Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему:Морфологические изменения в органах и тканях экспериментальных животных при воздействии наночастиц золота

На правах рукописи

2 7 АВГ 2009

Сулейманова Лейла Вахидовна

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ В ОРГАНАХ И ТКАНЯХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ НАНОЧАСТИЦ

ЗОЛОТА

14.00.15 - патологическая анатомия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

САРАТОВ - 2009

003475777

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный медицинский университет имени В.И.Разумовского Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Маслякова Галина Никифоровна. Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Федорина Татьяна Александровна;

доктор медицинских наук Мозеров Сергей Алексеевич.

Ведущая организация:

Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохина РАМН.

Защита состоится <oö» 2009 г. в/^часов на заседании диссертационного

совета Д 208.094.01 при ГОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И.Разумовского Росздрава по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Большая Казачья, 112.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И.Разумовского Росздрава.

Автореферат разослан « I С »

2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Маслякова Г.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Предполагается, что применение ианоматериалов приведет к революционным

достижениям в медицине благодаря способности наночастиц взаимодействовать с биологическими тканями на молекулярном и клеточном уровнях. Современные исследования по применению нанотехнологий в медицине, особенно в онкологии, широко распространены, в то время как побочные эффекты, связанные с .их использованием, практически не изучены. Хорошо известно, что уникальные физические и химические свойства наночастиц, которые делают их такими привлекательными, могут ассоциироваться с их потенциально вредными воздействиями на клетки и ткани живых организмов.

В настоящее время не ясна роль неблагоприятных эффектов ианоматериалов в патогенезе болезней, вызываемых загрязнением окружающей среды или профессиональными болезнями. Быстрое развитие отрасли нанотехнологии приводит к тому, что наночастицы становятся широко распространенными в окружающей среде и попадают в организм при дыхании, с пищей, через кожу и при внутривенном введении (Oberdórster et al., 2005). Несмотря на широкое распространение ианоматериалов механизмы их токсичности и потенциального риска для здоровья, связанного с контактом с ними, остаются неясными. Последние исследования in vitro и in vivo подтвердили, что ингаляция и чрескожная абсорбция некоторых наночастиц может иметь негативные эффекты на здоровье (Seaton A., Donaldson К., 2005; Shvedova А.А., Kisin E.R., 2005) и использование медицинских продуктов, содержащих наноматериалы, может привести к риску для здоровья (Peters К., Unger R.E., 2004). Существует концепция, что наноразмерные частицы заслуживают более строгой оценки их эффектов на здоровье человека и связанных с этим требований контроля, так как площадь их поверхности и токсичность значительно выше, чем у более крупных частиц. Несмотря на это, результаты, свидетельствующие о токсичности ианоматериалов, используемых в медицине, часто игнорируются (Moghimi S.M. et al., 2005).

В литературе отсутствуют работы по определению токсичности наночастиц, с применением морфологических методов исследования, хотя, несомненно, именно это проблема остается одной из наиболее актуальных и наименее изученных проблем в медицине.

Таким образом, широкое распространение наноматериалов и нанотехнологий в медицине при отсутствии конкретных знаний 'по накоплению и воздействию наночастиц на организм человека и животных послужили поводом для проведения данного исследования.

Цель исследования: в экспериментах in vivo установить закономерности распределения наночастиц золота в организме экспериментальных животных и морфологические изменения, развившиеся под влиянием данных наночастиц в их мягких тканях и внутренних органах. Задачи исследования:

1. Изучить характер местных изменений в мягких тканях экспериментальных животных при подкожном и внутримышечном введении золотых наночастиц разных размеров.

2. Изучить морфологические изменения во внутренних органах, головном мозге и имплантированной опухоли рака почки при внутривенном введении золотых наночастиц разных размеров.

3. Изучить морфологические изменения внутренних органов, головного мозга и привитого рака почки при пероральном введении золотых наночастиц диаметром 15, 50 и 160 нм.

4. Определить динамику распределения и накопления наночастиц разных размеров в органах и тканях экспериментальных животных с помощью метода атомно-абсорбционной спектроскопии.

5. Сопоставить данные морфо-функционалыюго исследования с показателями распределения и количеством золотых наночастиц в тканях и органах. .

Научная новизна

Впервые на экспериментальной модели у крыс in vivo исследованы особенности взаимодействии наночастиц золота с организмом экспериментальных животных и дана оценка характера и направленности патологических процессов, возникающих в результате воздействия наночастиц золота.

Описаны морфологические изменения мягких тканей, возникающие в месте введения золотых наночастиц. Проведен сравнительный анализ морфологических изменений во внутренних органах при разных методах введения наночастиц разного размера, и проведена оценка их взаимосвязи с функциональными изменениями и содержанием наночастиц.

Теоретическое и практическое значение работы

Результаты проведенной работы дополняют современные представления о характере и динамике развития изменений во внутренних органах при воздействии наночастиц золота. Разработанный алгоритм может применяться при проведении эксперимента на животных с целью определения морфологических изменений в органах и тканях под влиянием золотых наночастиц. Положения, выносимые на защиту

1. При введении золотых наночастиц они накапливаются в органах и тканях экспериментальных животных и вызывают развитие морфологических изменений.

2. Характер и выраженность морфологических изменений обусловлены методом и продолжительностью введения золотых наночастиц, а также их размерами.

3. Морфо-функционалыюе состояние органов в большей степени обусловлено размером наночастиц и в меньшей степени - их количественным содержанием.

Апробация работы

Результаты диссертации доложены на международной конференции Saratov Fall Meeting, 2007: Optical Technologies in Biophysics and Medicine IX (Саратов, 2007); Seventh International Conference on Photonics and Imaging in Biology and Medicine (China, Wu-Hun, 2008); VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2008); V съезде Российского фотобиологического общества (Пущино, 2008); Всероссийской конференции «Нанотехнологии в онкологии - 2008» (Москва, 2008); Саратовском областном обществе патологоанатомов (Саратов, 2008,2009); региональной конференции «Нанотехнологии в медицине» (Саратов, 2009). Внедрение результатов исследования

Результаты исследования внедрены в учебный процесс кафедр патологической анатомии и гистологии ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В.И.Разумовского Росздрава», патологической анатомии ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И.Вавилова»; научно-исследовательскую работу ЦНИЛ ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В.И.Разумовского Росздрава», департамента по медико-биологическим исследованиям образовательного научного института наноструктур и биосистем при

ГОУ ВПО «Саратовский ГУ им Н.Г.Чернышевского МО РФ», Ветеринарной клиники №1 г. Саратова.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 13 работ, одна из которых в журнале, включенном в перечень периодических научных и научно-практических изданий, рекомендованных ВАК для публикации основных результатов диссертационного исследования на соискание ученой степени кандидата медицинских работ, получен 1 патент.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 151 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и указателя литературы, содержащего 234 источника, из которых 13 отечественных и 221 зарубежных. Работа иллюстрирована 52 рисунками и 15 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Исследование проведено на 145 белых половозрелых лабораторных крысах-самцах массой 270-320 г.

Учитывая, |что биологические эффекты наночастиц зависят не только от их химического состава, но и от размера, в нашем исследовании использовались три типа золотых наночастиц:

1.Коллоидное золото диаметром 15 нм, с концентрацией частиц 1.2*1012 шт/мл (или 57 мкг/мл в пересчете на концентрацию золота).

2.Коллоидное золото диаметром 50 нм, с концентрацией частиц 4*Ю10 шт/мл (или 57 мкг/мл в пересчете на концентрацию золота).

З.Золотые нанооболочки диаметром 160 нм, состоящие из ядра диоксида кремния диаметром 120-140 нм и золотой оболочки толщиной 20 нм (концентрация частиц 2*109 шт/мл или 150 мкг/мл в пересчете на концентрацию золота). Использовались наночасгицы синтезированые в лаборатории наноразмерных биосенсоров ИБФРМ РАН

(зав. лабораторией д-р физ-мат.наук. Н.Г.Хлебцов). Для увеличения биодоступности и биосовместимости все типы наночастиц были конъюгированы с полиэтиленгликолем.

Учитывая особые перспективы применения золотых наночастиц в онкологии, изучали их влияние как на организм здоровых животных, так и на животных с трансплантированными опухолями. Для выявления морфологических изменений во внутренних органах у животных с опухолями использована модель перевиваемой опухоли - рака почки крысы (РА). Штамм опухоли получен из банка опухолевых штаммов ГУ Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина РАМН. Данный штамм опухоли перевивался беспородным крысам-самцам подкожно в область лопатки. Животные содержались в обычных условиях до тех пор, пока опухоли не достигали размера 1см и затем вводились в эксперимент.

Учитывая возможность различных путей введения наночастиц в организм, были проведены следующие серии эксперимента:

1-я серия - изучение морфологических изменений в мягких тканях при однократном подкожном и внутримышечном введении наночастиц разного размера.

2-я серия - изучение морфологических изменений во внутренних органах и тканях при однократном внутривенном введении наночастиц разного размера

3-я серия - изучение морфологических изменений во внутренних органах при пероральном многократном введении наночастиц разного размера.

4-я серия - изучение морфологических изменений во внутренних органах и динамики накопления наночастиц в опухоли при однократном внутривенном применении через 30 мин, 60 мин, 1,5 часа, 4 часа, 8 часов, 16 и 24 часов.

Все животные проходили необходимый карантин в виварии, где они содержались в индивидуальных клетках в закрытом, отапливаемом помещении при температуре 20-25°С. Пищевой режим обычный. Длительность наблюдения за крысами зависела от целей конкретного эксперимента и колебалась от 30 минут до 8 суток.

Все опыты проводили в соответствии с положением приказа № 755 МЗ СССР от 12.08.1977 года Экспериментальные работы выполнены на базе Ветеринарной клиники jYüI г. Саратова (главный врач - кандидат ветеринарных наук, Г.С. Терентюк).

В первой серии экспериментов наночастицы разных размеров вводили подкожно и внутримышечно для изучения их местного влияния на мягкие ткани. В этой серии экспериментов использовалась 21 здоровая крыса Каждой крысе из опытных групп

делали 1 подкожную инъекцию в область спины и 1 внутримышечную инъекцию в бедренную мышцу. Перед проведением подкожных инъекций с области спины удалялся волосяной покров, и место введения предварительно маркировали цветным фломастером. С каждой инъекцией вводили 0,1 мл раствора наночастиц. Для того чтобы выявить временную динамику морфологических изменений, образцы кожи и мышц забирали через 2 часа после введения и через 1 сутки.

Вторая серия экспериментов была посвящена изучению влияния размеров наночастиц на вызываемые ими морфологические изменения во внутренних органах при внутривенном их введении. Для этого использовались наночастицы коллоидного золота разных размеров (золотые наносферы 15 и 50 нм в диаметре и нанооболочки 160 нм). Беспородным здоровым крысам-самцам внутривенно однократно вводили 1 мл наночастиц. Все животные были разделены на 2 группы: контрольная (5 животных) и опытная (18 животных). Опытная группа крыс, в свою очередь, была разделена на три подгруппы по 6 животных в каждой.

Через 1 сутки после введения животные умерщвлялись путем декапитации с помощью специального устройства - «гильотины» (приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.1977г.). После декапитации у животных забирали образцы всех внутренних органов. Взятый у животных материал подвергался морфологическому, морфометрическому и статистическому исследованиям. Кроме этих методов, осуществлялось количественное определение золота во внутренних органах методом атомно-абсорбционной спектроскопии для выявления зависимости между размером наночастиц и их кинетикой в организме.

В третьей серии экспериментов 1мл наночастиц разных размеров вводили крысам перорально через желудочный зонд в течение 7 дней для изучения результатов их хронического воздействия на внутренние органы. В опыте использовались как здоровые животные, так и животные с трансплантированными опухолями. Опытные животные были распределены на группы, каждая из которых получала перорально частицы одного размера. На 8-е сутки после начала кормления животные выводились из эксперимента путем декапитации. После декапитации животные взвешивались на электронных весах, и после вскрытия определялась масса внутренних органов (печень, селезенка и почки). При этом отмечалось наличие макроскопических изменений. После взвешивания образцы всех внутренних органов забирали для морфологического исследования и для

количественного определения содержания золота методом атомно-абсорбционной спектроскопии. Кроме этого, немедленно после декапитации осуществлялся забор крови в количестве 1,5 мл для биохимических исследований.

В четвертой серил экспериментов крысам с трансплантированным раком почки внутривенно вводили 1 мл нанооболочек, и животные выводились из эксперимента через определенные промежутки времени для изучения временной динамики морфологических изменений во внутренних органах и динамики накопления золотых наночастиц. В те же промежутки времени забирались образцы крови для биохимического исследования.

Данные дополнительных методов исследования анализировались параллельно с морфологическими данными, а также данными иммуногистохимического исследования.

Для морфологического исследования образцы внутренних органов фиксировались в 10% - ном растворе нейтрального формалина, подвергались стандартной спиртовой и ацетоновой проводке, после чего доводились до парафиновых блоков. Срезы толщиной 6-8 мкм окрашивались гематоксилином и эозином, толуидиновым синим, по Перлсу.

Для выявления признаков дезорганизации соединительной ткани и оценки агрегатного состояния крови в работе использовался гистохимический метод ОКГ (оранжевый Ж, красный 2С, водный голубой), предложенный Марциусом и адаптированный Д.Д. Зербино и J1.JI. Лукасевич (1984) к отечественным красителям.

В клетках опухоли иммуногистохимическим методом определялся антиген пролиферирующего клеточного ядра (PCNA) и Ki-67.

Для определения данных антигенов использовался авидин-биотиновый метод с антителами ДАКО в разведении Ki-67 -1:100, PCNA-1:200.

Результаты данной реакции оценивались полуколичественным методом при использовании системы подсчета Histochemical score (H.S.).

Биохимическим методом определялись ферменты крови (аспартатаминотрансфераза, аланинаминотрансфераза, мочевина, креатинин). Планировалось провести исследование общего анализа крови, но в связи с малым объемом крови у крыс и быстрым образованием свертков постановка анализов оказалась невозможной. Кроме биохимического анализа крови было осуществлено исследование общего анализа мочи.

Для количественного определения содержания золота во внутренних органах использовался метод атомно-абсорбционной спектроскопии. Принцип действия спектрометра основан на использовании метода зеемановской поляризационной спектроскопии с высокочастотной модуляцией (ЗПВСМ), который является одним из вариантов селективного атомно-абсорбционного анализа. В результате на определенной частоте возникает разностный сигнал, пропорциональный концентрации атомов.

Результаты исследований обрабатывались общепринятыми статистическими методами с помощью статистической программы SPSS. Переменные, полученные в биохимических анализах по результатам теста Колмогорова-Смирнова на параметричность. Определялись средние арифметические показатели, стандартное отклонение, стандартная ошибка среднего, t - критерий, двухсторонняя значимость.

Для выявления линейной зависимости между изучаемыми признаками был применен метод корреляционно-регрессионного анализа.

Результаты собственных исследований

При подкожном и внутримышечном введении золотых наночастиц изучали морфологические изменения в органах и тканях через 2 и 24 часа после введения 0,1 мл наночастиц золота разных размеров (15 нм, 50 нм и 160 нм) для определения динамики морфологических изменений в области введения и внутренних органах.

При этих двух способах введения изменения в мягких тканях были стереотипны и не зависели от размера наночастиц. Через 2 часа после введения в месте инъекции обнаруживались .скопления золотых наночастиц, вокруг которых располагались формирующиеся клеточные инфильтраты, состоящие преимущественно из макрофагов и полиморфноядерных лейкоцитов; обнаруживалось большое количество дегранулированных тучных клеток. Кроме этого регистрировались признаки венозного полнокровия и деструктивного отека.

Через 24 часа после введения, обращали на себя внимание отсутствие наночастиц золота и более выраженные признаки воспаления с наличием распространенных клеточных инфильтратов, вплоть до образования микроабсцессов, с преобладанием в клеточном инфильтрате лимфоцитов и макрофагов, а также выраженные признаки дистрофических изменений в мышечных волокнах и их некроза. Интересным с нашей точки зрения является и установленный факт накопления наночастиц золота в мышечных волокнах.

Таким образом, местное введение золотых наночастиц в организм экспериментальных животных показало, что в ответ на введение возникает местная сосудисто - мезенхимальная реакция в виде отека, полнокровия, увеличения количества тучных клеток и макрофагов, а позже развертывается классическая картина воспаления с дистрофическими и некротическими изменениями мышечных волокон. Морфогенез не зависит от размера наночастиц.

Появление в зоне скопления наночастиц большого количества макрофагов тесно связано с вопросом о влиянии наночастиц на неспецифические и специфические механизмы иммунной системы, который остается открытым до сих пор. P.G. Barlow, К. Donaldson, J. MacCallum, A. Clouter and V. Stone (2005) ставили себе целью определить способность наночастиц активировать факторы сыворотки крови, которые могут индуцировать миграцию макрофагов. Они выявили, что сыворотка, которую подвергали воздействию наночастицами сажи в очень высоких дозах (10 мг/мл) вызывала усиление миграции макрофагов в 1,8 раза по сравнению с контрольной группой за счет образования факторов хемотаксиса Возможно, подобный механизм увеличения количества макрофагов в зоне введения наночастиц имеет место и в данном случае. Изменения во внутренних органах не отличались от таковых в контрольной группе.

В отличие от местного введения при внутривенном и пероральном введении золотых наночастиц методом атомно-абсорбционной спектроскопии в органах определялось различное количество золотых наночастиц.

Согласно нашим данным, при хроническом пероральном введении во внутренних органах содержится золота меньше, чем через 24 часа после внутривенного введения, в 3-30 раз. При внутривенном введении показатели колеблются от 1,5 до 35 нг/г массы органа, а при пероральном они не превышали 6 нг/г (табл.1).

Таблица 1

Содержание золота через 24 часа после внутривенного и перорального

В/в введение через 24 часа Пероральное введение

Орган^\ 160 им 160 нм 50 нм 15 нм

легкое 1,64 0,4 0,7 0,9

опухоль - 1,8 2,2 2,5

печень 4,98 0,8 1,0 2,8

селезенка 6,18 0,5 0,6 1,3

почка 29,4 3,6 4,5 5,6

Возможно, это обусловлено тем, что при пероральном введении большая часть золотых частиц выводится из организма через желудочно- кишечный тракт прежде чем они успевают проникнуть в кровеносное русло.

Вероятно, ряд авторов, Уагг^о е1 а1.,(1995); КтеуИ^ еГа!., (2002); 8ешт1ег й а1., (2004), занимающиеся изучением захвата и транспорта наноматериалов в ЖКТ правы, считая, что большинство наночастиц транзитом проходят через ЖКТ и быстро выводятся с фекалиями. Всасывание наночастиц из ЖКТ происходит лишь в незначительной степени. В эксперименте на крысах, которым указанные авторы перорально вводили радиомеченные функционализированные фуллерены С60_ они установили, что 98% частиц выводились с фекалиями в течение 48 часов, тогда как оставшаяся часть выводилась в мочу, указывая на некоторое поступление их в кровь. ,1ат й а1. (1990) обнаружили размер-зависимое всасывание полистиреновых частиц (от 50 до 3.000 нм) слизистой ЖКТ. Скорее всего, различия в захвате в ЖКТ зависят от химического состава поверхности частиц и от их размера. Что касается золотых частиц, сведений об их накоплении во внутренних органах при пероральном введении мы не встретили.

Что касается вопроса о распределении наночастиц в организме после их проникновения в кровеносную систему, нами было установлено размер-зависимое распределение наночастиц золота во внутренних органах. Феномен размерной зависимости сохранялся независимо от метода введения. Однако, если при внутривенном введении максимальное накопление золота происходит в печени и селезенке (к сожалению, в этой серии экспериментов мы не определяли содержание золота в опухоли), то при пероральном применении оно накапливается преимущественно в опухоли и почках. Мы считаем, что это обусловлено структурно-функциональными особенностями данных органов. Во-первых, в печени и селезенке находятся капилляры фенестрированного типа; во-вторых, печень - это орган, предназначенный для захвата и выведения чужеродных веществ, а селезенка обладает значительной способностью к аккумуляции крови, и, следовательно, содержащихся в ней наночастиц. При внутривенном введении максимальное накопление во внутренних органах отмечалось для самых крупных частиц (160 нм). С уменьшением размера частиц наблюдаемая концентрация в печени и селезенке снижается. Выраженного различия концентрации частиц диаметром 50 и 160 нм в селезенке и крови через сутки

после введения не наблюдается. В отличие от этого, мелкие частицы диаметром 15 нм циркулировали в крови спустя сутки в большем количестве, чем более крупные частицы. Это может объясняться большей способностью мелких частиц к рециркуляции, чем крупных. Полученные нами результаты согласуются с данными, представленными в работе \yirn Н. Бе ]ong (2008).

Ряд авторов (ЗЬаппа Ш, 8Ьагша А., 2007) свидетельствуют о том, что наночастицы металлов могут проникать через гематоэнцефалический барьер и оказывать неблагоприятное влияние на строение и функции головного мозга. В нашем исследовании через 24 часа после внутривенного введения наночастиц золота 15, 50 и 160 нм мы обнаруживали отек и дистрофию нервных клеток. Утверждать, что выявленные нами процессы, обусловлены воздействием наночастиц оснований нет, так как они являются неспецифическими и могут быть обусловленны стрессорной реакцией организма при проведении эксперимента и забое животного.

При сравнении изменений в почках, возникающих при внутривенном и пероральном введении наночастиц золота, можно отметить, что патологические изменения при разных способах введения не всегда имели однонаправленный характер. Например, сходным образом изменялась степень кровенаполнения. При обоих методах введения с уменьшением размера наночастиц увеличивалось кровенаполнение в сосудах коры и в обоих случаях скопления наночастиц обнаруживались в почках только при введении 50- и 15-нм частиц. Однако, если при внутривенном введении с уменьшением размера частиц степень кровенаполнения клубочков уменьшалась (с »репрессированием малокровия), то при пероральном введении с уменьшением размера частиц полнокровие клубочков нарастало. Другой находкой, обнаруженной нами, было появление диапедезных кровоизлияний в мозговом веществе при пероральном введении 15-нм частиц. Следует также отметить, что максимальные изменения при внутривенном введении возникали при 50-нм частицах, а при пероральном при 15-нм частицах. В целом, изменения, возникающие в почках при пероральном введении, носят более выраженный характер, чем при внутривенном введении. Однако при сравнении количества золота, накапливающегося в ткани почек при разных способах введения, мы выявили, что содержание золота при пероральном введении наночастиц было примерно в 6-8 раз меньше, чем при внутривенном введении. Из этого можно сделать предположение о том, что наночастицы золота вызывают более выраженные

морфологические изменения при хроническом воздействии, даже при условии их менее значительного накопления в ткани почек.

При параллельном исследовании показателей общего анализа мочи не было выявлено статистически достоверных изменений ни в одной группе. При изучении биохимических показателей выявлено, что достоверная разница по Ькритерию была получена между группой контроля и группой животных, которым вводились 50-нм частицы по мочевине (1=2,88 при р=0,05) и креатинину (1= 2,396286 при р= 0,05); между группами 15 нм и 160 нм по мочевине (1= -4,43501 при р=0,01); между группами 50 нм и 160 нм по мочевине 0= -4,86087 р= 0,001) и креатинину (1= -3,02451 р= 0,05). Анализ этих данных позволяет сказать, что введение наночастиц определенных размеров вызывает биохимические сдвиги.

При сравнении изменений в сердце, возникающих при внутривенном и пероральном введении наночастиц разных размеров, следует отметить, что изменения в клетках миокарда носили более выраженный характер при внутривенном введении наночастиц. При этом 160-нм частицы вызывали в кардиомиоцитах некротические и некробиотические изменения и малокровие крупных сосудов. Частицы размером 50-нм приводили к выраженным гемодинамическим нарушениям (выраженное полнокровие и диапедезные кровоизлияния в миокарде). С уменьшением размера наночастиц степень повреждения кардиомиоцитов уменьшалась. Относительно природы возникающего некроза кардиомиоцитов мы можем предположить, что существует два возможных механизма его развития. Первый - прямое цитопатическое действие наночастиц золота размером 160 нм на кардиомиоциты, и второй, с нашей точки зрения более вероятный механизм - это сосудистое происхождение некротических изменений. Наночастицы размером 160 нм при внутривенном воздействии вызывают преимущественное малокровие, и как следствие, ишемию в большинстве внугренних органов, в том числе и в сердце. При пероральном введении наночастиц не было прямой зависимости между размером наночастиц и степенью повреждения кардиомиоцитов (во всех случаях дистрофия носила умеренный характер). Относительно отека стромы следует отметить, что при внутривенном введении с уменьшением размера наночастиц увеличивалась выраженность отека стромы миокарда. Обратная ситуация возникала при пероральном введении наночастиц - с уменьшением размера частиц уменьшалась и степень отека. При пероральном введении частицы размером 160 нм больше воздействуют на крупные

сосуды, 50-нм и 15-нм частицы - на сосуды мелкого калибра; при этом 50-нм частицы вызывают самое выраженное полнокровие МЦР. Следует отметить, что в группе 160-нм частиц отмечалось достоверное повышение уровня аспартатаминотрансферазы по сравнению с контрольной группой.

В печени, при внутривенном введении наночастиц разных размеров, максимальные нарушения кровенаполнения возникали при введении 160-нм частиц. При этом гемодинамические нарушения носили неоднородный характер (сочетание умеренного полнокровия и малокровия). Дистрофия гепатоцитов при этом способе введения прямо зависела от размера частиц и возрастала с уменьшением их размера. Максимальное количество наночастиц обнаруживалось при введении 50-нм частиц.

При пероральном введении 50-нм частиц возникали самые минимальные изменения. Нарушения кровенаполнения имели размерную зависимость (при 160-нм малокровие, при 50-нм умеренное полнокровие, при 15-нм выраженное полнокровие). Дистрофия была самая выраженная при 160-нм частицах, а самая минимальная - при 50-нм, т.е. размерная зависимость отсутствовала. Возможно, это связано с разными патогенетическими механизмами этих изменений, крупные наночастицы приводят к дистрофическим изменениям непрямым механизмом, влияя на кровенаполнение в органе, а мелкие наночастицы обладают большей способностью к цитопатическому эффекту. При количественном определении содержания золота в печени при пероральном введении обнаружен размер-зависимый эффект его накопления. Вероятно, это связано с размер-зависимым всасыванием наночастиц в ЖКТ, приводящему к более выраженному накоплению самых мелких наночастиц.

Кроме гистологических изменений нами было обнаружено изменение массы печени по отношению к массе тела крысы. Для объективной оценки этого показателя нами был введен коэффициент К (отношение массы тела крысы к массе печени). При этом было отмечено, что при пероральном введении 15-нм частиц масса печени не отличалась от таковой в контрольной группе (Кконтр=40,4 и К|5=41,1) , а при введении 50-нм и 160-нм частиц масса печени достоверно увеличивалась, достигая максимума для 160-нм частиц (К50=35,1 и К160=29). Мы объяснили это тем, что при введении 160-нм частиц дистрофия достигает максимальной выраженности, что сопровождается увеличением органа. Биохимическое исследование крови при пероральном введении наночастиц золота показало достоверную разницу в уровне аланинаминотрансферазы

между группой контроля и группой 160 нм 0= -2,49946 при р= 0,05), между группами 15 нм и 160 нм (£= -2,50986 при р=0,05), между группами 50 нм и 160 нм (1= -3,01363 при р=0,05).

Таким образом, при сравнении изменений, возникающих в печени при внутривенном и пероральном введении наночастиц разных размеров, мы обнаружили как сходства, так и различия морфологических изменений. Из сходных изменений следует отметить, что максимальное количество наночастиц обнаруживалось в печени при введении 15-нм частиц независимо от способа введения. Однако максимальные нарушения кровенаполнения при внутривенном введении носили умеренный характер и были наиболее выраженны при 160-нм частицах. При пероральном введении нарушения кровенаполнения были выраженные и достигали максимума при применении 50- и 15-нм частиц. Если при внутривенном введении дистрофия усиливалась с уменьшением размера, то при пероральном введении этот показатель не имел размерной зависимости.

В селезенке при внутривенном введении 160-нм наночастиц в большинстве случаев обнаруживали выраженное полнокровие и большое количество наночастиц и гранул гемосидерина в красной пульпе. При 50-нм частицах полнокровие в красной пульпе было более выраженное; наночасгицы и гемосидерин встречались как в белой, так и в красной пульпе. Фолликулы белой пульпы имели размытые контуры, в них встречались апоптозные тельца. При введении 15-нм частиц отмечалось резкое полнокровие, и накапливалось большое количество наночастиц и гемосидерина в

красной пульпе.;

!

При внутривенном введении 50-нм частиц возникали самые выраженные изменения в строении селезенки, в частности, белой пульпы. При этом возникали нарушения строения лимфоидных фолликулов (размытость фолликулов и появление апоптозных телец). Наночасгицы других размеров (15 нм и 160 им) не вызывали нарушений в белой пульпе, но приводили к выраженным изменениям в красной пульпе. Развивалось максимально выраженное полнокровие и накапливалось большое количество наночастиц и гемосидерина. Накопление гемосидерина, по нашему мнению, может объясняться усиленным гемолизом эритроцитов.

При пероральном введении 160-нм частиц в селезенке преобладала белая пульпа, фолликулы крупные (средний размер 31,3), наночастицы и гемосидерин встречались в умеренном количестве, полнокровие красной пульпы также было умеренное. При 50-нм

частицах соотношение красной и белой пульпы было примерно одинаковым, средний размер фолликулов - 24,2, в большинстве случаев встречалось большое количество наночастиц и гемосидерина в красной пульпе. Полнокровие колебалось от малокровия до умеренного полнокровия, с преобладанием малокровия. При 15-нм частицах красная пульпа преобладала над белой пульпой, средний размер фолликулов составлял 16,3, отмечалось очень большое количество наночастиц и гемосидерина, полнокровие было умеренное и выраженное. При пероральном введении содержание золота в селезенке было в 5-6 раз меньше, чем при внутривенном, что позволяет сделать заключение о кумулятивном эффекте наночастиц на лимфоидную ткань селезенки.

При аутопсии крыс обращало на себя внимание уменьшение массы селезенки. Дополнительно к гистологическому исследованию, мы рассчитали коэффициент К для этого органа. При этом установили, что при пероральном применении наночастиц всех размеров масса селезенки достоверно уменьшалась (Кконтр=105,2; К160=266,2; К50=275,1; К|5=211,2). Уменьшение массы селезенки было наиболее значительным при введении частиц размером 50 нм и 160 нм. Макроскопическая и гистологическая картины изменений пульпы селезенки косвенно свидетельствовали о происходящих в иммунной системе нарушениях.

Хорошо известен тот факт, что комплексы молекулярного золота (III), такие как Auranofïn или Tauredon, ослабляют презентацию антигена и уменьшают аутоиммунные и воспалительные реакции, ассоциированные с ревматоидным артритом (De Wall, SL., 2006). Несколько сообщений описывают цитотоксичность и иммунотоксичность и золота (I) (Mirabelli et al., 1985; Grootveld et al., 1990; Gleichmann et al., 1991; Gleichmann et al.„ 1996) и золота (III) (Gleichmann et al., 1991; Cossu et al., 1994; Gleichmann et al.„ 1996; Svensson et al., 2002). В исследовании R. Shukla (2005) золотые наночастицы 3,5 нм в диаметре, покрытые лизином и полилизином, были биосовместимы и неиммуногенны.

Однако мы считаем, что выявили морфологические признаки иммуносупрессивного действия наночастиц золота 15, 50 и 160 нм, проявляющегося в уменьшении размеров и истощении лимфатических фолликулов селезенки.

В легком при внутривенном введении наночастиц разных размеров возникали следующие изменения. При введении 160-нм частиц преобладало умеренное полнокровие, и в некоторых случаях развивались малокровие и запустевание сосудов.

Феномен сепарации крови отмечался в 75% случаев; очаговые кровоизлияния встречались в 25%. Наночастиц и гранул гемосидерина мы не обнаружили. При введении 50-нм частиц в половине случаев полнокровие носило умеренный характер, в половине - выраженный; кроме этого, в половине случаев встречались множественные очаговые кровоизлияния со скоплением в них наночастиц и гранул гемосидерина. В просвете сосудов обнаруживались скопления наночастиц. При введении 15-нм частиц наблюдалось умеренное полнокровие, очаговые кровоизлияния со скоплениями наночастиц и гемосидерина; в просвете сосудов были видны наночастицы, но количество их было меньше чем при 50-нм.

Таким образом, при внутривенном введении наночастиц разных размеров максимальные изменения в легких наблюдались при 50-нм частицах.

При пероральном введении 160-нм частиц в сосудах легких во всех случаях отмечалась сепарация крови, полнокровие было незначительное. В половине случаев встречались единичные диапедезные кровоизлияния, и в 20% - множественные диапедезные и очаговые. В местах кровоизлияний наблюдались скопления наночастиц и гемосидерина. Ателектазов обнаружено не было. При применении 50 нм частиц сепарация крови отмечалась в меньшем количестве случаев, полнокровие было умеренное и выраженное. Кровоизлияния преимущественно были либо множественные диапедезные, либо крупные очаговые. Ателектазы встречались в 20%. При 15-нм частицах сепарация крови выявлялась в половине случаев, полнокровие преимущественно было выраженное. Увеличивались число и размер кровоизлияний. Ателектазы обнаруживали в половине случаев. В результате .количественного определения содержания золота в легких при этом методе введения мы можем констатировать, что накопление частиц имело размер-зависимый характер и увеличивалось с уменьшением их размера

При сравнительном анализе морфологических изменений в легких, возникающих при разных способах введения наночастиц золота, мы можем сделать вывод о разнонаправленности патологических процессов. Если при внутривенном введении выраженность полнокровия не имела размерной зависимости и была максимальной при введении 50-нм частиц, то при пероральном введении отмечается четкая зависимость от размера частиц (с уменьшением размера частиц возрастает степень полнокровия, достигая максимума при введении 15-нм частиц). При внутривенном введении

наночастиц не было зафиксировано появления ателектазов ни в одном случае, а при пероральном они присутствовали при введении 50-нм и 15-нм частиц. Из сходных параметров можно отметить сепарацию крови, которая при внутривенном введении присутствовала только при введении 160-нм частиц, а при пероральном при всех размерах, но имела четкую размерную зависимость и достигала максимума при введении 160-нм частиц.

Таким образом, изменения в легких гораздо более выражены при пероральном введении, хотя содержание наночастиц при этом способе введения в 3 раза меньше, чем при внутривенном введении; при этом большинство патологических процессов имеет размерную зависимость.

Крайне важным представляется вопрос о влиянии наночастиц на сосудистую систему.

Было отмечено, что при внутривенном введении 160-нм частицы вызывают малокровие, а 50- и 15-нм частицы - полнокровие сосудов. Возможно, это обусловлено тем, что наночастицы разных размеров по-разному воздействуют на стенку сосудов во внутренних органах. Мы можем предположить, что наночастицы взаимодействуют с рецепторами сосудистой стенки, меняя их активность и изменяя сосудистый тонус. По всей видимости, наночастицы разных размеров оказывают влияние па разные рецепторы,и поэтому более крупные наночастицы приводят к малокровию, а мелкие - к полнокровию во внутренних органах. Мы не исключаем, что наночастицы оказывают повреждающее воздействие на эндотелий сосудов, подтверждением чего служит обнаруженный нами феномен плазмопропитывания и фибриноидного набухания сосудов внутренних органов. Наши данные согласуются с результатами Peters et al. (2004), которые исследовали несколько различных наночастиц (поливиниловых, Tio2, Sio2, Со, Ni) и обнаружили, что наночастицы Со вызывали токсичность в эндотелиальных клетках, которая сопровождалась образованием провоспалительного цитокина IL8.

Другим важным вопросом является влияние наночастиц золота на кровь. Мы в своем исследовании получили свидетельство повышенного распада эритроцитов, о чем свидетельствовало повышенное накопление пигмента гемосидерина в селезенке. Кроме этого, нами было проведено исследование уровня билирубина в сыворотке крови, и мы выявили умеренный подъем его содержания в нескольких временных точках (45

мин, 2 часа) после введения нанооболочек с нормализацией к 24 часам. Эти данные не согласуются со сведениями V. \Viwanitkit (2008), который смешивал раствор золотых наночастиц и образцы крови. По его данным, после смешивания наблюдалась аккумуляция наночастиц в эритроцитах. Однако эти авторы не наблюдали значительного разрушения эритроцитов.

Мы в своем исследовании не проводили полного исследования влияния наночастиц золота на репродуктивную систему, однако, при изучении гистологических препаратов семенников в группе с хроническим пероральным введением, мы обратили внимание на то, что единичные семенные канальцы были запустевшими, и в части канальцев отмечались уменьшение клеточных слоев и нарушение ■процесса дифференцировки клеток. По нашему мнению, это может служить свидетельством нарушения сперматогенеза при воздействии наночастиц золота, однако в этой области необходимы более детальные исследования.

В литературе мы обнаружили только одну публикацию, касающуюся исследований сперматотоксичности золотых наночастиц. V. \Viwanitkit, А.Зегеетаярип, 1*..1^апаЙ1апе8 (2009) изучали влияние 9 нм наночастиц золота на сперматозоиды человека. Через 15 мин после инкубации 25% сперматозоидов были не подвижны. Кроме этого, авторы наблюдали проникновение наночастиц в головку и хвост и фрагментацию части сперматозоидов.

При изучении изменений процессов, происходящих в опухоли при пероральном введении наночастиц золота, при использовании стандартных гистологических окрасок не были обнаружены какие-либо изменения, т.е. пассивное накопление наночастиц в опухоли не вызывает изменений на тканевом уровне. В связи с этим мы решили проверить возможное влияние наночастиц золота на пролиферативную активность клеток опухоли с использованием иммуногистохимического метода Однако уровень экспрессии маркеров пролиферации РСЫА и Кь67 не отличался от таковых в группе контроля.

Для изучения морфогенеза изменений в органах, развивающихся при внутривенном введении наночастиц золота, был проведен эксперимент с забоем животных через определенные промежутки времени после внутривенного введения нанооболочек. Параллельно с морфологическим исследованием проводилось определение содержания золота во внутренних органах методом ААС.

При изучении морфогенеза патологических процессов в почках выявлено, что с течением времени прогрессирует дистрофия эпителия канальцев мозгового вещества, достигая максимального развития через 8 часов, однако через 24 часа степень ее становится умеренной. Дистрофия извитых канальцев была умеренная во всех временных точках. Был отмечен интересный феномен изменения кровенаполнения органа, т.е. чередования во времени малокровия и полнокровия и в капиллярных петлях клубочков и крупных сосудах. Мы полагаем, что это является еще одним подтверждением влияния нанооболочек на тонус сосудов, как микроциркуляторного русла, так и крупного калибра. Возможно, отражением вазопатического действия крупных наночастиц являлся и коллапс отдельных капиллярных петель клубочков. Биохимическое исследование уровня креатинина и мочевины показало их кратковременные колебания во времени, с нормализацией к 24 часам. При параллельном изучении динамики содержания золота в ткани почек нами выявлено увеличение его содержания от 2 часов до 24 часов. Мы считаем, что это отражает процесс постоянного выведения наночастиц из организма с мочой. Однако, плавная динамика накопления золота не коррелировала с обнаруженными изменчивыми во времени морфологическими изменениями.

Анализ морфологических изменений в печени показал, что кровенаполнение в сосудах, также как и в почках, отличалось крайней нестабильностью и колебалось от малокровия до умеренного полнокровия. Было обнаружено прогрессирование во времени дистрофии гепатоцитов (в течение первых 4 часов дистрофия носила умеренный характер, а начиная с 8 часов, достигала выраженной степени). Функциональное состояние печени оценивалось с помощью изучения уровня аланинаминотрансферазы в крови. При этом выявлен пик подъема фермента через 2 часа, с нормализацией уровня к 4 часам.

Максимальное содержание золота в печени наблюдалось в первые 4 часа после введения нанооболочек, затем оно начинало снижаться, достигая минимума к 24 часам. Возможно, прогрессирование дистрофии гепатоцитов после 4 часов объясняется тем, что, однажды вступив во взаимодействие с клеточными структурами, наночастицы запускают процесс нарушения метаболизма, который морфологически проявляется уже после того, как начинается выведение нанооболочек.

При изучении гистологических препаратов сердца обнаружили, что через 30 мин в сердце в большинстве случаев развивается выраженный отек стромы, и неравномерное кровенаполнение с сочетанием малокровия и умеренного полнокровия крупных сосудов. Через 45 мин выраженный отек стромы был выявлен во всех препаратах, и практически везде отмечалась нормализация кровенаполнения. Через 1-1,5 часа полнокровие было умеренным или выраженным в сочетании с умеренным или выраженным отеком стромы. Через 4 часа наблюдались малокровие большинства сосудов и развитие умеренной зернистой дистрофии в кардиомиоцитах. Через 8 часов кровенаполнение было неравномерным, дистрофия кардиомиоцитов достигала выраженной степени. Через 24 часа отмечались как некротические, так и некробиотические изменения кардиомиоцитов.

При изучении морфогенеза изменений в селезенке нами выявлено постепенное прогрессирование полнокровия во времени с нарастанием количества гранул гемосидерина в красной пульпе. Количество визуализирующихся наночастиц было примерно одинаковым во всех временных точках. По данным ААС, золотые нанооболочки максимально накапливаются в селезенке в течение первых 8 часов после введения, затем их количество уменьшается, отражая процессы их выведения.

В легких изменения касались в основном кровенаполнения крупных и мелких сосудов, которое аналогично с другими органами колебалось во времени. Следует отметить, что, начиная с 2 часов, в ткани легких наблюдались единичные диапедезные кровоизлияния, с накоплением в них гранул гемосидерина и небольшого количества наночастиц.

Выводы

1.Местные изменения в мягких тканях экспериментальных животных при подкожном и внутримышечном введении золотых наночастиц разных размеров носят размер-независимый характер и представлены дистрофией, некрозом и воспалением.

2. Морфологические изменения во внутренних органах при внутривенном введении золотых наночастиц разных размеров носят размер-зависимый характер: 160 нм нанооболочки вызывают преимущественно гемодинамичсскис нарушения и умеренную дистрофию паренхиматозных элементов, 50 нм наночастицы приводят к более выраженным дистрофическим изменениям во внутренних органах, 15 нм наночастицы вызывают умеренную дистрофию паренхиматозных клеток во внутренних

органах и умеренное полнокровие. Изменения в мозге не имеют размер - зависимого характера и представлены умеренной дистрофией нервных клеток и отеком.

3. Морфологические изменения при длительном пероральном введении золотых наночастиц во всех внутренних органах, кроме сердца, носят более выраженный характер, чем при однократном внутривенном.

4. Независимо от метода введения наночастиц золота максимальное их накопление наблюдается в печени и селезенке. Количественное содержание золота в органах зависит от размера наночастиц: чем крупнее наночастицы, тем выше концентрация золота в единице массы органа.

5. Морфо-функциональное состояние органов в большей степени обусловлено размером наночастиц и в меньшей степени - их количественным содержанием.

Практические рекомендации Алгоритм проведения эксперимента для изучения морфологических изменении во внутренних органах при воздействии наночастиц золота

1. При разработке дизайна эксперимента необходимо проводить подбор животных одной массы (разброс значений не более 10%), при этом количество животных в группах должно быть достаточным для проведения статистической обработки данных (не менее 10 для мелких видов и не менее 6 для крупных).

2. Животных необходимо содержать в одинаковых условиях при идентичном пищевом режиме, так как морфологические и биохимические показатели отличаются чувствительностью к изменениям факторов окружающей среды. Контрольная группа должна содержаться в одном помещении с опытной группой не менее 7 дней перед выведением из эксперимента.

3. При выборе способа забоя в случае отсутствия необходимости забора крови для биохимического исследования предпочтителен метод передозировки эфирного наркоза, так как он менее стрессорен для животных и не вызывает изменений, характерных для острого стресса.

4. При проведении морфологического эксперимента следует учитывать наличие обязательного контроля во всех сериях эксперимента (при внутривенном введении наночастиц целесообразно введение контрольной группе животных

аналогичных количеств физиологического раствора, при пероральном введении -пероральное введение физиологического раствора и т.д.).

5. Необходимо изучение влияния наночастиц на организм экспериментальных животных при всех возможных путях их введения (соответственно целям исследования).

6. Выбор дозы остается на усмотрение исследователя, однако следует отметить, что из трех возможных способов определения дозы наночастиц (по массе основного вещества, количеству наночастиц в мл раствора и суммарной площади поверхности частиц в растворе) последний является предпочтительным.

7. Рекомендуется проводить исследования как на здоровых животных, "так и на животных с имеющимся патологическим процессом (перевитые опухоли) для выявления возможного более выраженного влияния на больной организм.

8. Морфологическое изучение изменений в органах желательно проводить в динамическом наблюдении с максимально дробными промежутками времени (30 мин, 1 час, 2 часа, 4 часа, 8 часов , 16 часов и 24 часа при остром эксперименте и через разное количество суток после начала введения при подостром и хроническом эксперименте). Обязательным является проведение аутопсии с подробным описанием макроскопической картины изменений в органах и их контрольным взвешиванием. Для выявления имеющихся изменений в органах и тканях недостаточно использовать только рутинные методы исследования. Необходимо привлечение гисто- и иммуногистохимических методик с параллельным определением содержания наночастиц в тканях.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Changes of biological tissues and biochemical changes after intravenous injection of gold nanoparticles/ L.Suleymanova, G.Terentyuk, G.Maslyakova, B.Kogan //Proc. 7th International Conference on Photonics and Imaging in Biology and Medicine, - Wuhan, China, 2008. -P.6-37.

2.Применение золотых наночастиц для селективной фототермической терапии злокачественных новообразований/ Г.С.Терентюк, Г.Г.Акчурин, Г.Н.Маслякова, Л.В.Сулейманова // Материалы V Съезда фотобиологического общества. - Пущино , 2008.- С.216.

3.Применение наночастиц в онкологии/ И.Ю. Дорохин, С.Б. Радевич, Е.И. Заболотникова, Л.В. Сулейманова/ЛМолодые учёные - здравоохранению региона": Материалы 69-й научно-практической конференции студентов и молодых учёных Саратовского государственного медицинского университета,- Саратов, 2008. -С. 221222.

4. Сулейманова, Л.В. Распределение наночастиц золота в организме и

их токсичность/ С.Б.Радевич, И.Ю. Дорохин, Л.В. Сулейманова// "Молодые учёные -здравоохранению региона": Материалы 69 научно-практической конференции студентов и молодых учСных Саратовского государственного медицинского университета. -Саратов, 2008,-С. 229-231.

5. Сулейманова, Л.В, Распределение наночастиц железа в организме и изменения в органах, связанные с их накоплением/ Л.В. Сулейманова, Е.И.Заболотникова, С.Б. Радевич/ЛМолодые учёные - здравоохранению региона": Материалы 69 научно-практической конференции студентов и молодых учёных Саратовского государственного медицинского университета. - Саратов, 2008.- С. 235-236.

6. Сулейманова,Л.В. Накопление наночастиц золота в органах экспериментальных животных при их внутривенном введении/ O.E. Артемснко, А.Н. Жук, Л.В. Сулейманова//«Молодежь и наука: итоги и перспективы»: Материалы межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием. - Саратов, 2008.- С. 59.

7. Сулейманова, Л.В. Накопление наночастиц золота в органах экспериментальных животных при их внутривенном введении/ А.Н. Жук, Л.В. Сулейманова, O.E. Артеменко// «Молодежь и наука: итоги и перспективы»: Материалы межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием. - Саратов, 2008.-С. 77.

8. Сулейманова, Л.В. Уровень апоптоза в экспериментальном раке почки крысы/ Х.М. Магамедова, O.E. Артеменко, Л.В. Сулейманова//«Молодежь и наука: итоги и перспективы»: Материалы межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием. - Саратов, 2008.-С. 87.

9. Optimization of laser heating with the treatment of spontaneous tumors of domestic animals by the use of the thermography / G.S.Terentyuk, G.G.Akchurin, G.N.Maslyakova, L.V. Suleymanova //Proc. SPIE, 2008. - V. 6791.- P. 67910Q-10.

10. Оптимизация режимов лазерного термического воздействия для стимуляции процессов апоптоза при онкологических заболеваниях у мелких домашних животных/ Г.С.Терентюк, Л.П.Трояновская, Е.П.Соболева, Л.В.Сулейманова // Материалы XVI Московского международного конгресса по болезням мелких домашних животных. -М„ 2008. - С.44-45.

11. Сулейманова, Л.В. Морфологические изменения во внутренних органах крыс после внутривенного введения золотых наночастиц/ Маслякова Г.Н., Сулейманова Л.В., Терентюк Г.С.// Российский биотерапевтический журнал.- 2009. - №1.- С.21.

12. Laser-induced tissue hyperthermia mediated by gold nanoparticles: toward cancer phototherapy/ G.S. Terentyuk , G.N. Maslyakova , L.V. Suleymanova , N.G. Khlebtsov///. Biomed.Opt. - 2009.- Vol. 14.

13. Circulation and distribution of gold nanoparticles and induced alterations of tissue morphology at intravenous particle delivery/ G.S. Terentyuk , G.N. Maslyakova , L.V. Suleymanova, B.N.Khlebtsov// J. Biophotonics.- 2009,- May; 2(5):292-302.

Изобретения

1. Пат.№ 2329074 РФ Способ лазерной деструкции меланомы слизистой оболочки у собак / Г.Г Акчурин., И.Л.Максимова, Л.В. Сулейманова, Н.О.Пчелинцева, Г.С.Терентюк, В.А.Черванев.( РФ, ГОУ ВПО «Саратовский государственный университет им. Н.Г.Чернышевского).- дата приоритета 7.02.2008, Бюл. №20.

Подписано в печать 06.08.2009 Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Roman. Печать RISO. Объем 1,0 печ. л. Тираж 110 экз. Заказ № 115.

Отпечатано с готового оригинал-макета Центр полиграфических и копировальных услуг Предприниматель Серман Ю.Б. Свидетельство № 3117 410600, Саратов, ул. Московская, д. 152, офис 19, тел. 26-18-19, 51-16-28

Предполагается, что применение наноматериалов приведет к революционным достижениям в медицине благодаря способности наночастиц взаимодействовать с биологическими тканями на молекулярном и клеточном уровнях. Современные исследования по применению нанотехнологий в медицине, и особенно в онкологии, широко распространены, в то время как побочные эффекты, связанные с их использованием практически не изучены. Поражающие воображение результаты нанотехнологий несомненно важны, однако те же самые уникальные физические и химические свойства, которые делают наноматериалы такими привлекательными, могут ассоциироваться с их потенциально вредными воздействиями на клетки и ткани живых организмов.

Быстрое развитие отрасли нанотехнологии приводит к тому, что наночастицы становятся широко распространенными в окружающей среде и попадают в организм при дыхании, с пищей, через кожу и при внутривенном введении (Oberdörster G. et al., 2005). Однако, до настоящего времени отсутствует полноценная оценка результатов растущего использования наноматериалов в производстве и их выброса в окружающую среду. Не изучены механизмы их токсичности и потенциального риска для здоровья, связанного с контактом с ними. Исследования результатов загрязнения воздуха наночастицами подтвердили, что частицы могут иметь более токсичные эффекты на клетки на наноуровне, чем то же самое вещество на молекулярном уровне (Seaton А., 2006). Последние исследования in vitro и in vivo подтвердили, что ингаляция и чрезкожная абсорбция некоторых наночастиц может иметь негативных эффекты на здоровье (Seaton А., Donaldson К., 2005; Shvedova A.A., Kisin E.R., 2005) и использование медицинских продуктов содержащих наноматериалы может привести к риску для здоровья (Peters К., Unger R.E., 2004). Существует концепция, что наноразмерные частицы заслуживают более строгой оценки их эффектов на здоровье человека и связанных с этим требований контроля, так как их площадь поверхности и токсичность значительно выше, чем у более крупных частиц. Несмотря на это, результаты, свидетельствующие • о токсичности наноматериалов, используемых в медицине, часто игнорируются (Moghimi S.M. et al., 2005).

Наночастицы отличаются от такого же материала большего масштаба по химическим и физическим свойствам (Seaton А., 2006). Однако специфические механизмы и пути, через которые наноматериалы могут вызывать их токсические эффекты остаются неизвестными. Таким образом, в настоящее время наряду с созданием современных типов наночастиц существует острая необходимость оценки их токсических свойств.

Таким образом, широкое распространение наноматериалов и нанотехнологий в медицине при отсутствии конкретных знаний по накоплению и воздействию наночастиц на организм человека и животных послужили поводом для проведения данного исследования.

Цель исследования: в экспериментах in vivo установить закономерности распределения наночастиц золота в организме лабораторных животных и морфологические изменения, развившиеся под влиянием данных наночастиц в их мягких тканях и внутренних органах.

Основные задачи исследования:

1. Изучить характер местных изменений в мягких тканях лабораторных крыс при подкожном и внутримышечном введении наночастиц золота разных размеров.

2. Изучить на крысах морфологические изменения во внутренних органах, головном мозге и подкожно имплантированном перевиваемом раке почки при внутривенном введении наночастиц золота разных размеров.

3. Изучить на крысах морфологические изменения внутренних органов, головного мозга и привитого подкожно рака почки при пероральном введении наночастиц золота диаметром 15, 50 и 160 нм.

4. Определить динамику распределения и накопления наночастиц разных размеров в органах и тканях крыс с помощью метода атомно-абсорбционной спектроскопии.

5. Сопоставить данные морфо-функционального исследования с показателями распределения и количеством золотых наночастиц в тканях и органах.

Научная новизна. Впервые в эксперименте на крысах in vivo исследованы особенности воздействия наночастиц золота на организм экспериментальных животных и дана оценка характера и направленности возникающих патологических процессов в мягких тканях, внутренних органах, веществе головного мозга и перевитой подкожно опухоли.

Описаны патоморфологические изменения в мягких тканях, возникающие в месте введения золотых наночастиц. Проведен сравнительный анализ морфологических изменений во внутренних органах при разных методах введения наночастиц разного размера, и проведена оценка их взаимосвязи с функциональными изменениями и содержанием наночастиц золота.

Теоретическое и практическое значение работы.

Результаты проведенной работы дополняют современные представления о характере и динамике развития изменений во внутренних органах и перевитой подкожно опухоли при воздействии наночастиц золота. Практические рекомендации для изучения морфологических изменений во внутренних органах при воздействии наночастиц золота в эксперименте могут использоваться в работе лабораторий научно-исследовательских институтов и учебных заведений.

Апробация работы.

Результаты диссертации доложены на международной конференции Saratov Fall Meeting 2007: Optical Technologies in Biophysics and Medicine IX (Саратов, 2007) и Seventh International Conference on Photonics and Imaging in

Biology and Medicine (Wu-Hun, 2008), Конференции по нанотехнологиям (Саратов, 2009), V съезде Российского фотобиологического общества и Международной конференции «Преобразование энергии света при фотосинтезе» (Москва,2008), обществе патологоанатомов (2008,2009).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 13 работ, три из которых в журналах, рекомендованных ВАК, получен 1 патент.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Работа содержит 59 рисунков и 14 таблиц. Список литературы включает в себя 234 источника, из которых 13 отечественных и 221 зарубежных.

Выводы

1. Местные изменения в мягких тканях крыс при подкожном и внутримышечном введении наночастиц золота разных размеров носят размер-независимый характер и представлены дистрофией, некрозом и воспалением.

2. Морфологические изменения во внутренних органах при внутривенном введении наночастиц золота разных размеров носят размер-зависимый характер: 160 нм нанооболочки вызывают преимущественно гемодинамические нарушения и умеренную дистрофию паренхиматозных элементов, 50 нм наночастицы приводят к более выраженным дистрофическим изменениям во внутренних органах, 15 нм наночастицы вызывают умеренную дистрофию паренхиматозных клеток во внутренних органах и умеренное полнокровие. Изменения в мозге не имеют размер-зависимого характера, представлены умеренной дистрофией нервных клеток и отеком.

3. Морфологические изменения при длительном пероральном введении наночастиц золота во всех внутренних органах, кроме сердца, носят более выраженный характер, чем при однократном внутривенном введении.

4. Независимо от метода введения наночастиц максимальное накопление золота наблюдается в печени и селезенке. Количественное содержание золота в органах зависит от размера наночастиц: чем крупнее наночастицы, тем выше концентрация золота в единице массы органа.

5. Морфо-функциональное состояние органов в большей степени обусловлено размером наночастиц золота и в меньшей степени - их количественным содержанием.

Практические рекомендации для изучения морфологических изменений во внутренних органах при воздействии наночастиц золота в эксперименте

• Морфологическое изучение изменений в органах желательно проводить в динамическом наблюдении с максимально дробными промежутками времени (30 мин, 1 час, 2 часа, 4 часа, 8 часов, 16 часов и 24 часа при остром эксперименте и через разное количество суток после начала введения при подостром и хроническом эксперименте).

• Обязательным является проведение аутопсии с подробным описанием макроскопической картины изменений в органах и их контрольным взвешиванием.

• Для выявления имеющихся изменений в органах и тканях недостаточно использовать только рутинные методы исследования. Необходимо привлечение гисто- и иммуногистохимических методик с параллельным определением содержания золота в тканях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нередко появление новых материалов и технологий несет с собой угрозу для здоровья человека и сохранности окружающей среды. Нельзя исключить, что эти опасения весьма актуальны при применении наноматериалов, которые имеют весьма большую удельную поверхность, малые размеры, а значит, высокую химическую активность и высокую способность к проникновению в организм. К сожалению, исследования по изучению влияния наночастиц на живые организм, стоят далеко не на первом месте после большого количества исследований по возможному применению наночастиц во всех областях науки, в том числе и медицине. На отсутствие работ по токсичности наночастиц, с применением морфологических методов исследования мы уже указывали в литературном обзоре, хотя несомненно именно это проблема остается одной из наиболее актуальных и наименее ясных проблем в медицине.

После проведенного исследования мы считаем наиболее актуальным обсуждение следующих вопросов:

1. Как ведут себя золотые наночастицы различных размеров в организме человека при различных методах их введения, и в каких органах наблюдается их максимальное накопление?

2. В каких органах наночастицы вызывают максимальные морфологические изменения, и имеется ли связь с их количеством в органе?

3. Каково влияние наночастиц на функции различных органов?

В своей работе мы применяли несколько методов введения золотых наночастиц различных размеров (подкожное, пероральное и- внутривенное). .При этом определяли количество золота во внутренних органах при многократном пероральном и однократном внутривенном методах введения. Это дало возможность сопоставить данные о накоплении золотых наночастиц во внутренних органах при данных способах введения и судить о степени проникновения наночастиц в различные органы и ткани.

При подкожном и внутримышечном введении золотых наночастиц изучали морфологические изменении в органах и тканях через 2 и 24 часа после введения 0,1 мл наночастиц золота разных размеров (15 нм, 50 нм и 160 нм) для определения динамики морфологических изменений в области введения и внутренних органах.

При этих двух способах введения изменения в мягких тканях были стереотипны и не зависели от размера наночастиц. Через 2 часа после введения в месте инъекции обнаруживались скопления золотых наночастиц, вокруг которых располагались формирующиеся клеточные инфильтраты, состоящие преимущественно из макрофагов и полиморфноядерных лейкоцитов; обнаруживалось большое количество дегранулированных тучных клеток. Кроме этого регистрировались признаки венозного полнокровия и деструктивного отека.

Через 24 часа после введения, прежде всего, обращало на себя внимание отсутствие наночастиц золота и более выраженные признаки воспаления вплоть до образования микроабсцессов, а также с* преобладанием в клеточном инфильтрате лимфоцитов и макрофагов. Обнаруживались выраженные признаки дистрофических изменений в мышечных волокнах и их некроза. Интересным с нашей точки зрения является установленный факт накопления наночастиц золота в мышечных волокнах.

Таким образом, местное введение золотых наночастиц в организм экспериментальных животных показало, что в ответ на введение возникает местная сосудисто - мезенхимальная реакция в виде отека, полнокровия, увеличения количества тучных клеток и макрофагов, а позже развертывается классическая картина воспаления с дистрофическими и некротическими изменениями мышечных волокон. Морфогенез не зависит от размера наночастиц.

Появление в зоне скопления наночастиц большого количества макрофагов тесно связано с вопросом о влиянии наночастиц на неспецифические и специфические механизмы иммунной системы, который остается открытым до сих пор. P.G. Barlow, К. Donaldson, J. MacCallum, А. Clouter and V. Stone (2005) ставили себе целью определить способность наночастиц активировать факторы сыворотки крови, которые могут индуцировать миграцию макрофагов. Они выявили, что сыворотка, которую подвергали воздействию наночастицами сажи в очень высоких дозах (10 мг/мл) вызывала усиление миграции макрофагов в 1,8 раз по сравнению с контрольной группой за счет образования факторов хемотаксиса.

Возможно, что с подобным механизмом увеличения количества макрофагов в зоне введения наночастиц мы имеем дело и в данном случае.

Изменения во внутренних органах в этой группе животных не отличались от таковых в контрольной группе.

В отличие от местного введения при внутривенном и пероральном введении золотых наночастиц методом атомно-абсорбционной спектроскопии в органах определялось различное количество золотых наночастиц. Согласно нашим данным, при хроническом пероральном введении во внутренних органах содержится золота меньше, чем через 24 часа после внутривенного введения в 5-25 раз, чем череэ 24 часа после внутривенного введения. При внутривенном введении показатели колебались от 1,0 до 27 мкг/г массы органа, а при пероральном они не превышали 3 мкг/г.

Возможно это обусловлено тем, что при пероральном введении большая часть золотых частиц выводится из организма через желудочно-кишечный тракт прежде чем успевают проникнуть в кровеносное русло.

Вероятно ряд авторов, Yamago et al.,(1995); Kreyling et al., (2002); Semmler et al., (2004), занимающихся изучением захвата и транспорта наноматериалов в ЖКТ правы, считая, что большинство наночастиц транзитом проходят через ЖКТ и быстро выводятся с фекалиями. Всасывание наночастиц из ЖКТ происходит лишь в незначительной степени. В эксперименте на крысах, которым указанные авторы перорально вводили радиомеченные функционализированные фуллерены Сбо они установили, что

98% частиц выводились с фекалиями в течение 48 часов, тогда как оставшаяся часть выводилась в мочу, указывая на некоторое поступление их в кровь. Другие исследователи (1аш е1 а1. 1994; Вбсктапп е1 а1. 2000), работая с более крупными ТЮ2 частицами (150-500 нм) обнаружили проникновение их в кровь с транспортом в печень. 1аш а1. (1990) обнаружили размер-зависимое всасывание полистиреновых частиц (от 50 до 3.000 нм) слизистой ЖКТ. Скорее всего, различия в захвате в ЖКТ зависят от химического состава поверхности частиц и от их размера. Что касается золотых частиц, сведений об их накоплении во внутренних органах при пероральном введении мы не встретили.

Что касается вопроса о распределении наночастиц в организме после их проникновения в кровеносную систему, то нами было установлено размер-зависимое распределение наночастиц золота во внутренних органах. Феномен размерной зависимости сохранялся независимо от метода введения. Однако, если при внутривенном введении максимальное накопление золота происходит в печени и селезенке, то при пероральном применении оно преимущественно накапливается в опухоли и почках. Мы считаем, что это обусловлено структурно-функциональными особенностями данных органов. Во-первых, в печени и селезенке находятся капилляры фенестрированного типа, во-вторых, печень это орган, предназначенный для захвата и выведения чужеродных веществ, а селезенка обладает значительной способностью к аккумуляции крови, и, следовательно, содержащихся в ней наночастиц. При внутривенном введении максимальное накопление во внутренних органах отмечалось для самых крупных частиц (160 нм). С уменьшением размера частиц наблюдаемая концентрация в печени и селезенке снижается. Выраженного различия концентрации частиц диаметром 50 и 160 нм в селезенке и крови через сутки после введения не наблюдается. В отличие от этого, мелкие частицы диаметром 15 нм циркулировали в крови спустя сутки в большем количестве, чем более крупные частицы. Это может объясняться большей способностью мелких частиц к рециркуляции, чем крупных. Полученные нами результаты согласуются с данными, представленными в работе Wim Н. De Jong (2008).

Концентрация золота в мозге практически не превышает уровень контрольной группы. Возможно, это объясняется наличием гемато-энцефалического барьера.

Ряд авторов (Sharma HS, Sharma А., 2007) свидетельствуют о том, что наночастицы металлов могут проникать через гематоэнцефалический барьер и оказывать неблагоприятное влияние на строение и функции головного мозга. В нашем исследовании мы не обнаружили подобных эффектов для наночастиц золота 15, 50 и 160 нм через 24 часа после внутривенного введения. Нами были выявлены явления умеренного отека и дистрофии нервных клеток.

Особую актуальность с нашей точки зрения, имеет проведение исследований влияния наночастиц на организм животных с существующими патологическими процессами. Мы поставили своей целью изучить влияние наночастиц золота на организм животных с перевитыми опухолями, однако существенных отличий в морфологической картине внутренних органов между опытными группами здоровых животных и животных с опухолями мы не обнаружили.

При сравнении изменений в почках, возникающих при внутривенном и пероральном введении наночастиц золота можно отметить, что патологические изменения при разных способах введения не всегда имели однонаправленный характер. Например, сходным образом изменялась степень кровенаполнения. При обоих методах введения с уменьшением размера наночастиц увеличивалось кровенаполнение в сосудах коры и в обоих случаях скопления наночастиц обнаруживались в почках только при введении 50- и 15-нм частиц. Однако, если при внутривенном введении с уменьшением размера частиц степень кровенаполнения клубочков уменьшалась (с прогрессированием малокровия), то при пероральном введении с уменьшением размера частиц полнокровие клубочков нарастало.

Другой находкой, обнаруженной нами, было появление диапедезных кровоизлияний в мозговом веществе при пероральном введении 15-нм частиц. Следует также отметить, что максимальные изменения при внутривенном введении возникали при 50-нм частицах, а при пероральном при 15-нм частицах. В целом, изменения, возникающие в почках при пероральном введении, носят более выраженный характер, чем при внутривенном введении. Однако, при сравнении количества золота накапливающегося в ткани почек при разных способах введения, мы выявили, что содержание золота при пероральном введении наночастиц было примерно в 6-8 раз меньше, чем при внутривенном введении. Из этого можно сделать предположение о том, что наночастицы золота вызывают более выраженные морфологические изменения при хроническом воздействии, даже при условии их менее значительного накопления в ткани почек.

При параллельном исследовании показателей общего анализа мочи не было выявлено статистически достоверных изменений ни в одной группе. При изучении биохимических показателей выявлено, что достоверная разница по ^критерию была получена между группой контроля и группой животных, которым вводились 50-нм частицы по мочевине (1=2,88 при р=0,05) и креатинину 2,396286 при р= 0,05); между группами 15 нм и 160 нм по мочевине (1= -4,43501 при р=0,01); между группами 50 нм и 160 нм по мочевине (1= -4,86087 р= 0,001) и креатинину (р= -3,02451 р= 0,05). Анализ этих данных позволяет сказать, что введение наночастиц определенных размеров вызывает биохимические сдвиги.

При сравнении изменений в сердце, возникающих при внутривенном и пероральном введении наночастиц разных размеров следует отметить, что изменения в клетках миокарда носили более выраженный характер при внутривенном введении наночастиц. При этом 160-нм частицы вызывали в кардиомиоцитах некротические и некробиотические изменения и малокровие крупных сосудов. Частицы размером 50-нм приводили к выраженным гемодинамическим нарушениям (выраженное полнокровие и диапедезные кровоизлияния в миокарде). С уменьшением размера наночастиц степень повреждения кардиомиоцитов уменьшалась. Относительно природы возникающего некроза кардиомиоцитов мы можем предположить, что существует два возможных механизма его развития. Первый — прямое цитопатическое действие наночастиц золота размером 160 нм на кардиомиоциты, и второй, с нашей точки зрения более вероятный механизм, это сосудистое происхождение некротических изменений. Наночастицы размером 160 нм при внутривенном воздействии вызывают преимущественное малокровие, и как следствие, ишемию в большинстве внутренних органов, в том числе и в сердце. При пероральном введении наночастиц не было прямой зависимости между размером наночастиц и степенью повреждения кардиомиоцитов (во всех случаях дистрофия носила умеренный характер). Относительно отека стромы следует отметить, что при внутривенном введении с уменьшением размера наночастиц увеличивалась выраженность отека стромы миокарда. Обратная ситуация возникала при пероральном введении наночастиц - с уменьшением размера частиц уменьшалась и степень отека. При пероральном введении частицы размером 160 нм больше воздействуют на крупные сосуды, 50-нм и 15-нм частицы на сосуды мелкого калибра, при этом 50-нм частицы вызывают самое выраженное полнокровие МЦР. Следует отметить, что в группе 160-нм частиц отмечалось достоверное повышенйе уровня аспартатаминотрансферазы по сравнению с контрольной группой.

В печени, при внутривенном введении наночастиц разных размеров максимальные нарушения кровенаполнения возникали при введении 160-нм частиц. При этом гемодинамические нарушения носили неоднородный характер (сочетание умеренного полнокровия и малокровия). Дистрофия гепатоцитов при этом способе введения прямо зависела от размера частиц и возрастала с уменьшением их размера. Максимальное количество наночастиц обнаруживалось при введении 50-нм частиц.

При пероральном введении 50-нм частиц возникали самые минимальные изменения. Нарушения кровенаполнения имели размерную зависимость (при 160-нм малокровие, при 50-нм умеренное полнокровие, при 15-нм выраженное полнокровие). Дистрофия была самая выраженная при 160-нм частицах, а самая минимальная при 50-нм, т.е. размерная зависимость отсутствовала. Возможно, это связано с разными патогенетическими механизмами этих изменений, крупные наночастицы приводят к дистрофическим изменениям непрямым механизмом, влияя на кровенаполнение в органе, а мелкие наночастицы обладают большей способностью к цитопатическому эффекту. При количественном определении содержания золота в печени при пероральном введении обнаружен размер-зависимый эффект его накопления. Вероятно, это связано с размер-зависимым всасыванием наночастиц в ЖКТ, приводящему к более выраженному накоплению самых мелких наночастиц. На гистологических срезах скопления наночастиц в крови обнаруживались только при самых маленьких (15-нм) частицах.

Кроме гистологических изменений нами было обнаружено изменение массы печени по отношению к массе тела крысы. Для объективной оценки этого показателя нами был введен коэффициент К (отношение массы тела крысы к массе мечении). При этом было отмечено, что при пероральном введении 15-нм частиц масса печени не отличалась от таковой в контрольной группе (ККОНтр=40,4 и К15=41,1) , а при введении 50-нм и 160-нм частиц масса печени достоверно увеличивалась, достигая максимума для' 160-нм частиц (К50=35,1 и К 160=29). Мы объяснили это тем, что при введении 160-нм частиц дистрофия достигает максимальной выраженности, что сопровождается увеличением органа. Биохимическое исследование крови при пероральном введении наночастиц золота показало достоверную разницу в уровне аланинаминотрансферазы между группой контроля и группой 160 нм (1= -2,49946 при р= 0,05), между группами 15 нм и 160 нм (1= -2,50986 при р=0,05), между группами 50 нм и 160 нм (1= -3,01363 при р=0,05).

Таким образом, при сравнении изменений, возникающих в печени при внутривенном и пероральном введении наночастиц разных размеров, мы обнаружили как сходства, так и различия морфологических изменений. Из сходных изменений следует отметить, что максимальное количество наночастиц обнаруживалось в печени при введении 15-нм частиц независимо от способа введения. Однако, максимальные нарушения кровенаполнения при внутривенном введении носили умеренный характер и были наиболее выраженные при 160-нм частицах. При пероральном введении нарушения кровенаполнения были выраженные и достигали максимума при применении 50- и 15-нм частиц. Если при внутривенном введении дистрофия усиливалась с уменьшением размера, то при пероральном введении этот показатель не имел размерной зависимости.

В селезенке при внутривенном введении 160-нм наночастиц в большинстве случаев обнаруживалось выраженное полнокровие и большое количество наночастиц и гранул гемосидерина в красной пульпе. При 50-нм частицах полнокровие в красной пульпе было выраженное и очень выраженное, наночастицы и гемосидерин встречались как в белой, так и в красной пульпе. Фолликулы белой пульпы имели размытые контуры, в них встречались апоптозные тельца. При введении 15-нм частиц отмечалось резкое полнокровие и накапливалось большое количество наночастиц и гемосидерина в красной пульпе.

Следовательно, при внутривенном введении 50-нм частиц возникали самые выраженные изменения в строении селезенки, в частности белой пульпы. При этом возникали нарушения строения лимфоидных фолликулов (размытость фолликулов и появление апоптозных телец). Наночастицы других размеров (15 нм и 160 нм) не вызывали нарушений в белой пульпе, но приводили к выраженным изменениям в красной пульпе. Развивалось максимально выраженное полнокровие и накапливалось большое количество наночастиц и гемосидерина. Накопление гемосидерина, по нашему мнению, может объясняться усиленным гемолизом эритроцитов.

При пероральном введении 160-нм частиц в селезенке преобладала белая пульпа, фолликулы крупные (средний размер 31,3), наночастицы и гемосидерин встречались в умеренном количестве, полнокровие красной пульпы также было умеренное. При 50-нм частицах соотношение красной и белой пульпы было примерно одинаковым, средний размер фолликулов 24,2, в большинстве случаев встречалось большое количество наночастиц и гемосидерина в красной пульпе. Полнокровие колебалось от малокровия до умеренного полнокровия, с преобладанием малокровия. При 15-нм частицах красная пульпа преобладала над белой пульпой, средний размер фолликулов составлял 16,3, отмечалось очень большое количество наночастиц и гемосидерина, полнокровие было умеренное и выраженное. При пероральном введении содержание золота в селезенке было в 5-6 раз меньше чем при внутривенном, что позволяет сделать нам заключении о кумулятивном эффекте наночастиц на лимфоидную ткань селезенки.

При аутопсии крыс обращало на себя внимание уменьшение массы селезенки. Дополнительно к гистологическому исследованию; мы рассчитали коэффициент К для этого органа. При этом мы выяснили, что при пероральном применении наночастиц всех размеров масса селезенки достоверно уменьшалась (Кконтр=105,2; Ki60=266,2; K50=275,l; Ki5=211,2). Уменьшение массы селезенки было наиболее значительным при введении частиц размером 50 нм и 160 нм. Макроскопическая и гистологическая картина изменений пульпы селезенки косвенно свидетельствовала о происходящих в иммунной системе нарушениях.

Хорошо известен тот факт, что комплексы молекулярного золота (III), такие как Auranofin или Tauredon, ослабляют презентацию антигена и уменьшают аутоиммунные и воспалительные реакции, ассоциированные с ревматоидным артритом (De Wall, SL., 2006). Несколько сообщений описывают цитотоксичность и иммунотоксичность и золота (I) (Grootveld et al., 1990; Gleichmann et al., 1991; Griem & Gleichmann, 1996) и золота (III) (Mirabelli A. et al., 1985). В исследовании Shukla R. (2005) золотые наночастицы 3,5 нм в диаметре покрытые лизином и полилизином были биосовместимы и неиммуногенны.

Однако, мы считаем, что выявили морфологические признаки иммуносупрессивного действия наночастиц золота 15, 50 и 160 нм, проявляющееся в уменьшении размеров и истощении лимфатических фолликулов селезенки.

В легком при внутривенном введении наночастиц разных размеров возникали следующие изменения. При введении 160-нм частиц преобладало умеренное полнокровие, и в некоторых случаях развивалось малокровие и запустевание сосудов. Феномен сепарации крови отмечался в 75% случаев, очаговые кровоизлияния встречались в 25%. Наночастиц и гранул гемосидерина мы не обнаружили. При введении 50-нм частиц в половине случаев полнокровие носило умеренный характер, в половине — выраженный, кроме этого, в половине случаев встречались множественные очаговые кровоизлияния со скоплением в них наночастиц и гранул гемосидерина. В просвете сосудов обнаруживались скопления наночастиц. При введении 15-нм частиц наблюдалось умеренное полнокровие, очаговые кровоизлияния со скоплениями наночастиц и гемосидерина, в просвете сосудов были видны наночастицы, но количество их было меньше чем при 50-нм.

Таким образом, при внутривенном введении наночастиц разных размеров максимальные изменения в легких наблюдались при 50-нм частицах.

При пероральном введении наночастиц разных размеров при 160-нм частицах сепарация крови отмечалась во всех случаях, полнокровие было незначительное, или реже выраженное. В половине случаев встречались единичные диапедезные кровоизлияния, и в 20% множественные диапедезные и очаговые. В местах кровоизлияний встречались скопления наночастиц и гемосидерина. Ателектазов обнаружено не было. При применении 50 нм частиц сепарация крови отмечалась в меньшем количестве случаев, полнокровие было умеренное и выраженное.

Кровоизлияния преимущественно были либо множественные диапедезные, либо крупные очаговые. Ателектазы встречались в 20%. При 15-нм частицах сепарация крови встречалась в половине случаев, полнокровие преимущественно было выраженное. Увеличивалось число и размер кровоизлияний. Ателектазы обнаруживали в половине случаев. В результате количественного определения содержания золота в легких при этом методе введения мы можем констатировать, что накопление частиц имело размер-зависимый характер и увеличивалось с уменьшением их размера.

Таким образом, можно сделать вывод, что при пероральном введении самые выраженные изменения обнаруживались для 15-нм частиц. При уменьшении размера частиц увеличивалась степень полнокровия, достигая максимума для 15-нм. Та же зависимость отмечалась для кровоизлияний. При уменьшении размера наночастиц увеличивалось количество наночастиц и гемосидерина в очагах кровоизлияний. Ателектазы появлялись при 50-нм частицах, и достигали максимума при 15-нм. Степень сепарации крови уменьшалась с уменьшением размера частиц.

При сравнительном анализе морфологических изменений в легких, возникающих при разных способах введения наночастиц золота мы можем сделать вывод о разнонаправленности патологических процессов. Если при внутривенном введении выраженность полнокровия не имела размерной зависимости и была максимальной при 50-нм частицах, то при пероральном введении отмечается четкая зависимость от размера частиц (с уменьшением размера частиц возрастает степень полнокровия, достигая максимума при 15-нм частицах). При внутривенном введении наночастиц не было зафиксировано появление ателектазов ни в одном случае, а при пероральном они присутствовали при 50-нм и 15-нм частицах. Из сходных параметров можно отметить сепарацию крови, которая при внутривенном введении присутствовала только при 160-нм частицах, а при пероральном при всех размерах, но имела четкую размерную зависимость и достигала максимума при 160-нм частицах.

Таким образом, изменения в легких гораздо более выражены при пероральном введении, хотя содержание наночастиц при этом способе введения в 3 раза меньше, чем при внутривенном введении, при этом большинство патологических процессов имеет размерную зависимость.

Крайне важным представляется вопрос о влиянии наночастиц на сосудистую систему и кровь.

Было отмечено, что при внутривенном введении 160-нм частицы вызывают малокровие, а 50- и 15-нм частицы полнокровие сосудов. Возможно, это обусловлено тем, что наночастицы разных размеров по-разному воздействуют на стенку сосудов во внутренних органах. Мы можем предположить, что наночастицы взаимодействуют с рецепторами сосудистой стенки, меняя их активность и изменяя сосудистый тонус. По всей видимости наночастицы разных размеров взаимодействуют с разными рецепторами, и поэтому более крупные приводят к малокровию, а мелкие к полнокровию во внутренних органах. Мы не исключаем, что наночастицы оказывают повреждающее воздействие на эндотелий сосудов, подтверждением чего служит обнаруженный нами феномен плазмопропитывания и фибриноидного набухания сосудов внутренних органов. Наши данные согласуются с результатами Peters et al. (2004). которые исследовали несколько различных наночастиц (поливиниловых, Tio2, Sio2, Со, Ni), и обнаружили, что наночастицы Со вызывали токсичность в эндотелиальных клетках, которая сопровождалась образованием про-воспалительного цитокина IL8.

Другим важным вопросом является влияние наночастиц золота на систему крови. Мы в своем исследовании не ставили себе это конкретной целью, но все же мы получили свидетельства повышенного распада эритроцитов в форме усиленного накопление пигмента гемосидерина в селезенке. Кроме этого нами было проведено исследование уровня билирубина в сыворотке крови, и мы выявили умеренный подъем его содержания в нескольких временных точках (45 мин, 2 часа) после введения нанооболочек с нормализацией к 24 часам. Эти данные не согласуются со сведениями V. (2008), который смешивал раствор золотых наночастиц и образцы крови и анализировали смесь. По их данным после смешивания наблюдалась аккумуляция наночастиц в эритроцитах. Однако эти авторы не наблюдали значительного разрушения эритроцитов.

Мы в своем исследовании не проводили полного исследования влияния наночастиц золота на репродуктивную систему, однако, при изучении гистологических препаратов семенников в группе с хроническим пероральным введением мы обратили внимание на то, что единичные семенные канальцы были запустевшими, и в части канальцев отмечалось уменьшение клеточных слоев и нарушение процесса дифференцировки клеток. По нашему мнению это может служить свидетельством нарушения сперматогенеза при воздействии наночастиц золота, однако-в этой области необходимы более детальные исследования.

В литературе мы обнаружили только одну публикацию, касающуюся исследований сперматотоксичности золотых наночастиц. Авторы (\\^\уап^кЬ: V., Зегеетазрип А., Их^апаШапез И., 2009) изучали влияние 9-нм наночастиц золота на сперматозоиды человека. Через 15 мин после инкубации 25% сперматозоидов были не подвижны. Кроме этого авторы наблюдали проникновение наночастиц в головку и хвост и фрагментацию части сперматозоидов.

При изучении изменений процессов происходящих в опухоли при пероральном введении наночастиц золота при использовании стандартных гистологических окрасок не были обнаружены какие-либо изменения. В связи с этим мы решили проверить возможное влияние наночастиц золота на пролиферативную активность клеток опухоли с использованием иммуногистохимического метода. Однако, уровень экспрессии маркеров пролиферации РСЫА и Кл-67 не отличался от таковых в группе контроля.

Для изучения морфогенеза изменений развивающихся при внутривенном введении наночастиц золота был проведен эксперимент с забоем животных через определенные промежутки времени после внутривенного введения нанооболочек. Параллельно с морфологическим исследованием проводилось определение содержания золота во внутренних органах методом ААС.

При изучении морфогенеза патологических процессов в почках выявлено, что с течением времени прогрессирует дистрофия эпителия канальцев мозгового вещества, достигая максимального развития через 8 часов, однако через 24 часа степень ее становится умеренной. Дистрофия извитых канальцев была умеренная во всех временных точках. Был отмечен интересный феномен чередование во времени малокровия и полнокровия в капиллярных петлях клубочков и крупных сосудах. Мы полагаем, что это является подтверждением влияния нанооболочек на тонус, как сосудов микроциркуляторного русла, так и крупных сосудов. Со временем прогрессировала дольчатость клубочков, через 4 часа отмечалась их сегментация на 2-3 сегмента, которая сохранялась вплоть до 24 часов. Возможно, коллапс отдельных капиллярных петель также является отражением вазопатического действия крупных наночастиц. Биохимическое исследование уровня креатинина и мочевины показало их кратковременные колебания во времени, с нормализацией к 24 часам. При параллельном изучении динамики содержания золота в ткани почек нами выявлено увеличение его содержания от 2 часов до 24 часов. Мы считаем, что это отражает процесс постоянного выведения наночастиц из организма с мочей. Однако, плавная динамика накопления золота не коррелировала с обнаруженными изменчивыми во времени морфологическими изменениями.

Анализ морфологических изменений в печени показал, что кровенаполнение в сосудах также как и в почках, отличалось крайней нестабильностью, и колебалось от малокровия до умеренного полнокровия. Было обнаружено прогрессирование во времени дистрофии гепатоцитов (в течении первых 4 часов дистрофия носила умеренный характер, а начиная с 8 часов достигала выраженной степени). Функциональное состояние печени оценивалось с помощью изучения уровня аланинаминотрансферазы в крови.

При этом выявлен пик подъема фермента через 2 часа, с нормализацией уровня к 4 часам.

Содержание золота в печени максимально в первые 4 часа после введения нанооболочек, затем оно начинает снижаться, достигая минимума к 24 часам. Возможно, прогрессирование дистрофии гепатоцитов после 4 часов объясняется тем, что однажды вступив во взаимодействие с клеточными структурами, наночастицы запускают нарушения метаболизма, которые морфологически проявляются уже после того, как начинается выведение нанооболочек.

При изучении гистологических препаратов сердца обнаружили, что через 30 мин в сердце в большинстве случаев развивается выраженный отек стромы, и неравномерное кровенаполнение с сочетанием малокровия и умеренного полнокровия крупных сосудов. Через 45 мин выраженный отек стромы был выявлен во всех препаратах, и практически везде отмечалась нормализация кровенаполнения. Через 1 -1,5 часа полнокровие было умеренным или выраженным в сочетании с умеренным или выраженным отеком стромы. Через 4 часа отмечалось малокровие большинства сосудов и развитие умеренной зернистой дистрофии в кардиомиоцитах. Через 8 часов кровенаполнение было неравномерным, дистрофия кардиомиоцитов достигала выраженной степени. Через 24 часа отмечались как некротические, так и некробиотические изменения кардиомицитов.

При изучении морфогенеза изменений в селезенке нами выявлено постепенное прогрессирование полнокровия во времени с нарастанием количества гранул гемосидерина в красной пульпе. Количество визуализирующихся наночастиц было примерно одинаковым во всех временных точках. Золотые нанооболочки максимально накапливаются в селезенке в течение первых 8 часов после введения, затем их количество уменьшается, отражая процессы их выведения.

В легких изменения касались в основном кровенаполнения крупных и мелких сосудов, которое аналогично с другими органами колебалось во времени. Следует отметить, что, начиная с 2 часов, в ткани легких наблюдались единичные диапедезные кровоизлияния, с накоплением в них гранул гемосидерина и небольшого количества наночастиц.