Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Нарушения отдельных генов клеточного цикла на различных стадиях развития опухолей гортани

На праве« рукописи Балукова Ольга Владимировна

НАРУШЕНИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ГЕНОВ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА НА РАЗЛИЧНЫХ СТАДИЯХ РАЗВИТИЯ ОПУХОЛЕЙ ГОРТАНИ

14.00.14 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 2005г.

Работа выполнена в ГУ Российский Онкологический научный центр им.Н.Н.Блохина Российской академии медицинских наук

Научные руководители:

кандидат биологических наук

И.Б. Зборовская Г.В. Унгиадзе

доктор медицинских наук

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Павлиш O.A.

доктор медицинских наук, профессор Подвязников С.О.

Ведущая организация:

ГУ Медико-генетический Научный Центр РАМН

Защита диссертации состоится " 18 " марта 2005г.

в _10_ часов на заседании Специализированного Совета (К.001.17.01)

ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН по адресу 115478, г. Москва, Каширское шоссе, д.24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь

специализированного диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Ю.А. Барсуков

' 7 Т. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. 1.1 Актуальность проблемы.

Согласно статистическим исследованиям последних лет, в России к 2000 году число больных с впервые в жизни установленным диагнозом - рак верхних дыхательных путей составило 8,0 на 100 000 населения и этот показатель в 1,5 раза больше по сравнению с 1995 годом (5,4 на 100 000). Это связано, в основном, с повышением заболеваемости раком гортани, который составляет 60% наблюдений среди злокачественных новообразований верхних дыхательных путей. При сохранении современных тенденций число случаев заболевания будет увеличиваться. Многими научными исследованиями доказана связь развития рака гортани с экспозицией канцерогенами табачного дыма и промышленной загрязненностью окружающей среды. Одним из самых современных и перспективных подходов при диагностике онкологических заболеваний является исследование молекулярных характеристик предопухолевых заболеваний. Выявление диагностических маркеров опухолевого роста на ранних стадиях развития заболевания является одним из важнейших направлений в онкологии, а при исследовании рака гортани особенно актуально.

Приоритетное значение в развитии подавляющего большинства неоплазий имеют гены, регулирующие клеточный цикл, а - значит уровень пролиферации опухолевых клеток. Экспрессия белков, регулирующих клеточный цикл и апоптоз, часто нарушается в опухолевых клетках. Некоторые из них, например, белки генов р53, ЯЫ, Ъс1-2 широко используются как возможные прогностические маркеры при развитии многих злокачественных опухолей человека. Однако в патогенезе опухолей верхних дыхательных путей их роль до конца не изучена. Показано, что изменения в данных генах выявлялись и в пренеопластических очагах эпителия слизистой оболочки гортани, при этом экспрессия некоторых из них менялась в зависимости от степени выраженности анапластических изменений. В карциномах гортани наиболее часто встречаются соматические нарушения гена р16МК4а, кодирующего один из белков - ингибиторов цикпинзависимых киназ 1ЫК4, являющейся негативным регулятором сигнального пути Сёк-ЯЬ-Е2Р, и отвечающий за реализацию программы клеточного цикла. Наиболее частый механизм его инактивации - метилирование СрО островков промотора и 1-го экзона, гомозиготные делеции и точечные мутации. Наличие делеций в данном гене нередко коррелирует с глубиной опухолевой инвазии и наличием метастазов в лимфатических узлах.

Нарушение функции генов, ответственных за клеточный цикл и апоптоз, влияет не

только на трансформацию клетки, но и на характер прогрессии сформировавшейся

РОС НАЦИОН\ЛЬНЛЯ БИЬ.1Н$)Т1_К\ С Петербург 1

2005"РК

злокачественной опухоли. Так, нёпример, повышенная продукция bcl-2, обнаруженная на ранних стадиях неоплазии, ведет к снижению показателя выживаемости больных раком гортани почти в два раза. Все это говорит о ранних нарушения в данных генах и их важной роли в канцерогенезе.

1.2 Цель я задачи исследования.

Целью данной работы является выявление соматических молекулярно-генетических изменений, ассоциированных с развитием опухолей гортани на ранних стадиях, и изучение возможности их использования в качестве маркеров для ранней диагностики и/или прогноза заболевания.

В соответствии с указанной целью предполагалось решить следующие экспериментальные задачи:

1. Создать банк образцов тканей для следующих групп больных:

A. Предраковые изменения слизистой оболочки и доброкачественные опухоли гортани.

Б. Злокачественные новообразования гортани.

B. Неизмененная слизистая оболочка гортани (контрольная группа).

2. Исследовать частоту делеций в зоне локализации генов р16Ш4а, р15Ш4 (локус 9р21 -22), в зоне локализации гена Rbl (локус 13q 14.2) и в локусе 18q21, в зоне локализации гена bel 2.

3. Исследовать экспрессию мРНК данных генов.

4. Определить степень метилирования промоторной области гена р16МК4а

5. Провести типирование папилломавируса в исследуемых образцах методами полимеразной цепной реакции и иммуногистохимии.

6. Проследить динамику накопления молекулярно-генетических нарушений от стадии гиперплазии до анапластических изменений слизистой оболочки гортани.

7. Провести сравнительный анализ молекулярных нарушений в зонах локализации исследуемых генов в зависимости от индекса курения пациентов.

U Научная новизна.

В рамках данной работы впервые проведен детальный динамический анализ молекулярно-генетических изменений комплекса генов, участвующих в регуляции клеточного цикла, с целью определения молекулярных маркеров на ранних стадиях развития опухолей гортани на биологическом материале, полученном с помощью

щипцовой биопсии. А также проведено широкое исследование всех заболеваний слизистой оболочки гортани, а не только паппилом, на предмет наличия папилломовирусной инфекции. Показано, что случаи инфекции эпидермоидных клеток HPV 16 типа, столь характерные для опухолевого поражения плоского эпителия шейки матки и кожи, крайне редко наблюдаются при раке гортани, где превалируют случаи выявления HPV 18 типа.

1.4. Научно - практическая значимость работы.

Полученные результаты имеют теоретическое значение для понимания механизмов возникновения и прогрессии злокачественных новообразований и для выявления особенностей регуляции клеточного цикла в различных типах опухолей гортани. На основании полученных результатов даны рекомендации для проведения молекулярно-биологических исследований при опухолевой патологии гортани. После дополнительного тестирования будет предложен набор необходимых молекулярно-генетических маркеров для ранней диагностики злокачественных новообразований гортани и/или при составлении индивидуального прогноза.

1.5. Апробация работы.

Диссертационная работа апробирована 25 ноября 2004 года на совместной конференции лабораторий регуляции клеточных и вирусных онкогенов, молекулярной биологии вирусов, иммунологии онкогенных вирусов, цитогенетики НИИ Канцерогенеза, эндоскопического отделения и отделения опухолей верхних дыхательно-пищеварительных путей НИИ Клинической онкологии ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН.

Материалы работы были доложены на Научно-практическом симпозиуме "Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении" (Москва 2002), на конференции Cancer Prevention Research Conference (Boston, USA 2002), на III Съезде онкологов и радиологов стран СНГ (Минск, Белоруссия 2004) и конференции Cell cycle and cancer: Pathways and Therapies, AACR Special Conference in Cancer Research (Fort Lauderdale, USA, 2004). По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.

1.6. Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, изложения собственных результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 138 страницах

машинописного текста, включает 26 рисунков, 14 таблиц и список литературы из 214 источников, из них в отечественных журналах - 20, зарубежных -194.

2. Содержание работы.

2.1. Обзор литературы.

Обзор литературы посвящен обобщению данных о стадиях канцерогенеза гортани. Рассматривается роль возможных этиологических факторов развития рака гортани (алкоголь, канцерогены табачного дыма, влияние папилломавирусной инфекции, пола, наследственных факторов). Описаны молекулярно-генетические нарушения различных групп генов, связанные с развитием опухолей верхних дыхательных путей.

2.2. Материалы и методы исследования.

Образцы ткани и крови. В исследование включено 124 человека. Распределение больных по заболеваниям представлено в табл. 1. Как видно из таблицы, 46 больных имели предраковые заболевания и доброкачественные опухоли гортани, 46 пациентов -злокачественные новообразования гортани и 32 пациента с морфологически неизмененной слизистой гортани. Последние составляют условно контрольную группу, так как при отсутствии каких-либо нарушений эпителия гортани, как правило, имели другую опухолевую патологию. Все больные проходили лечение или наблюдались в НИИ Клинической Онкологии ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН в период с 2001 по 2003 год. Вся работа была выполнена на образцах, полученных методом щипцовой биопсии, каждый из которых имел достаточно малые размеры (около 0,04см3). Это было причиной, лимитирующей проведение всего комплекса исследований, так как количество ДНК и РНК, получаемое из щипцовых биоптатов, ограничено. Особенно это касается биологического материала, получаемого из очагов предраковых изменений слизистой гортани. В связи с этим панель исследуемых маркеров была применена не для всех пациентов. Однако использование эндоскопической техники является единственной возможной тактикой получения материала при раке гортани, ввиду специфического лечения, и, особенно, при предраковых заболеваниях.

Из полученного материала были выделены ДНК и РНК. Параллельно были получены образцы для приготовления парафиновых срезов и проведения иммуногистохимического анализа. Образцы периферической крови от каждого пациента использовались для выделения ДНК сразу после их получения. Материал, в том числе взятый и из визуально нормальной слизистой, прошел как гистологическую, так и цитологическую верификацию.

Таблица 1. Распределение больных по заболеваниям.

Заболевания гортани Количество больных

1. Рак гортани 2. Карциноид гортани 3. Поедоаковые изменения: Дискератозы* 45 1 19

Папиллома 10

Гипертрофический ларингит 4

4. Доброкачественные опухоли: Фиброма 8

Гемангиома 2

5. Опухолеподобные заболевания: Гранулема у

Киста гортанного желудочка 1

Условно-контрольная гоуппа (неизмененная слизистая гортани у пациентов с установленным диагнозом) Количество больных

Рак легкого 21

Рак пищевода 2

Злокачественная опухоль средостения 1

Рак шейки матки 1

Лимфома с поражением л/у средостения 1

Меланома кожи спины 1

Рак ротоглотки 1

Острый бронхит 1

Фарингит

Инородное тело правого главного бронха 1

Всего 124

* - Дискератоз является обобщенным названием гипер- и паракератозов

Анализ нарушения микросателлитных маркеров Нарушения микросателлитных маркеров (098974, 0981748 0981870, 098790, ЯЫ, ОШбО, 018868) анализировали с помощью гибридизации продуктов ПЦР, разделенных в 6% денатурирующем ПААГ и перенесенных на нейлоновые мембраны, с последующей авторадиографией. В качестве

зонда использовали олигонуклеотид (СА)п или один из праймеров, которые были помечены ИР с помощью полинуклеотид киназы фага Т4

Анализ экспрессии мРНК Реакция обратной транскрипции осуществлялась с помощью обратной транскриптазы MuLV (Ферментас). Анализ уровня экспрессии генов р16Ш4а, р15ШК4 ,Rbl, bel 2 осуществлялся с помощью полуколичественной обратной ПЦР.

Анализ метилирования промотора гена р16ШК4а Геномная ДНК была модифицирована с помощью бисульфита натрия и использована для ПЦР с праймерами, специфичными к метилированному и неметилированному состоянию промотора данного гена.

Определение папилломавирусной инфекции. Весь материал был исследован методом ПЦР на наличие последовательностей ДНК вируса папилломы 13 различных типов: 6, 11, 16,18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 58, 59, 67. Для проведения ПЦР использовались коммерческие наборы фирмы "ДНК-технология", включающие олигонуклеотиды, специфичные к различным типам HPV.

Иммуногистохимия Одну серию парафиновых срезов, толщиной 5 мкм, помещенных на полилизиновые стекла (Menzel-Glasser), инкубировали с мышиными поликлональными антителами к HPV 6, 11, 18 типов (NCL-HPV-4C4, Novocastra, UK), разведенными в пропорции 1:5, вторую - с моноклональными антителами к р1б (разведенние 1:40, clone 6Н12, code NCL-pl6-432, Novocastra, UK). Окрашивание проводилось с использованием стрептовидин-биотинового кита (NCL-ABCu, Novocastra, UK) и диаминобензидина.

Статистическая обработка данных Статистическая обработка результатов осуществлялась с помощью пакета статистических программ SPSS для Windows (SPSS Inc., Chicago, IL). Качественные признаки анализировались при помощи точного критерия Фишера при двусторонней альтернативе.

2.3. Результаты исследования и их обсуждение.

2.3.1 Результаты исследования потери гетерозиготности в зоне локализации генов pl6INK4a, plSINK4b Rb, bel 2 в предопухолевых и опухолевых изменениях эпителия гортани.

ДНК от 124 больных предраковыми и опухолевыми заболеваниями гортани была исследована на наличие делеций в 4 хромосомных локусах методом определения потери гетерозиготности. Всего исследовалось 7 маркеров, четыре из них расположены в локусе 9р21-22 (D9S1748, D9S974 (pl6,NK4°) и D9S1870, D9S790 (pl5INK4h)), один маркер в зоне

локализации гена Rb (Rbl) в локусе 13ql4.2 и два маркера находятся в локусе 18q21, где расположен ген bel 2 (D18S60, D18S68) .

В группе из 46 пациентов с предраковыми заболеваниями слизистой оболочки гортани потеря гетерозиготности в области локализации гена р16МК4° была обнаружена у 16 из 38 (42%) пациентов. По маркеру D9S1748 делеции были выявлены в 10 из 24 информативных случаев (38%), а делеции маркера D9S974 обнаружены в 6 из 20 случаев (35%). При этом наибольшее число делеций выявлено у пациентов с дисплазией эпителия гортани различной степени тяжести (71,4%), тогда как у больных с другими предраковыми изменениями и доброкачественными опухолями гортани потеря гетерозиготности в данном локусе не превысила 33%.

р15ШК4Ь Делеции в зоне локализации гена р15ШК4Ь исследовали по двум маркерам -D9S1870 и D9S790. Однако информативность вторЬго маркера оказалась достаточно низкой (40%), в связи с чем, он был исключен из дальнейшего анализа. Потеря гетерозиготности маркера D9S1870 была выявлена в 35% образцов. У шести больных, имеющих делецию pl5INK4b, мы также наблюдали делеции одного или двух маркеров в зоне локализации гена р16тК4а. У двух из этих больных была выявлена умеренная дисплазия, у остальных паракератоз (2), гемангиома (1), фиброма (1). В данных случаях делеции затрагивают не только область локализации р1бМК4а, но также и р15МК4Ь, а поскольку эти гены расположены рядом в локусе 9q21-22, этот факт свидетельствует о более обширном нарушении в данной зоне.

Количественное соотношение делеций в зоне локализации р16МК4а и р15тК4Ь при различных новообразованиях представлено на рисунке 1.

В Условно нормальная

слизистая ■Доброкачественные опухоли

□ Кератозы

□ Папилломы ■ Дисплазии

□ Плоскоклеточный рак

Рис. 1. Процентное соотношение делеций в зоне 9р21-22 при различных новообразованиях гортани.

И кератозы, и дисплазии относятся к предраковым изменениям слизистой гортани, однако процент делеций в дисплазиях в два раза выше. Таким образом, можно

предположить, что нарушения в области локализации генар16тк4а происходят на ранних стадиях и увеличиваются в процессе прогрессии заболевания от гиперкератоза до

дисплазии (р=0,002). При этом делеция распространяется от маркера D9S1748 к маркеру D9S974, расположенному ближе к гену р16ШК4а. Предположительные размеры делеции в случае утраты двух маркеров более 6kb (расстояние между D9S974 и D9S1748 составляет 6 180 Ьр).Следует отметить, что практически во всех случаях дисплазий мы наблюдали потерю всей анализируемой зоны, тогда как минимальный размер делеций наиболее часто был зафиксирован в случаях гиперкератоза.

В таблице 2 объединены все 18 случаев предраковых изменений гортани, имеющих какие-либо делеции в локусе 9р21-22.

Таблица 2. Случаи потери гетерозиготности в зонах локализации р16МК4а и plS!m4b в предраковых изменениях слизистой оболочки и доброкачественных опухолях гортани.

№ образца Гистологический диагноз D9S974 D9S1748 D9S1870

101 гиперкератоз N1 DEL I

102 папиллома N1 DEL DEL

103 умеренная и тяжела* дисплазия I DEL N1

104 умеренная дисплазия N1 DEL DEL

105 гиперкератоз N1 DEL N1

106 умеренная дисплазия N1 DEL DEL

107 умеренная дисплазия DEL DEL DEL

108 фиброма N1 DEL DEL

109 гемангиома NI DEL DEL

110 паракератоз DEL N1 DEL

111 паракератоз DEL I I

112 папиллома DEL I I

113 паракератоз DEL I N1

114 гиперкератоз N1 I DEL

115 умеренная дисплазия N1 N1 DEL

116 папиллома N1 N1 DEL

117 фиброма N1 N1 DEL

118 умеренная дисплазия DEL DEL N1

DEL (Deletion) - делеция указанного маркера, I (Informative) - информативно, гетерозиготные аллели, делеций нет, N1 (Not informative) - неинформативно, гомозиготные аллели.

Rbl Делеция в области локализации гена Rbl была обнаружена в одном из восемнадцати информативных случаев. У данного больного была выявлена ангиофиброма.

bcl-2 В зоне локализации гена bcl-2 выявлены единичные делеции - две делеции из 19 информативных случаев по маркеру D18S60 и 2 делеции из 23 анализируемых случаев для маркера D18S68 В последних двух образцах отмечались делеции также в зонах р16МК4а и р15Ш4Ь. Интересно, что у одного из этих больных в 1999 году был установлен диагноз рак гортани (T1N0M0), и после проведения лучевого лечения наблюдалась полная ремиссия опухоли, однако в 2002 году у больного была вновь выявлена умеренная дисплазия.

Исследование потери гетерозиготности в группе рака гортани проводились на материале от 45 больных. У одного больного был диагностирован карциноид гортани.

р16ШК4а Потеря гетерозиготности в зоне локализации гена р16ШК4° наблюдалась в 12 образцах злокачественных опухолях гортани (36%), из них делеции по маркеру D9S1748 были выявлены в 8 из 28 информативных случаев (28,5%), а по маркеру D9S974 в 4 из 16 информативных случаев (25%). Однако 80% из них были детектированы у больных с I и II стадиями заболевания, что свидетельствует о том, что данный вид нарушения в локусе 9р21 является ранним. На поздних стадиях заболевания (III-IV стадия) делеции были выявлены нами всего лишь в 20% случаев.

р15тК4 Потеря гетерозиготности в области гена р15ШК4Ь (маркер D9S1870) была выявлена только у 13% пациентов (3/24). Возможно, что нарушения гена р15ШК4а вторичны, не являются критичными и связаны с общей нестабильностью генома.

Rb Делеции в зоне локализации гена Rb были выявлены в 19% образцов (4/21). Все делеции обнаружились у больных с поздними стадиями заболевания (III - IV стадии).

bcl-2 Частота потери гетерозиготности в локусе 18q21 в зоне локализации bcl-2 составила 29% ( 8/27). Делеции маркера D18S60 выявлены в 3 из 16 информативных случаев (19%), а по маркеру D18S68 в 5 из 22 случаев (23%). У трех больных была диагностирована I стадия, у трех - II стадия, и у двух пациентов, у которых в дальнейшем наблюдался рецидив рака гортани, установлена III стадия развития заболевания.

Результаты исследования распределения делеций в трех хромосомных локусах в зависимости от стадии заболевания представлены в таблице 3.

Мы не выявили статистически достоверной разницы в частоте делеций в локусах 9р21-22 и 18q21 в зависимости от стадии развития РГ. Исключение составляют только делеции маркера Rbl. Мы обнаружили нарушение данного маркера в половине случаев

рака гортани Ш-1У стадии заболевания (4/8), тогда как в 13 случаях, относящихся 1-И стадии заболевания, не зафиксировано ни одной делении (р=0,01).

Таблица 3. Частоты потери гетерозиготности в исследованных локусах у больных с различными стадиями рака гортани.

Стадия заболевания там Кол-во больных 9р21-22 ыы 18ч21

I тшомо 13 7/13 0/13 3/7

II Т2Ы0М0 12 6/10 3/6

III Т31Ч0М0 12 1/10 4/8 1/8

ТЗИхМО 6 0/4 1/5

IV Т4Ы0М0 2 1/1 0/2

Всего: 45 15/38 (37%) 4/21 (19%) 8/27 (29%)

В группе из 32 пациентов с морфологически неизмененной слизистой оболочкой гортани наблюдались единичные делеции в исследованных областях генома. Делеции были выявлены всего у четырех пациентов. У трех больных был установлен диагноз - рак легкого, у этих пациентов наблюдалась потеря гетерозиготности по маркерам 0981748 (у одного больного) и 018868 (у двух пациентов). У четвертого больного предварительно выявлен метастаз рака почки в легкое, делеция у данного пациента была обнаружена в зоне локализации гена ЯЪ.

Внутриопухолевая молекулярно-генетическая гетерогенность. При исследовании опухолевых и, тем более, предопухолевых изменений нельзя не учитывать фактор внутриопухолевой молекулярно-генетической гетерогенности. Возможность параллельного взятия нескольких биопсий из одного патологического очага позволило нам провести сравнительный анализ нарушений генома в различных фрагментах одной опухоли. У трех больных с диагнозом "рак гортани" и у одного больного с диагнозом "кавернозная гемангиома", относящейся к разряду доброкачественных опухолей, были взяты биопсии из различных участков патологического очага. При морфологическом и цитологическом анализе было показано, что параллельно взятые образцы ничем не отличались друг от друга. Все биоптаты были исследованы на наличие делений в исследованных хромосомных зонах. Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4. Внутриопухолевая молекулярно-генетическая гетерогенность в различных опухолевых очагах гортани.

Jft участка Диагноз D9S974 D9S1748 D9SX870 Rbl D18S60 D18S68

222/Т1 плоскоклет. рак гортани (Т2ШМ0) I DEL N1 I I DEL

222/Т2 DEL 1 N1 1 I I

2i2m плоскоклет. рак гортани (ТШОМО) I 1 DEL I NI DEL

212ГТ2 I I I I NI I

109/Т1 кавернозная гемангиома гортани I N1 I NI NI NI

109ЛГ2 DEL N1 DEL NI NI NI

109/ТЗ I N1 I NI NI NI

109/Т4 I N1 I NI NI NI

224/Т1 плоскоклет. рак гортани (Т2ШМ0) N1 N1 N1 I I I

224/Т2 N1 N1 N1 I I I

У трех из четырех пациентов (у двух раком гортани и у одного с гемангиомой), нами была выявлена молекулярно-генетическая внутриопухолевая гетерогенность, т.е.делеции обнаружены не во всех участках опухоли. В образцах № 222 и 212 были выявлены делеции в зоне локализации генов р16тК4° и pl5INK4b, а также маркера D18S68 (ген Ъс12). Сходная картина наблюдалась и у третьего больного с доброкачественной опухолью. У него были выявлены делеции в одном и том же участке по маркерам D9S1748 и D9S1870. Остальные три образца ДНК, полученные из других участков той же опухоли, были интактны. В образцах рака гортани № 224 не обнаружено делеций ни по одному из исследованных маркеров. Тем не менее, следует отметить, что маркеры в зоне локализации гена р16МК4° не были информативными, т.е. представлены гомозиготами, и при использовании метода прямой ПЦР мы не можем исключить наличия гомозиготных делеций в данном локусе.

2.3.2 Исследование метилирования промотора гена р16ШК4Л

Одним из механизмов инактивации генов-супрессоров является аномальное гиперметилирование CpG-островков, расположенных в промоторных областях данных генов. Мы исследовали метилирование промоторной области гена pl6lNKi°, используя метилспецефическую ПЦР. Статус метилирования pl6,NK4a был исследован у 23 пациентов с предраком гортани и доброкачественными опухолями, у 18 больных раком гортани и у 7 пациентов условно-контрольной группы. Во всех группах, нами были обнаружены единичные случаи данного эпигенетического нарушения. Хотя методы,

использованные в работе, не позволяют выяснить один или оба аллеля р16Ш4А метилированы в каждом конкретном случае, тем не менее, мы наблюдали частичное метилирование промотора р16Ш4А в одной из папиллом и в одном образце плоскоклеточного рака гортани. Возможно, это - метилирование действительно только одного из аллелей гена, но мы не можем исключить минимальную контаминацию данных образцов ДНК нормальных клеток. Полное метилирование промотора р16т4А выявлено нами в трех случаях предрака (13%) и всего лишь в одном случае плоскоклеточного рака гортани. Тем не менее, в данных случаях мы наблюдали сочетание метилирования с другими нарушениями р1бШК4А (рис.2).

М 1

(А)

(В)

unmet met unmet met

Kt> ■ m ■

unmet met unmet met

M 1_2 3

(Б)

IN IT 2N 2T

M 1_2 3

IN IT 2N 2T

СП

Рис.2. Статус метилирования (А) и экспрессии р16МК4ж (Б) в образцах ДНК предраковых изменений слизистой гортани.

1 и 2 - ДНК и РНК от одного больного, 3 и 4 - ДНК и РНК от второго больного. В обоих случаях

наблюдается метилирование и отсутствие экспрессии р!б

Статус метилирования (В) и

экспрессия р16 "(Г) в образцах ДНК рака гортани. В первом случае отсутствует метилирование промотора р16ШК4°, экспрессия данного гена также сохранена, Во втором случае наблюдается метилирование и отсутствие экспрессии мРНК р16Ш4°. М - маркер молекулярного веса продуктов ПЦР.

В одном случае предопухолевого заболевания обнаружено одновременное метилирование и делеции в зоне локализации данного гена, в двух оставшихся случаях предрака и одном случае рака гортани наличие сигнала, соответствующего метилированному аллелю в этих образцах ассоциировалось с понижением (в среднем более чем в 3 раза) или полным отсутствием уровня экспрессии р16МК4А.

Таким образом, можно предположить, что в случаях, где мы наблюдали полное метилирование, ген р16МК4л является нефункциональным.

2.3.3. Экспрессия генов р16МК4А, Rb и Bcl-2 в предопухолевых и опухолевых поражениях слизистой оболочки гортани. Корреляция со структурными нарушениями исследуемых генов.

Следующим этапом исследования было определение экспрессии р16мш, Rb и Bcl-2 методом полуколичественной обратной ПЦР (RT-PCR) с использованием мРНК, выделенной из 23 биопсий, полученных от 5 больных предраковыми заболеваниями и от 18 больных раком гортани. Экспрессия гена GAPDH, фрагмент которого успешно амплифицировался во всех образцах, использовалась в качестве контроля. Для оценки уровня экспрессии интересующего гена интенсивность сигнала, соответствующего амплифицированному фрагменту данного гена, делилась на интенсивность сигнала, соответствующего фрагменту GAPDH, амплифицированному с использованием того же источника кДНК.

Предполагается, что аллельные делеции или гиперметилирование промотора определенного гена могут приводить к изменению уровня экспрессии его мРНК. Мы сравнили наличие структурных и эпигенетических нарушений в исследуемых генах с уровнем их экспрессии. Данные об изменениях экспрессии и возможной ее связи с других нарушениями в зоне локализации данных генов представлены таблице 5

Низкий уровень или отсутствие экспрессии р16тК4А отмечался в 80% случаев предрака и в 40% образцов рака гортани, что может объясняться присутствием в большинстве этих случаев потери гетерозиготности в зоне локализации р1бШ4А или метилированием промотора данного гена. Ни в одном из случаев, как предрака, так и рака гортани, где был зафиксирован нормальный или повышенный уровень экспрессии р16ШК4\ мы не обнаружили ни делеций, ни метилирования промотора. Дополнительно в некоторых случаях экспрессия белка р16 исследовалась иммуногистохимическим методом (рис.3).

Таблица 5. Данные о молекулярио-генетических нарушениях в образцах ткани больных с предопухолевых заболеваниями и раком гортани.

о\

Наименование Образца Del9p21 Del 13ql4 Del 18q21 Экспрессия р16ШК4А Экспрессия Rb Экспрессия Bcl-2 Наличие HPV

Предрак гортани 105 гиперкератоз del NI del + + нет

106 у/ддисплазия del I NI - — - + 18

118 гиперкератоз I I NI + — + + нет

119 гиперкератоз NI NI I + п + + нет

120 папилломатоз I I NI - + +t + 6/11

Рак гортани 201 T1N0M0 del I del +1 6/11,18

205 T1N0M0 I I NI - +Í - N/A 18

210 T1N0M0 I I I - + + N/A нет

213 T1N0M0 I I del - +1 - +Í 18

214 T2N0M0 NI NI NI - N/A - + нет

228 T3N0M0 NI I I - + +1 N/A 18

238 T3N1M0 I I NI — + + N/A нет

242 T3NxM0 NI NI I _ +T +t +T нет

243 T3NxM0 I I I - +t +T +Í нет

226 T3N0M0 I I I - N/A +T нет

Л

ч»

л- *

224 T2N0M0 I N1 N1 — +1 + N/A нет

228 T3N0M0 I I I — +T N/A нет

218 T2N0M0 I I I — N/A - + нет

219 T2N0M0 N1 1 I — N/A +T n нет

229 T3N0M0 I N1 I + N/A +1 — нет

231 T3N0M0 I N1 N1 - N/A - +r нет

232 T3NOMO I N1 I - N/A n + нет

225 T2N0M0 I N1 N1 - N/A +T - нет

DEL (Deletion) - делеция указанного маркера, 1 (Informative) - информативно, гетерозиготные аллели, делеций нет, N1 (Not informative) -неинформативно, гомозиготные аллели. "+" метилирование промотора р16 в опухоли,"-" - метилирование отсутствует, N/A - маркер не определялся. "+J" - снижение экспрессии гена,"+|" - повышение экспрессии гена, "-" - отсутствие экспрессии гена, "+" - нормальная экспрессия.

ff i^mmmm^

120 119 201 205 210 NTNT NT NT NT

1234567 89 10

Ii pl6INK4A

GAPDH

РисЗ А - Примеры экспрессии гена pl6INK4A очагах в предопухолевых и опухолевых поражений гортани.

N- норма, Т- опухоль. В каждом случае в качестве контроля проводилась оценка уровня экспрессии GAPDH. Б - пример иммуногистохимической окраски фрагмента папилломы. В базальном слое эпителия отмечается выраженная очаговая экспрессия белка р16 в ядре. х200, окраска гематоксилин-эозином

Полное отсутствие экспрессии гена Rb наблюдалось в 6 из 18 (33%) случаев рака гортани, делеций не было обнаружено ни в одном из них. Однако следует особо подчеркнуть, что в 4 из этих образцов была выявлена последовательность HPV 18 типа, основным свойством одного из его белков, является взаимодействие с продуктом гена Rb и убиквитинизацией последнего. Возможно, что в данных случаях ген Rb инактивиробан именно таким образом. Такая же картина наблюдалась в случае дисплазии гортани, где также был обнаружен HPV 18, и экспрессия Rb в этом образце отсутствовала. Увеличение экспрессии Rb было выявлено в 7 из 18 (38%) случаев рака и всего лишь в 1 случае папилломатоза гортани. В остальных случаях уровень экспрессии Rb не изменялся по сравнению с нормой.

Гиперэкспрессия bcl-2 была обнаружена у 5 из 12 (41%) больных раком гортани. У четырех из них была диагностирована III стадия заболевания, у одного больного - I стадия. Снижение или отсутствие экспрессии было выявлено в 4 из 12 (30%) образцов рака, в одном из этих случаев была также выявлена делеция в зоне 18q21. В группе предрака гортани отмечалась нормальная экспрессия bcl-2 у 90% исследованных пациентов.

Соотношение уровеня экспрессии всех исследованных генов в группах с предраковыми изменениями и плоскоклеточного рака гортани представлено на рисунке 4.

pl6 Rb Be 12 Предрак гортани

pl 6 Rb Bcl2

Рак гортани

I нормальный уровень экспрессии

I снижение или

отсутствие экспрессии I повышение экспрессии

Рис.4 Экспрессия генов р16 , ЯЬ и Вс1-2 в образцах предопухолевых и опухолевых поражений слизистой оболочки гортани.

Таким образом, мы установили, что в группе с предраковыми изменениями слизистой оболочки гортани большинство образцов сохраняет нормальный уровень экспрессии генов Rb и Bcl-2, в то время как снижение экспрессии р16Ш4А наблюдалось в подавляющем большинстве биоптатов и коррелировало как с наличием делеций, так и метилированием его промотора (см. табл.6). В группе со злокачественными новообразованиями гортани наблюдается противоположная картина. Нормальный уровень экспрессии Rb и Bel-2 зафиксирован нами менее чем у 20% пациентов, в то время как, изменения экспрессия <p\(¡NK4A (от нормального уровня до гиперэкспрессии) выявлены приблизительно в одинаковом количестве образцов. Небольшое количество наблюдений не позволило нам сопоставить данные о снижении или подъеме экспрессии генов с клиническими характеристиками больных, однако, это очень важно и требует дальнейших исследований.

2.3.4. Сравнительный анализ потери гетерозиготности в эпителии слизистой оболочки гортани среди курильщиков и некурящих индивидуумов.

Курение является одним из важных факторов в этиологии опухолевых поражений слизистой оболочки гортани. В связи с этим мы провели сравнительный анализ потери гетерозиготности в зонах локализации исследуемых генов у курильщиков и некурящих индивидуумов.

В группе пациентов с предраковыми изменениями и доброкачественными опухолями гортани 28 из 46 человек (25 мужчин и 3 женщины) (60%) подвергались экспозиции канцерогенами табачного дыма в течение длительного времени. В группе больных раком гортани 43 из 46 пациентов (41 мужчина и 2 женщины) (93,4%) также относятся к курильщикам. В контрольной группе из 32 пациентов курят 18 (56%) человек (16 мужчин и 2 женщины). Значения индекса курения в исследованных группах представлены в таблице 6.

Таблица 6. Количество курящих больных и индекс курения в исследованных группах пациентов.

Группа больных курят/общее число мужчины женщины индекс курения

предраковые заболевания и доброкачественные опухоли гортани 28/46' 25 3 15-94 (среднее 42,6)

плоскоклеточный рак гортани 43/46 41 2 5-99 (среднее 37,1).

условно-конрольная группа 18/322 16 2 3,5 - 120 (среднее 36).

'р-0,003 при сравнении с количеством курильщиков в группе больных злокачественными опухолями гортани.

2р=0,001 при сравнении с количеством курильщиков в группе больных злокачественными опухолями гортани.

В группе больных раком гортани количество курящих значительно превышает таковое в остальных двух группах (р< 0,003). Мы не обнаружили существенной разницы между индексом курения во всех исследованных группах. В группе курящих и некурящих больных с предопухолевыми и опухолевыми заболеваниями также не выявлено разницы в зависимости от степени тяжести морфологических изменений эпителия гортани.

Сопоставляя эти данные с исследованием потери гетерозиготности в различных локусах, нами бьии получены результаты, свидетельствующие о том, что 70% делеций локуса 9р21 были выявлены в ДНК предраковых изменений именно курильщиков. В группе больных раком гортани у всех 43 пациентов, являющимися злостными курильщиками, обнаружены делеции по какому-либо из исследованных маркеров, в то время как у трех некурящих пациентов делеций не было выявлено ни в одном из исследованных случаев.

В контрольной группе в ДНК нормального эпителия гортани курильщиков нами были выявлены единичные делеции, соответствующие -скорее общей фоновой

нестабильности генома, и не являющиеся специфичными. Тем не менее, необходимо отметить, что у большинства больных этой группы был установлен диагноз - рак легкого.

2.3.5. Определение папилломавирусной инфекции в исследованном материале.

Поскольку курение и алкоголь являются мощными факторами в этиологии опухолевых поражений слизистой оболочки верхних дыхательных путей, они, порой, могут маскировать воздействие других факторов на развитие неоплазии. Существуют основания, позволяющие утверждать, что папилломавирусная инфекция также играет немаловажную роль в патогенезе опухолей головы и шеи, в частности, рака гортани.

В данной работе был проведен скрининг ДНК, полученной из биопсий слизистой оболочки гортани больных всех трех групп, на наличие папилломавирусной инфекции 13 различных типов (табл.7). Общее число пациентов, инфицированных HPV, включая больных контрольной группы, составило 26% (32 из 124 индивидуумов). Интересно, что инфекция папилломавирусом в предраковых изменениях встречается в три раза чаще по сравнению с плоскоклеточным раком (р=0,017). В очагах предраковых поражений слизистой гортани 6 или 11 типы вируса присутствовали в 3 из 36 исследованных образцов (8%), исключая случаи папилломатоза, где у всех пациентов обнаружены папиломавирусы данных типов (рис.5А). При раке гортани инфекция HPV 6,11 типа обнаружена только в одном случае, тогда как высокоонкогенный 18 тип выявлен в 6 из 45 (13%) случаев рака, практически с такой же частотой, как и в предраке (11%). Продукты HPV 45,39,59 типов, являющиеся родственными HPV 18, обнаружены в 5 из 36 (14%) биопсийных образцов предрака гортани и в 3 из 45 (7%) случаях рака. Папилломавирус 31,35,26,51 типов встречался в единичных случаях. HPV 16 а также 33, 58, 67 типов не обнаружен ни в одной из исследованных нами групп. Таким образом, инфекция HPV 18 и родственными ему типами во всех трех исследованных нами группах встречается чаще по сравнению с HPV 16 и сходных с ним типов вируса. У 6 пациентов выявлена смешанная инфекция 2 или 3 типов HPV (HPV 6/11 и 45-59 или 18 типов) (рис.5В).

В контрольной группе только в 1 из 36 случаев обнаружен HPV 18 типа (рис.5Б). У данного больного диагностирован плоскоклеточный рак левого легкого Ш стадии. Заболеваний гортани не отмечено.

В нашем исследовании мы обнаружили значительные отличия в результатах, полученных методами ПЦР и иммуногистохимии. Иммуногистохимически капсидные белки папилломавирусов были выявлены только в 2 образцах. Оба случая относились к группе паппипоматозов (рис. 5Г). В тоже время у этих же 18 пациентов методом полимеразной цепной реакции последовательности HPV были обнаружены в 44% случаев.

Таблица 7. Частота встречаемости разных типов HPV в группах пациентов с предопухолевыми и опухолевыми поражениями гортани.

Тип вируса 6,11 1S 4SJ9.S9 16 31,35,52,67 51,26 Всего инфицировано

предраковые 3/36 4/36 5/36 0/36 0/36 0/36 10/36

заболевания 8% 11% 14%

папилломатгоз 10/10 100% 1/10 10% 1/10 10% 0/10 1/10 10% 0/10 10/10

плоскоклеточный рак 1/46 2% 6/46 13% 3/46 6% 0/46 2/46 4% 1/46 2% 11/46

контроль 0/32 1/32 0/32 0/32 0/32 0/32 1/32

к+ 1 2 3 4 5 6 7 8

Рис 5. А- HPV 6/11 типов у пациентов с рецидивирующим папилломатозом (треки 1,2,4,6,7,8), Б- единичный случай HPV 18 типа в контрольной группе пациентов (трек 2), В- смешанная инфекция HPV 6/11 и 45-59 типов у пациентов с плоскоклеточным раком гортани (треки 2 и 6), К+ - положительный контроль. Г -Пример иммуногистохимической окраски (фрагмент папилломы). В верхней трети эпителиального пласта слизистой оболочки гортани выявлена ядерная экспрессия белков капсида HPV 6,11.

Скорее всего, это можно объяснить тем фактом, что методом иммуногистохимии определяется только активная инфекция папилломавирусом, т.е. в случае образования полноценных вирусных частиц. Латентная форма инфекции не выявляется по причине отсутствия вирионных белков. Следовательно, определение HPV имунногистохимическим методом представляется сомнительным.

Мы не выявили различий в частоте HPV инфекции в зависимости от степени выраженности морфологических изменений слизистой при предраковых заболеваниях гортани (гипер-, паракератозы). Мы также не обнаружили различий в частоте персистенции HPV среди курящих и некурящих пациентов. Так, среди 89 обследованных курильщиков HPV последовательности обнаружены у 20 пациентов, а среди 35 некурящих мужчин и женщин - у 10, что составляет в одном случае 23%, а в другом -28%. Следует отметить, что как статус, так и индекс курения не коррелировали ни с гистологическим типом неоплазии, ни с типом обнаруженного папилломавируса.

Поскольку, папилломатоз является рецидивирующим заболеванием, нам удалось проследить развитие заболевания в динамике у больного N. У данного пациента биопсии брались четыре раза в период с 2001 по 2003 год. Каждые семь месяцев, после лазерной деструкции папилломы, у больного возникал новый рецидив. Во всех полученных образцах был выявлен папилломавирус б и 11 типов. Кроме того, на фоне папилломы были выявлены более тяжелые морфологические изменения эпителия слизистой гортани (умеренная и тяжелая дисплазии).

На молекулярном уровне в трех случаях были выявлены делеции в локусе 9р21-22 (рис.6), а также метилирование промотора pl6INK4°. В образце, полученном в четвертый раз, после проведения лечения, не обнаружено каких-либо нарушений в исследованной зоне, при этом морфологических изменений эпителия в зоне роста папилломы также обнаружено не было (табл.8). Скорее всего, это связано с тем, что вирусы папиллом 6 и 11 типов не относятся к группе HPV высокого риска, так как гены Е6 и Е7 данных типов не способны связываться с белками р53 и Rb, и не вызывают блокирования их функций и бесконтрольную клеточную пролиферацию. Кроме того, сказывается прием пациентом иммуностимулирующих препаратов, играющих немаловажную роль в подавлении вирусной инфекции.

Таблица 8. Распределение делеций в четырех последовательно взятых биопсиях у больного N.

Дата посещений Гистологический диагноз 0981748 1)98974 09в1870 КВ1 018860 Ш8в68

25.10.2001 Плоскоклеточная папиллома с умеренной дисплазией I ОЕЬ I I N1 I

23.04.2002 Плоскоклеточная папиллома с очагами умеренной и тяжелой дисплазии ОЕЬ I ОЕЬ I N1 I

19.11.2002 Плоскоклеточная папиллома с акантозом и паракератозом ОЕЬ I БЕГ, I N1 I

29.04.2003 Плоскоклеточная папиллома с акантозом I I I I N1 I

Рис.6. Потеря гетерозиготности в локусе 9р21-22 в образцах ДНК выделенных из папиллом, взятых в различное время у больного N.

А - делеция маркера 1398974, биопсия взята 25.10.2001, Б - делеции маркеров 13981870 и 15981748, биопсия взята 23.04.2002, В - делеция 0981748, биопсия взята 19 11.2002.

3. Практические рекомендации.

В результате анализа всех полученных результатов нам хотелось бы, в качестве заключения, предложить следующие практические рекомендации по алгоритму молекулярно-генетического исследования образцов, получаемых эндоскопическим методом, от больных предопухолевыми и опухолевыми заболеваниями гортани:

1. Учитывая фактор внутриопухолевой молекулярно-генетической гетерогенности, следует получать биоптаты, по крайней мере, в двух или трех зонах одного очага поражения, отстоящих друг от друга.

2. При исследовании молекулярно-генетических нарушений, необходимо учитывать, что изменения р1бШ4а являются наиболее ранними, и могут быть

диагностическими, в то время как альтерации гена Rb происходят на более поздних стадиях, и связаны, скорее всего, с прогрессией заболевания.

3. При исследовании заболеваний гортани, необходимым является определение папилломавирусной инфекции, относящейся к группе высокого риска, особенно HPV 18 и родственных ему типов. Исследование HPV 6,И типов является необязательным.

4. Учитывая, что канцерогены табачного дыма являются одним из важных факторов в этиологии опухолевых поражений слизистой оболочки гортани, следует анализировать мутации гена Ki-ras, являющиеся наиболее ранними изменениями, связанными с курением Это не входило в цели описанного исследования, однако данное заключение сделано, исходя из опыта и данных нашей лаборатории по исследованию рака легкого.

4. ВЫВОДЫ.

1. Щипцовые биопсии являются доступным способом получения материала, и количество выделяемых ДНК и РНК является достаточным для целей молекулярно-биологических исследований.

2. Наиболее ранним и частым нарушением в предопухолевых заболеваниях гортани является инактивация гена р1бтК4а, происходящая в результате делеций хромосомных локусов (42%), метилирования промотора (13%) и снижения уровня экспрессии РНК (80%).

3. Структурные нарушения в зоне локализации гена-супрессора Rb и онкогена Вс12, а также изменение экспрессии данных генов не характерны для предопухолевых поражений, обнаруживаюся, главным образом, в препаратах рака гортани III-IV стадии развития заболевания и связаны с прогрессией опухолевых образований гортани.

4. Количество молекулярно-генетических нарушений нарастает в ряду гиперплазия -дисплазия, что соответствует степени риска малигнизации предраковых изменений гортани.

5. Детекция различных типов HPV высокого риска злокачественного роста у больных с предопухолевыми поражениями гортани может дать дополнительную информацию для понимания как механизмов развития рака гортани, так и его течения. Наиболее часто встречаемым папилломавирусом группы HPV высокого риска малигнизации в предопухолевых и опухолевых поражениях гортани является HPV 18 и родственных ему типов.

6. Большинство молекулярно-генетических нарушений, обнаруженных в предопухолевых и опухолевых поражениях гортани ассоциировано с табакокурением.

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1 Балукова О.В., Немцова М.В, Землякова В.В, Концевая А.Ю., Зборовская И.Б., Унгиадзе Г.В. Молекулярно-генетическне нарушения в предопухолевых и опухолевых поражениях слизистой оболочки гортани. Научно-практический симпозиум 'Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении", стр104, Москва 2002.

2. Zborovskaya I, Balukova О, Chizhikov V, Ungiadze G, Savelov N, Tatosyan A. Molecular

follow up of preneoplastic lesions of upper aero digestive tract associated with smoking. $

Cancer Prevention Research Conference, p 112, Boston, 2002.

3. Балукова O.B., Унгиадзе Г.В., Зборовская И.Б. Скрининг молекулярных нарушений в ' ранней диагностике предраковых заболеваний гортани. III Съезд онкологов и радиологов стран СНГ, Т1,186-187, 25-28 Мая 2004, Минск, Белоруссия.

4. Балукова О.В., Щербак Л.Н, Савелов Н.А., Унгиадзе Г.В, Зборовская И.Б. Папилломавирусная инфекция в предопухолевых и опухолевых поражениях гортани. Вестник РАМН №12, 36-39, 2004.

5. Balukova О., Kochetkova М, Kontsevaya A, Ungiadze G., Zborovskaja I. Characterization of cell cycle regulation genes at the early stages of laryngeal tumorogenesis. Cell cycle and cancer: Pathways and Therapies, AACR Special Conference in Cancer Research. B27, 1-5 December, Fort Lauderdale, USA, 2004

*

Служба множительной техники ГУ РОНЦ им Н.Н Блохина РАМН Подписано в печать 11. 02 . 05 Заказ № 118 Тираж 100 экз

w

РНБ Русский фонд

2005-4 47782

1781

Актуальность. Согласно статистическим исследованиям последних лет, в России к 2000 году число больных с впервые в жизни установленным диагнозом рака верхних дыхательных путей составило 8,0 на 100 000 населения и этот показатель в 1,5 раза больше по сравнению с 1995 годом (5,4 на 100 000). Это связано, в основном, с повышением заболеваемости раком гортани, который составляет 60% наблюдений среди злокачественных новообразований верхних дыхательных путей. При сохранении современных тенденций число случаев онкологических заболеваний будет увеличиваться. Многими научными исследованиями доказана связь развития рака гортани с экспозицией канцерогенами табачного дыма и промышленной загрязненностью окружающей среды. Одним из самых современных и перспективных подходов в диагностике онкологических заболеваний является исследование молекулярных характеристик предопухолевых заболеваний. Выявление диагностических маркеров опухолевого роста на ранних стадиях развития заболевания является одним из важнейших направлений в онкологии, а при исследовании рака гортани особенно актуально.

Приоритетное значение в развитии подавляющего большинства неоплазий имеют гены, регулирующие клеточный цикл, а значит уровень пролиферации опухолевых клеток. Экспрессия белков, регулирующих клеточный цикл и апоптоз, часто нарушается в опухолевых клетках. Некоторые из них, например, белки генов р53, Rbl, bcl-2 широко используются как возможные прогностические маркеры при развитии многих злокачественных опухолей человека. Однако в патогенезе опухолей верхних дыхательных путей их роль до конца не изучена. В некоторых работах было показано, что изменения данных генов отмечались в пренеопластических нарушениях эпителия слизистой оболочки гортани, при этом экспрессия некоторых из них изменялась в зависимости от степени выраженности анапластических изменений. Нарушение функции генов, ответственных за клеточный цикл и апоптоз, влияет не только на трансформацию клетки, но и на характер прогрессии сформировавшейся злокачественной опухоли. Так, например, повышенная продукция bcl-2, обнаруженная на ранних стадиях неоплазии, ведет к снижению показателя выживаемости больных раком гортани почти в два раза. Все это говорит о ранних нарушения в данных генах и их важной роли в канцерогенезе.

Наиболее часто в карциномах гортани встречаются соматические нарушения гена кодирующего один из белков - ингибиторов циклинзависимых киназ INK4, и являющегося негативным регулятором сигнального пути Cdk-Rb-E2F, отвечающего за реализацию программы клеточного цикла. Наиболее частый механизм его инактивации -метилирование CpG островков промотора и 1-го экзона р16ШК4а, гомозиготные делеции и точечные мутации. Наличие делеций в данном гене может коррелировать с усилением инвазии и метастазированием в лимфатические узлы.

Цель. Целью данной работы является выявление соматических молекулярно-генетических изменений, ассоциированных с развитием опухолей гортани на ранних стадиях, и изучение возможности их использования в качестве' маркеров для ранней диагностики и/или прогноза заболевания.

В соответствии с указанной целью предполагалось решить следующие экспериментальные задачи:

1. Создать банк образцов тканей для следующих групп больных:

A. Предраковые изменения слизистой оболочки и доброкачественные опухоли гортани.

Б. Злокачественные новообразования гортани.

B. Неизмененная слизистая оболочка гортани (контрольная группа).

2. Исследовать частоту делеций в локусе 9р21-22 в зоне локализации геновр16Ш4а иpl5INK4, в локусе 13ql4.2, в зоне локализации гена Rbl, и в локусе 18q21, в зоне локализации гена bcl 2.

3. Определить степень метилирования промоторной области гена pl6,NK4a.

4. Исследовать экспрессию мРНК данных генов.

5. Провести типирование папилломавируса в исследуемых образцах методами полимеразной цепной реакции и иммуногистохимии.

6. Проследить динамику накопления молекулярно-генетических нарушений от стадии гиперплазии до анапластических изменений слизистой оболочки гортани.

7. Провести сравнительный анализ молекулярных нарушений в зонах локализации исследуемых генов в зависимости от индекса курения пациентов.

Научная новизна. В рамках данной работы впервые проведен детальный динамический анализ молекулярно-генетических изменений комплекса генов, участвующих в регуляции клеточного цикла, с целью определения молекулярных маркеров на ранних стадиях развития опухолей гортани на биологическом материале, полученном с помощью щипцовой биопсии. А также впервые проведено столь широкое исследование всех заболеваний слизистой оболочки гортани, а не только паппилом, на предмет наличия папилломовирусной инфекции. Показано, что случаи инфекции эпидермоидных клеток HPV 16 типа, столь характерные для опухолевого поражения плоского эпителия шейки матки и кожи, крайне редко наблюдаются при раке гортани, где превалируют случаи выявления HPV 18 типа.

Практическая значимость. Полученные результаты будут иметь теоретическое значение для понимания механизмов возникновения и прогрессии злокачественных новообразований и для выявления особенностей регуляции клеточного цикла в различных типах опухолей гортани. После дополнительного тестирования может быть предложен набор необходимых молекулярно-генетических маркеров для ранней диагностики неоплазии гортани и/или при составлении индивидуального прогноза.

выводы.

1. Щипцовые биопсии являются доступным способом получения материала, и количество выделяемых ДНК и РНК является достаточным для целей молекулярно-биологических исследований.

2.Наиболее ранним и частым нарушением в предопухолевых заболеваниях гортани является инактивация гена pl6INK4a, происходящая в результате делеций хромосомных локусов (42%), метилирования промотора (13%) и как следствие снижения уровня экспрессии РНК (80%).

3. Структурные нарушения в зоне локализации гена-супрессора Rb и онкогена Вс12, а также изменение экспрессии данных генов не характерны для предопухолевых поражений, обнаруживаюся, главным образом, в препаратах рака гортани III-IV стадии развития заболевания и связаны с прогрессией опухолевых образований гортани.

4. Количество молекулярно-генетических нарушений нарастает в ряду гиперплазия - дисплазия, что соответствует степени риска малигнизации предраковых изменений гортани.

5. Детекция различных типов HPV высокого риска злокачественного роста у больных с предопухолевыми поражениями гортани может дать дополнительную информацию для понимания как механизмов развития рака гортани, так и его течения. Наиболее часто встречаемым папилломавирусом группы HPV высокого риска малигнизации в предопухолевых и опухолевых поражениях гортани является HPV 18.

6. Большинство молекулярно-генетических нарушений, обнаруженных в предопухолевых и опухолевых поражениях гортани ассоциированно с табакокурением.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Исследование генов, ассоциированных с регуляцией клеточного цикла и апоптоза, является весьма важным и перспективным при изучении опухолей гортани, особенно на ранних стадиях развития неоплазии. Полученные нами данные дают основание предположить, что нарушения в зоне локализации гена pl61NK4a являются достаточно ранним событием. При этом наибольшее число делеций выявляется в образцах дисплазий эпителия гортани различной степени тяжести, тогда как в других предраковых изменениях и доброкачественных опухолях гортани процент потери гетерозиготности значительно ниже. Структурные повреждения других не менее важных генов, таких как Rb и bcl-2 , являются скорее не инициирующими, а результатом общих нарушений стабильности генома и регуляции клеточного цикла, и, скорее всего в плоскоклеточном раке гортани не задействованы в трансформации клетки. Это подтверждает тот факт, что в основном все молекулярно-генетические нарушения, включая изменения уровня экспрессии данных генов, обнаруживались у больных с более поздними стадиями заболевания. Кроме того, необходимо учитывать влияние на геном экзогенных факторов, особенно, курения. Это актуально для опухолей верхних дыхательных путей, и в частности гортани, где связь между возникновением рака и действием канцерогенов табака считается доказанной. Полученные нами результаты, также свидетельствуют об этом, так как наибольшее количество генных альтераций выявлено в ДНК предопухолевых и опухолевых изменений именно курильщиков.

Любые исследования опухолей верхних отделов дыхательных путей требуют обязательного контроля на наличие инфекции папиломавирусов, особенно HPV высокого риска (16 и 18). Так как именно эти типы вируса способны блокировать функции основных генов, регулирующих клеточный цикл, что может привести к бесконтрольной клеточной пролиферации и переходу предракового изменения эпителия к злокачественной опухоли.

Таким образом, выявление и использование молекулярных маркеров, может иметь важное значение в практике клинической онкологии. На сегодняшний день, очевидно, что для дальнейшего совершенствования методов ранней диагностики, а также критериев оценки течения болезни и эффективности проводимых лечебных мероприятий в онкологии, необходимо объединение в рамках единых программ традиционных способов диагностики и лечения с современными методами молекулярно-генетического тестирования.

В результате анализа всех полученных результатов нам хотелось бы, в качестве заключения, предложить следующие практические рекомендации по алгоритму молекулярно-генетического исследования образцов, получаемых от больных предопухолевыми и опухолевыми заболеваниями гортани:

1. Учитывая фактор внутриопухолевой молекулярно-генетической гетерогенности, следует получать биоптаты, по крайней мере, в двух или трех зонах одного очага поражения, отстоящих друг от друга.

2. При исследовании молекулярно-генетических нарушений, необходимо учитывать, что изменения pl6INK4a являются наиболее ранними, и могут быть диагностическими, в то время как альтерации гена Rb происходят на более поздних стадиях, и связаны, скорее всего, с прогрессией заболевания.

3. При исследовании заболеваний гортани, необходимым является определение папилломавирусной инфекции, относящейся к группе высокого риска, особенно HPV 18 типа. Исследование HPV 6,11 типов является необязательным.

4. Учитывая, что канцерогены табачного дыма являются одним из важных факторов в этиологии опухолевых поражений слизистой оболочки гортани, следует анализировать мутации гена Ki-ras, являющиеся наиболее ранними изменениями, связанными с курением. Это не входило в цели описанного исследования, однако данное заключение сделано исходя из опыта и данных нашей лаборатории по исследованию рака легкого.