Автореферат и диссертация по медицине (14.00.20) на тему:Экспериментальная оценка роли изменений системы глутатиона в реализации побочных цитотоксических эффектов повторного введения циклофосфана

00305Э816 На правах рукописи

МИНАЕВА / Любовь Валерьевна

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА РОЛИ ИЗМЕНЕНИЙ СИСТЕМЫ ГЛУТАТИОНА В РЕАЛИЗАЦИИ ПОБОЧНЫХ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ ПОВТОРНОГО ВВЕДЕНИЯ ЦИКЛОФОСФАНА

14.00.20 — токсикология, 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург

2007 ^ 7 [' К ¡? 9ППу

003059816

Работа выполнена в Военно-медицинасой академии имени С М Кирова Научные руководители:

доктор медицинских наук профессор Карпнщенко Анатолий Иванович кандидат медицинских наук Глушков Сергей Иванович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор Головко Александр Иванович доктор медицинских наук профессор Долго-Сабуров Валерий Борисович

Ведущая организация:

Федеральное государственное предприяше «НИИ гигиены, профпатологии и экологии человека» Федеральною медико-биологического агентства России

Защита диссертации состоится " 8 " июня 2007 I ода в часов на заседании диссертационного совета Д 215 002 11 в Военно-медицинской академии имени СМ Кирова (194044, г. Сашст-Нетербург, ул Академика Лебедева, дом 6)

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Военно-медицинской академии имени С М Кирова

Автореферат разослан " ^^ОиЯ._2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук профессор Б.И. Ищенко

Актуальность. В течение последних 25-30 лет рост заболеваемости злокачественными опухолями превысил годовой темп прироста мирового населения В России с 1992 по 2001 г показатель заболеваемости злокачественными новообразованиями возрос с 271,8 до 313,9 на 100 тысяч населения Прирост заболеваемости за десятилетие составил более 16%, при ежегодном темпе - 1,7% (Напалков НП , 2005) В связи с этим поиск адекватной противоопухолевой терапии заслуживает пристального внимания и требует решения ряда проблем, связанных, пре аде всего, с ранней диагностикой и коррекцией побочных токсических эффектов действия химиотерапевтических препаратов (Арчаков А И , 2004) Данное положение в полной мере относится и к цикло-фосфану как к одному из наиболее распространещшх цитостатиков, используемых в противоопухолевой терапии

Циклофосфан (ЦФ) - алкилируюший цитостатический препарат, обладающий относительно широким противоенз'холевым спектром действия В терапии ряда заболеваний используется кат< иммунодепрессивное средство Однако его применение ограничивается побочными эффектами, такими как гепа-тотоксичность, нефротоксичность, гематотоксичность, мутагенность Препарат обладает очень высокой кумуляцией и низкой обратимостью токсического действия (Блохин H H, 1998, Машковский M Д , 1993)

Активация ЦФ происходит под действием микросомалышх моноокси-геназ в различных тканях opi анизма, преимущественно в гепатоцитах, в результате чего накапливаются его реакциолно-способиые метаболиты, которые вступают в реакции алкшшрования, преимущественно, с нуклеиновыми кислотами, что и лежит в основе- механизма действия данного препарата Восстановленный глутатион, конъюгируя при участии ГТ с активными метаболитами ЦФ, обезвреживает их, необратимо при этом расходуясь Кроме того, с цшохрома Р45о возможна утечка активных форм кислорода, в обезвреживании которых также принимает участие система глутатиона (Блохин H H ,1998, Гиллер С А , 1965)

Таким образом, исследование системы глутатиона при повторном введении циклофосфана позволяет более подробно изучить молекулярные механизмы его токсического действия, кумулятивный эффект, а также биохимические механизмы детоксикации этого соединения

Целыо исследования явилось изучение состояния системы глутагаона в тканях печени, почек, головною мозга и в эритроцитах лабораторных животных при повторном введении циклофосфана для определения возможности использования показателей обмена i лутатиона в качестве лабораторных тестов оценки тяжести цитотоксичесюгх эффектов химиотерапии, а также при поиске новых средств цитопротекции

Для достижения поставленной цели предстояло решшь следующие задачи исследования:

— определить динамику и зменений состояния системы глутатиона и процессов перекисного окисления липидов в различных органах белых беспородных крыс при повторном введении циклофосфана в суточных дозах 20 и 40 мг/кг в течение 1-10 суток,

\

- исследовать влияние предшественника синтеза 1лутатиона (ацетилци-стеина), препаратов окисленного глутатиона (глутоксима, литана), антигипок-санга (трисана), антиоксидантов (мексидола, цитофлавина) на динамику изменений показателей системы глутатиона и интенсивность процессов перекисно-го окисления лишщов при повторном введении циклофосфана в суточной дозе 20 мг/кг в течение 10 суток,

- оценить информативность изменений показателей системы глутатиона в эритроцитах для оценки степени тяжести питотоксического повреждения тканей внутренних органов в условиях повторного введения циклофосфана

Основные положения, выносимые иа защиту:

1 В ответ на повторное введение циклофосфана в дозах 20, 40 мг/кг в ткани печени и в эритроцитах лабораторных животных отмечается активация обмена глутатиона По мере увеличения дозовой пагрузки развиваются нарушения состояния системы глутатиона и цитотсксические повреждения ткани печени, что подтверждается и выраженными морфологическими изменениями

2 Вед>щим показателем нарушений обмена глутатиона при повторных отравлениях циклофосфаном является снижение активности глкжозо-6-фосфатдегидрогеназы

3 Для проведения фармакологической коррекции цитотоксических повреждений ткани печени при повторном введении циклофосфана можно рассматривать применение препарата предшественника синтеза глутатиона (аце-тилцистеила), препарата окисленного глутатиона (глутоксима), антиоксвданта (мексидола)

4 Определение показателей, характеризующих обмен глутатиона в клетках красной крови, имеет диагностическое значение для оценки цитоток-сического поражения тканей печени в условия", повторного введения циклофосфана

Научная новизна. На основе проведенной комплексной оценки показателей системы глутатиона, сопряженчых биохимических процессов в различных тканях экспериментальных животных (печень, почки, головной мозг, эритроциты) при повторном введении циклофосфана показана взаимосвязь между выраженностью изменении естественной системы цитопротекции и ци-тотоксическими эффектами ксенобиотика Проведен анализ причин, вызывающих изменения состояния системы глутатиона и активацию процессов пе-рекисного окисления липидов в исследуемых тканях при повторном введении циклофосфана Установлено, что использование в эксперименте фармакологических препаратов (ацетилцистеина, глутоксима, мексидола) в условиях повторного введения циклофосфана в дозе 20 мгЛсг в течение 10 суток предотвращает развитие патобиохимических процессов и реализацию цитотоксических повреждений тканей паренхима гозных органов Показана перспективная возможность использования ряда покгзателей системы глутатиона (активности гшокозо-6-фосфатдегидрогеназы, глутатионред)'ктазы, концентрации диеновых конътогатов, малонового диальдегида) в эритроцитах для установления выраженности побочных токсических эффектов циклофосфана и оценки эффективности коррекционной терапии

Практическое значение работы заключаем в том, что для оценки тя-жесга токсического поражения парен \.иматозных органов и эффективности проводимой фармакологичес кой коррекции этого процесса у пациентов, проходящих курс полихимиотерапии, можно использовать показатели системы глутатиона (активности Г-6-Ф-ДГ, ГР, концентрации ДК, МДА) в эр1ггроцитах Реализация результатов исследования. Рекомендации, разработанные на основании полученных в ходе диссертационного исследования данных, используются в научной рабоге и учебьом процессе на кафедре клинической биохимии и лабораторной диагностики и кафедре военной токсикологаи и медицинской защиты Военно-медицинской академии

Апробация работы. Результаты работы доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Агтуалъные вопросы повышения работоспособности и восстановления здоровья военнослужащих и гражданского населения в условиях чрезвычайных ситуаций» (Санкт-Пегербург, 2006 г ), Всероссийской научно-практической конференция «Актуальные проблемы химической безопасности в Российской Федерации» (Санкт-Петербург, 2007 г), Итоговой конференции военно-научною общества слушателей и ординаторов 1 факультета (Санкт-Петербург, 2007 г ), Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения в многопрофильном лечебном учреждении» (Санкт-Петербург, 2007 г )

Публикации. По теме диссертационно! о исследования опубликовано ] 8 печатных работ, в том числе 7 стагей в отечественных научных журналах

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, включающих обзор литературы, общую характеристику материалов и методов исследования, полученные результаты и их обсуждение, заключение и выводы Работа изложена на 178 страницах машинописного текста, содержит 21 рисунок и 20 таблиц Список литературы состоит из loi источника, из них 76 отечественных и 85 иностранных авторов

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Схема проведения экспериментального исследования представлена в табл 1

Экспериментальные исследования выполнены на 180 белых беспородных крысах-самцах массой 190-210 г из питомника РАМН «Рапполово»

В ходе экспериментального исследования проводили оценку влияния повторного введения циклофосфана (в течение 1-10 суток) в дозах 20,40 мг/кг ежесуточно на состояние показателей системы глутатиона и перекисного окисления липидов в различных тканях лабораторных животных в различные сроки исследования

Моделирование повторной интоксикации ЦФ осуществляли согласно схеме гепатотоксического воздействия ЦФ по Т А Ажуновой (2004)

Забой животных проводили через 1 сутки после 1, 3, 5, 7 и 30 введений ЦФ в перечисленных суточных дозах

Таблица 1

Схема проведения экспериментального исследования

№ группы Суточная доза циклофосфана Количество введений Препарат коррекции Количество животных

1 Контроль 10

2 I 10

3 3 10

4 20 мг/кг 5 10

5 7 10

6 10 Нет 10

7 1 10

8 40 мг/кг 3 10

9 5 10

10 7 10

и контроль 10

12 без лечения 10

13 10 Ацетилцистеин 10

14 10 Трисан 10

15 20 мг/кг 10 Мексидол 10

16 10 Цитофлавин 10

17 10 Глутоксим 10

18 10 Литан 10

При проведении фармакологической коррекции цитотоксического действия ЦФ через 30 мин после введения токсиканта в дозе 20 мг/кг животным вн утрибрюшинно ежедневно вводили один из следующих препаратов в течение 10 суток ацетилцистеин - в виде 3 % официнального раствора (150 мг/кг), мексидол - в виде 1 % водного раствора (50 мг/кг), цитофлавин - в виде 10 % официнального раствора (118 мг/кг), трисан - в виде 1 % водного раствора (15 мг/кг), глутоксим - в виде 1% водного раствора (100 мг/кг), литан - 0,5% водного раствора (100 мг/кг)

У экспериментальных животных в тканях головного мозга, печени, почек и эритроцитах, а также в эритроцитах пациентов определяли содержание восстановленного глутатиона (ВГ), уровень свободных' сульфгидрильных грзшп бепков (СГ) и активность ферментов системы глутатиона и сопряженных систем - глутатионредуктазы (ГР), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-Ф-ДГ), глутатион-Б-трансферазы (ГТ), глутатионпероксидазы (ГП) и ка-

талазы Для оценки интенсивности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) определяли концентрацию диеновых конъюгатов (ДК), малонового ди-альдегида (МДА)

Концентрацию ВГ определяли методом G L Ellman (1959) в модифика-ЦШ1 С И Глушкова (2006), заключавшейся в осаждении белка 20% раствором сульфосалицшговой кислоты Содержание СГ определяли согласно методике G Bellomo et al (1990) Определение концентрации ДК проводили по методике И Д Стальной (1977) Концентрацию МДА определяли по методу М Uchiyama (1978) Определение активности ферментов системы глутатиона проводили в гемолизаге эритроцитов или в днтозольной фракции, полученной после центрифугирования гомогенатов тканей в течение часа при 150000 g на ультрацентрифуге L8-M («Весктап», США) Активность глутатионредуктазы определяли по методу I Garlberg, В Mannervik (1985), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы - по A Komberg et al (1955), глутатионпероксидазы - по методу А Н Гавриловой и Н Ф Хмары (1986) с использованием в качестве субстрата гидроперекиси трет-бутила, каталазы - по М АКоролюку (1988), глуга-тион-Б-трансферазы - методом W Н Habig, W В Jakoby (1981) Расчет активности ферментов производили на грамм белка или гемоглобина (в гемолизате эритроцитов) Концентрацию белка определяли методом Лоури в модификации G L Peterson (1977), гемоглобина - гемиглобинцианидным методом

Влияние повторного введения циклофосфана и использовавшихся средств фармакологической коррекции на тяжесть токсического поражения паренхиматозных органов оценивали по следующим биохимическим показателям гепато- и нефротоксичности, определяемым в сыворотке крови лабораторных животных поражение ткани печени - по активности аспартатами-нотрансферазы (ACT) и аланинаминотрансферазы (АЛТ), щелочной фосфага-зы (ЩФ), по содержанию общего билирубина, поражение тканей почек - по концентрации креатинина и мочевины Биохимические показатели токсичности ВОЗ (1985) (активность аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансфе-разы, содержание креатинина, общего билирубина) в сыворотке крови экспериментальных животных при повторном введении ЦФ определяли на автоматическом биохимическом анализаторе «Synchron» («Beckman Coulter», США) щелочную фосфатазу и мочевину на автоматическом биохимическом анализаторе Hitachi - 902 («Hitachi», Япония)

Статистическую обработку полученных результатов проводили на персональном компьютере с помощью пакета прикладных программ «Microsoft Excel» В каждой группе рассчитывали средние значения и ошибку среднего Достоверность различий с соответствующей контрольной группой оценивали по t-критерию Стьюдента Приведенные в тексте и таблицах значения представляли в виде Xq, ± тх

it

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенное экспериментальное исследование, направленное на изучение особенностей обмена глутатиона и интенсивности протекания процессов ПОЛ в тканях печени, почек, головного мозга и эритроцитах лабораторных животных при повторных введениях ЦФ, позволяет говорить о вовлечении изменений данной биохимической системы в механизмы повреждения клеток при повторных интоксикациях алкилирующими агентами

Анализ полученных результатов указывает на тесную связь изменений изучаемых биохимических показатели в исследуемых органах с величиной используемой дозы ЦФ, длительностью введения, участия ткани в метаболизме ксенобиотика и межтканевых особенностей обмена глутатиона

При изучении изменений концентрации В Г в условиях повторных введений ЦФ в ткани печени был выявлен ряд характерных особенностей В начальном периоде эксперимента (до 5 суток), длительность которого была обратно пропорциональна величине дозы, отмечалось компенсаторное увеличение концентрации ВГ по сравнению с контрольной группой животных, а в дальнейшем имела место тенденция к снижению уровня данного показателя в период истощения ресурсов системы 1 лутатиона После введения ЦФ в дозе 20 мг/кг максимальное увеличение конценграции ВГ на 23,2% (р<0,05) выше значений иитактного контроля отмечалось на 5 с\тки компенсаторного периода, введение большей дозы привело I- сокращению длительности компенсаторного периода и максимальному повышению уровня ВГ на 3 сутки эксперимента на 23,1% (р<0,05)

Данные изменения носили дозозависимый характер и предполагают связь с особенностями тканевого обмена глутатиона

В настоящее время истощение уровня ВГ в гепатоцитах при острых отравлениях ЦФ в высоких дозах отмечается многими исследователями (Глуш-ков С И, 2006, Кашуро В А, 2003) К снижению уровня ВГ может приводить его расходование на процессы конъюгации с ксенобиотиком и его метаболитами, наиболее интенсивно протекающими в тканях этого органа, при этом увеличение дозы вводимого ксенобиотика приводит к предельному напряжению системы детоксикации

В отличие от острой интоксикации высокими дозами, повторное введение ЦФ сопровождается развитием длительного «токсического стресса», характеризующегося постепенной мобилизацией, г затем расходованием компенсаторных резервов системы глутатиона За периодом напряжения адаптивных процессов следует период компенсации, направленный на временное возмещение поврежденных функций системы глутатаона в процессе интоксикации Если действие токсиканта продолжается, наступает срыв компенсации (Голиков С Н , 1986)

Подтверждением этого положения может служить двухфазный характер изменений, который отмечался и при исследовании активности ряда ферментов системы глутатиона в наиболее повреждаемой ткани - печени Введение ЦФ в дозах 20 (40) мг/кг сопровождалось повышением активности ГР в тече-

ние 3 (1) суток с последующим достоверным ее падением При введении токсиканта в меньшей дозе активность ГТ постепенно нарастала в течение 5 суток исследования, превысив значения контрольной группы в 1,61 раза (р<0,05) При применении ЦФ в дозе <10 мг/кг нарастание активности этого фермента наблюдалось через 1 суток в 1,44 раза (р<0,05) выше значений контроля с последующим значительным ее снижением При исследовании ГП и каталазы компенсаторная активация (р< 0,05) этих ферментов в ткани печени наблюдалась на 5 сутки эксперимента при использовании дозы токсиканта 20 мг/кг (в 1,37 и 1,30 раза, соответственно), а также в течение 1-3 суток при введении большей дозы - в 1,14 и 1,23 раза

Однако, при исследовании активности Г-6-Ф-ДГ в ткани печени периода компенсаторных изменений выявлено не было Напротив, па протяжении всего периода эксперимента набглодалось достоверное выраженное дозозависи-мое ее снижете (табл 2)

Таблица 2

Изменения активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в тканях различных органов белых беспородных крыс при повторных введениях циклофосфана в дозах 20 мг/кг и 40 мг/кг (мкмоль/(мин г белка)

группа исследования сроки исследования, сутки Исследуемый орган

Печень Эритроциты

Конт роль 56,7 [А 5,40 4,27 ±0,18

Циклофосфан, 20 мг/кг 1 37,36^ В,73* 2 90 ±0,21*

3 31,98 ¿6,12* 2,16 ±0,30*

5 38,38 ±3,67* 1 24 ± 0,29*

7 31,03 ±2,23* 1,16 ±0,07*

10 21,92 ±2,77* 1,13 ±0,12*

Циклофосфан, 40 мг/кг 1 34,34 ±5,80* 1 65 ± 0,25*

3 34,23 ±7,91* 1,23 ±0,15*

5 32,90 ±3,75* 0,94 ±0,04*

7 23,55 ±2 48* 0,85 ±0 12*

* - достоверность отличия р<0,05 по сравнению с группой контроля

Полученные данные о динамике изменений активности этого фермента можно объяснить его структурными особенностями - наличием в активном центре фермент: а сульфгидрипьной группы Поэтому снижение активности Г-б-Ф-ДГ при повторном отравлении ЦФ может быть связано с необратимым алкилированием тиоловых групп энзима активными метаболитами ЦФ (Голиков СН, 1986) и повреждающим действием на молекулы фермента АФК и свободных радикалов В свою очередь, усиленное расходование НАДФ Н в глзтатион-редуктазной и цито фОм Р-45С-редуктазной реакциях (Тиунов Л А, 1995, Еропкин МЮ , 2003) усугубляет процессы истощения резервов компенсаторно! о ответа системы глутатиона Подтверждением роли активации СРО и алкилирования БН-групп в снижении Г-б-Ф-ДГ активности может служить

глубокое снижение концентрации сульфгидрилъных групп и повышение уровня ДК, МДА в тоани печени

Известно, что процесс биотрансформации ЦФ под действием микросо-мальных монооксигеназ сопровождается образованием супероксидных анионов, а затем перекиси водорода и органических гидроперекисей (Белоусова А К, 1977, Блохин Н Н , 1984)

Антиоксидантные ферменты прямого действия, такие как СОД и катала-за, непосредственно удаляют из окружающего пространства АФК Но существуют и альтернативные пути, позволяющие клеткам «шунтировать» обмен АФК, посредством которых удаляются биологически активные электрофиль-ные интермедиаты Центральное место в этой стратегии принадлежит редокс-циклу глутатиона, а также системе глутатионовой конъюгации (рис 1)

Рис 1 Редокс-цикл глутатиона (Еропкин М Ю , 2003)

Редокс-цикл глутатиона принимает участие в обезвреживании как перекисей, так и органических гидроперекисей Однако, для развития «окислительного» стресса важна не столько концентрация ВГ и других восстановительных эквивалентов клетки, но и редокс-статус системы, то есть соотношение между про- и антиоксидантными молекулами, а также между скоростями окислительно-восстановительных превращений различных ее компонентов (Гиллер С А, 1965, КеЬгег ] Я , 1994)

В проведенном эксперименте выявлено, что несмотря на метаболиче-с!сую активацию ферментов антиоксидантной защиты в начале эксперимента, происходит нарастание содержания продуктов ПОЛ, связанное, по-видимому, с недостаточностью восстановленных эквивалентов Об активации процессов ПОЛ свидетельствовало накопление как начальных продуктов ПОЛ - ДК, так и конечных - МДА

При повторном введении различных доз токсиканта в ткани печени происходило накопление обоих продуктов, причем повышение концентрации IV!ДА было более выраженным При этом усиление протекания процессов ПОЛ имело отчетливый дозозависимый характер

Повторное введение ЦФ в дозах 20 и 40 мг/кг вызывало достоверное (р<0,05) повышение концентрации ДК по мере нарастания кумулятивного эффекта ЦФ в ткани печени на 10 и 7 сутки эксперимента в 2,03 и 2,52 раза и

МДА в 1,61 и 2,12 раза по сравнению с показателями интактной группы (табл 3)

Таблица 3

Динамика изменений концентрации малонового диальдегида в тканях различных органов белых беспородных крыс при повторных введениях циклофосфа-на в дозах 20 мг/кг и 40 мг/кг (нмоль/г ткани или нмоль/г гемоглобина)

Группа исследования сроки исследования, сутки Исследуемый орган

Печень Эритроциты

Кот золь 166,31± 8,68 4,49 ± 0,32

Циклофосфан, 20 мг/кг 1 188,88 ±8,39* 4,54 ± 0,20

3 242,94 ±18,50* 5,23 ±0,38

5 248,03 ±5,68* 5,26 ±0,21*

7 254,28 ±16,45* 5,60 ±0,16*

10 267,93 ±14,14* 5,94 ± 0,09*

Циклофосфан, 40 мг/кг 1 199,93 ±10,71* 5,61 ± 0,27*

3 218,88 ±17,^4* 5,91 ±0,21*

5 339,14 ±7,11* 6,06 ± 0,23*

7 353,42 ±8,49* б,19± 0,15*

* - достоверность отличия р<0,05 по сравнению с группой контроля

Высокая алкштирующая способность метаболитов ЦФ, образующихся в процессе активации системой цитохрома Р-450, лежит в основе их взаимодействия не только с ВГ, но и с функциональными (в том числе и с сульфгадрилъ-ными) группами различных биомолекул (Голиков С Н , 1986) Процессы обратимого Б-тиолирования функциональных групп белков окисленным глутатио-ном и образование смешанных дисульфидов также может приводить к снижению содержания СГ (Кулинский В И , 1990)

В ходе проведенного исследования было выявлено снижение содержания СГ в ткани печени на протяжении всего эксперимента, а максимальное его проявление отмечалось в момент срыва компенсаторных ресурсов системы глутатиона - после повторного введения ЦФ в дозе 20 мг/кг на 10 сутки исследования в 1,17 раза (р<0,05) ниже контроля, при использовании большей дозы на 7 сутки исследования - в 1,20 раза (р<0,05)

В ходе проведенного эксперимента установлено, что наиболее выраженные сдвиги в системе глутатиона отмечались в ткани печени, где, с одной стороны, уровень ВГ в норме значительно превосходит содержание в других органах, а с другой стороны, метаболизм глутатиона наиболее интенсивен (Кулинский В И , 1990) Гидроксшшрование ЦФ системой микросомальных мо-нооксигеназ приводит к образованию более токсичных продуктов, т е имеет место процесс метаболической активации ксенобиотика (Белоусова А К , 1977, Блохин НН, 1984) В дальнейшем активные продукты под воздействием ГТ подвергаются конъюгации с восстановленным глутатиоиом По-видимому, максимальное увеличение активности микросомальных ферментов именно в

тканях печени служит причиной и максимальной активации свободноради-кальных процессов в тканях этого ор! ана, связанных с утечкой активных форм кислорода с цитохрома Р-450

Полученные биохимические данные о патогенетической значимости изменений показателей системы глутатиона и сопряженных систем подтверждаются одновременно проведенным морфологическим исследованием тканей печени в различные сроки повторной интоксикации ЦФ, которое выявило сопряжение нарастающих морфологических признаков повторной интоксикации (выраженность жировой дистрофии, гиперхром ия ядер, расширение синусои-дов) с увеличением кумулятивного эффекта ксенобиотика

Периферическая кровь является самым доступным объектом для лабораторных исследований, поэтому определение показателей системы глутатиона в эритроцитах может использоваться для диагностической оценки тяжести ци-тотоксических эффектов при повторном воздействии алкилируюгцих агентов На это может указывать наличие корреляционных связей между изменениями показателей данной системы во внутренних органах, в частности, в ткани печени и в эритроцитах

В ходе эксперимента было выявлено, что в эритроцитах лабораторных животных достоверно! о изменения концентрации ВГ не отмечалось, содержание его соответствовало показателям контроля

Эритроциты не обладают ферментной системой микросомального окисления и поэтому в них отсутствуют процессы биотрансформации ЦФ, с обра-зовшшем электрофильных субстратов для конъюгации, а значит концентрация ВГ может поддерживаться на уровне физиологической нормы

Межорганный обмен ВГ при повторном ьведении ЦФ, по всей видимости, также существенно не изменяется, активация его ресурсов в гепатоцитах на ранних стадиях интоксикации после введения относительно малых доз не нарушает процессы экспорта эюго соединения, в отличие от острого отравления ЦФ в больших дозах Данное положение подтверждается сохранением концентрации ВГ в эритроцитах на уровне интактного контроля

Характер изменения концентрации сульфгидрильных групп носил дозо-зависимый характер, о чем свидетельствует вьражешюе нарастание концентрации СГ после повторного введения ЦФ в дою 40 мг/кг, которая на 7 сутки эксперимента превысила значения контроля в 1,82 раза (р<0,05) Данные изменения, по-видимому, могут иметь ромпенсаторный характер

В ходе исследования в клетка с красной крови наблюдалась активация ферментов антиоксидантной защиты Уровень активности ГТ при повторном введении ЦФ в дозе 20 мг/кг на протяжении всего эксперимента увеличивался и превысил в 1,90 раза (р<0,05) показатели группы контроля Применение более высокой дозы привело к более выраженному росту активности ГТ в первые 3 суток исследования - в 1,99 раза (р<0,05), с последующим снижением ее до значений интактного контроля на 7 сутки эксперимента

Сходные изменения наблюдались и при исследовании ГП нарастание активности фермента при введении ЦФ в дозе 20 мг/кг на 5 сутки в 1,4 раза

(р<0,05) и в течение 3 с\ток после введения 40 мг/кг в 1,34 раза (р<0,05) сменялось падением до показателей интактной группы.

Активность каталазы на протяжении всего эксперимента нарастала при использовании обеих суточных доз ксенобиотика.

Индукция ак-птпости данных энзимов в эритроцитах, по-видимому, связана с увеличением интенсивности процессов пероксидации липндов в этих клетках, о чем свидетельствует дозозависимое накопление как первичных продуктов ПОЛ, так и вторичных. Максимальное повышение концентрации ДК и МДА в 1,65 и 1,32 раза (р<0,05) отмечалось на 10 сутки при интоксикации ЦФ в'дозе 20 мг/кг, а также в 1,79 и 1,38 раза (р<0,05) на 7 сутки при использовании более высокой дозы токсиканта.

Определена умеренная корреляционная связ^ между изменениями показателей ПОЛ в эритроцитах и ткани печени. Коэффициент корреляции при введении обеих доз составил для ДК - 0,50 и 0,59 (рис. 2), МДА - 0,56 и 0,56.

Рис. 2. Изменение концентрации диеновых конъюгатов в ткани печени и эритроцитах при повторном введении ЦФ в дозе 40 мг/кг

Выраженные изменения наблюдались и при исследовании в эритроцитах ферментов, участвующих в процессе восстановления глутатиона из окисленной формы, активность которых на протяжении всего эксперимента .аозозави-симо снижалась.

Дозозависимое падение активности Г-6-Ф-ДГ наблюдалось в течение -всего срока исследования. Динамика изменений активное™ этого фермента в клетках красной крови коррелировала с таковыми в ткани печени. Была установлена умеренная положительная корреляционная связь, коэффициент корреляции составил при введении ЦФ в дозе 20 мг/кг - 0,65 (рис.3), и дозе 40 мг/кг--0,53.

)ГЕЗ эритроциты О печень \

300 250 200

% 150 от контроля

100 50

Рис. 3. Изменение активности i лнжозо-6-фосфаггдегидрогеназы в ткани печени и эритроцитах при повторном введении 1ДФ в суточной дозе 20 мг/кг

Снижение активности ГР также it мело дозозависимый характер. Максимальная выраженность этого эффекта отмечалась на 10 сутки эксперимента при введении меньшей дозы ксенобиотика - в 1,77 раза ниже контроля, при использовании ЦФ в дозе 40 мп'кг - в (,79 раза, Между изменениями активности ГР в эритроцитах и тканях печени при использовании Цф в дозе 40 мг/кг определялась умеренная положительная корреляционная связь, коэффициент корреляции составил 0,46.

Таким образом, определение активности Г-6-Ф-ДГ, ГР, содержания ДК, МДА в качестве маркеров тяжести ци готоксического поражения тканей печени при повторном введении ЦФ в малых дозах является обоснованным.

В ходе эксперимента проведена и сравнительная оценка между сроками появления и выраженностью изменений принятых в настоящее время маркеров гепато- и еефротоксичности (АЛТ, ACT, общего билирубина, креатин ияа, мочевины, [ЦФ) ВОЗ (Г985) и показателей системы глутатиона при повторной интоксикации ЦФ в суточной дозе 20 мг/кг в течение 10 суток. Установлено, что изменения таких показателей обмена глутатиона, как активность Г-6-Ф-ДГ, IT, содержание ДК; МДА происходили в более ранние сроки (3-5 сутки) и выявлялись щт отсутствии достоверней: изменений со стороны большинства общеизвестных биохимических показателей, а на 10 сутки эксперимента носили более выраженный характер.

Изменения показателей системы глутатиона в тканях почек были менее интенсивными по сравнению с такошми в печени, ПочкЬ участвуют в непосредственной экскреции как ЦФ в неизмененном виде (20%), так и его метаболитов. При этом непосредственно повреждающего действия на нефроциты, по некоторым экспериментальным данным, не наблюдается (Блохил Н.Н1984У

Концентрация 8Г, СГ, активность большинства ферментов - Г-6-Ф-ДГ, ГР, ГП, катал азы практически не отличались от значений интактного контро-

ля Наблюдалось умеренно выраженное повышение активности ГТ в 1-3 сутки эксперимента, которая в 1,43 и 1,36 раза (р<0,05) превысила значения контроля после введения ЦФ в доза> 20 и 40 мг/кг, соответственно

Кроме того, было отмечено достоверное усиление интенсивности процессов ПОЛ в тканях почек, выраженность которого соответствовала вводимой дозе Концентрация ДК превысила значения контроля в 1,29 и 1,31 раза (р<0,05), а МДА - в 1,31 и 1 63 раза (р<0,05), соответственно, при повторном введении ЦФ в различных до ¡ах

Отсутствие значимых изменений после повторною введения ЦФ в различных до ¡ах отмечалось при проведении морфологического исследования тканей почек

По сравнению со всеми исследуемыми тканями, изменения показателей системы глутатиона были минимальными в ткани головного мозга Это связано с наименьшим участием ткани в обмене глутатиона и отсутствием проницаемости гематоэнцефалического барьера для продуктов метаболизма ЦФ

В настоящее время дам профилактики и лечения цитотоксических повреждений тканей и органов в условиях проведения полихимиотерапии (ПХТ) и при острых отравлениях активно используются препараты различных фармакологических групп, в том числе предшественники синтеза глутатиона, ан-тиоксиданты, антишпоксантн (Блохин ПН, 1984) Тем не менее, остается мало изученной комплексная оценка влияния фармакологических препаратов на показатели системы глутатиона в разли тых органах и тканях при повторном введении ЦФ в малых дозах

В проведенном эксперименте на фоне введения ЦФ в течение 10 суток в дозе 20 мг/кг была предпринята попытка уменьшить цитотоксическое действие повторного введения препарата пугем подавления процессов СРО с помощью антиоксидантов (мексидола, цитофлавина), увеличения пула ВГ за счет введения предшественников синтеза ВГ (ацетшнщетеина), улучшения энергообеспечения тканей с помощью антигипоксантов (трисана), усиления регуля-торных процессов за счет введения препаратов окисленного глутатиона (глу-токсима, литана)

Проведенное исследование позволило установить, что реализация "цито-протекторных свойств этих препаратов при использовании для коррекции повторных интоксикаций ЦФ в дозах 20, 40 мг/кг, несмотря на разный механизм их действия, патогенетически связана с восстановлением обмена глутатиона

Наиболее выраженное положительное влияние на систему глутатиона оказывало использование метаболического предшественника синтеза глутатиона - ацетилцистеина Применение данного препарата приводило к повышению уровня эндогенного глутатиона и активации функций детоксикации и антиоксидантной защиты (Тиунов Л А, 1995)

Так, эффектом применения ацегилцистеина при повторной интоксикации ЦФ стал достоверный рос г концентрации ВГ в тканях почек, головного мозга и печени отравленных животных, наиболее ярко выраженный в последней, в которых содержание восстановленной формы трипептида в 1,23 раза превышало показатели не леченых отравленных животных (р<0,05)

Повышение концентрации ВГ в тканях отравленных циклофосфаном животных, получавших ацетшщистеин, закономерно приводило и к восстановлению показателей тиол-дисульфидного обмена, увеличивая содержание СГ в 1,28 раза (р<0,05) выше показателей группы без коррекции в ткани печени, в 1,15 раза (р<0,05) в ткани почек Как следствие, это сопровождалось повышением активности ферментативного звена системы глутатиона и снижением интенсивности процессов СРО Выраженный рост активности ГР (р<0,05) наблюдался в ткани печени (в 1,15 раза выше значений интактного конроля) и в эритроцитах (в 1,50 раза) Достоверного изменения активности Г-6-Ф-ДГ в ткани печени не отмечалось, в эритроцитах активность данного фермента превысила показатели группы отравленных животных без лечения в 1,59 раза (р<0,05) Активность каталазы в ткани печени превысила значения группы без коррекции в 1,44 раза (р<0,05), а активность ГП достигла показателей интактного контроля Содержание продуктов ПОЛ во всех тканях отравленных животных, получавших препарат, достоверно снижалось до значений контрольной группы

Вторым направлением фармакологической коррекции в нашем исследовании было воздействие на одно из лидирующих расстройств в механизме токсического действия циклофосфана - нарушение баланса между про- и ан-тиоксидантными системами С этой целью использовались два комплексных сукцинатсодержащих препарата - мексидол и цигофлавин

Действительно, использование мексидола в терапии животных при повторных отравлениях ЦФ позволило снизить интенсивность наработки первичных продуктов ПОЛ в ткани печени в 1,13 раза (р<0,05), в эритроцитах - в 1,24 раза (р<0,05) Также отмечалось значительное снижение концентрации МДА в эгах тканях в 1,47 и 1,15 раза (р<0,05), соответственно Снижение концентрации продуктов ПОЛ было тесно связано с активацией ферментов анти-оксидантной защиты Активность ГП превысила значения интактного контроля в ткани печени отравленных животных, получавших препарат, в 1,75 раза (р<0,05), а в эритроцитах снизилась до значений интактного контроля, сходные изменения наблюдались и при исследовании ГТ и каталазы

Кроме того, наблюдалась выраженная активация ферментов восстановления глутатиона Активность ГР возросла в 1,63 раза (р<0,05) в ткани печени отравленных животных, получавших препарат, и в 1,47 раза (р<0,05) в эритроцитах, а активность Г-6-Ф-ДГ в 1,47 и 1,95 раза (р<0,05), соответственно Повышения уровня восстановленного трипептида и сульфгидрильных групп при использовании мексидола не отмечалось

Для фармакологической коррекции в нашем исследовании был использован антигипоксантный препарат - трисан Трисан - растительный антиги-поксант, представляющий по химической структуре производное индолмор-фолина

Трисан не оказал выраженного влияния на уровень ВГ, СГ, активность ферментов АОЗ В то же время отмечался достоверный рост активности ГР в ткани печени, превысивший показатели группы без коррекции в 1,38 раза, и в эршроцитах - в 1,41 раза (р<0,05), соответственно Наблюдалось и доетовер-

ное снижение содержания ДК, МДА в этих тканях По-видимому, этот растительный препарат обладает способностью наиболее эффективно сопрягать окисление и фосфорилирование, так как ему присущи свойства переносчика электронов и антиоксидантная активность (Пастушенков JIВ , 1991)

Из используемых препаратов окисленного глутатиона, глутоксим оказал наиболее выраженный положительный эффект Глутоксим, вводимый в организм, подобно окисленному глутатиону не проникает в клетки Поэтому его фармакологическое действие направлено на молекулярные процессы, рецеп-торопосредованно регулируемые в организме окисленным глутатионом Вторичными эффектами стимуляции рецепторов являются активация транскрипционного фактора STAT3 и МАР-киназ, Ere- киназ 1,2 (Гаджиева С Ш, 2006) Известно, что МАР-киназы, через транскрипционный фактор АР -1 усиливают экспрессию генов ферментов II фазы биотрансформации ксенобиотиков (Тур-паев К Т , 2006)

В ходе проведенного эксперимента было установлено, что уровень ВГ во всех исследуемых тканях при использовании данного препарата не изменялся по сравнению с показателями группы отравленных животных, не подвергавшихся коррекции Концентрация СГ в ткани печени увеличивалась в 1,15 раза (р<0,05) по сравнению с группой без коррекции, в эритроцитах снижалась до уровня интактного контроля Выраженное индуцирующее действие препарат оказывал на ферменты восстановления трипептида и АОЗ Так, активность ГР и Г-6-Ф-ДГ в ткани печени увеличивалась по сравнению с контрольной группой без лечения в 1,54 и 1, 83 раза (р<0,05), а в эритроцитах - в 1,54 и 1,80 раза (р<0,05) Активность ГП и ГТ достоверно увеличивалась в тканях печени, почек, головного мозга, а в эритроцитах происходило снижение до значений интактного контроля Достоверное снижение содержания продуктов ПОЛ до уровня значений интактного контроля на фоне введения препаратов было наиболее выражено в тканях печени и эритроцитах

Одновременно проведенное морфологическое исследование тканей печени и почек экспериментальных животных на фоне терапии различными фармакологическими препаратами при повторной инггоксикации ЦФ показало, что использование ацетилцистеина, глутоксима приводило к существенному снижению выраженности нарушений как обмена глутатиона в ткани печенп, так и гистологических признаков токсического воздействия - в гепатоцитах определялась лишь мелкокапельная жировая и зернистая дистрофии/и умеренное расширение пространства Диссе

Таким образом, наиболее выраженная цитопротекторная активность при повторном введении ЦФ в дозе 20 мг/кг в течение 10 суток наблюдалась при использовании ацетилцистеина и глутоксима, динамика изменений в эритроцитах таких показателей системы глутатиона, как активность Г-6-Ф-ДГ, ГР, концентрация ДК, МДА достоверно отражала эффективность проводимой коррекционной терагши данными препаратами

Полученные экспериментальные данные об изменениях состояния системы глутатиона и процессов перекисного окисления липидов в эритроцитах и тканях различных органов лабораторных животных позволяют уточнить ме-

ханизмы патогенеза повторных отравлений веществами алкилирующего действия, связанных с реализацией цито-гоксических эффектов действия и с нарушениями состояния естественной системы цитопротекции

Представляется логичным приведение следующей схемы участия нарушений системы I лутат иона в патогенезе развитая цитотоксического поражения тканей внутренних органов в условиях повторной интоксикации ЦФ

Для полноценной реализации основных функции системы глутатиона, таких как конъюгация, антиоксидантная ¡ащита, поддержание тиол-дисульфидного равновесия, в условиях повторной интоксикации ЦФ необходимо 3 фактора 1) достаточный уровень ВГ, ?) адекватная активность ферментов АОЗ, 3) наличие энергетических ресурсов для осуществления рециклирования ВГ и процессов конъюгации

В условиях нарастающего необратимого расходования ВГ на процессы конъюгации, уровень концентрации трипетггада сохраняется за счет компенсаторной активации как процессов непосредственного синтеза ВГ, так и процессов его рециклирования, в то же время увеличение наработки продуктов СРО приводит к индукции активности ферментов АОЗ Данные изменения характеризуют компенсаторный период при повторной интоксикации ЦФ

Последующая возрастающая прооксидантная нагрузка, нарушение тиол-дисульфидного равновесия приводят к увеличению потребности НАДФ Н, однако интенсивность процессов его восстановлен™ недостаточна, в связи с выраженным снижением активности Г-6-Ф-ДГ, что при увеличении повторной дозочой нагрузки может привести к гггубоким нарушениям функционирования системы глутатиона в процессе срыв,г компенсаторных ресурсов в период декомпенсации

Таким образом, нарушения состояния и функций системы глутатиона (связанные с поддержанием тиол-дисудьфидного равновесия, участием в регуляции активности ферментов и белковом синтезе, регуляции состояния мембран) являются одним из основных механиэмоЕ патогенеза повторных отравлений ЦФ, так как лежат в основе реализации цитотоксического действия ксенобиотиков данной группы По-видимому, основой реализации этого неспецифического цитотоксического действия ЦФ является снижение активности Г-6-Ф-ДГ, поставщика НАДФ Н, необходимого для рециркуляции глутатиона и лимитирующего его обмен

Выявленные изменения состояния системы глутатиона при повторных интоксикациях веществами алкилирующего действия, вероятно, имеют прикладное значение для разработки ергдетв патогенетической терапии данных отравлений Использование в эксперименте на «ивотных средств фармакологической коррекции (ацетилцистеина, мексидола, глутоксима) не только послужило дополнительным доказательством наличия патогенетической взаимосвязи между нарушениями состояния системы глутатиона и цитотоксическими эффектами действия ЦФ, но и посолило определить некоторые направления гщто протекции

1) замещение антиоксидантнои ф/нкции системы глутатиона - использование антиоксидантных препаратов,

2) индукция синтеза ВГ - использование предшественников синтеза глутатиона,

3) деюксимодифинирующая - использование препаратов окисленного глутатиона

В качестве патогенетически обоснованных методов лабораторной диагностики оценки степени т яж( сти цитотоксического поражения тканей организма, эффективности проводимого лечения при повторном введении ЦФ в малых дозах могут быть использованы следующие показатели, характеризующие состояние системы глутатиона и процессы ПОЛ в эритроцитах пациентов

1) определение активности глю* озо-6-фосфзтдегидрогеназы,

2) определение активности глутатионредуктазы,

3) определение концентрации мдлоноваго диальдегида,

4) определение концентрации диеновых конъюгатов

ВЫВОДЫ

1 Повторное введение ЦФ в дозах 20, 40 мг/кг в течение 10 суток в ткани печени и в эритроцитах лабораторных животных в ранние сроки исследования (до 5 суток) вызывает компенсаторные изменения системы глутатиона в виде увеличения концентрации ВГ, активации ферментов антиоксидантной защиты (ГП, ГТ) и увеличения активности ГР

2 Дальнейшее увеличение дозовой нагрузки приводит к нарушению функций системы глутатиона в ткани печени и в эритроцитах (снижение концентрации СГ, акгивносги ферментов АОЗ ( ГТ, ГП и каталазы), восстановления глутатиона (Г-6-Ф-ДГ и ГР), увеличение содержания продуктов ПОЛ (ДК и МДА)), что совпадает с появлением выраженных морфологических признаков токсическою повреждения ткани печени

3 Повторное введение циклофосфана в тканях почек и головного мозга достоверных изменений обмена хлутатиола не вызывает

4 Ведущими показателями нарушений обмена глутатиона пря повторном введении циклофосфана в дозах 20, 40 мг/кг является снижение активности ферментов восстановления глутатиона Г-6-Ф-ДГ ( в ткани печени - в 2,4 и 2,6 раза, в эритроцитах - в 3,8 и 5,0 раза), ГР ( в ткани печени - в 1,4 и 1,8 раза, в эритроцитах - 1,7 и 1,8 раза), нарастание продуктов перекисного окисления липидов ДК ( в ткани печени - в 2,0 и 2,6 раза, в эритроцитах - 1,7 и 1,8 раза), МДА (в ткани печени - 1,6 и 2,1 раза, в эритроцитах - 1,3 и 1,4 раза) на 7 и 10 сутки исследования

5 Применение цитопротекторных препаратов различного механизма действия снижает морфологические проявления и биохимические признаки токсического действия повторного введения ЦФ Препарат, усиливающий синтез эндогенного глутатиона, - ацетилцистеин приводит к повышению концентрации ВГ, СГ, активации ГР, снижению концентрации ДК, МДА, препарат окисленного глутатиона - глутоксим к активации Г-6-Ф-ДГ, ГР, ГП, снижению концентрации ДК, МДА, антиоксидант - мексидол к активации ГР, ГП, снижению концентрации ДК, МДА

6 Между изменениями показателей системы глутатиона в эритроцитах и ткани печени при повторном введении ЦФ установлена умеренная положительная корреляционная связь (Г-б-Ф-ДГ - г -= 0,65 (20 мг/кг), 0,53 (40 мг/кг), ГР - г = 0,46 (40 мг/кг), ДК - г = 0,51 (20 мг/кг), 0,59 (40 мг/кг), МДА - г = 0,56 (20-40 мг/кг)), что экспериментально подтверждает возможность использования данных показателей для оценки степени тяжести цитотоксического поражения ткани печени при повторном введении ЦФ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Для оценки степени тяжести цитотоксического поражения паренхиматозных органов и эффективности фармакологической коррекции этого процесса у лиц, проходящих курс полихимиотерапии, представляется возможным использование определения в эритроцитах таких показателей системы глутатиона как, активность Г-б-Ф-ДГ, ГР, концентрации ДК, МДА,

2 В схему комплексной терапии веществами алкилирующего действия рекомендуется включить фармакологические препараты, обладающие антиок-сидантными и антигипоксантными свойствами (например, мексидол), а также препараты предшественника синтеза глутатиона - ацетилцистеин и препараты окисленного глутатиона - глугоксим

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Кашуро В А Состояние системы глутатиона и перекисного окисления ли-пидов в тканях печени и почек крыс при острых отравлениях циклофосфаном / В А Кашуро, А И Карпищенко, С И Глушков, Т М Новикова, Л В Минаева и др // Нефрология - 2006 - № 2 - С 81-85

2 Кашуро В А Состояние системы глутатиона в тканях паренхиматозных органов лабораторных животных при повторном введении циклофосфана / В А Кашуро, С И Глушков, А И Карпищенко, ТМ Новикова, ТИГлушкова, Л В Минаева и др // Нефрология - 2006 - № 4 - С 82-86

3 Минаева Л В Система глутатиона при воздействии циклофосфана на организм животных и человека / Л В Минаева, Т В Силиванова, В А Медус // Материалы итоговой конференции военно-научного общества слушателей 1 факультета - СПб, 2006 - С 137

4 Жерегеля С Н Динамика изменений концентрации восстановленного глутатиона в тканях печени на фоне развития острой почечной недостаточности вызванной введением ренгеноконтрастных препаратов / С Н Жерегеля, Л В Минаева, О О Ивойлов // Материалы итоговой конференции военно-научного общества слушателей и ординаторов I факультета - СПб, 2007 -СПб, 2007-С 42-43

5 Ивойлов О О Изменения активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы при повторном введении циклофосфана на фоне фармакологической коррекции / О О Ивойлов, Л В Минаева, С Н Жерегеля // Материалы итоговой конференции военно-научного общества слушателей и ординаторов I факультета - СПб,

2007 - С 47-48

6 Ивойлов О О Изменения концентрации продуктов перекисного окисления липидов при повторных введениях циклофосфана на фоне фармакологической коррекции / О О Ивойлов, Л В Минаева, С Н Жерегеля // Там же - С 48-49

7 Карпищенко А И Влияние некоторых фармакологических препаратов на содержание лейкоцитов периферической крови экспериментальных животных в условиях повторного введения циклофосфана / А И Карпшценжо, С И Глушков, Л В Минаева и др // Вестник Российской Военно-медицинской академии,- 2007 - Приложение 1(17) , ч 1 - С 371-372

8 Карпищенко А И Изменения глюкозо-б-фосфатдегидрогеназной активности при формировании ренгеноконтрастных нефропатий / А И Карпищенко, С И Глушков, С Н Жерегеля, Л В Минаева и др // Вестник Российс» ой Военно-медицинской академии - 2007 — Приложение 1(17), ч 1 — С 370

9 Карпищенко А И Изменение концентрации малонового диальдегида в тканях экспериментальных животных при острых отравлениях фосфорил-тиохолинами в сублетальных дозах / АЛ Карпищенко, С И Глушков, О О Ивойлов, Л В Минаева и др // Вестник Российской Военно-медицинской академии - 2007 - Приложите 1(17) , ч 1 - С 372

10 Карпищенко А И Динамика глутатионредуктазной активности тканей почек в условиях развития ренгеноконтрастных нефропатий / А И Карпищенко, С И Глушков, С Н Жерегеля, Л В Минаева и др // Вестник Российской Военно-медицинской академии - 2007 - Приложение 1(17), ч 1 - С.370

11 Карпищенко А И Экспериментальная оценка роли изменений системы глу-татиона в реализации побочных цитотоксических эффектов повторного введения циклофосфана / А И Карпищенко, С И Глушков, Л В Минаева и др // Вестник Российской Военно-медицинской академии - 2007 - Приложение 1(17), ч 1 - С 370-371

12 Кашуро В А Активность глутатионпероксддазы в тканях экспериментальных животных при повторном введении циклофосфана / В А Кашуро, Л В Минаева, С И Глушков и др // Актуальные вопросы повышения работоспособности и восстановления здоровья военнослужащих и гражданского населения в условиях чрезвычайных ситуаций / Материалы Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 40-летию НПО обитаемости и профессионального отбора ВМедА - СПб, 2007 - СПб, 2007 - С 206

13 Кашуро В А Активность глутатионредуктазы в тканях экспериментальных животных при повторных введениях циклофосфана / В А Кашуро, Л В Минаева, С И Глушков и др // Актуальные проблемы химической безопасности в Российской Федерации / Сборник- тезисов Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 45-летию ФГУП «НИИГПЭЧ» ФМБА России - СПб, 2007 - С 246

14 Кашуро В А Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в тканях эксце-риментапьных животных при повторном введении циклофосфана / В А Кашуро, Л В Минаева, С И Глушков и др II Актуальные вопросы повышения работоспособности и восстановления здоровья военнослужащих и гражданского населения в условиях чрезвычайных ситуаций / Материалы Всерос-

еийской научно-практической конференции, посвященной 40-летию НИО обитаемости и профессионального отбора ВМедА - СПб, 2007 - С 205-206

15 Кашуро В А Изменения концентрации малонового диальдегида в тканях экспериментальных животных при повторных введениях циклофосфана / В А Кашуро, Л В Минаева, С И Глуипсов и др // Актуальные проблемы химической безопасности в Российской Федерации / Сборник тезисов Всероссийской наз'чно-пракгаческой конференции, посвященной 45-летию ФГУП «НИИГПЭЧ» ФМБА России - СПб, 2007 - СПб, 2007 - С 247

16 Минаева Л В Динамика изменений концентрации восстановленного глута-тиона в тканях почек на фоне развития острой почечной недостаточности вызванной введением ренгеноконтрастных препаратов / Л В Минаева, С И Жерегеля, О О Ивойлов // Материалы итоговой конференции военно-научного общества слушателей и ординаторов I факультета- СПб 2007-С 95-96

] 7 Минаева Л В Изменения концентрации восстановленного глутатиона при повторном введении циклофосфана на фоне фармакологической коррекции / Л В Минаева, С Н Жерегеля, О О Ивойлов // Там же - С 43-44 18 Минаева Л В Органоспецифические изменения глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной активности при формировании ренгеноконтрастных нефропатий / Л В Минаева, С Н Жерегеля, О О Ивойлов // Там же - С 94-95

Подписано в печать (,> <>№»

Обьем 1 п л_Тираж юо экз

Формат 60x84 '/,6 Заказ № 404

Типография ВМедА, 194044, СПб , ул Академика Лебедева, 6

Актуальность. В течение последних 25-30 лет темп роста заболеваемости злокачественными опухолями превысил годовой темп прироста мирового населения. В России с 1992 по 2001 гг. показатель заболеваемости злокачественными новообразованиями возрос с 271,8 до 313,9 на 100 тысяч населения. Прирост заболеваемости за десятилетие составил более 16%, при ежегодном темпе - 1,7%[54]. В связи с этим поиск адекватной противоопухолевой терапии заслуживает пристального внимания и требует решения ряда проблем, связанных, прежде всего, с ранней диагностикой и коррекцией побочных токсических эффектов действия химиотерапевтических препаратов^].

Циклофосфан (ЦФ) - алкилирующий цитостатический препарат, обладающий относительно широким противоопухолевым спектром действия. В терапии ряда заболеваний используется как иммунодепрессивное средство. Однако его применение ограничивается побочными эффектами, такими как гепатотоксичность, нефротоксичность, гематотоксичность, мутагенность. Препарат обладает очень высокой кумуляцией и низкой обратимостью токсического действия [9,16,53,67].

Активация ЦФ происходит под действием микросомальных моноок-сигеназ в различных тканях организма, преимущественно в гепатоцитах, в результате чего накапливаются его реакционно-способные метаболиты, которые вступают в реакции алкилирования, преимущественно, с нуклеиновыми кислотами, что и лежит в основе механизма действия данного препарата. Восстановленный глутатион, конъюгируя под действием ГТ с активными метаболитами ЦФ, обезвреживает их, необратимо при этом расходуясь. Кроме того, с цитохрома Р450 возможна утечка активных форм кислорода, в обезвреживании которых также принимает участие система глутатион а [9,31,34,122].

Таким образом, исследование системы глутатиона при повторном введении циклофосфана в малых дозах позволяет более подробно изучить молекулярные механизмы токсического действия ЦФ и его метаболитов, кумулятивный эффект, а также биохимические механизмы его детоксикации.

Целью исследования явилось изучение состояния системы глутатиона в тканях печени, почек, головного мозга и в эритроцитах лабораторных животных при повторном введении циклофосфана для определения возможности использования показателей обмена глутатиона в качестве лабораторных тестов оценки тяжести цитотоксических эффектов химиотерапии, а также при поиске новых средств цитопротекции.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи исследования:

- определить динамику изменений состояния системы глутатиона и процессов перекисного окисления липидов в различных органах белых беспородных крыс при повторном введении циклофосфана в суточных дозах 20 и 40 мг/кг в течение 1-10 суток;

- исследовать влияние предшественника синтеза глутатиона (ацетил-цистеина), препаратов окисленного глутатиона (глутоксима, литана), анти-гипоксанта (трисана), антиоксидантов (мексидола, цитофлавина) на динамику изменений показателей системы глутатиона и интенсивность процессов перекисного окисления липидов при повторном введении циклофосфана в суточной дозе 20 мг/кг в течение 10 суток;

- оценить информативность изменений показателей системы глутатиона в эритроцитах для оценки степени тяжести цитотоксического повреждения тканей внутренних органов в условиях повторного введения циклофосфана.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В ответ на повторное введение циклофосфана в дозах 20, 40 мг/кг в ткани печени и в эритроцитах лабораторных животных отмечается активация обмена глутатиона. По мере увеличения дозовой нагрузки развиваются нарушения состояния системы глутатиона и цитотоксические повреждения ткани печени, что подтверждается и выраженными морфологическими изменениями.

2. Ведущим показателем нарушений обмена глутатиона при повторных отравлениях циклофосфаном является снижение активности глюкозо-6-фосфатдеги дрогеназы.

3. Для проведения фармакологической коррекции цитотоксических повреждений ткани печени при повторном введении циклофосфана можно рассматривать применение препарата предшественника синтеза глутатиона (ацетилцистеина), препарата окисленного глутатиона (глутоксима), антиок-сиданта (мексидола).

4. Определение показателей характеризующих обмен глутатиона в клетках красной крови имеет диагностическое значение для оценки цитоток-сического поражения тканей печени в условиях повторного введения циклофосфана.

Научная новизна. На основе проведенной комплексной оценки показателей системы глутатиона, сопряженных биохимических процессов в различных тканях экспериментальных животных (печень, почки, головной мозг, эритроциты) при повторном введении циклофосфана показана взаимосвязь между выраженностью изменений естественной системы цитопротекции и цитотоксическими свойствами ксенобиотика. Проведен анализ причин, вызывающих изменения состояния системы глутатиона и активацию процессов перекисного окисления липидов в исследуемых тканях при повторном введении циклофосфана. Установлено, что использование в эксперименте фармакологических препаратов (ацетилцистеина, глутоксима, мексидола) в условиях повторного введения циклофосфана в дозе 20 мг/кг в течение 10 суток предотвращает развитие патобиохимических процессов и реализацию цитотоксических повреждений тканей паренхиматозных органов. Показана перспективная возможность использования ряда показателей системы глутатиона (активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, глутатионредуктазы, концентрации диеновых конъюгатов, малонового диальдегида) в эритроцитах для установления степени тяжести интоксикации и эффективности кор-рекционной терапии.

Практическое значение работы заключается в том, что для оценки степени тяжести цитотоксического поражения паренхиматозных органов и эффективности фармакологической коррекции этого процесса у лиц, проходящих курс полихимиотерапии представляется возможным, по данным диссертационного исследования, использовать показатели системы глутатиона (активности Г-6-Ф-ДГ, ГР, концентрации ДК, МДА).

Реализация результатов исследования. Рекомендации, разработанные на основании полученных в ходе диссертационного исследования данных, используются в научной работе и учебном процессе на кафедре клинической биохимии и лабораторной диагностики и кафедре военной токсикологии и медицинской защиты Военно-медицинской академии.

Апробация работы. Результаты работы доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы повышения работоспособности и восстановления здоровья военнослужащих и гражданского населения в условиях чрезвычайных ситуаций» (Санкт-Петербург, 2006 г.), Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы химической безопасности в Российской Федерации» (Санкт-Петербург, 2007 г.), на итоговой конференции военно-научного общества слушателей и ординаторов 1 факультета (Санкт-Петербург, 2007 г.), Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения в многопрофильном лечебном учреждении» (Санкт-Петербург, 2007 г.).

Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 18 печатных работ.

159 ВЫВОДЫ

1. Повторное введение ЦФ в дозах 20, 40 мг/кг в течение 10 суток в ткани печени и в эритроцитах лабораторных животных в ранние сроки исследования (1-5 суток) вызывает компенсаторные изменения системы глутатиона в виде увеличения концентрации ВГ, активации ферментов антиоксидантной защиты (ГП, ГТ), ГР.

2. Дальнейшее увеличение дозовой нагрузки приводит к нарушению функций системы глутатиона в ткани печени и в эритроцитах (снижение концентрации СГ, активности ферментов АОЗ ( ГТ, ГП и каталазы), восстановления глутатиона (Г-6-Ф-ДГ и ГР), увеличение содержания продуктов ПОЛ (ДК и МДА)), что совпадает с появлением выраженных морфологических признаков токсического повреждения ткани печени.

3. Повторное введение циклофосфана в тканях почек и головного мозга достоверных изменений обмена глутатиона не вызывает.

4. Ведущими показателями нарушений обмена глутатиона при повторном введении циклофосфана в дозах 20, 40 мг/кг является снижение активности ферментов восстановления глутатиона: Г-6-Ф-ДГ ( в ткани печени - в 2,4 и 2,6 раза, в эритроцитах - в 3,8 и 5,0 раза), ГР ( в ткани печени - в 1,4 и 1,8 раза, в эритроцитах - 1,7 и 1,8 раза), нарастание продуктов перекисного окисления липидов: ДК ( в ткани печени - в 2,0 и 2,6 раза, в эритроцитах -1,7 и 1,8 раза), МДА (в ткани печени - 1,6 и 2,1 раза, в эритроцитах - 1,3 и 1,4 раза) на 7-10 сутки исследования.

5. Применение цитопротекторных препаратов различного механизма действия снижает морфологические проявления и биохимические признаки токсического действия повторного введения ЦФ. Препарат усиливающий синтез эндогенного глутатиона - ацетилцистеин приводит к повышению концентрации ВГ, СГ, активации ГР, снижению концентрации ДК, МДА, препарат окисленного глутатиона - глутоксим к активации Г-6-Ф-ДГ, ГР, ГП, снижению концентрации ДК, МДА, антиоксидант - мексидол к активации ГР, ГП, снижению концентрации ДК, МДА.

6. Между изменениями показателей системы глутатиона в эритроцитах и ткани печени при повторном введении ЦФ установлена умеренная положительная корреляционная связь ( Г-6-Ф-ДГ - г = 0,65 (20 мг/кг), 0,53 (40 мг/кг) ; ГР - г = 0,46 (40 мг/кг); ДК - г = 0,51 (20 мг/кг), 0,59 (40 мг/кг), МДА - г = 0,56 (20-40 мг/кг)), что экспериментально подтверждает возможность использования данных показателей для оценки степени тяжести цитотоксического поражения ткани печени при повторном введении ЦФ.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для оценки степени тяжести цитотоксического поражения паренхиматозных органов и эффективности фармакологической коррекции этого процесса у лиц, проходящих курс полихимиотерапии, представляется возможным использование определения в эритроцитах таких показателей системы глутатиона как, активность Г-6-Ф-ДГ, ГР, концентрации ДК, МДА;

2. В схему комплексной терапии веществами алкилирующего действия рекомендуется включить фармакологические препараты, обладающие анти-оксидантными и антигипоксантными свойствами (например, мексидол), а также препараты предшественника синтеза глутатиона - ацетилцистеин и препараты окисленного глутатиона - глутоксим.

162