Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Морфологические особенности нуклеологенеза лимфоидных клеток в норме, при лимфосаркомах и остром лимфобластном лейкозе

ЙО 0 9?

российская академия медицинских наук

ВСЕРОССИЙСКИЙ ОРДЕНА В.И.ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи

ПОГОРЕЛОВ Валерия Михайлович

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ НУКЛЕОЛОГЕНЕЗА ЛИМФОИДНЫХ КЛЕТОК В НОРМЕ, ПРИ ЛИМФОСАРКОМАХ И ОСТРОМ ЛИМФОБЛАСТНОМ

ЛЕЙКОЗЕ

14.00.29 - Гематология и переливание кроен

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинский наук

/

Москва -1992 г.

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте гематологии и интенсивной терапии Всероссийского гематологического научного центра Российской Академии Медицинских Наук.

Научный консультант

Доктор медицинских наук, профессор Козннец Г.И.

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор ТоруОарова Н.А.,

Доктор медицинских наук, профессор Морозова В.Т. ,

Доктор биологических наук, профессор Ленская Р.В.

Ведущее учреждение - Всероссийский онкологический научный центр Российской Академии Медицинских Наук.

Зашита состоится "..............".......................................... 1992 г.

в "............" час. на заседании специализированного совета Д 074.08.01 во

Всероссийском гематологическом научном центре РАМН (125167, Москва, Новозыковский проезд, 4а).

С раОотои можно ознакомиться в СиОлиотеке института.

Автореферат разослан "......................"......... 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Реук В Л-

ttSnE-T"!

т--у j

¿ЯГ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Пролиферативныи статус опухолевых клеток является комплексной характеристикой злокачественного процесса. Результаты его оценки важны как для классификации и, следовательно, диагностики новообразований любого генеза и локализации, так и для выбора их наиболее рациональной терапии. Классификации гемобластозов в настоящее время подвергаются значительному пересмотру. Это прежде всего связано с разработкой и применением программной терапии злокачественных заболеваний системы крови, ответ на которую во многом определяется морфологическим типом малигнизирозанных клеток [А.И.Воробьев и М.Д.Бриллиант, 1985; Г.И.Козинец и соавт., 1986].

До недавнего времени способность к нерегулируемому, безграничному делению считалась самым главным свойством опухолевой клетки. Однако изучение могеку-лярных механизмов процессов делания и дифференцировки клеток поставило под сомнение эту концепцию туморогенеза [А.К.Белоусова, 1987]. Оказалось, что клеточный цикл находится под контролем белковых продуктов соответствующих генов (cdc -гены контроля клеточного цикла) и регулируется как на транскрипционном, так и на посттрансляционном уровнях [Lewin, 1990]. Более того, все циклоспецифические морфологические изменения клеток являются следствием взаимодействия белковых транскриптов по принципу "энзим - субстрат". Опухоль может отличаться от нормы появлением специфических опухолевых белков, антигенов злокачественной пролиферации [Hall & Woods, 1990]. Внося существенные изменения в клеточную кинетику, опухолевые белки приводят к возникновению морфологической атипии клеток, которая может быть отражением степени злокачественности опухолевого процесса.

На современном уровне знаний проблема градации опухоли на степени злокачественности остается нерешенной. Von Hansemann первым пришел к выводу (1890), что морфология опухолевых клеток создает представление о их биологии и коррелирует с клиническими проявлениями заболевания [Underwood, 1990]. Как известно, классификации, дифференциальная диагностика и прогнозирование течения гемо-бластозов в первую очередь обоснованы морфо-цитохимическими особенностями лейкозных клеток. Преимущества методов количественной цитологии для их выявления все более очевидны: стандартный подход к исследуемому материалу, объективизация, повышение воспроизводимости получаемых результатов, вывод решающего правила, автоматизация сложных процессов измерения и машинная классификация клеток [Bartels, 1980]. Уже накоплена информация, открывающая принципиально новые возможности решения вопросов теоретической и практической гематологии.

Так, обнадеживающие в плане автоматической классификации властных клеток результаты получены при многомерной оценке данных анализа изображения клеток костного мозга больных рефрактерной анемией и острым лимфобластным лейкозом [Seigneurin et а!.. 1986; Tosi et ai., 1987). Морфометрические характеристики ним-

фоидных клеток в тонких срезах опухоли оказались пригодными для субклассификации неходжкинских лимфом [Crocker, 1984]. Отмечена положительная корреляция цитометрических характеристик лимфоцитов больных хроническим лимфолейкозом с прогностическими факторами течения заболевания [Lanza et а!., 19В5].

Без глубокого изучения гемопоэтических клеток нельзя думать о теории, которая с современных позиций могла бы объяснить строение и функцию клеток нормального гемопоэза или их неоплазированных аналогов при различных гемобластозах. Теперь ясно, что морфология клетки по-суидеству определяется разнообразием структурных (гистоновьк и негистоновах) белков, энзимов, включая ДНК- и РНК-полимеразы, и целый ряд других макромолекулярных соединений [Busch, 1990]. Непример, структура, размеры (обьем) и количество ядрышек отражают транскрипцию рибосомных генов, которая зависит от типа ткани, интенсивности клеточного метаболизма, степени клеточной дифференцировки и стадий клеточного цикла [Kamel et ai., 1990]. В этой связи нуклеолярный аппарат клетки с конца прошлого столетия привлекает к себе внимание исследователей.

Ядрышко является функцией рибосомных генов, локализованных в спутничной нити, т.е. в ядрышкообразующих районах (ЯОР), акроцентрических хромосом групп D и G набора клеток человека. Отсюда, акроцентрические хромосомы считаются ядрьш-кообразующими. Они формируют новое ядрышко, т.е. участвуют в нуклеологенезе сразу же после выхода клетки из митоза. В последние годы показано, что транс-крипционно активные ЯОР могут быть выявлены при световой микроскопии после обработки препаратов метафазньсх хромосом или интерфазных клеток 50% раствором нитрата серебра (Ag-ЯОР реакция) [Goodpasture & Bloom, 1975; Howell & Black, 1980; Ploton et a!., 1986].

В природе реакции лежит специфика связывания ионов металла нуклеолярными кислыми негистоновыми белками, по-видимому, принимающими участие в транскрипции и процессинге пре-рибосомной РНК, осуществляющими транспорт прерибо-сомных частиц в цитоплазму и, таким образом, структурирующими ядрышко в интерфазе [Kling et al., 1980; Lapeyre et al., 1987; Ans & Blobel, 1983; Borer et at., 1989; Caizergues-Ferrer et al., 1990]. По своей сути реакция является цитохимической. На практике в нормальных интерфазных клетках, например, в Go-лимфоцитах периферической крови, Ag-ЯОР обычно плотно агрегируют внутри одного или двух кольцевидных ядрышек. Их число, как и форма, количество и размеры нуклеол, в стимулированных митогеном in vitro клетках увеличивается только с повышением уровня активности рибосомного хроматина и пролиферации клеток [Wachtier et al., 1990). В метафазе митоза последующих делений при этом отмечается уменьшение частоты сателлитыых ассоциаций акроцентрических хромосом, среднего количества ассоциированных хромосом на клетку и среднего количества хромосом в одной ассоциации. In vivo для клеток другого типа, например, этритроидных или гранулоцитарных предшественников, аналогичная картина, по крайней мере для интерфазных ЯОР, имеет место только на ранних стадиях дифференцировки и вызревания [Smetana &

Ukovsky,19B6], Таким образом, в норме такие параметры нуклеологенеза, как количество, размеры и распределение ядрышек и Ag-ЯОР являются отражением активности рибосомного хромаматина.

Как показали предварительные данные, з злокачественных клетках, з том числе гемопоэтических, количество ядрышек достоверно увеличивается, причем зз счет доли (%) гомогенных [Н.Н.Талеленова и И.А.Быкова, 1973; Г.И.Козинец и соавт., !979]. Отмечена положительная корреляция частоты Ag-ЯОР и доли морфологически атипичных клеток [Н.Н.Мамаев и соазт., 1930; 1984; 1935; Kchno et al., 1979; Zankl et al., 1982; Reeves et al., 1982; Brasch et al., 1934]. Можно заключить, что, нуклеологенез в злокачественных клетках существенно изменен. Более того, оказалось, что Ад-ЯСР реакция пригодна для градации степени злокачесттвенности опухоли [Crocker, 1990]. Однако до сих пор вопрос о том, сопровождается ли злокачественная трансформация клеток какой-то общей закономерностью изменений нуклеологенеза остается открытым.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Оценить особенности нуклеологенеза лимфоидных клеток в норме, при лимфссаркомах и остром лимфобластном лейкозе.

1: Разработать критерии количественной оценки, включая компьютерную морфо-метрию, особенностей нуклеологенеза в лимфоидных клетках практически здоровых людей.

2: Дать сравнительную характеристику нуклеологенеза по мере дифференци-ровки гранулоцитарного ростка кроветворения в нормальном костном мозге человека, а также в условиях хронического воздействия циклофосфаном в эксперименте на крысах.

3: Определить информативность нуклеолярных параметров для машинной дискриминации клеток лимфоидной опухоли:

- при хроническом лимфолейкозе, лимфоцитоме и гистологических вариантах лимфосарком;

- при остром лимфобластном лейкозе;

4: Оценить нуклеолярные параметры властных клеток костного мозга больных острыми лимфобластным и нелимфоцитарными (миелобластном и миеломо-нобластном) лейкозами.

5: Сравнить морфологические показатели нуклеологенеза с параметрами пролиферации злокачественных лимфоидных клеток и оценить их прогностическую значимость.

6: Сформулировать теооетическую концепцию о нуклеологенезе в злокачественных лимфоидных клетках.

Новизна исследования- Получена комплексная характеристика нуклеологенеза в злокачественных лимфоидных клетках. На основе современных методов количест-

венной цитологии с использованием компьютерной техники расширен набор дифференциально-диагностических признаков гемобластозов и сделаны важные дополнения к существующим морфологическим классификациям злокачественных заболеваний системы крови.

Раработан метод объективной регистрации морфологических особенностей нук-леологенеза в клетках крови при нормальном гемолоэзе человека и экспериментальных животных с помощью полукодачественных показателей интерфазной активности ядрышкообразующих районов хромосом и морфометрической оценки площади нуклеол. Подтверждено снижение интерфазной активности рибосомных генов по мере вызревания клеток нормального гемопоэза. Выявлены и охарактеризованы различия нуклеологенеза в лимфоцитах при хроническом лимфолейкозе, в пролим-фоцитах, лимфобластах и иммунобластах периферической крови и срезов лимфои-дной опухоли, в бластных клетках при лимфобластном и миелобластном вариантах острого лейкоза. Доказана прямая связь аргентофильности, количества и размеров нуклеол с морфометрически идентифицированным типом злокачественных клеток. На основе многомерного анализа результатов морфометрии злокачественных клеток выбраны комбинации информативных параметров и дискриминантные функции для атоматической классификации мапигнизированных лимфоидных элементов. Модель нуклеологенеза обоснована собственными экспериментальные данными, клиническим материалом и современными представлениями о необычной активации клеточных протоонкогенов при злокачественных заболеваниях крови. Показано, что патология нуклеолярного аппарата клеток играет существенную роль в генезе и прогрессии гемобластозов.

Теоретическое и практическое значение работы Проведенные клинические и экспериментальные исследования расширяют существующие представления о нуклео-логенезе в нормальных и малигнизированных клетках системы крови.

Полученные сведения могут Сыть использованы для решения вопросов патогенеза, классификации и прогнозирования течения гемобластозов.

Реализация результатов исследования. (1) В 1986 г. получено удостоверение на рационализаторское предложение отраслевого значения:

"Использование метода оценки иммунологической реактивности лимфоцитов периферической крови методом импрегнации азотнокислым серебром для прогнозирования рецидивов и формирования хронического бактерионосительства при брюш-но-тифозной инфекции", N0.0-2443.

(2) Получена серебряная медаль за экспонат: "Компьютерная морфометрия у Сольньк гемобластозами", ВДНХ, 1988) (Постановление Главного комитета ВДНХ СССР от 25/Х1-В8 г. N0.958-Н).

(3) Глава "Цитогенетическая и кинетическая характеристика лимфоцитов при лимфопролиферативных заболеваниях" в книге: "Иммунологические аспекты лим-фопролиферативных заболеваний" (Под ред.: В.П.Лозового и Г.З.Шубинского), Новосибирск, Иэ-во "Наука", 1987, с. 70-86.

(4) Публикации результатов: 37 работ, из которых 32 в центральной печати РФ и 5 за рубежом.

Положения, выносимые на защиту. (1) Динамика изменений морфологии нуклео-лярного аппарата специфична и определяется принадлежностью клеток к лимфоид-ному ростку кроветворения, уровнем их дифференцирован и пролиферации.

(2) Интерактивная компьютерная морфометрия является обьективным методом исследования гетерогенных популяций злокачественных клеток в мазках периферической крови и костного мозга, отпечатках и срезах ткани и пригодна для регистрации особенностей опухолевой трансформации.

(3) Характеристики нукяеолярного аппарата с учетом параметров ядра (площадь, индекс формы) могут быть положены в основу дискриминации злокачественных лим-фоидных клеток, выделения преимущественного морфотипа лимфоидной опухоли и градации степени ее злокачественности.

(4) Выявленные при лимфоидных гемобластозах особенности нуклеологенеза связаны со степенью злокачественности и прогрессии заболевания, могут быть использованы для прогнозирования их течения.

Апробация работы. Выступления с докладами на научных съездах, конференциях, заседаниях научных обществ, на Всесоюзном совещании "Биофизика рака" (1987), на двух Всесоюзных школах (1987, 1S88), на 3-ей республиканской конференции (1988), на 6-ой научно-практической конференции ЦОЛИУВ (1988), на Ш Всесоюзном сьеэде гематологов и трансфузиологов (1991), на IY Всесоюзном съезде специалистов по клинической лабораторной диагностике (1991), на YII Всесоюзном совещании по проблемам автоматизации анализа изображения микроструктур (1991) и на международных совещаниях: "11th Nuclear Workshop" (Суздаль, 1989); "Applied Cell Biophysics" (Rostock, 1990).

Выступления с лекциями и подготовка специалистов, включая зарубежных, лечебных и научных учреждений гематологического профиля на рабочих местах.

ста, иллюстрирована 45 таблицами и 40 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, 5 глаз изложения и обсуждения результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы. Библиографический указатель включает 70 отечественных и 150 иностранных источников. Диссертация выполнена по плану научно-исследовательских работ ВГНЦ "Разработка системы цитологического мониторинга для прогнозирования заболе-левания и индивидуализации лечения больных гемобластозами (регистрационный N0. 01850073917) и входит в научно-техническую программу 0.69.05 "Лейкозы человека и животных".

Работа представлена на 250 стр. машинописного тек-

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Основные положения и выводы работы базируются на результатах обследования 378 человек, включая группу практически здоровых людей (п= 80), больных брюшным

тифом и бактерионосителей (п= 83), Вольных лимфопролиферативными расстройствами 122) и острыми лейкозами (п» 87). Кроме того, на 24 крысах (самки, \Vistar) проведено экспериментальное исследование гранулоцитарного ростка кроветворения после 14-ти дневного воздействия циклофосфаном. Работа (1982-1992) выло/иена на базе 1-ой гематологической клиники (зав. - кандмед.наук В.Г.Савченко) и поликлинического отделения (зав. - проф. Л.Г.Ковалева) Института гематологии и интенсивной терапии ВГНЦ.

Характеристика обследованных конгмнгентов.

В соответствии с целью и задачами исследования выборки наших наблюдений включили в себя группу практически здоровых людей (п= 80), куда вошли военнообязанные, участвующие в ликвидации последствий аварии на Чернобыльской атомной станции (п= 45; средний возраст 21 год), жители зоны ЧАС (п= 11; средний возраст 22 года), студенты (п= 15; средний возраст 23 года), и девять доноров (средний возраст 24 года), поступившие в институт с целью заготовки костного мозга для аллогенной трансплантации. Средние значения количества эритроцитов в гемограмме для группы составили 4,83+-0,24 х 10'2/л, лейкоцитов - 6,89+-0,25 х 109/л, содержания гемоглобина - 142.18+-5.84 г/л, а скорость оседания эритроцитов (СОЭ) - 7,22+-4,00 мм/ч. Количество миелокариоцитов в миелограмме девяти доноров и одинадцати жителей зоны ЧАС колебалось от 54 до 140 х 109/л, палочкоядерных и сегментоядерных ней-трофилов соответственно от 10 до 15% и от 19 до 25%, лимфоцитов от 10 до 15%, моноцитов от 1 до 2%; лейко-эритробластическое отношение было равно 3:1, а индекс созревания нейтрофилов оказался в пределах 0,7-0,8. Таким образом, основные гематологические показатели в этой группе обследованных соответствовали норме [Г.И.Козинец и соавт., 1988]. Здесь нами исследовались лимфоциты периферической крови (в прямых мазках или в препаратах из лейкоконцентрата); у доноров костного мозга и жителей зоны ЧАС - лимфоциты и клетки гранулоцитарного (миелобласты, промиелоциты и миелоциты) ростка кроветворения. В части случаев (п= 15) лимфоциты периферической крови изучены в динамике культивирования с фитогемаг-глотинином (ФГА), причем после 48-ми и 72-х ч с параллельным цитогенетическим анализом. Работа выполнялась совместно с аспирантами Л.В.Соколовой, ЕН.Тим-киной и Д.Ф.Каюмовой.

В группе больных брюшным тифом (п- 47) и бактерионосителей (п= 36) преобладал! (75,8%) лица молодого и среднего возраста (до 40 лет). Все обследованы в момент госпитализации в клинику (гл. врач - Н.Н.Пироцкий) кафедры инфекционных болезней 2-го МОЛГМИ им. Н.И.Пирогова (зав. кафедрой - проф. Ю.А.Ильинский). Диагноз устанавливался на основании клинической картины заболевания, эпидемиологического анамнеза и был подтвержден бактериологически (78% случаев), и серологически (18% случаев). В зависимости от степени тяжести были выделены подгруппы больных с легким (п= 7), средней тяжести (п«= 26) и тяжелым (п= 14) течением заболевания, которое по срокам делилось на периоды лихорадки (первые две недели),

эанней (3-4 недели) и поздней (5-6 недель) реконвалесценции. Бактерионосительст-зо подразделялось на острое (п= 8) и хроническое (п=» 28). При последнем в свою очередь произведена группировка на фазы выделения (п= 22) и латенции (п= 6). Клиническое течение брюшного тифа было типичным и характеризовалось симптомами интоксикации, наклонностью к запорам или жидкому стулу и гепатолиенальным синдромом. Лейкопения (4,0 х108/л) оказалась характерной для большинства (76%) больных. Относительный лимфоцитоз (40%) выявлен в 80% случаев. Нейтропения со сдвигом в сторону палочкоядерных нейтрофилов (3 %) обнаружена у 57% больных. СОЭ оказалась ускоренной (12 мм/ч) в 16% случаев. В нашей работе были исследованы лимфоциты в мазках периферической крови, причем в динамике заболевания или в зависимости от типа и фазы бактерионосительства. У 14-ти больных средней тяжести брюшного тифа после 48-ми и 72-х ч культивирования клеток с ФГА проведен цитогенетический анализ. У 47-ми больных и 15-ти хронических бактерионосителей ставились внутрикожные пробы с ФГА. Параллельно по способности к образованию розеток с эритроцитами мыши или барана оценивался иммунологический фенотип циркулирующих в периферической крови лимфоцитов. Весь обьем работы за период с 1982 по 1985 гг. выполнен вместе с аспирантом Л.В.Соколовой.

Результата, полученные после обследования описанных выше двух групп плюс данные экспериментов хронического воздействия циклофосфана на гранулоцитар-ный росток кроветворения крыс (см. ниже) использованы нами не в качестве контроля, а с целью создания модели нуклеологенеза в стимулированных к пролиферации, а также в вызревающих и дифференцирующихся клетках.

В группу с лимфопролиферациями (п= 122) вошли больные с реактивными лим-фоаденитами (п= 3), хроническим, включая ворсинчатоклеточный, лимфолейкозом (п= 5), лимфоцмтомой (п= 15) и лимфосаркомами (п= 99). Возраст больных колебался от 15 до 80 лет (медиана - 52 года). Нозологическая форма злокачественных лим-фопролифераций выделялась в соответствии с классификацией А.И.Воробьева и М.Д.Бриллиант (1935). В этой связи происходящие из лимфатических узлов опухоли были отнесены к нелейкемическим гемобластозам лимфоидной природы, которые в свою очередь подразделялись на лимфоцитому диффузную (количество наблюдений см. выше), нодулярные (п= 4) и диффузные (п= 35) лимфосаркомы, включая лим-фобластную (п= 8) и иммунобластную (п= 4). Давность заболевания, диагноз которо-ого подтвержден клинико-рентгенологическими данными, гемограммой, гистологическим и цитологическим изучением биоптатов лимфатических узлов, пунктатов и трепанобиоптатов костного мозга, а в 20 наблюдениях и иммунологическим фено-типированием опухолевых клеток [Р.С.Самойлова и соавт., 1931], варьировала от 2 - 6 мес до 3 лет. Больные обследовались в момент постановки диагноза (п= 43), как правило, в III-IV стадии процесса по классификации Ann Arbor (1981) для неходжкинских лкмфом или во II-III стадии по классификации Rai для хронического лимфолейкоза. А также в динамике адекватной терапии (хлорОутин, циклофосфан, ЦОП, АЦОП, NHL-

3-Ш, С0Р-В1АМ-Ш, т-ВАСОЭ, ВАСОР или СОМ1А) за Сюлее, чем пятилетний период наблюдения (п= 101), У всех сольных хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ) и у большинства больных лимфоцитомой и лимфосаркомами на стадии лейкемизации при абсолютном кошчестве лейкоцитов от 1,5 до 320 х Ю3/л, невзирая на вариант опухоли, преобладающая (52-97%) в периферической крови шмфоидная популяция была представлена клетками типа малых лимфоцитов (66,13+-6,24%). Доля (%) морфологически атипичных клеток (пролимфоцитов и лимфобластов) колебалась от О до 62%, достигая наибольших значении при смешанноклеточной (24,5+13,7%) и лим-фобластной (28.0%+-17,8%) лимфосаркомах. В случае ворсинчатоклеточного лейкоза (ВКЛ) 93,5% лимфоидных элементов идентифицированы при световой микроскопии как "ворсинчатые" клетки. Проводя настоящее исследование, мы группировали все наблюдения по преимущественному морфотилу лимфоидных клеток в отпечатках или срезах опухоли, взяв за основу рабочую формулировку неходжкинских мм-фом (1982). Выбор был продиктован тем, что именно в этом проекте классификации прослежена связь морфологии опухолевых клеток с типом злокачественности заболевания. Морфотип опухоли верифицировался при микроскопии (ст.н.сотрудник И.Б. Каплаиская) и условно обозначался в терминах (обозначения даны в соответствующих разделах автореферата) цитированного выше проекта классификации неходжкинских лимфом. При учете прогностической значимости цитологических и иммунологических характеристик частота и продолжительность клинико-гематологичес-ких ремиссий оценивались по общепринятым критериям. Работа (1984-1992 гг.) проведена с участием доктора мед. наук А.М.Полянской, аспиранта Б.М.Даровского и докторанта С.А.Байдурина.

При морфо-цитохимических вариантах острого лейкоза (п= 87) властные клетки костного мозга в окраске по Романовскому-Гимза исследованы у 57 больных острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ), включая 46 взрослых (средний возраст - 28 лет) и 11 детей (средний возраст - 8 лет) и у четырех больных острым нелимфоцитарным лейкозом (только в первой атаке заболевания): ОМЛ - 3, ОММОЛ - 1 (средний возраст - 41 год). Диагноз лейкоза подтвержден цитохимическими методами исследования; варианты выделялись на основании морфологических критериев РАВ-классифика-ции (1976). Клинические проявления заболевания характеризовались анемией (содержание гемоглобина до 100 г/л отмечено в 57% случаев ОЛЛ и в 68% случаев ОНЛЛ), выраженной тромбоцитопенией (менее 100 х 109/л в 54% и 89% соответственно). Количество лимфоцитов в периферической крови варьировало от 10 х 109/л до 50 х 10э/л гиперлейкоцитоз отмечен только у Сольных ОЛЛ (8% наблюдений), лейкопения с количеством клеток менее Зх109/л практически в одинаковой пропорции выявлялась как при ОЛЛ (18%), так и при ОНЛЛ (16%). Доля бластных клеток в периферической крови колебалась от 1% до 96%, в костном мозге - от 19% до 99%. От 10 до 90% лимфобластов давали положительную в гранулярной форме РАБ-реакцию на наличие полисахаридов в цитоплазме. Для этих лейкозных клеток было характерно отсутствие липидов, пероксидазы и хлорацетат эстеразы и слабая (1-3 гранулы в не-

большом числе клеток) активность а-нафтилацетат эстеразы и кислой фосфатазы. При ОМЛ от 5% до 85% миелобластов положительно реагировали с Суданом черным В в диффузной форме и более 5% клеток содержали пероксидазу. PAS-положитель-ный материал распределялся в цитоплазме к легок диффузно, активность кислой фосфатазы варьровала У больных ОММОЛ отмечена более выраженная (до 100% клеток) реакция на нафтил-АЗ-Э-ацетатэстеразу, ингибируемая фторидом натрия. Лимфоаденопатия чаще регистрировалась у больных ОЛЛ (61%), чем у больных ОНЛЛ, тогда как гепатомегалия и спленомегалия встречались приблизительно с одинаковой частотой: 56% и 30% соответственно. Иммунологическое фенотипиро-вание с помощью панели моноклональных антител [Г.Ю.Митерев и соавт., 1986] на этапе диагностики ОЛЛ проведено у 26 больных и в одном случае при рецидиве заболевания. У 48 больных этим вариантом лейкоза исследование проводилось до назначения полихимиотерапии, у 12 - в динамике лечения и у 6 - как в первом остром периоде, так и в рецидиве. Прогностическая значимость морфологических вариантов ОЛЛ по частоте и длительности ремиссий оценена на группе из 29 наблюдений. Частота (%) и продолжительность (мес.) полных клинико-гематологических ремиссий определялись с учетом возраста больных и морфологического варианта лейкоза. Двух- или трехкратное обследование, как правило, проводили после 1-3 курсов терапии по программам RACOP, L-AOP, SCOP, VAMP и "7+3". При анализе интерфазных Ag-ЯОР исследован костный мозг 42-х человек: 12 больных ОЛЛ (средний возраст - 24 года), 11 больных ОНЛЛ (средний возраст - 33 года). Кроме того, в эту группу вошли больные (возраст колебался от 24 до 49 лет), лимфоциты костного мозга которых изучались в первой ремиссии заболевания (от периода становления до 22 мес ): 4 пациента с ОЛЛ, 7 - с ОМЛ и 8 - с ОММОЛ. Для индукции ремиссии при ОЛЛ, как правило, применялась 8-ми недельная программа Хельцера (винкристин, преднизолон, L-аспарагинаэа, рубомицин, цктозар и циклофосфан), при ОНЛЛ использовалась общепринятая схема "7+3". Полная к лчнико-гемато логическая ремиссия констатировалась при пропорции бластов костного мозга не более 5% на фоне не менее 40% содержания лимфоцитов. Лимфоцшы идентифицировались в окрашенных по Ро-мановскому-Гимза мазках (бобовидная или овальная форма ядра, грубый хроматин и отсутствие ядрышек); принадлежность клеток к лимфоиддному ростку подтверждена отсутствием в их цитоплазме гликогена [Г.И.Козинеци соавт., 1980]: доля клеток с единичными мелкими гранулами PAS-положительного материала в среднем составила 20,7+-10,8% (СЦК: 0,21+-0,04). Исследования проведены (1982-1992) с участием проф. K.Smetana (Чехословакия), др. G.Mattes (Германия), ст. научного сотрудника В.Г.Исаева и аспирантов Е.Н.Тимкиной, Г.В.Скрыпниковой.

Группа наблюдений с апластической анемией (АА) включили в себя шесть человек. Все они были обследованы до применения антишмфоцитарного иммуноглобулина (АЛГ) и пять из них после проведения терапии АЛГ. При средней давности заболевания в 15,5 мес. в целом по группе больных абсолютные значения лимфоцитов колебались от 0,11х10э/л до 3,04x109/л (60-90%), нейтрофилов - от 0,96х109/л до 1,02x103/л;

тромбоциты составили 5.6 - 26,0 х 109/л, а концентрация гемоглобина а эритроците -26-89 г/л. Большинство (4 из 6) наших пациентов страдало тяжелой АА. Терапия лошадиным АЛГ (доза: 15 мг/кг) проводилась в течение пяти дней; материал для повторного изучения получали через 30 дн. после окончания лечения. Исследования проведены совместно с доктором мед наук Н.С.Турбиной, ст. научным сотрудником Е.А.Михаяловой, и аспирантом С.Сулейман.

В так называемой группе риска, т.е. у лиц, получивших ту или иную дозу облучения в результате аварии на ЧАС, состояние нуклеологенеза было изучено с помощью компьютерной морфометрии яимфоцитов периферической крови (п= 45) и костного мозга (п- 11). Гематологические данные представлены выше (группа практически здоровых людей). Для адекватной статобработки наблюдения группировались в зависимости от дозы облучения. Эти исследования выполнены совместно с аспирантами Е.Н.Тимкиной и Д.Ф.Каюмовой.

В экспериментальной части работы проведено сравнительное морфометричес-кое исследование ядер и аргентофильных структур нуклеол пролиферирующих (про-миелоциты, миелоциты) и непролиферирующих (метамиелоциты, палочко- и сегмен-тоядерные нейтрофилы) клеток гранулоцитарного ростка костного мозга крыс до и после введения циклофосфана. Животные (24 крысы линии Wistar массой 200-280 г получены из питомника "Столбовая'' АМН СССР) были разбиты на две равные группы: опыт и контроль. В опыте растворенный в 0,5 мл. стерильного физиологического раствора циклофосфан (20 мг/кг) вводился ежесуточно в брюшную полость (17 дн). Контрольным животным в брюшную полость вводили 0,5 мл стерильного физраствора. Костный мозг из бедренной кости суспендировался в инактивированной бычьей сыворотке и центрифугировался в течение 5 мин при 1000 об/мин. Клетки исследовали в мазках, приготовленных из осадка и импрегнированных нитратом серебра. Их изображение подвергалось автоматической морфометрии на системе текстурного анализа (TAS, Leitz, ФРГ). Исследование прозедено совместно с др. J.Berger (Научно-исследовательский институт фармакологии и биохимии, Чехословакия) и ст. научным сотрудником лаборатории патологии и экспериментальной терапии института общей патологии РАМН В.С.Шинкаренко.

Методы исследования и способы стандартизации материала.

Любое исследование настоящей работы строилось по единой схеме, которая включала в себя подготовку стандартного образца, выбор метода адекватной окраски клеточных структур и способа идентификации клеток, создание обучающих выборок клеток или наблюдений, т.е прототипа с относительно известными характеристиками, определение совокупности измеряемых признаков, анализ изображения и сбор полуколичественных или количественных данных, математическую оценку информативности комбинации признаков для дискриминации клеточных морфотипов или вариантов заболевания, вывод решающего правила, определение эффекта классифи-

кации в независимом экзамене на сплошных выборках и определение практической значимости проведенного анализа.

Подготовка стандартного образца и способы идентификации клеток и их структур,

Лимфоциты исследовались в прямых мазках периферической крови или в мазках лейкоконцентрата из венозной крови. Для приготовления последнего использовался метод седиментации с гепарином а качестве антикоагулянта.

Культуры лимфоцитов ставились а закрытой системе, как это описано в методических рекомендациях [Г.И.Козинец и соавт., 1982]. Пролиферация клеток in vitro в этой системе стимулировалась одной эмбриональной телячьей сывороткой (10%), а также ФГА (Difco М; стандартная концентрация) в присутствии сыворотки: первые пять часов культивирования клетки инкубировались с сывороткой, а затем добавлялся ФГА и культивирована продолжалось в течение 24 ч. В другой серии экспериментов нуклеологенез в модельной системе лимфоцитов оценивался в динамике 4-х, 16-ти, 24-х, 43-ми и 72-х ч. культивирования с ФГА. Синтез тотальной РНК на радиоавтографах оценивался по включению 3Н-уридина. В параллельные культуры для подавления транскрипции тРНК добавлялся актиномицин D (10 мкг/мл, а темноте). Исследовались интерфазные клетки, а посла 48-ми и 72-х ч - метафазнье хромосомы. Препараты метафазных хромосом изучались после окраски красителем Гимза [Г.И. Козинец и соавт., 1982], а также после импрегнации нитратом серебра [Н.А.Еголина и соав., 1981]. Учитывая известные результаты полуколичественной оценки ЯОР метафазных хромосом [Sigmund et а)., 1979; Verschaeve et а)., 1981], нами была разработана собственная методика учета Ад-ЯОР:

М - мода окрашенных хромосом. X - среднее арифметическое значение хромосом с окрашенными ядрышкообразующими районами. К2 - условный средний размер Ag-ЯОР (табл. 2). Х1 - среднее количество ассоциированных хромосом на клетку. Х2 -среднее количество хромосом в одной сателлитной ассоциации. F,% - частота сател-литных ассоциаций ахроцентрических хромосом а исследуемом материале. За сател-литную ассоциацию (CA) принимали положение, когда расстояние между короткими плечами ассоциированных хромосом не превышало ширину им хроматид [Sigmund et el., 1979].

Внутрикожные пробы с ФГА у больных брюшным тифом (реакция учитывалась аспирантом Л.В.Соколовой) ставились по методике, списанной А.Ф.Блюгер и соавт. (1980). Получено согласие каждого обследуемого на проведение пробы. Для выполнения реакции 0,1 мл. стерильного раствора ФГА (Difco М) на растворе Хзнкса Еводли в левое предплечье. Проба учитывалась через 24 ч: положительный ответ -гиперемия и инфильтрация от 1.0 до 2,0 мм.

Морфология клеток гранулоцитарного ростка здорового костного мозга или лей-козных бластов после цитохимической верификации варианта острого лейкоза оценивалась (аспирант ЕН.Тимкина) в стандартных, окрашенных по Романовскому-Гим-за мазках. При реактианьи лимфоаденитах или нелеякемических гемобластозах

-r f

— Ii. —

лимфатической природы, верифицированных в отпечатках или парафиновых срезах пораженных лимфатических узлов (ст. научный сотрудник И.Б.Капланская), преимущественный морфотип лимфоидных клеток идентифицировался после окраски гематоксилин-эозином. Затем весь исследуемый материал импрегнировался нитратом серебра (табл. 1).

Иммунологическое фенотипирование в части случаев брюшного тифа (аспирант Л.В.Соколова) или при хроническом лимфолейкозе, лимфоцитоме и лимфосарко-мах (ст. научный сотрудник Р.С.Самойлова) проводилось с учетом способности клэ-ток образовывать розетки с эритроцитами мыши (B-популяция) или барана (Т-по-пуляция), а также в реакциях с поливалентными сыворотками против иммуноглобулинов человека [Самойлова P.C. и соавт., 1981]. Б случае острого лимфобласт-ного лейкоза б ластике клетки типировались (младший научный ст. М.С.Пужицкая) моноклональными антителами [Митерев Г.Ю. и соавт., 1986].

Цитофотометрический анализ (ст. научный сотрудник В.М.Котельников) распределений клеток по фазам клеточного цикла в зависимости от содержания ДНК (окраска по Фельгену) проведен на отечественной цитофотометре МИФ-к [Хруст Ю.Р. и соавт., 1975] или на механической сканирующей система UniVar (Reichert, Австрия).

Оценка цитохимической реакции структур ядрышка с нитратом серебра, как и проведение самой реакции, зависят от выбора методов, адекватных целям исследования [Crocker, 1990]. Описанные в литературе методические подходы требуют дальнейшего совершенствования. В этой связи, иходя из природы реакции, мы предлагаем модификацию ее проведения и способ учета результатов анализа (табл. 1,2). Предлагаемые методы просты, могут быть легко реализованы в условиях любой лаборатории и пригодны для решения классификационных вопросов онкологии.

Создание обучающих выборок и компьютерная морфометрия клеток.

Идентифицированные клетки отбирались в стандартных участках препарата и использовались для создания обучающих выборок. Если речь идет о мазках периферической крови или костного мозга, то при компьютерной морфометрии анализировались только те поля зрения, где ядросодержащие элементы лежали свободно, без фрагментации и искажения формы клеток. В парафиновых срезах лимфоузлов (выбраны для исследования по той причине, что специальная коррекция результатов морфометрии и исключение эффекта неэкваториальности позволяют получить более оптимальную, чем на отпечатках, информацию [Crocker, 1984]) отбирались наименее плотные участки с сохранением полной картины морфологии пораженной ткани (нодулярный или диффузный характер роста). Резулотаты измерений накапливались на магнитных носителях в раздельных файлах памяти. Морфометрические исследования в настоящей работе выполнены на оснащенной микрокомпьютером LSI11 системе текстурного анализа изображения (TAS, Leitz, ФРГ) и на механической системе "MOP-Videopian" (Heichcrt, Австрия).

Ag-ЯОР РЕАКЦИЯ (МЕТОД ОКРАСКИ ПРЕПАРАТОВ)"

Таблица 1.

1. ФИКСАЦИЯ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА

2.ПРОВОДКА ЧЕРЕЗ СПИРТЫ

3. ПРОМЫВКА ДИСТИЛЛИРОВАННОЙ ВОДОЙ

4. ПЕРЕВАРИВАНИЕ ДЕЗОКСИ-РИБОНУКЛЕАЗОЙ-1

5. ОБРАБОТКА НИТРАТОМ СЕРЕБРА

6. ОТМЫВКА ПРОТОЧНОЙ И ДИСТИЛЛИРОВАННОЙ ВОДОЙ

7. ДОКРАСКА МЕТИЛЕНОВЫМ СИНИМ

8. ОТМЫВКА БУФЕРОМ

1 ч. ЛЕДЯНОЙ УКСУСНОЙ КИСЛОТЫ И 3 ч. АБСОЛЮТНОГО МЕТАНОЛА (45 мии. х 4° С)

50%. 40% и 30% МЕТАНОЛ (5 мин.)

0.08 мг/мл "SERVA" (200 U/мл) НА 0.003 М АЦЕТАТЕ Мд (рН 6.8): 2 ч. х37°С. ДЕЙСТВИЕ ЭНЗИМА ОСТАНАВЛИВАЕТСЯ 5% ТХУ (15 мин х 4" С)

50% ВОДНЫЙ РАСТВОР СМЕШИВАЕТСЯ EXTEMPORE 2:1 (ПО ОБЪЕМУ) С 2% ЖЕЛАТИНОЙ НА 1% МУРАВЬИНОЙ КИСЛОТЕ. СМЕСЬ НАНОСИТСЯ НА ПРЕПАРАТ (0.03 мл) И ПОКРЫВАЕТСЯ ПОКРОВНЫМ СТЕКЛОМ. ВЛАЖНАЯ КАМЕРА. 60 мин х 18a С В ТЕМНОТЕ.

0.25% Р-Р НА БУФЕРЕ Mdhvem (0.2М ФОСФАТ НАТРИЯ И 0.5 М ЛИМОННАЯ КИСЛОТА. 1:1; рН5.0). 30 мин х 18° С

*е.М.Погпрелов. Гематол. трянсфузиол.. 1990,11,38-39.

Таблица 2.

ПОЛУКОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ Ад-ЯОР РЕАКЦИИ*

КЛЕТКИ

КОЛИЧЕСТВО Ад-положительных ЯОР В т.ч. по баллам

Ад-отрицательных НУКЛЕОЛ клеток

N0 п/п ВСЕГО 0,1 (81) 0,5 (а2) 0.9 (аЗ)

1 - - - - - 1

2 15 10 4 1 2 -

3 8 7 1 0 1 -

4 16 9 5 2 4 -

5 14 3 7 4 3 -

ВСЕГО: 53 В ПРИМЕРЕ: К1- 29 17 13,25; НК- 2,5; К2= 7 0,33 10 1

К1

НК"

К2 =

где: К1 - показатель количества Ад-ЯОР;

А • сумма фану л Ад в исследованном материале; п - число Ад-положительньи клеток.

где: НК - среднее к-во ядрышек (нуклеолярный коэффициент); Н - сумма ядрышек; п - число клеток с нуклеолами.

(а1*0,1 )+(а2*0,5)+(аЗ*0,9)

где: К2 - средний размер гранулы Ад;

а • число гранул соответствующего балла; п - число Ад-положительных клеток.

'В.М.Погорелов, Гематол. трансфузиол., 1990,11,38-39.

А

В первом случае изображение клетки при оптическом разрешении 1250х подвергали автоматическому анализу с использованием алгоритма геометрии границ [B.C. Киричук, 1978]. При анализе в квадратных микронах (кв.мкм) определялись площади клетки (SCELL), ядра (SNUC) и аргентофильных структур нуклеол (SAg). Как производные показатели, вычислялись площадь цитоплазмы (SCYT) и цитоплазмо-ядерное отношение (ECN). Во втором, компьютерная морфометрия клеток проводилась в интерактивном режиме путем обвода их изображения на мониторе компьютера (увеличение в 8,5х) с использованием курсора и дигитайзера. Набор регистрируемых параметров включил в себя: P1 (SNUC) - площадь ядра (кв.мкм), Р2 (PNUC).- периметр ядра (мкм), РЗ (DNUC) - максимальный диаметр ядра (мкм), Р6 (SNLI) - суммарная площадь ядрышек (кв.мкм), Р7 (NNLI) - количество ядрышек, Р8 (aNE) - среднее расстояние между геометрическими центрами ядра и ядрышек или абсолютная ядрыш-ковая эксцентричность (мкм) [Boon et al., 1984], Р10 (dNUC) - средний диаметр ядра (мкм) и Р12 (SCELL) - площадь клетки (кв.мкм).

Производные параметров вычислялись по следующему алгоритму:

а) независимый индекс контура ядра (NCI, усл.ед), P13=P2/SQRT(P1) [Van der Valk eta!., 1982];

б) отношение площади цитоплазмы к площади ядра (ECN, услед), Р14= (Р12-Р1)/Р1;

в) относительная ядрышиовая эксцентричность (rNE, усл.ед), Р15=Р8/Р10 [Van der Valk et al., 1982; Boon et al., 1984].

Параметры выбраны, исходя из полученных в лаборатории данных [Г.И.Козинец и М.М.Таирова, 1979]. Дополнительно по полуколичественной схеме (табл. 2) оценивались среднее число (К1) и условный средний размер (К2) интерфазных Ад-положительных районов нуклеол. Измерения и статобработка проводились по стандартному пакету программ (Kontron), а также по программам, специально созданным в ходе настоящего исследования. Предварительные измерения показали высокую воспроизводимость результатов морфометрии как на том, так и на другом анализаторах изображения: в пяти повторах коэффициент вариации параметров колебался от 1,43% до 2,46% с максимумом для периметра. Комбинации информативных для дискриминации обучающих выборок параметров, т.е. признаков максимально снижающих вариабельность, отбирались по результатам регрессионного и дискриминант-ного аналаза. Решающее правило состояло в том, что при машинной классификации, если сумма произведений коэффициентов на соответствующие параметры не превышала значение порога дискриминантной функции, клетка относилась к категории 1, в противном случае - к категории 2 [Bartels, 1980]. Эффект классификации (%) определялся в независимомом экзамене на сплошных выборках клеток. Аналогичный подход использован для автоматической классификации морфометри-ческих вариантов заболевания. Детали анализа изложены в соответствующих разделах автореферата.

Для статистической обработки данных на персональном компьютере IBM-PC/AT испольэовагмсь методы описательной статистики, пошаговой рефессии и дискрими-нантного анализа (процедуры: MEANS*, STEPWISE* и STEPDISC* стандартного пакета SAS-института). Выделение набгаодений (клеток или подгрупп больных с различными морсротипами) проводилось после визуального анашэа гистофамм распределений с определением медианы и перцентильных рангов. Эффект дискриминации (%) оценивался фафически по виду бивариантных распределений [Bartels, 1980] или по положению распределений в многомерном диагностическом пространстве признаков. Достоверность различий устанавливалась на основе сравнения выборок с использованием непараметрических критериев (хи-квадрат, F-критерий, лямбда Уил-кса, U-критерий Вилкоксона и DM критерии Колмогорова-Смирнова).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Ядрышко - фабрика рибосом. Его появление и морфологические изменения в клеточном цикле обусловлены активностью рибосомного хроматина: тандемно расположенных и связанных с гистоносыми и негистоногыми белками блоков генов рибосомной РНК [Sommerville, 1986]. Аргенгофильные нуклеолярные белки, нукле-олин (С23), нуклеофозмин (В23) и фибриллярин, вовлекаются в нуклеологенез на ранних его стадиях и специфически приспосабливают рибосомный хроматин к транскрипции и процессингу рРНК, что является одним из основных сигналов перехода покоящихся клеток к пролиферации [Bouche et al., 1987; Caizergues-Ferrer et al., 1990]. Пролиферативное состояние нуклеол in vitro включает в себя активацию транскрипции рибосомных генов и структурирование ядрышка, связанное со ступенчатым биогенезом рибосом [Bouche et al., 1987]. Сравнительное изучение нуклеолярных белков с помощью Ag-ЯОР реакции в различных морфологических классах нуклеол стимулированных к пролиферации или дифференцирующихся клеток положено нами в основу рабочей модели нуклеологенеза in Vitro и in vivo.

■Нуклезлсгекеэ in vitro и in vivo (данние ТА5-морФ?метрии],

Обогащение нуклеол аргентофильными белками является сигналом клеточной пролиферации.

Так, специфика изменения аргентофильности нуклеол ФГА-стимулированных лимфоцитов практически здоровых людей по нашим данным состоит в увеличении площади нуклеолярных аргентофильных структур (SAg) от 0,14 кв.мкм. до 0,26 кв. мкм. в течение первых четырех часов культивирования. Затем к 16 ч значение показателя снижается (0,22 кв.мкм.), увеличиваясь повторно (0,61 кв.мкм.) в интервале от 24 до 48 ч. Параллельно на ранних сроках культуры главным образом за счет цитоплазмы, площадь которой к 16 часам падает, увеличивается площадь клетки (от 47,5-М0,9 до 53,7+-12,3 кв.мкм.) и существенно нарастает синтез тотальной РНК: до 67% меченных 3Н-уридином клеток, 11% которых с меткой над ядрышком. В интервале от 16 ч до 48 ч существенно возрастает площадь клеточного ядра: от

34,4-1-13,0 кв.мкм. в покоящихся лимфоцитах до 41,7+-11,1 кв.мкм. и 47,0-1-16,8 ка. мкм. соответственно. Процесс сопровождается увеличением значения нуклеоляр-ного коэффициента (с максимумом на 15 ч: 1,50+-0,70) и сменой кольцевидных ядрышек лимфоцитов (91%) на синтетически активные гомогенные [Сагп. 1976] нуклео-лы стимулированных клеток (45%). Интегральная площадь нуклеол была тем больше, чем больше становилось клеточное ядро. Так, если в лимфоцитах периферической крови ее средние значения составляли 0,89-1-0,42 кв.мкм., то после 48-ми ч культивирования с ФГА они достигли 5,61+-3,51 кв.мсм.

Рис. 1. Нуклеологенез в динамике ФГА-стимуляции лимфоцитов периферической практически здоровых людей (п= 10)

Все стадии клеточного цикла в этой модельной системе in vitro маркированы специфической морфологией нуклеолярного аппарата (Рис. 1): Go - кольцевидное ядрышко с единичными крупными гранулами серебра; G, - несколько гомогенных ядрышек с 1-3 крупными гранулами Ag; S - трабекулярное ядрышко с разбросанными средними и мелкими гранулами; G, - крупное диффузное ядрышко с кластерами мелких интерфазных Ag-ЯОР; митоз - крупные гранулы серебра маркируют вторичные перетяжки акроцентрических хромосом (мода - 7-8), размесы метафазных Ag-ЯОР (К2, усл.ед.) и частота их сателлитных ассоциаций (F, %) падают от первого к последующим делениям клетки: 1,74+-0,14 и 84,13+-8,45% против 1,45+-0,08 и 70,59+-3,58%. Field et al. (1984), исследовав ФГА-стимулированные лимфоциты после импрегнации нитратом серебра, окраски по Фельгену и авторадиографии с мечен-

ным ~Н-тимидином, пришли к аналогичному заключению. Правда, по их мнению небольшие гранулы cepeöpa могут давать асе-еще крупные конгломераты в S и G, фазах первого клеточного цикла, в то время как клетки второй и третьей генерации на этих участках цикла отличаются большим количеством мелких Ад. Актиномииин D, ингибитор трансквипции тРНК, на ранних сроках культуры не блокирует синтез аргентофильнъгх нуклеопярных белков. Через 4 ч также как и в обычньо« культурах с ФГА нарастает частота клеток с гомогенными нуклеолами. Однако с увеличением срока культуры (более 16-ти ч) возникает феномен ядрышковой сегрегации с образованием точечных, содержащих только одну гранулу серебра, ядрышек. В этой 'лттуации клетки не переходят в S фазу и не достигают митоза. Интересно, что интенсивность импрегнации нуклеол клеток, например, фибробластов человека в культурах, напрямую отражает активность транскрипции рибосомных цистронов [Morton el al., 1983]. Некоторые гормоны, например, гормон роста, стимулирующий синтез рРНК. или дексаметазон, влияющий на активность генов металлотионинов, увеличивают число метафазнсж Ag-ЯОР [De Сароа et al., 1935]. Те же авторы [De Сароа et а!., 1985] в другом исследовании отметили положительную связь транскрипции рРНК с концентрацией сыворотки в культивируемой среде. По нашим данным одна сыворотка в культурах лимфоцитов эффективна менее (20,6% меченных 3Н-уридином клеток с 0,6% метки над ядрышком), чем вместе с фитогемагглютинином.

Бактериальный антиген (больные брюшным тифом), по-видимому (у нас нет данных о распределении клеток по фазам цикла), стимулирует переход "Go - G,H: частота лифоцитов с гомогенными ядрышками в остром периоде заболевания по сравнению с контролем в среднем повышена вне зависимости от степени его тяжести (27%), как и повышена у бактерионосителей (23,0+-3,5% в фазе выделения и 17,5 +-2,8% в фазе латенции). Однако вряд ли эти клетки пролиферируют в периферической крови больных: (а) наряду с гомогенными ядрышками довольно часто (до 15%) встречаются лимфоциты с точечными ядрышками; (С) площадь ядер клеток практически соответствует нормальным значениям. Действие бактериального антигена снижает ответ лимфоцитов на ФГА как in vivo, так и in vitro: (а) в остром периоде заболевания внутрикожные пробы с ФГА у большинства (от 71% до 86%) больных отрицательны и лишь в периоде поздней реконвалесценции частота положительных проб достигает 64%-86%, т.е. приближается к контрольным значениям; (б) к 72-м ч культивирования с митогеном, когда в норме от 23% до 40% митозов соответствуют первому делению, от 38% до 63% - второму и от 18% до 25% третьему [Sigmund et al., 1979], судя по показателям частоты сателлитных ассоциаций, лимфоциты больных брюшным тифом проходят только первое деление: в отличии от клеток практически здоровых людей у больных частота сателлитных ассоциаций при культивировании от 48 ч до 72 ч не уменьшается (64.6+-3,0% против 62,3+-4,9%), а в периоде поздней реконвалесценции даже наоборот имеет место увеличение значений показателей (67,7+-4,3% против 73,1+-5,4%) Таким образом, по аналогии с актиномицином D бактериальный антиген как in vitro, так и in vivo блокирует (или снижает скорость их пролиферации)

ответ лимфоцитов на стимуляцию неспецифическим митогеном: клетки практически сохраняют Go-значения плошади ядер, но в них появляются гомогенные или точечные ядрышки; снижается частота положительных внутрикожных проб с ФГА Возможно, антиген останавливает лимфоциты в G.-фазе клеточного цикла и, связываясь с соответствующими рецепторами, делает их недоступными для фито-гемагглютинина. До некоторой степени ситуация напоминает снижение эффективности экзогенных протеинкиназ по отношению к С2Э пролиферирующих in vitro эндо-телиальных клеток аорты быка (ЗКАБ). Действительно, ядерные протеинкиназы (NKII), выделенные из растущих клеток, в 10 раз более активны по отношение к дефос-форилированному нуклеолину сливных (покоящихся) ЭКАБ, чем к нативному нуклео-лину клеток, растущих в присутствии сыворотки и основного фактора роста фибро-Оластов [Belengueretal., 1989].

Миелобласты и промиелоциты, пролиферирующие клетки костного мозга человека или крыс [Г.И.Козинец и соавт., 1986; В.М.Котельников и соавт., 1988], характеризуются выраженной аргентофильностью нуклеолярного аппарата. Так, медианы К1 и SAg для мие лоб ластов человека соответственно равны 9,72 и 0,47 кв.мкм., для промиелоцигов - 7,44 и 0,53 кв.мкм. Промиелоциты крыс имеют более высокие значения: 9,65 и 1,26 кв.мкм. При этом площадь ядра миелобласта человека составляет 72,4 KB.MKM., количество нуклеол равно 3, а их интегральная площадь - 6,GS ка мкм. Интересно: миелобласты отличаются от клеток 48-ми ч культур лимфоцитов с ФГА достоверно (р< 0,01) меньшей площадью аргентофильного материала (0,47 кв.мкм. против 0,61 KB.MKM.), но более высокими (р< 0,0001) значениями площади ядер (72,4 кв.мкм. против 46,8 кв.мкм.), нуклеолярного коэффициента (3 против 2; р< 0,01) и интегральной площади ядрышек (6,7 кв.мкм. против 5,5 кв.мкм.; р< 0,01). Ядра пролиферирующих клеток костного мозга крыс имеют площадь 95,5 кв.мкм., а непро-лиферирующих (метамиелоциты, палочкоядерные и сегментоядерные нейтрофилы) -59,1 КВ.МКМ. Различия между ними достоверны (р< 0,0001). По мере дифферен-цировки клеток в костном мозге доля аргентофильного материала в их нуклеолах как у человека, так и у крыс прогрессивно снижается: в миелоцитах значения указанных выше показателей составили 3,39 и 0,23 кв.мкм.; 4,56 и 0,54 кв.мкм. Известно, что аналогично ведет себя пролиферативная активность клеток в ряду мие-лобласт-промиелоцит-миелоцит: доля клеток в S-фазе прогрессивно уменьшается, увеличивается содержание клеток в G,, а доля клеток в G, практически не меняется [Г.И.Козинец и соавт., 1986]. Интересно, что в сводных выборках площадь ядер пролиферирующих клеток положительно (г= 0,59, р< 0,001) коррелирует с площадью ар-гентофильных структур. Активность рибосомных цистронов зависит от стадии клеточного цикла и снижается по мере дифференцировки клеток in vivo. Более того, основные показатели нуклеологенеза имеют тканевую и видовую специфичность. К аналогичным выводам пришли Smetana & Likovsky (1984), сравнив аргентофильность нуклеол вызревающих эритроидных и гранулоцитарных предшественников а костном мозге человека и кролика.

Возможно, нуклеолярные долгоживущие белки относятся к факторам транскрипции, накопленным во время оогенеза и эмбриогенеза и сохраненным в сома пмеских клетках (Маг&ог е1 а1., 1990). Накопленные в пролиферирующих гранулоцитарны* предшественниках крыс нуклеолярные белки остаются в гиперсегметированных ней-трофилах, вызревающих в костном мозге животных после длительного введения циклофосфана. В.М.Котельников и соавт. (1986) показали, что в условиях этого эксперимента доля Б-фазных по содержанию ДНК клеток пролиферирующего пула достоверно снижается, в то время как доля С^ клеток нарастает. Одновременно увеличивается пропорция Б и (х,- клеток непролиферирующего пула (для гиперсегментированных нейтрофилов - главным образом за счет Су. По нашим данным на фоне достоверного (р< 0,0001) относительно контроля увеличения площади ядер (ЗЫиС) клеток (пролиферирующих -137,1 кв.мкм. против 95,5 кв.мкм.; непролиферирующих -127,1 кв.мкм. против 59,1 кв.мкм.), суммарная площадь гранул серебра (БАд) внук-леолах пролиферирующих клеток уменьшилась в 1,5 раза: 0,48 кв.мкм. против 0,73 кв.мкм., тогда как в непролиферирующих двукратно увеличилась (0,46 кв.мкм. против 0,25 кв.мкм.). Как в тех, так и в других отмечена положительная корреляция БШС и Б Ад: г= 0,30, р< 0,01 и г= 0,33, р< 0,01 соответственно. Увеличение аргентофильности нуклеол под втмянием циклофосфана вряд ли связано с усилением транскрипции р РНК. Плотная упаковка хроматина и отсутствие в гиперсегментированных нейтрофи-лах четко организованных нуклеол свидетельствуют о том, что эти клетки инертны в плане синтеза нуклеиновых кислот. Вывод подтверждается данными о практическом отсутствии в выборках сегментоядерных нейтрофилов костного мозга экспериментальных крыс Б-фазных по содержанию ДНК клеток [В.М.Котельников и соавт., 1986; 1988]. Скорее всего, циклофосфамид блокирует клетки в Б и СЦ фазах клеточного цикла. В результате вызревание гранулоцитов происходит без последующих митозов примиелоцитов и миелоцитов и, как следствие, долгоживущие аргентофильные белки остаются в непролиферирующих, гиперсегментированных (с большой площадью ядер) клетках.

Итак, в совокупности данные этого раздела работы показали, что ядрышковый цикл обусловлен типом ткани, степенью пролиферативной активности и дифферен-цировки клеток и видоспецифичен. Изменения нуклеолярных параметров лимфоцитов под влиянием актиномицина Э или бактериального антигена как и их особенности, обусловленные действием циклофосфана на гранулоцитарные предшественники могут быть использованы в качестве модели для трактовки результатов изучения нуклеологенеза в злокачественных клетках.

Информативность морфометрических параметров для дискриминации клеток лим-ФРИДНРЙ ОПУХОЛИ.

Прогноз нелейкемических гемобластозов при поражении лимфатических узлов определяется распрастраненностью процесса и другими характеристиками опухоле-

вого роста [А.И.Воробьев и М.Д.Бриллиант, 1985], среди которых размер малигни-зированных клеток считается наиболее важным [Crocker, 1984]. Однако большинство сведении о морфологических особенностях злокачественных лимфоидных клеток получено на уровне качественного анализа, и эта затрудняет сопоставление различных сообщений. Кроме того, до сих пор окончательно не выбраны объективные критерии градации степени злокачественности лимфоидной опухоли. Следует отметить, что высокая дискриминирующая способность геометрических параметров для классификации нормальных или патологических лимфоидных клеток подтвержена в ряде морфометрических исследований [Raphael et al., 1985; Marchevsky et al., 3987; Walts & Marchevsky, 1989].

Обследовано 23 больных, возраст которых колебался от 15 до 70 лет, а давность заболевания с момента диагностики - от 2 до 6 месяцев. Клинический диагноз: у трех больных - реактивный лимфоаденит, у двух - диффузная лимфоцитома и у 18-ти остальных - лимфосаркома (2 случая - нодулярная и 16 диффузная, в т.ч. 3 наблюдения с иммунобластами). Всех обследовали в IY стадии процесса до проведения терапии. Морфотип лимфоидных клеток идентифицировался при микроскопии (ЮОх) 4-х микронных парафиновых срезов лимфоузлов и условно обозначался в терминах гистологических вариантов рабочей формулировки неходжкинских лимфом (1982): SL - малые лимфоциты; DSC - небольшие лролимфоциты с расщеплениями ядер; FL - крупные, относительно круглые лимфобласты без расщеплений ядер; DM - крупные лимфобласты с ядрами неправильной формы, но без расщеплений; DL - крупные клетки с расщеплениями ядер; LBL - крупные лимфобласты с линейным подразделением ядер; IBL - иммунобласты с относительно правильным контуром ядра и центрально расположенной нуклеолой. Лимфоциты при диффузных реактивных лимфо-аденитах (HPL) выбраны в качестве контроля. Морфометрия проведена на анализатор« "MOP-Videoplan". При каждом гистологическом варианте обучающая выборка включала результаты морфометрии 208 клеток (у одного больного исследовали не менее 40 идентифицированных клеток).

Van der Valk et al. (1983) первыми показали, что компьютерная морфометрия лимфоидных клеток в пластиковых слезах опухоли позволяет не только дискриминировать мелко- и крупноклеточные лимфомы, но и выделить подтипы внутри каждой из этих двух основных групп. Для субклассификации мелкоклеточной опухоли выбраны цитоплазмо-ядерное отношение (ECN) и независимый индекс формы (NCI), крупноклеточной - ECN, площадь ядрышек (SNLI) и относительная ядрышковая эксцентричность (rNE). Переход от одной группы к другой сопровождался увеличе-чением дисперсии распределений клеток по площади ядер, что вызвано приростом пропорции Оластных клеток, площадь ядер которых превышает 35 кв.мкм. При мелкоклеточных лимфомах нуклеолярные параметры клеток не исследовались. Наши измерения импрегнированных нитратом серебра клеток в парафиновых срезах лимфоузлов показали (табл. 3), что нуклеолярные параметры (представлены выборочно) существенно дополняют информацию о морфологических особенностях ядер клеток

лимфоидной опухоли. Как видно, лимфоциты реактивных лимфоузлов наиболее гомогенны по площади ядер, величина и вариабельность которой значимо (рк 0,001) возрастают при крупноклеточной опухоли. Наиболее неправильная форма ядер наблюдается у псолимфоцжов с расщепленными ядрами: 4,10-1-0,29 усл.ед. Даже дна нуклеоляоных параметра (SNLI и К1), дают право заключить, что в группе мелкоклеточных лимфопролифераций лимфоцитома (SL) и пролпмсроцитарная лимфо-саркома (DSC) отличаются от реактивных лимфоцитов большим количеством интер-спазных Ag-ЯОР, а между собой - площадью ядрышек (у лимфоцитов она больше, »-ем у пролимфоцитое). При крупноклеточнои опухоли значения и вариабельность площади ядрышка достоверно (р< 0,001) увеличиваются, достигая максимальных еелечин в иммунобластах. В последнем случае зарегистрировано максимальное количество интерфазных Ag-ЯОР, которых вообще в крупных злокачественных клетках (SNUC> 35 кв.мкм.) больше, чем в мелких.

Таблица 3.

Основные морфометрические характеристики импрегнированных нитратом серебра клеток срезов реактивных лимфоузлов и лимфоидной опухоли (п=23)

М +- SD

Опухоль' Морфотип SNUC NCI SNU К1

HPL 22,54+-4,14 3,73+-0,14 1,51+-0,40 4,35+-0,81

Мелкоклеточная SL 27,48+-4,40 3,73+-0,14 1,88+-0,56 5.50+-1,04

DSC 24,23-1-4,09 4,10+-0,29 1,50+-0,58 4,99+-1,02

FL 37,59+-9.11 3.66-1-0,19 4,03+-1,17 8,76+-2,38

Крупноклеточная DL 37,06+-5,46 3.95+-0,33 3.46+-1,06 8,86-1-1,14

LBL 37,93+-5,77 3,69+-0,20 3,57+-0,79 8,46+-1,62

IBL 44,03-1-7,38 3,94+-0,29 4,89+-0,97 10,27+-2,00

'К реактивному лимфоаденету (HPL) не относится.

Интересно, что значимая отрицательная корреляция (г= от - 0,24 до - 0,48, п= 208, р< 0.0001) размера и количества интерфазных Ад-ЯОР оказалась характерной для всех исследованных клеток. Разброс коэффициентов корреляции в скобках отражает колебания их значений при изученных гистологических вариантах. Площадь ядрышек положительно коррелировала с их числом (г= от 0,14 до 0,57) и с количеством АдЯОР (г= от 0,41 до 0,78), которые были также положительно (г= от 0,22 до 0,50) связаны между собой, и находилась в прямой зависимости от площади ядра (г= от 0,22 до 0,53). Отсюда следует то, что чем больше ядро злокачественной клетки, тем больше интегральная площадь ядрышек, образованных увеличенным количеством мелких Ад ЯОР.

Использование в дискриминатном анализе только ядерных параметров (БЫIIС и N01) позволило корректно в автоматическом режиме классифицировть 49,8% Ад-

окрашенных клеток срезов лимфатических узлов. Трудными для классифкации оказались крупные Dl-клетки с расщепленными ядрами (28,37%) и малые лимфоциты при В-лимфоцитоме (38,94%). Наиболее полно из сводной выборки клеток выделялись LBL-лимфобласты (67,79%) и небольшие QSC-илетки с расщепленными ядрами (71,15%). Дополнительное включение в анализ нуклеолярных параметров (SNLI, К2, К1, NNLI и rNE) снизило среднюю ошибку машинной классификации лимфоидных клеток до 37,14% (с разбросом от 48,09% для крупных и относительно круглых FL-клеток до 29,33% для LBL-шмфобластов). Достоверное увеличение эффекта классификации отмечено для всех, кроме малых DSC, категории исследованных клеток.

Итак, в классификацию всех клеток срезов реактиеных лимфоузлов или опухош, кроме небольших с расщепленными ядрами (OSC), где ведущим дискриминатором является форма ядра, нуклеолярные параметры вносят существенный вклад. Дополняя параметры ядра, характеристики нуклеологенеза могут быть положены в основу дискриминации злокачественных лимфоидных клеток и решения спорных вопросов классификации нелейкемических гемобластозов лимфатической природы. Более того, они пригодны для выделения преимущественного морфотипа, а значит и градации злокачественности лимфоиднои опухоли.

Нуклеоляоные параметры основного морс&отипа лимсЬоидчой опухоли: градация

степени злокачественности.

Градация степени злокачественности лимфоидной опухоли - важная клиническая задача. От ее решения в полной мере зависят тактика терапии и прогноз течения заболевания. Благодаря привлечению методов электронной микроскопии, иммуногис-тохимии, морфометрии и проточной цитометрии в этой области достигнут опреде-деленный прогресс. Наши данные показывают, что количественная оценка соОеннос-тей нуклеологенеза лимфоидных злокачественных клеток вносит вклад в дальнейшее ее развитие.

Исследование проведено на материале (4-х микронные парафиновые срезы опухоли) 101 больного в возрасте от 21 до 80 лет (медиана - 52 года) при диагностике заболевания в III или IV стадии по классификации Ann Arbor (1981). В каждом наблюдении нуклеолярные параметры (НК и К1) оценены полуколичественно (табл. 2) в 100 клетках.

Ersboll et al. (1985), сравнив основные гистологические классификаци неходжс-кинских лимфом (НХЛ) на большом клиническом материале (658 случаев), отнесли фолликулярные мелко- и смешанноклеточные опухоли (FSC и FM) к благоприятным по прогнозу (медиана выживаемости 7 лет), диффузные мелкоклеточные - к промежуточным (3,5 года), а все крупноклеточные (FL, DM, DL, IBL и LBL) объединили в подгруппу с неблагоприятным прогнозом (1 год). При статобработке данных мы включили FSC (один случай), SL и DSC в первую группу наблюдений (п= 36), DM, из-за 25% примеси властных клеток, - во вторую (п= 38), FL и DL (крупноклеточные опухош)

- з третью (п= 18) и отдельно выделили группу с иммунооластной и лимфобластной лимфосаркомами (п= 9).

Сравнение исходов заболевания в подгруппах больных с различным морфотипом опухоли показало (табл. 4), что увеличение пропорции Оластних клеток сопрождает-ся увеличением показателя летальности и снижением продолжительности ремиссий и жизни больных.

Таблица 4.

Клинико-цитологические параллели при лимфоидной опухоли (п= 101).

К-во случаев Летальность МЕДИАНА

Морфотип опухоли Ремиссии Выживаемости*

(п) (%) (мес) (мес)

Диффузная мелкоклеточная 36 19,4 20 23

Диффузная смешанноклеточная 38 31,6 13 41

Крупноклеточная 18 38,9 9,5 14

Иммунобластная и яимфобластная 9 55,6 0 5

*Для группы умерших больных (п= 31).

Среди 70-ти больных, оставшихся под наблюдением в течение пятилетнего периода (группа "выживших") ремиссии зарегистрированы в 100% случаев, хотя 88,6% из них отнесены к частичным. Остальные Сольные (п= 31) за этот промежуток времени умерли (медиана выживаемости 23 мес), невзирая на интенсивную терапию (группа "умерших"). Частота ремиссий здесь составила только 74,2%, также с преимуществом (87%) частичного восстановления клинико-гематологических показателей.

В сводной выборке больных (табл. 5) медианы НК, числа Ад-ЯОР и доли (%) Б/С^

Таблица 5.

Нуклеолярные параметры и доля Б/С^-клеток при морфотипах лимфоидной опухоли.

К-во случаев МЕДИАНА

МорсСотип опухоли (п) НК К1 в/Сь,

Диффузная мелкоклеточная 36 1,12 4,62 1,28

Диффузная смешанноклеточная 38 1,16 5,18 2,0

Крупноклеточная 18 1,56 6,95 4,0

Иммунобластная и лимфобластная 9 1,51 9,08 6,5

клеток прогрессивно нарастали от морфотипа к морфотипу опухоли: диффузные мелко- и смешанноклеточные опухоли достоверно (р< 0,0001) отличались от крупноклеточной, иммуноОластной и лимфобластной, которые в свою очереди отличались между соСой (р< 0,03) только по количеству интерфазных ЯОР. Значения нуклео-лярного коэффициента (НК) в объединенной группе Сольных иммуноОластной и лимфоОластной лимфосаркомами несколько снизились за счет иммуноОластов. НК, К1 и доля (%) S/Gj-клеток положительно коррелировали между собой (г= 0,64 и г= 0,44, р< 0,0001), а все вместе были отрицательно связаны с продолжительностью ремиссий: г= -0,33, р< 0,0001, г= -0,31, р< 0,002 и г= -0,29, р< 0,003, соответственно. Следует отметить, что значимая связь характеристик нуклеологенеза с пропорцией ДНК-синтезирующих клеток (г» 0,68, р< 0,002 и г= 0,32, р< 0,05) возникла в группе больных с крупноклеточной опухолью. Средняя ошибка автоматической классификации наблюдений с использованием комбинации признаков "нуклеолярный коэффициент, доля S/0L,, среднее количество интерфазных Ag-положительных ядрышко-образующих районов и продолжительность ремиссии4 в указанной последовательности составила 42,4%.

При адекватной терапии медиана выживаемости больных с диффузными мелко-и смешанноклеточными опухолями (п=19) оказалась равной 32 мес., а с крупноклеточной (п= 12) - 9,5 мес. Наши данные в этом отношении совпадают с литературными [Ersboll et al., 1985]. Однако продолжительность жизни в группе умерших больных (табл. 4) при диффузной мелкоклеточной лимфосаркоме была меньше (23 мес.), чем при диффузной смешанноклеточноя (41 мес.). Сгруппированные в последовательности от диффузной смешанноклеточной до лимфобластной опухоли (табл. 6) наблюдения этой группы, как и наблюдения сводной выборки (табл. 5), характеризовались прогрессивным увеличением значений зсех сравниваемых параметров, но здесь подгруппы с мелкоклеточным и смешанноклеточньм морфотипами опухоли достоверно (р< 0,02) отличалась друг от друга по величине нуклеолярного коэффициента Только доля S/Go-KneTOK отрицательно коррелировала (г=» -0,58, п= 31, р< 0,05) с выживаемостью больных.

Таблица 6.

Нуклеолярные параметры и доля Б/О^-клеток при морфотипах лимфоидной опухоли в группе умерших Сольных (п= 31).

К-во случаев МЕДИАНА

Морфотип опухоли (л) НК К1 S/G,

Диффузная смешанноклеточная 12 1,12 4,56 2,5

Диффузная мелкоклеточная 7 1,35 5,04 3,0

Крупноклеточная 7 1,54 7,48 5,0

Иммунобластная* и лимфобластная 5 1,77 7,32 8,0

* В подгруппу включен один только Сольной с иммуноОластной лимфосаркомой.

Средняя ошибка классификации наблюдении в группе умерших больных с использованием комбинации признаков "нуклеолярный коэффициент, доля S/G,- (%), среднее число Ag-положительных интерфазных ЯОР и медиана выживаемости больных" составила 27%. причем главным образом за счет низкого (57,1%) по отношению к другим морфотипам эффекта выделения диффузной мелкоклеточнои опухоли.

Итак, нуклеолярный коэффициент и среднее число Ag-положительных ядрышко-образующих районов хромосом в интерфазных клетках, пригодны для градации степени злокачественности нелейкемических гемобластозов. Природа положительной корреляции количества интерфазных Ag-ЯОР и злокачественности опухоли не ясна. Несколько антигенов (р40, р150, р145 и др.) экспрессируются в ядрышке во время клеточного цикла (Hail & Woods, 1990]. Возможно, некоторые из них, включая аргентофильные нуклеолярные белки, играют особую роль в регуляции деления клетки [Feurstein et. al.. 1938]. Crocker и соавт. (1988) отметили высокую корреляцию (г= 0.86, п= 8. р< 0,001) между числом клеток лимфоидной опухоли, реагирующих с антителами к K¡57 и средним количеством Ag-ЯОР на нуклеолу. Отсюда, аргенто-фильность нуклеол прямо связана с пролиферацией. Однако, Ag-ЯОР могут иметь отношение к темпу клеточной пролиферации, а не к плоидности клеток [Crocker & Nar, 1987, Jan Mohamed et al., 1989]. Мы показали, что значимая связь между нук-леолярными параметрами и долей ДНК-синтезируюидих клеток в лимфоидной опухоли возникает только по мере увеличения пропорции О ластов (SNUC> 35 кв.мкм). Возможно, клетки опухоли с низкой злокачественностью задерживаются после совершения митоза, а клетки высокозлокачественной опухоли продолжают пролифериро-вать. Действительно, высокий уровень пролиферации гранулоцитарных предшественников (миелобластов и промиелоцитов) в костном мозге in vivo или ФГА-сти-мулированных лимфоцитов второй и третьей генераций in vitro сопровождается увеличением кошчества мелких Ag-ЯОР в их нуклеолах (см. выше). В любом случае Ag-ЯОР реакция пригодна для градации степени злокачественности опухоли.

МорсЬотип и лейкемизаиия лимфоидной опухоли.

Прогрессировала лимфоидной опухоли, т.е. гематогенная диссеминация, при выходе в кровь S-фазньк по содержанию ДНК клеток значительно ухудшает прогноз течения заболевания [Jaikanen et al., 1990]. Интересно было понять, сохраняют ли злокачественные клетки свой морфотип, в том числе и особенности нуклеологенеза, выходя в периферическую кровь.

Морфометрические параметры лимфоидных клеток периферической крови исследованы у 20 больных (16 мужчин и 4 женщины в возрасте от 16 до 68 лет), включая 5 случаев хронического лимфолейкоза, ХЛЛ (4 - с типичной клинико-гематологичес-кой картиной и 1 - ворсинчатоклеточный, ВКЛ), 3 случая SL, 4 DSC, 5 DM и 3 LBL вариантами нелейкемических гемобластозов (обозначения вариантов см. выше). Клетки импрегнпровались нитратом серебра (табл 1) и измерялись (100 в каждом наблюдении) на телевизионном анализаторе TAS (Leitz, ФРГ). Параллельно оценивалось

распределение клеток по фазам клеточного цикла (G^.S и G,) и было лроЕедено их иммунологическое фенотипирование.

От 40% до 96% лимфоидных клеток периферической крови всех Сольных реагировали с глобулиновыми фракциями иммунных сывороток против легких цепей иммуноглобулинов, что подтвердило их В-клеточную опухолевую природу, а в случае лимфссарксм - гематогенную диссеминацию опухоли [Р.С.Самойлова и соавт., 1991]. В сводной выборке больных уровень лейкоцитоза положительно (г= 0,53, п=» 19, р< 0,02), а доля (%) морфологически атипичных клеток отрицательно (г= -0,56, п=19, р< 0,01) коррелировали с их способностью образовывать розетки с эритроцитами мыши. Фенотипические различия (плотность поверхностных иммуноглобулинов, выраже-ность рецепторов к эритроцитам мыши), отражающие степень иммунологической зрелости опухолевых клеток при морфологически неоднородных вариантах заболевания, позволили условно выделить иммунологические подгруппы больных. В случае ХЛЛ или SL и DSC вариантов нелейкемических гэмобластозов при низкой плотности slg (+-) в среднем для этой подгруппы 64,4+-3,7% лимфоидных клеток окрашивались поливалентной антииммуноглобулиновой сывороткой, а 54,1+-5,6% связывали эритроциты мыши (+++), т.е. имело место соответствие типичному иммунологическому варианту В-ХЛЛ [Р.С.Самойлова и соавт., 1981]. У больных смешан-ноклеточной лимфосаркомой плотность slg оказалась повышенной (+++), а розет-кообразующая способность снижс^ юй (+-); доли клеток составили: 79,2+-10,8% и 17,5+-2,1%. При лимфобластной шмфосарко.ме отмечено снижение плотности поверхностных иммуноглобулинов и розеткообразующей способности лимфоидных клеток периферической крови (+ или -); у одного больного кроме этого выявлена экспрессия la антигена. Фенотип регистрировался соответственно на 63,3+-12,0% и 13,0+-6,5% клеток. Атипичные ("ворсинчатые") лимфоидные клетки одного в настоящем исследовании больного ВКЛ отличались относительно низкой (+) плотностью slg и отсутствием способности к розеткообразованию (-): 84,0% и 2% клеток. Содержание Т-клеток (способность образовывать розетки с эритроцитами барана) в сводной выборке больных колебалось от 2% до 42%. Таким образом, иммунологическое фенотипирование идентифицирует опухолевую специфичность исследуемого субстрата, подтверждает прогрессирование и гематогенную диссеминацию лимфосарком. Однако дифференциация хронического лимфолейкоза и лимфоцитомы остается за пределами возможностей метода.

Значения площади ядра лимфоидных клеток у наших больных колебались от 9,48 до 98,8 кз.мкм, в среднем достоверно (р< 0,002) превышая аналогичный параметр "здоровых" лимфоцитов. Вместе с тем, клетки типа "малых лимфоцитов" у больных ХЛЛ и лимфоцитомой (SL) по площади ядер не отличались между собой и от обычных лимфоцитов; значимо (р< 0,012) величина параметра возрастала только у больных с DSC, DM и LBL гистологическими вариантами опухоли. Таким образом, сдвиг гистограмм влево, очевиднс, объясняется мелкими лимфоидными элементами больных ХЛЛ; вправо - примесью клеток с крупными (> 35 кв.мкм) ядрами.

По данным цитофотометрии окрашенных по Фельгену ядер, лимфоидные клетки периферической крови большинства наших Сольных находились в фазе СОЛ," по содержанию ДНК клетки обнаружены только в шести случаях. Доля таких клеток, как правило, не превышала 2%, не эависила от варианта заболевания или иммунологического фенотипа клеток и только у одного больного с ¡.В!, морфотипом спухош для лимфобластсв (62% в гемограмме) достигла 27%. Как в сводной вы-Оооке всех больных, так и при 1_В1. между пропорцией Б+С^ и долей морфологически атипичных клеток была положительная корреляция: г= 0,48, п= 19, р< 0,04 и г= 0.8В, 6, р< 0,02 соответственно.

Аргентофильность нуклеол (5Ад) нарастала в зависимости от доли морфологически незоелых клеток и степени злокачественности заболевания [В.М.Погорелов и соазт., 1587} Отмечена положительная корреляция параметра с долей морфологически незрелых клеток (г= 0,75, п= 19, р< 0.0002) и отрицательная корреляция (г=- 0,62, п= 19, р< 0.005) с долей клеток, образующих Ет-розетки. Малое количество наблюдений с З-Коэ-клетками среди наших больных не позволяет сделать вывод о взаимоотношении цитофотометрических параметров пролиферации и интерфазной активности риоосомных генов.

Включение комплекса характеристик в последовательности: площадь интерфазных Ад-ЯОР (кв.мкм), абсолютный лимфоцитоз (хЮ'/л), число клеток экспрессирую-щих поверхностные иммуноглобулины, фенотип, площадь клеточного ядра (кв.мкм), количество Б+Сх, по содержанию ДНК клеток и абсолютное число Т-клеток (по способности образовывать розетки с эритроцитами барана), - в дискриминантныи анализ позволило корректно классифицировать все наблюдения обучающей выборки (Рис. 2). При проверке решающего правила получен обнадеживающий результат: неизвестный случаи (X« ОМ-вариант опухоли?) отнесен в соответствующую подгруппу наблюдении

Итак, при лейкемизации опухоли лимфоидной природы, по крайней мере ее ОМ и 1_В1_ гистологических вариантов, в периферическую кровь больных выходят крупные (ЗЫиС> 35 кв.мкм.) злокачественные клетки с увеличенной площадью аргентофиль-ных структур нуклеол. Не менее важно и то, что если даже при таких злокачественных лимфопролиферациях, как ХЛЛ или лимфоцитома, лимфоидные клетки периферической крови не пролиферируют, имеют практически равную лимфоцитам площадь ядер и одинаковый фенотип, они все-таки отличаются друг от друга и от нормальных лимфоцитов увеличением площади аргентофильного материала нуклеол. Комбинация печерисленных выше параметров, включая оценку цитохимической Ад-ЯОР реакции, обеспечивает корректную классификацию морфотипа опухоли. Наш опыт многомерного анализа клинико-лабораторных данных, открывает перспективы разработки компьютерной экспертной системы оценки лейкемизации лимфоидной опухоли. Преимущества клинического применения интерактивной морфометрии лим-фоидных клеток выпотов полостей (брюшной, плевральной или перикарда) при хро-

ничесхсм лимфо лейкозе и неходжскинских лимфомах обсуждаются в литературе [Walts & Marchevsky, 1989].

12

э

в

df 2

3

О

-3

-23 -13 -3 7 17

dt 1

Рис. 2. Результаты дискриминантного анлиза наблюдении с злокачественными лимфопролиферациями: df 1 и df2 - дискриминантные функции; X - неизвестный случай.

Морфометрическая классификация острого шмфобластного лейкоза.

Подразделение ОЛЛ на варианты и субварианты в определенной мере определяет тактику современной терапии лейкоза [Prentice & Grob, 1986]. Поскольку ФАБ-клас-сификация предполагает более благоприятный прогноз при L1 варианте ОЛЛ [МПler et al. 1981, 1985; Liüeman et al., 1986; Marcus et al., 1986], важным является вопрос разработки способов обьективного анализа морфологического полиморфизма лей-козных клеток [Seshardi et al., 1935; Tosi et al., 1987]. Результаты анализа могут быть использованы для субклассификации лейкоза, что, возможно, найдет применение в клинической практике. В этом разделе работы была предпринята попытка оценки морфологических особенностей бластов LI и L2 при ОЛЛ с помощью компьютерной морфометрии на уровне светового микроскопа (MOP-Videoplan, Reichert, Австрия). Одновременно проведено сравнение результатов морфометрии и иммунологического фенотипирования лейкозньк элементов костного мозга и оценена прогностическая значимость исследованных параметров. Характеристика больных и методы подробно изложены выше.

Для автоматической классификации Оластов L1 и L2, а отсюда и соответствующих вариантов лейкоза, использовано решающее правило, выведенное нами на основе многомерного дискриминантного анатмза результатов морфометрии обучающих выборок клеток, идентифицированных по критериям ФАБ-классификации [Bennett et at., 1976; Brearley et al., 1979]. Определена следующая комбинации информативных параметров: РЗ (W3=-0.338), Р2 (W2=-6.145), Р12 (W12=-0.044), P1 (W1=1.007), Р15 (W15=-0.279). Р14 (W14=-5.920) и Р6 (W&=-0.640), В скобках указаны коэффициенты дискриминации. При машинной классификации, если сумма произведений коэффициентов на соответствующие парамегры не превышала значения порога дискрими-нантнои функции (Т»-117.776), клетка относилась к бласту L1, в противном случае - к бласту L2. Ошибка классификации в независимом экзамене составила 13,98% у взрослых больных и 10,26% - у детей.

Морфологическая гетерогенность бластов костного мозга отмечена у всех больных; в каждом наблюдении выделено два основных типа бластов. Кроме этих бластов. классифицированных как L1 и 12., нами выделены переходные L1/2 и L2/1 лей-кознью клетки. Остальные результаты этого раздела исследования сводятся к следующему:

1. Компьютерная морфометрия является объективным методом исследования структуры морфологически гетерогенных популяций бластов костного мозга; ее результаты пригодны для классификации L1 и L2 вариантов ОЛЛ и исследования цитологических особенностей опухолевой трансформации лейкоза

2. Выделенные на основе машинной классификации бластов морфологические варианты ОЛЛ встречаются как у детей, так и у взрослых, однако L1 преобладает в первой (72,7%), a L2 - во второй (64,9%) возрастных группах.

3. Вариант L2 отличается от варианта L1 достоверно (р< 0,001) большими значениями диаметра ядра, площади клетки, цитоплазмо-ядерного отношения и площади нуклеол бластов костного мозга.

4. Выделение переходных морфологических типов Оластов открывает перспективы цитологической субклассификации ОЛЛ. С другой стороны, наличие переходных форм, по-видимому, отражает функциональную неоднородность лейкозных элементов или неодинаковое их положение в фазах клеточного цикла.

5. Между иммунологическим фенотипом властных клеток и их морфологией нет связи: экспрессия одинаковьи антигенов наблюдается как при L1, так и при (^вариантах ОЛЛ, однако ранняя лимфоидная дифференцировка предположительно чаще (67%) регистрируется у больных с L2 морфологией Оластов.

6. Как у детей, так и у взрослых вольных при L1 ОЛЛ отмечается большая частота ремиссий, чем при L2; "взрослый" L1 отличается от "взрослого" 12 ОЛЛ недостоверной (р> 0,05) тенденцией к увеличению продолжительности ремиссий: 13,5+/-4,8 и 7,9+/-3,3 мес.

7. В динамике терапии при индукции ремиссий еще до полного исчезновения бластов из костного мозга наблюдается смена морфотипа L2Ha L1; при отсутствии ре-

миссия или в рецидиве заболевания имеет место стабилизация 12 морфологии или смена б ластов L1 на L2.

Наши данные не являются оригинальными. Seshardi et а). (1987), включив в многомерный анализ вместе с клиническими характеристиками (возраст, пол, лейкоцитоз) морфометрические параметры властных клеток (площадь ядра, коэффициенты вариации цитоплазмо-ядерного отношения и формы ядра), отметили положительную корреляцию доли властов 12 с ранним развитием рецидива заболевания. Tosi et al. (1987) показали, что чем больше площадь ядер бластов и меньше ядерно-цитоплаз-матическое отношение, тем меньше продолжительность жизни при детском ОЛЛ. М.А.Френкель и соавт. (1987) в иммуноморфологическом исследовании предположили возможность существования переходных типов властных клеток. Однако у взрослых больных до этого компьютерная морфометрия клеток не проводилась. Кроме того, мы хотели подчеркнуть важность параметров нуклеологенеза для классификации вариантов лейкоза и определить их связь с прогрессией заболевания.

Основной вывод этого раздела работы состоит в том, что морфометрические параметры лейкозных клеток костного мозга могут быть использованы для обьек-тивной идентификации L1 и L2 вариантов и дальнейшей субклассификации ОЛЛ как у детей, так и у взрослых. При том и другом лейкозах информативные для дискриминации властных клеток комбинации морфометрических параметров включают показатели нуклеолярного аппарата, которые занимают второе место после таких характеристик ядра, как максимальный диаметр, периметр и площадь. В рецидиве заболевания имеет место стабилизация L2 морфологии или смена бластов L1 на L2, т.е. прогрессия заболевания сопровождается уменьшением нуклеолярного коэффициента и увеличением площади нуклеол злокачественных клеток.

Ядрышкообразуюшие районы хромосом в интерфазных властных клетках при вариантах острого лейкоза.

Следующий раздел работы выл посвящен изучению интерфаэных Ag-ЯОР в клетках костного мозга Сольных острым лимфобластным и нелимфоцитарным, острым миелобластным и миеломоноОластным, вариантами лейкоза. Обследовано 32 человека: 12 больных ОЛЛ (средний возраст - 24 года), 11 больньк ОНЛЛ (средний возраст - 33 года) и 9 доноров костного мозга (средний возраст - 24 года). При микроскопии (100х) мазков, импрегнированных 50% раствором нитрата серебра в Ад-положительных шмфобластах и миело-(моно)бластах (50-100 клеток в каждом наблюдении) учитывались среднее количество гранул серебра на клетку (К1) и условный средний размер (К2) гранулы. Морфометрия клеток (не менее 100) проводилась на анализаторе MOP-Videoplan (Reichert, Австрия). Морфометрический вариант ОЛЛ устанавливался по доле автоматически классифицированных властных клеток. При стат-обработке в подгруппе ОЛЛ сравнивались медианы нуклеолярных параметров (НК, SNL), К1 и К2) и показателей пролиферации (доли S% и Gl,%) соответствующих бластов; ОНЛЛ рассматривался в выборках двух морфо-цитохимических вариантов:

ОМЛ (n- 5) и ОММОЛ (п= 6), а контролем служили миелоОласты здорового костного мозга.

На сроне разброса от 1% до 9% S-фазных по содержанию ДНК клеток при ОЛЛ и от 5% до 16% при ОНЛЛ, С ласты сравниваемых вариантов острого лейкоза существенно отличались по показателям нуклеологенеза. При L1 варианте ОЛЛ злокачественные клетки характеризовались относительно высоким нуклеолярным коэффициентом (2,1) и мелкими нуклеолами (2,9 кв.мкм), образоваными увеличенным, по сравнению с нормальными лимфоцитами (см. выше), количеством (6,45) крупных (0,41) Ag-ЯОР. Сателлит»ь»е ядрышки довольно часто встречаются в периферической крови больных ОЛЛ [Smetana et al., 1989]. Они содержат те же белки, что и обычные нуклеогы, окрашиваются метиленовым синим на РНК. Предполагается, что клетки с такими нуклеолами бокированы на выходе из митоза. При L2 ОЛЛ площадь единичных нуклеол, образованных большим количеством (8,45) мелких (0,24) АдЯОР увеличена (4,5 кв.мкм). Похоже, что эти клетки накапливаются в S-фазе (см. модель нуклеологенеза). Однако их доля по содержанию ДНК в этом участке цикла ниже, чем при ОМЛ. Интересно, что в бластах костного мога больных ОМЛ несколько (2,4) относительно крупных ядрышек (5,97 кв.мкм) с небольшим числом (4,93) слившихся (0,40) гранул нуклеолярного серебра. Что здесь низкая скорость пролиферации или блок на границе G,/ S? Вопрос требует разрешения. Преимущественно одна и самая крупная (8,96 кв.мкм) среди сравниваемых властных клеток нуклеола оказалась при ОММОЛ. В ее образовании участвует увеличенное количество (6,36) мелких (0,36) АдЯОР. Здесь практически одинаковая с ОМЛ доля S-фазных клеток, но более выражен переход в СЦ. Миелобласты костного мозга доноров, будучи потомками про-лиферирущей стволовой клетки, продолжают деление: до 61% S-фазных по содержанию ДНК клеток [Г.И.Козинец и соавт., 1986]. При цитохимической реакции с нитратом серебра эти клетки в интерфазе проявляют большое количество (9,72) мелких (0,22) гранул серебра, сохраняя относительно высокий нуклеолярный коэффициент (3) и увеличенное значение интегральной площади ядрышек (6,69 кв.мкм). Окраска метиленовым синим демонстрирует трабекулярную структуру ядрышек нормальных миелобластов, т.е. как и S-фазные лимфоцитов после стимуляции ФГА in vitro. Вряд ли отмеченные особенности нуклеологенеза лейкозных клеток определяются дефектами пролиферации. Скорее наоборот, патология нуклеологенеза лишает клетки -способности входить в цикл или задерживает их в предполагаемых контрольных точках клеточного цикла. А это в свою очередь может зависеть от активацией при вариантах острого лейкоза различных онкогенов, экспрессия которых нарушает контроль профирации (Cline & Ahuja, 1991].

Включение комплекса характеристик (Рис. 3) в последовательности: интегральная площадь ядрышек (кв. мкм), условный размер интерфазных Ag-ЯОР (К2), нуклеолярный коэффициент (НК), доля S-фазных по содержанию ДНК клеток (S,%) и среднее число Ag-ЯОР (К1) в дискриминантный анализ позволило классифицировать варианты острого лейкоза в обучающей выборке: только наблюдения с ОМЛ накладыва-

лись на другие распределения, которые между собой надежно разделились в диагностическом пространстве признаков.

♦ .г

2.2

df 2

0.2

-1.8 -3.8

Рис. 3. Результаты дискриминантного анализа наблюдений с различными вариантами острого лейкоза: df1 и dfZ - дискиминантные функции.

Больные острым нелимфоцитарным лейкозом в настоящей работе обследованы только для сравнения: детальное изучение варианта лейкоза не входило в задачу исследования. Тем не менее, наши результаты в основном совпадают с данными других авторов. Так, О.А.Иконникова (1990) считает, что активность ядрышковых организаторов - независимый прогностический признак острого лейкоза у детей. Arden et al. (1985; 1989] в серии исследований показали, что при выраженной гетерогенности ме-тафазных и интерфазных Ag-ЯОР их число при ОПП превышает значение показателя в клетках здорового костного мозга или костного мозга больных острым нелимфоцитарным лейкозом, приближаясь к Оластному кризу хронического миелолей-коза. В ремиссиях лейкоза аргентофильность нуклеол падает до уровня аргенто-фильности ядрышек клеток здорового костного мозга [Arden et al., 1989]. Последние проявляют меньшее сродство к нитрату серебра и более выраженно, чем ФГА-стимулированные лимфоциты периферической крови, варьируют по числу Ag-ЯОР [И.Л. Грабовская, 1985]. По мнению ряда авторов [Н.Н. Мамаев и соавт., 1980; 1984; И.Л.Грабовская, 1985], это связано с различиями в способности клеток кроветвор-

у

2 V* 12 \ L2 U4 U4 М4 ]

VL2/ г Л ч

С — tí L1 L1

-3-1 13 5

di 1

ной ткани вступать в митоз. Вообще считается, что у менее дифференцированных клеток большая потребность в синтезе белка, т.е. в транскрипции рРНК и продукции рибосом (Н.Н.Мамаев и согвт., 1930; 1984; Arden et al., 1989]. В работах ЕО.Мороэовой и со авт. (1989; 1990) показано, что изменения размеров, формы и количества ядрышек в властных клетках при лейкозах связаны с нарастанием синтеза 45SPHK и нарушением процессинга этого предшественника рибосом. Принимая во внимания все перечисленные факты, следует добавить, что содержание крупных нуклеолярных белков реально отражает скорость удвоения популяций опухолевых клеток, т.е. является важным фактором прогноза течения рака различной локализации [Derenzini et а!., 1990]. На примере ОЛЛ (Рис. 3) мы подтверждаем, что прогрессия злокачественного процесса сопровождается явным увеличением количества аргентофильных белков в злокачественных лимфоидных клетках.

АсгентоФильность нуклеол лимфоцитов костного мозга в ремиссиях острого лейкоза.

Цитохимическая реакция нуклеол с нитратом серебра пригодна для для оценки глубины ремиссии острого лейкоза [Arden et al., 1989]. Увеличение активности ядрьш-кообразующих районов хромосом морфологически сохранных лимфоцитов отмечено при гиперплазии и раке эндометрия [Л.Г.Бучинская, 1989]. В этой связи мы провели специальное полуколичественное исследование (тип нуклеол, нуклеолярный коэффициент и среднее количество интерфазных Ag-ЯОР) лимфоцитов костного мозга 4-х Сольных ОЛЛ, 7-ми Сольных ОМЛ и 8-ми больных ОММОЛ в первой кли-нико-гематологической ремиссии заболевания.

По сравнению с практически здоровыми людьми (табл. 7) при всех исследованных вариантах острого лейкоза доля (%) лимфоцитов с гомогенными нуклеола-ми (окраска метиленовъм синим) оказалась повышеной, а доля клеток с кольцевид-

Таблица 7.

Распределение лимфоцитов костного мозга по типу нуклеол в ремиссиях острого лейкоза (п- 19).

М +- SD

Группа наблюдений Нуклеолярный Доля (%) клеток с нуклеолами

коэффициент Кольцевидными Гомогенными Точечными

Контроль (п« 11)* 0,98+-0,53 91,04-1,8 3,0+-0,50 6,0+-0,7

ОЛЛ (п* 4) 1,40+-0,26 44,0 +-12,1 25,5 +- ад 30.0 +-12,4

ОМЛ(п=7) 1,444-0,28 68,6-1-13,1 21,1 +-10,5 12,3+-11,3

ОММОЛ (п= 8) 1,52+-0„32 61,4+-13,2 22,1 +-8,3 16.8 +-11,9

* Контролем служили лимфоциты костного мозга группы риска (см. материалы и методы).

ными ядрышками сниженной. У Сольных ОМЛ максимальное число клеток с гомогенными ядрышками отмечено на 2-3 мес. полной ремиссии, минимальное - на 10-ом. Аналогичные данные получены при ОММОЛ: 2 и 14 мес. соответственно. У больных ОЛЛ в динамике ремиссии распределение лимфоцитов костного мозга по классам ядрышек практически не менялось.

Соответственно с этим при ОМЛ (п= 6) и ОММОЛ (п=7) среднее количество интерфазных Ag-ЯОР, как и НК, по мере длительности ремиссии уменьшалось от 7,24-1,2 на клетку на втором месяце до 4,5+-2,8 на 10-14 мес. У больных острым лимфобластным лейкозом (п=> 3) показатель держался на одном уровне вне зависимости от срока ремиссии: 5,21+-0,18. В контроле (п= 11) среднее число Ag-ЯОР составило 3,77-1-0,38 на клеточное ядро.

Таким образом, показатели нуклеологенеза лимфоцитов костного мозга в ремиссиях острого лейкоза изменены: хотя и наблюдается связанная со сроком ремиссии тенденция к их восстановлению, особенно у больных ОНЛЛ, значения доли гомогенных ядрышек и количества интерфазных Ag-ЯОР не достигают контрольного уровня. Возможно, это связано с применением цитостатиков. Однако показано, что частота лимфоцитов с гомогенными и точечными ядрышками в периферической крови при раке легких, желудка или тела матки достоверно увеличивается по сравнению с контролем [Srnetana et al., 1980; Л.Г.Бучинская, 1989]. Также увеличенной в этой клинической ситуации оказывается активность метафазных ядрышкообразую-щих районов [Л.Г.Бучинская, 1989]. Авторы склонны объяснять эти факты стимуляцией синтеза ядрышковой РНК. Действительно, в стимулированных ФГА нормальных лимфоцитах (см. модель нуклеологенеза) гомогенные ядрышки появляются через 4 ч. культивирования, когда одновременно увеличиваются площадь нуклеолярного серебра, количество нуклеол и существенно нарастает синтез тотальной РНК. Считается, что снижение доли клеток с кольцевидными ядрышками указывает на диссеми-нацию опухоли [Srnetana et al., 1980]. Итак, во-первых, можно заключить, что реакция организма на опухолевый рост во время ремиссии лейкозного процесса сохраняется. Во-вторых, ОЛЛ отличается от ОНЛЛ: высокая частота лимфоцитов с гомогенными и точечными ядрышками при увеличенных значениях нуклелярного коэффициента и среднего количества интерфазных Ag-ЯОР в первом случае на всех сроках ремиссии остаются без изменения.

вии на организм человека иммуносупрессоров и ионизирующего облучения.

Ингибиторы синтеза молекул РНК, например, актиномицин D, в экспериментальных условиях вызывают трансформацию кольцевидных нуклеол лимфоцитов в точеч-чные или микроядрышки [Raska et al., 1981]. Микроядрышки не включают 3Н-уридин. При электронной микроскопии они характеризуются уплотнением (дегрануляцией) и отделением гранулярного компонента от фибриллярных центров. Происходит то, что Busch & Srnetana (1970) определили термином "ядрышковая сегрегация". В естест-

венных условиях феномен проявляется по по мере вызревания и дифф^ренцировки эритроидных или гранулоцитарных предшественников, а также возникает пр/ дегенерации клеток. Проведя анализ изображения импрегнированных нитратом серебра лимфоцитов периферической крови шести Сольных апластической анемией до и после лечения антилимфоцитарным иммуноглоглобулином, а также лимфоцитов 45 человек, подвергшихся облучению (группа риска), мы пришли к заключению, что феномен ядрышковой сегрегации (Рис. 4) является одним из морфологических выражений интерфазной гибели клеток, т.е. апоптоза.

Рис. 4. Феномен ядрышкоеой сегрегации в лимфоците периферической крови больной апластической анемией после терапии антилимфоцитарным иммуноглобулином: А. Малый и средний лимфоциты с одной нуклеолой. В. Сегрегация ядрышкового материала. (2500х).

Апластическая анемия (АА) - тяжелое гематологическое заболевание, характе-резующееся панцитопенией, миелокариоцитопенией и увеличением жировой ткани в костном мозге, отсутствием гиперплазии селезенки и лимфатических узлов. В целом патогенез АА до настоящего времени не ясен. Как об одном из многочисленных его звеньев в литературе обсуждается вопрос о супрессорном влиянии лимфоцитов на эритропоэз [Е.Д.Гольдберг и соавт., 1983]. Поэтому в практике лечения АА применяется антилимфоцитарный глобулин (АЛГ). Результаты проведенного нами исследования позволяют заключить, что при апластической анемии свыше 50% лимфоци-цитов периферической крови представлены крупными клетками с максимальным диаметром ядра более 9 мкм. (медиана: 9,47 мкм.) и наличием от 1 до 9 гранул Ад, средний размер которых составляет 0,56-1-0,23 усл. ед. Для сравнения: диаметр контрольных лимфоцитов колебался от 4,11 до 8,98 мкм., число гранул серебра - от 1 до 6 на клетку, а их средний размер - 0,48+-0,18 ус. ед. Доля клеток с увеличенным ядром у больных до терапии АЛГ отрицательно коррелировала с содержанием гемоглобина в эритроците. После терапии АЛГ диаметр лимфоцитов достоверно не из-

А.

менялся (удельный вес больших клеток по-прежнему превышает 50%), но в них увеличивалось число мелких нуклеол с крупными Ag-гранулами (Рис. 4).

Возможно, что морфологические изменения лимфоцитов при апластической анемии, например, на ее начальных этапах, носят компенсаторный характер. Однако, функциональная активность "сохранных" клеток в конечном итоге истощается и постепенно наступают их необратимая деструкция и гибель. Антилимфоцитарный глобулин относится к активным средствам терапии АА. С его помощью можно получить значительные положительные сдвиги показателей гемо- и миелограммы [В.Г.Савченко и соавт., 1990]. Однако гемопоэз восстанавливается не по всем параметрам и АЛГ, лишь частично компенсируя заболевание у некоторых больных, искусственно стимулирует деградацию циркулирующих лимфоцитов: через 30 дней после курса терапии в периферической крови больных значимо по сравнению с практически здоровыми людьми увеличивается доля клеток с крупными ядрами и морфологией нуклеолярного аппарата, напоминающей феномен "ядрышковой сегрегации", т.е. с признаками подавления синтеза рибосомной РНК. Все эти факты сегодня трудно объяснить с достаточной определенностью. Их трактовка может быть лишь предположительной. Например, интерфазная гибель иммунокомпетентных клеток в динамике заболевания или после терапии АЛГ выключает иммунный или какой-либо другой контроль кроветворения.

Количество интерфазных Ag-ЯОР в лимфоцитах периферической крови лиц (п= 45) принимавших участие в ликвидации аварии на ЧАС, достоверно (р< 0,01) увеличилось только в подгруппе (п= 15) с дозой облучения от 16 до 25 Бэр: 4,62+-0,83 против 1,24+-0,63 в контроле. Одновременно увеличилось значение нуклеолярного коэффициента: 1,23+-0,20 и 0,98+-0,53 соответственно (р< 0,05). Мы рассматриваем эти результаты как предварительные. Однако интересно, что интерфазная гибель лимфоцитов, например, после рентгеновсго облучения крыс, начинается с пикноза, уплотнения ядер и довольно быстрого (через 6 часов от начала эксперимента) исчезновения из периферической кроен животных малых лимфоцитов; средние и большие лимфоциты при этом наоборот набухают, размеры «х ядер увеличиваются, а процесс гибели растянут во времени; количественное соотношение меняется в пользу больших лимфоцитов [Э.Е.Оганджанян и соавт., 1989]. Пикноз и распад хроматина клеточных ядер лимфоцитов язляется следствием вторичной пострадиационной деградации ДНК в тканях облученных животных [A.M.Поверенный и соавт., 1937]. Облучение мышей нейтронами уже через 30 мин после воздействия наряду с повреждением цитоплазматических включений, исчезновением митохондрий и крист, появлением цитоплазматических выростов и фрагментацией мембран, в результате чего ядро становится неправильной формы, сопровождается сегрегацией ядрыш-кового материала [Somosy et а!., 1985].

Подводя итог всей работе, необходимо заключить, что в целом, изменения ядры-шкового аппарата клеток играют важную роль в патогенезе лимфосарком и острого

— '¿с? —

лимфобластного лейкоза. Нельзя окончательно установить природу этих изменений.Можно лишь предположить, что она сводится к активации онкогенов. Тем не менее, полученные данные, подтверждая прогрессию заболевания, расширяют возможности субклассификацми лимфосарком и острого лимфобластного леикоза. Вместе с морфоцитохимическими, цитофотометрическими и иммунологическими характеристиками малигнизированных клеток, могут быть использованы в качестве прогностических критериев течения гемобластозов.

ВЫВОДЫ:

1: Динамика изменений морфологии нуклеолярного аппарата, слецифичена и обусловлена принадлежностью клеток к лимфоидному ростку кроветворения, уровнем их дифференцировки и пролиферативной активности.

2: Характеристики нуклеолярного аппарата с учетом параметров ядра (площадь, индекс фермы) могут быть положены в основу дискриминации злокачественных лимфоидных клеток, выделения преимущественного морфотипа лимфоидной опухоли и градации степени ее злокачественности.

3: Лимфоцитома и пролимфоцитарная лимфосаркома (мелкоклеточные опухоли) отличаются от реактивных лимфоцитов большим количеством интерфазных ядрышкообраэующих районов, а между собой площадью ядрышек: при лимфоцитоме они крупнее. Крупноклеточные опухоли (ядро более 35 кв.мкм) характеризуются более высокими значениями площади ядрышек и количества ядрышкообразующих районов, которые достигают максимальных величин в иммунобластах.

4: Для автоматической классификации морфотипа лимфоидной опухоли информативна комбинация параметров а следующей последовательности: площадь клеточного ядра, количество и размеры интерфазных ядрышкообраэующих районов, нуклеолярный коэффициент и доля 5+С2-фазных клеток. Ошибка классификации мелко- и крупноклеточной опухоли в независимом экзамене составляет 14,8%.

5: Параметры нуклеологенеза в опухолевых клетках лимфоидной природы имеют самостоятельное прогностическое значение: нуклеолярный коэффициент и количество интерфазньсх ядрышкообраэующих районов отрицательно коррелируют с продолжительностью клинико-гематологических ремиссий.

6: У больных острым лимфобластным лейкозом лимфобласты И надежно выделяются от лифобластов 12 по морфометрическим параметрам и досто-стоверно отличаются меньшей площадью нуклеол, меньшим количеством , но большим размером интерфазных ядрышкообразующих районов.

7: В группе больных острым лимфобластным лейкозом с преобладанием 12-лейкозных клонов частота выхода в ремиссию и ее продолжительность зна-

чимо ниже, чем в группе вольных с преобладанием L1-клонов. В динамике эффективной терапии доля L2 клеток достоверно уменьшается, при рецидивах лейкоза - возрастает.

8: Феномен ядрышковой сегрегации в лимфоцитах является неспецифическим отражением интерфазной гибели клеток при воздействиях на организм им-муносупрессоров или ионизирующего облучения.

9: Интерактивная компьютерная морфометрия является объективным методом исследования гетерогенных популяций злокачественных клеток в мазках периферической крови и костного мозга, отпечатках и срезах ткани и пригодна для выявления особенностей опухолевой трансформации.

10: Теоретически возможно, что выявленные при лимфоидных гемобластозах особенности нуклеологенеза являются следствием необычной экспрессии клеточных онкогенов. В любом случае они связаны со степенью злокачественности и этапом профессии новообразования и могут быть использованы для прогнозирования течения заболевания.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Разработанные в диссертации методы в клинической гематологии могут быть использованы для:

1: Прогнозирования течения и ответа больных острым лимфобластным лейкозом и лимфосаркомами на проводимую терапию.

2: Оценки ответа больных апластической анемией на тепрапию антилимфоци-тарным иммуноглобулином.

3: Определения функциональной активности лимфоцитов периферической крови лиц, подвергшихся воздействию экологических факторов.

Методы могут быть реализованы в условиях клинико-диагностических лабораторий, просты и относительно дешевы.

В теоретическом плане предстоит решить вопрос о роли нуклеолярных белков в генетическом контроле клеточного цикла и о природе их посттрансляционных изменений под влиянием клеточных протоонкогенов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1: Дульцина С.М., Захарова A.B., Котельников В.М., Погорелов В.М. и др. Цитологические аспекты в диагностике лейкозов. В кн.-. Материалы 56-ой науч. сессии ЦНИИГПК. М„ 1984, с. 95-96.

=.и -

2: Козинец Г.И. , Захарова A.B., Погорелов В.М. и др. Кариотип гемопоэтических клеток человека в норме и при некоторых заболеваниях системы крови. Методические рекомендации. М., 1982,21 с.

3: Козинец Г.И., Котельников В.М., Дульцина С.М., Погорелов В.М., и др. Общие вопросы пролиферации. В кн.: Кинетические аспекты гемопоэза (ред. Г.И.Козинец и Е.Д.Гольдберг). Томск, 1982, с. 4-78.

4: Козинец Г.И., Белакооскии М.С., Ушаков A.C., Быкова И.А., Матвеенко В,П., Дульцина С.М., Дягилева O.A., Касаткина В.В., Ряполова И.В., Погорелов В.М. Структурные и функциональные изменения эритроцитов и лейкоцитов человека в условиях 7-суточной иммерсионной гипокинезии. Косм. биол. и авиа-космич. медицина., 1983, No. 3, с. 48-51.

5: Козинец Г.И., Ильинский Ю.А., Соколова Л.В., Погорельская Л.В., Погорелов В.М. Особенности нуклеолярного аппарата лимфоцитов периферической крови при брюшно-тифозной инфекции. Сов.медицина., 1983, No. 12, с. 34-38.

6: Козинец Г.И., Афонин Н.И., Касаткина В.В., Талеленова H.H., Дульцина С.М., Левина Н.В., Погорелов В.М. и др. Изучение влияния эмульсий фторуглеродов на клетки гемопоэтической ткани. В кн.: Биологически активные эмульсии в эксперименте и в клинике., М., 1983, с. 94-101.

7: Козинец Г.И., Котельников В.М., Погорелов В.М. и др. Цитофотометрия гемопоэтических клеток. В кн.: Автоматизация цитологических исследований. Пущино, 1985, с. 51-89.

8: Козинец Г.И., Ковалева Л.Г., Полянская А.М., Касаткина В.В., Дульцина С.М., Шишканова З.Г., Захарова A.B., Котельников В.М., Погорелов В.М. и др. Клинико-цитологическая диагностика гемобластозов. Гематол. трансфузиол., 1985, No. 5, с. 3-12.

9: Козинец Г.И., Котельников В.М., Погорелов В.М. Хроматин и кинетика пролиферации гемопоэтических клеток при гемобластозах. В кн.: 2-ой Всесоюзный сьезд гематологов и трансфузиологов. М., 1985, с. 179-179.

10: Козинец Г.И., Дульцина С.М., Захарова A.B., Шишканова З.Г., Кореневская М.И., Касаткина В.В., Котельников В.М., Погорелов В.М. Цитологическая диагностика острых лейкозов на основе классификации FAB и новых цитохимических критериев. Гематология и трансфузиология., 1986, No. 9, с. 8-14.

11: Козинец Г.И., Сарычева Т.Г., Ряполова И.В., Погорелов В.М. и др. Зритроидная дифференцировка и пролиферация (современные методы изучения и их дальнейшее развитие). В кн.: Научно-технический прогресс в службе крови страны. Рязань, 1987, с. 91-97.

12: Козинец Г.И., Погорелов В.М., Котельников В.М., и др. Цитогенетическая и кинетическая характеристика лимфоцитов при лимфопролиферативных заболеваниях. В кн.: Иммунологические и кинетические характеристики лимфоцитов при лимфопролиферативных заболеваниях (под ред. В.П.Лозового и Г.З.Шубинского). Новосибирск, Наука, 1987, с. 70-85.

13:Козинец Г.И., Погорелов В.М., Котельников В.М., и др. О стабильности крове-ворения и его лабораторных показателей (Обзор литературы). Лабор. дело., 1988, No. 7, с. 3-7.