Автореферат и диссертация по медицине (14.00.20) на тему:Экспериментальная оценка роли изменений системы глутатиона в реализации побочных цитотоксических эффектов повторного введения циклофосфана

ДИССЕРТАЦИЯ
Экспериментальная оценка роли изменений системы глутатиона в реализации побочных цитотоксических эффектов повторного введения циклофосфана - диссертация, тема по медицине
АВТОРЕФЕРАТ
Экспериментальная оценка роли изменений системы глутатиона в реализации побочных цитотоксических эффектов повторного введения циклофосфана - тема автореферата по медицине
Минаева, Любовь Валерьевна Санкт-Петербург 2007 г.
Ученая степень
кандидата медицинских наук
ВАК РФ
14.00.20
 
 

Автореферат диссертации по медицине на тему Экспериментальная оценка роли изменений системы глутатиона в реализации побочных цитотоксических эффектов повторного введения циклофосфана

00305Э816 На правах рукописи

МИНАЕВА / Любовь Валерьевна

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА РОЛИ ИЗМЕНЕНИЙ СИСТЕМЫ ГЛУТАТИОНА В РЕАЛИЗАЦИИ ПОБОЧНЫХ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ ПОВТОРНОГО ВВЕДЕНИЯ ЦИКЛОФОСФАНА

14.00.20 — токсикология, 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург

2007 ^ 7 [' К ¡? 9ППу

003059816

Работа выполнена в Военно-медицинасой академии имени С М Кирова Научные руководители:

доктор медицинских наук профессор Карпнщенко Анатолий Иванович кандидат медицинских наук Глушков Сергей Иванович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор Головко Александр Иванович доктор медицинских наук профессор Долго-Сабуров Валерий Борисович

Ведущая организация:

Федеральное государственное предприяше «НИИ гигиены, профпатологии и экологии человека» Федеральною медико-биологического агентства России

Защита диссертации состоится " 8 " июня 2007 I ода в часов на заседании диссертационного совета Д 215 002 11 в Военно-медицинской академии имени СМ Кирова (194044, г. Сашст-Нетербург, ул Академика Лебедева, дом 6)

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Военно-медицинской академии имени С М Кирова

Автореферат разослан " ^^ОиЯ._2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук профессор Б.И. Ищенко

Актуальность. В течение последних 25-30 лет рост заболеваемости злокачественными опухолями превысил годовой темп прироста мирового населения В России с 1992 по 2001 г показатель заболеваемости злокачественными новообразованиями возрос с 271,8 до 313,9 на 100 тысяч населения Прирост заболеваемости за десятилетие составил более 16%, при ежегодном темпе - 1,7% (Напалков НП , 2005) В связи с этим поиск адекватной противоопухолевой терапии заслуживает пристального внимания и требует решения ряда проблем, связанных, пре аде всего, с ранней диагностикой и коррекцией побочных токсических эффектов действия химиотерапевтических препаратов (Арчаков А И , 2004) Данное положение в полной мере относится и к цикло-фосфану как к одному из наиболее распространещшх цитостатиков, используемых в противоопухолевой терапии

Циклофосфан (ЦФ) - алкилируюший цитостатический препарат, обладающий относительно широким противоенз'холевым спектром действия В терапии ряда заболеваний используется кат< иммунодепрессивное средство Однако его применение ограничивается побочными эффектами, такими как гепа-тотоксичность, нефротоксичность, гематотоксичность, мутагенность Препарат обладает очень высокой кумуляцией и низкой обратимостью токсического действия (Блохин H H, 1998, Машковский M Д , 1993)

Активация ЦФ происходит под действием микросомалышх моноокси-геназ в различных тканях opi анизма, преимущественно в гепатоцитах, в результате чего накапливаются его реакциолно-способиые метаболиты, которые вступают в реакции алкшшрования, преимущественно, с нуклеиновыми кислотами, что и лежит в основе- механизма действия данного препарата Восстановленный глутатион, конъюгируя при участии ГТ с активными метаболитами ЦФ, обезвреживает их, необратимо при этом расходуясь Кроме того, с цшохрома Р45о возможна утечка активных форм кислорода, в обезвреживании которых также принимает участие система глутатиона (Блохин H H ,1998, Гиллер С А , 1965)

Таким образом, исследование системы глутатиона при повторном введении циклофосфана позволяет более подробно изучить молекулярные механизмы его токсического действия, кумулятивный эффект, а также биохимические механизмы детоксикации этого соединения

Целыо исследования явилось изучение состояния системы глутагаона в тканях печени, почек, головною мозга и в эритроцитах лабораторных животных при повторном введении циклофосфана для определения возможности использования показателей обмена i лутатиона в качестве лабораторных тестов оценки тяжести цитотоксичесюгх эффектов химиотерапии, а также при поиске новых средств цитопротекции

Для достижения поставленной цели предстояло решшь следующие задачи исследования:

— определить динамику и зменений состояния системы глутатиона и процессов перекисного окисления липидов в различных органах белых беспородных крыс при повторном введении циклофосфана в суточных дозах 20 и 40 мг/кг в течение 1-10 суток,

\

- исследовать влияние предшественника синтеза 1лутатиона (ацетилци-стеина), препаратов окисленного глутатиона (глутоксима, литана), антигипок-санга (трисана), антиоксидантов (мексидола, цитофлавина) на динамику изменений показателей системы глутатиона и интенсивность процессов перекисно-го окисления лишщов при повторном введении циклофосфана в суточной дозе 20 мг/кг в течение 10 суток,

- оценить информативность изменений показателей системы глутатиона в эритроцитах для оценки степени тяжести питотоксического повреждения тканей внутренних органов в условиях повторного введения циклофосфана

Основные положения, выносимые иа защиту:

1 В ответ на повторное введение циклофосфана в дозах 20, 40 мг/кг в ткани печени и в эритроцитах лабораторных животных отмечается активация обмена глутатиона По мере увеличения дозовой пагрузки развиваются нарушения состояния системы глутатиона и цитотсксические повреждения ткани печени, что подтверждается и выраженными морфологическими изменениями

2 Вед>щим показателем нарушений обмена глутатиона при повторных отравлениях циклофосфаном является снижение активности глкжозо-6-фосфатдегидрогеназы

3 Для проведения фармакологической коррекции цитотоксических повреждений ткани печени при повторном введении циклофосфана можно рассматривать применение препарата предшественника синтеза глутатиона (аце-тилцистеила), препарата окисленного глутатиона (глутоксима), антиоксвданта (мексидола)

4 Определение показателей, характеризующих обмен глутатиона в клетках красной крови, имеет диагностическое значение для оценки цитоток-сического поражения тканей печени в условия", повторного введения циклофосфана

Научная новизна. На основе проведенной комплексной оценки показателей системы глутатиона, сопряженчых биохимических процессов в различных тканях экспериментальных животных (печень, почки, головной мозг, эритроциты) при повторном введении циклофосфана показана взаимосвязь между выраженностью изменении естественной системы цитопротекции и ци-тотоксическими эффектами ксенобиотика Проведен анализ причин, вызывающих изменения состояния системы глутатиона и активацию процессов пе-рекисного окисления липидов в исследуемых тканях при повторном введении циклофосфана Установлено, что использование в эксперименте фармакологических препаратов (ацетилцистеина, глутоксима, мексидола) в условиях повторного введения циклофосфана в дозе 20 мгЛсг в течение 10 суток предотвращает развитие патобиохимических процессов и реализацию цитотоксических повреждений тканей паренхима гозных органов Показана перспективная возможность использования ряда покгзателей системы глутатиона (активности гшокозо-6-фосфатдегидрогеназы, глутатионред)'ктазы, концентрации диеновых конътогатов, малонового диальдегида) в эритроцитах для установления выраженности побочных токсических эффектов циклофосфана и оценки эффективности коррекционной терапии

Практическое значение работы заключаем в том, что для оценки тя-жесга токсического поражения парен \.иматозных органов и эффективности проводимой фармакологичес кой коррекции этого процесса у пациентов, проходящих курс полихимиотерапии, можно использовать показатели системы глутатиона (активности Г-6-Ф-ДГ, ГР, концентрации ДК, МДА) в эр1ггроцитах Реализация результатов исследования. Рекомендации, разработанные на основании полученных в ходе диссертационного исследования данных, используются в научной рабоге и учебьом процессе на кафедре клинической биохимии и лабораторной диагностики и кафедре военной токсикологаи и медицинской защиты Военно-медицинской академии

Апробация работы. Результаты работы доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Агтуалъные вопросы повышения работоспособности и восстановления здоровья военнослужащих и гражданского населения в условиях чрезвычайных ситуаций» (Санкт-Пегербург, 2006 г ), Всероссийской научно-практической конференция «Актуальные проблемы химической безопасности в Российской Федерации» (Санкт-Петербург, 2007 г), Итоговой конференции военно-научною общества слушателей и ординаторов 1 факультета (Санкт-Петербург, 2007 г ), Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения в многопрофильном лечебном учреждении» (Санкт-Петербург, 2007 г )

Публикации. По теме диссертационно! о исследования опубликовано ] 8 печатных работ, в том числе 7 стагей в отечественных научных журналах

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, включающих обзор литературы, общую характеристику материалов и методов исследования, полученные результаты и их обсуждение, заключение и выводы Работа изложена на 178 страницах машинописного текста, содержит 21 рисунок и 20 таблиц Список литературы состоит из loi источника, из них 76 отечественных и 85 иностранных авторов

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Схема проведения экспериментального исследования представлена в табл 1

Экспериментальные исследования выполнены на 180 белых беспородных крысах-самцах массой 190-210 г из питомника РАМН «Рапполово»

В ходе экспериментального исследования проводили оценку влияния повторного введения циклофосфана (в течение 1-10 суток) в дозах 20,40 мг/кг ежесуточно на состояние показателей системы глутатиона и перекисного окисления липидов в различных тканях лабораторных животных в различные сроки исследования

Моделирование повторной интоксикации ЦФ осуществляли согласно схеме гепатотоксического воздействия ЦФ по Т А Ажуновой (2004)

Забой животных проводили через 1 сутки после 1, 3, 5, 7 и 30 введений ЦФ в перечисленных суточных дозах

Таблица 1

Схема проведения экспериментального исследования

№ группы Суточная доза циклофосфана Количество введений Препарат коррекции Количество животных

1 Контроль 10

2 I 10

3 3 10

4 20 мг/кг 5 10

5 7 10

6 10 Нет 10

7 1 10

8 40 мг/кг 3 10

9 5 10

10 7 10

и контроль 10

12 без лечения 10

13 10 Ацетилцистеин 10

14 10 Трисан 10

15 20 мг/кг 10 Мексидол 10

16 10 Цитофлавин 10

17 10 Глутоксим 10

18 10 Литан 10

При проведении фармакологической коррекции цитотоксического действия ЦФ через 30 мин после введения токсиканта в дозе 20 мг/кг животным вн утрибрюшинно ежедневно вводили один из следующих препаратов в течение 10 суток ацетилцистеин - в виде 3 % официнального раствора (150 мг/кг), мексидол - в виде 1 % водного раствора (50 мг/кг), цитофлавин - в виде 10 % официнального раствора (118 мг/кг), трисан - в виде 1 % водного раствора (15 мг/кг), глутоксим - в виде 1% водного раствора (100 мг/кг), литан - 0,5% водного раствора (100 мг/кг)

У экспериментальных животных в тканях головного мозга, печени, почек и эритроцитах, а также в эритроцитах пациентов определяли содержание восстановленного глутатиона (ВГ), уровень свободных' сульфгидрильных грзшп бепков (СГ) и активность ферментов системы глутатиона и сопряженных систем - глутатионредуктазы (ГР), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-Ф-ДГ), глутатион-Б-трансферазы (ГТ), глутатионпероксидазы (ГП) и ка-

талазы Для оценки интенсивности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) определяли концентрацию диеновых конъюгатов (ДК), малонового ди-альдегида (МДА)

Концентрацию ВГ определяли методом G L Ellman (1959) в модифика-ЦШ1 С И Глушкова (2006), заключавшейся в осаждении белка 20% раствором сульфосалицшговой кислоты Содержание СГ определяли согласно методике G Bellomo et al (1990) Определение концентрации ДК проводили по методике И Д Стальной (1977) Концентрацию МДА определяли по методу М Uchiyama (1978) Определение активности ферментов системы глутатиона проводили в гемолизаге эритроцитов или в днтозольной фракции, полученной после центрифугирования гомогенатов тканей в течение часа при 150000 g на ультрацентрифуге L8-M («Весктап», США) Активность глутатионредуктазы определяли по методу I Garlberg, В Mannervik (1985), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы - по A Komberg et al (1955), глутатионпероксидазы - по методу А Н Гавриловой и Н Ф Хмары (1986) с использованием в качестве субстрата гидроперекиси трет-бутила, каталазы - по М АКоролюку (1988), глуга-тион-Б-трансферазы - методом W Н Habig, W В Jakoby (1981) Расчет активности ферментов производили на грамм белка или гемоглобина (в гемолизате эритроцитов) Концентрацию белка определяли методом Лоури в модификации G L Peterson (1977), гемоглобина - гемиглобинцианидным методом

Влияние повторного введения циклофосфана и использовавшихся средств фармакологической коррекции на тяжесть токсического поражения паренхиматозных органов оценивали по следующим биохимическим показателям гепато- и нефротоксичности, определяемым в сыворотке крови лабораторных животных поражение ткани печени - по активности аспартатами-нотрансферазы (ACT) и аланинаминотрансферазы (АЛТ), щелочной фосфага-зы (ЩФ), по содержанию общего билирубина, поражение тканей почек - по концентрации креатинина и мочевины Биохимические показатели токсичности ВОЗ (1985) (активность аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансфе-разы, содержание креатинина, общего билирубина) в сыворотке крови экспериментальных животных при повторном введении ЦФ определяли на автоматическом биохимическом анализаторе «Synchron» («Beckman Coulter», США) щелочную фосфатазу и мочевину на автоматическом биохимическом анализаторе Hitachi - 902 («Hitachi», Япония)

Статистическую обработку полученных результатов проводили на персональном компьютере с помощью пакета прикладных программ «Microsoft Excel» В каждой группе рассчитывали средние значения и ошибку среднего Достоверность различий с соответствующей контрольной группой оценивали по t-критерию Стьюдента Приведенные в тексте и таблицах значения представляли в виде Xq, ± тх

it

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенное экспериментальное исследование, направленное на изучение особенностей обмена глутатиона и интенсивности протекания процессов ПОЛ в тканях печени, почек, головного мозга и эритроцитах лабораторных животных при повторных введениях ЦФ, позволяет говорить о вовлечении изменений данной биохимической системы в механизмы повреждения клеток при повторных интоксикациях алкилирующими агентами

Анализ полученных результатов указывает на тесную связь изменений изучаемых биохимических показатели в исследуемых органах с величиной используемой дозы ЦФ, длительностью введения, участия ткани в метаболизме ксенобиотика и межтканевых особенностей обмена глутатиона

При изучении изменений концентрации В Г в условиях повторных введений ЦФ в ткани печени был выявлен ряд характерных особенностей В начальном периоде эксперимента (до 5 суток), длительность которого была обратно пропорциональна величине дозы, отмечалось компенсаторное увеличение концентрации ВГ по сравнению с контрольной группой животных, а в дальнейшем имела место тенденция к снижению уровня данного показателя в период истощения ресурсов системы 1 лутатиона После введения ЦФ в дозе 20 мг/кг максимальное увеличение конценграции ВГ на 23,2% (р<0,05) выше значений иитактного контроля отмечалось на 5 с\тки компенсаторного периода, введение большей дозы привело I- сокращению длительности компенсаторного периода и максимальному повышению уровня ВГ на 3 сутки эксперимента на 23,1% (р<0,05)

Данные изменения носили дозозависимый характер и предполагают связь с особенностями тканевого обмена глутатиона

В настоящее время истощение уровня ВГ в гепатоцитах при острых отравлениях ЦФ в высоких дозах отмечается многими исследователями (Глуш-ков С И, 2006, Кашуро В А, 2003) К снижению уровня ВГ может приводить его расходование на процессы конъюгации с ксенобиотиком и его метаболитами, наиболее интенсивно протекающими в тканях этого органа, при этом увеличение дозы вводимого ксенобиотика приводит к предельному напряжению системы детоксикации

В отличие от острой интоксикации высокими дозами, повторное введение ЦФ сопровождается развитием длительного «токсического стресса», характеризующегося постепенной мобилизацией, г затем расходованием компенсаторных резервов системы глутатиона За периодом напряжения адаптивных процессов следует период компенсации, направленный на временное возмещение поврежденных функций системы глутатаона в процессе интоксикации Если действие токсиканта продолжается, наступает срыв компенсации (Голиков С Н , 1986)

Подтверждением этого положения может служить двухфазный характер изменений, который отмечался и при исследовании активности ряда ферментов системы глутатиона в наиболее повреждаемой ткани - печени Введение ЦФ в дозах 20 (40) мг/кг сопровождалось повышением активности ГР в тече-

ние 3 (1) суток с последующим достоверным ее падением При введении токсиканта в меньшей дозе активность ГТ постепенно нарастала в течение 5 суток исследования, превысив значения контрольной группы в 1,61 раза (р<0,05) При применении ЦФ в дозе <10 мг/кг нарастание активности этого фермента наблюдалось через 1 суток в 1,44 раза (р<0,05) выше значений контроля с последующим значительным ее снижением При исследовании ГП и каталазы компенсаторная активация (р< 0,05) этих ферментов в ткани печени наблюдалась на 5 сутки эксперимента при использовании дозы токсиканта 20 мг/кг (в 1,37 и 1,30 раза, соответственно), а также в течение 1-3 суток при введении большей дозы - в 1,14 и 1,23 раза

Однако, при исследовании активности Г-6-Ф-ДГ в ткани печени периода компенсаторных изменений выявлено не было Напротив, па протяжении всего периода эксперимента набглодалось достоверное выраженное дозозависи-мое ее снижете (табл 2)

Таблица 2

Изменения активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в тканях различных органов белых беспородных крыс при повторных введениях циклофосфана в дозах 20 мг/кг и 40 мг/кг (мкмоль/(мин г белка)

группа исследования сроки исследования, сутки Исследуемый орган

Печень Эритроциты

Конт роль 56,7 [А 5,40 4,27 ±0,18

Циклофосфан, 20 мг/кг 1 37,36^ В,73* 2 90 ±0,21*

3 31,98 ¿6,12* 2,16 ±0,30*

5 38,38 ±3,67* 1 24 ± 0,29*

7 31,03 ±2,23* 1,16 ±0,07*

10 21,92 ±2,77* 1,13 ±0,12*

Циклофосфан, 40 мг/кг 1 34,34 ±5,80* 1 65 ± 0,25*

3 34,23 ±7,91* 1,23 ±0,15*

5 32,90 ±3,75* 0,94 ±0,04*

7 23,55 ±2 48* 0,85 ±0 12*

* - достоверность отличия р<0,05 по сравнению с группой контроля

Полученные данные о динамике изменений активности этого фермента можно объяснить его структурными особенностями - наличием в активном центре фермент: а сульфгидрипьной группы Поэтому снижение активности Г-б-Ф-ДГ при повторном отравлении ЦФ может быть связано с необратимым алкилированием тиоловых групп энзима активными метаболитами ЦФ (Голиков СН, 1986) и повреждающим действием на молекулы фермента АФК и свободных радикалов В свою очередь, усиленное расходование НАДФ Н в глзтатион-редуктазной и цито фОм Р-45С-редуктазной реакциях (Тиунов Л А, 1995, Еропкин МЮ , 2003) усугубляет процессы истощения резервов компенсаторно! о ответа системы глутатиона Подтверждением роли активации СРО и алкилирования БН-групп в снижении Г-б-Ф-ДГ активности может служить

глубокое снижение концентрации сульфгидрилъных групп и повышение уровня ДК, МДА в тоани печени

Известно, что процесс биотрансформации ЦФ под действием микросо-мальных монооксигеназ сопровождается образованием супероксидных анионов, а затем перекиси водорода и органических гидроперекисей (Белоусова А К, 1977, Блохин Н Н , 1984)

Антиоксидантные ферменты прямого действия, такие как СОД и катала-за, непосредственно удаляют из окружающего пространства АФК Но существуют и альтернативные пути, позволяющие клеткам «шунтировать» обмен АФК, посредством которых удаляются биологически активные электрофиль-ные интермедиаты Центральное место в этой стратегии принадлежит редокс-циклу глутатиона, а также системе глутатионовой конъюгации (рис 1)

Рис 1 Редокс-цикл глутатиона (Еропкин М Ю , 2003)

Редокс-цикл глутатиона принимает участие в обезвреживании как перекисей, так и органических гидроперекисей Однако, для развития «окислительного» стресса важна не столько концентрация ВГ и других восстановительных эквивалентов клетки, но и редокс-статус системы, то есть соотношение между про- и антиоксидантными молекулами, а также между скоростями окислительно-восстановительных превращений различных ее компонентов (Гиллер С А, 1965, КеЬгег ] Я , 1994)

В проведенном эксперименте выявлено, что несмотря на метаболиче-с!сую активацию ферментов антиоксидантной защиты в начале эксперимента, происходит нарастание содержания продуктов ПОЛ, связанное, по-видимому, с недостаточностью восстановленных эквивалентов Об активации процессов ПОЛ свидетельствовало накопление как начальных продуктов ПОЛ - ДК, так и конечных - МДА

При повторном введении различных доз токсиканта в ткани печени происходило накопление обоих продуктов, причем повышение концентрации IV!ДА было более выраженным При этом усиление протекания процессов ПОЛ имело отчетливый дозозависимый характер

Повторное введение ЦФ в дозах 20 и 40 мг/кг вызывало достоверное (р<0,05) повышение концентрации ДК по мере нарастания кумулятивного эффекта ЦФ в ткани печени на 10 и 7 сутки эксперимента в 2,03 и 2,52 раза и

МДА в 1,61 и 2,12 раза по сравнению с показателями интактной группы (табл 3)

Таблица 3

Динамика изменений концентрации малонового диальдегида в тканях различных органов белых беспородных крыс при повторных введениях циклофосфа-на в дозах 20 мг/кг и 40 мг/кг (нмоль/г ткани или нмоль/г гемоглобина)

Группа исследования сроки исследования, сутки Исследуемый орган

Печень Эритроциты

Кот золь 166,31± 8,68 4,49 ± 0,32

Циклофосфан, 20 мг/кг 1 188,88 ±8,39* 4,54 ± 0,20

3 242,94 ±18,50* 5,23 ±0,38

5 248,03 ±5,68* 5,26 ±0,21*

7 254,28 ±16,45* 5,60 ±0,16*

10 267,93 ±14,14* 5,94 ± 0,09*

Циклофосфан, 40 мг/кг 1 199,93 ±10,71* 5,61 ± 0,27*

3 218,88 ±17,^4* 5,91 ±0,21*

5 339,14 ±7,11* 6,06 ± 0,23*

7 353,42 ±8,49* б,19± 0,15*

* - достоверность отличия р<0,05 по сравнению с группой контроля

Высокая алкштирующая способность метаболитов ЦФ, образующихся в процессе активации системой цитохрома Р-450, лежит в основе их взаимодействия не только с ВГ, но и с функциональными (в том числе и с сульфгадрилъ-ными) группами различных биомолекул (Голиков С Н , 1986) Процессы обратимого Б-тиолирования функциональных групп белков окисленным глутатио-ном и образование смешанных дисульфидов также может приводить к снижению содержания СГ (Кулинский В И , 1990)

В ходе проведенного исследования было выявлено снижение содержания СГ в ткани печени на протяжении всего эксперимента, а максимальное его проявление отмечалось в момент срыва компенсаторных ресурсов системы глутатиона - после повторного введения ЦФ в дозе 20 мг/кг на 10 сутки исследования в 1,17 раза (р<0,05) ниже контроля, при использовании большей дозы на 7 сутки исследования - в 1,20 раза (р<0,05)

В ходе проведенного эксперимента установлено, что наиболее выраженные сдвиги в системе глутатиона отмечались в ткани печени, где, с одной стороны, уровень ВГ в норме значительно превосходит содержание в других органах, а с другой стороны, метаболизм глутатиона наиболее интенсивен (Кулинский В И , 1990) Гидроксшшрование ЦФ системой микросомальных мо-нооксигеназ приводит к образованию более токсичных продуктов, т е имеет место процесс метаболической активации ксенобиотика (Белоусова А К , 1977, Блохин НН, 1984) В дальнейшем активные продукты под воздействием ГТ подвергаются конъюгации с восстановленным глутатиоиом По-видимому, максимальное увеличение активности микросомальных ферментов именно в

тканях печени служит причиной и максимальной активации свободноради-кальных процессов в тканях этого ор! ана, связанных с утечкой активных форм кислорода с цитохрома Р-450

Полученные биохимические данные о патогенетической значимости изменений показателей системы глутатиона и сопряженных систем подтверждаются одновременно проведенным морфологическим исследованием тканей печени в различные сроки повторной интоксикации ЦФ, которое выявило сопряжение нарастающих морфологических признаков повторной интоксикации (выраженность жировой дистрофии, гиперхром ия ядер, расширение синусои-дов) с увеличением кумулятивного эффекта ксенобиотика

Периферическая кровь является самым доступным объектом для лабораторных исследований, поэтому определение показателей системы глутатиона в эритроцитах может использоваться для диагностической оценки тяжести ци-тотоксических эффектов при повторном воздействии алкилируюгцих агентов На это может указывать наличие корреляционных связей между изменениями показателей данной системы во внутренних органах, в частности, в ткани печени и в эритроцитах

В ходе эксперимента было выявлено, что в эритроцитах лабораторных животных достоверно! о изменения концентрации ВГ не отмечалось, содержание его соответствовало показателям контроля

Эритроциты не обладают ферментной системой микросомального окисления и поэтому в них отсутствуют процессы биотрансформации ЦФ, с обра-зовшшем электрофильных субстратов для конъюгации, а значит концентрация ВГ может поддерживаться на уровне физиологической нормы

Межорганный обмен ВГ при повторном ьведении ЦФ, по всей видимости, также существенно не изменяется, активация его ресурсов в гепатоцитах на ранних стадиях интоксикации после введения относительно малых доз не нарушает процессы экспорта эюго соединения, в отличие от острого отравления ЦФ в больших дозах Данное положение подтверждается сохранением концентрации ВГ в эритроцитах на уровне интактного контроля

Характер изменения концентрации сульфгидрильных групп носил дозо-зависимый характер, о чем свидетельствует вьражешюе нарастание концентрации СГ после повторного введения ЦФ в дою 40 мг/кг, которая на 7 сутки эксперимента превысила значения контроля в 1,82 раза (р<0,05) Данные изменения, по-видимому, могут иметь ромпенсаторный характер

В ходе исследования в клетка с красной крови наблюдалась активация ферментов антиоксидантной защиты Уровень активности ГТ при повторном введении ЦФ в дозе 20 мг/кг на протяжении всего эксперимента увеличивался и превысил в 1,90 раза (р<0,05) показатели группы контроля Применение более высокой дозы привело к более выраженному росту активности ГТ в первые 3 суток исследования - в 1,99 раза (р<0,05), с последующим снижением ее до значений интактного контроля на 7 сутки эксперимента

Сходные изменения наблюдались и при исследовании ГП нарастание активности фермента при введении ЦФ в дозе 20 мг/кг на 5 сутки в 1,4 раза

(р<0,05) и в течение 3 с\ток после введения 40 мг/кг в 1,34 раза (р<0,05) сменялось падением до показателей интактной группы.

Активность каталазы на протяжении всего эксперимента нарастала при использовании обеих суточных доз ксенобиотика.

Индукция ак-птпости данных энзимов в эритроцитах, по-видимому, связана с увеличением интенсивности процессов пероксидации липндов в этих клетках, о чем свидетельствует дозозависимое накопление как первичных продуктов ПОЛ, так и вторичных. Максимальное повышение концентрации ДК и МДА в 1,65 и 1,32 раза (р<0,05) отмечалось на 10 сутки при интоксикации ЦФ в'дозе 20 мг/кг, а также в 1,79 и 1,38 раза (р<0,05) на 7 сутки при использовании более высокой дозы токсиканта.

Определена умеренная корреляционная связ^ между изменениями показателей ПОЛ в эритроцитах и ткани печени. Коэффициент корреляции при введении обеих доз составил для ДК - 0,50 и 0,59 (рис. 2), МДА - 0,56 и 0,56.

Рис. 2. Изменение концентрации диеновых конъюгатов в ткани печени и эритроцитах при повторном введении ЦФ в дозе 40 мг/кг

Выраженные изменения наблюдались и при исследовании в эритроцитах ферментов, участвующих в процессе восстановления глутатиона из окисленной формы, активность которых на протяжении всего эксперимента .аозозави-симо снижалась.

Дозозависимое падение активности Г-6-Ф-ДГ наблюдалось в течение -всего срока исследования. Динамика изменений активное™ этого фермента в клетках красной крови коррелировала с таковыми в ткани печени. Была установлена умеренная положительная корреляционная связь, коэффициент корреляции составил при введении ЦФ в дозе 20 мг/кг - 0,65 (рис.3), и дозе 40 мг/кг--0,53.

)ГЕЗ эритроциты О печень \

300 250 200

% 150 от контроля

100 50

Рис. 3. Изменение активности i лнжозо-6-фосфаггдегидрогеназы в ткани печени и эритроцитах при повторном введении 1ДФ в суточной дозе 20 мг/кг

Снижение активности ГР также it мело дозозависимый характер. Максимальная выраженность этого эффекта отмечалась на 10 сутки эксперимента при введении меньшей дозы ксенобиотика - в 1,77 раза ниже контроля, при использовании ЦФ в дозе 40 мп'кг - в (,79 раза, Между изменениями активности ГР в эритроцитах и тканях печени при использовании Цф в дозе 40 мг/кг определялась умеренная положительная корреляционная связь, коэффициент корреляции составил 0,46.

Таким образом, определение активности Г-6-Ф-ДГ, ГР, содержания ДК, МДА в качестве маркеров тяжести ци готоксического поражения тканей печени при повторном введении ЦФ в малых дозах является обоснованным.

В ходе эксперимента проведена и сравнительная оценка между сроками появления и выраженностью изменений принятых в настоящее время маркеров гепато- и еефротоксичности (АЛТ, ACT, общего билирубина, креатин ияа, мочевины, [ЦФ) ВОЗ (Г985) и показателей системы глутатиона при повторной интоксикации ЦФ в суточной дозе 20 мг/кг в течение 10 суток. Установлено, что изменения таких показателей обмена глутатиона, как активность Г-6-Ф-ДГ, IT, содержание ДК; МДА происходили в более ранние сроки (3-5 сутки) и выявлялись щт отсутствии достоверней: изменений со стороны большинства общеизвестных биохимических показателей, а на 10 сутки эксперимента носили более выраженный характер.

Изменения показателей системы глутатиона в тканях почек были менее интенсивными по сравнению с такошми в печени, ПочкЬ участвуют в непосредственной экскреции как ЦФ в неизмененном виде (20%), так и его метаболитов. При этом непосредственно повреждающего действия на нефроциты, по некоторым экспериментальным данным, не наблюдается (Блохил Н.Н1984У

Концентрация 8Г, СГ, активность большинства ферментов - Г-6-Ф-ДГ, ГР, ГП, катал азы практически не отличались от значений интактного контро-

ля Наблюдалось умеренно выраженное повышение активности ГТ в 1-3 сутки эксперимента, которая в 1,43 и 1,36 раза (р<0,05) превысила значения контроля после введения ЦФ в доза> 20 и 40 мг/кг, соответственно

Кроме того, было отмечено достоверное усиление интенсивности процессов ПОЛ в тканях почек, выраженность которого соответствовала вводимой дозе Концентрация ДК превысила значения контроля в 1,29 и 1,31 раза (р<0,05), а МДА - в 1,31 и 1 63 раза (р<0,05), соответственно, при повторном введении ЦФ в различных до ¡ах

Отсутствие значимых изменений после повторною введения ЦФ в различных до ¡ах отмечалось при проведении морфологического исследования тканей почек

По сравнению со всеми исследуемыми тканями, изменения показателей системы глутатиона были минимальными в ткани головного мозга Это связано с наименьшим участием ткани в обмене глутатиона и отсутствием проницаемости гематоэнцефалического барьера для продуктов метаболизма ЦФ

В настоящее время дам профилактики и лечения цитотоксических повреждений тканей и органов в условиях проведения полихимиотерапии (ПХТ) и при острых отравлениях активно используются препараты различных фармакологических групп, в том числе предшественники синтеза глутатиона, ан-тиоксиданты, антишпоксантн (Блохин ПН, 1984) Тем не менее, остается мало изученной комплексная оценка влияния фармакологических препаратов на показатели системы глутатиона в разли тых органах и тканях при повторном введении ЦФ в малых дозах

В проведенном эксперименте на фоне введения ЦФ в течение 10 суток в дозе 20 мг/кг была предпринята попытка уменьшить цитотоксическое действие повторного введения препарата пугем подавления процессов СРО с помощью антиоксидантов (мексидола, цитофлавина), увеличения пула ВГ за счет введения предшественников синтеза ВГ (ацетшнщетеина), улучшения энергообеспечения тканей с помощью антигипоксантов (трисана), усиления регуля-торных процессов за счет введения препаратов окисленного глутатиона (глу-токсима, литана)

Проведенное исследование позволило установить, что реализация "цито-протекторных свойств этих препаратов при использовании для коррекции повторных интоксикаций ЦФ в дозах 20, 40 мг/кг, несмотря на разный механизм их действия, патогенетически связана с восстановлением обмена глутатиона

Наиболее выраженное положительное влияние на систему глутатиона оказывало использование метаболического предшественника синтеза глутатиона - ацетилцистеина Применение данного препарата приводило к повышению уровня эндогенного глутатиона и активации функций детоксикации и антиоксидантной защиты (Тиунов Л А, 1995)

Так, эффектом применения ацегилцистеина при повторной интоксикации ЦФ стал достоверный рос г концентрации ВГ в тканях почек, головного мозга и печени отравленных животных, наиболее ярко выраженный в последней, в которых содержание восстановленной формы трипептида в 1,23 раза превышало показатели не леченых отравленных животных (р<0,05)

Повышение концентрации ВГ в тканях отравленных циклофосфаном животных, получавших ацетшщистеин, закономерно приводило и к восстановлению показателей тиол-дисульфидного обмена, увеличивая содержание СГ в 1,28 раза (р<0,05) выше показателей группы без коррекции в ткани печени, в 1,15 раза (р<0,05) в ткани почек Как следствие, это сопровождалось повышением активности ферментативного звена системы глутатиона и снижением интенсивности процессов СРО Выраженный рост активности ГР (р<0,05) наблюдался в ткани печени (в 1,15 раза выше значений интактного конроля) и в эритроцитах (в 1,50 раза) Достоверного изменения активности Г-6-Ф-ДГ в ткани печени не отмечалось, в эритроцитах активность данного фермента превысила показатели группы отравленных животных без лечения в 1,59 раза (р<0,05) Активность каталазы в ткани печени превысила значения группы без коррекции в 1,44 раза (р<0,05), а активность ГП достигла показателей интактного контроля Содержание продуктов ПОЛ во всех тканях отравленных животных, получавших препарат, достоверно снижалось до значений контрольной группы

Вторым направлением фармакологической коррекции в нашем исследовании было воздействие на одно из лидирующих расстройств в механизме токсического действия циклофосфана - нарушение баланса между про- и ан-тиоксидантными системами С этой целью использовались два комплексных сукцинатсодержащих препарата - мексидол и цигофлавин

Действительно, использование мексидола в терапии животных при повторных отравлениях ЦФ позволило снизить интенсивность наработки первичных продуктов ПОЛ в ткани печени в 1,13 раза (р<0,05), в эритроцитах - в 1,24 раза (р<0,05) Также отмечалось значительное снижение концентрации МДА в эгах тканях в 1,47 и 1,15 раза (р<0,05), соответственно Снижение концентрации продуктов ПОЛ было тесно связано с активацией ферментов анти-оксидантной защиты Активность ГП превысила значения интактного контроля в ткани печени отравленных животных, получавших препарат, в 1,75 раза (р<0,05), а в эритроцитах снизилась до значений интактного контроля, сходные изменения наблюдались и при исследовании ГТ и каталазы

Кроме того, наблюдалась выраженная активация ферментов восстановления глутатиона Активность ГР возросла в 1,63 раза (р<0,05) в ткани печени отравленных животных, получавших препарат, и в 1,47 раза (р<0,05) в эритроцитах, а активность Г-6-Ф-ДГ в 1,47 и 1,95 раза (р<0,05), соответственно Повышения уровня восстановленного трипептида и сульфгидрильных групп при использовании мексидола не отмечалось

Для фармакологической коррекции в нашем исследовании был использован антигипоксантный препарат - трисан Трисан - растительный антиги-поксант, представляющий по химической структуре производное индолмор-фолина

Трисан не оказал выраженного влияния на уровень ВГ, СГ, активность ферментов АОЗ В то же время отмечался достоверный рост активности ГР в ткани печени, превысивший показатели группы без коррекции в 1,38 раза, и в эршроцитах - в 1,41 раза (р<0,05), соответственно Наблюдалось и доетовер-

ное снижение содержания ДК, МДА в этих тканях По-видимому, этот растительный препарат обладает способностью наиболее эффективно сопрягать окисление и фосфорилирование, так как ему присущи свойства переносчика электронов и антиоксидантная активность (Пастушенков JIВ , 1991)

Из используемых препаратов окисленного глутатиона, глутоксим оказал наиболее выраженный положительный эффект Глутоксим, вводимый в организм, подобно окисленному глутатиону не проникает в клетки Поэтому его фармакологическое действие направлено на молекулярные процессы, рецеп-торопосредованно регулируемые в организме окисленным глутатионом Вторичными эффектами стимуляции рецепторов являются активация транскрипционного фактора STAT3 и МАР-киназ, Ere- киназ 1,2 (Гаджиева С Ш, 2006) Известно, что МАР-киназы, через транскрипционный фактор АР -1 усиливают экспрессию генов ферментов II фазы биотрансформации ксенобиотиков (Тур-паев К Т , 2006)

В ходе проведенного эксперимента было установлено, что уровень ВГ во всех исследуемых тканях при использовании данного препарата не изменялся по сравнению с показателями группы отравленных животных, не подвергавшихся коррекции Концентрация СГ в ткани печени увеличивалась в 1,15 раза (р<0,05) по сравнению с группой без коррекции, в эритроцитах снижалась до уровня интактного контроля Выраженное индуцирующее действие препарат оказывал на ферменты восстановления трипептида и АОЗ Так, активность ГР и Г-6-Ф-ДГ в ткани печени увеличивалась по сравнению с контрольной группой без лечения в 1,54 и 1, 83 раза (р<0,05), а в эритроцитах - в 1,54 и 1,80 раза (р<0,05) Активность ГП и ГТ достоверно увеличивалась в тканях печени, почек, головного мозга, а в эритроцитах происходило снижение до значений интактного контроля Достоверное снижение содержания продуктов ПОЛ до уровня значений интактного контроля на фоне введения препаратов было наиболее выражено в тканях печени и эритроцитах

Одновременно проведенное морфологическое исследование тканей печени и почек экспериментальных животных на фоне терапии различными фармакологическими препаратами при повторной инггоксикации ЦФ показало, что использование ацетилцистеина, глутоксима приводило к существенному снижению выраженности нарушений как обмена глутатиона в ткани печенп, так и гистологических признаков токсического воздействия - в гепатоцитах определялась лишь мелкокапельная жировая и зернистая дистрофии/и умеренное расширение пространства Диссе

Таким образом, наиболее выраженная цитопротекторная активность при повторном введении ЦФ в дозе 20 мг/кг в течение 10 суток наблюдалась при использовании ацетилцистеина и глутоксима, динамика изменений в эритроцитах таких показателей системы глутатиона, как активность Г-6-Ф-ДГ, ГР, концентрация ДК, МДА достоверно отражала эффективность проводимой коррекционной терагши данными препаратами

Полученные экспериментальные данные об изменениях состояния системы глутатиона и процессов перекисного окисления липидов в эритроцитах и тканях различных органов лабораторных животных позволяют уточнить ме-

ханизмы патогенеза повторных отравлений веществами алкилирующего действия, связанных с реализацией цито-гоксических эффектов действия и с нарушениями состояния естественной системы цитопротекции

Представляется логичным приведение следующей схемы участия нарушений системы I лутат иона в патогенезе развитая цитотоксического поражения тканей внутренних органов в условиях повторной интоксикации ЦФ

Для полноценной реализации основных функции системы глутатиона, таких как конъюгация, антиоксидантная ¡ащита, поддержание тиол-дисульфидного равновесия, в условиях повторной интоксикации ЦФ необходимо 3 фактора 1) достаточный уровень ВГ, ?) адекватная активность ферментов АОЗ, 3) наличие энергетических ресурсов для осуществления рециклирования ВГ и процессов конъюгации

В условиях нарастающего необратимого расходования ВГ на процессы конъюгации, уровень концентрации трипетггада сохраняется за счет компенсаторной активации как процессов непосредственного синтеза ВГ, так и процессов его рециклирования, в то же время увеличение наработки продуктов СРО приводит к индукции активности ферментов АОЗ Данные изменения характеризуют компенсаторный период при повторной интоксикации ЦФ

Последующая возрастающая прооксидантная нагрузка, нарушение тиол-дисульфидного равновесия приводят к увеличению потребности НАДФ Н, однако интенсивность процессов его восстановлен™ недостаточна, в связи с выраженным снижением активности Г-6-Ф-ДГ, что при увеличении повторной дозочой нагрузки может привести к гггубоким нарушениям функционирования системы глутатиона в процессе срыв,г компенсаторных ресурсов в период декомпенсации

Таким образом, нарушения состояния и функций системы глутатиона (связанные с поддержанием тиол-дисудьфидного равновесия, участием в регуляции активности ферментов и белковом синтезе, регуляции состояния мембран) являются одним из основных механиэмоЕ патогенеза повторных отравлений ЦФ, так как лежат в основе реализации цитотоксического действия ксенобиотиков данной группы По-видимому, основой реализации этого неспецифического цитотоксического действия ЦФ является снижение активности Г-6-Ф-ДГ, поставщика НАДФ Н, необходимого для рециркуляции глутатиона и лимитирующего его обмен

Выявленные изменения состояния системы глутатиона при повторных интоксикациях веществами алкилирующего действия, вероятно, имеют прикладное значение для разработки ергдетв патогенетической терапии данных отравлений Использование в эксперименте на «ивотных средств фармакологической коррекции (ацетилцистеина, мексидола, глутоксима) не только послужило дополнительным доказательством наличия патогенетической взаимосвязи между нарушениями состояния системы глутатиона и цитотоксическими эффектами действия ЦФ, но и посолило определить некоторые направления гщто протекции

1) замещение антиоксидантнои ф/нкции системы глутатиона - использование антиоксидантных препаратов,

2) индукция синтеза ВГ - использование предшественников синтеза глутатиона,

3) деюксимодифинирующая - использование препаратов окисленного глутатиона

В качестве патогенетически обоснованных методов лабораторной диагностики оценки степени т яж( сти цитотоксического поражения тканей организма, эффективности проводимого лечения при повторном введении ЦФ в малых дозах могут быть использованы следующие показатели, характеризующие состояние системы глутатиона и процессы ПОЛ в эритроцитах пациентов

1) определение активности глю* озо-6-фосфзтдегидрогеназы,

2) определение активности глутатионредуктазы,

3) определение концентрации мдлоноваго диальдегида,

4) определение концентрации диеновых конъюгатов

ВЫВОДЫ

1 Повторное введение ЦФ в дозах 20, 40 мг/кг в течение 10 суток в ткани печени и в эритроцитах лабораторных животных в ранние сроки исследования (до 5 суток) вызывает компенсаторные изменения системы глутатиона в виде увеличения концентрации ВГ, активации ферментов антиоксидантной защиты (ГП, ГТ) и увеличения активности ГР

2 Дальнейшее увеличение дозовой нагрузки приводит к нарушению функций системы глутатиона в ткани печени и в эритроцитах (снижение концентрации СГ, акгивносги ферментов АОЗ ( ГТ, ГП и каталазы), восстановления глутатиона (Г-6-Ф-ДГ и ГР), увеличение содержания продуктов ПОЛ (ДК и МДА)), что совпадает с появлением выраженных морфологических признаков токсическою повреждения ткани печени

3 Повторное введение циклофосфана в тканях почек и головного мозга достоверных изменений обмена хлутатиола не вызывает

4 Ведущими показателями нарушений обмена глутатиона пря повторном введении циклофосфана в дозах 20, 40 мг/кг является снижение активности ферментов восстановления глутатиона Г-6-Ф-ДГ ( в ткани печени - в 2,4 и 2,6 раза, в эритроцитах - в 3,8 и 5,0 раза), ГР ( в ткани печени - в 1,4 и 1,8 раза, в эритроцитах - 1,7 и 1,8 раза), нарастание продуктов перекисного окисления липидов ДК ( в ткани печени - в 2,0 и 2,6 раза, в эритроцитах - 1,7 и 1,8 раза), МДА (в ткани печени - 1,6 и 2,1 раза, в эритроцитах - 1,3 и 1,4 раза) на 7 и 10 сутки исследования

5 Применение цитопротекторных препаратов различного механизма действия снижает морфологические проявления и биохимические признаки токсического действия повторного введения ЦФ Препарат, усиливающий синтез эндогенного глутатиона, - ацетилцистеин приводит к повышению концентрации ВГ, СГ, активации ГР, снижению концентрации ДК, МДА, препарат окисленного глутатиона - глутоксим к активации Г-6-Ф-ДГ, ГР, ГП, снижению концентрации ДК, МДА, антиоксидант - мексидол к активации ГР, ГП, снижению концентрации ДК, МДА

6 Между изменениями показателей системы глутатиона в эритроцитах и ткани печени при повторном введении ЦФ установлена умеренная положительная корреляционная связь (Г-б-Ф-ДГ - г -= 0,65 (20 мг/кг), 0,53 (40 мг/кг), ГР - г = 0,46 (40 мг/кг), ДК - г = 0,51 (20 мг/кг), 0,59 (40 мг/кг), МДА - г = 0,56 (20-40 мг/кг)), что экспериментально подтверждает возможность использования данных показателей для оценки степени тяжести цитотоксического поражения ткани печени при повторном введении ЦФ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Для оценки степени тяжести цитотоксического поражения паренхиматозных органов и эффективности фармакологической коррекции этого процесса у лиц, проходящих курс полихимиотерапии, представляется возможным использование определения в эритроцитах таких показателей системы глутатиона как, активность Г-б-Ф-ДГ, ГР, концентрации ДК, МДА,

2 В схему комплексной терапии веществами алкилирующего действия рекомендуется включить фармакологические препараты, обладающие антиок-сидантными и антигипоксантными свойствами (например, мексидол), а также препараты предшественника синтеза глутатиона - ацетилцистеин и препараты окисленного глутатиона - глугоксим

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Кашуро В А Состояние системы глутатиона и перекисного окисления ли-пидов в тканях печени и почек крыс при острых отравлениях циклофосфаном / В А Кашуро, А И Карпищенко, С И Глушков, Т М Новикова, Л В Минаева и др // Нефрология - 2006 - № 2 - С 81-85

2 Кашуро В А Состояние системы глутатиона в тканях паренхиматозных органов лабораторных животных при повторном введении циклофосфана / В А Кашуро, С И Глушков, А И Карпищенко, ТМ Новикова, ТИГлушкова, Л В Минаева и др // Нефрология - 2006 - № 4 - С 82-86

3 Минаева Л В Система глутатиона при воздействии циклофосфана на организм животных и человека / Л В Минаева, Т В Силиванова, В А Медус // Материалы итоговой конференции военно-научного общества слушателей 1 факультета - СПб, 2006 - С 137

4 Жерегеля С Н Динамика изменений концентрации восстановленного глутатиона в тканях печени на фоне развития острой почечной недостаточности вызванной введением ренгеноконтрастных препаратов / С Н Жерегеля, Л В Минаева, О О Ивойлов // Материалы итоговой конференции военно-научного общества слушателей и ординаторов I факультета - СПб, 2007 -СПб, 2007-С 42-43

5 Ивойлов О О Изменения активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы при повторном введении циклофосфана на фоне фармакологической коррекции / О О Ивойлов, Л В Минаева, С Н Жерегеля // Материалы итоговой конференции военно-научного общества слушателей и ординаторов I факультета - СПб,

2007 - С 47-48

6 Ивойлов О О Изменения концентрации продуктов перекисного окисления липидов при повторных введениях циклофосфана на фоне фармакологической коррекции / О О Ивойлов, Л В Минаева, С Н Жерегеля // Там же - С 48-49

7 Карпищенко А И Влияние некоторых фармакологических препаратов на содержание лейкоцитов периферической крови экспериментальных животных в условиях повторного введения циклофосфана / А И Карпшценжо, С И Глушков, Л В Минаева и др // Вестник Российской Военно-медицинской академии,- 2007 - Приложение 1(17) , ч 1 - С 371-372

8 Карпищенко А И Изменения глюкозо-б-фосфатдегидрогеназной активности при формировании ренгеноконтрастных нефропатий / А И Карпищенко, С И Глушков, С Н Жерегеля, Л В Минаева и др // Вестник Российс» ой Военно-медицинской академии - 2007 — Приложение 1(17), ч 1 — С 370

9 Карпищенко А И Изменение концентрации малонового диальдегида в тканях экспериментальных животных при острых отравлениях фосфорил-тиохолинами в сублетальных дозах / АЛ Карпищенко, С И Глушков, О О Ивойлов, Л В Минаева и др // Вестник Российской Военно-медицинской академии - 2007 - Приложите 1(17) , ч 1 - С 372

10 Карпищенко А И Динамика глутатионредуктазной активности тканей почек в условиях развития ренгеноконтрастных нефропатий / А И Карпищенко, С И Глушков, С Н Жерегеля, Л В Минаева и др // Вестник Российской Военно-медицинской академии - 2007 - Приложение 1(17), ч 1 - С.370

11 Карпищенко А И Экспериментальная оценка роли изменений системы глу-татиона в реализации побочных цитотоксических эффектов повторного введения циклофосфана / А И Карпищенко, С И Глушков, Л В Минаева и др // Вестник Российской Военно-медицинской академии - 2007 - Приложение 1(17), ч 1 - С 370-371

12 Кашуро В А Активность глутатионпероксддазы в тканях экспериментальных животных при повторном введении циклофосфана / В А Кашуро, Л В Минаева, С И Глушков и др // Актуальные вопросы повышения работоспособности и восстановления здоровья военнослужащих и гражданского населения в условиях чрезвычайных ситуаций / Материалы Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 40-летию НПО обитаемости и профессионального отбора ВМедА - СПб, 2007 - СПб, 2007 - С 206

13 Кашуро В А Активность глутатионредуктазы в тканях экспериментальных животных при повторных введениях циклофосфана / В А Кашуро, Л В Минаева, С И Глушков и др // Актуальные проблемы химической безопасности в Российской Федерации / Сборник- тезисов Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 45-летию ФГУП «НИИГПЭЧ» ФМБА России - СПб, 2007 - С 246

14 Кашуро В А Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в тканях эксце-риментапьных животных при повторном введении циклофосфана / В А Кашуро, Л В Минаева, С И Глушков и др II Актуальные вопросы повышения работоспособности и восстановления здоровья военнослужащих и гражданского населения в условиях чрезвычайных ситуаций / Материалы Всерос-

еийской научно-практической конференции, посвященной 40-летию НИО обитаемости и профессионального отбора ВМедА - СПб, 2007 - С 205-206

15 Кашуро В А Изменения концентрации малонового диальдегида в тканях экспериментальных животных при повторных введениях циклофосфана / В А Кашуро, Л В Минаева, С И Глуипсов и др // Актуальные проблемы химической безопасности в Российской Федерации / Сборник тезисов Всероссийской наз'чно-пракгаческой конференции, посвященной 45-летию ФГУП «НИИГПЭЧ» ФМБА России - СПб, 2007 - СПб, 2007 - С 247

16 Минаева Л В Динамика изменений концентрации восстановленного глута-тиона в тканях почек на фоне развития острой почечной недостаточности вызванной введением ренгеноконтрастных препаратов / Л В Минаева, С И Жерегеля, О О Ивойлов // Материалы итоговой конференции военно-научного общества слушателей и ординаторов I факультета- СПб 2007-С 95-96

] 7 Минаева Л В Изменения концентрации восстановленного глутатиона при повторном введении циклофосфана на фоне фармакологической коррекции / Л В Минаева, С Н Жерегеля, О О Ивойлов // Там же - С 43-44 18 Минаева Л В Органоспецифические изменения глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной активности при формировании ренгеноконтрастных нефропатий / Л В Минаева, С Н Жерегеля, О О Ивойлов // Там же - С 94-95

Подписано в печать (,> <>№»

Обьем 1 п л_Тираж юо экз

Формат 60x84 '/,6 Заказ № 404

Типография ВМедА, 194044, СПб , ул Академика Лебедева, 6

 
 

Оглавление диссертации Минаева, Любовь Валерьевна :: 2007 :: Санкт-Петербург

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Система глутатиона и ее биологическое значение.

1.2. Особенности токсикокинетики и токсикодинамики циклофосфана

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Выбор и содержание животных.

2.2.Моделирование повторной интоксикации циклофосфаном и ее экспериментальная терапия.

2.3. Характеристика использованных фармакологических препаратов.

2.4. Получение образцов тканей для исследований.

2.5. Определение показателей системы глутатиона и продуктов перекисного окисления липидов в эритроцитах и в тканях лабораторных животных.

2.6. Определение маркеров гепато- и нефротоксичности в сыворотке крови экспериментальных животных.

2.7. Гистологическое исследование тканей печени и почек экспериментальных животных.

2 .8.Статистическая обработка результатов.

Глава 3. ОБМЕН ГЛУТАТИОНА И ПРОЦЕССЫ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ В ТКАНЯХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ПОВТОРНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ ЦИКЛОФОСФАНОМ.

3.1. Концентрации восстановленного глутатиона и сульфгидрильных групп белков в тканях печени, почек, головного мозга экспериментальных животных.

3.2. Активность ферментов системы глутатиона в тканях печени, почек, головного мозга экспериментальных животных.

3.2. Активность ферментов системы глутатиона в тканях печени, почек, головного мозга экспериментальных животных

3.3. Концентрация продуктов перекисного окисления липидов в тканях печени, почек, головного мозга экспериментальных животных.

3.4. Морфологическая картина тканей печени и почек экспериментальных животных.

3.5. Показатели системы глутатиона и интенсивности процессов перекисного окисления липидов в эритроцитах экспериментальных животных

Глава 4. ВЛИЯНИЕ СРЕДСТВ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ КОРРЕКЦИИ НА СОСТОЯНИЕ СИСТЕМЫ ГЛУТАТИОНА И ИНТЕНСИВНОСТЬ ПРОЦЕССОВ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ В ТКАНЯХ ПЕЧЕНИ ПОЧЕК, ГОЛОВНОГО МОЗГА И ЭРИТРОЦИТАХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ПОВТОРНОМ ВВЕДЕНИИ ЦИКЛОФОСФАНА.

4.1. Влияние средств фармакологической коррекции на концентрацию восстановленного глутатиона и сульфгидрильных групп белков в тканях печени, почек, головного мозга и эритроцитах при повторном введении циклофосфана.

4.2. Влияние средств фармакологической коррекции на активность ферментов системы глутатиона в тканях печени, почек головного мозга и эритроцитах при повторном введении циклофосфана.

4.3. Влияние средств фармакологической коррекции на концентрацию продуктов перекисного окисления липидов в тканях печени, почек головного мозга и эритроцитах при повторном введении циклофосфана.

4.4. Влияние средств фармакологической коррекции на изменение лабораторных показателей гепато- и нефротоксичности экспериментальных животных при повторном введении циклофосфана.

4.5. Влияние средств фармакологической коррекции на морфологические изменения в тканях печени и почек экспериментальных животных при повторном введении циклофосфана.

 
 

Введение диссертации по теме "Токсикология", Минаева, Любовь Валерьевна, автореферат

Актуальность. В течение последних 25-30 лет темп роста заболеваемости злокачественными опухолями превысил годовой темп прироста мирового населения. В России с 1992 по 2001 гг. показатель заболеваемости злокачественными новообразованиями возрос с 271,8 до 313,9 на 100 тысяч населения. Прирост заболеваемости за десятилетие составил более 16%, при ежегодном темпе - 1,7%[54]. В связи с этим поиск адекватной противоопухолевой терапии заслуживает пристального внимания и требует решения ряда проблем, связанных, прежде всего, с ранней диагностикой и коррекцией побочных токсических эффектов действия химиотерапевтических препаратов^].

Циклофосфан (ЦФ) - алкилирующий цитостатический препарат, обладающий относительно широким противоопухолевым спектром действия. В терапии ряда заболеваний используется как иммунодепрессивное средство. Однако его применение ограничивается побочными эффектами, такими как гепатотоксичность, нефротоксичность, гематотоксичность, мутагенность. Препарат обладает очень высокой кумуляцией и низкой обратимостью токсического действия [9,16,53,67].

Активация ЦФ происходит под действием микросомальных моноок-сигеназ в различных тканях организма, преимущественно в гепатоцитах, в результате чего накапливаются его реакционно-способные метаболиты, которые вступают в реакции алкилирования, преимущественно, с нуклеиновыми кислотами, что и лежит в основе механизма действия данного препарата. Восстановленный глутатион, конъюгируя под действием ГТ с активными метаболитами ЦФ, обезвреживает их, необратимо при этом расходуясь. Кроме того, с цитохрома Р450 возможна утечка активных форм кислорода, в обезвреживании которых также принимает участие система глутатион а [9,31,34,122].

Таким образом, исследование системы глутатиона при повторном введении циклофосфана в малых дозах позволяет более подробно изучить молекулярные механизмы токсического действия ЦФ и его метаболитов, кумулятивный эффект, а также биохимические механизмы его детоксикации.

Целью исследования явилось изучение состояния системы глутатиона в тканях печени, почек, головного мозга и в эритроцитах лабораторных животных при повторном введении циклофосфана для определения возможности использования показателей обмена глутатиона в качестве лабораторных тестов оценки тяжести цитотоксических эффектов химиотерапии, а также при поиске новых средств цитопротекции.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи исследования:

- определить динамику изменений состояния системы глутатиона и процессов перекисного окисления липидов в различных органах белых беспородных крыс при повторном введении циклофосфана в суточных дозах 20 и 40 мг/кг в течение 1-10 суток;

- исследовать влияние предшественника синтеза глутатиона (ацетил-цистеина), препаратов окисленного глутатиона (глутоксима, литана), анти-гипоксанта (трисана), антиоксидантов (мексидола, цитофлавина) на динамику изменений показателей системы глутатиона и интенсивность процессов перекисного окисления липидов при повторном введении циклофосфана в суточной дозе 20 мг/кг в течение 10 суток;

- оценить информативность изменений показателей системы глутатиона в эритроцитах для оценки степени тяжести цитотоксического повреждения тканей внутренних органов в условиях повторного введения циклофосфана.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В ответ на повторное введение циклофосфана в дозах 20, 40 мг/кг в ткани печени и в эритроцитах лабораторных животных отмечается активация обмена глутатиона. По мере увеличения дозовой нагрузки развиваются нарушения состояния системы глутатиона и цитотоксические повреждения ткани печени, что подтверждается и выраженными морфологическими изменениями.

2. Ведущим показателем нарушений обмена глутатиона при повторных отравлениях циклофосфаном является снижение активности глюкозо-6-фосфатдеги дрогеназы.

3. Для проведения фармакологической коррекции цитотоксических повреждений ткани печени при повторном введении циклофосфана можно рассматривать применение препарата предшественника синтеза глутатиона (ацетилцистеина), препарата окисленного глутатиона (глутоксима), антиок-сиданта (мексидола).

4. Определение показателей характеризующих обмен глутатиона в клетках красной крови имеет диагностическое значение для оценки цитоток-сического поражения тканей печени в условиях повторного введения циклофосфана.

Научная новизна. На основе проведенной комплексной оценки показателей системы глутатиона, сопряженных биохимических процессов в различных тканях экспериментальных животных (печень, почки, головной мозг, эритроциты) при повторном введении циклофосфана показана взаимосвязь между выраженностью изменений естественной системы цитопротекции и цитотоксическими свойствами ксенобиотика. Проведен анализ причин, вызывающих изменения состояния системы глутатиона и активацию процессов перекисного окисления липидов в исследуемых тканях при повторном введении циклофосфана. Установлено, что использование в эксперименте фармакологических препаратов (ацетилцистеина, глутоксима, мексидола) в условиях повторного введения циклофосфана в дозе 20 мг/кг в течение 10 суток предотвращает развитие патобиохимических процессов и реализацию цитотоксических повреждений тканей паренхиматозных органов. Показана перспективная возможность использования ряда показателей системы глутатиона (активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, глутатионредуктазы, концентрации диеновых конъюгатов, малонового диальдегида) в эритроцитах для установления степени тяжести интоксикации и эффективности кор-рекционной терапии.

Практическое значение работы заключается в том, что для оценки степени тяжести цитотоксического поражения паренхиматозных органов и эффективности фармакологической коррекции этого процесса у лиц, проходящих курс полихимиотерапии представляется возможным, по данным диссертационного исследования, использовать показатели системы глутатиона (активности Г-6-Ф-ДГ, ГР, концентрации ДК, МДА).

Реализация результатов исследования. Рекомендации, разработанные на основании полученных в ходе диссертационного исследования данных, используются в научной работе и учебном процессе на кафедре клинической биохимии и лабораторной диагностики и кафедре военной токсикологии и медицинской защиты Военно-медицинской академии.

Апробация работы. Результаты работы доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы повышения работоспособности и восстановления здоровья военнослужащих и гражданского населения в условиях чрезвычайных ситуаций» (Санкт-Петербург, 2006 г.), Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы химической безопасности в Российской Федерации» (Санкт-Петербург, 2007 г.), на итоговой конференции военно-научного общества слушателей и ординаторов 1 факультета (Санкт-Петербург, 2007 г.), Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения в многопрофильном лечебном учреждении» (Санкт-Петербург, 2007 г.).

Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 18 печатных работ.

 
 

Заключение диссертационного исследования на тему "Экспериментальная оценка роли изменений системы глутатиона в реализации побочных цитотоксических эффектов повторного введения циклофосфана"

159 ВЫВОДЫ

1. Повторное введение ЦФ в дозах 20, 40 мг/кг в течение 10 суток в ткани печени и в эритроцитах лабораторных животных в ранние сроки исследования (1-5 суток) вызывает компенсаторные изменения системы глутатиона в виде увеличения концентрации ВГ, активации ферментов антиоксидантной защиты (ГП, ГТ), ГР.

2. Дальнейшее увеличение дозовой нагрузки приводит к нарушению функций системы глутатиона в ткани печени и в эритроцитах (снижение концентрации СГ, активности ферментов АОЗ ( ГТ, ГП и каталазы), восстановления глутатиона (Г-6-Ф-ДГ и ГР), увеличение содержания продуктов ПОЛ (ДК и МДА)), что совпадает с появлением выраженных морфологических признаков токсического повреждения ткани печени.

3. Повторное введение циклофосфана в тканях почек и головного мозга достоверных изменений обмена глутатиона не вызывает.

4. Ведущими показателями нарушений обмена глутатиона при повторном введении циклофосфана в дозах 20, 40 мг/кг является снижение активности ферментов восстановления глутатиона: Г-6-Ф-ДГ ( в ткани печени - в 2,4 и 2,6 раза, в эритроцитах - в 3,8 и 5,0 раза), ГР ( в ткани печени - в 1,4 и 1,8 раза, в эритроцитах - 1,7 и 1,8 раза), нарастание продуктов перекисного окисления липидов: ДК ( в ткани печени - в 2,0 и 2,6 раза, в эритроцитах -1,7 и 1,8 раза), МДА (в ткани печени - 1,6 и 2,1 раза, в эритроцитах - 1,3 и 1,4 раза) на 7-10 сутки исследования.

5. Применение цитопротекторных препаратов различного механизма действия снижает морфологические проявления и биохимические признаки токсического действия повторного введения ЦФ. Препарат усиливающий синтез эндогенного глутатиона - ацетилцистеин приводит к повышению концентрации ВГ, СГ, активации ГР, снижению концентрации ДК, МДА, препарат окисленного глутатиона - глутоксим к активации Г-6-Ф-ДГ, ГР, ГП, снижению концентрации ДК, МДА, антиоксидант - мексидол к активации ГР, ГП, снижению концентрации ДК, МДА.

6. Между изменениями показателей системы глутатиона в эритроцитах и ткани печени при повторном введении ЦФ установлена умеренная положительная корреляционная связь ( Г-6-Ф-ДГ - г = 0,65 (20 мг/кг), 0,53 (40 мг/кг) ; ГР - г = 0,46 (40 мг/кг); ДК - г = 0,51 (20 мг/кг), 0,59 (40 мг/кг), МДА - г = 0,56 (20-40 мг/кг)), что экспериментально подтверждает возможность использования данных показателей для оценки степени тяжести цитотоксического поражения ткани печени при повторном введении ЦФ.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для оценки степени тяжести цитотоксического поражения паренхиматозных органов и эффективности фармакологической коррекции этого процесса у лиц, проходящих курс полихимиотерапии, представляется возможным использование определения в эритроцитах таких показателей системы глутатиона как, активность Г-6-Ф-ДГ, ГР, концентрации ДК, МДА;

2. В схему комплексной терапии веществами алкилирующего действия рекомендуется включить фармакологические препараты, обладающие анти-оксидантными и антигипоксантными свойствами (например, мексидол), а также препараты предшественника синтеза глутатиона - ацетилцистеин и препараты окисленного глутатиона - глутоксим.

162

 
 

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2007 года, Минаева, Любовь Валерьевна

1. Ажунова Т.А. Фитофармакоррекция лекарственных гепатопатий / Т.А.Ажунова, Э.А. Алексеева, Т.Г. Бидогаева // Практическая фитотерапия,- 2004. №3. - С. 17-20.

2. Альберт А. Избирательная токсичность / Пер.с англ. А.Альберт. М.: Медицина, 1989. - Т.2. - 432 с.

3. Антонов В.Г. Физиологические и биохимические аспекты действия аль-фа-фетопротеина на гепатоциты и иммунокомпетентные клетки: Дис. . д-ра мед. наук: 03.00.04, 14.00.16 / В.Г.Антонов; Воен. мед. акад. СПб., 1997.-230 с.

4. Арчаков А.И. Микросомальное окисление / А.И. Арчаков. М.: Наука, 1975.-327 с.

5. Арчаков А.И. Окисление чужеродных соединений и проблемы токсикологии / А.И.Арчаков, И.И.Карузина // Вестн. АМН СССР. 1988. - №1. -С. 14-23.

6. Арчаков А.И. Постгеномные технологии и молекулярная медицина /

7. A.И.Арчаков // Вестн. РАН. 2004. - Т.74, № 5. - С.423 - 428.

8. Барабой В.А. Перекисное окисление и стресс / В.А.Барабой, И.И.Брехман,

9. B.Г.Голотин СПб.: Наука, 1992. - 148 с.

10. Белоусова А.К. Молекулярные механизмы действия алкилирующих агентов и антибиотиков / А.К.Белоусова // Химиотерапия злокачественных опухолей. М: Медицина, 1977. - С.61-117.

11. Блохин Н.Н. Химиотерапия опухолевых заболеваний / Н.Н.Блохин, Н.И.Переводчикова. М.: Медицина, 1984. - 304 с.

12. П.Владимиров Ю.А. Свободнорадикальное окисление липидов и физические свойства липидного слоя биологических мембран / Ю.А. Владимиров // Биофизика. 1987. - Т.32, Вып.5. - С.830-844.

13. Воронина Т.А. Механизм действия и обоснование применения препарата мексидол в неврологии / Т.А.Воронина, Л.Д.Смирнов, И.И.Горяйнова -М.: Институт биохим. физики. 2002. - С. 15.

14. З.Воскресенский О.Н. Перекиси липидов в живом организме / О.Н.Воскресенский, А.П.Левицкий // Вопр. мед. химии. 1970. - Т. 16, №6. - С.563-583.

15. Гаврилов В.Б. Измерение диеновых конъюгатов в плазме крови по УФ-поглощению гептановых и изопропанольных экстрактов / В.Б.Гаврилов, А.Р.Гаврилова, Н.Ф.Хмара // Лаб. дело. 1988. - №.2. - С.60-64.

16. Гипоксия: адаптация, патогенез, клиника: рук. для врачей / Под. ред. Ю.Л.Шевченко. СПб.: ЭЛБИ, 2000. - 384с.

17. Глушков С.И. Нарушения системы глутатиона и их роль в патогеназе острых интоксикаций ксенобиотиками с различными механизмами токсического действия: Дис. . д-ра. мед. наук: 14.00.20, 03.00.04

18. С.И.Глушков ; Воен. мед. акад. СПб., 2006. - 451с.

19. Голиков С.Н. Общие механизмы токсического действия / С.Н.Голиков, И.В.Саноцкий, Л.А.Тиунов. Д.: Медицина, 1986. - 279 с.

20. Гусев Е.И. Ишемия головного мозга / Е.И.Гусев, В.И.Скворцова М.: Медицина, 2001. - 328 с.

21. Зозуля Ю.А. Свободнорадикальное окисление и антиоксидантная защита при патологии головного мозга / Ю.А.Зозуля, В.А.Барабой, Д.А.Сутковой. М.: Знание, 2000. - 344 с.

22. Ивницкий Ю.Ю. Интенсивность клеточного дыхания и радиорезистентность организма: Дис. . д-ра мед. наук: 03.00.01 / Ю.Ю.Ивницкий; Воен. мед. акад. СПб., 1994. - 262 с.

23. Ивницкий Ю.Ю. Янтарная кислота в системе средств метаболической коррекции функционального состояния и резистентности организма / Ю.Ю.Ивницкий, А.И.Головко, Г.А.Софронов. СПб.: Воен. мед. акад., 1998,-82 с.

24. Карпищенко А.И. Система белков теплового шока БТШ70 у крыс при отравлении дихлорэтаном / А.И.Карпищенко, С.А.Куценко, С.И.Глушков // Токсикологический вестник. 1999. - №6. - С.8-12.

25. Карпищенко А.И. Методика определения показателей системы глутатиона в лимфоцитах человека / А.И.Карпищенко, В.В.Смирнов, С.И.Глушков, В.Л.Пастушенков // Клиническая лабораторная диагностика. 1997. -№12. -С.41-42.

26. Кашуро В. А. Система глутатиона и перекисное окисление липидов в патогенезе острых тяжелых интоксикаций циклофосфаном: Дис. . канд. мед. наук: 14.00.20, 03.00.04 / В.А.Кашуро; Воен. мед. акад. СПб., 2003. - 209 с.

27. Кашуро В.А. Изучение влияния антигипоксантов на систему глутатиона при остром отравлении циклофосфаном / В.А.Кашуро, С.И.Глушков, Т.М.Новикова // Медико-биологические проблемы противолучевой и противохимической защиты. СПб.: Фолиант, 2004. - С.349-350.

28. Кивман Г.Я. Фармакокинетика химиотерапевтических препаратов / Г.Я.Кивман, Э.А.Рудзит, В.П.Яковлев. М.: Медицина, 1982. - 255 с.

29. Кожевников Ю Н. О перекисном окислении липидов в норме и патологии: обзор / Ю.Н.Кожевников // Вопр. мед. химии. 1985. - №5. - С. 2-7.

30. Колесниченко Л.С. Глутатионтрасферазы / Л.С.Колесниченко,

31. B.И.Кулинский // Успехи соврем, биологии. 1989. - Т.107, Вып.2.1. C.179-194.

32. Колесниченко Л.С. Влияние эмоционально-болевого стресса, гипоксии и адаптации к ней на активность ферментов метаболизма глутатиона и концентрацию глутатиона в органах крыс / Л.С.Колесниченко,

33. B.И.Кулинский, Е.Н.Екимов // Вопр. мед. химии. 1994. - Т.40, Вып.5.1. C.10-12.

34. Корнеев А.А. Роль глутатиона в формировании метаболического ответа клетки на гипоксию / А.А.Корнеев, И.А.Комиссарова // Известия РАН. -1993. №4. - С.542-549.

35. Королюк М.А. Метод определения активности каталазы / М.А.Королюк // Лаб. дело. 1988. -№1.- С. 16-19.

36. Костюшов Е В. Применение антиоксидантов в токсикологической практике / Е.В.Костюшов, А.Г.Овчаренко, В.Д.Соляников // Здоровье и химическая безопасность на пороге XXI века: Материалы международного симпозиума. СПб.: б. и., 2000. - С. 138.

37. Кропачкова К. А. Индукция латентного повреждения печени циклофос-фаном / К.А.Кропачкова, Е.И.Мишурова // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1989. - № 6. - С. 756-758.

38. Кулинский В.И. Ферменты метаболизма глутатиона и их регуляция в норме и при усиленной пролиферации / В.И.Кулинский, Л.С.Колесниченко // Всесоюзный симпозиум по медицинской этимологии: тезисы докладов. -М.: б.и.,1986. С. 197-198.

39. Кулинский В.И. Биологическая роль глутатиона / В.И.Кулинский, Л.С.Колесниченко // Успехи соврем, биологии. 1990. - Т. 110, Вып.1 (4). - С.20-37.

40. Кулинский В.И. Обмен глутатиона / В.И.Кулинский, Л.С.Колесниченко // Успехи биол. химии. 1990. - Т.31. - С. 157-179.

41. Кулинский В.И. Структура, свойства, биологическая роль и регуляция глутатионпероксидазы / В.И.Кулинский, Л.С.Колесниченко // Успехи совр. биол. 1993,- Т.113, Вып.1, - С.107- 122.

42. Куценко С.А. Военная токсикология, радиобиология и медицинская защита: Учебник / С.А.Куценко, Н.В.Бутомо, А.Н.Гребенюк. СПб.: Фолиант, 2004. - 528 с.

43. Лабори А. Регуляция обменных процессов (теоретический, экспериментальный, фармакологический и терапевтический аспекты) / А.Лабори. -М.: Медицина, 1970. 384 с.

44. Ленинджер А. Основы биохимии / А.Ленинджер; Под ред. В.А.Энгельгардта. М.: Мир, 1985 - Т.1. - 367 с.

45. Ленинджер А. Основы биохимии / А.Ленинджер; Под ред. В.А.Энгельгардта. М.: Мир, 1985. - Т.2. - 523 с.

46. Лужников Е.А. Клиническая токсикология / Е.А.Лужников. М.: Медицина, 1982.-368 с.

47. Машковский М.Д. Лекарственные средства / М.Д.Машковский. Вильнюс, 1993. - Т.2. - 528 с.

48. Напалков Н.П. Рак и демографический переход / Н.П.Напалков // Биотехнология и онкология: сборник тезисов 1-й Российско-американской конференции. СПб.: б. и.,2005. - С.9 - 11.

49. Пастушенков J1.В, Растения антигипоксанты (фитотерапия) /

50. B.Л.Пастушенков, Е.Е.Лесиовская. СПб.: Хим.-фарм. Институт, 1991. -96 с.

51. Петрович Ю.А. Глутатионпероксидазы в системе антиоксидантной зашиты мембран / Ю.А.Петрович, Д.В.Гуткин // Патол. физиология и экспе-рим. терапия. 1981. -№5. -С.76-78.

52. Петрович Ю.А. Свободно-радикальное окисление и роль в патогенезе воспаления, ишемии и стресса / Ю.А.Петрович, Д.В.Гуткин // Патол. физиология и эксперим. терапия. 1986. - №5. - С.85-92.

53. Прайер У. Свободные радикалы в биологии / У.Прайер М.: Мир, 1979. - Т.1.- 318с.

54. Проценко Л.Д. Химия и фармакология синтетических противоопухолевых препаратов / Л.Д.Проценко, З.П.Булкина Киев: Наук, думка, 1985. -286 с.

55. Рева Ю.П. Хромато-масс-спектрометрическое изучение обмена цикло-фосфана на субклеточном уровне / Ю.П. Рева // Хроматография в биологии и медицине: тезисы докладов 1-й Всесоюзной конференции. М.: б.и., 1983.- С.252-253.

56. Северин Е.С. Биохимия / Е.С.Северин. М.: ГЭОТАР - Медиа, 2005.1. C.622-623.

57. Соколовский В В. Тиолдисульфидное соотношение крови как показатель состояния неспецифической резистентности организма: Учебное пособие / В.В.Соколовский. СПб.: б.и., 1996. - 30 с.

58. Соколовский В.В. Тиоловые антиоксиданты в молекулярных механизмах неспецифической реакции организма на экстремальное воздействие / В.В.Соколовский // Воп. мед. химии. 1988. - №6. - С.2-11.

59. Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России. М.: Медицина, 2000,- С. 991-992.

60. Стальная И.Д. Метод определения диеновой конъюгации ненасыщенных высших жирных кислот / И.Д.Стальная // Современные методы в биохимии. М.: Медицина, 1977,- С.63-64.

61. Тиунов JI.A. Механизмы естественной детоксикации и антиоксидантной защиты / Л.А.Тиунов // Вестник РАМН. 1995. - №3. - С.9- 13.

62. Тиунов Л.А. Роль глутатиона в процессах детоксикации / Л.А.Тиунов, В.А.Иванова //Вест. АМН СССР. 1988. - №1. - С.62-69.

63. Турпаев К.Т. Роль фактора транскрипции АР-1 в интеграции внутриклеточных сигнальных систем / К.Т.Турпаев // Молекулярная биология. -2006,- Т.40, №6,- С.945-961.

64. Узбеков М.Г. Действие глутатиона на энергетический обмен мозга при антенатальной гипоксии / М.Г.Узбеков, И.К.Карпачевская // Патол. физи-ол. и эксперим. терапия. 1991. -№5. - С. 11-13.

65. Циклофофан. Сборник статей / под ред. С. А. Гиллера. Рига: Зинатне, 1965.-270 с.

66. Шанин В.Ю. Клиническая патофизиология / В.Ю.Шанин. СПб.: Специальная Литература, 1998. - 569 с.

67. Янковский О.Ю. Редокс-факторы как модуляторы клеточных функций / О.Ю.Янковский, С В. Слепенков // Вестник СПбГУ. 1995. - Сер.З,3. С.78-84.

68. Ajit S. Ultrastructural changesof sarcoma-180 cells after treatment with cis-dichlorodiamine pestium (II) in vivo and in vitro / S.Ajit // Ind. J. Exp. Biol. -1976 Vol. 14, №4. - P. 383-390

69. Alin P. 4-hydroxyalk-2-enals are substrates for glutathione transferase / P.Alin, U.Danielson, B.Mannervik // FEBS Letters. 1985. - Vol.179, №2. - P.267-270.

70. Anders M.W. S-conjugate-dependent toxicity alternatives to animal studies / M.W.Anders // Altera Animal Testing Experiment. 2000. - Vol.7, № 1. -P.30-36.

71. Anderson B.B. Glutathione reductase activity and its relationship to pyri-doxinephosphate activity in G6PD deficiency / B.B.Anderson, J.E.Clements, G.M.Perry//Eur. J. Haematol. 1987. - Vol.38, №1. - P. 12-20.

72. Arai M. Mitochondrial phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase plays a major role in preventing oxidative injury to cells / M.Arai, H.Imai, T.Koumura// J. Biol. Chem. 1999. - Vol.274, №8. - P.4924-4933.

73. Bagley C.M. Clinical pharmacology of cyclophosphamide / C.M.Bagley, F.W.Bortick, V.T.De Vita// Cancer Res. 1973. - Vol. 33 - P. 226-233.

74. Bellomo G. Modulation of cellular glutathione and protein thiol status during quinone metabolism / G.Bellomo, H.Thor, S.Orrenius // Meth. Enzymol. -1990. Vol. 186. - P.627-635.

75. Bergmeytr H.U. Methoden der enzymatischen analyse / H.U.Bergmeytr. -Berlin, 1970.-P. 599-606.

76. Bhanumathi P. Modulation of glutathione depletion and lipid peroxidation by WR-77913 an 2-mercaptopropionylglycine in cyclophosphamide chemotherapy / P.Bhanumathi, P.Devi//Indian J. Exp. Biol. 1994,- Vol.32, №8-P.562-564.

77. Boveris A. Superoxyde dismutase / A.Boveris, E.Cadenas ed by L.Oberly. -CRS Press, BocaRraton, Fl, 1983. P.15-30.

78. Boyd M.R. The effect of hepatic metabolism on the production and toxicity of reactive metabolites in extra-hepatic organs / M.R.Boyd, C.N.Statham // Drug metabol. 1983.-Vol. 14, №1,- P.35-47.

79. Boyd N. Biochemical mechanisms in chemical-induced injury: role of metabolic activation / N.Boyd // CRC Crit. Rev. Toxicol. 1980. - Vol.7, №2. -P.103-176.

80. Brock N. Uber die Aktivierung von Cyclophosphamide in vivo und in vitro / N.Brock, H.Honorst- Arzneimittel: Forschung, 1963. Vol. 13 - P. 10261031.

81. Bull S. Genetically engineered cell-based system for detecting metabolism-mediated toxicity / S.Bull, I.Langezaal, R.Clothier, S.Coecke // Altern. Lab. Anim. 2001. - №6 - P.703-716.

82. Burgman P.W. Possible role of localized protein denaturation in the mechanism of induction of thermotolerance by heat, sodium-arsenite and ethanol /P.W.Burgman, H.H.Kampinga, A.W.T.Konings /Ant. J. Hypertherm. 1993. -Vol.9. - P.151-162.

83. Chang S.W. Hypoxia increases plasma glutathione disulfide in rats / S.W.Chang, T.J.Stelzner, J.V.Weil // Lung. 1989. - Vol.167, №5. - P.269-276.

84. Chen Q. Activation of the growth arrest and DNA damage-inducible gene gadd 153 by nephrotoxic cysteine conjugates and dithiothreitol / Q.Chen, K.Yu, J.Stevens // J. Biol. Chem. 1992. - Vol.267, № 12. - P.8207-8212.

85. Colvin M. Alkylating properties of phosphamide mustard / M.Colvin // Cancer Res. 1976. - Vol. 36. - P. 1121-1126.

86. Davies K.J. Protein damage and degradation by oxygen radicals. 1 .General aspects / K.J.Davies // J. Biol. Chem. 1987. - Vol.262, №17. - P.9865-9901.

87. Davies K.J. Protein damage and degradation by oxygen radicals. Modification of secondary and tertiary structure / K.J.Davies,M.E. Delsignore // J. Biol. Chem. 1987. - Vol.262, № 17. - P.9908-9913.

88. Davies K.J. Protein damage and degradation by oxygen radicals. Modification of aminoacids / K.J.Davies, M.E.Delsignore, W.Lin // J. Biol. Chem. -1987. Vol.262, №17. - P.9902- 9907.

89. Davis L. Effect of Withania somnifera on cyclophosphamide-induced uro-toxicity / L.Davis, G.Kuttan // Cancer Lett. 2000. - Vol. 148, №1. - P. 9-17.

90. Dean R.T. Hypothesis: a damaging role in aging for reactive protein oxidative products / R.T.Dean, J.Gebiki, S.Gieseg // Mutat. Res. 1992. - Vol. 275. -P.387-3 93.

91. De Leve L.D. Cellular target of cyclophosphamide toxicity in the murine liver: role of glutathione and site of metabolic activation / L.D.De Leve // Hepatology. 1996. - Vol. 24, №4. - P.830-837.

92. Deneke S.M. Regulation of cellular glutathione / S.M.Deneke, B.L.Fanburg // Am. J. Physiol. 1989. - Vol.257, №1. - P.163-L173.

93. Descamps-Latscha B. Oxidative stress and cadiovascular disease in end-stage renal failure / B.Descamps-Latscha, T.N.Khoa // Cadiovascular disease inend-stage renal failure. New-York: Oxford University Press., 2000. - P.245-271.

94. Diana L. Stress ossidativo nell'insufficienza renale: uno studio sperimentale / L.Diana, R.Di Giovannandrea, M.Valeri // Ann. 1st. Super Sanita. 2000. -Vol.36, №4,- P.497-501.

95. Dirven H.A. Glutathione conjugation of the cytostatic drug ifosfamide and the role of human glutathione S-transferases / H.A.Dirven, L.Megens, M.J.Oudshoorn, M.A.Dingemanse, van B.Ommen, van P.J.Bladeren // Chem. Res. Toxicol. 1995. - №7. P.979-986.

96. Dirven H.A. Involvement of human glutathione S-transferase isoenzymes in the conjugation of cyclophosphamide metabolites with glutathione / H.A.Dirven, van B.Ommen, van P.J.Bladeren // Cancer Res. 1994. - №23. -P.6215-6220.

97. Droge W. Function of glutathione and glutathione disulfide in immunology and immunopathology / W.Droge, K.Schulze-Osthoff, S.Mihm // FASEB J. -1994. Vol.8. - P.l 131—1138.

98. Ellman G.L. Tissue sulfhydryl groups / G.L.Ellman // Arch. Biochem. Bio-phys. 1959. - Vol.82, N.l. - P.70-77.

99. Friedman J.M. Cyclophosphamide and related phosphoramide mustards / J.M.Friedman, O.M.Myles, M.Colvin. New York: Basel,1979. - P. 143-204.

100. Gilman A. The biological actions and therapeutic applications of the p-chloroethylamines and sulfides / A.Gilman, F.S.Philips // Sience. 1946. -Vol. 103. - 409 p.

101. Grant R.L. Experimental models and general mechanisms of toxicity / R.L.Grant, J.D.Acosta, M.A.Smith // Comprehensive Toxicology on CD-ROM. Elsevier Sci. 1997. - Vol. 1 - P. 567-568.

102. Habig W.H. Assay for differentiation of glutathione S-transferases / W.H.Habig, W.B.Jakoby // Meth. Enzymol. 1981. - Vol.77. - P.398-405.

103. Harman D. Free-radical theory of aging: inversing the functional life span / / D. Harman//Ann. NY Acad. Sci. 1994,- Vol.717. - P.l-15.

104. Isaacs J.T. Cyclic AMP-dependent control of rat hepatic glutathione disulfi-de-sulfhydryl ratio / J.T.Isaacs, F.Binkley // Biochem. Biophys. Acta. 1977. -Vol.498, №l.-P.29-38.

105. Juma F. D.First pass hepatic metabolism of cyclophosphamide / F.D.Juma, H.J.Rogers, et al. // Brit. J. Clin. Pharmacol. 1979. -Vol. 7. - P. 422.

106. Kanekal S. Metabolism of cyclophosphamide by lipoxygenases / S.Kanekal, J.P. Kehrer // Drug Metab. Dispos. 1994. - №1. - P.74-78.

107. Ketterer B. The structure and maltiple function of glutathione transferases / B.Ketterer, P.Beale, D.J.Meyer // Biochem. Soc. Transact. 1982: - Vol.10, №2.-P.82-83.

108. Kehrer J. R Cellular reducing equivalents and oxidative stress / J.R.Kehrer, L.G.Lund // Free Radical. Biol. Med. 1994. - Vol.17, № 1. - P. 65-75.

109. Kinscherf R. Effect of glutathione depletion and oral N-acetyl-cysteine treatment on CD4+ and CD8+ cells / R.Kinscherf, T.Fischbach, S.Mihm // FASEB J. 1994. - Vol.8. - P.448-451.

110. Kornberg A. Glucose-6-phosphate dehydrogenase 6-phosphogluconic dehydrogenase / A.Kornberg, B.L.Horecker, P.Z.Smyrniot // Meth. Enzymol. -1955,-Vol.1.-P.323-327.

111. Lash L.H, Transport of glutathione by renal basal-lateral membrane vesicles / L.H.Lash, D.P.Jones // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1983. - Vol.112, №1. - P.55-60.

112. Liu X L. Glutathione antagonized cyclophosphamide- and acrolein-induced cytotoxicity of PC3 cells and immunosuppressive actions in mice / X.L.Liu,

113. K.Chen, Y.P.Ye, X.Y.Peng, B.C.Qian // Zhongguo Yao Li Xue Bao. 1999. -№7. - P.643-646.

114. Liu H. The reduction of glutathione disulfide produced by t-butyl hydroperoxide in respiring mitochondria / H.Liu, J.P.Kehrer // Free Radic. Biol. Med.- 1996 -Vol.20, №3. P.433-442.

115. Lawrence R.A. Species, tissue and subcellular distribution of non Se-dependent glutathione peroxidase activity / R.A.Lawrence, R.F.Burk // J. Nutr.- 1978. Vol.108, №2. -P.211-215.

116. Lu S.C. Hormonal regulation of glutathione efflux / S.C.Lu, C.Garcia-Ruiz, J.Kuhlenkamp // J. Biol. Chem. 1990. - Vol.265, №27. - P. 16088-16095.

117. Lu S.C. Specificity and directionality of thiol effects on sinusoidal glutathione transport in rat liver / S.C.Lu, J.Kuhlenkamp, J.L.Ge // Mol. Pharmacol. 1994. - Vol.46, №3. - P.578-585.

118. Maiorino M. Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase / M.Maiorino, C.Gregolin, F.Ursini // Meth. Enzymol. 1990. - Vol.186. -P.448-457.

119. Mannervick B. Role of cytoplasmic thioltransferase in cellular regulation by thyol-disulfide interchange / B.Mannervick, K.Axelsson // Biocheni. J. 1980. -Vol. 190, №1. - P.125-130.

120. Mannervik B. Thioltransferases / B.Mannervik // Enzymatic basis of detoxi-catio. Orlanto: Acad. Press, 1980. - Vol.2. - P.229-244.

121. Mannervik B. Glutathione: chemical, biochemical and medical aspects / B.Mannervik, J.Carlberg, K.Larson // Pt. A: Coenzymes and cofactors. N.Y.: Wiley, 1989,-Vol.3 -693 p.

122. Meister A. Methods for the selective modification of glutathione metabolism and study of glutathione transport / A.Meister // Meth. Enzymol. 1985. -Vol.113. -P.571-589.

123. Meister A. Glutathione / A.Meister, M.E.Anderson // Ann. Rev. Biochem. -1983,-Vol.52.-P.711-760.

124. Meister A. Glutathione and related glutamyl compounds: biosynthesis and utilization / A.Meister, S.S.Tate //Ann. Rev. Biochem. 1976. - Vol.45, №3. -P.559-564.

125. Morin J.E. Thiol: protein disulfide exchange enzymes / J.E.Morin, J.E. Dixon // Meth. Enzymol. 1985. - Vol.113. -P.541-547.

126. Pacifici R.E. Protein, lipid and DNA repair system in oxidative stress: free radical theory of aging revisited / R.E.Pacifici, K.J.A.Davies // Gerontology. -1991.- Vol.37. -P.166-180.

127. Papa S. Reactive oxygen species, mitochondria, apoptosis and aging / S.Papa, V.P.Skulachev // Mol. Cell. Biochem. 1997. - Vol.174. - P.305-319.

128. Peterson G.L. Simplification of protein assay method of Lowry et al which is more generally applicable / G.L.Peterson // Anal. Biochem. - 1977. -Vol.83, N.2.-P.346-356.

129. Prohaska J.R. The glutathione peroxidase activity of glutathione -S-transferases / J.R.Prohaska // Biochim. Biophys. Acta. 1980. - Vol. 611, № 1.- P.87-98.

130. Ramu K. Studies on the basis for the toxicity of acrolein mercapturates / K.Ramu, C.S.Perry, T.Ahmed, G.Pakenham, J.P.Kehrer // Toxicol. Appl. Pharmacol. 1996. - №2. - P.487^198.

131. Ramu K. Acrolein mercapturates: synthesis, characterization, and assessment of their role in the bladder toxicity of cyclophosphamide / K.Ramu, L.H.Fraiser, B.Mamiya, T.Ahmed, J.P.Kehrer// Chem. Res. Toxicol. 1995. -№4.-P.515-524.

132. Richman P.G. Regulation of y-glutamylcysteine sinthetase by nonallosteric feedback inhibition by glutathione / P.G.Richman, A.Meister // J. Biol. Chem.- 1975. Vol.250, №4. - P.l422-1426.

133. Singh S.N. Effect of high altitude (7,620 m) exposure on glutathione and related metabolism in rats / S.N.Singh, P.Vats, M.M.Kumria // Eut. J. Appl. Physiol. 2001. - Vol.84, №3. - P.233-237.

134. Sulkowska M. The effect of pentoxifylline on infrastructure and antioxidant potential during cyclophosphamide-induced liver injury / M.Sulkowska, S.Sulkowski, E.Skrzydlewska // J. Submicrosc. Cytol. Pathol. 1999. - №3. -P.413^122.

135. Tachikawa T. Chemosensitivity testing of human mouth carcinoma cell link / T.Tachikawa, H.Kumazawa, Y.Hori // Acta Otorinolaryngol. Suppl. -Stockh., 1993. Vol.500. - P. 154-157.

136. Tian W N Importance of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in cell death / W.N.Tian, L.D.Braunstein, K.Apse, J.Pang, M.Rose, X.Tian and R.C. Stanton // Am. J. Physiol. 1999. - Vol.276. - P.l 121-1131.

137. The cytotoxics handbook / Ed. by: M.C.Allwood, P.Wright. Oxford: Red-cliffe med. Press, 1990. - 239 p.

138. Uchiyama M. Determination of malonaldehyde precursor in tissues by thio-barbituric acid test / M.Uchiyama, M.Michara // Anal. Biochem. 1978. -Vol.86, N.l.-P.271-278.

139. Venkatesan N. Modulation of cyclophosphamide-induced early lung injury by curcumin, an anti-inflammatory antioxidant / N. Venkatesan, G.Chandrakasan // Mol. Cell Biochem. 1995. - №1. - P.79-87.

140. Venkatesan N. In vivo administration of taurine and niacin modulate cyclophosphamide-induced lung injury / N. Venkatesan, G.Chandrakasan // Eur. J. Pharmacol. 1994. - №1. - P.75-80.

141. WHO Handbook for reporting results of cancer treatment // WHO Offset Publication NO. Geneva, 1985 - 48 p.

142. Yoshimura S. Inhibition of neutral sphingomyelinase activation and cera-mide formation by glutathione in hypoxic PC 12 cell death / S.Yoshimura, Y.Banno, S.Nakashima // J. Neurochem. 1999. - Vol.73, №2. - P.675-683.

143. Yuan Z.M. Glutathione conjugation with phosphoramide mustard and cyclophosphamide. A mechanistic study using tandem mass spectrometry / Z.M.Yuan, P.B.Smith, R.B.Brundrett, M.Colvin, C.Fenselau // Drug Metab. Dispos. 1991. -№3. -P.625-629.

144. Ziegler D M. Role of reversible oxidation-reduction of enzyme thiols-disulfides in metabolic regulation / D.M.Ziegler // Annual. Rev. Biochem. -1985. Vol.54. - P.305-329.