны системы глутатиона. Более того, умеренное снижение уровня ВГ при отравлении представителями этой группы (азалептин, 1,1-диметилгидразин, ФСХ) происходило существенно позднее (через 3-12 ч) сроков (от 10 мин до 3-4 ч) возникновения специфических эффектов действия токсикантов (кома, судороги и т.д.).

Все это свидетельствует о том, что нарушения системы глутатиоиа при отравлениях исследуемыми нейротоксикантами являлись вторичными вследствие нарушений регуляторных. функций ЦНС и последующих расстройств метаболизма ряда тканей, в первую очередь головного мозга.

Таким образом, повреждения системы глутатиона имеют различное значение в патогенезе острых отравлений ксенобиотиками с отличающимися механизмами токсического действия: они достаточно глубоко выражены и имеют патогенетическое значение в повреждении клеток при интоксикации ядами, обладающими высокой цитотоксичностъю. Все это позволяет судить об изменениях состояния системы глутатиона как о специфических, связанных с ответом организма на действие аг ентов, обладающих цитотоксическими свойствами. По-видимому, мнение о том, что повреждения системы глутатиона являются неспецифическими сдвигами, происходящими в условиях острого токсического воздействия практически любого ксенобиотика неверно, так как основывается чаще всего на определении ограниченного числа параметров системы (например, уровня восстановленного глутатиона или концентрации продуктов ПОЛ).

, Оценка влияния токсикантов только на уровень ВГ в тканях не может дать ответ на целый ряд практически важных (с точки зрения формирования подходов к поиску цитопротекторов и диагностики тяжести повреждения тканей) вопросов: о наличии нарушений состояния системы глутатиона и механизмах их реализации, о взаимосвязи этих сдвигов с пусковыми процессами реализации цитотоксических эффектов действия ксенобиотиков.

Так, не смотря на различия специфических механизмов действия токсикантов, существует достаточно небольшое количество патогенетических механизмов поражения й гибели клеток:

1. активация свободнорадикальных процессов в клетке;

2. повреждающее действие избытка ионов Са+2 в клетке;

3. повреждения клеточных мембран;

4. первичное нарушение процессов биоэнергетики;

5. нарушения процессов синтеза белка и клеточного деления.

Проведенный анализ данных литературы указывает на взаимосвязь механизмов реализации цитотоксических эффектов и повреждений системы глутатиона. В свою очередь глубокое исследование ее состояния, связанное с изучением динамики изменений активности ферментов обмена глутатиона (ГР, ГП, Г-б-Ф-ДГ, ГТ) и сопряженных биохимических процессоз (интенсивности протекания процессов ПОЛ, состояния тиол-дисульфидного равновесия, активности каталазы) позволило выявить несколько механизмов реализации ци-тотоксического действия ксенобиотиков., связанных с нарушениями указанной биохимической системы (рис. 1):

1. Истощение запасов восстановленного глутатиона в результате его необратимого расходования при осуществлении глутатионовой конъюгации ксенобиотиков и (или) их метаболитов в связи с ограниченными возможностя-

ми клеток синтеза глутатиона de novo. По-видимому, этот механизм является одним из наиболее важных при реализации гепато- и нефротоксического действия изучаемых в нашем исследовании таких токсикантов, как дихлорэтан и циклофосфан, метаболиты которых конъюгируют с глутатионом;

Ксенобиотики

Так, в наиболее повреждаемых ДХЭ тканях печени после его введения в дозе 1Л>50 наиболее ранним-.(уже через 3 ч) и ярким показателем нарушений обмена глутатиона стало падение концентрации ВГ в 3,82 раза (р<0,05). При этом остальные изменения, указывающие на повреждения естественной системы цитопротекции, были, как правило, менее выраженными и проявлялись в более поздние сроки (через 6-12 ч) - снижение содержания белковых тиолов на 27,1 %; повышение уровня ДК в 1,48 раза, а МДА - в 3,87 раза; угнетение активности Г-6-Ф-ДГ и ГР в 1,26 и 1,66 раза, соответственно; снижение активности ГП и ГТ на 24,2 % и 14,3 %, соответственно. Примечательно, что и при

использовании ДХЭ в дозе 0,3 г/кг в тканях печени отравленных животных происходило достаточно существенное (в 3,62 раза ниже нормы) хотя и обратимое снижение содержания восстановленной формы трипептида, в то время как в изменениях активности большинства ферментов обмена глутатиона преобладали адаптивные сдвиги.

2. Интенсивная наработка активных форм кислорода (АФК) в результате метаболизма ксенобиотиков. Непременным условием действия цитохрома Р450, принимающего активное участие в метаболизме широкого круга токсикантов, является активации кислорода. Повышенная наработка АФК, ок-сидативное повреждение ими ряда липидных, белковых и нуклеиновых структур клетки изначально приводит к обратимому расходованию восстановленного глутатиона, как субстрата глутатионпероксидазной реакции, и переходу его в окисленную форму. Однако при более длительной или более мощной прооксидантной нагрузке возможно истощение резервов системы гес!-ох-циклирования глутатиона (относительный дефицит, а затем и падение активности глутатионредуктазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы вследствие расходования глюкозо-6-фосфата и снижения уровня НАДФН), а затем и уменьшение глутатионпероксидазной активности. Все это служит основой для перехода оксидативного стресса в декомпенсированную фазу в связи с невозможностью поддержания необходимого тканевого уровня восстановленного глутатиона. В нашем исследование это' положение нашло отражение в виде воздействия на активность ферментов системы глутатиона при интоксикации такими метаболизируемыми цитохромом Р450 токсикантами, как дихлорэтан, циклофосфан, паракват. Известно, что в организме существуют и другие ферментные системы, активирующие кислород при метаболизме ксенобиотиков (например, ксантиноксидаза);

Наиболее глубокие изменения состояния системы глутатиона при острых интоксикациях циклофосфаном отмечались в тканях печени крыс (органа с максимальной активностью микросомального окисления). Так, введение ЦФ в дозе 1ЛЭ5о вызывало падение уровня ВГ в тканях этого органа в 3,38 раза (р<0,05) ниже контроля уже через 3 ч, происходившее на фоне повышения концентрации МДА и ДК в 1,86 и 2,57 раза, соответственно, и падения активности ГП в 2,31 раза, каталазы - в 1,44 раза. Несмотря на наличие алкилирую-щих свойства у этого токсиканта максимальное снижение уровня СГ происходило лишь через 24 ч - на 28,1 % (р<0,05) ниже контрольных значений. Глубина изменений других показателей системы глутатиона (по "сравнению данными об активации свободнорадикальных процессов) также была менее выраженной: в 1,51 раза снижалась активность Г-6-Ф-ДГ, а активность ГР даже возрастала на 38,3 %, также как и ГТ - в 1,30 раза выше уровня контроля.

3. Третьей возможной причиной повреждения системы глутатиона является образование в организме свободнорадикальных промежуточных продуктов метаболизма ксенобиотиков (например, карбониевого иона, глутатион-эписульфония или сульфоний катиона, соответственно, в условиях токсиче-

ского воздействия ДХЭ, ЦФ, ипритов, а также активной формы параквата), что также может привести к критическому снижению уровня восстановленного' глутатиона при относительном дефиците резервов глутатионредук-тазной и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной активности (факторов, лимитирующих обмен глутатиона;

Одним из наиболее существенных из выявленных изменений при острых отравлениях паракватом явилось выраженное накопление продуктов ПОЛ в тканях легких отравленных животных, что подтверждает основную роль образующихся АФК в реализации пульмонотоксичес ких эффектов действия этого токсиканта. Так, после его введения в среднесмертельной дозе отмечалась выраженная и длительная активация липопероксидации в тканях легких, при этом содержание ДК в 1,55 раза (р<0,05) через 1 сут, а МДА в 1,97 раза (р<0,05) через 5 сут максимально превышало контрольный уровень. Накопление продуктов ПОЛ в тканях этого органа происходило даже на фоне первоначального, но обратимого повышения (р<0,05) активности как ферментов антирадикальной защиты (активность ГП, ГТ, катаяазы возрастала в 1,98, 1,60 и 1,94 раза, соответственно), так и ферментов восстановления глутатиона из окисленной формы (активность Г-6-Ф-ДГ и ГР увеличивалась в 1,56 и 1,91 раза); сохранения на близком к физиологическому уровне показателя тиол-дисульфидного обмена (отмечалось умеренное обратимое снижение концентрации СГ на 18,7 %). Тем не менее, «платой» за повышенную прооксидант-ную нагрузку на систему цитопротекции в тканях легких, связанную с образованием свободнорадикальпых продуктов метаболизма параквата, стало достоверное снижение уровня ВГ в 2,80 раза ниже контрольных значений. 4. В связи со значительной энергоемкостью процессов поддержания высокого уровня ВГ в тканях причиной истощения резервов системы цитопротекции в условиях токсического воздействия могут явиться и нарушения энергетического метаболизма клетки. Даже в физиологических условиях на поддержание высокого уровня и скорости обмена глутатиона в гепатоците расходуется до 30 % энергии макроэргов, а в таких клетках, как нейроны (расходующих более 50 % АТФ на поддержание ионных градиентов) или эритроциты (не обладающих системой митохондриального дыхания), интенсивность и концентрация ВГ на порядок более низкие (Кулинский В.И., 1990). Обмен глутатиона в тканях (как за счет биосинтеза de novo, так и за счет восстановления из окисленной формы) является энергоемким процессом и требует, по крайней мере, затрат 3 молекул АТФ на 1 молекулу субстрата. Кроме того, развитие различных форм гипоксии закономерно приводит к повышенной наработке АФК и активации свободнорадикальных процессов, связанной с целым рядом причин: переходом фермента обмена пуриновых оснований КСО (ксантиноксидазы) из Д-формы в О-форму и наработкой супероксидного иона этим энзимом (Антонов В.Г., 1997); утечкой АФК с цитохромоксидазы при формировании тканевой формы гипоксии; нарушениями процессов не только доставки кислорода тканям, но и его утилиза-

ции при тяжелых формах гемической, дыхательной или циркуляторной гипоксии (Лузиков В.Н., 1980; Лукьянова Л.Д. , 1987); снижение уровня у-аминобутирата, выполняющего антиоксидантные функции. Все это приводит к увеличению концентрации кислорода в зоне его свободнорадикаль-пых реакций. Гиперактивация свободнорадикального окисления и ПОЛ ми-тохондриальной мембраны приводят к усугублению угнетения клеточного дыхания, развитию энергодефицитных состояний и может способствовать формированию патогенетического порочного круга. По-видимому, эти изменения явились основой нарушений состояния системы глутатиона, в первую очередь, в тканях головного мозга и в эритроцитах при острых интоксикациях седативно-гипнотическими препаратами, ФСХ, НДМГ, а также в тканях внутренних органов при отравлениях ФГ и паракватом.

После введения параквата в полулегальной дозе на фоне развития токсического отека легких (через 3-5 сут) достаточно глубокое снижение уровня ВГ (р<0,05).определялось не только в легких, по и в остальных исследуемых тканях - в 1,39 раза (печень), в 1,36 раза (почки), в 1,35 раза (головной мозг) и в 1,76 раза (эритроциты), соответственно, ниже контрольных значений. Причиной данных изменений стало выраженное снижение активности ферментов, ответственных за восстановление глутатиона и сохранение, таким образом, нормальной концентрации ВГ - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и глутатион-редуктазы. Она, соответственно, снижалась на 32,5 % и 18,1 % (в печени), на 29,0 % и 13,5 % (в почках), на 27,1 % и 15,2 % (в эритроцитах), что могло быть связано с истощением пула НАДФ-Н в условиях развития дыхательной гипоксии и истощения энергетических ресурсов системы защиты клетки.

Влияние глубокой гемической гипоксии, вызванной интоксикацией фенил-гидразином в полулетальной дозе, выразилось в виде достоверного (р<0,05) снижения содержания ВГ на 20,1% в тканях печени, 31,6 % - почек, в тканях головного мозга даже в 2,18 раза. Введение ФГ в полулетальной дозе сопровождалось выраженным образованием мет гемоглобина (—50 %) и развитием г емической гипоксии, признаками которой может служить и развитие судорог у части животных. Следствием энергодефицита тканей могло стать и снижение интенсивности обмена глутатиона. Наиболее отчетливо эти изменения проявились в тканях головного мозга, более умеренно в почках и печени. По-видимому, показателями реализации цитотоксических эффектов воздействия гипоксии на ткань головного мозга может служить не только более чем 2-х кратное снижение уровня ВГ и соответствующий рост концентрации МДА, но и достоверное снижение активности ГР на 20,8 % и выраженное снижение (р<0,05) активности ферментов антирадикальной защиты (ГТ - в 1,36 раза, ГГ1 - в 1,77 раза, каталазы - в 2,27 раза ниже контрольных значений).

5. Нарушения состояния естественной системы цитопротекции в условиях острого токсического воздействия могут быть вызваны снижением активности ряда ферментов обмена глутатиона в результате прямого повреждения ксенобиотиками, их метаболитами, свободными радикалами белковых

молекул или грубых расстройств процессов биосинтеза энзимов этой биохимической системы. По-видимому, наиболее ярко механизм повреждения системы глутатиона проявляется при нарушениях активности ГР и Г-6-Ф-ДГ (лимитирующих скорость обмена глутатиона в тканях) в условиях токсического действия ряда цитостатиков. В нашем исследовании примером реализации такого механизма повреждения системы глутатиона стало токсическое воздействие доксорубицина на активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы;

Особенностью нарушений состояния системы глутатиона в тканях сердца при острых интоксикациях доксорубицином явилась отстроченность выявленных изменений (через 5-7 сут после введения токсиканта в полулетальной дозе). При этом глубокое снижение уровня ВГ (с максимумом через 7 сут — в 10,4 раза (р<0,05) ниже уровня контроля) явилось следствием повреждающего воздействия ксенобиотика на ферменты восстановления глутатиона из окисленной формы (в большей степени на Г-б-Ф-ДГ, которая снижалась в 3,04 раза) и стало причиной срыва антирадикальной функции системы глутатиона и повторной активации свободнорадикальных процессов (через 7 сут концентрация МДА в 1,90 раза превышала контрольные значения).

6. Еще одним механизмом повреждения системы глутатиона может явиться критическое расходование ВГ в процессах репарации поврежденных токсикантами и их метаболитами биомолекул (белков, азотистых оснований нуклеиновых кислот, липидов). При этом истощение системы цитопротекции может происходить как в отдельных тканях, "так и даже типах клеток. А примерами реализации такого механизма могут служить факты выраженного снижения содержания ВГ в эритроцитах в результате его расходования на восстановление метгемоглобина при действии метгемоглобинобразова-теля фенилгидразина или в тканях печени животных, .отравленных Р-хлорвинилдихлорарсином вследствие утилизации глутатиона в процессах репарации тиоловых групп ферментов и липоевой кислоты.

Так, выраженность нарушений системы глутатиона, в первую очередь глубина снижения уровня ВГ, в тканях животных после введения (5-хлор-винилдихлорарсина достоверно коррелировала с изменениями уровня СГ, с которыми взаимодействует токсикант. При интоксикации ХВА в полулетальной дозе содержание глутатиона достоверно (р<0,05) снижалось на 44,1 % (печень), 31,3 % (почки), 53,9 % (эритроциты) и 18,0 % (головной мозг), при этом практически совпадая как по срокам, так и по глубине с падением уровня белковых тиолов (на 41,4 %, 31,3 %, 34,2 % и 10,0. % ниже показателей контрольных животных).

Проведенное исследование состояния системы глутатиона в эритроцитах животных при отравлении фенилгидразином указывает на то, что механизм повреждения системы также может быть связан со снижением уровня ВГ, расходующегося на восстановление метгемоглобина. Одним из наиболее ранних (через 3 ч) и ярких признаков интоксикации при отравлении этим агентом явилось

снижение содержание восстановленной формы глутатиона в эритроцитах отравленных крыс - в 2,45 раза (р<0,05) ниже контрольных значений после введения полулетальной дозы. Логичным будет предположить, что поддержание необходимого уровня ВГ будет требовать существенного напряжения со стороны системы глутатиона и большого расхода макроэргов, что не возможно при нарушении обменных процессов в клетках красной крови. Поэтому критическое снижение концентрации глутатиона в эритроцитах при интоксикации ФГ могло явиться основой его ярко выраженных гемолитических свойств.

По-видимому, в условиях токсического воздействия некоторых цитоток-сикантов могут быть задействованы не только один, но два и более механизма истощения системы глутатиона. Например, в условиях интоксикации хлорированными углеводородами (ДХЭ, ЦФ) отмечается необратимое расходование восстановленного глутатиона на конъюгацию с метаболитами, активация мик-росомального окисления с повышенной наработкой АФК и образование сво-боднорадикальных промехсуточных продуктов. Токсическое воздействие на организм метгемоглобинобразователя фенилгидразина, метаболизируемого цитохромом Р450, связано как с образованием свободнорадикальных метаболитов, так с развитием тяжелой гемической гипоксии, а также с расходованием глутатиона в эритроцитах на восстановление метгемоглобина.

Выделение механизмов повреждения естественной системы цитопротек-ции, основанное на данных динамического исследования не только уровня ВГ,-но и активности ферментов обмена глутатиона, а также показателей ПОЛ в критических тканях имеет существенное значение. Оно позволяет определить роль нарушений системы глутатиона в реализации цитотоксических эффектов ксенобиотиков, показать возможные маркеры цитотоксичности, а в дальнейшем сформулировать подходы к использованию цитопротекторов при отравлении тем или иным агентом. Все это позволяет рассматривать определение параметров, характеризующих состояние системы глутатиона в тканях отравленных животных в качестве перспективных методов оценки цитотоксических эффектов действия широкого круга токсикантов. При этом важное значение приобретает выделение маркеров повреждения системы глутатиона (табл. 5).

Данные табл. 5 не только позволяют сравнить выраженность цитотоксических свойств ксенобиотиков, но и указывают на маркер поражения системы глутатиона, определение которого уже может лечь в основу выявления механизма цитотоксического действия и поиска направлений цитопротекции.

В то же время использование понятий «критический орган» (т.е. тот орган, в котором отмечается наибольшая степень повреждения системы глутатиона) указывает на то, что глубина изменений указанной биохимической системы в различных тканях существенно различается. Это связано с тем, что возможность истощения системы глутатиона и запуск механизмов цитотоксичности зависит от ряда параметров как токсиканта, так и тканевых особенностей метаболизма ксенобиотиков и состояния обмена глутатиона:

Таблица 5

Возможные маркеры поражения системы глутатиона при острых отравлениях __ксенобиотиками с различными механизмами действия_

Токсикант «Критический» орган Максимальнее снижение уровня ВГ Механизм Маркер и его выраженность

Доксорубицин Сердце 90,4 % Повреждение ферментов обмена глутатиона Падение активности Г-6-Ф-ДГ в 3,0 раза

Циклофосфан Печень 70,4 % Глутагионовая конъюгация Снижение уровня глутатиона в 3,4 раза

1,2-дихлорэтан Печень 73,8 % Снижение уровня глутатиона в 3,8 раза

Паракват Легкие 64,3 % Образование сво-боднорадикальных метаболитов Повышение концентрации МДА в 2,0 раза, снижение уровня глутатиона в 2,8 раза

Р-хлорвинил-дихлорарсин Печень 44,1 % Расходование глутатиона на репарацию поЕреждеиных биомолекул Снижение уровня глутатиона в 1,8 раза

Фенилгидразин Эритроциты 59,1 % Снижение уровня глутатиона в 2,2 раза

Тиопентал натрия Мозг 54,2 % Нарушения биоэнергетики клеток Снижение уровня глутатиона

ФСХ Почки 19,9%

1. токсикокинетических и токсикодинамических параметров токсиканта - его распределения в организме и преимущественного накопления в тех или иных тканях, метаболических превращений ксенобиотика с образованием активных радикалов и АФК, способностью токсиканта вызывать формирование гипоксии, наличия определенных специфических механиз1м0в токсического действия.

Подтвердить данный тезис можно на примере токсического действия ци-тостатика доксорубицина, вызывающего ярко выраженное повреждение тканей миокарда, но не тканей паренхиматозных органов (табл. 6). В эксперименте на животных, отравленных данным агентом, было выявлено глубокое (практически 10-кратное) снижение уровня ВГ в тканях сердца, вызванное свободнорадикальным повреждением участкоз ДНК, кодирующих синтез

Г-6-Ф-ДГ, что приводило к падению активности фермента более чем в 3 раза. В тканях других органов, напротив, существенного уменьшения активности фермента не отмечалось (печень), или даже происходило ее увеличение (почки и головной мозг). Соответственно, и выраженность снижения концентрации ВГ (отмечавшегося лишь в тканях почек) было достаточно умеренным (на 38,3 %), да и происходило онэ в поздние сроки исследования. Все это позволяет расценивать выявленные изменения системы глутатиона в тканях почек, как адаптивный ответ на повреждающее воздействие циркуляторной гипоксии.

Таблица 6

Динамика изменений некоторых показателей системы глутатиона в тканях

различных органов при остром отравлении доксорубицином в дозе ЬР50

Сроки исследования Показатель Исследуемый орган

Сердце Печень Почки Головной мозг

Контроль ВГ, ммоль/г ткани 4,42 ±0,15 7,67 ±0,16 1,88 ±0,11 0,61 ± 0,07

1 сут 1,88 + 0,57* 8,60 ±0,22* 1,93 ±0,12 0,86 ±0,10

3 сут. 0,82 + 0,15* 7,98 ± 0,35 1,67 ±0,07 0,63 ± 0,06

5 сут 0,54 ± 0,14* 9,08 ±0,45* 1,16 + 0,12* 0,75 + 0,27

7 сут 0,42 + 0,10* 10,9 ± 1,17* 1,45 ±0,17* 0,79 ± 0,22

Контроль Г-б-Ф-ДГ, мкмоль/ (минт белка) 57,5 + 10,5 43,89 ± 6,66 38,84 ± 3,58 72,75 ± 5,72

1 сут 26,5 ± 4,2* 47,27 ± 5,34 29,92 + 5,48 72,38 ±5,39

3 сут 26,3 + 3,5* 42,48 ±3,36 46,72 ±6,88 83,77 ±3,1*

5 сут 20,0 + 2,4* 37,93 ±4,12 52,90 + 8,74* 77,54 ± 2,37

7 сут 18,9 + 2,4* 45,06 ±5,15 53,6 ±6,08* 85,8 ±5,54*

* - достоверность отличия р<0,05 по сравнению с группой контроля.

2. степень поражения системы глутатиона может зависеть и от интенсивности метаболизма ксенобиотиков в тканях. Классическим примером могут служить отравления токсикантами, метаболизируемыми микросомальными ферментами, активность которых в тканях существенно различается (максимальна в тканях печени и почек, значительно ниже в других тканях) (Ар-чаков А.И., 1975; Арчаков А.И., 1988).

Механизм цитотоксического действия циклофосфана тесно связан С метаболизмом ксенооиотика, осуществляемым цитохромом I .}а в дальнейшем с выраженным расходованием ВГ (в реакциях конъюгации метаболитов ксенобиотика и восстановления образующихся в результате работы микросо-мальных оксигеназ АФК). Полученные данные о влиянии острых отравлений ЦФ на уровень глутатиона в тканях животных во многом отражают и существенные межтканевые различия в скорости протекания процессов микросо-

мального окисления (табл. 7). Так, после использования максимальной дозы ксенобиотика в тканях печени животных (характеризующихся максимальной активностью цитохрома Р45о) отмечалось раннее (через 3 ч) и наиболее глубокое (в 4,32 раза) достоверное снижение уровня ВГ. Снижение уровня ВГ в тканях почек (где активность микросомальных оксигеназ, по сравнению с тканями печени, существенно ниже) было более умеренным (в 2,12 раза). А в тканях головного мозга, где активность микросомальных ферментов минимальна, изменения уровня ВГ вообще отсутствовали. Подобная тенденция влияния ксенобиотика на глубину снижения уровня глутатиона (печень>почки>головной мозг) отмечалась и при использовании меньших доз токсиканта.

Таблица 7

Динамика изменений концентрации восстановленного глутатиона в тканях

белых беспородных крыс при остром отравлении ЦФ (ммоль/г ткани)

Группа исследования Сроки исследования Исследуемый орган

Печень Почки Головной мозг

Контроль 10,77 + 0,72 7,28 ±0,31 3,40 ±0,19

ЦФ, 400 мг/кг Зч 2,49 ±0,31* 3,89 + 0,23* 2,99 ±0,41

6ч 2,68 ± 0,44* 3,43 ± 0,46* 3,14 + 0,39

12ч 3,43 ± 0,29* 3,46 ± 0,42* 3,11 ±0,07

24 ч 3,26 + 0,29* 3,62 + 0,48* 3,05 + 0,06

ЦФ, 200 мг/кг Зч 3,19 ±0,44* 3,97 ± 0,45* 3,22 ±0,31

6 ч 4,43 ± 0,32* 4,61 ± 0,32* 3,14 ±0,24

12 ч 4,51 ±0,47* . 3,90 ±0,45* 2,96 ±0,14

24 ч 5,55 + 0,86* 4,97 + 0,56* 3,50 ±0,15

' ЦФ, 60 мг/кг 3 ч 5,19 ±0,39* 4,27 ± 0,38* 3,41 ±0,27

6ч 4,99 ±0,30* 4,64 + 0,42* 3,29 ±0,14

12ч 5,35 ± 0,26* 4,61+0,44* 3,48 ± 0,36

24 ч 7,00 + 0,44* 5,51 + 0,36* 3,17 ±0,21

* - достоверность отличия р<0,05 по сравнению с группой контроля.

3. выраженность повреждения системы глутатиона (в первую очередь, степень снижения уровня ВГ) в условиях отравления цитотоксическими агентами зависит и от скорости обмена глутатиона в тканях конкретного органа. Содержание восстановленного глутатиона и интенсивность его обмена в тканях печени на порядок выше, чем в тканях головного мозга (Meister А., 1976).

Так, в условиях острых отравлений седативно-гипнотическими препаратами лидирующим механизмом повреждения системы глутатиона является механизм, связанный с нарушениями процессов биоэнергетики. По-видимому, глубина цитотоксического повреждения различных тканей в условиях воздей-

ствия гипоксии может, по крайней мере, частично, быть связана с различиями в интенсивности обмена глутатиона и его уровня в этих тканях.

По выраженности снижения уровня глутатиона при отравлении седатиа-но-гипнотическими препаратами ткани выстраивались в следующий ряд: головной мозг > эритроциты > почки >печень (табл. 8). Это распределение, как оказывается, обратно пропорционально интенсивности обмена глутатиона в этих тканях (Meister А., Anderson М.Е., 1983). При отравлении тиопенталом натрия в полулетальной дозе снижение концентраций ВГ составляло: в головном мозге - в 2,18 раза, в эритроцитах - в 1,73 раза, в почках - в 1,22 раза и в 1,40 раза в тканях печени; при интоксикации этанолом - в 1,80 раза, 1,78 раза, 1,26 раза и 2,19 раза, соответственно; после введения азалептина в полулетальной дозе - 1,33 раза, 1,27 раза, 1,15 раза и 1,11 раза, соответственно. Данные изменения легко объяснимы с точки зрения интенсивности обмена глутатиона, который в тканях печени и почек по сравнению с эритроцитами и головным мозгом осуществляется более чем в 10 раз интенсивнее. Кроме того, концентрация ВГ в тканях печени приблизительно в 2 раза выше, чем в почках и в 4-5 раз выше, чем в головном мозге.

Таблица 8

Динамика изменений концентрации восстановленного глутатиона в тканях различных органов при остром отравлении нейротоксикантами в дозах LD5q

(ммхэль/г ткани или мкмоль/г гемоглобина)

Группа исследования Сроки Исследуемый орган

Печень Почки Головной мозг Эритроциты

Контроль 9,27 ± 0,72 4,27 ±0,13 1,29 + 0,03 6,09 + 0,63

Тиопентал натрия 3 ч 8,80 ± 0,66 3,80 ±0,10* 0,59 ±0,05* 4,18 ±0,56*

6ч 8,41 ± 1,0 3,49 ±0,15* 0,76 ± 0,06* 3,51 ±0,51*

12 ч 6,60 ± 0,50* 3,85+0,16* 0,60 + 0,07* 4,17 ±0,63*

Этанол Зч 4,22 ± 0,26* 3,57 ±0,15* 0,77 ±0,10* 3,43+0,51*

6ч 6,05 + 0,35* 3,38 ±0,18* 0,92 ±0,03* 4,41 ±0,26*

12 ч 8,61 ± 0,44 3,75 + 0,19* 0,96 ± 0,03* 4,97 ±0,55*

Азалептин 3 ч 9,11 ±0,33 3,72 ±0,05* 0,97 ± 0,08* 5,15 + 0,12*

6 ч 8,34 ±0,31* 4,19 ±0,22* 1,13 ±0,03* .5,57 ±0,30

12 ч 9,94 ±0,32* | 3,80 ±0,15* 1,20 ±0,03* 4,81+0,43*

* - достоверность отличия р<0,05 по сравнению с группой контроля.

Существенным исключением из полученной закономерности явился факт более глубокого снижение уровня ВГ в тканях печени при отравлениях тиопенталом натрия и, особенно, этанолом. Это исключение вполне разрешимо, учитывая участие микросомальных оксигеназ печени в метаболизме этих ксенобиотиков. Однако это исключение из одной закономерности в то же время является подтверждением предыдущего положения о том, что повреждение системы глутатиона может быть связано с наработкой АФК микросомальными

ферментами, активность которых в тканях печени существенно выше по сравнению с другими органами.

4. выраженность и направленность изменений системы глутатиона зависит и от дозовых нагрузок - если использование достаточно высоких доз ксенобиотика может вызывать истощение системы глутатиона, то введение меньших доз может даже сопровождаться адаптивной ее активацией.

Так, экспериментальные данные о динамике изменений ряда параметров системы глутатиона в тканях печени животных при острых интоксикациях дихлорэтаном (табл. 9) указывают на то, что направленность этих сдвигов существенно зависит от величины введенной дозы токсиканта.

Таблица 9

Динамика изменений некоторых показателей системы глутатиона в тканях пе-

чени при остром отравлении дихлорэтаном в различных дозах

Доза | Сроки Исследуемый орган

ВГ, ммоль/ г ткани Г-6-Ф-ДГ, мкмоль/ (минт белка) ГР, мкмоль/ Гминт белка) ГТ, мкмоль/ (минт белка)

Контроль 12,71 ±0,56 51,70 ± 1,23 139,8 ± 10,8 452,5 ± 20,6

1500 мг/кг 1,5 ч 4,89 ± 0,47* 45,04 ±4,64 103,8 + 9,3* 433,6 ±21,9

3 ч 2,71 +0,51* 43,05 + 3,87* 103,7 ± 12,4* 427,8 ± 12,4

6 ч 2,06 ± 0,40* 33,66 + 5,23* 123,6 ± 12,0 423,9 ± 12,7

600 мг/кг 3 ч 3,33 ±0,58* 47,18 + 3,81 106,6+4,6* I 387,9 ± 22,6*

6 ч 4,05 ± 0,67* 48,44 ± 1,60 95,9 ± 3,7* 406,5 ± 15,3*

12 ч 8,81 +0,87* 40,82 ±6,31* 84,2 ±9,8* 341,1 ± 10,2*

24 ч 9,55 ±0,67* 52,53 ± 5,16 105,9 ± 11,3* 356,6 ±9,8*

300 мг/кг 3 ч 3,51 ±0,46* 56,01 + 5,42 165,3+ 13,0* 569,7 ±23,6*

6 ч 6,71 ± 0,34* 56,37 ±6,41 141,7± 13,6 489,9 ± 22,4

12 ч 10,15 + 0,52* 53,69 ± 1,21 136,0 ± 10,0 437,7 ± 18,8

24 ч 15,31 ±0,59* 54,68 ±5,99 132,9 ±9,1 490,9 ± 12,5*

* - достоверность отличия р<0,05 по сравнению с группой контроля.

При использовании ДХЭ в максимальной дозе в тканях печени отмечалось снижение концентрации ВГ в 4,69 раза, затем угнетение активности ферментов системы глутатиона, в первую очередь, лимитирующих уровень восстановленной формы трипептида в тканях (Г-6-Ф-ДГ - на 34,9 %, а ГР - на 25,8 %), и, наконец, происходил рост содержания продуктов ПОЛ и нарушения тиолдисульфидного равновесия в тканях. Все этя сдвиги указывают па крайнее истощения функциональных возможностей системы цитопротекции в условиях интоксикации ДХЭ в дозе 1,5 г/кг. Применение токсиканта в дозе 300 мг/кг вызывало качественно иные по направленности изменения состояния системы глутатиона. Так, после первоначального снижения концентрация ВГ в тканях печени возрастала даже выше значений интактного контроля на 20,5 %, в ранние сроки отмечалось и повышение активности ферментов системы глу-

татиона: ГР - на 18,9 % и ГТ- на 25,9 %. Таким образом, при отравлении ДХЭ в относительно малых дозах отмечается адаптивная активации системы естественной цитопротекции, которая может сменяться угнетением лишь при увеличении вводимой дозы ксенобиотика.

По-видимому,- объяснение этих фактов тесно связано с особенностями метаболизма ксенобиотика и ролью системы глутатиона в этих процессах. Дихлорэтан на первом этапе метаболизируется цитохромом Р450, при этом происходит образование реакционно-способных метаболитов токсиканта и АФК. Первые под воздействием ГТ вступают в реакцию конъюгации с ВГ, а последние могут ферментативно восстанавливаться при участии ГП. И тот, и другой процессы в конечном итоге сопровождаются снижением уровня восстановленной формы глутатиона. При повышении дозовой нагрузки в условиях интоксикации дихлорэтаном создаются предпосылки к функциональной недостаточности конъюгирующей функции печени, следствием чего является и алки-лирование ряда ферментов обмена глутатиона (таких, как Г-6-Ф-ДГ, ГР, ГТ) и уменьшение их активности. Однако при интоксикации меньшими дозами ДХЭ рост концентрации окисленной формы глутатиона может привести к адаптивным изменениям системы и повышению активности Г-6-Ф-ДГ, ГР, ГТ и даже уровня ВГ выше контрольных значений.

Глубине резервов естественной системы цитопротекции принадлежит решающее значение в защите клеток от повреждающего действия широкого круга токсикантов. Подобный адаптивный ответ системы глутатиона (в виде активации не только ферментов конъюгации и антирадикальной защиты, но и энзимов восстановления глутатиона) на воздействие относительно малых доз ксенобиотиков отмечался и при использовании целого ряда других токсикантов - циклофосфана, (3-хлорвинил-дихлорарсина, 1,2-диметилгидразина, тио-пентала натрия, этанола и др. Дальнейшее даже небольшое (2-3-кратное) увеличение дозы агентов, обладающих ярко выраженными цитотоксическими свойствами (ЦФ, ХВА, ДХЭ, ПТ, ДР) приводило к срыву функциональных возможностей системы глутатиона.

Таким образом, полученные данные полностью опровергают представление об изменениях системы глутатиона, как о неспецифических, происходящих при воздействии практически любого токсиканта. Напротив, выраженность и направленность сдвигов системы глутатиона в полной мере отражает как специфические особенности действия токсиканта (токсикокинетические, токсикодинамические, дозовые, механизмов действия и т.д.), так и собственно обмена глутатиона в различных тканях.

Сведения об особенностях изменений состояния системы глутатиона в . тканях животных при острых отравлениях ксенобиотиками с различными механизмами токсического действия и выраженностью цитотоксических свойств имеют не только сугубо теоретическое значение, связанное с расширением наших представлений об особенностях функционирования естественной системы цитопротекции, но и существенное практическое значение.

Влияние фармакологических препаратов на состояние системы глутатиона в тканях отравленных животных

Комплексное изучение системы глутатиона может быть положено в основу поиска дитопротекторов. Таким образом., открывается перспектива использования таких препаратов, патогенетическая направленность действия которых будет связана с коррекцией состояния естественной системы цитопро-текции. При этом, основываясь на выявленных различиях в пусковых механизмах воздействия цитотоксических агентов на состояние системы глутатиона, поиск препаратов цитопротекции при воздействии конкретного агента может быть построен с учетом его специфичности воздействия на естественную систему защиты клетки. При этом и подходы к поиску новых препаратов фармакологической защиты клетки в каждом конкретном случае могут существенно отличаться, что, по-видимому, позволит добиться и лучшей эффективности проводимой терапии. Обобщение этих направлений поиска препаратов цитопротекции, основанное на выявленных пусковых механизмах повреждения системы глутатиона, приведено ниже (табл. 10).

Таблица 10

Возможные направления поиска цитопротекторов, корригирующих состояние

системы глутатиона

Механизм повреждения системы глутатиона Механизм действия цитопротектора Примеры

Истощение запасов восстановленного глутатиона при осуществлении глутатионо-вой конъюгации препараты экзогенного глутатиона; предшественники синтеза глутатиона эфиры глутатиона ацетилцистеин, глицин

Критическое расходование ВГ на процессы репарации поврежденных биомолекул

Интенсивная наработка активных форм кислорода в результате метаболизма ксенобиотиков антиоксиданты аскорбиновая кислота, а-то'коферол, убихинон, липоевая кислота и др.

Образование свободноради-кальных промежуточных продуктов метаболизма ксенобиотиков антиоксицанты - ловушки свободных радикалом; комплексообразователи мексидол, трисан и др. ЭДТА, кардиоксан

Нарушения энергетического обмена антигипоксапты реамберин, цитофла-вин. амтизол

Прямое повреждение или снижение активности ряда ферментов обмена глуга-тиона индукторы белкового синтеза; экзогенное введение продуктов реакции этомерзол, беметил и т.п. эфиры глутатиона

Правомочность таких подходов к поиску препаратов цитопротекции подтверждается полученными экспериментальными данными.

Так, коррекция цитотохсических эффектов действия циклофосфана представляется достаточно сложной с учетом комплекса механизмов повреждения системы глутатиона. В результате метаболических превращений этого токсиканта, происходящих с участием цитохрома Р450, идет образование сво-боднорадикальных промежуточных продуктов и АФК, оказывающих повреждающее действие на белки и нуклеиновые кислоты. Кроме того, в тканях печени, принимающей непосредственное участие в метаболизме ЦФ, происходит существенное расходование ВГ в результате конъюгации, а также имеет место повреждение ряда липидных структур клеток свободными радикалами, в том числе развиваются процессы нарушения тканевого дыхания.

Поэтому в качестве препаратов фармакологической коррекции состояния системы глутатиона в тканях отравленных ЦФ животных, согласно приведенной выше схеме, были использованы препараты экзогенного глутатиона (изопропиловый эфир глутатиона), антиоксиданты (трисан, мексидол) и анти-гипоксант ремаксол. Как обсуждалось выше, одним из показателей при оценке цитопротекторной активности фармакологических препаратов является их влияние на содержание ВГ в тканях отравленных животных.

Таблица 11

Влияние препаратов коррекции на динамику изменений концентрации ВГ в тканях крыс при остром отравлении циклофосфаном в дозе Ь05о

(ммоль/г ткани или мкмоль/г гемоглобина)

Группа исследования Исследуемый орган

Печень Почки Эритроциты

Контроль 10,77 + 0,72 7,28 ±0,31 8,82 ± 0,66

я •в< й о ■ о Ь •а< я 8 ° 5 ° й ^ в Без лечения 12 ч 4,51 ±0,47* 3,90 ± 0,45* 4,36 ± 0,60*

24 ч 5,55 ± 0,46* 4,97+0,56* 4,49 ± 0,43*

Мексидол 12 ч 7,84 ± 0,23*# 7,77 ± 0,20# 5,29 ± 0,22*

24 ч 5,50 ±0,21* 9,14 ± 0,76*# 6,08 ± 0,32*#

Изопропилглутатион 12 ч 6,74 ± 0,29*# 9,78 ± 1,01*# 6,74 + 0,30*#

24 ч 7,17 ± 0,23*# 10,81 ± 1,29*# 5,73 ±0,26*#

Ремаксол 12 ч 7,61 ± 0,34*# 7,23 ± 0,74# 7,3 8 ± 0,46#

24 ч 5,61 ±0,35* 7,49 ± 0,98# 7,12 + 0,78#

Трисан 12 ч 5,44 ± 0,28* 10,27 ± 1,27*# 7,62 ± 0,43#

24 ч 6,99 ± 0,38*# 10,89 ± 1,10*# 7,25 ±0,34#

* - достоверность отличия р<0,05 по сравнению с группой контроля.

* - достоверность отличия р<0,05 по сравнению с группой отравленных животных без коррекции.

Все препараты частично предотвращали снижение содержания ВГ в тканях печени и в эритроцитах отравленных ЦФ животных, а также полностью его предупреждали в тканях почек (табл. 11). По сравнению с показателями не получавших препаратов коррекции отравленных крыс на фоне применения

мексидола концентрация ВГ достоверно возрастала у животных в 1,74, 1,84 и 1,35 раза (печень, почки, эритроциты); эфира глутатиона - в 1,49, 2,51 и 1,55 раза; ремаксола - в 1,69, 1,85 и 1,69 раза; трисана - в 1,26, 2,63 и 1,75 раза, соответственно. Однако наиболее выраженное воздействие на состояния системы глутатиона отмечалось при использовании изопропилового эфира глутатиона. Оно позволяло добиться не только наиболее длительного по времени предупреждения снижения уровня ВГ в тканях печени (тогда как действие ан-тигипоксантов и антиоксидантов было обратимо), но и максимально предупреждало накопление продуктов ПОЛ в тканях, а также оказывало индуцирующее действие на глутатион-8-трансферазу и глутатионпероксидазу. Все эти данные не только подтвердили лидирующую роль срыва механизмов глу-татионовой конъюгации при реализации цитотоксических эффектов действия ЦФ, но и дают указание на то, что дальнейшим направлением поиска наиболее эффективных средств цитопротекции в условиях острых интоксикаций ЦФ может явиться использование соединений, повышающих уровень глутатиона в тканях. Эти положения подтверждаются и доступными сведениями о новых направлениях поиска антидотных средств поражения ипритами, в которых основной акцент исследования сделан на синтез новых тиолсодержащих препаратов (РаШак 11., 2004).

Таблица 12

Влияние фармакологической коррекции на уровень восстановленного глутатиона при остром отравлении тиопенталом натрия в дозе LD50 _(ммоль/г ткани или мкмоль/г гемоглобина)__

Средство коррекции Исследуемый орган

Токсикант Сроки Головной мозг Эритроциты

Контроль 1,29 ±-0,03 6,09 ± 0,63

а 1 СЗ Без коррекции 6ч 0,76 ± 0,06* 3,51 ±0,51*

12 ч 0,60 ± 0,07* 4,17 ±0,63*

Аскорбат 6ч 0,77 ± 0,05* 4,29 ±0,55*

3 12 ч 0,73 ± 0,05 *# 4,17 ±0,49*

1 Пирацетам 6ч 0,71 ±0,08* 4,45 ± 0,76*

с 12 ч 1,02 ± 0,09*# 5,82 ± 0,75#

Н Цитофлавин 6 ч 0,88 ± 0,05*# 4,75 ± 0,60*#

12ч 1,02 ± 0,06*# 4,19 ±0,57*.

* - достоверность отличия р<0.05 по сравнению с группой контроля.

'* - достоверность отличия р<0.05 по сравнению с группой отравленных животных

без коррекции.

Напротив, при острых интоксикациях седативно-гипнотическими препаратами (в частности, тиопенталом натрия) ведущим механизмом повреждения системы глутатиона и реализации цитотоксических эффектов является развитие гипоксии и энергодефицита тканей. Но в настоящее время в состав схем

медикаментозной терапии этих форм интоксикаций включены только антиок-сидантные препараты (Лужников Е.А., 2000). Однако, как показало проведенное исследование, использование в этих условиях антигипоксантов (пирацета-ма, цитофлавина) не только оказывало положительное действие на ряд показателей системы глутатиона (в т.ч. на уровень ВГ, концентрацию продуктов ПОЛ, активность ГР, Г-6-Ф-ДГ, ГП) в тканях головного мозга и в эритроцитах отравленных животных, но и выраженность этого эффекта у антигипоксантов порой превосходила таковую у антиоксиданта - аскорбиновой кислоты (табл. 12).

При сочетанном использовании фармакологических препаратов и окси-генотерапии, лишь применение метаболического антигипоксанта цитофлавина сопровождалось потенцированием протекторных эффектов действия кислорода, тогда как у антиоксидантов и 02 проявлялись даже антагонистические взаимоотношения.

Таким образом, система глутатиона по многим параметрам соответствует понятиям скрининговой системы при.поиске новых средств цитопротекции:

- механизмы нарушений состояния системы глутатиона находятся в тесной взаимосвязи со специфическими механизмами реализации цитотоксических эффектов действия широкого круга ксенобиотиков;

- наличие корреляций между глубиной и направленностью изменений системы глутатиона и величиной вводимой дозы токсиканта;

- совпадение во времени и месту («критическая ткань») максимальной выраженности нарушений естественной ..системы цитопротекции в тканях и цитотоксических явлений.

Состояние системы глутатиона в эритроцитах пациентов с острыми

отравлениями веществами седативно-гипнотического действия

Другим перспективным направлением практического использования показателей системы глутатиона является возможность оценки с их помощью тяжести цитотоксических поражений и их исходов в клинике острых интоксикаций. Последнее положение было отработано нами в клинике острых интоксикаций седативно-гнпнотическими веществами (наркотические препараты, барбитураты, транквилизаторы, антидепрессанты, этанол)

Исследование динамики изменений содержания ВГ в эритроцитах пациентов с острыми тяжелыми отравлениями седативно-гипнотическими препаратами позволило выявить наличие снижения данного показателя уже в первые часы нахождения пациентов в стационаре. Глубина снижения на 1-2 сут отражала степень тяжести интоксикации, а отсутствие положительной динамики на 2-3 сут явилось прогностически неблагоприятным признаком. Так, у выживших пациентов по сравнению со значениями доноров максимальное снижение уровня ВГ на 38,4 % (мужчин) и 55,2 % (женщины) отмечалось в 1-е сут, а в дальнейшем имелась тенденция к частичному восстановлению данного показателя. У погибших лиц истощение содержания ВГ даже в 1-е сут было

более значительным - на 41,9 % (мужчины) и 71,3 % (женщины), в более поздние сроки указанное снижение прогрессировало до наступления летального исхода. Уже на 2 сут уровень ВГ у выживших пациентов в 1,99 раза (мужчины) и 1,77 раза (женщины) достоверно (р<0,05) превышал показатель погибших; на 3 сут, соответственно, в 2,09 и 3,41 р;1за.

Существенные отличия отмечались и в динамике изменений активности ГП в эритроцитах выживших и погибших пациентов с острыми отравлениями седативно-гипнотическими препаратами. У первых после первоначального угнетения (р<0,05) с максимумом на 1-2 сут (на 26,8 % у мужчин и на 21,6 % у женщин) к 3 сут Отмечалось восстановление активности фермента до уровня нормы. В эритроцитах погибших лиц глубина снижения активности ГП, начиная с 1-2 сут, была более выраженной, а тенденция к ее восстановлению отсутствовала. Таким образом, глубина снижения активности ГП в эритроцитах на 1-2 сут нахождения в стационаре и наличие (отсутствие) динамики к повышению (восстановлению) активности фермента в более поздние сроки явились надежными диагностическими и прогностическими показателями.

В эритроцитах выживших пациентов в течение 1 и 2 сут нахождения в стационаре активность ГР сохранялась на уровне, характерном для здоровых лиц, что явилось свидетельством сохранения резервов системы глутатиона. В эритроцитах погибших лиц, напротив, начиная с 1 сут нахождения в стационаре, происходило значительно снижение активности фермента, усиливающееся во времени. Сам факт угнетения активности ГР в эритроцитах в ранние сроки тяжелых отравлений веществами седативно-гипнотического действия, по нашему мнению, явился прогностически неблагоприятным признаком исхода интоксикации.

Степень активации процессов ПОЛ в эритроцитах пациентов с острыми отравлениями седативно-гипнотическими препаратами не только отражала тяжесть интоксикации, но и свидетельствовала о сохранности резервов всей системы глутатиона. Во-первых, по сравнению с показателями здоровых доноров концентрация МДА в эритроцитах выживших пациентов максимально возрастала в 1,12+2,47 раза, против 1,944-4,01 раза у погибших больных. Во-вторых, приблизительно у 80 % умерших пациентов уже на 1-2 сут нахождения в стационаре концентрация МДА в эритроцитах достигала значений, превышающих 10,0+10,5 нмоль/г гемоглобина. Данный уровень можно признать критическим, свидетельствующим о необратимом истощении системы глутатиона и, по-видимому, являющимся абсолютно прогностически неблагоприятным признаком.

Примечательно, что даже, несмотря на, казалось бы, умеренную выраженность цитотоксических повреждений в условиях экспериментальных интоксикаций, приведенная схема использования показателей системы глутатиона в эритроцитах пациентов с острыми отравлениями веществами седативно-гипнотического действия для оценки тяжести и прогноза исхода интоксикации (табл. 13) имеет важное значение в связи с крайне высокой частотой и деталь-

Таблица 13

Схема использования показателей системы глутатиона в эритроцитах пациентов с острыми отравления веществами

седативно-гипнотического действия для оценки тяжести и прогноза исхода интоксикации

№ Исследуемый показатель Значения нормы Течение и исход интоксикации Сроки исследования

Благоприятные Неблагоприятные

1 Восстановленный глутатион (мкмоль/г гемоглобина) м. 5,18-6,38 ж. 7,46 - 8,66 м. 3,56-4,29 ж. 3,61-4,19 м. <3,36 ж. <2,31 1-2 сут

Динамика к повышению Отсутствие динамики к повышению 2-3 сут

2 Сульфгидрильные группы белков (мкмоль/г гемоглобина) м. 4,95-6,25 ж. 5,58-6,88 м. 2,51-3,34 ж. 1,96-2,55 м. <2,17 ___ ж. <1,50 Отсутствие динамики к повышению 1-2 сут

Динамика к повышению 2-3 сут

3 Малоновый диальдегид (нмоль/г гемоглобина) м. 5,16-6,38 ж. 3,04-4,06 м. < 8,70 ж. <8,55 м.> 11,00 ж. >10.00 1 сут

4 Глгакозо-б-^осфат-дегидрогеназа (мкмоль/(мин-г гемоглобина) м. 4;93 -6,17 ж. 5,78 - 6^88 м. >4 19 ж. > 3,93 < з 49 ж. <з',19 2 сут

Динамика к повышению (восстановлению) Отсутствие динамики к повышению 2-3 сут

5 Глутатионредуктаза (мкмоль/(мин-г гемоглобина) м. 185 -233 ж. 184-242 > 150 <120 2-3 сут

Отсутствие угнетения активности Наличие угнетения активности 1-2 сут

б Глутатионпероксидаза (мкмоль/(миит гемоглобина) м. 4,90-5,38 ж. 5,96 - 7,28 м. >4,19 ж. >3,93 м. <3,49 ж. <3,19 2 сут

Динамика к повышению (восстановлению) Отсутствие динамики к повышению 2-3 сут

7 Катал аза (мкмоль/(минт гемоглобина) м. 27,0 - 29,2 ж. 36,5-41,3 Отсутствие угнетения активности м. <18,1 ж. < 20,9 1-3 сут

костью при этих формах интоксикаций (Литвинов H.H., 1997). Определение глубины нарушений ряда показателей системы глутатиона (ВГ, СГ, МДА, ГР, Г-6-Ф-ДГ, и каталазы) в эритроцитах пациентов с острыми отравлениями седа-тивно-гапнотическими препаратами становится информативным уже в 1-2 с^т при оценке степени тяжести, а динамика их изменений на 1-3 сут — при прогнозе исхода отравления, т.е. в те сроки, когда большинство лабораторных и инструментальных методов исследования не позволяют в полной мере дать ответ на эти вопросы.

Кроме того, экспериментальные данные о высокой корреляции изменений состояния системы глутатиона в тканях внутренних органов и в эритроцитах животных при отравлениях циклофосфаном, доксорубицином позволяют с перспективой оценивать возможность клинического использования показателей этой биохимической системы в клетках крови пациентов, получающих ци-. тостатики, с целью прогноза развития осложнений (Аксенов В.В., 2004) и, возможно, индивидуализации схемы проводимой терапии с учетом личных особенностей функционирования системы цитопротекции. Подобные закономерности, отмеченные нами при экспериментальном изучении острых отравлений ß-хлорвинилдихлорарсином, указывают и на возможность использования определения показателей системы глутатиона в эритроцитах п качестве лабораторных тестов оценки состояния здоровья персонала объектов по уничтожению химического оружия (Глушков С.И., 2003).

Приведенные данные о наличии положительных высоких корреляций между изменениями состояния системы глутатиона в эритроцитах и тканях внутренних органов лабораторных животных при применении фармакологических средств указывают и на возможность использования показателей системы глутатиона клеток крови человека при оценке эффективности назначения ряда цитопротекторов в клинике. Подобная высокая информативность изменений системы глутатиона в эритроцитах при оценке тяжести состояния пациентов может лечь в основу использования показателей данной системы в скрининге клинической эффективности цитопротекторов. Хотя это положение было апробировано лишь на примере использования цитофлавина (комплексного препарата, состоящего из сукцината, рибоксина, рибофлавина и никотинами-да) в клинике острых интоксикаций седативно-гипнотическими препаратами, оно может стать основой для клинической оценки свойств цитопротекторов при проведении полихимиотерапии и отравлениях цитотоксическими агентами.

Таким образом, изучение состояния системы глутатиона в условиях острого токсического воздействия существенно расширяет наши представления о механизмах цитотоксичности и естественной цитопротекции; может стать основой для совершенствования мероприятий, связанных с поиском новых средств цитопротекции и оценки их эффективности в условиях эксперимента и клиники; может стать основой использования новых лабораторных приемов

клинической оценки тяжести цитотоксических поражений, их профилактики и лечения.

ВЫВОДЫ

1. Острые интоксикации регуляторными ядами (седативно-гипнотические препараты, вещества с возбуждающим влиянием на ЦНС) в диапозоне доз от 0,3 1ЛЭ30 до 1ЛЭ50 оказывают возмущающее воздействие на состояние системы глутатиона в тканях отравленных животных, что проявляется в виде умеренного и обратимого снижения содержания ВГ (на 20-40 % ниже уровня контроля) на фоне активации ферментов обмена глутатиона (ГП, ГР, Г-б-Ф-ДГ) и сохранности функций антирадикальной защиты и поддержания тиол-дисульфидного равновесия.

2. При острых отравлениях веществами с выраженными цитотоксическими свойствами как в относительно малых (0,3 ЬО;о), так и среднесмертельных дозах в тканях лабораторных животных отмечаются глубокие нарушения системы глутатиона, что проявляется в виде выраженного снижения уровня ВГ (в 2-10 раз ниже контроля), угнетения-активности ферментов обмена глутатиона и срыва гомеостатических функций этой биохимической системы.

-3. Сроки и выраженность нарушений системы глутатиона (степень снижения содержания ВГ и активности глутатион-зависимых ферментов) в тканях отравленных животных тесно связаны с реализацией цитотоксических эффек тов действия ксенобиотиков.

4. Самостоятельными пусковыми механизмами повреждения системы глутатиона являются:

- истощение запасов восстановленного глутатиона при осуществлении глу-татйоновой конъюгации;

- повышенная наработка активных форм кислорода при относительной недостаточности резервов активности глутатионпероксидазы и ферментов восстановления глутатиона (глутатионредуктазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы;

- образование в организме свободнорадикальных промежуточных продуктов метаболизма ксенобиотиков и критическое снижение уровня восстановленного глутатиона;

- развитие нарушений энергетического метаболизма клеток и тканей;

- прямое повреждение ферментов обмена глутатиона или нарушения процессов их биосинтеза;

- критическое расходование ВГ на поддержание нативной структуры биологически значимых макромолекул.

5. Применение антидотов и средств патогенетической терапии приводит к коррекции ряда нарушений системы глутатиона в тканях отравленных животных, что позволяет использовать показатели этой биохимической систе-

мы при скрининговой оценке цитопротекторных свойств антидотов, средств патогенетической и симптоматической терапии.

6. Принципиальными направлениями поиска новых цитопротекторных препаратов, действие которых связано с восстановлением состояния системы глутатиона, является синтез антиоксидантов, антигипоксантов, комплексо-образующих соединений, препаратов экзогенного глутатиона и предшественников его синтеза, индукторов белкового синтеза.

7. Динамическое исследование показателей системы глутатиона в эритроцитах пациентов (при ряде острых отравлений, в условиях проведения полихимиотерапии и т.д.) может широко использоваться в клинической практике для оценки тяжести цитотоксического поражения тканей, течения интоксикации и прогноза ее исхода, при оценке эффективности разрабатываемых антидогов и новых препаратов цитопротекции.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В существующую систему лабораторной диагностики тяжести и прогноза исхода острых интоксикаций веществами седативно-гипнотического действия рекомендуется включение динамического определения в эритроцитах пациентов (начиная с 1 суток нахождения в стационаре) показателей, характеризующих состояние системы глутатиона и процессов ПОЛ: концентрации малонового диальдегида, восстановленного глутатиона, сульфгид-рильных групп белков и активность глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы, глу-татионредуктазы, глутатионпероксидазы. Для оценки состояния больного и прогноза исхода интоксикации рекомендуется применение разработанной схемы (табл. 13), при этом в качестве диагностических и прогностических критериев оценки тяжести и исхода интоксикации могут использоваться:

1) Определение выраженности снижения содержания ВГ в эритроцитах пациентов в 1-2 сутки нахождения в стационаре:

- до 50-65 % от уровня здоровых лиц (3,56 - 4,29 мкмоль/г гемоглобина -мужчины, 3,61 - 4,19 мкмоль/г гемоглобина - женщины) - относительно благоприятное течение интоксикации;

- до 50 % и ниже (< 3,36 мкмоль/г гемоглобина - мужчины, <2,31 мкмоль/г гемоглобина - женщины) - неблагоприятное течение, высокая вероятность летального исхода.

2) Наличие тенденции к повышению концентрации ВГ в эритроцитах, начиная с 3 суток:

- положительная динамика - благоприятный прогноз исхода;

- отсутствие положительной динамики - неблагоприятный прогноз исхода отравления.

3) Определение степени снижения активности ГП в эритроцитах пациентов в 1-2 сутки нахождения в стационаре:

- до 80-85 % от уровня здоровых лиц (3,76 - 4,95 мкмоль/(мин-г гемоглобина) - мужчины, 5,19 - 6,34 - женщины) - относительно благоприятное течение интоксикации;

- до 60 % и ниже (<2,62 мкмоль/(мин-г гемоглобина) - мужчины, <3,90 — женщины) - неблагоприятное течение, высокая вероятность летального исхода.

4) Наличие (отсутствие) динамики к повышению (восстановлению) активности ГП в эритроцитах, начиная с 2 суток исследования:

- положительная динамика - благоприятный прогноз исхода;

- отсутствие положительной динамнки - неблагоприятный прогноз исхода отравления.

5) Отсутствие (наличие) угнетения активности каталазы в эритроцитах пациентов в 1-3 сутки нахождения в стационаре:

- сохранение или повышение активности фермента выше нормальных значе-

ний указывает на относительно благоприятные течение и прогноз исхода интоксикации;

- снижение активности фермента (<18,1 мкмоль/(мин-г гемоглобина) - мужчины и <20,9 - женщины) - неблагоприятное течение, высокая вероятность летального исхода.

6) Степень повышения концентрации МДА в эритроцитах пациентов в 1-е сутки нахождения в стационаре:

- не более, чем в 2,5 раза выше уровня здоровых лиц (<8,70 нмоль/г гемоглобина у мужчин, <8,55 нмоль/г гемоглобина у женщин) - относительно благоприятное течение интоксикации;

- более чем, в 3,0 раза выше уровня здоровых лиц (>11,00 нмоль/г гемоглобина у мужчин, >10;00 нмоль/г гемоглобина у женщин) - неблагоприятное течение, высокая вероятность летального исхода.

7) Отсутствие (наличие) повышения концентрации МДА выше критического уровня (10,0-10,5 нмоль/г гемоглобина):

- отсутствие превышения критического уровня - благоприятный прогноз исхода;

- превышение критического уровня - неблагоприятный прогноз исхода отравления.

8) Степень угнетения активности Г-6-Ф-ДГ в эритроцитах пациентов во 2-е сутки нахождения в стационаре:

- свыше 70 % от уровня здоровых лиц (>4,19 мкмоль/(мин-г гемоглобина) -мужчины, >3,93 - женщины) - относительно благоприятное течение интоксикации;

- ниже 60 % от уровня здоровых лиц (<3,49 - мужчины, <3,19 - женщины) -

неблагоприятное течение, высокая вероятность летального исхода.

9) Наличие (отсутствие) динамики к повышению (восстановлению) активности Г-6-Ф-ДГ в эритроцитах пациентов, начиная со 2-3 суток исследования:

- положительная динамика - благоприятный прогноз исхода;

- отсутствие положительной динамики - неблагоприятный прогноз исхода от-

равления.

10) Отсутствие (наличие) угнетения активности ГР в эритроцитах пациентов в 1-2 сутки нахождения в стационаре:

- отсутствие угнетения активности фермента указывает на относительно благоприятное течение и прогноз исхода интоксикации;

- наличие снижения активности фермента в ранние сроки - неблагоприятное течение, высокая вероятность летального исхода.

Н) Степень максимального снижения активности ГР в эритроцитах пациентов во 2-3 сутки нахождения в стационаре:

- свыше 70 % от уровня здоровых лиц (>150 мкмоль/(минт гемоглобина)) -относительно благоприятное течение интоксикации;

- ниже 60 % от уровня здоровых лиц (<120 мкмоль/(мин-г гемоглобина)) -неблагоприятное течение, высокая вероятность летального исхода.

12) Глубина снижения концентрации СГ в эритроцитах пациентов в 1-2 сутки нахождения в стационаре:

- до 40-60 % от уровня здоровых лиц (2,51 - 3,34 мкмоль/г гемоглобина -мужчины, 1,96 - 2,55 мкмоль/г гемоглобина - женщины) - относительно благоприятное течение интоксикации;

- до 20-40 % и ниже (<2,17 мкмоль/г гемоглобина - мужчины, <1,50 мкмоль/г гемоглобина - женщины) - неблагоприятное течение, высокая вероятность летального исхода.

13) Наличие (отсутствие) динамики к повышению концентрации СГ в эритроцитах, начиная со 2 суток исследования:

- положительная динамика - благоприятный прогноз исхода;

- отсутствие положительной динамики - неблагоприятный прогноз исхода отравления.

2. Наличие зависимости между выраженностью нарушений обмена глутатио-, на в тканях внутренних органов и в эритроцитах лабораторных животных

при отравлениях циклофосфаном и доксорубицином позволяет использовать показатели этой биохимической системы и при оценке побочных эффектов действия цитостатиков в клинике.

3. При проведении доклинических и клинических испытаний новых фармакологических препаратов в качестве скриниговой оценки их цитопротектор-ных свойств рекомендуется использование определения параметров, характеризующих состояние системы глутатиона и сопряженных биохимических процессов (концентрация восстановленного глутатиона, сульфгидрильных групп белков, малонового диальдегида, диеновых конъюгатов, активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, глутатионредуктазы, глутатионперокси-дазы, глутатион-Б-трансферазы, каталазы).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Карпищенко А.И. Влияние острой интоксикации дихлорэтаном на показатели системы глутатиона / А.И.Карпищенко, С.И. Глушков // Клиническая лабораторная диагностика.- 1997- № б.- С.52.

2. Карпищенко А.И. Глутатион-зависимая антиоксидантная система в некоторых тканях крыс в условиях острого отравления дихлорэтаном / А.И.Карпищенко, С.И.Глушков, В.В.Смирнов // Токсикологический вестник- 1997,- №3-С.17-23.

3. Карпищенко А.И. Методика определения показателей системы глутатиона в лимфоцитах человека / А.И.Карпищенко, В.В.Смирнов, С.И.Глушков,

B.Л.Пастушенков // Клиническая лабораторная диагностика.- 1997.- № 12-

C.41-42.

4. Карпищенко А.И. Роль процессов перекисного окисления липидов и глута-тион-зависимой антиоксидантной системы в патогенезе острого отравления дихлорэтаном / А.И.Карпищенко, Н.Э.Дворцова, С.И.Глушков // Биоантиокси-дант/Материалы международного симпозиума-Тюмень, 1997.-С.157-158.

5. Глушков С.И. Влияние этомерзола на состояние глутатион-зависимой антиоксидантной системы / С.И.Глушков, А.Б.Бутенко, В.Н.Гончаренко // Международный сборник научных трудов V научно-практической конференции по созданию и апробации новых лекарственных средств "Лекарства - человеку".-Харьков, 1998.-Т.6.-С.65-66.

6. Глушков С.И. Использование этомерзола в коррекции антиоксидантной защиты при остром отравлении дихлорэтаном / С.И.Глушков, А.Б.Бутенко, А.И.Карпищенко, В.Н.Гончаренко // Там же - С.69-70.

7. Карпищенко А.И. Система белков теплового шока БТШ 70 у крыс при отравлении дихлорэтаном / А.И.Карпищенко, С.А.Куценко, С.И Глушков., О.Н.Демидов // Токсикологический вестник - 1999- №6,- С.8-12.

8. Башарин В.А. Нарушения антирадикальной защиты и отдаленные последствия интоксикации гидразиноидами / В.А.Башарин, С.А.Куценко, А.И.Карпищенко, С.И.Глушков // Медицинские последствия экстремальных воздействий на организм.- СПб, 2000.- С.204-205.

9. , Глушков С.И. Некоторые аспекты нейротоксического действии 1,2-дихлорэтана / С.И.Глушков, С.А.Куценко, А.И.Карпищенко, М.В.Александров // Современные подходы к диагностике и лечению нервных и психических заболеваний / Материалы юбилейной научной конференции с международным участием, посвященной 140-летию кафедры душевных и нервных болезней Военно-медицинской академии-СПб., 2000,-С.214.

10. Глушков С.И. Тиолдисульфидный статус эритроцитов в условиях гипоксии при остром отравлении нейротропными ядами / С.И.Глушков, С.А.Куценко, Т.М.Новикова и др. // Международный симпозиум. Здоровье и химическая безопасность на пороге XXI века,- Спб.: изд. СПбМАПО, 2000,- С.48-49.

11. Ивницкий ю.ю: Влияние циклофосфана на клеточное дыхание в тканях печени, почек и головного мозга / Ю.Ю.Ивницкий, А.В.Носов, С.И.Глушков // Медицинские последствия экстремальных воздействий на организм.- СПб, 2000,-С. 234-235.

12. Куценко С.А. Влияние острой интоксикации нейротропными ядами на интенсивность перекисного окисления липидов в эритроцитах / С.А.Куценко, С.И.Глушков, Т.М. Новикова и др. // Международный симпозиум. Здоровье и химическая безопасность на пороге XXI века.- Спб.: изд. СПбМАПО, 2000.-С. 51-52. '

13. Куценко С.А. Роль процессов перекисного окисления липидов и изменений системы глутатиона в механизмах неЗротоксичности производных гидразина / С.А.Куценко, А.И.Карпищенко, С.И.Глушков, В.А.Башарин // Современные подходы к диагностике и лечению нервных и психических заболеваний / Материалы юбилейной научной конференции с международным участием, посвященной 140-летию кафедры душевных и нервных болезней Военно-медицинской академии - СПб., 2000.- С.210.

14. Ливацов Г.А. Активность ферментов антирадикальной защиты в эритроцитах при острых отравлениях нейротропными ядами / Г.А Ливанов, Б.В.Батоцыренов, М.В.Климина, С.И. Глушков и др. // Международный симпозиум. Здоровье и химическая безопасность на пороге XXI века- Спб.: изд. СПбМАПО, 2000.- С.53-54.

15. Ливанов Г.А. Влияние реамберина на содержание восстановленного глутатиона и интенсивность процессов перекисного липидов при остром отравлении нейротоксическими ядами / Г.А.Ливанов, Б.В.Батоцыренов, М.В.Климина, С.И.Глушков и др. // Там же.- С.54-55.

16. Ливанов Г.А. Клиническая эффективность реамберина у больных с острыми тяжелыми отравлениями нейротропными ядами / Г.А.Ливанов, С.И.Глушков, Б.В.Батоцыренов, А.Л.Коваленко // Aqua Vitae- 2000.- № 4,-С.46-48.

17. Башарин В.А. Изменения глутатион-редухтазной и глюкозо-6-фосфат-дегидрогецазной активности тканей при острой интоксикации гидразиноидами / В.А.Башарин, С.И.Глушков, С.А.Куценко, А.И.Карпищенко // Медицинские аспекты радиационной и химической безопасности / Материалы Российской научной конференции-СПб: Воен. мед. акад, 2001 -С.306-307.

18. Глушков С.И. Влияние острой интоксикации гидразиноидами на состояние тиол-дисульфидного статуса и интенсивность процессов перекисного окисления липидов в тканях экспериментальных животных / С.И.Глушков, С.А.Куценко, А.И.Карпищенко, В.А.Башарин // Там же.- С.309 -311.

19. Ивницкий Ю.Ю. Применение реамберина в интенсивной терапии эндоток-сикоза при острых тяжелых отравлениях нейротропными ядами / Ю.Ю.Ивницкий, С.А.Куценко, С.И.Глушков и др. // Там же.- С.369-371.

20. Ивницкий Ю.Ю. Принцип метаболической коррекции в профилактике и неотложной терапии экстремальных состояний / Ю.Ю.Ивяицкий, С.И.Глуш-ков, А.В.Носов // Там же,- С.403-405.

21. Карпищенко А.И. Активность ферментов антиперекисной защиты в тканях различных органов в условиях острого отравления производными гидразина / А.И.Карпищенко, С.А.Куценко, С.И.Глушков, В.А.Башарин // Там же - С.308-309.

22. Куценко С.А. Глутатион-зависимая антиоксидантная система в некоторых тканях крыс в условиях острого отравления производными гидразина / С.А.Куценко, А.И.Карпищенко, В.А.Башарин, С.И.Глушков // Авиакосмическая экологическая медицина.- 2001,- Т.35.— № 1.- С.68-73.

23. Ливанов Г.А. Влияние Регмберина на течение острых тяжелых отравлений нейротропными ядами / Г.А.Ливанов, С.А.Куценко, С.И.Глушков. и др. // В кн. Исаков В.А., Сологуб Т.В., Коваленко А.Л., Романцов М.Г. Реамберин в терапии критических состояний: руководство для врачей,- 3-е изд., доп.- СПб.: Минимакс, 2001,- С.87-126.

24. Ливанов Г.А. Коррекция нарушений респираторного компонента транспорта кислорода при острых тяжелых отравлениях нейротоксическими ядами метаболическими антигипоксантами / Г.А.Лиг.анов, С.А.Куценко, Б.В.Батоцыренов, С.И.Глушков и др. // Тезисы докладов VIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство».- 2001С.468.

25. Ливанов Г.А. Коррекция нарушений транспорта кислорода у больных с острыми тяжелыми отравлениями нейротропными ядами метаболическим анти-гипоксантом реамберин / Г.А.Ливанов, С.А.Куценко, Б.В.Батоцыренов, С.И.Глушков и др.-// Международный медицинский журнал.- 2001 - №2,-С.127-128.

26. Ливанов Г.А. Коррекция свободнорадикапьных процессов препаратом янтарной кислоты (реамберином) в интенсивной терапии острых отравлений нейротропными ядами / Г.А.Ливанов, С.А.Куценко, Б.В.Батоцыренов, С.И.Глушков и др. // Анестезиология и реаниматология,- 2001,- №4,- С.28-31.

27. Ливанов Г.А. Лекарственная терапия тканевой гипоксии и ее последствий / Г.А.Ливанов, С.А.Куценко, Б.В.Батоцыренов, С.И.Глушков и др. // Тезисы докладов VIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство»,-2001.-С.439.

28. Ливанов Г.А. Применение прёпаратов янтарной кислоты у больных с острыми тяжелыми отравлениями нейротропными ядами / Г.А.Ливанов, С.А.Куценко, Б.В.Батоцыренов, С.И.Глушков и др. // Медицинские аспекты радиационной и химической безопасности / Материалы Российской научной конференции,- СПб: Воен. мед. акзд, 2001,- С.343-346.

29. Ливанов Г.А. Применение реамберина при острых отравлениях психотропными средствами / Г.А.Ливанов, С.А.Куценко, Б.В.Батоцыренов, С.И.Глушков и др. // Тезисы докладов VIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство».- 2001С.439.

30. Ливанов Г.А. Роль нарушений системы антиоксидантной защиты в формировании критических состояний у пациентов с острыми тяжелыми отравлениями веществами с угнетающим действием на ЦНС и возможности их коррекции препаратом «Реамберин» / Г.А.Ливанов, С.А.Куценко, С.И.Глушков и др. // Международный медицинский журнал.- 2001,- №6,- С.529-53.

31. Новикова Т.М. Состояние системы глутатиопа в тканях различных органов при остром отравлении циклофосфаном / Т.М.Новикова, С.И.Глушков,

B.А.Кашуро // Медицинские аспекты радиационной и химической безопасности / Материалы Российской научной конференции - СПб: Воен. мед. акад, 2001 -

C.296-298.

32. Носов A.B. Тканевое дыхание и состояние системы глутатиона в тканях почек при остром отравлении циклофосфаном / А.В.Носов, С.И.Глушков, Т.М.Новикова // Там же.- С.298-300.

33. Аксенов В.В. Состояние системы глутатиона в тканях сердца при острых отравлениях доксорубицином / В.В.Аксенов, А.А.Новик, С.И.Глушков,

B.А.Кашуро // Тезисы научных докладов 1П съезда биохимического общества.-2002.-С.132.

34. Батоцыренов Б.В. Возможности использования метаболического антиги-поксанта цитофлавин в коррекции эндотоксикоза у больных с острыми тяжелыми отравлениями нейротропными ядами / Б.В.Батоцыренов, Г.А.Ливанов,

C.И.Глушков и др. // Вестник СПГМА им. И.И.Мечникова.- 2002. - №4 (3).-С. 115-119.

35. Глушков С.И. Биохимические механизмы действия препаратов на основе янтарной кислоты и возможности их клинического применения в терапии экстремальных состояний / С.И.Глушков, С.А.Куценко, Ю.Ю.Ивницкий и др. // Тезисы докладов IX Российского национального конгресса «Человек и лекарство»,- М - 2002,- С.542—543.

36. Глушков С.И. Состояние глутатион-зависимой антирадикалыюй системы и процессов перекисного окисления ляпидов в различных тканях лабораторных животных при острых отравлениях тиопенталом натрия / С.И.Глушков, С.А.Куценко, Г.А.Ливанов и др. // Токсикологический вестник,- 2002.- №1.- С. 11-17.

37. Кашуро В.А. Возможность использования определения показателей системы глутатиона в лабораторной диагностике осложнений курсового лечения циклофосфаном / В.А.Кашуро, А.И.Карпшценко, С.А.Куценко, С.И.Глушков // Клиническая лабораторная диагностика - 2002 - №10 - С.43.

38. Кашуро В.А, Динамика активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в эритроцитах и тканях печени лабораторных животных при отравлениях циклофосфаном / В.А.Кашуро, А.И.Карпищенко, С.А.Куценко, С.И.Глушков и др // Биохимия - Медицине / Тезисы докладов Всероссийской научной конференции, посвященной 110-летию кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики Военно-медицинской академии и 100-летию со дня рождения академика АМН СССР Г.Е.Владимирова.- СПб, 2002 - С.35.

39. Кашуро В.А. Динамика изменений концентраций сульфгидрильных групп тканевых белков в эритроцитах и тканях печени лабораторных животных при отравлениях циклофосфаном / В.А.Кашуро, С.А.Куценко, С.И.Глушкоз и др. //, Там же.- С.Зб. .

40. Кашуро В.А. Динамика концентрации восстановленного глутатиона в эритроцитах и тканях печени лабораторных животных при отравлениях циклофосфаном / В.А.Кашуро, А.И.Карпищенко, С.А.Куценко, С.И.Глушков и др. // Там же — С.34-35.

41. Кашуро В.А. Состояние системы глутатиона в тканях лабораторных животных при острых отравлениях циклофосфаном / В.А.Кашуро,

A.И.Карпищенко, С.А.Куценко, С.И.Глушков // Тезисы научных докладов III съезда биохимического общества,- 2002 - С.171—172.

42. Карпищенко А.И. Глутатион-зависимая антиоксидантная система в норме и при различных патологических состояниях / А.И.Карпищенко, С.А.Куценко,

B.В.Смирнов, С.И.Глушков // Там же.- С.224-225.

43. Куценко С.А. Интенсивность процессов перекисного окисления липидов при острых интоксикациях производными гидразина / С.А.Куценко, А.И.Карпищенко, С.И.Глушков, В.А.Башарин//Там же-С.182.

44. Ливанов Г.А. Комбинированный метаболический антигипоксант в интенсивной терапии тяжелых отравлений нейротропными ядами / Г.А.Ливанов, Б.В.Батоцыренов, Н.В.Белякова, С.И.Глушков и др. // РеаМберин: реальность и перспективы / Сборник научных статей - СПб, 2002.-С.99-107.

45. Ливанов Г.А. Нарушение транспорта кислорода при острых отравлениях нейротропными. препаратами и его метаболическая коррекция / Г.А.Ливанов, Б.В.Батоцыренов, С.И.Глушков и др. // Биохимия - Медицине / Тезисы докладов Всероссийской научной конференции, посвященной 110-летию кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики Военно-медицинской академии и 100-летию со дня рождения академика АМН СССР Г.Е.Владимирова-СПб, 2002,-С.45-53. "

46. Ливанов Г.А. Нарушение транспорта кислорода при острых отравлениях нейротропными препаратами и его метаболическая коррекция / Г.А.Ливанов, Б.В.Батоцыренов, С.И.Глушков и др. //Международный медицинский хсурнал-2002,- №1.- С. 33-36.

47. Ливанов Г.А. Роль нарушений системы антиоксидантной защиты в формировании критических состояний у пациентов с острыми тяжелыми отравлениями веществами с угнетающим действием на ЦНС и возможности их коррекции препаратом реамберин / Г.А.Ливанов, С.А.Куценко, С.И.Глушков и др. // Биохимия - Медицине / Тезисы докладов Всероссийской научной конференции, посвященной 110-летию кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики Военно-медицинской академии и 100-летию со дня рождения академика АМН СССР Г.Е.Владимирова.- СПб, 2002,- С.34-44.

48. Ливанов Г.А. Фармакологическая коррекция последствий гипоксии у больных в токсической коме вследствие острого отравления ядами нейротропного

действия / Г.А.Ливанов, М.Л.Калмансон, Б.В.Батоцыренов, С.И.Глушков, А.Н.Лодягин //Анестезиология и реаниматология,- 2002-№2.-С.14-17.

49. Новикова Т.М. Влияние цитофлавина на состояние системы глутатиона и интенсивность процессов перекисного окисления липидов в тканях головного мозга лабораторных животных при острых отравлениях тиопенталом натрия / Т.М.Новикова, С.И.Глушков, С.А.Куценко и др. // Вести. СПГМА им. И.И.Мечникова- 2002.-№1-2 (З).-СЛ 49-152.

50. Новикова Т.М. Возможность использования определения концентрации восстановленного глутатиона в эритроцитах пациентов с острыми отравлениями веществами ссдативно-гишготического действия в оценке тяжести и прогнозе исхода интоксикаций / Т.М.Новикова, А.И.Карйищенко, С.А.Куценко, С.И.Глушков // Биохимия - Медицине / Тезисы докладов Всероссийской научной конференции, посвященной 110-летию кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики Военно-медицинской академии и 100-летию со дня рождения академика АМН СССР Г.Е.Владимирова.- СПб, 2002 - С.63-64.

51. Новикова Т.М. Интенсивность перекисного окисления липидов в эритроцитах пациентов с острыми тяжелыми отравлениями веществами седативно-гипнотического действия / Т.М.Новикова, С.И.Глушков, А.И.Карпищенко и др. //Там же,-С.67-68.

52. Новикова Т.М. Определение показателей системы глутатиона в эритроцитах пациентов как лабораторный тест оценки эффективности проводимого лечения и прогноза исхода острых, отравлений веществами седативно-гипнотического действия / Т.М.Новикова, А.И.Карпищенко, С.А.Куценко, С.И.Глушков // Клиническая лабораторная диагностика.- 2002,— № 10 — С.44.

53. Новикова Т.М. Состояние системы глутатиона при острых отравлениях веществами седативно-гипнотического действия / Т.М.Новикова, А.И.Карпищенко, С.А.Куценко, С.И.Глушков // Тезисы научных докладов III съезда биохимического общества.- 2002.- С. 197-198.

54. Аксенов В.В. Влияние цитофлавина на состояние системы глутатиона в сердечной мышце при острых отравлениях доксорубицином / В.В.Аксенов, С.И.Глушков, Т.М.Новикова, А. А.Новик // Тезисы докладов X Российского национального конгресса «Человек и лекарство».- М, 2003 — С.570.

55. Аксенов В.В. Система глутатиона в оценке средств коррекции доксоруби-циновой кардиомиопатии / В.В.Аксенов, С.И.Глушков, Т.М.Новикова, A.A. Новик // Там же - С.570-571.

56. Глушков С.И. Изучение системы глутатиона при острых отравлениях цик-лофосфаном и диалкил-производным фосфорилтиохолина - перспективный метод оценки состояния здоровья персонала объектов уничтожения химического оружия / С.И.Глушков, С.А.Куценко, В.А.Кашурс и др. // «Медицинские и биологические проблемы, связанные с уничтожением химического оружия» / Тезисы докладов международного симпозиума - Волгоград, 2003.- С.205-206.

57. Глушков С.И. Система глутатиона как перспективное направление изучения цитотоксических эффектов действия ксенобиотиков / С.И.Глушков,

С.А.Куценко, Т.М.Новиковаи др. // Тезисы докладов 2-го съезда токсикологов России.- М: Российский регистр потенциально опасных химических и биологических веществ Минздрава России, 2003.- С.77-78.

,58. Глушков С.И. Состояние системы глутатиона в тканях печени крыс при острых отравлениях циклофосфаном / С.И.Глушков, С.А.Куценко, А.И.Карпи-щенко и др. // Токсикологический вестник - 2003.- №4.- С.25-30.

59. Глушков С.И. Состояние системы глутатиона и процессов перекисного окисления липидов в эритроцитах пациентов в клинике острых отравлений веществами седативно-гипнотмеского действия / С.И.Глушков, С.А.Куценко, А.И.Карпищенко, Т.М.Новикова // Там же,- 2003,- №5,- С.6-12.

60. Кашуро В.А. Влияние сукцинатсодержащего препарата Ремаксол на состояние цитопротекторной системы глутатиона в тканях печени при острых отравлениях циклофосфаном / В.А.Кашуро, С.А.Куценко, А.И.Карпищенко, С.И.Глушков // Тезисы докладов X Российского национального конгресса «Человек и лекарство».- М, 2003 - С.613.

61. Кашуро В.А. Влияние сукцинатсодержащего препарата Ремаксол на состояние цитопротекторной системы глутатиона в тканях почек при острых отравлениях циклофосфаном / В.А.Кашуро, С.А.Куценко, А.И.Карпищенко, С.И.Глушков // Там же - С.613-614.

62. Кашуро В.А. Фармакологическая коррекция системы глутатиона - перспективное направление профилактики и терапии острых и повторных отравлений нейро- и цитотоксикаптами / В.А.Кашуро, С.А.Куценко, С.И.Глушков и др. // «Медицинские и биологические проблемы, связанные с уничтожением химического оружия» / Тезисы докладов международного симпозиума.— Волгоград, 2003.-С.215.

63. Ливанов Г.А. Особенности формирования эндотоксикоза в ранней фазе тяжелых форм острых отравлений / Г.А.Ливанов, С.А.Куценко, Б.В.Батоцыренов, С.И.Глушков и др. // Тезисы докладов 2-го съезда токсикологов России.- М: Российский регистр потенциально опасных химических и биологических веществ Минздрава России, 2003 - С.362-364.

64. Ливанов Г.А. Особенности формирования эндотоксикоза у больных в критическом состоянии в результате острых отравлений пейротрогшыми средствами и пути коррекции / Г.А.Ливанов, М.Я.Малахова, Б.В.Батоцыренов, С.А.Куценко, С.И.Глушков и др. // Вестник интенсивной терапии - 2003.- №1.-С.27-33.

65. Петров АЛО. Оценка гепатопротекторного действия различных комбинаций препарата цигохол в гомогенатах тканей печени / А.Ю.Петров, Ю.В.Казимова, А.Л.Коваленко, С.И.Глушков II Тезисы докладов X Российского национального конгресса «Человек и лекарство».- М, 2003.- С.647.

66. Glushkov S.I. Research into glutathione system at acute intoxications by cyclo-phosphane and phosphorylthiocholine derivatives. A promising method for health state evaluathion of personnel of chemical weapon destruction facilities / S.I.Glushkov, S.A.Kutsenko, V.A.Kashuro et al. // Medical and Biological Aspects of

Chemical Weapons Stockpile Demilitarization / Internatonal Symposium Proceedings.- Volgograd, 2003. - P.5 8-59.

67. Kashuro V.Ä. Pharmacological correction of glutathione system as a promising aim of pr ophylaxis and therapy of acute and repeated poisonings by neuro- and cyto-toxicants / V.A.Kashuro, S.A.Kutsenko, S.I.Glushkov et al. // Там же - P.67.

68. Глушков С.И. Нарушения состояния системы глутатиона в патогенезе развития доксорубициновой кардиомиопатии / С.И.Глушков, Т.М.Новикова, В.В.Аксенов, А.Д.Лавлинский // Тезисы докладов Российского национального конгресса кардиологов,- Томск, 2004 - С.44.

69. Глушков С.И. Новые направления поиска средств профилактики развития доксорубициновой кардиомиопатии / С.И.Глушков, Т.М.Новикова, В.В.Аксенов П Бюллетень научно-исследовательского института кардиологии им. В.А^Алма-зова.-2004,-Т. 2, № 1.-С.196.

70. Глушков С.И. Определение показателей состояния системы глутатиона в эритроцитах как диагностический прием оценки риска формирования доксорубициновой кардиомиопатии / С.И.Глушков, Т.М.Новикова, В.В.Аксенов // Там же,-С. 196.

71. Глушков С.И. Система глутатиона и гипоксиия в условиях острых интоксикаций / С.И.Глушков, Т.М.Новикова, Т.И.Глушкова, //, Фармакотерапия гипоксии и ее последствий при критических состояниях / Материалы Всероссийской научной конференции - СПб, 2004 - С.11-12.

72. Глушков С.И. Система глутатиона как естественная цитопротекторная система в условиях острых интоксикаций / С.И.Глушков, С.А.Куценко // Медико-биологические проблемы противолучевой и противохимической защиты,- Спб.: ООО «Издательство Фолиант», 2004,- С.67-68.

73. Глушков С.И. Состояние системы глутатиона в тканях легких при острых интоксикациях паракватом / С.И.Глушков, Т.М.Новикова, Т.И.Глушкова // Там же.- С.65-66.

74. Глушков С.И. Сравнительная оценка состояния системы глутатиона в сердечной мышце и в эритроцитах при формировании экспериментальной доксорубициновой кардиомиопатии / С.И.Глушков, Т.М.Новикова, В.В.Аксенов, А.Д.Лавлинский // Тезисы докладов Российского национального конгресса кардиологов,- Томск, 2004,- С. 111.

75. Глушков С.И. Сравнительная оценка состояния системы глутатиона в тканях внутренних органов при острых интоксикациях паракватом / С.И.Глушков, Т.М.Новикова, Т.И.Глушкова // Медико-биологические проблемы противолучевой и противохимической защиты.- Спб.: ООО «Издательство Фолиант», 2004.- С.66-67.

76. Кашуро В.А. Изучение влияния антигипоксантов на систему глутатиона при остром отравлении циклофосфаном / В.А.Кашуро, С.И.Глушков, Т.М.Новикова // Там же - С.349-350.

77. Кашуро В.А. Исследование эффективности антиоксидантных препаратов в качестве средств медицинской зашиты при отравлениях алкилирующими аген-

тами / В.А.Кашуро, С.И.Глушков, В.В.Смирнов, Л.Д.Смирнов // Там же,— С.351-352.

78. Кашуро В.А. Коррекция цитотоксических эффектов действия циклофосфа-на и состояния системы глутатиона / В.А.Кашуро, С.И.Глушков, С.А.Куцен-ко

■ и др. И Вестник СПГМА им. И.И.Мечникова.- 2004 - №3- С.62-67.

79. Кашуро В.А. Показатели перекисного окисления липидов при острых отравлениях циклофосфаном / В.А.Кашуро, С.И.Глушков, В.В.Смирнов // Там же,-С.100-101.

80. Кашуро В.А. Синтетические производные глутатиона - новый подход к поиску антидотов резорбтивного действия ипритов / В.А.Кашуро, С.И.Глушков, Т.М.Новикова, В.Ю.Ковтун // Медико-биологические проблемы противолучевой и противохимической защиты - Спб.: ООО «Издательство Фолиант», 2004,— С.350-351.

, 81. Куценко С.А. Влияние препарата «Мексидол» ■ на содержание в тканях сердца лабораторных животных малонового диальдегида и глутатиона при повторной интоксикации доксорубицином в дозе 0,3 LD5o / С.А.Куценко, С.И.Глушков, В.В.Аксенов и др. // Там же - С.358-359.

82. Куценко С.А. Содержание восстановленного глутатиона в эритроцитах при остром отравлении производными гидразина / С.А.Куценко, А.И.Карпищенко,

B.А.Башарин, С.И.Глушков//Там же,-С. 108-109.

83. Ливанов Г.А. Использование цитофлавина в интенсивной терапии больных с тяжелыми формами острых отравлений / Г.А.Ливанов, Х.В.Батоцыренова, А.Н.Лодягин, С.И.Глушков и др. // Там же - С.361-362.

84. Ливанов Г.А. Применение цитофлавина при токсической и постгипоксиче-ской энцефалопатии: Пособие для врачей / Г.А.Ливанов, Б.В.Батоцыренов,

C.И.Глушков и др.- СПб.: ООО «Тактик-Студио», 2004 - 44 с.

85.Нагибович O.A. Окислительный стресс при диабетической нефропатии / О.А.Нагибович, С.И.Глушков, Т.М.Новикова, В.А.Тарасов // Нефрология. -2004,- Т.8, Приложение 2,- С.139-140.

86. Глушков С.И. Состояние системы глутатиона в тканях сердца крыс при острых отравлениях доксорубицином / С.И.Глушков, С.А.Куценко, Т.М.Новикова, В .В .Аксенов // Вопросы онкологии - 2005 - Т. 51.- № 1.- С. 108-112.

87. Glushkov S.I. Glutathione system and cytotoxic effects of xenobiotics / S.I.Glushkov, S.A.Kutsenko // XXXVI World Congress on Military Medicine- St. Petersburg, 2005.- P. 192.

88. Karpischenko A.I. The alteration in the glutathione system by the influence of cyclophosphamide and the drugs of pharmacological correction / A.I.Karpischenko, V.A.Kashuro, S.A.Kutsenko, S.I.Glushkov//Там же-P. 224.

89. Глушков С.И. Состояние системы глутатиона и перекисного окисления липидов в тканях печени и почек при острых отравлениях циклофосфаном / С.И.Глушков, В.А.Кашуро, А.И.Карпищенко и др. // Нефрология,- 2006.- №2-С.81-85.

Подписано в печать ь", И- Формат 60x84 '/16.

Объем 2 пл. Тираж 100 экз. Заказ №

Типография ВМедА, 194044, СПб., ул. Академика Лебедева, 6

Актуальность. Количество острых отравлений в развитых странах мира (например, в США около 600 ООО случаев в год) и Российской Федерации ежегодно возрастает, не снижается существенно и число летальных исходов [113, 115], все это указывает на необходимость совершенствования мероприятий по оказанию помощи отравленным.

Действие многочисленных химических веществ на организм человека сложно и многообразно. Существенно различаются механизмы токсического действия ксенобиотиков, патогенез и проявления интоксикации. Поэтому решение задачи совершенствования оказания помощи отравленнным сопряжено с необходимостью разработки новых многочисленных этиотропных препаратов (антидотов), а также средств патогенетической и симптоматической терапии острых интоксикаций. Вместе с тем организм человека и животных располагает целым рядом сложных биохимических систем (метаболизма ксенобиотиков, антирадикальной защиты, репарации поврежденных биологических молекул и т.д.), во многом определяющих чувствительность к действию токсикантов разного строения. К числу таких систем относится и система глутатиона. Она принимает участие в реализации целого ряда важнейших физиологических процессов: детоксикации и антиоксидантной защиты; в биохимических превращениях витаминов С, Е, липоевой кислоты и убихинона; в регуляции тиол-дисульфидного равновесия; в процессе транспорта аминокислот; в поддержании восстановленной среды клетки; в регуляции углеводного, липидного, белкового и нуклеинового обменов; в поддержании гемоглобина эритроцитов в восстановленном состоянии; в поддержании оптимального состояния и функций биологических мембран; в регуляции клеточной пролиферации; в обмене ряда эйкозаноидов - простаг-ландинов и лейкотриенов; глутатион выступает и в качестве резерва цистеи-на в клетке; участвует в регуляции функциональной активности лимфоцитов и обеспечении иммунного ответа организма; оказывает регулирующее влияние на синтез белков теплового шока; принимает участие в реализации механизмов программируемой клеточной гибели [98, 99, 350, 352, 359].

Все это позволяет, по мнению Л.А.Тиунова (1988, 1995), рассматривать систему глутатиона в качестве механизма обеспечения неспецифической резистентности организма к действию широкого круга токсикантов. Указанное выше способствует появлению новых фармакологических препаратов на основе глутатиона, в том числе, для профилактики и лечения токсического повреждения тканей при действии ипритов, цитостатиков и других цитотоксических агентов [3, 33, 47, 73, 101].

В системе диагностики риска развития поражений тканей внутренних органов при воздействии цитотоксических агентов прослеживаются существенные недостатки: выявляемые современными лабораторными и инструментальными методами изменения часто указывают на глубокий, мало обратимый характер повреждений тканей [3, 73]. В то же время имеются данные о перспективности определения содержания концентрации восстановленного глутатиона в клетках крови при оценки тяжести отравлений различными токсикантами [45, 70, 112].

По мере накопления фактического материала становится очевидным, что роль нарушений системы глутатиона в патогенезе интоксикаций веществами с различными механизмами действия далеко не одинакова. Подтверждением этого может служить и низкая эффективность цитопротекторных препаратов, которые назначаются порой без должных на то показаний.

Таким образом, выявление закономерностей реагирования системы глутатиона на острое воздействие химических веществ с различными механизмами токсического действия является важной проблемой современной токсикологии, решение которой может способствовать существенному росту эффективности оказания помощи отравленным, благодаря целенаправленному совершенствованию средств фармакологической коррекции, точного определения показаний к их назначению.

В СвЯЗн с эта и целью нашего исследования явилось выявление основных закономерностей реакций системы глутатиона на острое воздействие химических веществе различными механизмами токсического действия и на их основе разработка путей оптимизации диагностики и тактики оказания помощи отравленным при острых интоксикациях,

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

- изучить в динамике изменения системы глутатиона при однократном и повторном воздействии а разных дозах веществ с различными механизмами токсического действия (цнклофосфан, I ^-дихлорэтан, jj-хлорвиннл-днхлорарсин, доксорубицин, паракват, фенил гидразин, тиопеитал натрия, этанол, азалептин, 1 J-даметнлгнлразкн, дналкнлнронзводиое фосфорнл-тиохолина) в ряде органов (печени, почки, сердце, головной мозг, эритроциты ) экспериментальных животных;

- исследовать влияние на состояние системы глутатиона и сопряженных биохимических систем м тканях отравленных лабораторных животных принятых на снабжение и перспективных лекарственных средств различных фармакологических групп (антиоксиданТы, антигнплксанты, ноо-тропные препараты, производные глутатиона и предшественники его синтеза, индукторы белкового синтеза, хелаторные агенты), предназначенных для зашиты клеток от повреждающего действия ядов;

- определить возможность использования показателей состояния системы глутатиона в клетках периферической крови с целью диагностики степени тяжести интоксикации, эффективности проводимого лечения и прогноза исхода интоксикации.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Острые отравления ксенобиотиками с различными механизмами токсического действия вызывают существенные изменения состояния системы глутатиона в тканях отравленных животных. Их направленность, выраженность и длительность определяются величиной введенной дозы токсиканта, его токсико-кинетическими и токсико-динамическими параметрами (распределением в организме и преимущественным накопле-ниием в тканях, особенностями метаболических превращений, наличием специфических механизмов токсического действия и т.д.), тканевыми особенностями обмена глутатиона.

2. В основе нарушений обмена глутатиона в органах и тканях отравленных животных лежит реализация цитотоксических эффектов действия ксенобиотиков. Возможно существование ряда независимых самостоятельных пусковых механизмов повреждения системы глутатиона и связанных с этим путей реализации цитотоксического действия токсикантов.

3. При разработке новых препаратов цитопротекции и изучении их эффективности в экспериментальных условиях и в клинике может использоваться оценка динамики изменений системы глутатиона в тканях различных органов отравленных животных и в эритроцитах пациентов.

4. Динамическое исследование показателей системы глутатиона в эритроцитах отравленных лиц может быть включено в систему лабораторной диагностики тяжести цитотоксического поражения тканей, эффективности проводимого лечения и прогноза исхода интоксикации.

Научная новизна. Впервые проведена комплексная оценка изменений состояния системы глутатиона и сопряженных биохимических процессов в различных тканях экспериментальных животных (печень, почки, сердце, легкие, головной мозг, эритроциты) при острых отравлениях токсикантами с различными механизмами токсического действия. Показана взаимосвязь между направленностью и глубиной изменений состояния естественной системы цитопротекции и выраженностью цитотоксических свойств ксенобиотиков - активация ферментов обмена глутатиона (ГП, ГР, Г-6-Ф-ДГ) на фоне обратимого снижения содержания ВГ на 20 - 40 % при острых интоксикациях регуляторными ядами; уменьшение уровня ВГ в 2-10 раз ниже контроля, угнетение активности ферментов обмена глутатиона, срыва гомеостатиче-ских функций этой биохимической системы в тканях животных с острыми отравлениями веществами с выраженными цитотоксическими свойствами. Проведен анализ причин, вызывающих нарушения состояния системы глутатиона при острых отравлениях, выявлены механизмы развития данных изменений (истощение запасов ВГ при осуществлении глутатионовой конъюгации; повышенная наработка активных форм кислорода при относительной недостаточности резервов активности глутатионпероксидазы и ферментов восстановления глутатиона; образование в организме свободнорадикальных промежуточных продуктов метаболизма ксенобиотиков и критическое снижение уровня восстановленного глутатиона; развитие нарушений энергетического метаболизма клеток и тканей; прямое повреждение ферментов обмена глутатиона или нарушения процессов их биосинтеза; критическое расходование ВГ на поддержание нативной структуры биологически значимых макромолекул) и их роль в формировании цитотоксических эффектов действия широкого круга ксенобиотиков. Показана возможность использования показателей системы глутатиона в тканях отравленных животных при разработке новых направлений поиска средств фармакологической коррекции цитотоксических эффектов действия ксенобиотиков и оценке их эффективности. Обоснованы некоторые патогенетические направления цитопротекции (синтез антиоксидантов, антигипоксантов, комплексообразующих соединений, препаратов экзогенного глутатиона и предшественников его синтеза, индукторов белкового синтеза), связанные с восстановлением состояния обмена глутатиона. Показана принципиальная возможность использования показателей системы глутатиона в эритроцитах пациентов для установления степени тяжести интоксикации, эффективности проводимого лечения и прогноза исхода интоксикации. Разработаны диагностические схемы использования показателей системы глутатиона в эритроцитах пациентов с острыми отравлениями седативно-гипнотическими препаратами, включающие в себя динамическое определение (в течение 1 -3 суток) содержания восстановленного глутатиона, сульфгидрильных групп белков, малонового диальдегида. активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, глутатионредуктазы, глутати-oh-S-траисферазы. глутатионпероксидазы и каталазы.

Практическая значимость работы заключается в том, что полученные в ходе диссертационного исследования данные о динамике изменений состояния системы глутатиона в тканях человека и лабораторных животных в условиях острых отравлений ксенобиотиками с различными механизмами токсического действия позволяют сформулировать представление об общих механизмах цитотоксического действия ксенобиотиков, связанных с повреждениями указанной биохимической системы. Представления о механизмах нарушений состояния естественной системы цитопротекции могут быть положены в основу поиска новых лекарственных препаратов (антиоксидантов. антигипоксантов. комплексообразующих соединений, препаратов экзогенного глутатиона. индукторов белкового синтеза), обладающих цитопротектор-ными свойствами. Оценка состояния системы глутатиона в биосредах пациентов может использоваться в качестве метода установления степени тяжести интоксикации, эффективности проводимого лечения и прогноза течения интоксикации седативно-гипнотическими препаратами, цитостатиками (циклофосфан, доксорубицин). Определение параметров системы глутатиона и сопряженных биохимических процессов (концентрация восстановленного глутатиона, сульфгидрильных групп белков, малонового диальдегида. диеновых конъюгат. активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, глутатионредуктазы, глутатионпероксидазы, глутатион-Б-трансферазы. каталазы) может использоваться при проведении доклинических и клинических испытаний новых фармакологических препаратов для скриниговой оценки их цитопро-текторных свойств.

Реализация результатов исследования. Рекомендации, разработанные на основании полученных в ходе диссертационного исследования данных, используются в научной работе и учебном процессе на кафедре военной токсикологии и медицинской защиты и кафедре клинической биохимии и лабораторной диагностики Военно-медицинской академии, в лечебно-диагностическом процессе в Центре лечения острых отравлений Научно-исследовательского института Скорой Помощи им. И.И.Джанелидзе, были учтены при разработке и внедрении в клиническую практику отечественных препаратов «Реамберин», «Цитофлавин», «Мексидол».

Апробация работы проведена на национальных днях лабораторной медицины России (Москва, 1997, 2002), на международном симпозиуме "Био-антиоксидант" (Тюмень, 1997), на V научно-практической конференции по созданию и апробации новых лекарственных средств «Лекарства - человеку» (Харьков, 1998), на международной конференции "Медицинские последствия экстремальных воздействий на организм» (Санкт-Петербург, 2000), на международном симпозиуме «Здоровье и химическая безопасность на пороге XXI века» (Санкт-Петербург, 2000), на юбилейной научной конференции с международным участием, посвященной 140-летию кафедры душевных и нервных болезней Военно-медицинской академии (Санкт-Петербург, 2000), на Российской научной конференции «Медицинские аспекты радиационной и химической безопасности» (Санкт-Петербург, 2001), на VIII, IX и X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2001, 2002, 2003), на Всероссийской научной конференции «Биохимия - Медицине» (Санкт-Петербург, 2002), на III съезде Российского биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), на международном симпозиуме «Медицинские и биологические проблемы, связанные с уничтожением химического оружия» (Волгоград, 2003), на 2-ом съезде токсикологов России (Москва,

2003), на Российской научной конференции «Медико-биологические проблемы противолучевой и противохимической защиты» (Санкт-Петербург,

2004), на Российском национальном конгрессе кардиологов (Томск, 2004), на Всероссийской научной конференции «Фармакотерапия гипоксии и ее последствий при критических состояниях» (Санкт-Петербург, 2004), на XXXVI World Congress on Military Medicine (Санкт-Петербург, 2005).

Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 89 работ, в том числе 27 статей в отечественных научных журналах, оформлено 14 рационализаторских предложений.

281 ВЫВОДЫ

1. Острые интоксикации регуляторными ялами (седатнвно-гипнотические препараты, вещества с возбуждающим влиянием на ЦНС) в лиалозоне доз от 0,3 LDjo до LD» оказывают возмущающее воздействие на состояние системы глутатиона в тканях отравленных животных, что проявляется в виде умеренного и обратимого снижения содержания ВГ (иа 20-40 % ниже уровня контроля) на фоне актнваинн ферментов обмена глутатиона (ГП, ГР, Г-б-Ф-ДГ) и сохранности функций ан тирад и кал ьной зашиты и поддержания тиол-дисульфидного равновесия.

2. При острых отравлениях веществами с выраженными дитотокенческимн свойствами как в огноентсльно малых (0.3 LO»), так и срсднесмсртель-НЫХ дозах а тканях лабораторных животных отмечаются глубокие нарушения системы глутатиона, что проявляется в виде выраженного снижения уровня ВГ (в 2-Ю раз ниже контроля), угнетения активности ферментов обмена глутатиона н срыва гомеостатических функций угой биохимической системы.

3. Сроки и выраженность нарушений системы глутатиона (степень снижения содержания ВГ и активности глутатнон-зависнмых ферментов) в тканях отравленных животных тесно связаны с реализацией цнтотокенче-скнх эффектов действия ксенобиотиков,

4. Самостоятельными пусковыми механизмами повреждения системы глутатиона являются:

- истощение запасов восстановленного глутатиона при осуществлении глутатионовой конъюгации;

- повышенная наработка активных форм кислорода при относительной недостаточности резервов активности глутатионперокендаэы и ферментов восстановления глутатиона (глутатионрелуюазы н глюкозо-6-фосфатдегндропеназы,

- образование в организме свободнорвднкалиных промежуточных продуктов метаболизма ксенобиотиков н критическое снижение уровня восстановленного глутатиона;

- развитие нарушений энергетического метаболизма клеток и тканей;

- прямое повреждение ферментов обмена глутатиона или нарушения процессов их биостггеза:

- критическое расходование ВГ на поддержание натнвной структуры биологически значимых макромолекул.

5. Применение антидотов н средств патогенетической терапии приводит к коррекции ряда нарушений системы глутатиона в тканях отравленных животных, что позволяет использовать показатели этой биохимической системы при скрннннговой оценке иитопротскторных свойств антидотов, средств патогенетической и симптоматической терап и lift, Принципиальными направлениями поиска новых цитопротекториых препаратов, действие которых связано с восстановлением состояния системы глутатиона, является синтез антноксидантов, антигипоксатттов, комплек-сообразуюшнх соединений, препаратов экзогенного глутатиона н предшественников его синтеза, индукторов белкового синтеза. 7. Динамическое исследование Показателей системы глутатиона в эритроцитах пациентов (при ряде острых отравлений, в условиях проведения по-лнхнмиотсрапни и т.д.) может широко использоваться в клинической практике для оиенки тяжести ннтотоксического поражения тканей, течения интоксикации н прогноза се нехода, при оценке эффективности разрабатываемых антидотов и новых препаратов цитопротекции.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

I- В существующую систему лабораторной диагностики тяжести и прогноза исхода острых интоксикаций веществами седативно-гипнотического действия рекомендуется включение динамического определения в эритроцитах пациентов (начиная с 1 суток нахождения в стационаре) показателей, характеризующих состояние системы глутатиона и процессов ПОЛ: концентрации молонового диальдегида, восстановленного глутатиона, сульф-гндрндьных групп белков и активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. глутатнонредуктазы, глутатионпероксидазы. Для оценки состояния больного к прогноза исхода интоксикации рекомендуется применение разработанной схемы (табл. 13), при этом в качестве диагностических к прогностических критериев оценки тяжести и исхода интоксикации могут использоваться:

1) Определение выраженности снижения содержания ВГ в эритроцитах пациентов в 3-2 сутки нахождения в стационаре:

- до 50-65 % от уровня здоровых лиц (3,56 - 4,29 мкмоль/г гемоглобина -мужчины, 3,61 - 4,19 мкмоль/г гемоглобина - женщины} - относительно благоприятное течение интоксикации,

- до 50 % н ниже (< 3,36 мкмоль/г гемоглобина - мужчины, <2,33 мкмоль/г гемоглобина - женщины} - неблагоприятное течение, высокая вероятность летального исхода.

2) Наличие тенденции к повышению концентрации ВГ в эритроцитах, начиная с 3 суток:

- положительная динамика - благоприятный прогноз исхода;

- отсутствие положительной динамики - неблагоприятный прогноз нехода отравления.

3) Определение степени снижения активности ГП в эритроцитах пациентов в 1-2 сутки нахождения в стационаре;

- до 80-85 % от уровня здоровых лиц (3,76 - 4.95 мкмоль^мнн г гемоглобина) - мужчины, 5,19 - 6,34 - женщины) - относительно благоприятное течение интоксикации;

- до 60 % и ниже (<2.62 мкмоль/(мнн-г гемоглобина) - мужчины, <3,90 -женщины) - неблагоприятное течение, высокая вероятность летального нехода.

4) Наличие (отсутствие) динамики к повышению (восстановлению) активности ГП в эритроцитах, начиная с 2 суток исследовал ня:

- положительная динамика - благоприятный прогноз исхода;

- отсутствие положительной динамики - неблагоприятный прогноз нехода отравления.

5) Отсутствие (наличие) угнетения активности каталазы в эритроцитах пациентов в 1 -3 сутки нахождения в стационаре:

- сохранение или повышение активности фермента выше нормальных значений указывает на относительно благоприятные течение и прогноз исхода интоксикации;

- снижение активности фермента (<18,[ МкмольДмин-г гемоглобина) -мужчины и <20,9- женщины) неблагоприятное течение, высокая вероятность летал ьного нехода.

6) Степень повышения концентрации МДА в эритроцитах пациентов в 1-е сутки нахождения в стационаре:

- не более, чем в 2,5 раза выше уровня здоровых лнц (<8,70 нмоль'г гемоглобина у мужчин, <8,55 нмоль/г гемоглобина у женщин) - относительно благоприятное течение интоксикации;

- более чем, в 3,0 раза выше уровня здоровых лиц (>11.00 нмоль'г гемоглобина у мужчин. >10,00 нмоль/г гемоглобина у женщин) - неблагоприятное течение, высокая вероятность летального исхода.

7) Отсутствие (наличие) повышения концентрации МДА выше критического уровня (10,0-10,5 нмоль/г гемоглобина):

- отсутствие превышения критического уровня благоприятный прогноз исхода;

- превышение критического уровня - неблагоприятный прогноз исхода отравления.

8) Степень угнетения активности Г-6-Ф-ДГ в эритроцитах пациентов во 2-е сутки нахождения в стационаре;

- свыше 70 % от уровня здоровых лиц (>4,19 мкмоль/(мннг гемоглобина) -мужчины, >3,93 - женщины) - относительно благоприятное течение интоксикации;

- ниже 60 % от уровня здоровых лн|( (<3.49 - мужчины, <3,t9 - женщины) - неблагоприятное течение, высокая вероятность летального исхода.

9) Наличие (отсутствие) динамики к повышению (восстановлению) активности Г-б-Ф-ДГ в эритроцитах пациентов, начиная со 2-3 суток исследования: положительная динамика - благоприятный прогноз исхода; отсутствие положительной динамики - неблагоприятный прогноз исхода отравления.

10) Отсутствие (наличие) угнетения активности ГР в эритроцитах пациентов в 1 -2 сутки нахождения в стационаре

- отсутствие угнетения активности фермента указывает на относительно благоприятное течение и прогноз исхода интоксикации;

- наличие снижения активности фермента в ранние сроки - неблагоприятное течение, высокая вероятность летального исхода.

11) Степень максимальною снижения активности ГР в эритроцитах пациентов во 2-3 сутки нахождения в стационаре:

- свыше 70 % от уровня здоровых лиц (>150 мкмоль/(.минт гемоглобина)) -относительно благоприятное течение интоксикации;

- ниже 60 % от уровня здоровых лиц (<120 мкмоль/(мнн г гемоглобина)) -неблагоприятное течение, высокая вероятность летального исхода.

12) Глубина снижения копией грации СГ в эритроцитах пациентов в 1-2 сутки нахождения а стационаре:

- до 40-60 % от уровня здоровых дни (2.51 - 3,34 мкмоль/г гемоглобина -мужчины. 1,96 - 2,55 мкмоль/г гемоглобина - женщины) - относительно благоприятное течение интоксикации;

- до 20-40 % и ниже {<2,17 мкмоль/г гемоглобина - мужчины, <1,50 мкмоль/г гемоглобина - женщины) - неблагоприятное течение, высокая вероятность летального исхода.

13) Наличие (отсутствие) динамики к повышению концентрации СГ в эритроцитах, начиная со 2 суток исследования;

- положительная динамика - благоприятный прогноз исхода;

- отсутствие положительной динамики - неблаг оприятный прогноз исхода отравления.

2. Наличие зависимости между выраженностью нарушений обмена глутатиона в тканях внутренних органов и в эритроцитах лабораторных животных при отравлениях цнклофосфаном н доксорубнцнном позволяет использовать показатели этой биохимической системы и прн оценке побочных эффектов действия интостатнков в клинике,

3, При проведении доклинических и клинических испытаний новых фармакологических препаратов в качестве скрин нговой оценки их цнтопротекторных свойств рекомендуется использование определения параметров, характеризующих состояние системы глугатнока и сопряженных биохимических процессов (концентрация восстановленного глутатиона. сульфгнлрильных групп белков, малонового лнальдегнла. диеновых коньюгатов, активность глюкозо-б-фосфатдсгнлрогсназы. глутатнонредуктазы, глутатионпероксидаэы. глутатион-Х-трансферазы. катал азы).

2S7