Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Клинико-генетические исследования наследственной предрасположенности к раку толстой кишки

На правах рукописи

Корчагина Елена Леонидовна

КЛИНИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ НАСЛЕДСТВЕННОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К РАКУ ТОЛСТОЙ КИШКИ

14.00.14 - онкология 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2009

003462442

003462442

Работа выполнена в лаборатории клинической онкогенетики ГУ Российского онкологического научного центра имени H.H. Блохина Российской Академии Медицинских Наук.

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

^2рЬК2ВЦ652 Рэ!!С2 Фб^ОрОВ!!» доктор медицинских наук, профессор Барсуков Юрий Андреевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Петрин Александр Николаевич доктор медицинских наук, профессор Сельчук Владимир Юрьевич

Ведущая организация: Московская медицинская академия

имени И.М. Сеченова

Защита состоится

«Ж лл&Яло. _2009 г. в М часов

на заседании Диссертационного совета при ГУ РОНЦ им. H.H.Блохина РАМН по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24. №001.0 п. DZJ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН.

Автореферат разослан«O^t/ 200%.

Ученый секретарь Диссертационного совета ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Ю.А.Барсуков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Рак толстой кишки (РТК) является одним из самых распространенных злокачественных новообразований у человека. Значение проблемы РТК возрастает в связи с неуклонным ростом заболеваемости и смертности от данного заболевания в экономически развитых странах (Давыдов М.И., Аксель Е.М. 2004). Раннюю диагностику рака толстой кишки до настоящего времени нельзя считать удовлетворительной, поскольку у каждого третьего на момент установления диагноза уже отмечается генерализация опухолевого процесса. Причиной сложившейся ситуации является низкая выявляемость на ранних этапах развития опухоли (Старинский В.В. и др., 2002).

В последнее десятилетие решение вопросов этиологии, патогенеза, ранней диагностики и профилактики во многом связывают с меднко-генетическими исследованиями, направленными на изучение роли наследственной предрасположенности в развитии РТК, его генетической гетерогенности и открытиями в области молекулярной генетики. Большая часть исследований посвящена прак-тическим аспектам РТК, подходам к лечению и возможной профилактике. Однако, вопрос о причинах возникновения РТК и роли наследственных факторов в его развитии на сегодняшний день остается открытым. В последние годы появилось значительное количество работ (Aktan-Collan К et al., 2007; Jo W.S. et al., 2005), указывающих на высокую значимость наследственных факто-ров в развитии заболевания. Кроме того, появилась возможность выявлять гены, мутации которых, ассоциированы с развитием РТК.

Для 65%-95% случаев РТК (являющихся спорадическими) наследуемая составляющая, определенно вносящая вклад в развитие заболевания, пока охарактеризована в недостаточной степени (Lichtenstein et al., 2000). Тем не менее, вероятность возникновения ненаследственных форм рака толстой кишки у ближайших родственников пациентов с данным диагнозом больше, чем у других представителей той же популяции, что указывает на наличие минорных генетических компонент, определяющих предрасположенность ближайших родственников к данному заболеванию (Sharp L et al., 2000). Средства ДНК-

родственников к данному заболеванию (Sharp L et al., 2000). Средства ДНК-диагностики спорадических вариантов РТК пока не разработаны. В этой связи поиск и выявление ассоциаций данного заболевания с ранее не изученными полиморфными маркерами может иметь как теоретическую, так и клиническую ценность (Kablenberg M.S. Et al., 2003). Наиболее частыми нарушениями при РТК, являются мутации в генах K-ras, GSTM1, TS, OGG1, MSH3, MSH6, MLH1. Данные нарушения с определенной частотой регистрируются и на ранних стадиях туморогенеза - в полипах и мелких аденомах толстой кишки, что позволяет рассматривать их в качестве перспективных маркеров для ранней диагностики (Wang J.Y. Et al., 2004). Многочисленные исследования, проведенные за последние несколько лет, показали возможность выявления вышеперечисленных молекулярных изменений также и в биологических образцах (копрологических, биопсийных и образцах плазмы крови), полученных от больных РТК.

Все сказанное подтверждает необходимость проведение клинико-генетичес-ких исследований РТК и разработку научно-обоснованных рекомендаций для медико-генетического консультирования конкретных семей, как одного из способов ранней диагностики и первичной профилактики РТК. В связи с этим нам представлялось важным изучить частоту семейного накопления РТК с целью оценки вклада наследственных факторов в их возникновении, провести поиск маркеров наследственной предрасположенности и попытаться выяснить возможную их этиологическую и генетическую гетерогенность. Цель исследования.

Оценка роли и характера наследственного предрасположения в развитии РТК и на этой основе разработка генетических подходов в комплексной диагностике, прогнозировании и профилактике этого заболевания. Задачи исследования.

1. Изучить характер и основные параметры семейного накопления рака толстой кишки, как в целом, так и при различных его вариантах с использованием методов генетико-математического анализа.

2. Выявить степень генетической обусловленности РТК путем оценки соотносительного вклада наследственных и средовых факторов в общую

подверженность к развитию этого заболевания и провести проверку предположения о генетической общности РТК и опухолей других локализаций.

3. Установить структуру и соотношение генетически детерминированных форм РТК.

4. Определить значение молекулярно-генетических маркеров для ранней диагностики, прогнозирования и профилактики РТК:

- популяционно-геиетический анализ связи полиморфизма генов-супрессоров ОСа, М8НЗ, МБН6 и М1Л1, относящихся к системе репарации генетических повреждений, с развитием РТК;

- поиск и выявление полиморфизма генов ТБ, СБТМ! у больных РТК;

- анализ соматических мутаций гена А'-Ла^ в аденокарциномах и аденомах толстой кишки.

5. Разработать систему эффективного прогнозирования развития РТК и формирование «групп риска» для научно-обоснованного медико-генетического консультирования семей с высокой предрасположенностью к РТК.

Научная новизна.

На основе комплексного клинико-генетического исследования представлены степень и характер семейного отягощения при различных вариантах РТК, установлена мультифакториальная природа РТК, получены оценки соотносительного вклада наследственных и внешнесредовых факторов в развитии данного заболевания, таким образом определена степень генетической обусловленности РТК и его отдельных форм. Разработан комплексный подход, позволяющий идентифицировать наследственно детерминированные формы РТК, представлена их структура и соотношение. Выявлены спектры мутаций в гене К-гся у больных с аденокарциномами, доброкачественными и злокачественными полипами толстой кишки. Проведен поиск ассоциации определенных аллелей генов Ойа, МБНЗ, М5Н6, МШ1, СБТМ1 и 73 с риском развития РТК.

На основе применения различных методов оценки риска разработан дифференцированный подход к уточнению индивидуального развития заболевания у родственников больных РТК и сформулированы научно-обоснованные принципы медико-генетического консультирования при этом заболевании.

Практическая значимость.

Систематизированные в результате проведенной работы исследования будут использованы для выявления наследственно обусловленных форм заболевания и лиц, имеющих с генетической точки зрения высокий риск развития РТК, что позволит сформировать регистр, включающий родственников, отнесенных к контингенту повышенного генетического риска развития РТК и организовать их клинический мониторинг с целью ранней диагностики и повышения эффективности медико-генетического консультирования семей, отягощенных РТК. Выявление генотипов, ассоциированных с высоким риском развития спорадической формы рака толстой кишки, позволяет осуществить раннюю диагностику предрасположенности к данной форме онкологического заболевания, а в дальнейшем, возможно, проведение необходимых профилактических мероприятий по предотвращению развития болезни. Этот подход может быть положен в основу выявления генетической предрасположенности к возникновению разных типов опухолей, что позволит существенно снизить смертность от данных заболеваний. Апробация работы.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: VIII конференции молодых онкологов с международным участием «Современные проблемы экспериментальной и клинической онкологии» (г. Киев, 2007г.), совместной научной конференции сотрудников НИИ КО ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН 25 ноября 2008года.Материалы диссертации представлены на отечественных и международных конференциях.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 167 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Диссертация иллюстрирована 33 таблицами и 21 рисунком. Список литературы включает 203 источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом исследования служили клинико-генеалогические сведения о 631 больных (пробандах) раком толстой кишки, с гистологическим подтвержденным диагнозом рака толстой кишки, подвергшихся хирургическому лечению в отделении проктологии ГУ НИИ РОНЦ им. Н. Н. Блохина с 2001 по 2007 гг. Среди пациентов мужчин было 271 (42,9%), женщин - 360 (57,1%). Сбор материала осуществлялся клинико-генеалогическим методом при личной беседе с больным и доступными для обследования его родственниками. С этой целью была разработана специальная семейная регистрационная карта, которая содержала паспортные данные, клинические и фенотипические характеристики (возраст манифестации заболевания, локализацию опухоли, гистологическое заключение, сопутствующие заболевания), родословную пробанда, включавшую сведения о родственниках I, II, а иногда и III степени родства.

Сведения о каждом пациенте включали: демографические характеристики, локализацию первой опухоли в соответствии с 10 пересмотром Международной классификации онкологических заболеваний (ICD-10) (World Heals Organization. International classification of diseases of oncology. I-st ed. Geneva: World Heals Organization, 2002). В нашем исследовании использовался поодиночный метод регистрации (пациент-пробанд), учитывая семью только один раз независимо от числа пораженных членов в семье. Клинический диагноз: наследственный неполипозный колоректальный рак (ННКРР) базировался на Амстердамских критериях (Vasen). В качестве контроля использовались популяционные частоты распространенности злокачественных новообразований в популяции г. Москвы, которые были вычислены по данным отдела медицинской статистики Московского городского онкологического диспансера за период с 2000 по 2006 гг.

Методы генетического анализа Исследование проведено с использованием различных генетико-математических методов, подробно изложенных в диссертационной работе В.И. Трубникова (1992) «Прикладная математическая генетика психических болезней» и пакете программ «Biometrika».

Методы молекулярно-генетических исследований.

Сбор образцов крови пациентов осуществляли в Российском Онкологическом Научном Центре РАМН им. H.H. Блохина. Образцы крови контрольной группы были собраны на базе поликлиники № 202. Для поиска ассоциации полиморфизмов генов OGG1, MSH3, MSH6 и MLH1 с предрасположенностью к РТК в исследуемую выборку были включены: 277 больных РТК и 361 индивидов без клинически выявленных онкологических заболеваний. Для поиска ассоциации полиморфизмов генов GSTM1, TS с предрасположенностью к РТК в исследуемую выборку были включены: 115 больных РТК и 103 индивида без клинически выявленных онкологических заболеваний. Материалом для исследования соматических мутаций гена K-ras в аденокарциномах толстой кишки служили образцы опухолевых тканей, полученные от 58 больных РТК и 46 больных с полипами толстой кишки. Больные РТК были прооперированы в НИИ клинической онкологии РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН. Эндоскопическое удаление полипов ТК было проведено в ГНЦ колопроктологии МЗ РФ. Для всех больных проведена гистологическая верификация диагноза, а также их TNM классификация, размер и степень дисплазии полипов. В качестве контроля использовали образцы с нормальными тканями больных или их кровь.

Выделение ДНК из лимфоцитов перефирической крови проводилось набором реактивов «DIAiow™ DNA Pre200» фирмы БиоКом в соответствии с инструкциями и предписаниями, предоставленными изготовителем. Геномную ДНК из образцов опухолевых и нормальных тканей выделяли с помощью набора QIAamp Blood and Tissue Kit фирмы QLAGEN, следуя соответствующим протоколам. Определение полиморфизма проводилось методом цепной реакции (ПЦР) с последующей рестрикцией амплифицированного фрагмента ДНК соответствующими рестриктазами. Анализ ПЦР-продуктов проводили с помощью электрофореза в 1,5-2% агарозном геле использованием однократного трис-ацетатного (ТАЕ) буфера после окрашивания гелей бромистым этидием. SSCP-анализ амплифицированного экзона 1 гена K-ras (157 п.о. и 200 п.о.) проводили безизотопным методом. (Амосенко Ф.А. и соавт., 1997). Сиквенс амплифицированного фрагмента гена K-ras (200 п.о.), содержащего аномалии, выявленные в ходе SSCP-анализа или рестрикционнош анализа, проводили с помощы автоматического секвенатора фирмы "Applied BioSystems", модель 377, использу

систему «BigDye-terminators». Для оценки достоверности полученных результатов использовали общепринятые методы вариационной статистики (Айала Ф., 1984).

Данные по однонуклеотдным полиморфизмам генов GSTM1 и TS обрабатывались с использованием статистического критерия х2(Флетчер Р., Флетчер С. и др., 1998). При анализе данных по полиморфизмам генов OGG1, MSH3, MSH6 и MLH1 использовался метод х2 Для выявления значимости различия между эмпирическими распределениями группы больных и контролем. Для вычисления у} использовалась программа Biogenic, разработанная в лаборатории Изменчивости генома ИОГен им. Н.И. Вавилова. Корреляционный анализ был произведен с помощью программы Statistica-6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. Клинико-генеалогические и генетико-математические исследования РТК

Настоящее исследование посвящено одной из наиболее сложных проблем современной онкологии - клинической и молекулярной генетике рака толстой кишки. Изучение семенного накопления проводилось в основном в двух группах пациентов, у которых все или хотя бы одна из опухолей локализовались в толстой кишке: I группа - 493 больных спорадическим раком толстой кишки, II группа - 63 пациента с первично множественными злокачественными новообразованиями (ПМЗН). Кроме того, отдельно рассмотрены семьи, в которых накопление злокачественных новообразований соответствовало критериям наследственного неполипозного колоректального рака (синдромы Lynch I и II) и семьи, в которых были идентифицированы наследственные полипозные синдромы. С целью изучения степени семейного отягощения злокачественными новообразованиями в 609 семьях пробандов исследованы частота и характер их накопления среди 3206 родственников первой степени родства (таб. 1). Из 2569 родственников первой степени родства 493 больных спорадическим РТК у 544 (44,1±0,8%) были различные злокачественные и доброкачественные новообразования. Сравнительный анализ частоты накопления злокачественных опухолей среди родственников первой степени родства показал, что она достаточно высока во всех выделенных группах пробандов и колеблется от 34,8+8.3% в семьях с синдромом Lynch-I до 47,9±2,8% - в семьях больных ПМЗН. Частота в популяции составила 2,24±0,0051%.

Таблица 1. Частота злокачественных и доброкачественных новообразований среди родственников первой степени родства пробандов с колоректальным раком, первично множественными злокачественными новообразованиями и синдромом наследственного неполипозного колорекгального рака (ЬупсЬ-!, ЬупсЬ-И).

Клиническая форма у пробанда Всего Родственники первой степени родства

Число пробан ДОВ Число обсле дован ных Всего Больные (%)

РТК РТМ РШМ РЯ РМЖ РЖ РЛ ПМЗН ДЗНО АТК дцно

РТК 493 2569 544 *** (44.1+0.8) 9.4± 0.6*** 1.8+ 0.26*** 0.75± 0.17 ** 1.8± 0.26*** 3.5+ 0.36*** 7.3± 0.51*** 4.01± 0.32 *** 0.33± 0.11 ** 9.5+ 0.57*** 2.8+ 0.32 2.6± 0.31

ПМЗН 63 324 *** (47.9±2.8) 12.8± 1 §*** 3.0+ 0.9 ** - 6.0± 1.3*** 6.0+ | 2 *** 6.0+ 1 з *%* 4.8± 1.2*** 1.23± 0.6 * 4.8± 12 *** 1.2± 0.6 1.8± 0.7

Синдром ЬупсЬ-11 25 150 *** (34.8+3.9) 19.1± 3.2 *#* 2.6± 1.3 1.8+ 1.1 2.6± 1.3* 1.6± 1.0 2.5± 1.3 0.4+ 0.5 0.4+ 0.5 2.6+ 1.3 - 1.2± 0.9

Синдром ЬупсЬ-П 1 28 163 63 *** (39.2± 3.8) 7.6± 2 1*** 6.3± 1.9 ** - 6.3+ 1 д *** 7.6± 2.1*** 3.2± 1.4* 3.1± 1.3 * 1.3± 0.89 3.8± 1.4 *

Популяция 2.24± 0.0051 0.25± 0.0017 0.37± 0.003 0.25± 0.002 0.15± 0.0018 1.1± 0.005 0.12+ 0.0012 0.07± 0.0009 0.0055+ 0.00026 0.84± 0.003 - -

Примечание: * - р<0.05 (по отношению к контролю) ** - р<0.01

***-р <0.001 | - без учета коррекции на возраст

Высокая частота накопления РТК среди родственников отмечается во всех группах пробандов. Наиболее высокая агрегация отмечена у родственников в семьях с «сайт-специфическим» синдромом ЬупсЬ-1 (19,1+3.2%) и у пробандов, пораженных ПМЗН (12,8±1,8%), что превышает популяционную частоту в 76 и 51 раз (р<0,001), соответственно. Достаточно высока частота рака аналогичной локализации в семьях пробандов с колоректальным раком - 9,4+0,6%, превышающая таковую в популяции в 38 раз (р<0,001). Из представленных выше данных также видно, что в семьях больных РТК отмечается высоких уровень накопления и других ЗНО: рака желудка (7,3±0,5%), легких (4,0±0,3%), молочной железы (3,5+0,4%), тела матки (1,8+0,3%) и ПМЗН (0,33+0,1%).

Обращает на себя внимание достаточно высокий уровень накопления среди родственниц пробандов рака гормонозависимых органов: рака тела матки (от 1,8±0,3% при РТК до 6,3±1.9% при синдроме ЬупсЬ-Н), рака молочной железы (от 1,6±1,0% в семьях с синдромом ЬупсЬ-1 и 3,5±0,4% - при РТК до 7,6±2,1% в семьях с синдромом ЬупсЬ-Н). Следует отметить очень высокий уровень накопление ПМЗН во всех семьях пробандов, который превышает таковой в популяции в 60 раз при РТК (0,33±0Д%), и более чем в 200 раз при ПМЗН (1,2±0.6%) (р<0,05). В семьях пробандов-женщин, пораженных раком толстой кишки, отмечается более высокий уровень накопления злокачественных и доброкачественных новообразований (46.0+1.3%) по сравнению с семьями пробандов-мужчин (41,3±1,4%) (р<0,05).

Наибольшая агрегация злокачественных новообразований среди родственников первой степени родства отмечается в семьях с синдромом ННКРР. Частота накопления несколько выше в семьях с синдромом ЬупсЬ-И по сравнению с семьями с синдромом ЬупсМ - 39,2+3,8% и 34,8+3,9%, соответственно (р<0,05). Таким образом, предварительно можно предполагать, что столь высокая агрегация идентичных случаев заболевания в семьях больных раком толстой кишки обусловлена истинным наследственным отягощением, которое отражает наследование в этих семьях неблагоприятных генетических факторов и обосновывает необходимость проведения генетического анализа.

Учитывая достаточно высокое накопление рака органов репродуктивн системы у женщин в семьях пробандов с колоректальным раком и ПМЗН, был вычислены минимальные оценки генетической корреляции между подверженностям к РТК и раком тела матки, шейки матки, молочной железы, яичников и ПМЗ (табл.2). Установлено, что доля общих генетических факторов, детерминирующих и развитие, достаточно высокая. Наиболее выражено это для РТК и ПМЗН (43%), РТ и раком яичников (41%), РТК и раком тела матки (32%). Что касается доли общи генетических факторов между ПМЗН и колоректальным раком, то он составил 279? Более выражена генетическая корреляция наблюдалась между ПМЗН и рако репродуктивных органов у женщин (28%-34%).

Таблица 2. Минимальные оценки генетической корреляции между подверженностям к первично-множественным злокачественным новообразованиям и рако репродуктивных органов у женщин.

Клиническая форма заболевания Рак тела матк и Рак молочно й железы Рак яичнико в Рак шейки матки ПМЗН Рак толстой кишки

Рак толстой кишки 0.32 0.25 0.41 0.19 0.43 -

ПМЗН 0.28 0.30 0.34 0.32 - 0.27

Результаты исследования позволяют предположить наличие патогенетическо! общности между раком толстой кишки, ПМЗН и раком органов репродуктивно' системы у женщин.

С целью проверки предположений о возможной моногенной детерминации РТ и ПМЗН был проведен сегрегационный анализ. Полученные оценки сегрегационны частот оказались весьма далекими от ожидаемых для простого менделевског наследования. Это послужило основанием для проверки мультифаюгориалык» модели наследования, более адекватной с точки зрения предположений о структур генетической гетерогенности РТК на основе генетических корреляций между отдель ными клиническими формами. Для этой цели использовался дисперсионный подход.

Таблица 3. Компоненты фенотипической дисперсии по подверженности к проявлению рака толстой кишки и первично-множественных злокачественных новообразований. Квазинепрерывная и альтернативная модели.

Клиническая форма заболевания Квазинепрерывная модель Альтернативная модель

Доля аддитивной генетической дисперсии (%) Средовая случайная компонента (%) Доля аддивной генетической дисперсии (%) Средовая случайная компонента (%)

Рак толстой кишки 81.39±16.9 18.61+16.93 1.41+1.17 98.59±1.17

ПМЗН 94.66±3.4 5.34±3.4 11.94±1.17 88.06±1.17

Доля аддитивной генетической дисперсии для рака толстой кишки составила 81%. Достаточно высоким оказался вклад наследственных факторов в возникновение ПМЗН - 95%. Вклад случайных средовых факторов составил 19% и 5% соответственно. Следовательно, можно предполагать, что предрасположенность к РТК и ПМЗН наследуется полигенно, а взаимодействие генетических и средовых факторов играет важную роль в их возникновении и развитии.

В результате проведенного исследования из 631 семьи с различными клиническими формами РТК было выявлено 138 семей (22%) с наследственно обусловленным РТК и 493 семьи (78%) со спорадическим РТК. Анализ собственного материала исследования позволил выделить следующие генетически-детерминированные формы наследственных РТК-ассоциированных с заболеваниями, которые являются клиническими проявлениями самостоятельных семейных онкосиндромов: 1) рак толстой кишки на фоне наследственных полипозных синдромов (22 человека): семейный аденоматозный полипоз толстой кишки 8% (11 человек), синдром Гарднера 4% (5 человек), синдром Пейтц-Егерса 2%(3 человека), ювенильный полипоз толстой кишки 1% (2 человека) и синдром Турко1% (1 человек); 2) неполипозный наследственный рак толстой кишки (синдром Линча) (53 человека): синдром Линча I 18% (25 человек), синдром Линча II 20% (28 человек); 3) первично-множественные злокачественные новообразования, у которых все или хотя бы одна опухоль локализовалась в толстой кишке 46% (63 человека).

Линча 1 18%

Рис.1 Структура и соотношение генетически детерминированных форм РТК.

Таким образом, одним из важных результатов изучения наследственной природы РТК является обнаружение его этиологической и генетической гетерогенности. Для подтверждения вышесказанного нами проведены молекулярно-генетические исследования, направленные на поиск и выявление мутаций и полиморфизмов генов, ассоциированных с высоким риском РТК.

Поиск молекулярно-генетических маркеров, ассоциированных с высоким риском развития РТК.

Для поиска ассоциаций были выбраны гены-супрессоры Оса, МБНЗ, М5Н6 и МЬН1, участвующие в репарации генетических повреждений. Был проведен рестрикционный анализ полиморфных сайтов ДНК в этих генах. В каждом гене было исследовано по одному полиморфному сайту. В таблице 4 показана характеристика полиморфных сайтов исследованных генов с указанием их условного^ обозначения.

Таблица 4. Условные обозначения аллелей генов ОСа, МЗНЗ, М8Н6 и МЬН1.

Ген № экзона Замена в белке Обозначения аллелей

ОвС1 7 326 8ег>Суз А1-частый аллель (вег) А2-редкий аллель (Суэ)

MSH3 23 1036 Thr>Ala В1-частый аллель (Thr) В2-редкий аллель (Ala)

MSH6 1 39Gly>Glu Cl-частый аллель (Gly) С2-редкий аллель (Glu)

MLH1 8 219 Val>Ile DI-частый аллель (Val) В2-редкий аллель (Ile)

На основании первичных данных были произведены расчеты частот генотипов в контрольной группе и группе больных, и выполнена статистическая обработка результатов. Анализ исследованных нами генотипов позволил выявить 13 вариантов генотипов, у которых частота встречаемости в группе больных значимо отличается (с уровнем значимости 0,05) от этой частоты в контрольной группы (таблица 5).

Таблица 5. Генотипы, ассоциированные с риском развития РТК.

№ генотип Контр, группа Больные х2 (р=0.05) Р Ki

кол-во частота кол-во частота

1 А2/А2 21 0,058 7 0,025 3,87 0,049 0,398

2 С2/С2 6 0,017 16 0,058 7,69 0,006 0,547

3 А1/А2;С2/С2 2 0,006 8 0,029 4,13 0,042 0,657

4 А1/-;С2/С2 6 0,017 15 0,054 6,71 0,010 0,521

5 А2/-;С2/С2 2 0,006 9 0,032 5,22 0,022 0,684

6 А2/А2;С1/- 21 0,058 6 0,022 4,94 0,026 0,450

7 А2/А2; D1/- 19 0,053 6 0,022 3,84 0,050 0,413

8 В1/В1;С2/С2 5 0,014 И 0,040 4,18 0,041 0,481

9 В1/-;С2/С2 6 0,017 15 0,054 6,71 0,010 0,521

10 С1/С2; D1/D2 37 0,102 44 0,159 3,92 0,048 0,218

11 С2/С2; D1/- 5 0,014 14 0,051 7,09 0,008 0,569

12 С2/-; D1/D2 38 0,105 48 0,173 5,38 0,020 0,245

13 С2/-; D2/- 46 0,127 55 0,199 5,01 0,025 0,221

Установлено, что в некоторых случаях, частота встречаемости генотипов по анализируемым генам при их парном сочетании у 277 больных отличается от таковой в контроле (р<0,05). При однолокусном анализе по генам МБНб и 0001 выявлены гомозиготные генотипы по редким аллелям А2/А2 и С2/С2, ассоциированные с повышенным риском развития рака кишечника. При этом во всех случаях с повышенным риском вносит свой вклад редкий аллель гена МБНб, а во всех случаях с пониженным риском редкий аллель гена ОСа, исключение составляет только генотип С2/С2; А2/-, который наглядно демонстрирует, что наличие генотипа с высоким риском (С2/С2) является определяющим фактором развития заболевания.

На следующем этапе выбраны гены 08ТМ1, кодирующий глютатион-Б-трансферазу М1, 73, кодирующий тимидилатсинтазу, по которым имелись предварительные данные об их возможном участии в процессе развития карциномы толстого кишечника. Полученные данные указывают на "разнонаправленность" действия генов С57М/ и ТБ - делеции гена й8ТМ1 могут играть защитную роль, в то время как делеции гена Т8 способствуют развитию опухолей кишечника. Поэтому мы провели дополнительный анализ сочетанных генотипов, включающих в себя наличие гомозиготной делеции гена 08ТМ1 в присутствии хотя бы одного аллеля гена Г5 в группе больных РТК и контрольной группе. Наличие гомозиготной делеции гена ОБТМ! и присутствие хотя бы одного аллеля гена 73 также приводит к снижению риска развития карциномы толстого кишечника (ОР = 0,83) (доверительный интервал С1: 0,48 - 1,46 определенный для Р < 0,05).

Как простой, так и сочетанный анализ генотипов больных РТК и здоровых представителей российской популяции указывают на вклад аллельных состояний генов ТЗ1 и С57М7 в развитие несемейных форм РТК. Для определения степени влияния индивидуальных аллелей генов 73 и необходимо исследование

больших групп пациентов и здоровых лиц.

Таблица 6. Частоты полных и делеционных аллелей генов СБТМ1 и Г5 в выборках российских больных спорадической формой рака толстого кишки и здоровых лиц.

GSTM1 ОР CI (95%)

д/д Д/+ или +/+ 0.755 [0.44- 1.28]

Случаи 52 63

Контроли 54 49

TS ОР сг т%)

д/д Д/+ или +/+ 1.476 [0.55 - 3.93]

Случаи 11 99

Контроли 7 96

GSTM1 Д/Д; TS Д/+ или TS +/+ Все остальные генотипы ОР CI (95%)

Случаи 43 65 0.83 [0.48- 1.461

Контроли 42 53

GSTM1 Д/Д; TS+/+ Все остальные генотипы ОР CI (95%)

Случаи 23 85 0.80 [0.42-1.54]

Контроли 24 71

ОР = Относительный Риск, CI = доверительный интервал.

Развитие аденокарцином толстой кишки протекает с минимальными клиническими симптомами, поэтому, несмотря на современное усовершенствование технических возможностей, только в небольшом числе случаев эти опухоли диагностируются на ранних стадиях. В этой связи поиск новых методов ранней диагностики ассоциируется с пониманием молекулярной этиологии этих заболеваний. Наиболее распространенными мутациями в опухолях человека являются точечные замены в 12 и 13 кодонах первого экзона K-ras (Takayuki S et all., 2000.; Pral F. et. al., 2007). В исследование были включены 58 российских больных со спорадическим раком толстой кишки (26 мужчин и 32 женщины в возрасте 29-87 лет) и 46 российских больных с одиночными и множественными полипами ТК (20 мужчин и 26 женщин в возрасте 35-77 лет).У обследованных больных выявлено 8 различных мутаций: 6 типов в 12 кодоне и 2 типа в 13 кодоне гена K-ras. Все они относятся к однонуклеотидным заменам. Мутации в гене

К-ген обнаружены у 43,1% больных с аденокарциномами толстой кишки, 48,5 пациентов с доброкачественными полипами и у 69,2% больных с малигнизированным! полипами.

Таблица 7. Спектр и частота К-гая мутаций, выявленных в аденокарциномах I полипах толстой кишки российских больных,^ _

Тип мутации Замена аминокислоты Кодо H Аденокарциномы Полипы

Доброкачеств. Малигнизиров.

n % n % n %

ССТ>ОаТ Gly>Asp 12 8 32,0 6 37,5 3 33,3

ССС>СаС >Asp 13 5 20,0 3 18,8 3 33,3

>Val 12 4 16,0 5 31,3 1 11,1

>йсТ >А1а 12 3 12,0 0 0,0 0 0,0

>аСТ >Ser 12 2 8,0 1 6,2 0 0,0

>ЮТ >Cys 12 2 8,0 0 0,0 2 22,3

>сйС >Arg 13 1 4,0 0 0,0 0 0,0

>сйТ >Arg 12 0 0,0 1 6,2 0 0,0

ВСЕГО:

Без мутации 33 56,9 17 51,5 4 30,8

С мутацией 25 43,1 16 48,5 9 69,2

Мутации в к. 12 19 76,0 13 81,2 6 66,7

Мутации вк.13 6 24,0 3 18,8 3 33,3

Аденокарциномы

Как видно из таблицы 7, частота K-ras мутаций в аденокарциномах состави 43,1%: 76% из них обнаружены в кодоне 12 и 24% - в кодоне 13, при этом 60% из н являются транзициями, а 40% - трансверсиями. Все мутации затрагивают первый второй нуклеотиды 12-го и 13-го кодонов K-ras. Всего выявлено 7 типов мутаци Наиболее распространенными в исследованной выборке больных являют следующие мутации: GaT (Asp) в к. 12 (32%), GaC (Asp) в к. 13 (20%), GtT (Val) в 12 (16%) и GcT (Ala) в к. 12 (12%). Мутации не были обнаружены ни в одном

контрольных образцов ДНК. Всего было исследовано 232 хромосомы. Мы не выявили зависимость частоты K-ras мутаций от локализации аденокарцином в правой (44,4%) или левой частях толстой кишки (43,5%). В исследованной выборке мы не нашли статистически значимых отличий в частоте K-ras мутаций в аденокарциномах с высокой и умеренной степенями дифференцировки (44,4 и 45,2% соответственно). Показана зависимость частоты K-ras мутаций от стадии опухолевого процесса: 11,1% - для стадии II, 40,0% - для стадии III и 61,1% - для стадии IV (таблица 8). К сожалению, мы обследовали только одного больного с первой стадией.

Таблица 8. Частота и спектр K-ras мутаций в аденокарциномах толстой кишки в зависимости от стадии опухолевого процесса._

Стадия Частота Кодон Тип мутаций

мутаций (%)

I (1/1) 12 GtT

П 11.1(1/9) 12 GaT

Ш 40.0(12/30) 12 GaT (4/12)

13 GaC (3/12)

12 GtT (2/12)

12 aGT(l/12)

12 tGT(l/12)

12 GcT(l/12)

IV 61.1(11/18) 12 GaT (3/11)

13 GaC (2/11)

12 GcT(2/ll)

12 aGT(l/ll)

12 GtT (1/11)

12 tGT (1/11)

13 cGC(l/ll)

Полипы

46 полипов и такое же количество образцов нормальной слизистой в качестве контроля (всего 184 хромосомы) были проанализированы с помощью ПЦР, ПДРФ анализа, 55СР анализа и прямого секвенирования. На основании гистологического анализа все полипы были разделены на две группы: доброкачественные полипы без

элементов малигнизации и малигнизированные полипы (полипы с различной степены малигнизации + полипы, ассоциированные с РТК). Частота мутаций в гене К-ras i исследованных группах составила 48,5% (16/33) и 69,2% (9/13) соответственно (табл. 7) Большая часть мутаций была выявлена в 12 кодоне: 81,2% среди доброкачественнь полипов и 66,7% - в группе малигнизированных полипов. Соответственно в 13 колон частота K-ras мутаций составила 18,8 % и 33,3 %. Все выявленные мутации затрагиваю первый и второй нуклеотиды 12-го и 13-го юдонов K-ras. В доброкачественных полипа, обнаружено 5 типов мутаций, а в малигнизированных - 4 типа мутаций. Наиболе частой в обеих группах исследованных полипов является замена GGT (Gly)>GaT (Asp 37,5% от всех мутаций в доброкачественных полипах и 33,3% - в малигнизированны При сравнении частот K-ras мутаций в правом и левом отделах толстой кишки был обнаружено, что они достоверно не отличаются для левого отдела: 48% (12/25) - сред доброкачественных полипов и 55.6% (5/9) - в малигнизированных полипах. В право отделе ТК все полипы из обеих групп были с мутациями. К сожалению, эти полип были представлены в небольшом количестве: 9,1% (3/33) среди доброкачественны аденом и 23,1% (3/13) - среди малигнизированных. При сравнении частоты К-га мутаций в полипах с различной гистологией мы выявили достоверные отличия дл тубулярных и тубулярно-ворсинчатых аденом как среди доброкачественных (33,3 и 60 соответственно), так и малигнизированных полипов (40 и 66,7 % соответственно).

Спектры K-ras мутаций в аденокарциномах, доброкачественных малигнизированных полипах перекрываются, но не идентичны. Максимальная часто мутации GaT (Asp) показана для всех трех групп больных: 32% - в аденокарцином 37.5% - в доброкачественных полипах и 33,3% - в малигнизированных полипах. Данн мутация также преобладает у японских больных с аденокарциномами толстой кишк (44,7%) (Haseva Н. et al., 1995). В малигнизированных полипах определена еще од мутация с частотой 33,3% - замена в кодоне 13 GGC (Gly)->GaC (Asp), тогда как аденокарциномах эта мутация встречается с частотой 20%, а в доброкачественны полипах - 18.3%. Интересно, что мутация GtT (Val) встречается с максимально частотой в доброкачественных полипах (31,3%), а у больных с аденокарциномами

малигнизированными полипами значительно реже: с частотой 16,0% и 11,1% соответственно. Следует отметить совпадение наших результатов, полученных для больных аденокарциномой толстой кишки, с данными, полученными другими авторами на самой большой выборке больных РТК (1413 человек), в которой частота мутации GaT (Asp) в кодоне 12 составила 31,1%, а мутации GaC (Asp) в кодоне 13 - 20,8% (Samowitz W.S. Et al., 2000).

Эти исследования являются перспективными, так как позволяют проводить довольно быстрый скрининг диспластических поражений всех участков толстой кишки с целью формирования " групп риска ". Обнаружение K-ras мутаций в опухолях толстой кишки позволяет использовать их в качестве молекулярных маркеров для прогноза, а также контроля после операционного лечения.

Таким образом, полученные в ходе нашего исследования данные позволили уточнить и рекомендовать тактику обследования родственников больных аденомами, РТК и ПМЗН. На первом этапе проводится медико-генетическое консультирование пробандов из наследственно отягощенных семей. Выявленные наследственно отягощенные семьи заносятся в генетический канцеррегистр. Критериями для включения в канцеррегистр являются: 1) накопление в семье 2-х и более злокачественных новообразований желудочно-кишечного тракта и других злокачественных новообразований; 2) характер распределения заболевания в семьях соответствует аутосомно-доминантному типу наследования; 3) ранний возраст начала болезни (до 50) лет; 4) высокая частота первично-множественных злокачественных новообразований среди членов семьи, в том числе с первично-множественным РТК; 5) развитие РТК на фоне наследственных заболеваний и синдромов, предрасполагающих к этому заболеванию; 6) обнаружение мутаций генов, ассоциированных с возникновением опухоли. Вторым этапом медико-генетического консультирования является определение генетического диагноза и степени риска возникновения злокачественного новообразования у родственников больных с целью формирования групп повышенного риска. При обследовании родственников проводится отбор лиц в три группы и лечение выявленной патологии (второй этап): первая группа - с выявленной фоновой, пред- и опухолевой патологией, а также лица с патологическим

генотипом; вторая группа — с наличием преморбидного фона, но без определяемой при обследовании патологии; третья группа - «практически здоровые» лица (без преморбида). На третьем, заключительном этапе, осуществляется активное диспансерное наблюдение (мониторинг) в выделенных группах в зависимости от возраста и в соответствии с категорией риска.

Применение разработанной нами программы скрининга среди родственнико (особенно в наследственно отягощенных семьях) создает реальные возможност профилактики РТК и раннего его выявления в этих семьях. Создани автоматизированного ракового регистра семей позволяет значительно повысит эффективность профилактики злокачественных новообразований за счет своевременног выявления семей, члены которых нуждаются в обследовании, включающее тестировани генов предрасположенности у клинически здоровых родственников.

Выводы:

1. На основании изучения 631 семьи больных с гистологически подтвержденным диагнозом рака толстой кишки (РТК) и 3206 их родственников получены доказательства наследственной предрасположенности к возникновению РТК:

а) семейная частота РТК в среднем составила 12,2%, значительно превысив популяционную частоту этого заболевания 0,25% (р<0,001). Частоты накопления других злокачественных новообразований, включая ПМЗН среди родственников, также в десятки раз превышают популяционные частоты этих заболеваний;

б) наиболее адекватной для описания системы подверженности к РТК и ПМЗН оказывается мультифакториальная модель наследования: доля аддитивной генетической компоненты для РТК составила - 81%, еще более высокой она оказалась для ПМЗН - 95%, что позволяет судить об удельном весе генотипической изменчивости изучаемого признака в общей его фенотипической изменчивости в данной конкретной группе больных.

2. Генетический анализ полученных данных продемонстрировал значимую патогенетическую общность наследования РТК и рака органов репродуктивной системы у женщин в семьях больных колоректальным раком и ПМЗН:

а) коэффициенты корреляции между подверженностями к РТК и опухолями гормонозависимых органов составили -19-41%;

б) минимальные оценки генетической корреляции между подверженностями к ПМЗН и РТК 43%, ПМЗН и раком репродуктивных органов у женщин - 28-34%.

3. Выявлена значимая этиологическая и генетическая гетерогенность РТК в пределах общей выборки: наследственно детерминированные формы заболевания идентифицированы у 22% больных, ненаследственные (спорадические) - у 78% больных. Структура наследственно детерминированных форм РТК включает: 1) рак толстой кишки как проявление наследственных полипозных синдромов, подтвержденных в некоторых случаях анализом мутаций в гене АРС: семейный аденоматозный полипоз толстой кишки — 8%, синдром Гарднера - 4%, синдром Пейтц-Егерса - 2%, ювенильный полипоз толстой кишки -1% и синдром Турко -1%;

2) неполипозный наследственный рак толстой кишки как проявление синдром Линча, подтвержденный в некоторых случаях анализом мутаций в генах hMSH2 \ hMLHl\ синдром Линча I -18%, синдром Линча II - 20%; 3) ПМЗН, у которых все ил хотя бы одна опухоль локализовалась в толстой кишке - 47%.

4. Анализ полиморфных вариантов генов OGGI, MSH6, MSH3'u MLH1 у 27 больных РТК показал статистически значимые различия от контрольной группь (р<0,05). Идентифицированы ассоциации полиморфных сайтов разных генов характеризующиеся высоким (10 генотипов) и низким риском развития рака толсто! кишки (3 генотипа). Гомозигота по редкому аллелю (С2/С2) гена MSH ассоциирована с повышенным риском развития рака кишечника, а гомозигота п редкому аллелю (А2/А2) гена OGG1, ассоциирована с пониженным риском.

5. Поиск ассоциации носительства определенных аллелей генов GSTM1, TS развитием рака толстой кишки у 115 пациентов показал, что относительный рис развития РТК для носителей GSTMl-нуль генотипа составил 0,755, для носителе rS-нуль генотипа составил 1,476, что свидетельствует о возможной роли указанны делеции в процессе развития РТК (р<0,5).

6. Частота мутаций протоонкогена К-ras ( к. 12 и к. 13) в образцах ДНК, выделеннь из 46 полипов и 58 аденокарцином толстой кишки составила в аденокарцинома толстой кишки 43,1%, в доброкачественных полипах - 48,5%, в группе больных малигнизированными полипами - 69,2%. Максимальная частота мутации GaT (As показана для всех трех групп больных: 32% - в аденокарциномах, 37,5% -доброкачественных полипах и 33,3% - в малигнизированных полипах. Обнаружение ras мутаций в опухолях толстой кишки может служить в качестве неблагоприятног прогностического маркера на различных стадиях малигнизации новообразовани толстой кишки.

7. Результаты клинико-генетического анализа явились основой создания комплексно системы медико-генетической помощи семьям с РТК, которая состоит из взаимосвязанных этапа: 1) выявление и регистрация семей, отягощенных РТК и ПМЗ 2) уточнение генетического диагноза и прогноза заболевания; 3) формирование груп

риска и их клинико-генетический мониторинг с целью ранней диагностики и профилактики рака.

Благодарности

Выражаю искреннюю признательность научным руководителям диссертационной работы: зав. лабораторией клинической онкогенетики РОНЦ РАМН, д.м.н., профессору Гарькавцевой Р.Ф., зав. проктологического отделения д.м.н., профессору Барсукову Ю.А. за постоянное внимание к работе и ценные советы при обсуждении результатов. Приношу глубокую благодарность д.б.н., профессору Асланяну М. М. кафедры генетики МГУ им. М.В. Ломоносова, зав. лаб. изменчивости генома ИОГен им. Н.И.Вавилова, д.б.н., профессору Тарасову В. А., гл.н.с. лаб. генетической эпидемиологии МГНЦ РАМН, д.б.н. Барановой A.B. за помощь в проведении молекулярно-генетаческих исследований.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Корчагина EJL, Сазонова М.А., Амосенко Ф.А., Казубская Т.П. Анализ мутаций гене K-ras у больных с опухолями разных локализаций.//Ш научно-практическа5 конференция «Проблемы онкогенетики : научные и прикладные аспекты» 23-24 мая 2002г., С.41.

2. Казубская Т.П., Корчагина ЕЛ., Гарькавцева Р.Ф., Амосенко Ф.А. Соматически мутации K-ras гена при колоректальном раке, раке поджелудочной железы i диагностическая и прогностическая значимость. // VII Российскоий онкологически! конгресс. Москва, 2003, С. 137-140.

3. Корчагина E.JI., Казубская Т.П., Сазонова М.А., Амосенко Ф.А. Рол наследственной предрасположенности в развитии колоректального рака //Медицинская генетика. 2005, № 5., С.209-210.

4. Сазонова М.А.,Казубская Т.П., Корчагина E.JL, Ермилова В.Д., Гарькавцева Р.Ф. Амосенко Ф.А., Калинин В.И. Анализ соматических мутаций гена K-ras пр аденокарциномах толстой кишки и поджелудочной железы. // Вестник Российског научного центра им. Н.Н.Блохина. 2005, №3-4., С.16-23.

5. Белев Н.Ф., Самотыя Е.Е., Корчагина Е.Е. Генетическая эпидемиологи наследственного неполипозного рака толстой кишки. И Вестник Московског Онкологического общества. 2005г., № 2, С. 6-7.

6. Корчагина E.JL, Степанова Е.В., Гарькавцева Р.Ф., Баранова A.B. Поис ассоциаций аллелей генов человека TS, GSTM1 И СОХ2 с раком толстой кишки //Медицинская генетика. 2006г., №8, С.30-33.

7. Корчагина ЕЛ. Молекулярно-генетические аспекты рака толстой khuikh.//VII конференция молодых онкологов с международным участием. Современны проблемы эксперементальной и клинической онкологии. 26-27 апреля 2007 г., Кие С.40.

8. Амосенко Ф.А., Корчагина ЕЛ., Ваганов Ю.Е., Власов С.Б., Никулин М.В. Веселов, В.В. Казубская Т.П., Гарькавцева Р.Ф., Калинин В.Н. Анализ генетическог полиморфизма G870A гена CCND1 у больных спорадическим раком поджелудочно

железы и полипозом толстой кишки.// XI Российский онкологический конгресс. 2007г., Москва, С. 200.

9. N.Belev, Diana Iarovoi, P.Rusu, S.$tepa, M.Ciobanu, Gr.Clecicov, I.Breni?ter, N.PTnzaru, Silvia Halipli, Irina Tripac, Elena Korciaghina, Lidia Gheorghitä Screeningul endoscopic in familiile pacienjilor cu cancer colorectal nonpolisic ereditar Bulletin of the Academy of sciences of Moldova/ Medical science. N4(13), 2007, P.249.

10. Корчагина ЕЛ., Белев Н.Ф., Барсуков Ю.А., Гарькавцева РФ. Гетерогенность рака толстой кишки и идентификация его наследственных форм. V — съезд онкологов и радиологов СНГ. Ташкент 14-16 мая, 2008 г. С. 304.

11. E.Korchagina. Clinico-genetic and molecular aspects of colorectal cancer. European Multidisciplinary Colorectal Cancer Congress 24-26 February, 2008. Berlin, Germany. Annals of Oncology.Oxford Journals.-V.19.N.I.-P.133.

12. Корчагина EJI., Белев Н.Ф., Казубская Т.П., Барсуков Ю.А., Тимофеев Ю.М., Музаффарова Т. А., A.B. Карпухин A.B., Р.Ф. Гарькавцева Р.Ф. Клинико-генетические аспекты рака толстой кишки и идентификация его наследственных форм. Колопроктология. 2008. -№2(24).-С. 19-24.

13. Н.Ф. Белев, С.Д. Халипли, Л.Ф Георгица, U.E. Трипак, Р.П. Мындруца-Стратан, Е. Л. Корчагина, Т.П. Казубская, Р.Ф. Гарькавцева. Синдром наследственного злокачественные неполипозного колоректального рака - .первично-множественные новообразования - «соотношение». Материалы Российской научно-практической конференции с международным участием 24-25 июня 2008 года г. Барнаул (под редакцией д.м.н., профессора А.Ф. Лазарева - г. Барнаул 24-25 июня 2008 г.) С.8-10.

14. Корчагина ЕЛ., Гарькавцева Р.Ф. Принципы медико-генетического консультирования семей больных РТК. XII Российский онкологический конгресс. 2008г., Москва, С. 192.

Подписано в печать 30.01.09 Формат 60x84/16. Бумага офсетная.

_Тираж 100 экз. Заказ № 134 _

Отпечатано в службе множительной техники ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Современные достижения клинической и молекулярной генетики способствуют изучению проблемы наследственной предрасположенности к онкологическим заболеваниям и дают возможность более глубокому проникновению в биологическую сущность опухолевых заболеваний, изучению механизмов их распространенности в популяции и в отдельных семьях. С практической точки зрения медико-генетические исследования создают основу для индивидуального прогнозирования в онкологических отягощенных семьях с целью семейной профилактики, основанной на создании регистра «групп риска» среди родственников пробандов, с последующим наблюдением за ними. Большинство распространенных онкологических заболеваний в генетическом отношении изучены недостаточно, а вопрос о соотносительной роли наследственных и внешнесредовых факторов в их развитии остается открытым.

Рак толстой кишки (РТК) является одним из самых распространенных злокачественных новообразований у человека. Значение проблемы РТК возрастает в связи с неуклонным ростом заболеваемости и смертности от данного заболевания в экономически развитых странах (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2004).

Раннюю диагностику рака толстой кишки до настоящего времени нельзя считать удовлетворительной, поскольку у каждого третьего на момент установления диагноза уже отмечается генерализация опухолевого процесса. Причиной сложившейся ситуации является низкая выявляемость на ранних этапах развития опухоли (Старинский В.В. И соавт., 2002).

В последнее десятилетие решение вопросов этиологии, патогенеза, ранней диагностики и профилактики опухолей во многом связывают с медико-генетическими исследованиями, направленными на изучение роли наследственной предрасположенности в развитии РТК, его генетической гетерогенности и открытиями в области молекулярной генетики. Большая часть исследований посвящена практическим аспектам РТК, подходам к лечению и возможной профилактике. В настоящее время многими лабораториями мира картированы и клонированы сотни генов, вовлеченных в канцерогенез, многие из них представлены в популяциях человека десятками полиморфных вариантов. Исследования ведутся в трех основных направлениях: картирование и клонирование новых генов, комплексный анализ и ДНК-диагностика пациентов, разработка методов и подходов к генотерапии онкологических заболеваний (Залетаев Д.В., 2000). Однако, вопрос о причинах возникновения РТК и роли наследственных факторов в его развитии на сегодняшний день остается открытым. В последние годы появилось значительное количество работ (Aktan-Collan К et al., 2007; Fearnhead N. S. et al., 2002; Jo W.S. et al., 2005), указывающих на высокую значимость наследственных факторов в развитии заболевания. Кроме того, появилась возможность выявлять гены, мутации которых, ассоциированы с развитием РТК.

В многочисленных исследованиях показано, что 15-20% больных РТК имеют родственников первой степени родства с такой же патологией (Гарькавцева Р.Ф., Белев Н.Ф., 2001). Для родственников риск заболеть постепенно возрастает в зависимости от числа пораженных членов семьи, тяжести клинической картины и возраста проявления у них злокачественного новообразования.

Можно предположить, что генетически обусловленные формы РТК характеризуется существенной фенотипической неоднородностью. Основной целью на данном этапе исследований является не только изучение генетических механизмов наследственной предрасположенности к известным наследственным синдромам (семейный аденоматоз толстой кишки, синдром Гарднера, синдром Турко, синдром Пейтц-Егерса), но также исследование фено-генотипических связей наследственных форм РТК, и таких как наследственный неполипозный рак толстой кишки, рак толстой кишки, возникающий на фоне наследственно обусловленного семейного полипоза толстой кишки. Отсутствие точных данных о генетических механизмах предрасположенности к РТК сдерживает развитие теоретически обоснованной медико-генетической консультации и ее практических перспектив -разработку ранней диагностики, своевременного лечения, профилактики и активной диспансеризации членов семей с высоким риском развития аналогичного заболевания.

Исследования в области молекулярной онкопроктологии направлены на определение структурных и функциональных изменений генов, которые могут служить специфическими маркерами, регистрируемыми при различных формах РТК. На сегодняшний день генетическая основа возникновения РТК хорошо описана только для двух видов колоректального рака: семейного аденоматозного полипоза и наследственного неполипозного рака толстой кишки. Для семейного аденоматозного полипоза проводится мониторинг терминальных мутаций гена АРС. Для диагностики наследственной неполипозной формы рака выявляют мутации генов MSH-2, MLH-1, контролирующих репарацию ДНК и стабильность генома. Однако данные синдромы соответствуют лишь 10% -15% от всех случаев колоректального рака (Lynch Н.Т. et al., 2000; Church J. et al., 2004).

Для остальных 65%-95% случаев (являющихся спорадическими) наследуемая составляющая, определенно вносящая вклад в развитие заболевания, пока охарактеризована в недостаточной степени (Lichtenstein et al., 2000). Тем не менее, вероятность возникновения ненаследственных форм рака толстой кишки у ближайших родственников пациентов с данным диагнозом больше, чем у других представителей той же популяции, что указывает на наличие минорных генетических компонент, определяющих предрасположенность ближайших родственников к данному заболеванию (Sharp L et al., 2000). Средства ДНК-диагностики спорадических вариантов

РТК пока не разработаны. В этой связи поиск и выявление ассоциаций данного заболевания с ранее не изученными полиморфными маркерами может иметь как теоретическую, так и клиническую ценность (Kablenberg M.S. Et al., 2003). Наиболее частыми нарушениями при РТК являются мутации в генах К-ras, GSTM1, TS, OGG1, MSH3, MSH6, MLH1. Данные нарушения с определенной частотой регистрируются и на ранних стадиях туморогенеза — в полипах и мелких аденомах толстой кишки, что позволяет рассматривать их в качестве перспективных маркеров для ранней диагностики. Кроме того, многочисленные исследования, проведенные за последние несколько лет, показали возможность выявления вышеперечисленных молекулярных изменений также и в биологических образцах (копрологических, биопсийных и образцах плазмы крови), полученных от больных РТК.

Все сказанное подтверждает необходимость проведения клинико-генетических исследований РТК и разработку научно-обоснованных рекомендаций для медико-генетического консультирования конкретных семей, как одного из способов ранней диагностики и первичной профилактики РТК. В связи с этим нам представлялось важным изучить частоту семейного накопления РТК с целью оценки вклада наследственных факторов в их возникновении, провести поиск маркеров наследственной предрасположенности и попытаться выяснить возможную их этиологическую и генетическую гетерогенность. ЦЕЛЬ РАБОТЫ.

Оценка роли и характера наследственного предрасположения в развитии РТК и на этой основе разработка генетических подходов в комплексной диагностике, прогнозировании и профилактике этого заболевания. ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Изучить характер и основные параметры семейного накопления рака толстой кишки, как в целом, так и при различных его вариантах с использованием методов генетико-математического анализа.

2. Выявить степень генетической обусловленности РТК путем оценки соотносительного вклада наследственных и средовых факторов в общую подверженность к развитию этого заболевания и провести проверку предположения о генетической общности РТК и опухолей других локализаций.

3. Установить структуру и соотношение генетически детерминированных форм РТК.

4. Определить значение молекулярно-генетических маркеров для ранней диагностики, прогнозирования и профилактики РТК:

- популяционно-генетический анализ связи полиморфизма генов-супрессоров OGG1, MSH3, MSH6 и MLH1, относящихся к системе репарации генетических повреждений, с развитием спорадической формы рака кишки.

- поиск и выявление полиморфизма генов TS, GSTM1 у больных раком толстой кишки.

- анализ соматических мутаций гена K-Ras в аденокарциномах и аденомах толстой кишки;

5. Разработать систему эффективного прогнозирования развития РТК и формирования «групп риска» для научно-обоснованного медико-генетического консультирования семей с высокой предрасположенностью к РТК.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

На основе комплексного клинико-генетического исследования представлены степень и характер семейного отягощения при различных вариантах РТК, получены оценки соотносительного вклада наследственных и внешнесредовых факторов в развитии данного заболевания, таким образом определена степень генетической обусловленности РТК и его отдельных форм. Разработан комплексный подход, позволяющий идентифицировать наследственно детерминированные формы РТК, представлена их структура и соотношение. Выявлены спектры мутаций в гене K-Ras у больных с аденокарциномами, доброкачественными и злокачественными полипами. Проведен поиск ассоциации определенных аллелей генов OGG1, MSH3, MSH6, MLH1, GSTM1 и TS с риском развития рака толстой кишки.

На основе применения различных методов оценки риска разработан дифференцированный подход к уточнению индивидуального развития заболевания у родственников больных РТК и сформулированы научно-обоснованные принципы медико-генетического консультирования при этом заболевании.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

Систематизированные в результате проведенной работы исследования будут использованы для выявления наследственно обусловленных форм заболевания и лиц, имеющих с генетической точки зрения высокий риск развития РТК, что позволит сформировать регистр, включающий родственников, отнесенных к контингенту повышенного генетического риска развития РТК и организовать их клинический мониторинг с целью ранней диагностики и повышения эффективности медико-генетического консультирования семей, отягощенных РТК. Выявление генотипов, ассоциированных с высоким риском развития спорадической формы рака толстой кишки, позволяет осуществить раннюю диагностику предрасположенности к данной форме онкологического заболевания, а в дальнейшем, возможно, проведение необходимых профилактических мероприятий по предотвращению развития болезни. Этот подход может быть положен в основу выявления генетической предрасположенности к возникновению разных типов опухолей, что способствует снижению смертности от данных заболеваний. Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: VIII конференции молодых онкологов с международным участием «Современные проблемы экспериментальной и клинической онкологии» (г. Киев, 2007г.), совместной научной конференции сотрудников НИИ КО ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН.

По теме диссертации опубликовано 14 работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 167 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Диссертация иллюстрирована 21 рисунком и 33 таблицами. Список литературы включает 203 источника.

145 Выводы:

1. На основании изучения 631 семьи больных с гистологически подтвержденным диагнозом рака толстой кишки (РТК) и 3206 их родственников получены доказательства наследственной предрасположенности к возникновению РТК: а) семейная частота РТК в среднем составила - 12,2%, значительно превысив популяционную частоту этого заболевания - 0,25% (р<0.001). Частоты накопления других злокачественных новообразований, включая ПМЗН среди родственников, также в десятки раз превышают популяционные частоты этих заболеваний. б) наиболее адекватной для описания системы подверженности к РТК и ПМЗН оказывается мультифакториальная модель наследования: доля аддитивной генетической компоненты для РТК составила -81%, еще более высокой она оказалась для ПМЗН - 95%, что позволяет судить об удельном весе генотипической изменчивости изучаемого признака в общей его фенотипической изменчивости в данной конкретной группе больных.

2. Генетический анализ полученных данных продемонстрировал значимую патогенетическую общность наследования РТК и рака органов репродуктивной системы у женщин в семьях больных колоректальным раком и ПМЗН: а) коэффициенты корреляции между подверженностями к РТК и опухолями гормонозависимых органов составили - 19-41%; б) минимальные оценки генетической корреляции между подверженно стями к ПМЗН и РТК 43%, ПМЗН и раком репродуктивных органов у женщин - 2834%.

3. Выявлена значимая этиологическая и генетическая гетерогенность РТК в пределах общей выборки: наследственно детерминированные формы заболевания идентифицированы у 22% больных, ненаследственные (спорадические) -у 78% больных. Структура наследственно детерминированных форм РТК включает: 1) рак толстой кишки как проявление наследственных полипозных синдромов, подтвержденных в некоторых случаях анализом мутаций в гене АРС: семейный аденоматозный полипоз толстой кишки — 8%, синдром Гарднера - 4%, синдром Пейтц-Егерса - 2%, ювенильный полипоз толстой кишки -1% и синдром Турко -1%; 2) неполипозный наследственный рак толстой кишки как проявление синдрома Линча, подтвержденный в некоторых случаях анализом мутаций в генах hMSH2 и hMLHl: синдром Линча I -18%, синдром Линча II - 20%; 3) ПМЗН, у которых все или хотя бы одна опухоль локализовалась в толстой кишке - 47%.

4. Анализ полиморфных вариантов генов OGG1, MSH6, MSH3 и MLH1 у 277 больных РТК показал статистически значимые различия от контрольной группы (р<0,05). Идентифицированы ассоциации полиморфных сайтов разных генов, характеризующиеся высоким (10 генотипов) и низким риском развития рака толстой кишки (3 генотипа). Гомозигота по редкому 'аллелю (С2/С2) гена MSH6 ассоциирована с повышенным риском развития рака кишечника, а гомозигота по редкому аллелю (А2/А2) гена OGG1, ассоциирована с пониженным риском.

5. Поиск ассоциации носительства определенных аллелей генов GSTM1, TS с развитием рака толстой кишки у 115 пациентов показал, что относительный-риск развития РТК для носителей GSTMl-нуль генотипа составил 0,755, для носителей Т^-нуль генотипа составил 1,476, что свидетельствует о возможной роли указанных делеции в процессе развития РТК (р<0,5).

6. Частота мутаций протоонкогена K-ras ( к.12 и к.13) в образцах ДНК, выделенных из 46 полипов и 58 аденокарцином толстой кишки составила в аденокарциномах толстой кишки 43,1%, в доброкачественных полипах — 48,5%, в группе больных с малигнизированными полипами - 69,2%. Максимальная частота мутации GaT (Asp) показана для всех трех групп больных: 32% - в аденокарциномах, 37,5% - в доброкачественных полипах и 33,3% - в малигнизированных полипах. Обнаружение K-ras мутаций в опухолях толстой кишки может служить в качестве неблагоприятного прогностического маркера на различных стадиях малигнизации новообразований толстой кишки.

7. Результаты клинико-генетического анализа явились основой создания комплексной системы медико-генетической помощи семьям с РТК, которая состоит из 3 взаимосвязанных этапов: 1) выявление и регистрация семей, отягощенных РТК и ПМЗН; 2) уточнение генетического диагноза и прогноза заболевания; 3) формирование групп риска и их клинико-генетический мониторинг с целью ранней диагностики и профилактики рака.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящее исследование посвящено одной из наиболее сложных проблем современной онкологии - клинической и молекулярной генетике рака толстой кишки. Медико-генетические исследования рака толстой кишки (РТК), направленные на изучение роли наследственной предрасположенности в развитии РТК и выявление лиц среди родственников с потенциально высоким риском заболевания, высоко актуальны. В последние годы появилось значительное количество работ, свидетельствующих о существовании наследственно обусловленной предрасположенности к развитию РТК, которая может реализоваться в болезнь при участии факторов внешней среды. В связи с этим нами было проведено исследование роли наследственных факторов в развитии РТК с использованием современных методов анализа семейных материалов. Особое внимание уделялось выявлению возможной генетической гетерогенности этого заболевания.

Представлены результаты исследования, целью которого была оценка влияния генетических факторов на возникновение и развития РТК. Исходя из этих положений были разработаны современные подходы клинико-генетических исследований в онкопроктологии, которые включали: 1) изучение семейного накопления рака толстой кишки, как в целом, так и при различных его вариантах 2) оценку и конкретизацию вклада генетических и внешнесредовых факторов риска в подверженность к РТК; 3) установление структуры и соотношение генетически детерминированных форм РТК; 4) изучение молекулярно-генетических маркеров, ассоциированных с высоким риском развития РТК; 5) разработку этапов МГК.

Исследование включает анализ клинико-генеалогических данных о 631 больных (пробандах) раком толстой кишки, с гистологическим подтвержденным диагнозом рака толстой кишки, подвергшихся хирургическому лечению в отделении проктологии ГУ НИИ РОНЦ им. Н.Н.Блохина с 2001 по 2007 гг и 3206 родственников 1 степени родства. Среди пациентов мужчин было 271 (42.9%), женщин - 360 (57.1%). В качестве контроля использовались популяционные частоты распространенности злокачественных новообразований в популяции г. Москвы, которые были вычислены по данным отдела медицинской статистики Московского городского онкологического диспансера за период с 2000 по 2006 гг.

Изучение семейного накопления проводилось в основном в двух группах пациентов, у которых все или хотя бы одна из опухолей локализовались в толстой кишке: I группа - 493 больных раком толстой кишки, II группа - 63 > пациента с первично множественными злокачественными новообразованиями (ПМЗН). Кроме того, отдельно рассмотрены семьи, в которых накопление злокачественных новообразований соответствовало критериям наследственного неполипозного колоректального рака (синдромы Lynch I и II) и семьи, в которых были идентифицированы наследственные полипозные синдромы.

Из 2569 родственников первой степени родства 493 больных раком толстой кишки у 544 (44.1±0.8%) были различные злокачественные и доброкачественные новообразования. Сравнительный анализ частоты накопления злокачественных новообразований среди родственников первой степени родства показал, что она достаточно высока во всех выделенных группах пробандов и колеблется от 34.8±8.3% в семьях с синдромом Lynch-I до 47.9±2.8% - в семьях больных ПМЗН. Частота в популяции составила 2.24±0.0051%.

Высокая частота накопления РТК среди родственников отмечается во всех группах пробандов. Наиболее высокая агрегация отмечена у родственников в семьях с «сайт-специфическим» синдромом Lynch-I (19.1±3.2%) и у пробандов, пораженных ПМЗН (12.8±1.8%), что превышает популяционную частоту в 76 и 51 раз (р<0.001), соответственно. Достаточно высока частота рака аналогичной локализации в семьях пробандов с колоректальным раком - 9.4±0.6%, превышающая таковую в популяции в 38 раз (р<0.001). Из представленных выше данных также видно, что в семьях больных РТК отмечается высоких уровень накопления и других ЗНО: рака желудка (7.3±0.5%), легких (4.0±0.3%), молочной железы (3.5±0.4%), тела матки (1.8±0.3%) и ПМЗН (0.33±0.1%).

Обращает на себя внимание достаточно высокий уровень накопления среди родственниц пробандов рака гормонозависимых органов: рака тела матки (от 1.8±0.3% при РТК до 6.3±1.9% при синдроме Lynch-II), рака молочной железы (от 1.6±1.0% в семьях с синдромом Lynch-I и 3.5±0.4% - при РТК до 7.6±2.1% в семьях с синдромом Lynch-II). Следует отметить очень высокий уровень накопление ПМЗН во всех семьях пробандов, который превышает таковой в популяции в 60 раз при РТК (0.33±0.1%), и более чем в 200 раз при ПМЗН (1.2±0.6%) (р<0.05). В семьях пробандов-женщин, пораженных раком толстой кишки, отмечается более высокий уровень накопления злокачественных и доброкачественных новообразований (46.0±1.3%) по сравнению с семьями пробандов-мужчин (41.3±1.4%) (р<0.05).

Наибольшая агрегация злокачественных новообразований среди родственников первой степени родства отмечается в семьях с синдромом ННКРР. Частота накопления несколько выше в семьях с синдромом Lynch-II по сравнению с семьями с синдромом Lynch-I - 39.2±3.8% и 34.8±3.9%, соответственно (р<0.05).

Таким образом, предварительно можно предполагать, что столь высокая агрегация идентичных случаев заболевания в семьях больных раком толстой кишки обусловлена истинным наследственным отягощением, которое отражает наследование в этих семьях неблагоприятных генетических факторов и обосновывает необходимость проведения генетического анализа.

Учитывая достаточно высокое накопление рака органов репродуктивной системы у женщин в семьях пробандов с колоректальным раком и ПМЗН, были вычислены минимальные оценки генетической корреляции между подверженностями к раку толстой кишки и раком тела матки, шейки матки, молочной железы, яичников и ПМЗН. Установлено, что доля общих генетических факторов, детерминирующих их развитие, достаточно высокая.

Наиболее выражено это для рака толстой кишки и ПМЗН (43%), раком толстой кишки и раком яичников (41%), колоректальным раком и раком тела матки (32%). Что касается доли общих генетических факторов между ПМЗН и колоректальным раком, то он составил 27%. Более выражена генетическая корреляция наблюдалась между ПМЗН и раком репродуктивных органов у женщин (28%-34%). Результаты исследования позволяют предположить наличие патогенетической общности между раком толстой кишки, ПМЗН и раком органов репродуктивной системы у женщин.

С целью проверки предположений о возможной моногенной детерминации РТК и ПМЗН был проведен сегрегационный анализ. Полученные оценки сегрегационных частот оказались весьма далекими от ожидаемых для простого менделевского наследования. Это послужило основанием для проверки мультифакториальной модели наследования, более адекватной с точки зрения предположений о структуре генетической гетерогенности РТК на основе генетических корреляций между отдельными клиническими формами. Для этой цели использовался дисперсионный подход. В результате этого анализа определен вклад наследственных факторов в общую подверженность к РТК определена степень их генетической обусловленности. Доля аддитивной генетической дисперсии для рака толстой кишки составила 81%. Достаточно высоким оказался вклад наследственных факторов в возникновение ПМЗН - 95%. Вклад случайных средовых факторов составил 19% и 5% соответственно. Важно подчеркнуть, что коэффициент наследуемости признака отнюдь не указывает, как иногда ошибочно думают, на относительную роль наследственности (и соответственно среды) в становлении этого признака. Этот коэффициент позволяет судить лишь об удельном весе генотипической изменчивости изучаемого признака в общей его изменчивости и притом только в данной конкретной группе особей. Следовательно, можно предполагать, что предрасположенность к РТК и ПМЗН наследуется полигенно, а взаимодействие генетических и средовых факторов играет важную роль в их возникновении и развитии.

Примененные методы фено- и формально-генетического анализа позволили выделить среди всей массы случаев РТК генетически детерминированные, в развитии которых решающая роль принадлежит наследственным факторам, а также показать, что и эта группа неоднородна. В результате проведенного исследования из 631 семьи с различными клиническими формами РТК было выявлено 138 семей (22%) с наследственно обусловленным РТК и 493 семьи (78%) со спорадическим РТК. Анализ собственного материала исследования позволил выделить следующие генетически-детерминированные формы РТК, которые являются клиническими проявлениями самостоятельных семейных онкосиндромов: 1) рак толстой кишки как проявление аутосомно-доминантных наследственных полипозных синдромов (3,3% от общей выборки); 2) неполипозный наследственный рак толстой кишки как проявление аутосомно-доминантного синдрома Линча (8,7% от общей выборки); 3) первично-множественные злокачественные новообразования, у которых все или хотя бы одна опухоль локализована в толстой кишке (10% от всей выборки).

Анализ нашего материала позволил унифицировать критерии диагностики наследственных форм с целью проведения научно-обоснованного отбора «групп риска» и индивидуального прогнозирования развития заболевания для родственников больного в зависимости от формы заболевания и конкретной семейной ситуации. К ним отнесены следующие характеристики: 1) накопление в семье 2-х и более злокачественных новообразований желудочно-кишечного тракта и других злокачественных новообразований; 2) характер распределения заболевания в семьях соответствует аутосомно-доминантному типу наследования; 3) ранний возраст начала болезни (до50) лет; 4) высокая частота первично-множественных злокачественных новообразований среди членов семьи, в том числе с первично-множественным РТК; 5) развитие РТК на фоне наследственных заболеваний и синдромов, предрасполагающих к этому заболеванию; 6) обнаружение мутаций генов, ассоциированных с возникновением опухоли.

Каждый из этих критериев является показанием для: обращения семьи в профильную генетическую консультацию.

Таким образом, одним из важных результатов изучения наследственной природы РТК является обнаружение его этиологической и генетической гетерогенности. Выявленная генетическая гетерогенность РТК очевидна обусловлена как мутациями в разных генах (локусная; гетерогенность), так и мутациями в одном- гене (аллельная гетерогенность). Для подтверждения вышесказанного нами проведены молекулярно-генетические исследования, направленные на поиск и выявление мутаций и полиморфизмов генов, ассоциированных с высоким риском данного заболевания.

Для поиска ассоциаций были выбраны гены-супрессоры OGG1, MSH3, MSH6 и MLIJ1, участвующие в репарации генетических повреждений. С этой целью мы провели рсстрикционный анализ полиморфных сайтов ДНК в вышеуказанных генах-супрессорах. В каждом гене было исследовано по одному полиморфному сайту. На основании первичных данных были произведены расчеты частот генотипов в контрольной группе: и группе больных, и выполнена статистическая: обработка результатов. Анализ исследованных нами генотипов позволил выявить 13 вариантов генотипов, у которых частота встречаемости в группе больных значимо отличается ( с уровнем значимости'0,05) от этой частоты в контрольной группы.

Результатом совместного рассмотрения генотипов генов; OGG1 и MSH6 явилось то, что генотипы (А1/А2,С2/С2; А1/-,С2/С2; А2/-,С2/С2; А2/-.С2/С2) характеризуются повышенным риском развития; рака кишки, а один генотип (А2/А2;С1/-), наоборот, характеризуется сниженным риском • развития, заболевания. : При; однолокусном анализе по каждому из этих генов имеются значимые различия в распределении гомозигот по редким аллелям: между контролем и группой больных. Так как гомозигота по редкому аллелю (G2/G2)-гена М5Я6 ассоциирована с повышенным риском развития рака кишки, а гомозигота1 по редкому аллелю (А2/А2) гена OGG1, наоборот, ассоциирована с пониженным риском, то интересно посмотреть, какой риск свойственен двойной гомозиготе по редким аллелям обоих генов. К сожалению, количество таких особей в исследованной выборке не позволяет это оценить, однако, особи с генотипом А2/-;С2/С2 (который включает в себя интересующий нас генотип) присутствуют в достаточном количестве и характеризуются повышенным риском развития заболевания, что позволяет предположить, что гомозигота по редкому аллелю гена MSH6 вносит более сильный отрицательный вклад в развитие заболевания, нейтрализуя тем самым положительный вклад гомозиготы по редкому аллелю гена OGG1.

При взаимодействии генов OGG1 и MLH1 выявлен один генотип (А2/А2; D1/-), характеризующийся низким риском развития рака кишки, по-видимому, в данном сочетании ключевую роль играет редкий аллель гена OGG1, который и в одиночном анализе показал сходный результат.

При рассмотрении распределения частот генотипов по полиморфным сайтам двух генов: MSH3 и MSH6, выявлено два генотипа, характеризующихся повышенной частотой возникновения заболевания. Пациенты, у которых присутствует частый аллель гена MSH3 и гомозиготные по редкому аллелю гена MSH6 имеют больший риск развития рака кишки. Анализ частот встречаемости генотипов генов MSH6 и MLH1 показал значимые различия между группой больных и контролем. Выявлено четыре генотипа, характеризующихся повышенной встречаемостью в группе больных: С1/С2, D1/D2; С2/С2, Dl/-; С2/-, D1/D2 и С2/-, D2/-. Характерно, что редкий аллель С2 гена MSH6 присутствует во всех комбинациях.

Таким образом, установлено, что в некоторых случаях, частота встречаемости генотипов по анализируемым генам при их парном сочетании у больных отличается от таковой в контроле. При этом во всех случаях с повышенным риском вносит свой вклад редкий аллель гена MSH6, а во всех случаях с пониженным риском редкий аллель гена OGG1, исключение составляет только генотип С2/С2; А2/-, который наглядно демонстрирует, что наличие генотипа с высоким риском (С2/С2) является определяющим фактором развития заболевания.

На следующем этапе выбраны гены GSTM1, кодирующий глютатион-S-трансферазу Ml, TS, кодирующий тимидилат синтазу, по которым имелись предварительные данные об их возможном участии в процессе развития карциномы толстого кишечника. Полученные данные указывают на "разнонаправленность" действия генов GSTM1 и TS - делеции гена GSTM1 могут играть защитную роль, в то время как делеции гена TS способствуют развитию опухолей кишечника. Поэтому мы провели дополнительный анализ сочетанных генотипов, включающих в себя наличие гомозиготной делеции гена GSTM1 в присутствии хотя бы одного аллеля гена TS в группе больных РТК и контрольной группе. Наличие гомозиготной делеции гена GSTM1 и присутствие хотя бы одного аллеля гена TS также приводит к снижению риска развития рака толстой кишки (ОР = 0.83) (доверительный интервал CI: 0.48 -1.46 определенный для Р < 0.05). Как простой, так и сочетанный анализ генотипов больных РТК и здоровых представителей российской популяции указывают на вклад аллельных состояний генов TS и GSTM1 в развитие несемейных форм РТК. Для определения степени влияния индивидуальных аллелей генов TS и GSTM1 необходимо исследование больших групп пациентов и здоровых лиц.

С целью поиска новых методов ранней диагностики РТК проведен молекулярный анализ мутаций в гене K-ras ( к. 12 и к. 13) в образцах ДНК, выделенных из 46 полипов и 58 аденокарцином толстой кишки. У обследованных больных выявлено 8 различных мутаций, затрагивающих 12 и 13 кодоны гена K-ras. Все они относятся к однонуклеотидным заменам. Мутации в гене K-ras обнаружены у 43,13% больных с аденокарциномами толстой кишки, 48.5% пациентов с доброкачественными полипами и у 69.2% больных с малигнизированными полипами. Наиболее частой из них у пациентов с аденокарциномой толстой кишки является замена гуанина на аденин во 2 положении в к. 12 32,0% и 37,5% у пациентов с полипами. Ни в одном из исследованных образцов с нормальными тканями толстой кишки, а также в нормальных лимфоцитах периферической крови мутации в гене K-ras обнаружены не были. Максимальное число замен (19 из 42 мутаций) обнаружено в образцах с умереннодифференцированными аденокарциномами, вероятно вследствие того, что в исследованной выборке, эта группа, была самой многочисленной. Следует отметить, что у больных из этой группы обнаружены 7 типов мутаций в к. 12 и к. 13. Наиболее частая из них - замена гуанина на аденин во 2 положениив к. 12. Частота таких мутаций равна 45,2%. Частота K-ras-мутаций для группы высокодифференцированных аденокарцином: 44,4%. Показана зависимость частоты K-ras мутаций от стадии опухолевого процесса: 11.1% - для стадии П, 40.0% - для стадии Ш и 61.1% - для стадии IV.

Эти исследования являются перспективными, так как позволяют проводить довольно быстрый скрининг диспластических поражений всех участков толстой кишки с целыо формирования " групп риска ". Обнаружение K-ras мутаций в опухолях толстой кишки позволяет использовать их в качестве молекулярных маркеров для прогноза, а также контроля после операционного лечения.

Определение генетического прогноза в семьях, отягощенных РТК, является важнейшей составляющей медико-генетического консультирования. Основными задачами МГК в онкопрокгологии являются: 1) уточнение генетического диагноза и определение типа наследования в данной семье; 2) определение прогноза потомства и риска заболеть для каждого члена семьи; 3) объяснение семье в доступной форме смысла генетического риска, а также помощь в принятии решения и выборе программы действий.

Таким образом, одним из важных результатов изучения наследственной природы РТК является обнаружение его этиологической и генетической гетерогенности. В этом плане поиск дополнительных фенотипических и генотипических признаков позволит идентифицировать различные патогенетические варианты колоректального рака и на этой основе проводить генетическое прогнозирование развития заболевания как у клинически здоровых родственников больных в зависимости от конкретной семейной ситуации, так и у пациентов.

Применение разработанной нами программы скрининга среди родственников (особенно в наследственно отягощенных семьях) создает реальные возможности профилактики РТК и раннего его выявления в этих семьях. Создание автоматизированного ракового регистра семей позволяет значительно повысить эффективность профилактики злокачественных новообразований за счет своевременного выявления семей, члены которых нуждаются в обследовании, включающее тестирование генов предрасположенности у клинически здоровых родственников.

Подводя итоги выполненного исследования, считаем необходимым подчеркнуть, что для оказания эффективной профилактической помощи семьям, отягощенным злокачественными новообразованиями в целом и раком толстой кишки в частности, целесообразна организация в общей системе онкологической службы специализированной медико-генетической консультации, деятельность которой состоит из следующих этапов: 1) генетический скрининг (выявление и регистрация семей, отягощенных РТК и ПМЗН); 2) генетическое консультирование (уточнение генетического диагноза и прогноза заболевания); 3) формирование групп риска и их клинико-генетический мониторинг (ранняя диагностика и профилактика рака).