Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему:Морфологические особенности развития хронического диссеминированного туберкулезного воспаления в печени и легких при лечении лизосомотропной пролонгированной формой изониазида

од

, г л вез

' 1 0

На правах рукописи

Филимонов Павел Николаевич

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАЗВИТИЯ ХРОНИЧЕСКОГО ДИССЕМИНИРОВАННОГО ТУБЕРКУЛЕЗНОГО ВОСПАЛЕНИЯ В ПЕЧЕНИ И ЛЕГКИХ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ЛИЗОСОИОТРОПНОЙ ПРСЯСНГИРОВАННСЙ ФОРМОЙ ИЗОШАЗИДА

14.00.15 - патологическая анатомия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск - 1996

Работа выполнена в Новосибирском медицинском институте

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Шкурутай В.А.; кандидат медицинских наук Курунов Ю.Н.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Завдман А.М.; кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник Вакулин Г.и.

Ведувря организация: Институт региональной патологии и патологической морфологии СО РАМН

Защита диссертации состоится " ¡^¡Жшъу . в

часов на заседании диссертационного совета Д 084.52.03 Новосибирского медицинского института (Новосибирск, 630091, Красный проспект 52).

о диссертацией цожно ознакомиться в библиотеке Новосибирского медицинского института.

Автореферат разослан " ¡х'&^Р-Лг.

Ученый секретарь диссертационного совета, доцент

Машак А.Н.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

Туберкулез - хроническое инфекционное заболевание с волнообразным течением, при котором могут поражаться все органы человеческого организма, но чаще всего легкие.

Туберкулез в последнее десятилетие включен в интенсивно изучаемую группу гранулематозных болезней, так как самым ярким его морфологическим проявлением является гранулема (Струков А.И., Кауфман О.Я., 1989, Adams D.O.,1876).

В последние годы в мире происходит значительный рост заболеваемости и смертности от туберкулеза, который приобретает черты эпидемии (Хоменко А.Т., 1990). В странах СНГ тайке растет заболеваемость и смертность от туберкулеза, что в основном связано с социальными условиями (Урсов И.Г.,1995). Сложившаяся ситуация накладывает отпечаток на морфологию туберкулезного воспаления и требует разработки новых эффективных, методов медикаментозной коррекции, так как с 1965 года не создано ни одного нового противотуберкулезного средства (Sensi Р., 1989). Одним из возможных решений является создание- пролонгированных лизосомогропных форм известных противотуберкулезных препаратов, которые обладают свойством избирательно накапливаться в вакуолярном аппарате клеток системы мононуклеарных фагоцитов и действовать на находящиеся в нем микобактерии (Рабинович И.М., 1966, Шкурупий В.А., Курунов Ю.Н., Чернова Т.Г. 1991,1993, Шкурупий В.А. и др., 1994, Курунов Ю.Н.,1992, Чернова Т.Г., 1993). Свойство лизосомотропизма может предаваться путем конъюгации действующего вещества с высокомолекулярным носителем, причем матрица может опосредованно потенцировать эффект антимикобактериального препарата (Шкурупий В.А., 1992,1993, Чернова Т.Г., 1993). Другим путем может быть заключение действующего начала в липосомы, что также делает препарат ли-зосомотропныы и позволяет применять его ингаляционно (Курунов Ю.Н., 1994). Подобные направления представляются перспективными, но их разработка требует экспериментального обоснования.

В современных условиях важной особенностью патоморфоза туберкулеза, дающей значительный процент летальности, является рост хронических форм заболевания, сопровождающихся развитием орга-носклероэа, в частности, пневмофиброза, и хронической органной недостаточностью (Струков А.И., Соловьева И.П., 1986).

Процессы склерозирования при туберкулезе недостаточно изучены, что в значительной степени ограничивает возможности разработ-

- г -

ки средств, способных наряду с прямым антимккобактериальным эффекте»! активно влиять на фиброгенез.

Б современной литературе мало не только обзорных работ и монографий, во и оригинальных публикаций, посвященных изучению хропичес-кого туберкулезного воспаления и его лекарственного патоморфоза, особенно на субклеточной уровне (Ерохин В.В., 1987, Шкурупий В. А., 1993).

Цель исследования.

Изучить особенности развития фиброзирования в связи с характером патоморфологических изменений, происходящих в печени и легких экспериментальных животных при "спонтанном" развитии хронического диссеминированного туберкулезного воспаления и его лечении лизосомотропной пролонгированной формой изониазида.

Задачи исследования.

1. Изучить патомсрфологические изменения печени и легких в динамике "спонтанного" раззигия хронического диссеминированного туберкулезного воспаления на тканевом, клеточном и субклеточном уровнях организации.

2. Исследовать антишкобактериальный и вероятный антифиброти-ческии эффекты лизосомотропной пролонгированной формы изониазида при лечении хронического диссеминированного туберкулезного воспаления в печени и легких.

3. Сформулировать представление о вероятных патогенетических механизмах эффекта пролонгированной формы изониазида на процессы фиброгенеза при лечении хронического диссеминированного туберкулезного воспаления в печени и легких.

4. Исследовать возможные динамические и органоепецкфические особенности в развитии хронического диссеминированного туберкулезного процесса при его "спонтанном" формировании и лечении лизосомотропной пролонгированной формой изониазида на тканевом, клеточном и субклеточном уровнях организации в печени и легких.

Научная новизна результатов исследования.

Епервые проведено комплексное (на тканевом, клеточном и субклеточном уровнях организации) стереометрическое исследование структурных преобразований, происходящих в печени и легких при диссеыинированном адоническом туберкулезном воспалении.

Получены свидетельства того, что структурно-функциональные изменения, происходящие в гранулемах, могут быть квалифицированы как процесс их "эволвции", результатом которой является "диссоци-

ация" клеток мононуквеарного рада, как ОДИН из основных механизмов уменьшения количества этих структурам* образований.

Впервые с помощью методов сгерзонэтрда проведен анализ ультраструктурных изменений в волокнистой соединительной ткани, макрофагах и фяброОластах, и их взаимосвявь в регулировании процесса фиброгенеза в динамике развития диссеыинйрованного хронического туберкулезного воспаления в печени и легких при "естественном" развитии и лечении лмзосомотропной пролонгированной формой изони-азида.

С помощью сравнения результатов яэчэяия изониазидом и его ли-зосомотропной пролонгированной формой ттодами стереометрии, дисперсионного, корреляционного и регрессионного анализов обосновано представление о роли матрицы комплексного препарата изониазида, определяющей его преимущества в проявлении антимикобактериального и антифибротического эффектов.

Впервые проведен сравнительный анализ динамических и ультраструктурных преобразований, происходила в клетках ыакрофа-гального и фкбробластического ряда печени и легких, и обусловленных различиями -ыаневого (паренхиматоаного) окружения, при "естественном" развитии диссеминированного хронического туберкулезного воспаления и его лечении лизосоыотропной пролонгированной формой изониазида.

Практическое значение работы.

Полученные данные раскрывают закономерности "эволюции" грану-лематозного воспаления и процессов фиброзирования в различных органах при хронических формах туберкулеза.

Изучаемая лизосомотропная форма изониазида ва декстрановой матрице наряду с большей, чем изониазид, бактериостатической активностью, обладает выраженными антифибротическими свойствами при лечении хронического диссеминированного туберкулеза. Полученные результаты по изучению влияния лечения этим препаратом ва динамику структурных изменений в органах и процессы фиброгенеза могут послужить основой предклинических испытаний данного лекарственного средства для лечения хронических склерозирующих форм туберкулезного воспаления.

На защиту выносятся следующие положения.

1. В динамике развития диссеминированного туберкулезного воспаления в гранулемах происходят изменения, которые, видимо, могут быть квалифицированы как "эволюция", но не "инволюция" этого

структурного образования. Для данного процесса характерно постепенное снижение интенсивности процессов дифференцирования в ряду моноцит-макрофаг-зпителиоидная клетка, не обусловленное дефицитом предшественников эпителиоидных клеток; увеличение доли клеток фибробластического ряда и степени фиброэирования органа, уменьшение количества гранулем путем "диссоциации" ее клеток не фибробластического генеза в связи со снижением градиента хемотаксичес-кого фактора (микобактерий) как результата естественной микроби-цидной активности макрофагов и их производных. При развитии идентичного процесса в связи с заражением вирулентными микобактериями наряду с некробиозом "диссоциация", возможно, является основным механизмом уменьшения количества гранулем при затухании воспалительного процесса.

2. Гранулемы представляю! собой мощный гидролитический потенциал, сосредоточенный в основном в эпителиоидных клетках, видимо, с ограниченной способностью к повторному фагоцитозу в связи с особенностью их взаимных контактов, но являющийся фактором риска при воздействиях триггерного характера, провоцирующих секрецию лизосомальных гидролаз, это может определять деструктивную направленность процесса, что следует учитывать при использовании медикаментозных лизосомотропных средств, лабшшзирующих мембраны лизосом.

3. Полученные данные свидетельствуют о том, что как в гранулемах, так и вне этих образований процесс фиброэирования ь значительной мере модулируется не только функциональным состоянием макрофагов и фибробластов, но и их количественным соотношением в органах.

4. Существуют определенные динамические и органоспецифические особенности развития хронического диссеминированного туберкулезного процесса в печени и легких, обусловленные, по-видимому, как специфичностью "стартовых" условий для развития процесса (исходные различия в количестве и органоспецифических особенностях макрофагов и фибробластов), так и различиями тканевого окружения, играющего существенную роль.

5. Предложенная лизосомотропная пролонгированная форма изони-азвда обладает выраженным антимикобактериальным и антифибротичес-ким эффектами, обусловленными свойствами лизосомотропной дексгра-новой матрицы, потенцирующей антибактериальное действие изониази-да путем повышения естественной микробицидной активности макрофа-

гов, реализуемой усилением уровня обменных и пластических процессов, что оказывает модулирующее влияние на клетки фибробластичес-кого ряда.

6. Полученные данные свидетельствуют о том, что успешное лечение хронического диссеминированного туберкулезного воспаления с персистенцией возбудителя возможно при сочетании антибактериальной химиотерапии и факторов повышения естественной антибактериальной резистентности путем направленного воздействия на клетки макрофагального происхождения, причем лизосомотропные препараты могут быть наиболее перспективными в этом отношении.

Апробация материалов диссертации.

Основные положения диссертации обсуждены на юбилейной пятой научно-практической конференции врачей, посвященной 50-летию Победы в Великой Отечественной войне 1941-1945 гг., в г.Новосибирске, 27-29 июня 1995 года, на Научной сессии сотрудников НМИ, в г.Новосибирске, ноябрь 1995 года.

Внедрение результатов исследования.

Результаты настоящего исследования используются на кафедре патологической анатомии в лекционном курсе по разделам "Специфическое воспаление", "Компенсаторные и приспособительные процессы", 'Туберкулез".

Публикации. Опубликовано 15 печатных работ, из них по теме диссертации - 3.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 3 глав, общего заключения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на /Х? страницах машинописного текста, иллюстрирована рисунками, содержит^ таблиц. Список литературы содержит источника отечественных и иностранных авторов.

Материалы, изложенные в диссертации, получены, обработаны и проанализированы лично автором. Работа выполнена в рамках комплексной темы ДНИЛ "Изучение неспецифических и специфических проявлений острых и хронических нарушении в системе кровь-ткань и разработка эффективных методов их профилактики и коррекции".

СОДЕРЖАНИЕ ГАВОТЫ

В главе "Обзор литературы" изложены современные представления о патогенезе и патоморфологии хронического гранулематозного воспаления, межклеточных взаимодействиях в туберкулезной гранулеме, процессах скл^пляит.гтяния. Обсуждены данные литературы о совре-

!,генных методах лекарственного воздействия на процессы фиброгенеза при туберкулеге, роль лиэосшотропных препаратов в лечении и связанный с з-хш взгошСрфзз.

Материалы и методы исследования.

Работа выполнена на шшах-сгащах гибридах СВАхС57В1/6 2-х месячного возраста, массой тела 19-20 г. В опытах использовано 90 животных.

Дкссешнйрованнъш туберкулез моделировали внутрибрюзашным за-ргдениеы животных вакциной БЦЯ (Ташкентский НИИ вакцин и сывороток). Каддому нивотноыу вводили 0,5 иг вакцины. Одна группа мышей (10 особей) служила интакяныа контролем. Ыыши опытной серии через 2 мэс после заражения были разделены на 3 группы. Первая группа -излеченные - служила контролем. Шшей второй группы через 2 мэс. после заражения начинали лечить в интерыиттирующеы режиме (2 раза в недели) (Урсов И.Г.,1993) взутрибршиннши инъекциями изониази-да в дозе 15 иг/кг изсси тела (Мааковскпй Ы.Д. ,1993). Мышей третьей опытной группы в те хв периоды и в том же режиме начинали лечить комплексным лхзосохотройным препаратом игониазида (КПИ) на декстрановои матрице. Лечение продолдали в течение 6 месяцев. Органы для исследования забирали через 1, 3, 4, Б, 6 мес от начала лэчзния.

Синтез КПИ осуществляли по методике К.П.Хомякова и др.(1965) ü модификации Ю.Н.Курунова в биохимической лаборатории ЦШЛ НШ (зав. лабораторией - к.б.н. А.Б.Еупшев). В качестве источника декстрана использовали коьгыерческий плазмозамещающий препарат "реополиглюкин" с Ш 30-40 кД, в качестве действующего начала -коммерческий препарат изониазида.Полученное полимерное соединение ::срозо растворяется в воде и кислой среде, способно к диссоциации на исходные продукты с сохранением противомикобактериальной активности изониазида (Чернова Г.Г.,1993).

Интермиттирующнй режим введения лекарственных препаратов выбран в связи с тем, что при том же терапевтическом эффекте доза и, соответственно, токсическое действие препарата существенно ниже (УрсовИ.Г., 1991, турулийВ.А., 1992, Чернова Т.Г.,1993).

Объектами исследования служили печень и легкие.

Для гистологического исследования образцы органов обрабатывали по общепринятым методикам (Меркулов Г.А., 1969, Волкова О.В., Елецкий ¡O.K. ,1971).

Для морфометрического исследования гистологические срезы пе-

чени окрашивали по методу ван-Гиэона (Меркулов Г.А,, 1969).

В гранулемах печени подсчитывали клеточный состав (абсолютное и относительное количество - только моноцитов, макрофагов (14ф), эпителиоидных клеток (ЭК), лимфоцитов, нейтрофилов в фибробластов (Фб)), а также диаметр, количество гранулем на единицу площади печени. Используя окулярную сетку из 214 квадратов, подсчитывали объемную плотность фуксинофильных коллагеновых волокон в процентах к площади гранулемы.

По строению гранулемы подразделяли на эпителиовдноклеточные, макрофагальные и фиброзирующиеся (Некрасова Т.П. и др.,1992, Некрасова Т.П. , Нондратьева О.Н.,1993, Altmann H.W. ,1980).

Для гистологических исследовании легких образцы получали из левого легкого (тотально) и правого (средние и нижние отделы). Срезы имлрегнировали серебром для выявления аргирофильнызс волокон по методике Гордона и Свита (Пирс Э., 1969).

Препараты легких подвергали морфометрическому изучению с использованием окулярной сетки из 214 квадратов (Автандилов Г.Г., 1990). Подсчитывали суммарную объемную плотность аргирофильных волокон в легких.

Для исследования в электронном микроскопе, работающем в трансмиссионном режиме, брали образцы печени из правой доли и легкого из верхней доли правого легкого. Кусочки объемом 1 кв мы, в количестве 7-8/орган/животное фиксировали в IX водном растворе четырехокиси осмия на фосфатном буфере при рН 7,2-7,4 (MlHoning G., 1962), дегидратировали в серии спиртов возрастающей концентрации и заключали в эпон 812 (Уикли Б.,1975). Из каждого блока на пирамитоме LKB 11800 получали полутонкие срезы. С блоков, полученных из печени, изготовляли серийные срезы с шагом 8-10 иш до обнаружения гранулем. Блоки затачивали и приготовляли на ультрамикротоме LKB-8800 ультратонкие срезы, контрастировали их водными растворами уранилацетата и цитрата свинца (Reynolds E.R., 1963).

Ультратонкие срезы просматривали в электронных микроскопах JEM-100/ASID/SEGZ и JEM-1010.

Морфометрическому исследованию подвергали цитоплазму четырех типов клеток: в легких - интерстициальных фибробластов и альвеолярных макрофагов, в печени (в гранулемах) - фибробластов и эпителиоидных клеток типа А. Со случайно выбранных участков цитоплазмы делали снимки (40-50 снимков каждого типа клеток на подгруппу из 5-ти животных) при увеличении изображения в 3500 раз.

Морфометрические исследования выполняли в соответствии с рекомендациями, изложенными в многочисленных работах, посвященных теоретическому обоснованию и конкретным примерам применения этих методов (Автандилов Г.Г., 1973, 1980, 1990; Христолюбова Н.Б., Шилов А.Г., 1974; Вейбель Э.Р., 1970, 1979). При статистической обработке результатов морфометрии использовали методы регрессионного, корреляционного и дисперсионного анализов. Различия между сравниваемыми величинами считали достоверными при Р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Динамика структурных изменений в гранулемах печени на све-тооптичвском уровне.

С ранних периодов эксперимента (2-3 мэс с момента заражения) наблюдали полиморфизм гранулем, которые по строению были разделены вами на эпителиоидноклеточные, макрофагальные и фиброзирующие-ся (Некрасова Т.П. и др., 1992, Некрасова Т.П., Кондратьева О.Н. ,1993, Аигеапп Н.И. ,1980).

При "естественном" развитии процесса наблюдали уменьшение численной плотности эпителиоидноклеточных, увеличение - макрофа-гальных и фиброзирующихся гранулем в печени (Рис.1,2,3). Отмечена сильная отрицательная нелинейная корреляционная связь между динамикой макрофагальных и эпителиоидноклеточных гранулем (п-0.99, Р<0,001), а также между динамикой эпителиоидноклеточных и фиброзирующихся гранулем (ц-0,88, р<0,01). Динамика изменения количества макрофагальных и фиброзирующихся гранулем описывается сильной положительной нелинейной корреляционной связью (п-0,97, р<0,001).

Общее количество гранулем (Рис. 7) и их средний диаметр у не-леченных нивотных плавно снижались со стабилизацией в последние месяцы эксперимента.

С течением времени росла степень фиброзирования гранулем (доля фуксинофяльных коллагеновых волокон в % к площади гранулем) (Рис.6). Во все периоды присутствовали гранулемы без признаков фиброзирования.

На клеточном уровне в гранулемах уменьшалось количество эпи-телиоидных клеток, практически не изменялось - моноцитов и переходных форм, снижалось суммарное содержание клеток макрофагалького происхождения (Рис.4,5). Возрастало количество фибробластов со стабилизацией в последние месяцы.

Рис.1.

динамика содержания эпителиоцдноклеточньк гранулем в печени

месшы

здесь и далее период с момента заражения

БЦЛ

| Изоыиаэид В5Э кпи

РИС.3.

динамика содержания ♦иброэируюшюсся гранулем в печени

•v я>

ЪесяцьГ

ДИНАМИКА СОДЕРЖАНИЯ МАКРОМГАЛЬНЬК ГРАНУЛЕМ

о пел (сии

2 Э 6 • 7 в

МЕСЯЦЫ

Рис.4.

ГРА«+ЖИ РЕГРЕССИИ СОДЕРЖАНИЯ ЭПИТЕПИОЙОНЬК

| —— БШ -Изонимид -«— КЛИ

ГРАФИКИ РЕГРЕССИИ СУММАРНОГО СОДЕРЖАНИЯ клеток МАКРОФАГАПЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

I —»— БЦЖ -Иэониаэив — КПИ

Рис.7.

динамика численной плотности граалем печени (и«1 квадратный миллиметр сре»а печени)

3 Ъесш!

| ваа бцж

Изониазид БЯ КПИ

Рис.в.

ГРАФИКИ РЕГРЕССИИ ♦ИБР0ЭИР08АНИН ГРАК/ГЕМ

I —— БЦЖ -Иаонммид —— КПИ'

Рис.8.

ОБЪЕМНАЯ ПЛОТНОСТЬ ФИБРОЗНОЙ ТКАНИ В ПЕЧЕНИ

Таким образом, при "естественном" развитии хронического дис-семинированного туберкулеза у мышей, относительно резистентных к вакцине ВЦЖ, имела место "эволюция" гранулематозного процесса с' тенденцией к стабилизации, что, возможно, связано с трансформацией при хроническом процессе основной массы микобактерий в формы, менее способных инициировать превращение Ыф в ЭК (Земскова З.С., Дорожкова И.Р.,1984)."Эволюция" гранулем также предполагает, вероятно, деградацию микобактерий до продуктов, не оказывающих хемотаксического действия на моноциты и не способных индуцировать трансформацию моноцитов в ЭК.

При лечении оценивали те же показатели, что и в контрольной группе.

Не выявлено значительных отличий между группами в динамике различных типов гранулем (Рис.1,2,3). При изучении клеточного состава обнаружено, что в группе животных, леченных НИИ, во все периоды наблюдения имело место максимальное содержание эпители-оидных клеток и всех клеток макрофагального происхождения (Рис. 4,5). Дисперсионный анализ показал, что указанные различия обусловлены эффектом матрицы КПИ. Увеличение количества макрофагаль-ных элементов в гранулемах этой группы мышей сопровождалось снижением количества фибробластов и степени фиброзирования гранулем.

Эффективность лечения оценивали, определяя количество гранулем на единицу площади среза печени. В обеих группах леченных животных количество гранулем уменьшалось, но быстрее - при лечении КПИ. Так, после 6 месяцев лечения количество гранулем у животных, леченных изониазидом, было в 2 раза меньше, чем в контроле, а пра лечении КПИ - почти в 4 раза (Рис.7).

С целью оценки динамики процессов склерозирования в печени подсчитывали объемную плотность соединительной ткани. В связи с тем, что у мышей всех опытных групп объем фуксинофильных коллаге-новых волокон в печени вне гранулем (зрелый коллаген преимущественно 1 типа) был незначителен, считали, что основная масса фиброзной ткани сосредоточена в гранулемах. При "естественном" развитии показатель объемной плотности поствоспалительной фиброзной ткани повышался, в группах же леченных мышей, начиная с 5 месяца после заражения, неуклонно снижался, причем быстрее при лечении КПИ. Таким образом, после 6 месяцев лечения в печени животных, леченных изониазидом, фиброзной ткани было в 2 раза меньше, чем в контроле, а при лечении КПИ - в 5 ра4 (Рис.8).

Анализ полученных результатов лечения хронического гранулема-гозного туберкулезного воспаления позволил заключить, что лечение КПИ более аффективно, чем свободным изониазидом, несмотря на одинаковую курсовую догу иэониазида, полученную животными, Акткфвб-рогенное -действие КШ, вероятно, опосредованное Мф и ЭК, обусловлено пролонгированным стимулирующим действием его матрицы на процессы дифференцировки макрофагов в ЭК, задержкой уменьшения их количества в ранние периоды эксперимента. Этим объясняется и больший, в сравнении с изониазидом, бактериостатическии эффект КПИ, проявляющийся в уменьшении размеров гранулем, а также их количества, что свидетельствует о его большей эффективности и в отношение циркулирующего пуда микобактерий. Уменьшение количества гранулем в органе мы объясняем диссоциацией из гранулем клеток макрофагального происхождения, которая значительно усиливается при лечении, особенно КПИ. Наряду с некрозом диссоциация является, вероятно, основным механизмом уменьшения количества грануле» при заражении вирулентными микобактериями.

Морфологические изменения в легких при лечении хронического диссеминированного туберкулеза.

К моменту начала эксперимента (2 мес. после заражения) в легочной ткани животных мы обнаружили, что типичные эпителиоиднок-леточные гранулемы, в отличие от печени, встречаются редко, а доминируют макрофагальные гранулемы и инфильтраты, расположенные преимущественно периваскудярно и перибронхиально, а также редко, даже в серийных срезах, крупные очаги массивной мононуклеарной инфильтрации ыежальвеолярных перегородок - очаговая интерстици-альная пневмония, с локализацией, в основном, субплеврально.

Морфометрда подвергали коллагеновые волокна как в гонах воспаления, так и вне их.

В легочной ткани определяли суммарную объемную плотность ар-гпрофильных волокон межальвеолярных перегородок, перибронхиалькой и пернваскулярной соединительной ткани (Рис.9,10), а также просветов альвеол. Обнаружено, что у интактных животных в начале эксперимента (2 мес. после заражения) и в конце (8 мес) совершенно не изменялась суммарная объемная плотность аргирофильных волокон (29,72), объем же альвеол изменялся незначительно (62,4Х и 61,72 соответственно), что свидетельствует об отсутствии возрастных склеротических изменений в легочной ткани интактных животных.

ДИНМИИКА СУММАРНОЙ ОБЪЕМНОЙ плотности АРГИРО€ИПЬНЬК ВОЛОКОН 8 ЛЕГКИ*:

JO] œ да S& •V » « » 6 о I........................................... 1

1 jjj ..д Jiüí Ч"

I ¡gu3 еад "Sa иаон Esa кпи |

мьемтя плотноcrb^Swijx (4 и сушмрны объем

Н»Я ПЛОТНОСТЬ ЛИЭОСОМ (Oí ЭК Г M.WTEU ПЕЧЕНИ

* POßi ЗДЕСЬ И ДАЛЕЕ НЕПЕЧЕННЫЕ В СРАВНЕНИИ С ИНТАК-ТНЫМИ, ЛЕЧЕННЫ6-С НЕЛЕЧЕННЫМИ

[ваш» "Е^аизои"Ёакпи |

ГРАФИКИ РЕГРЕССИИ СУММАРНОЙ ОБЪЕМНОЙ ПЛОТНОСТИ АРГЙРОФИЛЬНЫХ ВОЛОКОН В ЛЕГКИХ

| — БШ> -Иаоншаид —— КПИ

Рис.12.

ОБЬЕШ*Я ПЛОТНОСТЬ ВТОРИЧНЬК ЛИЗОСОМ14 И ПОВЕРХНОСТНЫ! ПЛОТНОСТЬ ИХ МЕМБМН (Е) В АЛЬВЕОЛЯРНЫЕ МДО04ЛГАХ

I Е5Э Интакт В23 БШ» ИД Изон В53 ЮТИ

У животных всех опытных групп отмечено снижение объемной плотности аргирофильных волокон в ходе эксперимента (Рис.10).

В группе мышей, не подвергавшихся никаким воздействиям, через 2 мес. после варажения объемная плотность аргирофильных волокон составляла 35,32 и плавно снижалась к концу эксперимента до 30,4%. У мышей, леченных изониагидом, соответствующие значения составили: в начале эксперимента - 34,6%, после б мес. лечения -29,2%. В группе животных, леченных КПИ, соответствующие цифры -29,3% И 22,6%.

Таким образом, во все периоды эксперимента максимальная объемная плотность аргирофильных волокон наблюдалась в группе животных, леченных изониагидом, а минимальная - у леченных КПИ мышей. Показатели контрольной группы (нелечениые) занимали промежуточное положение (рис.9,10). Результаты дисперсионного анализа свидетельствует, что лечение изониагидом достоверно повышает содержание аргирофильных волокон в легких в сравнении с контрольной группой (Г-7,0, Р<0,05), лечение же КПИ снижает их содержание в сравнении с нелеченными животными (Р-40,8, £<0,0001). Различия между показателями в двух группах леченных животных обусловлены матрицей КПИ (Р-75,4, Р<0,0001).

Дополнительно было предпринято морфометрическое исследование общего относительного объема межальвеолярных перегородок при окраске препаратов гематоксилином и эозином, что позволило оценить объем как коллагеновых и эластических волокон, так и клеток.

Полученные результаты свидетельствуют, что у интактных животных относительный объем межальвеолярных перегородок практически не увеличивался с возрастом, а во всех опытных группах во все периоды эксперимента был ниже контрольных значений, причем между опытными группами различия оказались незначительными. Эти данные, совместно с результатами морфометрии аргирофильной стромы, можно интерпретировать следующим образом.

При хроническом продуктивном воспалении у животных изучаемых нами групп, как было указано выше, преобладали периваскулярные и перибронхиальные инфильтраты и очаги интерстициальной пневмонии. Именно в этих участках концентрируются основные массы новообразованной соединительной ткани (посттуберкулезный склероз). В межальвеолярных же перегородках, составляющих основную массу легочной ткани,! 7 животных всех опытных групп в той или иной степени лыалось уменьшение объема аргирофильных волокон, относительного

объема перегородок з целом и увеличение объема альвеол, что свидетельствует о повышении воздушности легких и перераспределении коллагена в легочной ткани - уменьшении его объема в межальвеолярных перегородках и увеличении в периваскулярной, перибронхи-альной ткани и в очагах инфильтрации.

Полученные данные сопоставимы с результатами изучения гранулем печени, и свидетельствуют, что исследуемые нами лекарственные препараты оказывают разнонаправленное влияние на склеротические процессы (как непосредственно в очагах туберкулезного воспаления, гак и вне их) в различных органах - легких и печени - при моделировании диссеминкрованного туберкулеза.

Удьтраструктура эпителиоидяых клеток и фибробластов гранулем печени, альвеолярных макрофагов и интерсткциальных фибробластоз легких при лечении хронического диссеминированного туберкулеза.

Удьтраструктура эпителиоидяых клеток гранулем печени. У животных контрольной группы (нелеченные) в ЗК гранулем среди всех органелл преобладали крупные лязосош, в основном вторичные, суммарный объем которых приближался к 4QX объема цитоплазмы, представляя, таким образом, значительный гидролитический потенциал.

Лечение изониазвдом приводило к снижению в 1,65 раза объемной плотности вторичных лизосом, а поскольку эти лизосомы преобладали, то и суммарной объемной плотности лизосом (Рис.11).

У животных, леченных КПП, объем лизосомального аппарата ЗК был также ниже по сравнению с контролем, но значительно выше, чем у леченных изониазвдом животных (Рис.11). Объяснением этому может служить лизосомотропизм КГО1. Увеличение (в сравнении с леченными изониазвдом мышами) объема лизосомального аппарата может способствовать коллагенолитической функции ЭК, т.к. на уровне световой микроскопии у дивотных этой группы отмечен самый низкий уровень фиброзирования в динамике. Возможно также, что у животных этой группы усилен экзоцитоз лизосоиальных ферментов, т.к. у hie тлеется гиперплазия комплекса Гольджи.

Полученные результаты могут свидетельствовать, что у аелечен-ных животных размножение микобактерий может обусловить увеличение объема вакуолярного аппарата, но зто сопряжено с ослаблением бак-териостатических свойств клеток вследствие угнетения активности лизосомальных ферментов (Chlcurel М., Garcia Е., Goodsaid F. 1988), а также с лабилизацией мембран лизосом с последующей дест-

рукцией тканей. У животных, леченных игониагидом, уменьшение суммарного объема лиэосом можно связать со снижением лизиса коллагена лизосомальными катепсинами и относительным преобладанием процессов его синтеза, что было отмечено на светооптическом уровне. В отличие от данных Т.Г.Черновой (1993), на более поздних этапах развития хронического туберкулезного воспаления обнаруженное нами на светооптическом уровне снижение количества, размеров гранулем и уменьшение в них содержания зпителиоидных клеток на субклеточном уровне сопровождается "стабилизацией" динамики изменений ультраструктур ЭК, даже несмотря на стимулирующий эффект КПИ и изо-ниазида, но в го же время не приводит к угнетению бактерицидной способности ЭК, возможно, вследствие активации внелизосомального механизма - пероксидного, характерного для клеток, находящихся в аэробных условиях (Lowrie D.B., Andrew P.W., 1988, Kasama Г. et al., 1992). Наши данные, также как и результаты В.А.Шкурупия (1991, 1992,1993), Т.Г.Черновой (1993), С.А.Архипова (1994,1995), подученные в краткосрочных экспериментах, говорят о том, что КПИ стимулирует повышение естественной бактерицидности клеток макро-фагального ряда в гранулемах печени.

Ультраструктура альвеолярных макрофагов. В легких вакуолнрный аппарат Мф нелеченных мышей гипертрофировался - увеличивалась объемная плотность лизосом, в основном за счет вторичных (на 27,6%), поверхностная плотность их мембран (на 21%) (Рис.12). Вместе с увеличением объема вакуолярного аппарата (на 21,2%) возрос и объем эндоцитозных вакуолей (на 31,8%), что свидетельствует об активации процессов пгаюцитоза, обусловивших, вероятно, увеличение доли вторичных лиэосом и всего вакуолярного аппарата.

Лечение изониазидом приводило к уменьшению как объемной плотности (на 21,6%), так и поверхностной плотности наружных (на 22,8%) и внутренних (на 25,5%) мембран митохондрий в сравнении с нелеченныыи мышами. Процессы синтеза белка "на экспорт", вероятно, были несколько снижены даже в сравнении с нелеченными животными в контроле, о чем свидетельствует уменьшение численной плотности прикрепленных рибосом и объемной плотности цистерн шероховатого эндоплазматического ретикулума (ШЭР). У леченных изониазидом мышей увеличивалась объемная плотность первичных лизосом (в 2 раза) и уменьшалась - вторичных (на 17,6%), суммарная объемная плотность лизосом после лечения уменьшилась на 11,7% (рис.12).

Таким образом, результаты изучения ультраструктур альвеолярных макрофагов свидетельствуют, что при "естественном" развитии процесса имела место гипертрофия вакуолярного аппарата, обусловленная активацией процессов эндоцитоза, в сравнении с интактными животными. Вместе с тем синтез белков оказался значительно снижен. Лечение изониазидом приводило к нарушению энергообеспечения клеток, что проявлялось дистрофическими изменениями митохондрий -набуханием, разрушением крист. Объем вакуолярного аппарата в сравнении с нелеченными животными снижался. Полученные данные подтверждают предположение, что усиление фиброзирования легочной ткани при лечении изониазидом в сравнении с нелеченными мышами объясняется не усилением фиброгенеза, а угнетением фагоцитарной и коллагенолитической активности органных макрофагов. Лечение КПИ приводило к сходным изменениям ультраструктуры в сравнении с лечением изониазидом, что также свидетельствует о снижении функциональной активности альвеолярных макрофагов, и дает основание связать этот эффект с длительным введением изониазида, так как ранее (В.А.Шкурупий и др.,1993, Т.Г.Чернова,1993) было показано, что матрица препарата (декстран) активирует макрофаги.

Ультраструктура фибробластов гранулем печени. При "естественном" течении процесса в Фб гранулем наблюдали морфологические свидетельства значительного уровня синтеза коллагена наряду с признаками задержки его экскреции, о чем свидетельствуют расширенные цистерны ГОР с хлопьевидным материалом, занимающие больше трети объема цитоплазмы, и большее в сравнении с группами леченных животных содержание рибосом (Рис. 14).

При лечении изониазидом значительно (на 44%) снижалась объемная плотность ШЭР, на 35% - поверхностная плотность его мембран, что сопровождалось уменьшением на 29% количества свободных и на 32% - прикрепленных рибосом в сравнении с нелеченными мышами в контроле (Рис.14,16).

При лечении КПИ, так же как и при лечении изониазидом, отмечали, но менее выраженное, уменьшение объема ШЭР и незначительное уменьшение количества свободных и прикрепленных рибосом в сравнении с контролем (Рис.14,16).

Таким образом, можно с большой долей вероятности предположить, что лечение КПИ приводит к более низкому уровню коллагено-генеза, что и было нами обнаружено на светооптическом уровне.

m n n^g

S Œ

ö S еихц-'гихц-з 'v.-u

n > n ^

еихн'гюш-s W

Í \ ï П

euau'ouxu

Ультраструктурные изменения Ф5 гранулем говорят о том, что секреция тропоколлагена фибробластами мышей всех трех групп в исследуемый период была в значительной степени блокирована при явных признаках низкой функциональной активности и уменьшения количества ЭК. Наряду с этим, свободный изониазид, вероятно, угнетает лизис коллагена самими Фб, влияя на синтез и "сборку" лизо-сом, что и проявилось уменьшением объемной плотности лизосомаль-ного аппарата.

Ультраструктура фибробластоз легких. В легких у нелеченных животных наблюдали структурные признаки усиления синтеза коллагена фибробластами и задержки его секреции, о чем свидетельствует расширение цистерн ШЗР (Рис.13). Вместе с этим отмечено значительное увеличение объемной плотности лизосом в Фб (в 2,3 раза) за счет вторичных (в 2,7 раза).

В группе животных, леченных изониазидом, поверхностная плотность наружных и внутренних мембран митохондрий была ниже на 20,3% и 20,4% соответственно, а численная плотность - на 15,4% ниже, чем у нелеченных, и на 31% меньше, чем у интакгных жизот-ных, что свидетельствует о значительном уменьшении количества митохондрий, их набухании и уменьшении энергообразующей способности при лечении изониазидом. Снижение энергообеспечения сопровождалось уменьшением объема ШЭР (в 1,7 раза) и поверхностной плотности его мембран (в 1,5 раза) в сравнении с нелечекными, а также уменьшением - на 35% - количества прикрепленных рибсссм (Рис.13, 15). Из полученных данных видно, что пластические процессы в клетках снижались, что подтверждается уменьшением показателя суммарной поверхностной плотности мембран органелл на 20%. Лечение изониазидом приводило также к значительному снижению поверхности мембран лизосом, их объемной и численной плотностей как в сравнении с нелеченными, так и интактными животными. Таким образом, обнаруженное на светооптическом уровне относительное увеличение количества коллагеновых волокон в строке легких при лечении изониазидом обусловлено не увеличением их синтеза, который оказался даже сниженным, а подавлением процессов коллагенолизиса, в том числе самими Фб.

Лечение КПИ привело к следующем изменениям ультраструктуры Фб. Объемная плотность митохондрий, так же, как и при лечении свободным изониазидом, снижалась. Уменьшались и показатели по-

верхностной плотности мембран, причем внутренних - наиболее значительно (на 402), что говорит о снижении процессов окислительного фосфорилирования. Объем цистерн ШЭР был ниже, чем у нелечен-ных, на 18%, но выше, чем у леченных изониазидом, на 30%. Белок-синтетические процессы также были угнетены, о чем свидетельствует снижение количества как свободных (на 19%), так и прикрепленных (на 28%) рибосом в сравнении с нелеченными мышами (Рис.13,15).

Полученные данные позволяют предположить, что лечение КПИ, также как и лечение свободным изониазидом, угнетает пластические процессы в фибробластах легких (суммарный показатель Sv мембран органелл снижается на 21% в сравнении с нелеченными животными), подавляет как синтез коллагена, так и его деградацию самими фиб-робластами.

Результаты исследования свидетельствуют, что использование изониазида, коныогированного с реополиглюкином, для лечения хронического диссеминированного туберкулеза, за счет придания лизо-сомотропизма и свойства стимулировать трансформацию моноцитов в эпителиоидные клетки в гранулемах, приводит к усилению микроби-цидных свойств клеток СМФ, препятствует склерозированию органов, уменьшает гидролитический потенциал, сосредоточенный в макрофагах и является перспективным для дальнейшего изучения.

ВЫВОДЫ

1. Для хронического диссеминированного туберкулезного воспаления характерна совокупность морфофункциональных преобразований в гранулеме, определяемых как процесс "зволюции", завершающийся "диссоциацией" ее клеток не фибробластического генеза - как основного механизма уменьшения количества гранулем в тканях.

2. Высокий гидролитический потенциал, сосредоточенный в моноцитах и их производных как в гранулемах, так и вне их, является фактором риска при воздействиях, провоцирующих секрецию гидролаз или дабилизирующих мембраны лизосом, к числу которых следует относить и лизосомотропные препараты.

3. При лечении хронического диссеминированного туберкулезного воспаления предложенный препарат изониазида на лизосомотропной декстрановой матрице снижает, гидролитический потенциал, создаваемый макрофагальными клетками, стимулируя процессы "диссоциации" гранулем; обладает выраженными антимикобактериальным и антифибро-

тическим эффектами, в значительной степени детерминированными свойствами матрицы.

а. антифибротический эффект пролонгированной лизосомотропной формы изониазида реализуется модулирующим влиянием матрицы на клетки макрофагального ряда в тканях и гранулемах печени и легких, опосредованно через клетки фибробластяческого ряда и паренхиму органов.

б. большая антибактериальная эффективность пролонгированной формы изониазида по сравнению с изониазидом обусловлена лизосо-мотропными свойствами матрицы, стимулирующей пластические и обменные процессы в макрофагах.

4. При развитии хронического диссеминироваюгого. туберкулезного воспаления имеются динамические и органоспецифические особенности, обусловленные исходными отличиями "участников" данного процесса (тканевоспецифические макрофаги и фибробласты) и условиями микроокружения (паренхима органов) в соответствии со спецификой конкретного органа, что, вероятно, определяет различия в количестве гранулем и динамике их преобразований, степени фибрози-рования тканей органа, особенностях деструктивных процессов и их последствий.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Шкурупий В.А., Курунов Ю.Н., Филимонов П.Н., Панасенко С.Г. Особенности структурных преобразований в гранулемах при лечении хронического диссеминированного туберкулеза комплексным ли-зосомотропным препаратом изониазида.//Сборник научных трудов юбилейной научно-практической конференции. -Новосибирск, 1995, -С.292-293

2. Филимонов П.Н., Шкурупий В.А., Курунов Ю.Н. Сравнительная морфометрия ультраструктур фибробластов легких и гранулем печени при лечении хронического диссеминированного туберкулеза. //Тез. докладов научной сессии сотрудников НМИ. -Новосибирск. -1995, -С.39

3. Филимонов П.Н., Шкурупий В.А., Курунов Ю.Н. Морфологические изменения в гранулемах при лечении хронического диссеминированного туберкулеза комплексным препаратом изониазида. //Тез. докладов научной сессии сотрудников НИИ. -Новосибирск. -1995.-С.40.