Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Клинико-экономическое обоснование скрининга и ранней диагностики рака толстой кишки в условиях регионарного консультативно-диагностического центра

„а

а

I/я прш'ньх рукописи

\

БУРЦЕВ ДМИТРИЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

КЛИНИКО-ЭКОНОМИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ СКРИНИНГА И РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ РАКА ТОЛСТОЙ КИШКИ В УСЛОВИЯХ РЕГИОНАРНОГО КОНСУЛЬТАТИВНО-ДИАГНОСТИЧЕСКОГО ЦЕНТРА

14.01.12 -онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени' доктора медицинских наук

—"оои757

Ростоп-иа-Дону - 2014

005550157

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Министерства здравоохранения Российской Федерации и государственном автономном учреждении Ростопскон области «Областной консультативно-диагностический центр»

Научным консультант: - д.м.н., профессор

К'нт Олег Иванович

Официальные оппоненты: - Хвастуном 1'о.мап Александрович

д.м.м., профессор ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава России, заведующий кафедрой онкологии с курсом онкологии ФУВ

Куликов Евгений Петрович

д.м.н., профессор ГГ>ОУ ВПО «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.Г1. Павлова» Минздрава России, заведующий кафедрой онкологии с курсом лучевой диагностики ФДПО

Кутуков Владимир Владимирович

д.м.н., профессор ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздрава России, заведующий кафедрой онкологии с курсом лучевой диагностики и лучевой терапии

Ведущая организации: ФГВУ «Московский научно-исследовательский

институт онкологии им. П.А. Герцена» Минздрава России

Защита диссертации состоится «30 » 2014 г. в часов на

заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д.208.083.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Министерства здравоохранения Российской Федерации (344037, г. Ростов-на-Доиу, 14-я линия, 63).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Автореферат разослан «_»_ 2014 г.

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций, д. м. п., профессор

В.В. Поздпнкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Колоректальный рак является широко распространенной в мире патологией, ежегодная заболеваемость достигает 1 миллиона случаев, а ежегодная смертность превышает 500 000 (Мерабишвили В.М., 2011). Колоректальный рак занимает второе место по смертности от злокачественных новообразований среди мужчин и женщин. По прогнозам абсолютное число случаев колоректального рака в мире в следующие два десятилетия увеличится в результате роста населения в целом и его старения, как в развитых, так и в развивающихся странах (Ганцев Ш.Х и соавт., 2012). В Российской Федерации распространенность заболеваний ободочной кишки значительна и достигает 32 случая на 100 тысяч населения, из них 11,3 случаев приходится на колоректальный рак (Циммерман Я.С., 2012). Тревожным является тот факт, что на 100 новых больных раком ободочной и прямой кишки приходится более 70 умерших: из них на 1-м году с момента установления диагноза - около 40% (Чалык Ю. и соавт, 2011). Данное обстоятельство обусловлено тем, что при первичном обращении пациентов к врачу запущенные формы рака (II1-IV стадии) диагностируются у 71,4% больных раком ободочной кишки и у 62,4% в случаях заболевания раком прямой кишки (Солодкий В. и соавт., 2012).

Степень риска возникновения колоректального рака меняется от страны к стране и даже в пределах одной страны. Она также разнится между отдельными лицами в зависимости от особенностей диеты, культуры, стиля жизни и наследственных факторов (Бредер В.В. и соавт., 2012, Циммерман Я.С., 2012). В связи с этим, существует высокая востребованность информации по региональным особенностям распространенности рака толстой кишки.

Под скринингом рака понимают применение различных методов исследования, позволяющих диагностировать опухоль па ранней стадии, когда еще нет симптомов болезни (Воробьев A.B., 2010). Целью скрининга является раннее активное выявление бессимптомного рака и его лечение (Егорепков В.В. и соавт., 2010). Скрининг опухолей в широких масштабах осуществляются на базе регионарных консультативно-диагностических центров. В онкологических

диспансерах и онкологических институтах усилия врачей в большей мере занимает лечение рака различных локализаций. В связи с этим, на областные диагностические центры ложится ответственная задача грамотной организации скрининга и ранней диагностики опухолей при содействии медицинских учреждений первичного звена.

К сожалению, уровень скрининга в странах с высоким риском колорек-тального рака, включая Россию, остается низким. Ошибки на догоспитальном этапе диагностики колоректального рака, несмотря на впечатляющий арсенал диагностических возможностей, достигают 87,8% (Имянитов Е.Н., 2011, 2012). Видимо, проблема заключена в отсутствии системности и достаточной кратности использования диагностических инноваций. Необходимость разработки логических схем, имеющих своей целью оптимизацию каждого этапа скрининга и диагностического процесса в выявлении рака толстой кишки, очевидна.

Стандартные возможности проведения скрининга колоректального рака у лиц со средним риском делают его экономически выгодным (Faivre J. et al., 2012). В сравнении со стоимостью проведения интенсивной химиотерапии запущенного рака с использованием большого количества лекарственных препаратов скрининг является более дешевым мероприятием (Hamilton W. et al., 2011). Однако, таких систематизированных сведений по соотношению цены и эффективности скрининга колоректального рака на базе областных консультативно-диагностических центров нет.

В связи с вышеизложенным, создание адекватных скрининговых и диагностических алгоритмов по выявлению колоректального рака на базе областных консультативно-диагностических центров является безусловно актуальной темой исследовательской работы, позволит повысить эффективность диагностики рака толстой кишки, с одной стороны, а с другой, уменьшить затраты на дорогие и неинформативные методы исследования.

Цель работы. Целью работы является оптимизация системы скрининга и ранней диагностики колоректального рака на основе внедрения новых диагно-

стических тестов, осуществления системности, последовательности и кратности обследований больных в условиях областного диагностического центра.

Задачи работы:

1. Провести ретроспективный анализ (за 2008-2012 гг.) диагностической чувствительности анализов кала на скрытую кровь при скрининге пациентов для выявления рака толстой кишки на базе областного консультативно-диагностического центра.

2. Разработать дизайн многоуровневой системы скрининга и ранней диагностики колоректалыюго рака на базе областного консультативно-диагностического центра путем применения серологических, молекулярно-гене-тнческих и эпигенетических исследований крови и ДНК колоноцитов, выделенных из кала.

3. Определить диагностическую значимость скрннннговых мероприятий начального этапа для выявления рака толстой кишки на основе определения уровня в крови раково-эмбрионального антигена, онкомаркеров СЛ-242 и СА-19-9.

4. Определить целесообразность использования эпигенетического теста на наличие метилированной ДНК гена SEPT9 в крови как скриппиговой методики и выявить зависимость результатов эпигенетического теста от стадии рака толстой кишки и локализации опухоли.

5. Выявить оптимальное сочетание скрининговых исследований начального этапа для разделения пациентов на группы риска по развитию рака толстой кишки, стратификации больных колорсктапьным раком по степени риска генерализации онкологического процесса.

6. Установить целесообразность проведения скрининга, основанного на определении уровня фекальных опухолевых маркеров, а также генетических и эпигенетических исследованиях ДНК колоноцитов, выделенных из кала.

7. Провести анализ течения заболевания н выживаемости у больных раком толстой кишки, диагностированным на доклинической стадии после скри-

шшгооых мероприятий, а также в группе пациентов с спмптомнммп проявлениями болезни.

8. Провести сравнительный анализ соотношения затраты / эффективность различных методик скрининга для выявления колоректального рака.

Научная новизна работы. В работе разработана методика многоуровневого скрининга колоректального рака с учетом риска развития заболевания на базе областного консультативно-диагностического центра. Изученные показатели распространенности рака толстой кишки среди больных областного консультативно-диагностического центра позволили оценить эффективность диагностической деятельности медицинских учреждений региона и определить высокую значимость областных консультативно-диагностических центров в выявлении онкологической патологии среди населения. В диссертации определена диагностическая ценность и эффективность нового скринингового теста по определению наличия метилированной ДНК гена 8ЕРТ9 в крови, реализованного на базе ГБУ РО «Областной консультативно-диагностический центр». В работе доказано, что эпигенетический тест по определению метилированной ДНК гена 8ЕРТ9 в крови обладает высокой чувствительностью для выявления ранних стадий колоректального рака и позволяет выявить рак толстой кишки вне зависимости от локализации опухоли. В исследовании доказано, что кровь как субстрат для определения метилированной ДНК гена 8ЕРТ9 адекватна, поскольку диагностическая эффективность метода при исследовании ДНК коло-ноцитов кала была сходной. В работе установлено, что предварительное анкетирование больных на предмет выявления наследственной предрасположенности и выявления факторов риска заболевания, симптомов дисфункции кишки, проведение анализа кала на скрытую кровь иммунохимическим методом позволяет стратифицировать больных по риску развития рака толстой кишки и ограничить излишние затраты па скрпнинговые мероприятия. Анализ результатов определения фекальных маркеров поражения толстой кишки позволил выработать стратегию дифференциальной диагностики воспалительного и онкологического поражения толстой кишки и разработать систему мониторинга больных с

воспалительными заболеваниями кишечника для своевременного выявления угрозы мапипшзацпи воспалительного очага. В работе впервые проведен сравнительный анализ соотношения цены-эффективности скрининга пациентов на колоректальнын рак и обоснованы затраты на проведение скршпшговых мероприятий.

Практическая значимость работы. Определена роль областных диагностических центров в системе поэтапного наблюдения и контроля за состоянием здоровья населения в отношении ранней диагностики рака толстой кишки как промежуточного элемента между первичным звеном здравоохранения и специализированными онкологическими стационарами. Расширен алгоритм скрипин-говых и диагностических мероприятий для выявления онкологической патологии толстой кишки. Доказана обоснованность внедрения эпигенетического теста на наличие метилированной ДНК гена 5ЕРТ9 в крови как скринпнговой методики с высокой диагностической значимостью п экономической оправданностью. С помощью клиннко-экономического анализа выделены методики с низкой диагностической эффективностью либо высокой экономической затратностью, что исключает их применение. Разработаны успешные комбинации скрпнипговых и диагностических тестов для выявления рака толстой кишки. Разработана система определения риска генерализации процесса, методика динамичного наблюдения за больными после проведения лечения в специализированных стационарах. Разработка дизайна послеоперационного мониторинга больных раком толстой кишки в зависимости от риска генерализации процесса повышает эффективность лечебной помощи пациентам в адекватном объеме. Достаточная кратность исследований, зависимость объема диагностики и наблюдения от степени риска, внедрение нового эпигенетического теста и успешная комбинация иммунохимиче-ских и молекулярно-генетических тестов, система контроля осуществления скршпшговых программ определяет практическую значимость разработанных инноваций по ранней диагностике рака толстой кишки.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Системность, преемственность взаимодополняющих диагностических этапов, использование различных комбинаций эффективных по диагностической ценности и экономичности методов исследования на разных этапах наблюдения и лечения больных раком толстой кишки позволяет объединить между собой скрининг, диагностику КРР и рациональное динамичное наблюдение в единую систему контроля за течением заболевания.

2. Диагностическая эффективность (точность) комбинаций скрининговых тестов для выявления рака толстой кишки выше по сравнению с проведением отдельных тестов. Мультипликативный эффект взаимодействия скрининговых методик позволяет приблизить их эффективность к эндоскопическому скринингу.

3. В основе скрининга для выявления больных раком толстой кишки лежит комплекснроваиие иммунохимического метода определения крови в кале н эпигенетического теста на метилат ДНК гена SEPT9 крови. Диагностический этап связан с проведением фиброколоноскопии с гистологическим исследованием колонобиоптатов. Динамичное наблюдение за пациентами после хирургического лечения КРР включает молекулярно-генетические и серологические тесты: идентификацию мутаций генов в колоноцитах, определение уровнен РЭА и СА-242 в крови. Серийное определение уровня фекального кальпротектина и опухолевого метаболита Tumor М2-РК, метилированной ДНК SEPT9 в колоноцитах кала у больных с предраковыми заболеваниями позволяет контролировать развитие опухоли.

Внедрение результатов исследования. Результаты диссертационного исследования были внедрены и использованы в работе лабораторного комплекса ГБУ РО «Областной консультативно-диагностический центр», диагностического отделения ГБОУЗ «Онкологический диспансер» Ростовской области и при чтении лекций на кафедре онкологии ГБОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава РФ.

Апробация работы. Апробация диссертации состоялась 2 августа 2013 г. на заседании Ученого Совета Ростовского научно-исследовательского онкологического института.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.01.12-«онкология». Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования данной специальности, конкретно пункту 3 паспорта научной специальности (Разработка и совершенствование программ скрининга и ранней диагностики).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них - 12 в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем н структура диссертации. Диссертация изложена па 244 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, характеристики клинического материала и методов исследования, 4 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 301 источник, включая 248 зарубежных. Работа содержит 96 таблиц, 62 рисунка и 3 схемы.

Материалы п методы исследования В исследование включено 7853 пациентов, обследованных в ГБУ РО Областной консультативно-диагностический центр г. Ростова-на-Дону за 2008-2012 гг. по системе скрининга, и 213 больных, которые самостоятельно обратились в специализированные онкологические учреждения с кишечными либо общими системными жалобами. На первом этапе исследования формировали две группы больных раком толстой кишки в зависимости от наличия скрининговых мероприятий. Основную группу пациентов составили 204 больных, у которых рак толстой кишки был выявлен при проведении скрининговых мероприятий у 7853 пациентов, направленных на обследование врачами центра после анализа факторов риска заболевания, и далее диагноз был подтвержден с помощью фпброколоноскопии с гистологическим исследованием биоптатов. В группе скрининга клинических проявлений заболевания не было,

жалоб на дисфункцию толстой кишки пациенты не предъявляли. Таким образом, фиброколоноскопию больным проводили при отсутствии их первоначальной инициативы в результате направления врачей. Контрольную группу составили 213 больных раком толстой кишки, которым при наличии кишечных и системных жалоб в результате активных диагностических мероприятий (по одновременной инициативе больного и врача), у пациентов был выявлен рак толстой кишки. Таким образом, условное название основной группы -группа скрининга, а контрольной - группа активной диагностики при клинических проявлениях болезни.

В ходе работы была использована многоуровневая система скрининга рака толстой кишки в основной группе. Скрипппговые мероприятия на первом этапе объединяли иммунохроматографическин тест кала на скрытую кровь (СКК), определение онкомаркеров в крови (раково-эмбрионального антигена, онкоантигенов СА 19-9, СА 242), метилированной ДНК гена септина 9 в крови. Из перечисленных методик определение метилированной ДНК гена септина 9 в крови находится на стадии апробации в ряде зарубежных клиник (США, Швейцария), но до момента настоящего исследования не использовалась ни в одной из российских клиник.

Отличительной чертой следующего этапа разработанной системы скрининга явилось то, что основным объектом последующего исследования у пациентов среднего и высокого риска колоректального рака по результатам первого этапа скрининга, явилась ДНК колоноцитов кала. В ряде ведущих онкологических центров молекулярно-генетические исследования у больных при подозрении на рак толстой кишки проводят па биопсийных образцах, полученных при колоноскопии. Но колоноскопия относится к методам диагностики, верификации заболевания, а не к скринпнговым мероприятиям. Поэтому генетическое и эпигенетическое исследование ДНК колоноцитов, слущенных с поверхности нормальной и патологически измененной слизистой оболочки толстой кишки, определение копрологических иммунологических маркеров органического поражения кишки максимально приближено к самому понятию скрининга.

На втором этапе скрининга были подключены методики: исследование мутаций генов ТР53 и КЯАБ ДНК выделенных колоноцитов из кала, выявление метилата гена БЕРТ9 в ДНК кала, копрологический тест на димерную М2-пнруваткиназу, количественное определение содержания кальпротектина в образцах стула (для дифференциальной диагностики с колитами, включая неспецифические, а также для выделения контингента больных с высоким риском малигнизации).

Для выделения колоноцитов из кала использовали метод иммуномагнит-ной сепарации клеточного материала с использованием магниточувствитель-ных микросфер, покрытых моноклональными антителами. Этот метод обладает высокой избирательностью по отношению к колопоцитам, что позволяет избавиться от значительной части ДНК бактериального происхождения и примесей.

В ходе исследования были выявлены комбинации из различных скринин-говых методик, обладающих максимальной диагностической чувствительностью и специфичностью, разработана система стратификации больных по риску колоректалыюго рака в зависимости от результатов исследования.

На заключительном этапе диагноз рака толстой кишкп подтверждали путем проведения колоноскопип с гистологическим исследованием биоптатов.

В основной и контрольной группах изучали выживаемость больных, сроки генерализации онкологического процесса, определяли прогноз прогрессиро-вания рака толстой кишкп в зависимости от результатов скрининговых исследований. Кроме того, проводили сравнительный анализ соотношения цепа-эффективность скрининга колоректалыюго рака у больных основной и контрольной групп.

После изучения эффективности всех диагностических этапов система скрининга рака толстой кишки подвергалась оптимизации и часть методик с начальных этапов скрининга перемещались на конечный этап, а фпброколоно-скопия - с третьего этапа на второй. Таким образом, скрпнинговая эффективность части методик была пересмотрена и повышалась их значимость для контроля течения болезни.

В основной группе мужчин было 99 (48,5%), а женщин - 105 (51,5%). В контрольной группе число мужчин было 96 (45,1%), а женщин - 117 (54,9%).

Средний возраст пациентов основной группы составил 61,4±1,56 года, а в контрольной группе 63,7±1,5б лет.

Распределение больных раком толстой кишки основной и контрольной групп с учетом стадии опухолевого заболевания отражено в таблице 1.

Таблица 1

Распределение больных раком толстой кишки исследуемых групп с учетом стадии опухолевого заболевания

Стадии Основная группа Контрольная группа Р

абс. ч. % абс. ч. %

I 45 22,1 3 1,4 <0,05

11 141 69,1 24 11,3 <0,05

III 18 8,8 154 72,3 <0,05

IV - - 32 15,0 -

Всего 204 100,0 213 100,0

На момент постановки диагноза в основной группе преобладала II стадия заболевания (69,1%), а в контрольной группе - III стадия (72,3%) (табл.1). В основной группе I стадия заболевания встречалась чаще (р<0,05), чем в контрольной группе (22,1% против 1,4%), а IV стадия не наблюдалась. В контрольной группе IV стадия встречалась в 15%.

Распределение больных основной группы с учетом классификации TNM представлено в таблице 2.

Таблица 2

Распределение больных раком толстой кишки исследованных групп с учетом классификации TNM

Стадии INM Основная группа Контрольная группа Р

абс.ч. % абс.ч. %

T1N0M0 21 10,3 1 0,5 <0,05

T2N0M0 141 69,1 2 0,9 <0,05

T3NUM0 24 11,8 9 4,2 >0,05

T4N0M0 - - 15 7,0 -

T3N1M0 12 5,9 85 39,9 <0,05

T3N2M0 6 2,9 69 32,4 <0,05

T3N1M1 - - 24 11,3 -

T4N2M1 - - 8 3,8 -

Всего 204 100,0 213 100,0

Опухоли больных раком толстой кишки имели различную глубину инвазии в кишечную стенку. В основной группе прорастание слизистого и подсли-зистого слоев (Т,) наблюдали у 21 (10,3%) больного, врастание опухоли в мышечную оболочку (Т2) -у 141 (69,1%) пациентов, прорастание всех слоев стенки кишки (Т3) - у 42 (20,6%) больных. В контрольной группе прорастание слизистого и подслизистого слоев (Т,) встречали у 1 (0,5%) больного, врастание опухоли в мышечную оболочку (Т2) - у 2 (0,9%) пациентов, прорастание всех слоев стенки кишки (Т3) - у 187 (87,8%) больных, прорастание всех слоев стенки кишки и окружающей жировой клетчатки (Т4) - у 23 (10,8%) больных.

Наличие регионарных метастазов в перпколярных лимфоузлах (Ы|-Ы2) отмечено у 18 (8,8%) пациентов основной группы и у 186 (87,3%) больных контрольной группы. Прорастание опухоли в соседние органы и ткани (мочевой пузырь, матку, тонкую кишку) наблюдалось у 15 (7%) больных контрольной группы. Прорастание опухоли, включая отдаленные органы и ткани обнаружили у 32 (15%) больных контрольной группы.

При гистологическом исследовании бнопсийного материала у всех больных была диагностирована аденокарцинома толстой кишки различной степени дифференцировки (табл. 3).

Таблица 3

Распределение больных раком толстой кишки исследуемых групп с учетом степени дифференцировки опухоли

Степень дифференцировки Основная группа Контрольная группа Р

абс.ч. % абс.ч. %

Низкая 24 11,8 29 13,6 >0,05

Средняя 138 67,6 146 68,5 >0,05

Высокая 42 20,6 38 17,8 >0,05

Всего 204 100,0 213 100,0

В основной и контрольной группах преобладали опухоли средней степени дифференцировки (67,6 и 68,5%,соответственно). Низкодифференцирован-ные опухоли в основной и контрольной группах встречались, соответственно, в 11,8 и 13,6%. В двух наблюдениях в одной и той же опухоли имелись участки

различной степени дифференцировкп, в результате чего выбиралась дифферен-цировка с более низкой градацией.

Анализ частоты различных локализаций рака толстой кишки у больных основной и контрольной групп показал, что в обеих группах пациентов чаще других локализаций выявлялся рак сигмовидной и прямой кишки. На третьем и четвертом месте по встречаемости были злокачественные новообразования поперечной ободочной и слепой кишки. Достоверные различия по частоте рака разной локализации в сравниваемых группах отсутствовали.

При проведении работы были использованы следующие методы исследования:

- статистический - при расчете необходимого количества пациентов для скрининга рака толстой кишки;

- анализ кала на скрытую кровь с помощью иммунохроматографическо-го теста (Hexagon OBTI). Для заключения о наличии крови использовали предел количества гемоглобина в кале в 50 и 100 нг/мл;

- определение уровней онкомаркера раково-эмбрионалыюго антигена (РЭА), онкоантигена СА 19-9 в крови базировалось на принципе иммупоанали-за «сэндвич» с использованием сухих реакционных компонентов TOSOH AIA, фиксированных на магнитных частицах-носителях и детекцией реакции методом 2-х волновой флюоресценции с помощью автоматизированного иммуно-ферментного анализатора AIA (TOSOH Bioscience, Япония);

- определение уровня онкоантигена СА 242 в сыворотке крови проводили с помощью твердофазного неконкурентного метода ИФА с использованием реагентов «CanAg СА 242» («CANAg Diagnostics», Швеция);

- для выделение ДНК колопоцитов из образцов кала для проведении генетических п эпигенетических исследований использовали метод иммуномаг-нптной сепарации клеточного материала с использованием магниточувстви-тельных микросфер (ММС), покрытых моноклональными антителами, фирмы Invitrogen (DynabeadsR Epithelial Enrich DYNAL);

- для секвенировапия первичной структуры фрагментов генов ТР53 - 4-8 экзон гена и гена KRAS - 12 и 13 кодон использовали набор ABl PrisniR BigDyc™ Terminator CycIeScquencing Ready Reaction Kit с последующим разделением продуктов реакции секвенировапия на автоматическом секвенаторе ABI PrismR 3 100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США; Hitachi Япония);

- качественный анализ наличия метилата гена SEPT9 в крови и колоно-цитах кала проводили, используя протокол Epi proColon теста (Epigenomics AG, Berlin, Germany) для ПЦР в реальном времени. ПЦР в реальном времени выполнена на амплнфнкаторе (Abbott Molecular, Швейцария);

- опухолевую М2-пируваткпназу (Tumor М2-РК) в каловых экстрактах определяли при помощи количественного ИФА-теста сэндвич-тина (ScheBo ® Tumor М2-РК (TM) ), который основан на использовании двух типов монокло-нальных антител ( ScheBo ® Biotech AG , Германия);

- количественное определение содержания кальпротектина в образцах кала (ФК) проводили иммуноферментным анализом (ELISA) типа «сэндвич» с помощью стандартных наборов Buhlmann Quantum Blue® (Швейцария).

Фиброколоноскопня (ФКС) выполнялась с использованием вндеоин-формацнонных систем V-70, EVIS EXERA и EVIS EXERA-2 «OLYMPUS» (Япония), оснащенных видеоколоноскопами. При этом, по показаниям при выявлении патологических объектов применяли, кроме стандартной, магнн-фнкационную эндоскопию с использованием видеоколоноскопа CF-180AI с функцией 74-х электронного увеличения без потери качества, что делало возможным различать мельчайшие структуры слизистой и позволяло проводить исследование близкое по качеству к микроскопическому, а также узкоспектральную эндоскопию с помощью видеоколоноскопов «180» для коррекции изображения. При проведении колоноскопин прицельно забирали биоп-таты толстой кишкн для последующего гистологического исследования. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином, проводили световую микроскопию.

Анализ продолжительности жизни больных основной и контрольной групп с построением кривых вероятности выживаемости проводили по методу Каплана-Мейера с помощью соответствующего модуля в системе компьютерной математики Statistica 7.0. Сравнение кривых выживаемости в различных группах пациентов, построенных по методу Каплаи-Майера, проводилось с использованием логарифмического рангового критерия. Различия считались достоверными при р<0,05 (95% точности). Влияние ряда факторов на выживаемость проводилась с помощью регрессионной модели Кокса. Математическая аппроксимация между вероятностью риска прогрессировать рака толстой кишки и онкомаркерами осуществлялась с помощью множественного логистического регрессионного анализа.

При выполнении клинико-экономического анализа в основной и контрольной группах подсчитывали прямые и непрямые затраты на осуществление скрининга и проведение лечения. Показатель соотношения «затраты / эффективность» рассчитывали по формуле: CER = С / Ef, где CER показывает затраты, приходящиеся на единицу эффективности; С - затраты на лечение одного пациента; Ef - вероятность достижения эффекта лечения (соответствует выбранному индивидуально для каждого исследования критерию эффективности в %). В качестве критерия эффективности была выбрана выживаемость в %. Наиболее эффективным является вмешательство с наименьшим коэффициентом затратной эффективности.

Для расчета чувствительности, специфичности, эффективности (точности) диагностических тестов, нахождения диагностической точки разделения использовали ROC-анализ (Receiver Operating Characteristic). Значения площади под ROC- кривыми (Area Under Curve, AUC) позволяли оценить качество диагностических тестов. ROC-анализ проводили с помощью программы MedCalc (версия 9.3.5.0).

Результаты исследования и их обсуждение

Параметры ROC-анализа диагностической значимости методов начального этапа скрининга рака толстой кишки представлены в таблице 4.

Таблица 4

Показатели КОС-аналнза диагностической значимости методов начального этапа скрининга рака толстой кишки

Метод скрининга ДЧ ДС ДЭ лис г-стати-стнка, р

Тест на скрытую кровь при пороге 50 нг/мл 41,9 94,9 93,1 0,613±0,0132 г=2,4 р=0,04

Тест па скрытую кровь при пороге 100 нг/мл 63,0 91,1 90,1 0,645±0,0241 г=2,9 р=0,02

СА19-9 27,9 87,5 51,7 0,602±0,0324 7= 1,2 р=0,13

СА 242 41,7 83,9 50,8 0,632±0,0658 г=5,0 р=0.0001

РЭА 48,0 87,5 40,4 0,746±0,0468 г=5,2 р=0,0001

8ЕРТ9 крови 85,3 91,1 86,5 0,821±0,0287 г=5,13 р=0,0000

Примечание: ДЧ - диагностическая чувствительность, ДС - диагностическая специфичность, ДЭ - диагностическая эффективность, А11С - площадь под КОС-кривой, /.статистика - критерий доверительной значимости теста при доверительной вероятности р.

Величины диагностической чувствительности методов начального этапа скрининга рака толстой кишки представлены на рисунке 1.

Диагностическая чувствительность

СА 19-9 СА 242

РЭА СКК (50 СКК(100 ЭЕРТЭ нг/мл) нг/мл)

Рис. 1. Диагностическая чувствительность методов начального этапа скрининга рака толстой кишки

Низкая диагностическая чувствительность отдельного использования скрининговых методов была отмечена для онкомаркеров СА 19-9 (27,9%), СА

242 (41,7%), РЭА (48%), теста на скрытую кровь в кале при пороговом значении гемоглобина 50 нг/мл (41,9%). Диагностическая чувствительность теста на скрытую кровь в кале у пациентов для выявления рака толстой кишки при уровне 100 нг/мл возрастала до 63%. Наиболее перспективной скрининговой методикой был тест на наличие в крови метилированной ДНК гена 8ЕРТ9. Диагностическая чувствительность этого теста составила 85,3%.

На рисунке 2 отражена совокупность ЯОС-кривых методов 1 этапа скрининга рака толстой кишки.

О 20 40 60 80 100 100-Зрес№сИу

Рнс. 2. Сравнительный анализ ЯОС-кривых методов 1 этапа скрининга рака толстой кишки

ЯОС-кривая, соответствующая тесту на метилат ДНК гена БЕРТ9 в крови, отличалась высокими значениями диагностической чувствительности и специфичности. В результате площадь под ЯОС-кривой эпигенетического теста имела высокое значение (АиС=0,821±0,0287) и статистически значимо (р<0,05) отличалась от аналогичных величин других методов начального этапа скрининга — анализа кала на скрытую кровь при пороговом значении 100 нг/мл (0,645±0,0241), определения уровня в крови онкомаркеров СА-19-9 (0,602±0,0324), СА 242 (0,632±0,0658), РЭА (0,746±0,0468).

Среди больных основной группы при I стадии заболевания положительный результат теста на метилат ДНК гена 8ЕРТ9 в крови был выявлен у 34

100

80

тЗЕРТЭ РЭА СА 242 СКК

(75,6%), II стадии -у 123 (87,2%), III стадии - у 17 (94,4%) пациентов. Чувствительность эпигенетического теста при I стадии была 75,6%, II стадии - 87,2%, III стадии - 94,4%. Таким образом, диагностическая значимость эпигенетического теста на ранних стадиях колоректалыюго рака была высокой. С повышением стадии рака толстой кишки от I к III чувствительность изучаемого тсста повышалась с 75,6 до 94,4% (р<0,05).

На следующем этапе была изучена взаимосвязь между локализацией рака толстой кишки и чувствительностью тсста по выявлению метилированной ДНК гена SEPT9 в крови (табл. 5).

Таблица 5

Гезультаты тсста по вылвлс.....о метилированной ДНК гена SIÍPT9 в крови

у больных раком толстой кишки в завпснмостиог локализации опухоли

Локализация рака толстой кишки Общее число больных Число больных с положительным результатом тсста Диагностическая чувствительность теста, %

Слепая кишка 22 21 19 95,5

Восходящая ободочная кишка 19 17 89,5

Печеночный изгиб 12 10 83,3

Поперечная ободочная кишка 23 15 65,2

Селезеночный изгиб 2 2 100,0

Нисходящая ободочная кишка 11 10 90,9

Сигмовидная кишка 52 44 84,6

Поражение ободочной кишки, выходящее за пределы одной и более вышеуказанных локализаций 1 1 100,0

Ободочная кишка нсуточненной локализации 3 1 33,3

Ректосигмовидное соединение 15 13 86,7

Прямая кишка 44 40 90,9

Всего 204 174 85,3

Анализ данных таблицы 5 показал, что результаты Epi proColon теста не зависели от локализации рака толстой кишки. В труднодоступных местах толстой кишки, где при фиброколоноскопии существуют определенные затруднения для выявления опухоли, положительные результаты теста выявлялись в 83,3-100%.

Таким образом, определение в крови метилированной ДНК гена SEPT9 эффективно при ранних стадиях рака толстой кишки, а также при проксимальной локализации опухоли.

В результате исследования было выявлено, что диагностической точкой разделения РЭА, при превышении которой повышается вероятность выявления рака толстой кишки, была величина 11,9 иг/мл. При достижении этой величины чувствительность метода соответствовала 48%, а специфичность - 87,5%. Чувствительность изучаемого метода зависела от стадии заболевания. При I стадии чувствительность составила 20%, II стадии - 53,2% и III стадии - 77,8%. У больных раком толстой кишки при распространении опухолевого процесса на лимфатические узлы уровень РЭА в крови возрастал практически вдвое (р<0,001) - 56,7±1,5 против 25,9±1,2 иг/мл. Степень дифференцировки опухоли также прямо пропорциапьно влияла на уровень РЭА. После хирургического лечения в ранний послеоперационный период уровень РЭА в крови у больных достоверно снижался (р<0,001) с 2б,8±1,9 до 8,3±0,8 нг/мл. В отдаленном периоде наблюдения содержание оикоантигена в крови зависело от наличия рецидива или метастазов заболевания. При прогрессировании опухолевого процесса уровень РЭА статистически значимо возрастал до 72,1±1,7 нг/мл. У больных без рецидивов заболевания через 3 года после операции уровень РЭА был значительно ниже - 15,8±0,6 нг/мл. Таким образом, для выявления рака толстой кишки диагностическая чувствительность теста по оценке уровня РЭА в крови была недостаточной. Однако, уровень РЭА крови отражает степень распространенности опухолевого процесса, его серийное определение в послеоперационном периоде хирургического лечения рака толстой кишки позволяет предположить рецидив заболевания при многократном повышении концентрации оикоантигена в крови.

На следующем этапе у больных скрининговой группы изучали эффективность определения в крови карбогидрат-антигена СА-242. Изучение ROC-кривых показало, что диагностической точкой разделения СА-242, при превышении которой повышается риск наличия рака толстой кишки, была копией-

трация 23 Е/мл. При достижении этой величины чувствительность метода соответствовала 41,7%, а специфичность - 83,9%. При верхней границе нормы 15 Е/мл чувствительность теста была крайне низкой, а специфичность - высокой, что привело бы при соблюдении такой точки разделения к гиподиагности-ке. Диагностическая чувствительность метода определения СА-242 в крови повышалась при 111 стадии заболевания. При 1 стадии диагностическая чувствительность составила 33,3%, II стадии -43,3% и 111 стадии - 50%. У больных раком толстой кишки при распространении опухолевого процесса на лимфатические узлы уровень СА-242 в крови возрастал незначительно (р>0,05) - с 34,7±2,1 до 41,7±1,5 Е/мл. Степень дифференцировки опухоли не влияла на уровень СА-242 в крови. После хирургического лечения в раннем послеоперационном периоде уровень СА-242 в крови у больных снижался с 35,2±1,7 до 20,7±1,9 Е/мл (р<0,05). В отдаленном периоде наблюдения при развитии метастазов содержание оикоаптигепа в крови возрастало в 4 раза до 80,5±1,6 Е/мл. У больных без рецидивов заболевания через 3 года после операции уровень СА-242 достоверно не изменялся и составил 23,9±1,5 Е/мл. Таким образом, только по определению СА-242 в крови скрпиинг рака толстой кишки является неэффективным. Концентрация СА-242 коррелировала со стадиями заболевания и отражала распространенность опухолевого процесса, что определяет целесообразность динамичного серийного учета СА 242 в крови после операции у больных раком толстой кишки.

На следующем этапе определяли диагностический уровень карбогидрат-антигена СА 19-9 в крови для выявления больных раком толстой кишки. Диагностической точкой разделения была концентрация СА 19-9 в 46 U/мл. При содержании СА 19-9 в 46 U/мл чувствительность и специфичность составили, соответственно, 27,9 п 87,5%. Диагностическая чувствительность метода определения СА 19-9 в крови составила при I стадии рака толстой кишки -17,8%, II стадии - 27,6% и III стадии - 55,5%. У больных раком толстой кишки при распространении опухолевого процесса на лимфатические узлы повышенный уровень СА 19-9 в крови наблюдался в 88,9% и значительно возрас-

тал по сравнению с больными без поражения лимфатических узлов - на 61,3%. Степень дифференцировки опухоли, как и в случае СА-242, не влияла на уровень СА 19-9 в крови. После хирургического лечения в раннем послеоперационном периоде уровень СА 19-9 в крови у больных снижался с 62,1±2,1 до 44,1±2,5 и/мл. В отдаленный период наблюдения при развитии у больных метастазов содержание онкоантигепа в крови возрастало с 62,1±2,1 до 86,3±2,3 и/мл. У больных без рецидивов заболевания через 3 года после операции уровень СА 19-9 достоверно не изменялся и составил 47,2±1,9 и/мл. Таким образом, самая низкая диагностическая эффективность в отношении скрининга рака толстой кишки была характерна для СА 19-9. Однако, концентрация СА 19-9 изменялась сопряжено со стадией заболевания, уровень онкоантигепа отражал распространенность опухолевого процесса на лимфатические узлы и повышался при развитии рецидивов и метастазов рака толстой кишки.

Низкая диагностическая эффективность серологических методов скрининга рака толстой кишки обусловливала необходимость исследования значимости их совместного определения для выявления колоректального рака в комбинации с эпигенетическими опухолевыми маркерами.

Комплексное использование методов скрининга рака толстой кишки приводило к последовательному возрастанию их совместной диагностической ценности. Исключение составило сочетание определения онкогенов СА 242 и СА 19-9. При таком сочетании серологических методов скрининга диагностическая чувствительность не изменялась по сравнению с одиночным применением методов.

Эффективной программой I этапа скрининга оказался комплекс методов, включающих анкетирование для выяснения наличия наследственной предрасположенности к заболеванию и факторов риска рака толстой кишки, иммуно-хроматографическнй анализ кала на скрытую кровь при пороговом значении 100 нг/мл и определение наличия метилата ДНК гена БЕРТ9 в крови (чувствительность - 89,2%, специфичность - 92,9%, эффективность - 90%).

Кроме того, была разработана модель объективизации прогноза рака тол-стоп кишки у больных по результатам тестов на СКК, MSEPT9, определения уровней РЭА и СА-242 в крови (диагностическая чувствительность - 87,3%).

Математическое выражение модели было следующим:

р = 0,17-0,16*X1+0,002*X2+0,003*X3+0,79*X4, где р - вероятность рака толстой кишки,

XI - результат анализа кала на СКК при пороговом значении 100 нг/мл (1 - положительный, 0 - отрицательный), Х2 - уровень РЭА крови в нг/мл, ХЗ - уровень СА 242 крови в Е/мл,

Х4 - результат теста на метилат ДНК гена SEPT9 в крови (1 - положительный, 0 - отрицательный).

Детерминационная значимость разработанной модели была высокой, поскольку коэффициент детерминации составил R2=0,89 (р<0,001). Следовательно, созданная регрессионная модель в 89% предопределяла величину вероятности развития рака толстой кишки после начального этапа скрининга. Критерий Фишера F составил 35,6 (р<0,001), что указывало на высокую статистическую значимость регрессионной модели. Таким образом, прогноз прогрессировать болезни после операции был возможен уже при анализе результатов начального этапа скрининга.

На следующем этапе работы была изучена диагностическая ценность генетических и эпигенетических исследований колоноцитов кала. В результате было установлено, что диагностическая чувствительность методик одновременного определения мутаций в генах ТР53 или K-RAS составляла 60,3%, теста на метилат ДНК гена SEPT9 в колоноцитах - 88,7%, определения уровня фекального кальпротектина - 74% и опухолевого метаболита Tu М2-пируватки-назы в кале - 79,4% (рис. 3).

В нашем исследовании было установлено, что только одновременное определение мутаций в генах ТР53 или K-RAS позволяет достичь повышения диагностической ценности метода. Так, прп исследовании мутаций в двух генах

диагностическая чувствительность составила 60,3%, а диагностическая эффективность 68,8%.

Диагностическая чувствительность

ТР 53 К^АБ ТР53+ К- Ти М2-РК ФК ИАБ

Рнс. 3. Диагностическая чувствительность коирологических методов скрининга рака толстой кишки

Исследование в пределах одного гена не имело высокой эффективности (38,7 и 21,6%, соответственно для ТР53 или К-ЯАБ). Повышение стадии онкологического процесса было сопряжено с более частой выявляемосгыо патологических мутаций. Таким образом, мутации в генах ТР53 или К-ЯАБ информативны при оценке стадийности опухолевого роста. Проведение генетических исследований по выявлению мутаций в генах ТР53 или К-ЯАЭ показано в группах высокого и очень высокого риска. Так, диагностическая чувствительность метода в группе высокого риска была 68,5%, а в группе очень высокого риска - 71,6%. В группах низкого и среднего риска использование генетических методов было нерезультативным. Кроме того, малое число пациентов с патологическими мутациями генов ТР53 или К-ЯАБ в ДНК колоноцитов кала при 1 стадии рака толстой кишки свидетельствовало о проблемности использования генетических методов как скрининговых.

Показатели диагностической значимости коирологических методов скрининга рака толстой кишки обобщены в таблице 6.

Таблица 6

Показатели 1ЮС-апалта диагностической значимости к-опрологпчсаспх методов скрннпнга рака толстой ктшпеп

Метод скрининга ДЧ ДС ДЭ AUC z-стати-стика, р

Мутации в генах ТР53 пли K-RAS 60,3 100,0 68,8 0,683±0,047 z=2,6 р=0,03

Tumor М2-РК 79,0 87,5 81,2 0,85±0,0676 z=5,3 р=0,0001

ФК 74,0 92,9 78,1 0,731±0,089 z=2,6 р=0,009

SEPT9 колопоцитов кала 88,7 96,4 90,4 0,878±0,0319 z=5,5 р=0,0000

Примечание: ДЧ - диагностическая чувствительность, ДС - диагностическая специфичность, ДЭ - диагностическая эффективность, АЫС - площадь под 1ЮС-кривой, Ъ-статистика- критерий доверительной значимости теста при доверительной вероятности р.

Наибольшая диагностическая эффективность среди копрологических методов скрининга была установлена для определения ДНК метилата ЯЕРТ9 в ко-лоноцитах кала. Показатель площади под ЯОС-кривой АиС для выявления наличия БЕРТ9 в колоноцитах кала (0,878±0,0319) был достоверно выше по сравнению с серологическим методом по определению ФК (0,731 ±0,089) и генетического исследования по выявлению мутаций в генах ТР53 или К-ЯАБ (0,683±0,047).

Высокие экономические затраты на проведение генетических и иммунологических исследований на колоноцитах позволяют рекомендовать их использование у больных с полипами толстой кишки, колитами и раком толстой кишки, диагностированными после ФКС, для уточняющей диагностики и определения исходных уровней маркеров для последующего мониторинга и прогнозирования течения заболевания.

Для интерпретации результатов фекальных иммунологических тестов у больных при скрининге рака толстой кишки были разработаны дискриминант-ные модели. При использовании модели для интерпретации результатов скрининга индивидуальные показатели фекальных тестов больного нужно внести в каждое из трех уравнений для функций Р1, Р2, РЗ и рассчитать три значения Р.

F1 =0,063 «ФК+ 0,68* Tu M2-PK - 25,3

F2=0,064*OK+ 0,033* Tu M2-PK- 10,3

РЗ=0,013*ФК+ 0,57* Tu M2-PK- 11,4,

где ФК — фекальный кальпротектин в мг/г, Tu М2-РК - уровень Tu М2-пируваткиназы в кале в Ед/мл.

F1 соответствует заключению о высоком риске рака толстой кишки на фоне воспалительных заболеваний кишечника, F2 - заключению о низком риске рака толстой кишки, но высоком риске неспецифических колитов, F3 - решению о высоком риске рака толстой кишки при отсутствии воспалительных явлений в толстой кишке. Полученные значения трех классификационных функций сравнивают между собой и делают вывод в пользу той функции и заключения, при которой полученный F имеет максимальное значение, т.е. дис-криминантная мощность является наиболее высокой.

Превышение маркера органического поражения кишки кальпротектипа свыше 57 мг/г и опухолевого метаболита Tumor М2-РК выше 21 Ед/мл, положительные результаты теста исследования ДНК колоноцитов кала на мутации генов ТР53 и KRAS, наличие метилированной ДНК SEPT9 являются основанием для определения пациента в группу очень высокого риска по наличию рака толстой кишки. Схема интерпретации результатов фекальных иммунологических тестов представлена на рисунке 4.

Фекальные иммунологические тесты

Фекачьный кальпротектин (ФК) Фекальный Tumor М2-РК (Tu М2-РК)

ТТФК, f t Tu М2-РК ТТФК, Tu М2-РК в ТФК, TTTu М2-РК ФК в N, TfTu М2-

N РК

Д ü Д

Высокий риск рака ВЗК с низким Высокий риск РТК Высокий риск РТК

толстой кишки на риском рака тол- без воспалительного без воспалительного

фоне ВЗК стон кишки компонента компонента

Примечание: ВЗК - воспалительные заболевания кищки

Рис. 4. Схема интерпретации результатов фекальных иммунологических тестов

Таким образом, одновременное определение в кале кальпротектина и Tumor М2-РК важно для выделения при скрининге не только больных с высоким риском рака толстой кишки, но и пациентов с воспалительными заболеваниями кишки и высокой вероятностью малнгнпзации предраковых изменений стенки кишки.

После всестороннего изучения диагностической эффективности скринин-говых методов, нами была оптимизирована поэтапная система скрининга рака толстой кишки (рис. 5).

I этап скрининга рака толстой кишки: анкетирование, кал на скрытую кровь, мДНК ВЕРТ9 крови. Пациенты направляются из поликлиник области и города в областной консультативно-диагностический центр, где реализуется

Наследственная предрасположенность, факторы риска (1+)

1 этап скрининга

Ф

Kilt на СКК (2+)

мДНК SEPT9 крови (3+)

(ГЬ

И этап скрининга: проведение фиброколоноскотш. Пациенты при положительных пробах направляются на фнброколоноскопию. Место проведения «золотого» стандарта диагностики рака толстой кишки - областной консультативно-диагностический центр.

Полипы, колиты

Ф

111 этап

Ф

Определение фекальных маркеров - маркера органического поражения кишечника кальпротектина и опухолевого метаболита Tumor М2-РК; исследование тотальной ДНК крови на наличие метилированной ДНК SEPT9.

Цель III этапа - проведение диффереицналь-ной диапюстики и контроля малнгничации

Рак толстой кишки

Ф

III этап

Ф

Исследование ДИК колоноцптов кала на мутации генов ТР53 и K.RAS, количественное определение уровня РЭА, CA 242 в крови.

Цель III этапа — уточняющая диагностика, исходные показатели для дальнейшего мониторинга, прогнозирование течения забо-леванняв послеоперационном периоде_

Рис.5. Оптимизированная схема скрининга рака толстой кишки

Разработанные нами скрининговые программы включают неинвазнвные тесты, доступные к выполнению как для обследуемого, так и для врача, обладающие оптимальным соотношением чувствительности и специфичности, эффективности и затратности. Кроме того, возрастание в крови содержания не-

следуемых опухолевых маркеров поставляет дополнительную информацию о степени распространенности опухолевого процесса и, что особенно важно, об эффективности проведенного лечения в дальнейшем при их мониторировании. Периодическое исследование опухолевых маркеров после окончания лечения дает возможность заподозрить развитие рецидива опухолевого процесса раньше традиционно используемых в онкологии методов диагностики.

Отдаленная выживаемость больных оценивалась с помощью метода по Каплану-Мейеру. На рисунке 6 представлена динамика общей выживаемости по Каплану-Мейеру в обеих изучаемых группах. Общая выживаемость больных в основной группе была достоверно выше по сравнению с контрольной группой (Log-Rank test 5,048, р=0,0000001).

Общая выживаемость (Kaplan-Meier) • Летальный исход в основной группе о - Летальный исход в контрольной группе

\...........

1 .............

\ 1,

\ \

048 %...........

р-0 0000001 V

0 1 2 3 4 5 6 7

Продолжительность наблюдения в годах

Рис. 6. Динамика общей выживаемости по Каплану-Мейеру в исследуемых группах

В таблице 7 отражены параметры оценки % выживания и кумулятивной доли выживания по Каплану-Мейеру па различных интервалах. Данные величины отражали относительную и кумулятивную долю выживания больных на каждом интервале при условии, что в начале интервала пациент был жив.

В основной группе медиана ожидаемого времени жизни с учетом общего количества летальных исходов составляла 4,8 года, а в контрольной группе -

4,2 года. Показатели медианы ожидаемого времени жизни достоверно отличались друг от друга (р<0,01). В основной группе медиана дожития была на 42,3% продолжительнее (р<0,01).

Таблица 7

Процент выживания и кумулятивная доля выживании у больных исследуемых групп в динамике наблюдения

Период наблюдения, годы Процент выживания на интервале Кумулятивная доля выживания

основная гр. контрольная гр. основная гр. контрольная гр.

0,30 99,5 97,1 100,0 100,0

0,88 98,4 88,2 99,5 97,1

1,45 99,4 91,3 97,9 85,7

2,03 98,6 81,1 97,3 78,2

2,61 96,9 92,9 95,9 63,4

3,19 93,0 89,5 92,9 58,9

3,77 89,4 80,7 86,4 52,8

4,34 80,0 68,8 69,7 47,1

4,92 77,8 61,3 47,9 37,7

Используя регрессионную модель Кокса, было установлено, что диагностика рака толстой кишки в результате реализации скрининговых мероприятий явилась значимым фактором, продлевающим жизнь больного. При этом экспоненциальный (3-стандартизированный критерий регрессии относительно диагностики рака толстой кишки посредством скрининга составил 2,31±0,17, статистика Вальда - 24,4 при р=0,000001, критерий Г-25,4 при р<0,001. Следовательно, диагностика рака толстой кишки при скрининговых мероприятиях является независимым фактором, способствующим удлинению последующего периода жизни.

Стадия заболевания является важнейшим фактором, определяющим продолжительность жизни онкологического больного. Диагностика рака толстой кишки посредством скрининговых мероприятий была ассоциирована с выявлением больных более ранних стадий и снижала выраженность влияния стадии болезни на выживаемость пациентов. Однако, среди больных со сходной стадиен, но принадлежащих к разным группам, выживаемость пациентов достоверно

не отличалась (р>0,05), поскольку стандарты лечения пациентов обеих групп были сходными.

Общее количество рецидивов и летальных исходов за пятилетний срок наблюдения составило 79 (38,7%) в основной группе и 138 (64,8%) - в контрольной группе. Соответствующий критерий Пирсона %2 имел значение 7,6 (р<0,001), что было выше критического и указывало на статистически значимое различие между величинами встречаемости рецидивов и метастазов в двух изучаемых группах больных.

В таблице 8 представлены результаты статистического анализа влияния различных факторов на общую выживаемость больных раком толстой кишки.

Таблица 8

Результаты регрессионного анализа по Коксу влияния факторов на общую выживаемость больных раком толстой кишки

Показатель Р" стандартизированный критерий регрессии Статистика Вальда Критерий х2 Пирсона Р

Возраст -0,89 4,78 4,03 0,047

Мужской пол 1,24 5,12 4,19 0,041

Стадия заболевания 3,27 19,4 19,1 0,00001

Опухолевые осложнения (непроходимость, перфорация) 6,72 17,3 15,8 0,0002

Инвазия нервов и сосудов 7,03 15,8 13,2 0,00001

Кровь в кале по результатам FOBT или FIT 5,43 11,6 10,8 0,024

Наибольшее влияние на прогноз течения заболевания оказывали стадия болезни (Statistica Walda 19,4), осложнения опухолевого процесса (Statistica Walda 15,8), инвазия нервов и сосудов (Statistica Walda 15,8), кровь в кале, определяемая лабораторным способом (Statistica Walda 11,6) на начальном этапе диагностики.

В послеоперационном периоде с прогрессированием рака толстой кишки были ассоциированы повышение в крови уровня РЭА, онкогена СА 19-9, повышение содержания фекальной Tumor М2-РК, обнаружение в крови метилированной ДНК SEPT-9. При достижении дискриминантных уровней онкомар-керов, РЭА крови - 10 нг/мл, СА - 19-9 40 ед/мл, уровня фекального Tumor

М2-РК - 4 ед/мл и наличии в крови метилированной ДНК 8ЕРТ9, вероятность появления рецидивов или метастазов у больного раком толстой кишки была равна 0,83.

Затраты па массовые обследования людей при скрининге должны быть обоснованы. Стоимость скрининговой программы в отношении к ее полезности должна быть не выше, чем у прочих медицинских вмешательств. Клинико-экономпческое обоснование скрининга основывается на учете баланса истинно-положительных и ложноотрицательных случаев. Научный интерес представляет изучение экономической эффективности различных стратегий скрининга (разные методы, разная последовательность методов, разная периодичность обследования, разная тактика ведения выявленных больных). Традиционный способ повышения эффективности затрат - ограничение групп населения, подлежащих скринингу, как минимум - по возрасту. В нашем исследовании была разработана поэтапная стратегия скрининга рака толстой кишки, что позволяет проводить дорогостоящие диагностические исследования в группе пациентов с высоким и очень высоким риском развития колоректалыюго рака.

В результате подсчета прямых экономических затрат на разные методы скрининга было установлено, что у 204 больных на проведение колоноскоппи и гистологическое исследование биоптатов объем прямых затрат составляет 7400 руб. х 204 чел. = 1,51 млн. руб. При обследовании 204 больных раком толстой кишки диагностическая чувствительность начального этапа скрининга составила 89,2%. Это значит, что у 182 больных из 204 эти тесты были истинноположительными. Всего на проведение I этапа скрининга среди 204 больных, исключая затраты на колоноскопию, было потрачено 622 608 руб., из них 555 366,3 руб. - на истинно положительные случаи и 67 241,7 руб. -на ложноотрицательные. Объем затрат I этапа скрининга на истпнноположп-тельные результаты отражен на рисунке 7. Следовательно, прямые затраты на начальный этап скрининга по сравнению со стоимостью эндоскопического исследования были практически в 2 раза меньше при преобладающих тратах на истннноположительные результаты.

Начальный этап скрининга

ИП: 89,2%

Рис. 7. Объем затрат ма истинноположительные (ИП) результаты при начальном этапе скрининга рака толстой кишки

Таким образом, совокупность серологических и эпигенетических методов скрининга ввиду их высокой диагностической чувствительности и меньшей стоимости по сравнению с фиброколоноскопией могут выступать альтернативой эндоскопическому скринингу.

Показатель соотношения «затраты/эффективность» СЕЯ для 1 этапа скрининга составил 34,96, для теста на метилат ДНК гена БЕРТ9 колоноцитов из II этапа скрининга — 14,66, для колоноскопии - 60. Следовательно, проведение колоноскопии как метода скрининга является менее экономичным. В таблице 9 представлены коэффициенты СЕЯ для различных скрининговых методик. Обращает внимание, что высокозатратной методикой является определение мутаций в генах ТР53 или К-ЯАБ колоноцитов, что учитывая достаточно низкую диагностическую чувствительность (60,3%), ставит под сомнение целесообразность ее проведения как скрининговой.

Таблица 9

Коэффициенты СЕК для скрининговых методик колоректального рака

Методика Коэффициент СЕЯ

Методики I этапа скрининга 34,96

Мутации в генах "ГР53 или К-ЯАБ колоноцитов 58,04

Тест метилат ДНК гена ЭЕРТ9 колоноцитов 14,66

Определение Ти М2-РК в кале 13.85

Фекальный кальпротсктии 14.86

Колоноскопия 60,0

Несмотря на достигнутые успехи существующих скрининговых программ, в ряде случаев используемые в них методы оказываются слишком дорогостоящими, трудоемкими, а часто - инвазивными. Поэтому не вызывает сомнений необходимость совершенствования начальных этапов скрининга.

Разработанные нами скринпнговые программы включают неннвазивные тесты, доступные в выполнении как для обследуемого, так и для врача, обладающие оптимальным соотношением чувствительности и специфичности, эффективности и затратности. Кроме того, возрастание в крови уровней исследуемых опухолевых маркеров поставляет дополнительную информацию о степени распространенности опухолевого процесса и, что особенно важно, об эффективности проведенного лечения. Периодическое исследование опухолевых маркеров после окончания лечения дает возможность заподозрить развитие рецидива опухолевого процесса раньше традиционно используемых в онкологии методов диагностики.

ВЫВОДЫ

1. Диагностическая чувствительность иммунохимпческого теста на скрытую кровь в кале при скрининговых исследованиях на рак толстой кишки при уровне 50 нг/мл составляет 41,9%, а при диагностической точке разделения 100 нг/мл — 63%. Низкая диагностическая чувствительность иммунохимпческого теста на скрытую кровь в кале определяет нецелесообразность его самостоятельного использования при скрининге, предполагает повышение кратности проведения исследования и комплексирование с другими информативными диагностическими тестами и анкетированием больных.

2. Разработанная система скрининга и диагностики рака толстой кишки представляет последовательный и многокомпонентный процесс, объединяющий этапы: предварительный - анализ наследственной предрасположенности, факторов риска, проявлений дисфункции кишечника, иммунохимиче-ский метод определения крови в кале; I этап - комбинация методов по определению скрытой крови в кале иммунохимическпм методом, определения

наличия метилата ДНК гена 5ЕРТ9 в крови; II этап - фиброколоноскоппя; III этап — идентификация мутации генов в колоноцитах, динамичное определение уровней РЭА и СА-242 в крови для мониторинга заболевания в послеоперационном периоде.

3. Диагностическая эффективность скрининга рака толстой кишки путем определения уровней в крови РЭА, СА 242 и С А 19-9 составляет, соответственно, 40,4%, 50,8 и 51,7%. Уровни опухолевых маркеров изменяются (р=0,01) сопряжено со стадией заболевания, отражают распространенность опухолевого процесса на лимфатические узлы и повышаются при развитии рецидивов и метастазов рака толстой кишки.

4. Эпигенетический тест на наличие метилата ДНК гена 5ЕРТ9 в крови как скрининговая методика характеризуется высокой диагностической чувствительностью — 85,3%, диагностической специфичностью - 91,1% и диагностической эффективностью - 86,5%. Диагностическая чувствительность эпигенетического теста на ранних стадиях колоректапьного рака составила: I стадия -75,6%, II стадия - 87,2%, III стадия - 94,4% и не зависела от локализации опухоли в кишке.

5. На начальном этапе скрининга рака толстой кишки оптимальным сочетанием методов является комбинация иммунохимического теста на скрытую кровь в кале, определения наличия метилата ДНК гена БЕРТ9 в крови. Диагностическая эффективность I этапа скрининга составила 90%. Разработанная модель прогноза заболевания у больных по исходным результатам тестов на СКК, м5ЕРТ9, определения уровней РЭА и СА-242 в крови позволяет с детермина-ционной значимостью 89% определить прогноз прогрессировать болезни после операции.

6. Диагностическая эффективность определения мутаций в генах ТР53 или К-ЯАБ составляет 68,8%, теста на метилат БЕРТ9 в колоноцитах кала — 90,4%, определение уровня фекального кальпротектнна - 78,1% и Ти М2-РК в кале-81,2%.

7. У больных в группе скрининга по сравнению с группой активной диагностики выживаемость больных в течение 5-летнего периода наблюдения выше (Log-Rank test 5,048, р=0,0000001). Общее количество рецидивов и летальных исходов за пятилетний срок наблюдения в группе скрининга составила 38,7%, а в группе активной диагностики с клиническими проявлениями -64,8% (р<0,001).

8. Показатель соотношения «затраты / эффективность» CER для I этапа скрининга составляет 34,96, для копрологических методик, теста на метилат ДНК гена SEPT9 колоноцитов 14,66, определение мутаций в генах ТР53 или K-RAS колоноцитов - 58,04, определение Тн М2-ппруваткиназы в кале - 13,85, для фиброколоноскопии - 60. Эндоскопический скрининг оказался менее экономичным.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Пациенты первичного звена здравоохранения старше 50 лет после анкетирования на наследственную предрасположенность и факторы риска рака толстой кишки должны направляться в региональный консультативно-диагностический центр для реализации многоэтапной системы скринппговых мероприятий.

2. После первого этапа скрининга, включающего анкетирование, анализ кала на скрытую кровь, определение метилата ДНК SEPT9 в крови, пациентов в зависимости от риска рака толстой кишки необходимо делить на четыре группы. Группа низкого риска — отрицательные результаты тестов начального этапа скрининга, без наследственной предрасположенности и специфической симптоматики, наличия факторов риска заболевания. Группа среднего риска -пациенты с отрицательными результатами всех тестов, но с наследственной предрасположенностью и факторами риска. Группа высокого риска - пациенты с положительным результатом тестов. Группа очень высокого риска - пациенты с положительным результатом тестов, наследственной предрасположенностью к раку толстой кишки и факторами риска.

3. Скрининговая программа пациентов зависит от риска возникновения рака толстой кишки. Группа среднего, высокого и очень высокого риска должна быть направлена на фиброколоноскопию. При выявлении полипов толстой кишки или колитах для дифференциальной диагностики необходимо проведение фекальных тестов с определением уровня кальпротектина и Tumor М2-РК. У больных раком толстой кишки определение мутаций в генах ТР53 или K-RAS, уровней серологических маркеров РЭА и CA 242 в крови необходимо для оценки вероятности развития рецидивов заболевания.

4. Эпигенетический тест на наличие метилата ДНК гена SEPT9 в крови рекомендуется для внедрения в практическое здравоохранение как эффективная методика скрининга рака толстой кишки.

5. Высокие экономические затраты на проведение генетических и иммунологических исследований на колоноцитах позволяют рекомендовать их у больных с полипами толстой кишки, колитами и раком толстой кишки после ФКС для прогнозирования течения и мониторинга заболевания.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кит О.П., Бурцев Д.В., Максимов A.IO. Эффективность выявления рака толстой кишки при скрииниговых эндоскопических исследованиях на уровне регионального консультативно-диагностического центра // Современные проблемы пауки и образования. — 2011. - № 6; URL: www.science-education.ru/100-5107

2. Бурцев Д.В. Структура злокачественных заболевании толстой кишки и диагностические мероприятия по их выявлению на базе регионального консультативно-диагностического центра // Фундаментальные исследования. -2012. - №4 (часть 1). -С.34-37.

3. Бурцев Д.В. Структура доброкачественных новообразований толстой кишки, выявляемых при проведении скрииниговых диагностических мероприятий на базе регионального копсультатнвно-диагностиче-

ского центра // Вестник новых медицинских технологий. — 2012. —Т.Х1Х. — №3. -С. 116-118.

4. Бурцев Д.В. Возрастные особенности риска колоректального рака при появлении общих и кишечных симптомов // Московский хирургический журнал. - 2012. - №2 (24). - С.16-19.

5. Бурцев Д.В. Эффективность скрининга опухолей толстой кишки на базе регионального консультативно-диагностического центра // Практическая медицина. - 2012. - №2 (57). - С.214-217.

6. Бурцев Д.В., Кит О.П., Максимов АЛО. Преваленс злокачественных и доброкачественных опухолей толстой кишки у больных с факторами риска колоректального рака. // Уральский медицинский журнал. - 2012.-№5 (97). - С.140-142.

7. Бурцев Д.В. Риск колоректального рака у больных с общими п кишечными симптомами с учетом результатов скрпнппгового исследования кала на скрытую кровь II Уральский медицинский журнал. — 2012. -№6 (98).-С.112-115.

8. Бурцев Д.В., Максимов АЛО., Ильпшенко М.Г., Тарасова Г.Н. Многоэтапная система диагностики воспалительных н опухолевых заболевании толстой кишки // Фундаментальные исследования. - 2012. - №7 (часть 1). - С.54-57.

9. Бурцев Д.В., Кит О.Н., Максимов АЛО. Эффективность молекулярного скрининга рака толстой кишки // Московский хирургический журнал. - 2012. - №3 (25). - С.43-46.

10. Бурцев Д.В., Кит О.И., Максимов АЛО. Эффективность н оптимизация эпигенетических методов при молекулярном скрининге рака тол-стон кишки// Практическая медицина.— 2012. — №6 (61).-С.90-93.

11. Бурцев Д.В., Кит О.П., Максимов АЛО. Дифференциальная диагностика воспалительных и онкологических заболевании кишечника с помошыо молекулярных серологических и копрологнческих методов //

Современные проблемы науки п образования. - 2012. - №4. URL: www.science-education.ru /104-6544.

12. Омельченко В.П., Бурцев Д.В., Кит О.И., Демидова A.A. Моделирование прогноза рака толстой кишки после радикального оперативного лечения по результатам скрппинговых тестов // Фундаментальные исследования. - 2012. - №8 (часть 2). - С.377-380.

13. Бурцев Д.В. Эффективность скрининга рака толстой кишки с помощью эпигенетического теста на метилат гена SEPT9 в крови // Материалы 111 съезда хирургов Юга России с международным участием. Астрахань. 17-21 сентября 2013 г.-С.49.

14. Бурцев Д.В. Организация скрининга рака толстой кишки на базе регионального консультативно-диагностического центра // Главный врач Юга России. - 2013. - Т.35. - №4. - С.59-62.

15. Бурцев Д.В. Способ дифференциальной диагностики воспалительных и онкологических заболеваний кишечника с помощью копрологических тестов // Материалы XIII Международного Конгресса хирургов и гастроэнтерологов. Баку. 12-15 сентября 2013 г. - С.278.

Список сокращений

АФП - альфа-фетопротеин

AUC - Area Under Curve - площадь под кривой

Вс1-2 - антиапоптотический белок

ВЗК - воспалительные заболевания кишки

ГТФ - гуанозин-трифосфат

ДУ - дискриминационный уровень

EGFR - рецептор эппдермального фактора роста

ИДК - пррнгоскопия с двойным контрастированием

КТК - комныотерно-томографическая колонография

КРР - колоректальный рак

МРР - матриксные металлопротеиназы

НЯК - неспецнфический язвенный колит

ОМ - опухолеассоциированные маркеры

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РЭА - раково-эмбриональпый антиген

РТК - рак толстой кишки

ROC - Receiver Operator Characteristic - операционная характеристика приемника

СА - карбогндратные антигены

СКК - скрытая кровь в кале

Septin-9 - белок-онкосупрессор

SEPT9- ген, кодирующий синтез белка Septin-9

ТМВ -тетраметилбеизидин

ФЕП - фосфоенолпируват

Печать цифровая. Бумага офсетная. Гарнитура «Тайме». Формат 60x84/16. Объем 1.7 уч.-изд.-л. Заказ № 3390. Тираж 100 экз. Отпечатано в КМЦ «КОПИЦЕНТР» 344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Суворова, 19, тел. 247-34-88