Автореферат и диссертация по медицине (14.03.02) на тему:Морфологические изменения во внутренних органах и перевитой опухоли лабораторных животных при введении наночастиц железа

На правах рукописи

Кун Сянмяо

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ВО ВНУТРЕННИХ ОРГАНАХ И ПЕРЕВИТОЙ ОПУХОЛИ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ВВЕДЕНИИ НАНОЧАСТИЦ

ЖЕЛЕЗА

14.03.02 - патологическая анатомия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Саратов - 2013

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный медицинский университет имени В. И. Разумовского» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Маслякова Галина Никифоровна.

Официальные оппоненты:

Бугаева Ирина Олеговна - доктор медицинских наук, профессор; ГБОУ ВПО Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского Минздрава России; кафедра гистологии, заведующая кафедрой. Плотникова Надежда Алексеевна - доктор медицинских наук, профессор; ГБОУ ВПО Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева; кафедра патологии с курсом патологической физиологии, заведующая кафедрой.

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Смоленская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится « » 2013 г. в /У" часов на заседании

диссертационного совета 208.094^01 при ГБОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В. И. Разумовского» Минздрава России по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Б. Казачья, 112.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В. И. Разумовского» Минздрава России.

Автореферат разослан« -/с/» /^^¿^Уу/сУ 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Маслякова Г. Н.

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ

БИБЛИОТЕКА 3

2014

Общая характеристика работы Актуальность исследования

В настоящее время наноструктуры широко применяются в различных областях биомедицины для визуализации различных биообъектов и доставки лекарственных средств; для усиления контрастирования и повышения диагностической чувствительности при проведении магнитной резонансной томографии; целевой доставки и специфического связывания терапевтических препаратов с клетками, тканями и органами; гипертермии с помощью переменного магнитного поля; тканевой инженерии (Laurent S., Forge D., Port M, 2010).

Уникальные особенности наночастиц, такие как высокая поверхностная активность, стабильность биомолекулярного поглощения, изменения физико-химических свойств под влиянием физических полей, их небольшие размеры, сопоставимые с биомолекулами, выраженность магнитных свойств и биосовместимость, с одной стороны, открывают широкие возможности для их применения, а с другой - являются возможными причинами для неблагоприятных последствий (Weissleder R., Stark D.D., Engelstad B.L., 1989, Chin A.B., Yaacob I.I., 2007).

По мнению Г.Г.Онищенко (2007), несмотря на то, что наноматериалы в мире используются уже более 10 лет, ни один вид наночастиц не был изучен в полном объеме на безопасность ни в одной из стран мира. Учитывая, что нанотехнологии относятся к новым и далеко не полностью освоенным областям науки, необходимость изучения возможных побочных эффектов является весьма актуальной. Кроме этого, в литературе практически отсутствуют данные относительно структурных и функциональных изменений, возникающих во внутренних органах лабораторных животных при различных методах введения магнитоуправляемых наночастиц.

Цель исследования: Выявить и оценить морфологические изменения во внутренних органах и опухоли у лабораторных крыс с перевиваемым раком печени РС-1 при введении наночастиц железа.

Задачи исследования:

Изучить морфологические изменения во внутренних органах и тканях лабораторных крыс при однократном внутримышечном и пероральном введении непокрытых оболочкой наночастиц.

• Провести сравнительный анализ развивающихся морфологических изменений в органах при однократном внутримышечном и пероральном введении покрытых цитратом наночастиц железа.

• Изучить морфологические изменения во внутренних органах лабораторных животных при введении наночастиц железа, покрытых цитратной оболочкой: при однократном и многократном внутрибрюшинном, многократном пероральном и однократном внутривенном введении.

• Провести сравнительный анализ эффекта накопления наночастиц в ткани опухоли и оценить их влияние на опухолевые клетки при различных методах введения.

• Выявить наиболее предпочтительный путь введения и дозировку наночастиц железа для усиления контрастности опухоли при проведении магнитно-резонансной томографии.

Научная новизна. В эксперименте изучены особенности влияния непокрытых и покрытых цитратом наночастиц железа на органы здоровых лабораторных животных и крыс с перевитой опухолью рака печени РС-1. Дана оценка характера и направленности патологических процессов, возникающих в результате воздействия данных наночастиц. Разработан комплекс морфометрических параметров для ряда органов с целью оценки развивающихся в них патологических процессов. Проведен сравнительный анализ между количеством наночастиц, накопившихся в опухоли, и патоморфозом опухолевой ткани при различных методах введения. Установлены оптимальные методы введения и эффективные дозировки наночастиц железа для усиления визуализации опухоли методом магнитно-резонансной томографии.

Теоретическое и практическое значение работы

Результаты проведенной работы дополняют современные представления о характере и динамике развития изменений во внутренних органах и опухоли при воздействии наночастиц железа и об их возможном накоплении в перевиваемых опухолях. Разработанный комплекс морфометрических параметров для ряда органов с целью оценки их состояния позволяет объективно оценить возможности токсического воздействия наночастиц на организм животных, что может применяться в лабораториях по исследованию токсичности новых лекарственных средств и веществ.

Установленные оптимальные методы введения и эффективные дозировки наночастиц железа могут применяться при проведении экспериментальных исследований для усиления визуализации опухоли методом магнитно-резонансной томографии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1 .Непокрытые наночастицы железа при внутримышечном и пероральном введении вызывают выраженные морфологические изменения как в месте введения, так и во внутренних органах, что делает их применение нецелесообразным в тераностике опухолей.

2.Покрытые цитратом наночастицы железа при пероральном и внутримышечном способах введения вызывают в органах и тканях менее выраженные морфологические изменения, зависящие от продолжительности их введения и дозировки.

3.При внутрибрюшинном методе введения наночастицы железа вызывают низкий цитотоксический эффект, однако не накапливаются в опухоли, что делает данный метод введения нецелесообразным для усиления ее контрастности при магнитно-резонансной томографии.

4.Накопление покрытых цитратом наночастиц железа в перевиваемой опухоли происходит только при внутривенном введении, что подтверждается данными атомно - адсорбционной спектроскопии. При проведении МРТ эффект контрастирования проявляется при дозировке 16 мг/кг.

Внедрение результатов работы в практику

Полученные научные данные используются в учебном процессе на кафедрах патологической анатомии, гистологии, цитологии и эмбриологии ГБОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Минздрава России, в научно-исследовательской работе НОЦ фундаментальной медицины и нанотехнологий НИИ фундаментальной и клинической уронефрологии ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава России.

Апробация работы

Результаты диссертации доложены на 71-й и 72-й научно-практических конференциях «Молодые ученые здравоохранения» (Саратов, 2010, 2011); межрегиональной научной конференции с международным участием «Новые технологии в экспериментальной и клинической хирургии» (Саратов, 2011); IV-м Международном конкурсе научных работ молодых ученых в области нанотехнологий в рамках НАНОФОРУМА (Москва, 2011); Локальном

Саратовском кластере по биофотонике в рамках международной программы "Seventh Framework Programme" (Саратов, 2011); на III-й Всероссийской научно-практической конференции по «Наноонкологии» (Саратов, 2011); XI и XII Международной школе для студентов и молодых ученых по оптике, лазерной физике и биофизике «Saratov Fall Meeting» (Саратов, 2011,2012).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 12 работ, 6 из которых в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Личный вклад соискателя в проведенное исследование Автором лично проведены эксперименты и собран аутопсийный материал; сделан комплексный анализ результатов морфологического, морфометрического и иммуногистохимического методов исследования. Осуществлен мониторинг основных морфологических параметров во внутренних органах, проведена аналитическая и статистическая обработка полученных результатов; представлены научное обоснование и выводы; подготовлены материалы к публикации. Разработаны практические рекомендации, внедренные в учебный процесс и работу научно-образовательного центра фундаментальной медицины и нанотехнологий Саратовского государственного медицинского университета.

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Работа содержит 49 рисунков и 56 таблиц. Список литературы включает в себя 123 источника, из которых 41 отечественный и 82 зарубежных.

Содержание работы Материалы и методы исследования Исследование проведено на 200 белых половозрелых лабораторных крысах-самцах массой 160-250 г. При разработке дизайна эксперимента использовали «Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (Хабриев Р.У., 2005) и «Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств» (Миронов А.Н., 2012).

Учитывая то, что биологические эффекты наночастиц зависят не только от их химического состава, но и от наличия покрытия, в исследовании использовались два типа железных наночастиц:

Ферромагнитные наночастицы (Fe304, 70 nm ± 10), непокрытые

оболочкой.

Водный раствор коллоидного магнетита, стабилизированного цитрат-ионами (Fe304, 20 nm ± 10) Zp = -30 mv. Концентрация магнитного коллоида составила 8 мг/мл.

Принимая во внимание особые перспективы применения ферромагнитных наночастиц в онкологии, изучали их влияние как на организм здоровых животных, так и животных с трансплантированными опухолями -холангиогенного альвеолярного рака печени крысы (РС-1). Штамм опухоли получен из банка опухолевых штаммов ГУ «Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина» РАМН. Данный штамм опухоли перевивали беспородным лабораторным крысам-самцам подкожно в область лопатки в объеме 0,5 мл опухолевой взвеси, которая на 25% состояла из клеток опухоли и на 75% - из раствора питательной среды Хэнкса. Животные содержались в обычных условиях до тех пор, пока опухоли не достигали размера 1±0,2 см, и затем вводились в эксперимент.

С учетом возможности различных путей введения наночастиц в организм были проведены следующие серии эксперимента:

1 серия - изучение морфологических изменений во внутренних органах лабораторных животных при однократном внутримышечном и пероральном введении непокрытых наночастиц железа.

2 серия — изучение морфологических изменений во внутренних органах и перевитой опухоли лабораторных животных при однократном внутримышечном и пероральном введении покрытых цитратом наночастиц железа.

3 серия — изучение морфологических изменений во внутренних органах и перевитой опухоли лабораторных животных при многократном пероральном введении наночастиц железа, покрытых цитратной оболочкой.

4 серия - изучение морфологических изменений во внутренних органах лабораторных животных и перевитой опухоли при однократном и многократном внутрибрюшинном введении наночастиц железа, покрытых цитратной оболочкой.

5 серия - изучение морфологических изменений во внутренних органах лабораторных животных и перевитой опухоли при однократном внутривенном введении наночастиц железа, покрытых цитратной оболочкой (табл.1).

Таблица 1

Распределение животных по группам, используемые виды

Способ введения Кратность введении Дозировки (иг/кг) Кол-во животных

Непокрытые наночастицы железа

Внутримышечно Однократно - 2 группы 7,4; 14,8 20

Перорально Однократно 4,5 10

Покрытые цитратом наночастицы железа

Внутримышечно Однократно - 2 группы 7,4; 14,8 20

Перорально Однократно 4,5 10

Перорально Многократно в течение 7 дней - 3 группы 0,25; 0,5; 1,0. 30

Внутрибрюшинно Однократно 0,5 10

Многократно в течение 7 дней 1,0 10

Внутривенно Однократно - 2 группы 0,2; 16 20

Контрольные группы

Контроль без опухоли В группах с однократным внутримышечным и пероральным введением 40

Группа сравнения с опухолью (РС-1) В группах с многократным пероральным, внутрибрюшинным и внутривенным введением 40

Работа с лабораторными животными осуществлялась согласно протоколу исследований в соответствии с Женевской Конвенцией «International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals» (Geneva, 1990г.) и Хельсинкской декларацией 2000 г. о гуманном отношении к животным, а также в соответствии с положением приказа № 755 МЗ СССР от 12.08.1977 года, и была одобрена этическим комитетом ГБОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Минздрава РФ от 06.12.2011 г., протокол №4.

Экспериментальные работы выполнены на базе Научно-образовательного центра фундаментальной медицины и нанотехнологий НИИ фундаментальной и клинической уронефрологии при ГБОУ ВПО Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского Минздрава России (Руководитель НОЦ - к.б.н. Бучарская А.Б.).

Для морфологического исследования образцы внутренних органов фиксировали в 10% - м растворе забуференного нейтрального формалина, подвергали стандартной спиртовой проводке, после чего доводили до парафиновых блоков. Срезы толщиной 3-5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Для выявления конгломератов наночастиц проводили реакцию Перлса (2%-я желтая кровяная соль, 1%-й раствор HCl).

Для изучения патоморфоза опухоли применялись гистохимические методики: окраска на лектин зародышей пшеницы (WGA-тропного к N-ацетилглюкозамину) и бобовника анагиролистного (LAL-тропного к ß-L-фукозе (ß-LFuc)), визуализация с помощью пероксидазы; иммуногистохимических маркеров пролиферации Ki-67 и белка - регулятора роста р53. Для определения данных антигенов использовали авидин-биотиновый метод с антителами ДАКО в разведении к антителу -1:100.

Результаты данной реакции оценивали полуколичественным методом, разработанным McCarthy и соавторами в 1985 году. Система подсчета включает в себя интенсивность иммуногистохимической окраски, оцениваемую по четырех-балльной шкале, и долю (процент) окрашенных клеток. Интенсивность окраски: 0-нет окрашивания; 1-слабое окрашивание; 2-умеренное окрашивание; 3-сильное.

Для выявления наночастиц в тканях проводили темнопольную микроскопию в различных режимах: фазового, дифференциально-диагностического и флуоресцентного контраста на микроскопе LeikaDM 2500 с цветной CCD камерой и специальной приставкой, позволяющей осуществлять боковое освещение при 400- кратном увеличении.

Для количественного определения содержания в опухоли железа использовали метод зеемановской поляризационной спектроскопии с высокочастотной модуляцией (ЗПСВМ), который является одним из вариантов селективного атомно-абсорбционного анализа.

Для оценки качественных изменений в органах (выраженность полнокровия, отека, дистрофии, феномена сепарации крови и эмфиземы легких) применялась полуколичественная оценка в баллах, в зависимости от выраженности признака, от 0 до 3-х баллов: 0 - отсутствие признака, 1 балл -слабо выраженный признак, 2 балла - умеренно выраженный признак, 3 балла -выраженный признак.

Все морфометрические исследования и фотографирование проводились в 10 полях зрения при увеличении 774 с помощью Микровизора медицинского проходящего света (iVizo-lOl (JIOMO).

Для обработки полученных в ходе исследований данных был использован пакет прикладных статистических программ «SPPS 17.0». Представленная статистическая обработка данных заключалась в проверке соответствия формы распределения количественных признаков нормальному с помощью применения теста Колмогорова-Смирнова. Нулевую гипотезу отвергали в случае р<0,05. Для каждого показателя в исследуемых группах вычисляли среднее арифметическое (М), среднюю ошибку среднего арифметического (т), среднеквадратичное отклонение (а). Показатель достоверности различий (Р) определялся с использованием критериев Сгьюдента (t). Различия оценивались как достоверные при вероятности 95% (Р<0,05) и выше. При непараметрическом распределении значимость различий определяли при помощи критерия Мозеса и Манна-Уитни с вычислением медианы, максимума и минимума.

Результаты исследования

Для определения возможности развития различных патологических изменений органов и тканей было проведено морфологическое исследование состояния внутренних органов при разных вариантах введения наночастиц. Учитывая, что биологические эффекты наночастиц зависят не только от их химического состава, но и от наличия покрытия, что уже было показано в ряде работ с золотыми наночастицами (Goodman С.М., McCusker C.D., 2004; Pan Y., Neuss S., Fischler M., 2007; Сулейманова Л.В., Маслякова Г.Н., 2009), в исследовании использовались два типа железных наночастиц:

• Ферромагнитные наночастицы (Fe304,70 nm ± 10), непокрытые оболочкой.

• Водный раствор коллоидного магнетита, стабилизированного цитрат-ионами (Fe304, 20 nm ± 10) Zp = -30 mv. Концентрация магнитного коллоида составила 8 мг/мл.

На первом этапе работы было принципиальным моментом определиться с выбором частиц: непокрытых или покрытых. Априори было известно, что более целесообразно проводить эксперименты с покрытыми частицами, так как они являются наиболее биодоступными и вызывают менее выраженные морфологические изменения в органах и тканях. Однако при отсутствии

доказательной базы об отрицательном влиянии непокрытых наночастиц на организм лабораторных животных было решено провести эксперимент по внутримышечному и пероральному введению непокрытых наночастиц железа на животных без перевитых опухолей.

Для проведения эксперимента с введением непокрытых наночастиц железа было выделено 3 группы по 10 крыс: животным 1-й и 2-й групп однократно вводили внутримышечно непокрытые наночастицы Fe в дозировках 7,4 мг/кг и 14,8 мг/кг; животным 3-й контрольной группы вводили однократно внутримышечно 1 мл физиологического раствора. Через 24 часа после введения наночастиц животных всех групп выводили из эксперимента и забирали органы и ткани для дальнейшего гистологического изучения.

Исследования показали, что при работе с непокрытыми наночастицами уже на этапе их введения возникали трудности, так как они быстро осаждались в растворе, образовывали конгломераты, с трудом проходили через иглу. То есть они не соответствовали основному требованию, предъявляемому к наночастицам, применяемым для биомедицинских исследований:

образовывать устойчивую коллоидную систему в водных растворах (Веггу С., Curtis А., 2003.; Ito A., Shincai М., Honda Н., et al., 2005).

На аутопсии через сутки в месте инъекции непокрытых наночастиц железа обнаруживали их скопления между мышечными волокнами и в жировой клетчатке. Создавалось впечатление, что они не всасывались и продолжали лежать в виде конгломератов.

При гистологическом исследовании в месте введения развивались воспалительная реакция, отек, кровоизлияния и некроз мышц. При пероральном введении развивался катаральный гастроэнтерит со скоплением наночастиц в слизистой. Изменения во внутренних органах имели дозозависимый характер и проявлялись признаками нарушения кровообращения и дистрофией клеток. При увеличении дозы от 7,4 мг/кг до 14,8 мг/кг выраженность указанных изменений возрастала.

В печени при внутримышечном введении непокрытых наночастиц железа отмечалось увеличение количества клеток Купфера и некротизированных гепатоцитов. В почках - дистрофические изменения в эпителии извитых канальцев и увеличение площади клубочков. В селезенке -значимое увеличение размеров фолликулов и мантийной зоны. В легких -

увеличение толщины межальвеолярных перегородок за счет развития отека и полнокровия.

При внутримышечном введении покрытые наночастицы также вызывали дистрофические и некротические изменения в гепатоцитах, но в меньшей степени, чем непокрытые частицы. В селезенке покрытые цитратом наночастицы вызывали в дозировке 7,4 мг/кг увеличение и размеров фолликулов, и толщины мантийной зоны, а при дозировке 14,8 мг/кг - только увеличение толщины мантийной зоны. В почках развивались дистрофические изменения только со стороны эпителия извитых канальцев (табл. 2).

При пероральном введении во внутренних органах развивались сходные гистологические изменения при введении как непокрытых, так и покрытых частиц (табл. 3).

Таблица 2

Морфометрические изменения в органах при однократном _внутримышечном введении НЧ железа_

Орг аны Показатель Контр, группа Непокрытые НЧ Покрытые НЧ

7,4 мг/кг 14,8 мг/кг 7,4 мг/кг 143 мг/кг

Печень Клепки Кудфера и Ито 8,37±2,7 12,6±1,2 ффф 21,5±1,4 *фф 14,8±],2 ффф 17,7±0,05 ффф

Лимфоциты 3,1±1.4 5,5±0,3 ффф 5±0,5 ффф 1,8±0,3 ффф 1,6±0,2 ффф

Некротизированные гепатоцшы 0,87±0,7 9,1 ±0,4 ффф 21,5±1,4 ффф 6,3±0,9 ффф 4,3±0,6 ффф

Легкие $ инфильтратов (мм2) 0,017±0,00 1 0,052±0,0 001" 0,061±0,00 1 фф 0,063±0,00 05 фф 0,1 ±0,02 ффф

Толщина межальвеолярных перегородок (мм) 0,0057± 0,0021 0.01±0,00 02 * 0,015±0,00 07 ффф 0,009±0,00 05 ффф 0,01 ±0,000 7 ффф

Почки $ клубочков (мм2) 0,0032±0,0 001 0,005±0,0 001 фф 0,0034±0,0 001 0,0026±0,0 0008 ф 0,0032±0,0 0021

Высота эпителиоцита (мм) 0,0094±0,0 001 0,0104±0, 0002 * 0,013±0,00 03 фф 0,01±0,000 4 ф 0,015±0,00 07 фф

Селезенка 5 фолликулов (мм2) 0,107±0,016 0,19±0,026 • 0,26±0,0Э6 ффф 0,174±0,017 ф 0,0965±0,01 9

Толщина маргинальной зоны (мм) 0,0077±0,00 1 0,019*0,00 и фф» 0,013±0,000 5 ффф 0,0193±0,00 009 фф* 0,0218±0,00 15 *

Примечание: — различия достоверно отличаются при сравнении значений опытной

и контрольной групп при *-Р<0,05, **Р<0,005, ***-Р<0,001

Таблица 3

Морфометрические изменения в органах при однократном _пероральном введении НЧ железа _

Орган Показатель Контрольная группа Непокрытые НЧ железа Покрытые цитратом НЧ железа

Клетки Купфера и Ито 8,37±2,7 17,6±0,79 * 18,8*0,68

X а* я- Лимфоциты Э,1±1,4 2,6±0,Э5 1,4±0ДЗ

С Некротизированные гепатоциты 0,87±0,7 6,8±0,76 ** 7,4±0,89 **

4> 5 инфильтратов (мм^) 0,017±0,001 0,27±0,08 0,096*0,048 *

■х и и ч Толщина межальвеолярных перегородок (мм) 0,0057±0,0021 0,008±0,004 ** 0,0098±0,0012 **

в а в клубочков (мм'') 0,0032±0,0001 0,0046±0,00021 ** 0,0031±0,0001

о С Высота эпителиоцита (мм) 0,0094±0,0001 0,013±0,00048 0,019±0,001 **

а а X $ фолликулов (мм11) 0,Ю7±0,016 0,365±0,071 »* 0,074±0,011

и 5 и Толщина маргинальной зоны (мм) 0,0077±0,<Ю1 0,0815±0,0038 Ф* 0,0192±0,001 •т

Примечание: — различия достоверно отличаются при сравнении значений опытной и контрольной групп при * - Р<0,05, ** - Р<0,001

В веществе головного мозга, сердце, семенниках животных при однократном пероральном и внутримышечном методах введения при используемых дозировках как непокрытых, так и покрытых наночастиц железа выраженных морфологических изменений не выявлялось.

Сравнительный анализ воздействия на организм экспериментальных животных непокрытых и покрытых наночастиц показал, что покрытые частицы не агрегировали и вызывали меньшие изменения в зоне введения.

Обращало на себя внимание и следующее обстоятельство: непокрытые наночастицы, попадая в кровоток в меньшем количестве, вызывали более выраженные морфологические изменения во внутренних органах животных, чем покрытые.

Таким образом, на основании собственных исследований и данных литературы о том, что покрытие наночастиц снижает их поглощение макрофагами и способствует эффективному проникновению через мембраны, а

также решает проблему растворимости и их коллоидной устойчивости (Zhang Y., Kohler N., Zhang M., 2002), было решено дальнейшие исследования проводить с покрытыми цитратом наночастицами.

Для изучения морфологических изменений во внутренних органах лабораторных животных при многократном пероралъном введении наночастиц железа, покрытых оболочкой, животные были разделены на 3 опытные группы по 10 крыс в каждой, получавших в течение 7 дней раствор покрытых цитратом наночастиц железа в дозировках 250 мкг/кг, 500 мкг/кг, 1000 мкг/кг. Группа сравнения (10 крыс) получала в течение 7 дней перорально 1 мл физиологического раствора. На 8 сутки все животные выводились из эксперимента путем декапитации.

Все крысы на момент начала эксперимента имели привитую в межлопаточной области опухоль в размере 1±0,2 см. Данный контроль был необходим для объективной оценки изменений во внутренних органах, вызванных наночастицами, так как сама опухоль могла вызывать морфологические изменения в органах за счет токсического воздействия (табл. 4).

Таблица 4

Морфометрические изменения в органах при многократном _пероральном введении НЧ железа__

Орг ан Показатель Контр, группа Группа сравнения 250 мкг/кг 500 мкг/кг 1000 мкг/кг

1 Печень Клетки Купфера и Ито 8,37±2,7 14Д±0,89 7,6±1Д ** 11,27±0,98 • • 3,4±0,54 »

Лимфоциты 3,1±1,4 3,7±0,61 1,61±0,31 3,8±0,22 2,25±0,31 *

Некротизированные гепатоциты 0,87±0,7 6,8±0,73 19,8±1,7 ** 21,96±0,86 * 25,95±0,85 *

Легкие 8 инфильтратов (мм2) 0,017± 0,001 0,016± 0,0042 0,025± 0,0045 0,019± 0,003 0,102± 0,036**

Толщина межальвеолярных перегородок (мм) 0,0057± 0,0021 0,0055± 0,0002 0,0083± 0,00047 0,014± 0,0007 ** 0,016± 0,00098 **

Почки 8 клубочков (мм2) 0,0032± 0,0001 0,0032± 0,0001 0,0031± 0,0001 0,0025± 0,00015* 0,0021± 0,00006*

Высота эгштелиоцита (мм) 0,0094± 0,0001 0,0095± 0,0001 0,0099± 0,0002 0,018± 0,0003* 0,015± 0,00034*

Селезенка 8 фолликулов (мм2) 0,107±0,01 6 0,108± 0,016 0,17±0,022 • 0,28±0,02 •* 0,30±0,021

Толщина маргинальной зоны (мм) 0,0077± 0,001 0,0077± 0,001 0,017± 0,001* 0,079± 0,0121** 0,084± 0,01**

Примечание: — различия достоверно отличаются при сравнении значений опытной и контрольной групп при * - Р<0,05, **- Р<0,001

Во всех отделах желудочно-кишечного тракта при многократном пероральном введении наночастиц железа в дозировках 500 и 1000 мкг/кг развивалось катаральное воспаление с отложением наночастиц железа в слизистой оболочке в виде черных гранул.

Изменения в печени имели дозозависимый характер, что проявлялось увеличением числа поврежденных гепатоцитов, а также нарастанием кровенаполнения сосудов и синусоидов печени.

В почках изменения также носили дозозависимый характер. С увеличением дозировки нарастала степень полнокровия сосудов коркового, мозгового вещества почек и клубочков, дистрофия эпителиоцитов извитых и прямых канальцев. Введение наночастиц в дозировке 250мкг/кг не влияло на размеры клубочков и высоту эпителиоцитов извитых канальцев, в то время как дозировка в 500 мкг/кг приводила к увеличению высоты эпителиоцитов извитых канальцев.

В легких при многократном пероральном введении наночастиц железа в дозировках от 250 до 1000 мкг/кг отмечали нарастание выраженности полнокровия сосудов и увеличение толщины межальвеолярных перегородок, а при дозировке 1000 мкг/кг наблюдали появление феномена сепарации крови в сосудах и увеличение перибронхиальных лимфоидных инфильтратов.

В селезенке при многократном пероральном введении наночастиц железа в дозировках от 250 до 1000 мкг/кг отмечали увеличение размеров фолликулов и толщины их мантийной зоны, появление скоплений наночастиц в виде гранул коричневого цвета, что подтверждалось положительной реакцией Перлса.

В сердце при многократном пероральном введении наночастиц железа в дозировке 1000 мкг/кг наблюдали умеренно выраженную зернистую дистрофию кардиомиоцитов и полнокровие сосудов.

В веществе головного мозга независимо от дозировки развивался умеренный периваскулярный и перицеллюлярный отек.

В перевиваемой опухоли рака печени РС-1 при многократном пероральном введении покрытых цитратом наночастиц значимых изменений нами не было выявлено. Как и в контроле, опухоль имела ячеистое строение. Ячейки различной величины были разделены тонкими прослойками соединительной ткани. Как в контрольной, так и экспериментальной группах в строме опухоли отмечали полнокровные сосуды, в просвете которых располагались не только эритроциты, но и лейкоциты. Опухолевые клетки

овально-округлой формы имели эксцентрично расположенные ядра. Значительная часть цитоплазмы была занята крупными вакуолями, содержащими клеточную слизь, которая давала положительную окраску при проведении PAS-реакции.

В опухолевой ткани крыс как контрольной, так и экспериментальной групп развивались очаги некроза, занимавшие от 20 до 50% площади опухоли.

При окраске на лектины зародышей пшеницы (WGA) как в экспериментальной, так и группе сравнения отмечалась умеренно выраженная экспрессия, что свидетельствовало о частичной сохранности гликопротеидных комплексов в мембранах опухолевых клеток. При окраске на лектины бобовника анагиролистного (LAL) экспрессия не определялась ни в контрольной, ни в экспериментальной группах. При окраске на маркер пролиферации Ki-67 и регулятор роста клеток Р 53 количество позитивных клеток как в опытной, так и в группе сравнения достоверно не отличалось.

Проведение МРТ и КТ исследований показало, что многократное пероральное введение наночастиц железа в дозировках 250 мкг/кг, 500 мкг/кг, 1000 мкг/кг является неэффективным для усиления визуализации.

При многократном пероральном введении покрытых цитратом наночастиц у животных максимальные изменения во внутренних органах развивались при дозировке 1000 мкг/кг. Признаки нарушения кровообращения и дистрофические изменения клеток имели обратимый характер, однако увеличение размеров фолликулов в селезенке и увеличение площади лимфоидных инфильтратов в легких свидетельствовало об активирующем влиянии наночастиц на иммунную систему.

Таким образом, ни один из изученных путей введения наночастиц (ни внутримышечный, ни пероральный) не приводил к желаемому результату: не происходило накопления наночастиц в опухоли для возможного контрастирования на этапе диагностики и последующего воздействия с их помощью на этапе лечения. Достичь желаемого эффекта с помощью увеличения дозировки не представлялось возможным в связи с развитием дистрофических, некробиотических и иммунных нарушений, развивающихся в организме лабораторных животных.

Следующим этапом эксперимента явилось изучение морфологических изменений во внутренних органах и тканях лабораторных животных при внутрибрюшинном введении. Были выделены 2 опытные группы животных

по 10 крыс в каждой: животным первой группы вводили по одной внутрибрюшинной инъекции покрытых цитратом наночастиц железа в дозировке 700 мг/кг; вторая группа животных получала внутрибрюшинно такие же частицы в течение 7 дней в дозировке 250 мг/кг. Также были введены две группы сравнения, каждая по 5 крыс, которым по той же схеме вместо наночастиц делали инъекции 1 мл физиологического раствора. Все крысы на начало эксперимента имели привитую опухоль в диаметре 1±0,2 см.

Всех животных выводили из эксперимента путем декапитации, в первой экспериментальной и группе сравнения через 24 часа, во второй экспериментальной и группе сравнения через 7 суток.

Было установлено, что при внутрибрюшинном введении стабилизированных цитратом наночастиц железа они в большем количестве захватываются лимфатическими узлами брюшной полости. При длительном введении скопления были настолько значимы, что лимфатические узлы были контрастными на МРТ и хорошо диагностировались во время аутопсии и при последующем гистологическом исследовании. Единичные скопления частиц обнаруживали в сосудах миокарда и клетках Купфера печени, в то время как в опухоли накопление НЧ не подтвердилось ни морфологическими методами, ни данными МРТ.

Следует отметить низкий цитотоксический эффект наночастиц железа при данном методе введения, так как повреждения клеток имели обратимый характер и были представлены в основном зернистой дистрофией. Сосудистые нарушения были выражены в большей степени и проявлялись в виде полнокровия сосудов, сепарации крови, отека, развития диапедезных и очаговых кровоизлияний. Данные нарушения сосудистого звена и крови могли быть причиной гипоксических изменений в головном мозге, проявлявшихся ишемическими изменениями клеток Пуркинье (табл. 5).

Морфологических изменений в перевитой опухоли по сравнению с контрольной группой не наблюдали. Опухоль сохраняла ячеистое строение. Количество слизи в клетках не изменялось. Накопления наночастиц не были подтверждены ни морфологически, ни методом МРТ. При проведении иммуногистохимического исследования с маркером пролиферации Ki-67 было установлено, что количество пролиферирующих клеток в группе животных с введенными наночастицами было несколько ниже, чем в группе сравнения.

Таблица 5

Морфометрические изменения в органах при внутрибрюшинном _введении покрытых цитратом НЧ железа_

О рг ан Показатель Контроль ная группа Группа сравнения Однократное введение Многократное введение

Печень Клетки Купфера и Ито 8,37±2,7 6,17±0,43 7±0,43 8,6±0,95

Лимфоциты 3,1±1.4 1,52±0,18 4,09±0,53 ** 1,5±0,39

Некротизированные гепаггоциты 0,87±0,7 10,17±0,68 15,63±0,908 +# 6,1±1,01 **

Легкие Б инфильтратов (мм2) 0,017±0,00 1 0,084± 0,0005 0,188± 0,033 *** 0,048±0,0034 **

Толщина межальвеолярных перегородок (мм) 0,0057± 0,0021 0,012± 0,0009 0,011± 0,0011 0,0096± 0,0006 *

Почки в клубочков (мм^) 0,00Э2± 0,0001 0,0039± 0,00018 0,0033± 0,0002** 0,0034± 0,0001

Высота эпителиоцита (мм) 0,0094± 0,0001 0,012± 0,0003 0,014± 0,0002 *** 0,011± 0,0002

Селезенка Б фолликулов (мм2) 0,107±0,016 0,14±0,01 0,15±0,009 0,12±0,014

в светлого центра (мм2) 0,011± 0,001 0,013± 0,002 0,024± 0,0006 0,044±0,002 «**

Толщина маргинальной зоны (мм) 0,0077± 0,001 0,015± 0,0011 0,014± 0,0009 0,009±0,0006 ***

Примечание: — различия достоверно отличаются при сравнении значений опытной и контрольной групп при *-Р<0,05, **Р<0,005, ***- Р<0,001

Маркер Р53 тоже не показал достоверных различий, хотя количество экспрессирующих клеток уменьшалось, что, возможно, объясняется тем, что в опухолевой ткани группы животных с введенными наночастицами существенно увеличивалась площадь некроза (с 30% в группе сравнения до 60% в опытной группе).

Данный эксперимент позволил сделать вывод, что, несмотря на то, что морфологические изменения, развивающиеся во внутренних органах при данном методе введения, оказываются минимальными, использовать внутрибрюшинный метод введения наночастиц железа для усиления контрастности опухоли при магнитно-резонансной томографии

нецелесообразно, так как наночастицы почти полностью захватываются мезентериальными лимфатическими узлами.

Следующим этапом работы явилось изучение морфологических изменений во внутренних органах и опухоли лабораторных крыс-самцов с перевитым раком печени РС-1 при однократном внутривенном введении покрытых цитратом наночастиц железа в дозировках 20 мкг/кг и 16 мг/кг. Через сутки животных выводили из эксперимента и проводили забор внутренних органов для морфологического исследования (табл. 6).

Таблица 6

Морфометрические изменения в органах при внутривенном введении

покрытых наночастиц железа

Орг ан Показатель Контр, группа Группа сравнения Дозировка НЧ Fe 20 мкг/кг Дозировка НЧ Fe 16 мг/кг

Печень Клетки Купфера и Ито 8,37±2,7 8,9±0,523 6,82±0,47 13Д7±0,89 • •

Лимфоциты Э,1±1,4 5,5±0,54 2,85±0,31 ** 1,09±0,33 **

Некротизированные гепагоциты 0,87±0,7 Э,5±0,454 26,8±0,818 14,36±1,7 **

Легкие 8 инфильтратов (мм2) 0,017± 0,001 0,068± 0,00529 0,58±0,161 ** 0,21±0,02 **

Толщина межальвеолярных перегородок (мм) 0,0057± 0,0021 0,0092± 0,00062 0,0053± 0,000226 0.011± 0,0006 •

Почки Б клубочков (мм ) 0,0032± 0,0001 0,0096t 0,00038 0,006Э± 0,00016 *** 0,0073± 0,0005 ***

Высота эпителиоцитов (мм) 0,0094± 0,0001 0,0099± 0,00025 0,0179± 0,00031 *** 0,017± 0,00049 ***

Селезенка Б фолликулов (мм*) 0,107±0,016 0,167±0,018 0,136±0,019 0,22±0,027

Толщина маргинальной зоны (мм) 8,37±2,7 0,0139± 0,0018 0,0189±0,0012 * 0,03±0,039 ***

Примечание: — различия достоверно отличаются при сравнении значений опытной и контрольной групп при *-Р<0,05, **Р<0,005, ***-Р<0,001

Необходимо отметить, что ряд авторов отмечают схожие изменения в печени при внутривенном введении наночастиц Fe304: расширение желчных и синусоидных капилляров печени, полнокровие центральной вены и краевое стояние лейкоцитов (Мильто И.В., Михайлов Г.А., Ратькин A.B., Магаева A.A., 2008; Васюков Г.Ю., 2011).

В почках, по нашему мнению, дистрофические изменения в эпителии извитых канальцев возникали за счет как непосредственного влияния

наночастиц, так и сосудистой реакции в почках на их введение. Повреждение проявлялось их набуханием и дистрофией, что морфометрически проявлялось увеличением высоты эпителиоцитов. Кроме этого, нами были отмечены клубочки в состоянии полного коллапса, и морфометрически это было подтверждено статистически значимым уменьшением их размеров.

Другие авторы, изучавшие морфологию почек крыс при внутривенном введении наночастиц Fe304, отмечали также полнокровие сосудов мозгового вещества (Мильто И.В., Михайлов Г.А., Ратькин A.B., Магаева A.A., 2008), а также расширение капсулы Шумлянского-Боумена, чего мы не наблюдали в нашем эксперименте, что, возможно, обусловлено другим размером и покрытием наночастиц.

В легких на фоне внутривенного введения НЧ происходило статистически значимое истончение межальвеолярных перегородок, развивалась эмфизема, а также увеличивалось кровенаполнение сосудов. Скоплений наночастиц выявлено не было, но отмечалось значительное увеличение площади перибронхиальных лимфоидных инфильтратов, что свидетельствовало об иммунной реакции организма на введение чужеродных частиц.

В селезенке при внутривенном введении отмечали преобладание красной полнокровной пульпы над белой, в фолликулах появлялись светлые центры, что говорит об активации размножения B-лимфоцитов, а также наблюдали статистически значимое увеличение мантийной зоны, что свидетельствовало об увеличении кооперации Т и В лимфоцитов и накоплении В-лимфоцитов памяти, то есть наночастицы железа, стабилизированные цитратом, вызывают стимуляцию иммунных процессов.

В перевиваемой опухоли рака печени РС-1 при однократном внутривенном введении наночастиц в дозировке 20 мкг/кг значимых изменений нами не было выявлено. При дозировке 16 мг/кг наблюдали сходное строение опухоли, но обращало на себя внимание увеличение площади некрозов в опухоли - до 90% - и выраженное полнокровие сосудов.

При иммуногистохимическом исследовании мы не обнаружили значимых изменений со стороны экспрессии Ki-67 и увеличения степени выраженности экспрессии Р53.

Только при дозировке 16 мг/кг появился эффект контрастирования при МРТ как опухоли, так и печени. Они выглядели гиперинтенсивными на Т2

изображениях, что свидетельствовало о значительном накоплении в них наночастиц железа, что в дальнейшем было подтверждено методом атомно-адсорбционной спектроскопии.

Выводы

1. Непокрытые наночастицы железа при внутримышечном и пероральном путях введения образуют крупные конгломераты, ограничивающие их всасывание; вызывают выраженные морфологические изменения как в месте введения, так и во внутренних органах; не накапливаются в опухоли, что делает нецелесообразным их применение для тераностики новообразований.

2. Покрытые цитратом наночастицы железа при однократном как внутримышечном, так и пероральном путях введения вызывают в органах нарушения кровенаполнения и повреждение клеток, которые нарастают по мере увеличения дозировки. Максимальные изменения наблюдаются при многократном пероральном введении наночастиц в дозировке 1000 мкг/кг, причем в этих случаях появляются признаки нарушения иммуногенеза.

3. При однократном и многократном внутрибрюшинном введении покрытых цитратом наночастиц железа изменения во внутренних органах экспериментальных животных имеют дозозависимый характер и более выражены при однократном введении наночастиц в дозировке 700 мг/кг. По сравнению с другими методами введения дистрофические изменения клеток и пролиферативные процессы со стороны иммуннокомпетентных клеток выражены минимально, однако накопление наночастиц наблюдается только в мезентериальных лимфоузлах, что подтверждается гистологически и данными МРТ.

4. Накопление наночастиц железа в опухолевой ткани происходит только при внутривенном введении, причем влияние их на опухолевые клетки не установлено. Для контрастирования опухоли при МРТ-диагностике необходимо применение внутривенного введения наночастиц в дозировке не менее чем 16мг/кг массы экспериментального животного.

Практические рекомендации

1. Для диагностики и терапии перевитых опухолей рекомендуется использовать наночастицы железа, покрытые оболочкой, для увеличения биосовместимости и безопасности их применения.

2. Разработанные количественные показатели, отражающие степень выраженности патологических процессов, развивающихся в органах здоровых лабораторных животных и животных с перевитой опухолью, могут явиться основой для проведения сравнительного анализа морфологических изменений под влиянием различных факторов, в том числе и наночастиц.

3. Для эффективного накопления в опухоли наночастиц железа с целью усиления контрастирования опухолей при МРТ-диагностике и возможности дальнейшего на нее воздействия (например, гипертермии) рекомендуется внутривенное введение покрытых частиц в дозировке не менее чем 16мг/кг массы экспериментального животного.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Исследование мутагенной активности и морфофункционапьных изменений при пероральном введении наночастиц золота [Текст] / Н.А. Наволокин, С.М. Кун, С.С. Фирсова, Д.С. Джумагазиева // Молодые ученые - здравоохранению: Материалы 71-й научно-практической конференции. - Саратов, 2010. - С. 273274.

2. Comprehensive analysis of morphofunctional changes in the inner organs of laboratory animais after administration of gold nanoparticles [Текст] / N.A. Navolokin, X.M. Kong, L.V. Suleymanova, S.S. Firsova // Вестник российского государственного медицинского университета. - 2011. - Вып. 1. -С. 224.

3. Патоморфологические изменения в органах лабораторных животных при внутримышечном введении наночастиц железа [Текст] / Н.А. Наволокин, С.М. Кун, О.В. Матвеева и др. // Молодые ученые — здравоохранению: Материалы 72-й научно-практической конференции. — Саратов, 2011. - С. 287.

4. Морфологические изменения во внутренних органах у лабораторных мышей при однократном внутримышечном введении магнитоуправляемых наночастиц, используемых для визуализации и диагностики злокачественных новообразований [Текст] / Н.А. Наволокин, С.М. Кун, О.В. Матвеева и др. // Новые технологии в экспериментальной и клинической хирургии: Материалы межрегиональной научной конференции с международным участием. -Саратов, 2011. - С. 98-99.

5. Морфологические изменения во внутренних органах лабораторных животных при однократном введении наночастиц Fe [Текст] / Н.А. Наволокин, О.В. Матвеева, С.М. Кун и др. // Известия Саратовского государственного университета. Серия Физика. - Саратов.- 2011. - Том.11, №.2. - С. 62-66.

6. Морфологические изменения во внутренних органах лабораторных животных при однократном пероральном введении магнитоуправляемых наночастиц [Текст] / Н.А. Наволокин, Г.Н. Маслякова, С.М. Кун и др. // Вестник биотерапевтического журнала. — 2011. - № 4. - С. 105 http://www.ntsr.info/nor/structure/sections/medical-biologic/6706.htm.

7. Морфологические изменения в почках и семенниках при различных методах введения наночастиц железа [Текст] / А.Б. Бучарская, О.В. Матвеева, Н.А. Наволокин, С.М. Кун // Актуальные вопросы фундаментальной и клинической уронефрологии: Сборник научных трудов- Саратов, 2011. - С. 13-19.

8. Наволокин H.А., Кун С.М. Морфологические изменения внутренних органов и головного мозга при пролонгированном пероральном введении наночастиц железа [Текст] //Саратовский научно-медицинский журнал. - Саратов. - 2011. -Том. 8, №3,-С. 760-762.

9. Morphological changes in the kidney, liver and spleen during prolonged administration of iron nanoparticles [Текст] / N.A. Navolokin, G.N. Maslyakova, A.B. Bucharskya, X.M. Kong // Journal of Physics: Conférence Sériés. - 2012. -V.345., № 012043, doi:10.1088/1742-6596/345/l/012043.

10. Динамика морфологических и биохимических изменений у лабораторных животных с перевитым раком почки при внутривенном введении золотых нанооболочек [Текст] / Н.А. Наволокин, Г.Н. Маслякова, С.М. Кун и др. // Известия Саратовского государственного университета. Серия Физика. Саратов. - 2012. - Том.12, №.2. - С. 37-43.

11. Распределение и морфологические изменения во внутренних органах лабораторных крыс с перевитым раком печени цитрат-стабилизированных наночастиц магнетита при их внутрибрюшинном введении [Текст] / А.Б. Бучарская, Н.А. Наволокин, Г.Н. Маслякова, С.М. Кун // Актуальные вопросы фундаментальной и клинической уронефрологии: Сборник научных трудов. - Выпуск III. - Саратов, 2012. - С. 19-25.

12. Кун С.М. Морфологические изменения в тканях и органах лабораторных крыс с перевиваемым раком печени РС-1 при внутрибрюшинном введении цитрат-стабилизированных наночастиц железа [Текст] /Фундаментальные исследования. - 2013. - № 9(3). - С.380-384.

Подписано в печать 08.11.2013. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Roman. Печать RISO. Объем 1,0 печ. л. Тираж 100 экз.

Заказ № 257.

Отпечатано с готового оригинал-макета Центр полиграфических и копировальных услуг Предприниматель Серман Ю.Б. Свидетельство № 3117 410600, Саратов, ул. Московская, д.152, офис 19, тел. 26-18-19, 51-16-28

201

406346

2014063460