Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему:Морфологические и иммуногистохимические особенности разных гистологических типов лейомиомы матки

На правах рукописи

Игнатова Виктория Евгеньевна

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАЗНЫХ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ТИПОВ ЛЕЙОМИОМЫ МАТКИ.

14.00.15. - патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва, 2005

Работа выполнена в Московской медицинской академии имени И.М. Сеченова

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Евгения Алтаровна Коган.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Г. А. Галил-Оглы доктор медицинских наук, профессор Л. В. Кактурский

Ведущая организация: Всероссийский онкологический научный центр

имени Н.Н.Блохина РАМН

Защита диссертации состоится «/¿Р» ¿¿¿РАСА* 2005г. В 14 часов на заседании диссертационного совета Д.208.040.01 при Московской медицинской академии имени И.М. Сеченова (119992, Москва, ул. Малая Трубецкая, д.8).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской медицинской академии имени И.М. Сеченова (Москва, Нахимовский пр., д.32).

Автореферат разослан 2005г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

В.А. Варшавский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность работы.

Лейомиома матки (Лм) - это истинная доброкачественная опухоль миометрия, что было доказано ее клинико-морфологическими особенностями и моноклональным происхождением (Towsend D.E., 1970). Распространенность Лм достигает 77% у женщин репродуктивного возраста, из них 15% Лм сочетается с гиперплазией эндометрия и 30 % - с аденомиозом (Бохман Я.В., 1995; Железное Б.И., Стрижаков А.Н., 1990). Лм может вызывать бесплодие, маточные кровотечения, нарушение функции тазовых органов и является одной из основных причин для гистерэктомии. Хирургическое лечение Лм признано основным патогенетически обоснованным методом лечения. По поводу Лм выполняется до 50-70 % оперативных вмешательств в гинекологических стационарах, из которых 60,9 - 95,5% приходится на радикальные операции, в том числе и в репродуктивном возрасте (2426,8%), когда предпочтительными должны быть органосохраняющие методы лечения. (Вихляева Е.М., Железное Б.И., Запорожан В.Н., 1997).

При выборе тактики лечения Лм в настоящее время практически не учитывается гистологический тип Лм. Одной из проблем является также то, что морфологические особенности Лм при гистологическом исследовании авторами оцениваются по-разному, в связи с чем в руководствах представлены различные классификации Лм. ВОЗ рекомендует выделять Лм, которую в русскоязычной литературе часто обозначают как простую или обычную Лм (Хмельницкий O.K., 1999), и ее гистологические варианты (клеточная, митотически активная, эпителиоидная,

миксоидная, атипическая Лм и липолейомиома и т.д.) (ВОЗ, 2003). Известно, что разные гистологические типы Лм обладают различным пролиферативным потенциалом, и вследствие этого могут требовать разного тактического подхода к лечению.

Механизмы роста и развития разных гистологических типов Лм сегодня изучены недостаточно. В то же время в литературе описана гормонозависимость Лм от эстрогенов и прогестеронов (Irwin J.C., 1991; Rein M.S., 1998; Wu J., 1995). В ряде работ установлена роль фактора роста фибробластов, сосудистого фактора роста, бета-трансформирующего фактора роста, тромбоцитарного фактора роста (ТцФР), эпидермального фактора роста (ЭФР), инсулиноподобного фактора роста 1 типа (ИПФР-1), фактора некроза опухолей и их регуляция гормонами в развитии и прогрессировании Лм (Anania В., 1998;. Guidice L.C., 1993; Kalmes A., 2000). В некоторых работах изучалась экспрессия онкомаркеров р53, Bcl-2, Bax, C-myc, Bad, маркеров пролиферации Ki67, PCNA, FAS рецептора и лиганда, уровень апоптоза в ткани Лм, прилежащего миометрия и эндометрия (Gao Z., 2002; Kevin D., 2000; Matsuo H., 1997). Однако остается неясным вопрос, с чем связан регресс Лм и каковы его молекулярные механизмы. В ранее проведенных исследованиях процессы клеточной гибели, гипертрофии и пролиферативная активность опухолевых клеток Лм не сопоставлялись, а апоптоз лейомиоцитов не изучался с учетом гистологического типа Лм (Shimomura Y., 1998; Vos S, 1994).

Целью настоящего исследования явилось изучение соотношения процессов пролиферации, гипертрофии и апоптоза лейомиоцитов, а также факторов их регулирующих, в разных гистологических типах Лм с использованием морфологического и иммуногистохимического анализа.

Для реализации цели поставлены следующие задачи:

1. Дать сравнительную морфологическую характеристику простой, клеточной и митотически активной Лм.

2. Изучить иммуногистохимию маркеров пролиферации (Ki67, PCNA), факторов роста (ЭФР, ЭФР-Р, ИПФР-1, ТцФР) и уровень экспрессии онкобелков (C-myc, Bcl-2) в простой, клеточной и митотически активной Лм.

3. Исследовать уровень апоптоза (ApopDETEK тест, экспрессию FAS рецепторов, Вах) в простой, клеточной и митотически активной Лм.

4. Сравнить соотношение процессов пролиферации, гипертрофии и апоптоза лейомиоцитов в простой, клеточной и митотически активной Лм.

5. Охарактеризовать механизмы увеличения размеров простой, клеточной и митотически активной Лм

Научная новизна.

В результате проведенного исследования показаны патогенетические и морфогенетические различия между простой, клеточной и митотически активной Лм. Установлено, что разные гистологические типы Лм характеризуются особенностями нарушения

процессов пролиферации, гипертрофии и апоптоза лейомиоцитов в опухолевых клетках, что обуславливает различия в механизмах их роста.

Простая Лм отличается преобладанием гипертрофии и апоптоза над их пролиферацией, что подтверждается высоким уровнем апоптоза (TUNEL-метод) и экспрессией проапоптотических факторов - Вах, Fas рецептора, на фоне низкой экспрессии маркеров пролиферации Ki67, PCNA и онкобелков С-тус и Вс1-2. Увеличение размеров такой опухоли, вероятно, является результатом ее вторичных изменений, а также пролиферации элементов стромы под влиянием ЭФР, ИПФР-1 и гипертрофии лейомиоцитов.

Клеточные Лм характеризовались самым низким уровнем апоптоза, экспрессией Вах и FAS рецептора среди всех типов Лм, на фоне средней экспрессии маркеров пролиферации Ki67, PCNA в опухолевых клетках. Тогда как уровни ЭФР и его рецептора, ИПФР-1 были максимальными по сравнению с другими типами Лм. Увеличение размеров клеточной Лм связано с выраженной гипертрофией и увеличением количества лейомиоцитов, вероятно, за счет удлинения срока их жизни.

Митотически активная Лм отличается преобладанием процессов пролиферации над апоптозом опухолевых клеток за счет высокого уровня Ki67, PCNA, C-myc, Bcl-2, ЭФР, ИПФР-1, особенно в клетках периваскулярных зон, что и является основным условием роста данной опухоли. Стромообразование, гипертрофия лейомиоцитов и удлинение сроков их жизни также могут вносить вклад в увеличение размеров митотически активной Лм.

Важную роль в механизме роста Лм играют стромально-паренхиматозные взаимоотношения. Было отмечено, что разные гистологические типы Лм отличаются составом и количеством стромы. В простой Лм обнаруживается зрелая по составу строма с преобладанием коллагеновых волокон и клеток фибробластического ряда, для которой характерны вторичные изменения. В клеточной Лм строма представлена соединительной тканью с небольшим количеством коллагеновых волокон и сосудов. В митотически активной Лм количество стромы меньше по сравнению с паренхимой, она менее зрелая, с признаками неоангиогенеза и наличием «зон роста» клеток фибробластического ряда и лейомиоцитов вокруг сосудов.

Было отмечено, что при сочетании Лм с аденомиозом и гиперплазией эндометрия происходит усиление процессов пролиферации в опухолевых клетках по ауто- и паракринному механизмам.

Данные морфологического и иммуногистохимического исследований позволили выделить группу основных патологических процессов, участвующих в росте Лм: гипертрофию, пролиферацию и апоптоз лейомиоцитов, стромообразование, а также вторичные изменения в опухолях. В разных типах Лм соотношение этих процессов различно. При этом усиление экспрессии ЭФР, ИПФР-1 приводит не столько к усилению пролиферации лейомиоцитов сколько к их гипертрофии.

Полученные результаты, показали, что при митотически активных и клеточных Лм, особенно при субмукозной локализации

опухоли, обильные кровотечения встречаются чаще, чем при простых Лм. При этом экспрессия гепарин-связанных факторов роста в них выше, чем в простой Лм, что, вероятно, может способствовать не только неоангиогенезу в ткани Лм и в эндометрии, но и местной гипокоагуляции, что приводит к обильным кровотечениям.

Практическая значимость работы.

Результаты исследования могут быть использованы при определении тактики ведения больных с лейомиомой и определения прогноза заболевания. Полученные данные могут служить патогенетической базой для создания органосохраняющего лечения, особнно у женщин репродуктивного возраста, направленного на ингибицию ангиогенеза, пролиферации, гипертрофии лейомиоцитов и усиления в них апоптоза.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Простая, клеточная и митотически активная Лм отличаются морфологическими особенностями строения и механизмами роста. Основные патологические процессы, участвующие в росте Лм это: пролиферация, гипертрофия и апоптоз лейомиоцитов, стромообразование и вторичные изменения в опухоли. В разных типах Лм соотношение этих процессов различно.

2. Рост Лм связан с экспрессией факторов роста (ИПФР-1, ЭФР, ТцФР), онкопротеинов C-myc, Bd-2, которые, судя по низкой экспрессии маркеров пролиферации Ю67 и

PCNA, подтверждающих доброкачественный характер опухоли, приводят не столько к пролиферации лейомиоцитов, сколько к их гипертрофии. Максимальный уровень маркеров пролиферации наблюдается в митотически активной Лм и определяет рост данного типа опухоли.

3. Разные гистологические типы лейомиом характеризуются особенностями апоптоза в клетках опухоли. Самый высокий уровень апоптоза лейомиоцтов выявляется в простой Лм. Наименьший уровень апоптоза - в клеточных и митотически активных Лм, что может способствовать удлинению жизни лейомиоцитов и в сочетании с относительно высокой пролиферацией накоплению клеток и росту опухоли.

4. Соотношение процессов пролиферации и апоптоза в простой, клеточной и митотически активной Лм различно, что позволяет сделать вывод о разных механизмах их роста. Увеличение размеров простой Лм, является результатом не только пролиферации опухолевых клеток, но и их гипертрофии под влиянием ЭФР, ИПФР-1, а также пролиферации элементов стромы и ее вторичных изменений. Рост клеточной Лм связан с гипертрофией и увеличением количества лейомиоцитов, вероятно, за счет удлинения срока их жизни на фоне относительно низкого уровня апоптоза. Митотически активная Лм

отличается преобладанием процессов пролиферации над апоптозом опухолевых клеток, за счет высокого уровня Ю67, РСМЛ С-тус, Вс1-2, ЭФР, ИПФР-1, особенно в клетках периваскулярных зон, что и является основным условием роста данной опухоли.

Внедрение результатов в практику.

Результаты исследований используются при чтении лекций и проведении практических занятий со студентами по темам: «Повреждение и гибель клеток и тканей», «Процессы адаптации», «Мезенхимальные опухоли» на кафедре патологической анатомии ММА им. И.М. Сеченова, а также в лечебно-диагностической работе в клиниках ММА им. И.М. Сеченова.

Апробация работы.

Апробация работы проведена 15 декабря 2004 года на заседании кафедры патологической анатомии ММА им. И.М.Сеченова. Результаты работы были доложены на 7 конгрессе Европейского общества клеточной патологии (апрель, 2001г., Франция), на конференции молодых ученых «Татьянин день» (январь, 1999г., Москва).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 6 работ, из них статей в центральных журналах - 1, тезисов в материалах научных конференций - 4 и публикаций в зарубежных'изданиях -1.

Объем н структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, трех глав (обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения), заключения, выводов и списка изпользованной литературы. Текст диссертации изложен на 130 страницах машинописного текста, иллюстрирован 4 таблицами и 29 рисунками, в том числе цветным и монтажами микрофотографий. Библиографический указатель включает 119 источников.

Содержание работы.

Материал и методы исследования.

Исследование проводилось на операционном материале (всего 75 наблюдений) кафедр акушерства и гинекологии лечебного факультета (зав. каф. - проф. Н.М. Побединский) и факультета последипломного образования на базе ГКБ № 40 (зав. каф. - член-кор. РАМН, д.м.н., проф. И.С. Сидорова) ММА им. И.М.Сеченова. По возрасту больные были разделены на 2 группы: 33 пациентки доменопаузального (от 18 до 51 года) и 32 женщины постменопаузального возраста (от 52 до 76 лет)(табл.1). Большинство больных (40 женщин) предъявляли жалобы на обильные и длительные менструации, приводящие к развитию посттеморрагической анемии. Сравнивались группы пациенток, у которых был отмечен быстрый рост миоматозных узлов, то есть увеличение размеров матки на 5 недель беременности менее чем за один год наблюдения, с группой без отмеченного роста. В 30 случаях у пациенток была диагностирована только Лм, у 11 женщин - в сочетании с гиперплазированным эндометрием, в 10 наблюдениях Лм сочеталась с аденомиозом и с гиперплазированным эндометрием; у 14

пациенток Лм сочеталась только с аденомиозом. В контрольную группу вошли 6 пациентов с изолированным аденомиозом и 4 пациентки с выпадением матки без патологии эндометрия и миометрия.

Таблица 1.

Характеристика материала исследования.

№ Группы Количество пациенток

сравнения Доменопаузаль-ного возраста (18-51 год) Постменопаузального возраста (51-76 лет) Всего

1 Простая Лм 6 18 24

2 Клеточная Лм 12 10 22

3 Митотически активная Лм 15 4 19

4 Контрольная группа 4 6 10

Всего 37 38 75

Изучался макропрепарат (удаленная матка и миоматозные узлы). Из каждой опухоли вырезалось от 2 до 5 кусочков, кроме того, исследовался прилежащий миометрий и ткань эндометрия. Проводилось гистологическое исследование парафиновых срезов с окрасками гематоксилином и эозином и пикрофуксином по Ван Гизону. Гипертрофия лейомиоцитов оценивалась по сопоставлению их размеров с размерами лимфоцитов, обнаруживаемых в препарате. Иммуногистохимические реакции ставились по общепринятой

методике с демаскировкой антигенов в СВЧ печи на серийных парафиновых срезах из лейомиоматозных узлов, миометрия и эндометрия женщин. В качестве первичных специфических антител использовались моноклональные антитела к Bcl-2 (DAKO), к Вах (Calbiochem), к C-myc (NOVOCASTRA), PCNA (NOVOCASTRA), ЭФР (Santa Cruz Biotechnology), ЭФР-Р (Santa Cruz Biotechnology), ТцФР (Calbiochem), Fas рецептор (DIANOVA), к Ki67 (DIANOVA), и моноспецифических сывороток ИПФР-1 (Pepro Tech EC LTD). При работе с антителами были подобраны рабочие концентрации: первичные антитела Вс1-2, Вах 1:80; C-myc, PCNA, ЭФР, ЭФР-Р, ТцФР, ИПФР-1 1:100; Ki67, FAS 1:50; вторичные антитела: мышинные 1:200. В качестве вторичных антител и визуализирующей системы применялся стрептавидиновый комплекс (LSAB KIT (DAKO)). Ставился отрицательный контроль реакции на срезах без специфических первичных антител. В качестве положительного контроля использовался мелкоклеточный рак легкого человека (с известной экспрессией маркеров). Результаты иммуногистохимических реакции для Вах, Bcl-2, C-myc, ЭФР, ЭФР-Р, ТцФР, ИПФР-1 оценивались в баллах полуколичественным методом по проценту окрашенных клеток. Оценка экспрессии Ki67 и PCNA проводилась путем подсчета процента окрашенных ядер на 3000 клеток. Апоптоз оценивали с помощью Tunel-метода in situ labeling hybridization (ENZO ApopDETEK Cell Death Assay System). Результаты апоптоза оценивались по проценту выявленных апоптозных телец на 3000 клеток с вычислением среднего арифметического и стандартного отклонения.

Проводился статистический анализ полученных результатов. Среднеквадратическая (стандартная) ошибка и доверительные интервалы средних арифметических величин оценивались по таблицам Р.Б. Стрелкова (1999г.). Уровень значимости доверительного интервала был взят р=0,05, при котором степень достоверности воспроизведения оцениваемого явления равняется 95%. Проводился корреляционный анализ с вычислением коэффициента корреляции.

Результаты собственных исследований.

Проведено сравнительное исследование клинических, морфологических и иммуногистохимических особенностей простой, клеточной и митотически активной Лм.

Для установления гистологического типа Лм нами использовалась рекомендации ВОЗ 2003 г., где выделяется классическая Лм, которая в русскоязычной литературе часто обозначается как простая или обычная Лм, и ее гистологические варианты (клеточная, митотически активная, эпителиоидная, миксоидная, атипическая Лм и липолейомиома и т.д.)(табл. 1).

Простая Лм представлена хаотично переплетающимися короткими пучками гладкомышечных клеток с выраженными прослойками зрелой соединительной ткани, содержащей большое количество коллагенновых волокон. Лейомиоциты имеют вытянутую веретенообразную форму и более крупные размеры (гипертрофированы), по сравнению с миометрием контрольных групп. Строма представлена в основном фиброцитами и фибробластами, а также небольшим количеством сосудов, часто со

склерозированными стенками. Нередко отмечаются

микроскопические признаки вторичных изменений - отека, некроза и гиалиноза. Из 24 простых Лм рост отмечен в 12 случаях, в которых обнаруживается богатая строма и особенно выражены вторичные изменения.

Клеточные Лм построены из плотно расположенных и плохо контурируемых пучков гипертрофированных лейомиоцитов с большими гиперхромными ядрами вытянутой формы и слабо выраженной незрелой стромы. Строма опухоли в основном содержит сосуды и тонкие соединительно-тканные септы. Признаки атипизма клеток и фигуры митозов отсутствуют. Из 22 клеточных Лм рост отмечен в 11, ив них особенно выражены гипертрофия клеток и гиперклеточность. Проведенный анализ показал, что гипертрофия лейомиоцитов в клеточных Лм больше выражена, чем в других типах Лм, а также по сравнению с прилежащим миометрием.

Митотически активная Лм характеризуется наличием гипертрофированных лейомиоцитов и незрелой сосудистой стромы. В отличие от простой и клеточной Лм встречались фигуры митоза 510 в 10 полях зрения при большом увеличении (х400). При этом митотическая активность носит очаговый характер и выявляется в виде отдельных очагов пролиферации, локализованных, как правило, вокруг сосудов синусоидного типа, так называемых «зон роста», в которых хорошо различима только эндотелиальная выстилка, а мышечный и адвентициальный слои преобразованы в клеточные скопления (периартериолярные клеточные муфты).

В 1 возрастной группе (пременопаузы) преобладали митотически активные Лм (80%), во 2 возрастной группе

(постменопаузы) преобладали простые Лм (77%). Клеточные Лм встречались как в 1 (45%) так во 2 (55%) группах. Простые Лм были представлены в основном субсерозными и интрамуральными узлами, клеточные Лм - узлами различной локализации, митотически активные Лм - субмукозными узлами. В 30 Лм был отмечен быстрый рост опухоли. Количество узлов Лм в матке не имело корелляционной связи с гистологическим типом Лм.

Результаты морфологического исследования показали, что рост Лм может осуществляться за счет гипертрофии лейомиоцитов, пролиферации и апоптоза лейомиоцитов, а также стромообразования и вторичных изменений, накопления и удлинения жизни лейомиоцитов. В разных типах Лм соотношение этих процессов различно.

Увеличение размеров простой Лм происходит не столько за счет пролиферации лейомиоцитов, сколько за счет гипертрофии, и, в большей степени, стромообразования и вторичных изменений в опухоли. Строма простой Лм может считаться зрелой, так как содержит элементы зрелой соединительной ткани с большим количеством интерстициального коллагена. Эти данные согласуются с результатами исследований Г.И. Брехмана, А.А. Миронова (1986), которые объясняли, что коллагеновые волокна сдавливают капилляры, в результате чего происходит нарушение микроциркуляции, нарастание тканевой гипоксии и отек.

Процесс гипертрофии наиболее выражен в клеточных Лм. Высокая клеточность в клеточных Лм, вероятно, обусловлена накоплением клеток и удлинением их жизни.

Увеличение массы митотически активной Лм происходит за счет повышения пролиферативной активности клеток «зон роста» -

перицитов, фибробластоподобных клеток и единичных миоцитов вне сосудов, а также гипертрофии лейомиоцитов.

Пролиферативная активность по Ю67 и PCNA была невысока и отмечалась в основном в митотически активных и меньше в клеточных Лм (р=0,05) (рис.1а,б). При этом пролиферирующие клетки в основном располагались в периваскулярных зонах в основном в подкапсулярной зоне узла Лм. Следует отметить о несоответствии между количеством митотических фигур и уровнем маркеров пролиферации. В литературе этот факт объясняется тем, что клетки вступают в S фазу митотического цикла, который прерывается или растягивается во времени. И результатом такого незавершенного митоза могут быть многоядерные клетки или гипертрофированные клетки с очень крупным ядром. Учитывая локализацию Ю67 и PCNA положительных клеток можно предположить, что источником роста Лм являются очаги пролиферации из периадвентициальной ткани сосудов синусоидного типа («зон роста»), клетки которой обладают выраженной потенцией к дифференцировке в фибро- и миобласты, что подтверждается данными литературы. Различия уровней экспрессии С-тус и Вс1-2 в разных гистологических типах Лм, можно сделать вывод, что в простых Лм С-тус способствует апоптозу при относительно низком уровне Вс1-2, а в митотически активных и клеточных Лм -делению клеток при высокой экспрессии Вс1-2 (рис. 1г,д). В митотически активной и клеточной Лм имеется тенденция к повышению содержания ЭФР и его рецептора, ТцФР и ИПФР-1 по сравнению с простой Лм. При этом во всех гистологических типах Лм содержание факторов роста выше, чем в окружающем миометрии (р=0,05) (рис. 1 е,ж,з,и).

Полученные результаты о низкой пролиферативной активности опухолевых клеток в простой и клеточной Лм ставит вопрос, за счет каких процессов увеличивается размер опухоли под действием факторов роста. Проведенное нами исследование показало, что высокое содержание факторов роста в тканях Лм сочетается с развитием гипертрофии лейомиоцитов, что особенно выражено в клеточных Лм. Из литературы известно, что ЭФР, ИПФР-1 и ТцФР вызывают гипертрофию гладкомышечных клеток (Ь. УМег^етеп, 1997; М. Регге1а, 1994). На основании полученных нами данных и анализа литературы можно высказать предположение о влиянии факторов роста не только на миграцию и пролиферацию гладкомышечных клеток в Лм, но и, в большей степени, на их гипертрофию. Экспрессия ЭФР и ЭФР-Р, ТцФР и ИПФР-1 лейомиоцитами, а также клетками «зон роста» может свидетельствовать о существовании ауто- и паракринных механизмов регуляции гипертрофии клеток в Лм.

Таким образом в митотически активной Лм факторы роста способствуют пролиферации лейомиоцитов, которая сочетается с их гипертрофией, в клеточной - выраженной гипертрофии лейомиоцитов на фоне низкой пролиферативной активности, а в простой - пролиферации фибробластов и гипертрофии лейомиоцитов на фоне очень низкой пролиферативной активности.

Рис. 1. Молекулярно-биологические показатели пролиферации в разных гистологических типах Лм.

Полученные результаты, показали, что при митотически активных и клеточных Лм обильные кровотечения встречаются чаще, чем при простых Лм (Табл. 2).

Таблица 2.

Количество пациенток с кровотечениями в группах с разными гистологическими типами Лм.

№ Группы сравнения Количество пациенток с кровотечениями Всего

1 Простая 5(21%) 24(100%)

2 Клеточная 18(82%) 22(100%)

3 Митотически активная 17(89%) 19(100%)

4 Контрольная группа - 10

Всего 40(53%) 75(100%)

При этом апоптоз и экспрессия гепаринсвязывающих факторов роста в них выше, чем в простой Лм (рис. 1е,ж,и; 2а). Поэтому можно высказать предположение, что ЭФР, ТцФР не только способствуют неоангиогенезу в ткани Лм и в эндометрии, но и, вероятно, за счет повышения количества связанного гепарина, создают условия для местной гипокоагуляции, что приводит к обильным кровотечениям.

В результате проведенных исследований, установлено, что в разных гистологических типах Лм отличался и уровень апоптоза (рис. 2а). В клеточной и мистически активной Лм наблюдалось

достоверное снижение уровня апоптоза по сравнению с простой (р<0,05), тогда как в простой Лм отмечается наоборот, повышение апоптоза. Вероятно, повышение уровня апоптоза в простых Лм может объяснить их регресс. Снижение уровня апоптоза по сравнению с пролиферацией в митотически активных и клеточных Лм, по всей видимости, играет большую роль, наоборот, в их росте, за счет накопления опухолевых клеток. Полученные результаты согласуются с данными литературы, где указывается, что уровень апоптоза снижается при действии факторов роста, что, по всей видимости, и происходит в клеточных и митотически активных Лм.

Наши результаты показали, что экспрессия FAS рецептора в тканях Лм невысока и в разных типах уровни FAS рецептора различны. Имелась тенденция к более высоким показателям в простой Лм по сравнению с клеточной и митотически активной (рис. 2в).

Как показало проведенное нами исследование, экспрессия Вах отражает тенденцию к повышению апоптоза в простой Лм, и его снижении в клеточной и митотически активной Лм (рис. 26). Учитывая невысокую экспрессию Вс1-2 белка по сравнению с Вах в простых Лм, можно предположить, что в данном типе Лм довольно активно происходят процессы апоптоза, поэтому в них возможен регресс. Увеличение размеров простых Лм обусловлено в значительной мере вторичными изменениями и стромообразованием. В митотически активных Лм на фоне сниженной экспрессии Вах и высоким уровнем Вс1-2 и факторов роста, имеется нарушение регуляции апоптоза. Учитывая также наиболее активные по сравнению с другими типами Лм процессы пролиферации, можно предположить, что основную

роль в росте митотически активных Лм играет нарушение соотношения процессов пролиферации и апоптоза в пользу пролиферации. Тогда как в клеточных Лм уровень апоптоза по Вах самый низкий по сравнению с другими типами, уровень пролиферации ниже, чем в митотически активных Лм, и довольно высокий уровень факторов роста. Это подтверждает, что рост клеточных Лм происходит главным образом за счет гипертрофии лейомиоцитов.

Полученные результаты показали, что соотношение процессов пролиферации и апоптоза в простой, клеточной и митотически активной Лм различно. В простой Лм пролиферативная активность в лейомиоцитах была наименьшая, а уровень апоптоза максимальный по сравнению с клеточной и митотически активной Лм. Уровень апоптоза в клеточной Лм был наименьший, а пролиферации - средний по сравнению с простой и митотически активной Лм. Максимальная пролиферативная активность отмечалась в митотически активной Лм на фоне среднего уровня апоптоза.

При этом в простой Лм апоптоз значительно преобладает над пролиферацией, тогда как в митотически активной Лм пролиферативная активность лейомиоцитов сравнительно выше, чем апоптоз. В клеточной Лм имеется незначительное преобладание пролиферации над апоптозом.

Следовательно, разные гистологические типы Лм характеризуются особенностями нарушения процессов пролиферации и апоптоза в опухолевых клетках, что обуславливает различия в механизмах их роста.

□ контроль В Простая □ Клеточная В Миготчаски активная

Рис. 2. Молекулярно-биологические показатели апоптоза, Вах и FAS в разных гистологических типах Лм.

Таким образом, простая, клеточная и митотически активная Лм отличаются не только морфологическими особенностями, но и механизмами роста (рис. 3).

Рисунок 3. Механизмы роста простой, клеточной и митотически активной Лм.

Простая Лм характеризуется низкой пролиферативной активностью лейомиоцитов в сочетании с их гипертрофией и высоким уровнем апоптоза. Увеличение размеров простой Лм, вероятно, происходит за счет процессов гипертрофии, усиления стромообразования и вторичных изменений в опухоли. Относительно повышенный апоптоз в Лм свидетельствует о возможном регрессе опухоли.

Клеточная Лм характеризуется незначительным преобладанием процессов пролиферации опухолевых клеток над апоптозом. Увеличение размеров клеточной Лм связано с пролиферацией и гипертрофией лейомиоцитов, а также с их накоплением за счет удлинения сроков их жизни на фоне сниженного апоптоза.

Митотически активная Лм отличается значительным преобладанием процессов пролиферации над апоптозом опухолевых клеток, что и является основным условием роста данной опухоли. Стромообразование, гипертрофия лейомиоцитов и удлинение сроков их жизни также могут вносить вклад в увеличение размеров митотически активной Лм.

Выводы.

1. Разные гистологические типы Лм характеризуются патогенетическими и морфологическими особенностями, вследствие изменения соотношения процессов пролиферации и апоптоза в опухолевых клетках, что обуславливает различия механизмов их роста.

2. Данные морфологического и иммуногистохимического исследований позволили выделить группу основных патологических процессов, участвующих в росте Лм: пролиферацию, гипертрофию и апоптоз лейомиоцитов, а также стромообразование и вторичные изменения.

3. Рост Лм связан не только с пролиферацией, но и с гипертрофией лейомиоцитов, возникающих под действием факторов роста (ИПФР-1, ЭФР, ТцФР), онкопротеинов C-myc, Bd-2.

4. Простая Лм отличается преобладанием апоптоза над пролиферацией в лейомиоцитах. Увеличение размеров такой опухоли, вероятно, является результатом не только пролиферации опухолевых клеток, но и их гипертрофии под влиянием ЭФР, ИПФР-1, а также пролиферации элементов стромы и ее вторичных изменений.

5. Клеточная Лм характеризуется незначительным преобладанием процессов пролиферации опухолевых клеток над апоптозом. Увеличение размеров клеточной Лм связано с пролиферацией и гипертрофией лейомиоцитов, а также с их накоплением за счет удлинения сроков их жизни на фоне сниженного апоптоза.

6. Митотически активная Лм отличается значительным преобладанием процессов пролиферации над апоптозом опухолевых клеток, что и является основным условием роста данной опухоли.

Стромообразование, гипертрофия лейомиоцитов и удлинение сроков их жизни также могут вносить вклад в увеличение размеров митотически активной Лм.

7. Важную роль в механизме роста Лм играют стромально-паренхиматозные взаимоотношения. Было отмечено, что разные гистологические типы Лм отличаются составом и количеством стромы. В простой Лм - наиболее зрелая по составу строма с преобладанием коллагеновых волокон и клеток фибробластического ряда, что способствует развитию вторичных изменений. В клеточной Лм строма представлена в виде сосудов с незначительным количеством коллагеновых волокон, что способствует гипертрофии гладкомышечных клеток. В митотически активной Лм количество стромы меньше по сравнению с паренхимой и она менее зрелая с признаками ангиогенеза в виде «зон роста», которые и играют ключевую роль в росте данного типа Лм.

8. При митотически активных и клеточных Лм обильные кровотечения встречаются чаще, чем при простых Лм, что обусловлено более высоким накоплением в них гепаринсвязывающих факторов роста, вызывающих неоангиогенез и, вероятно, местную гипокоагуляцию.

9. При сочетании Лм с аденомиозом и гиперплазией эндометрия происходит усиление процессов пролиферации опухолевых клеток различных гистологических типов Лм.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Тугусова В.Е. Апоптоз и пролиферация при эндометриозе.//Материалы конференции Российского конкурса на лучшую научную работу студентов 1999 г. По разделу «Медицинские науки». -Москва, 2000, стр. 90-91.

2. Сидорова И.С., Коган ЕА, Унанян А.Л., Демура С.А., Тугусова В.Е. Соотношение ингибиторов и индукторов апоптоза и пролиферации в морфо- и патогенезе внутреннего эндометриоза и лейомиомы матки.// Журнал Медицинской Науки Армении. -Ереван, 2000, Том XL № 4, стр. 82-88

3. Сидорова И.С., Коган ЕА, Унанян А.Л., Демура С.А., Тугусова В.Е. Соотношение ингибиторов и индукторов апоптоза в морфо- и в патогенезе лейомиомы матки у больных с сочетанной патологией.// Материалы пленума Российской ассоциации врачей акушеров и гинекологов. - Ижевск, 2000, стр. 240-244

4. Tougoussova V Correlation between the process of cell proliferation and appoptosis in adenomyosis. //Analytical Cellular Pathology. -2001.-Vol. -22. № 1,2.-P.29.

5. Сидорова И.С., Коган ЕА., Унанян А.Л., Демура С.А., Тугусова В.Е. Сочетание миомы матки с внутренним эндометриозом. Клинико-морфологические особенности сочетанной патологии. // Материалы V Российского форума «Мать и дитя». - Москва, 2003.

6. Сидорова И.С., Коган ЕА, Унанян А.Л., Демура СА, Тугусова В.Е. Молекулярные механизмы в патогенезе развивающейся миомы матки (особенности пролиферации, апоптоза, антиогенеза и стромообразования). // Материалы V Российского форума «Мать и дитя». - Москва, 2003.

Отпечатано в ООО «Копиринг» Заказ.№2612 Тираж 100 экз.

V "

19 МАЙ ?005

Актуальность работы.

Лейомиома матки (Лм) - это истинная доброкачественная опухоль миометрия, что было доказано ее клинико-морфологическими особенностями и моноклональным происхождением (Towsend D.E., 1970). Распространенность Лм достигает 77% у женщин репродуктивного возраста, из них 15% Лм сочетается с гиперплазией эндометрия и 30 % - с аденомиозом (Бохман Я.В., 1995; Железнов Б.И., Стрижаков А.Н., 1990). Лм может вызывать бесплодие, маточные кровотечения, нарушение функции тазовых органов и является одной из основных причин для гистерэктомии. Хирургическое лечение Лм признано основным патогенетически обоснованным методом лечения. По поводу Лм выполняется до 50-70 % оперативных вмешательств в гинекологических стационарах, из которых 60,9 - 95,5% приходится на радикальные операции, в том числе и в репродуктивном возрасте (24-26,8%), когда предпочтительными должны быть органосохраняющие методы лечения (Вихляева Е.М., Железнов Б.И., Запорожан В.Н., 1997).

При выборе тактики лечения Лм в настоящее время практически не учитывается гистологический тип Лм. Одной из проблем является то, что морфологические особенности Лм при гистологическом исследовании авторами оцениваются по-разному, в связи с чем в руководствах представлены различные классификации Лм. ВОЗ рекомендует выделять Лм, которую в русскоязычной литературе часто обозначают как простую или обычную Лм (Хмельницкий O.K., 1999), и ее гистологические варианты (клеточная, митотически активная, эпителиоидная, миксоидная, атипическая Лм и липолейомиома и т.д.) (ВОЗ, 2003). Известно, что разные гистологические типы Лм обладают различным пролиферативным потенциалом, и вследствие этого могут требовать разного тактического подхода к лечению.

Механизмы роста и развития разных гистологических типов Лм сегодня изучены недостаточно. В то же время в литературе описана гормонозависимость Лм от эстрогенов и прогестеронов (Irwin J.C., 1991; Rein M.S., 1998; Wu J., 1995). В ряде работ установлена роль фактора роста фибробластов, сосудистого фактора роста, бета-трансформирующего фактора роста, тромбоцитарного фактора роста (ТцФР), эпидермального фактора роста (ЭФР), инсулиноподобного фактора роста 1 типа (ИПФР-1), фактора некроза опухолей и их регуляция гормонами в развитии и прогрессировании Лм (Anania В., 1998;. Guidice L.C., 1993; Kalmes А., 2000). В некоторых работах изучалась экспрессия онкомаркеров р53, Bcl-2, Вах, С-myc, Bad, маркеров пролиферации Ki67, PCNA, FAS рецептора и лиганда, уровень апоптоза в ткани Лм, прилежащего миометрия и эндометрия (Gao Z., 2002; Kevin D., 2000; Matsuo H., 1997). Однако остается неясным вопрос, с чем связан регресс Лм и каковы его молекулярные механизмы. В ранее проведенных исследованиях процессы клеточной гибели, гипертрофии и пролиферативная активность опухолевых клеток Лм не сопоставлялись, а апоптоз лейомиоцитов не изучался с учетом гистологического типа Лм (Shimomura Y., 1998; Vos S, 1994).

Целью настоящего исследования явилось изучение соотношения процессов пролиферации, гипертрофии и апоптоза лейомиоцитов, а также факторов их регулирующих, в разных гистологических типах Лм с использованием морфологического и иммуногистохимического анализа.

Для реализации цели поставлены следующие задачи: 1. Дать сравнительную морфологическую характеристику простой, клеточной и митотически активной Лм.

2. Изучить иммуногистохимшо маркеров пролиферации (Ki67, PCNA), факторов роста (ЭФР, ЭФР-Р, ИПФР-1, ТцФР) и уровень экспрессии онкобелков (C-myc, Вс1-2) в простой, клеточной и митотически активной Лм.

3. Исследовать уровень апоптоза (ApopDETEK тест, экспрессию FAS рецепторов, Вах) в простой, клеточной и митотически активной Лм.

4. Сравнить соотношение процессов пролиферации, гипертрофии и апоптоза лейомиоцитов в простой, клеточной и митотически активной Лм.

5. Охарактеризовать механизмы увеличения размеров простой, клеточной и митотически активной Лм

Научная новизна.

В результате проведенного исследования показаны патогенетические и морфогенетические различия между простой, клеточной и митотически активной Лм. Установлено, что разные гистологические типы Лм характеризуются особенностями нарушения процессов пролиферации, гипертрофии и апоптоза лейомиоцитов в опухолевых клетках, что обуславливает различия в механизмах их роста.

Простая Лм отличается преобладанием гипертрофии и апоптоза лейомиоцитов над их пролиферацией, что подтверждается высоким уровнем апоптоза (TUNEL-метод) и экспрессией проапоптотических факторов - Вах, Fas рецептора, на фоне низкой экспрессии маркеров пролиферации Ki67, PCNA и онкобелков C-myc и Вс1-2. Увеличение размеров такой опухоли, вероятно, является результатом ее вторичных изменений, а таюке пролиферации элементов стромы под влиянием ЭФР, ИПФР-1 и гипертрофии лейомиоцитов.

Клеточные Лм характеризовались самым низким уровнем апоптоза, экспрессией Вах и FAS рецептора среди всех типов Лм, на фоне средней экспрессии маркеров пролиферации Ki67, PCNA в опухолевых клетках. Тогда как уровни ЭФР и его рецептора, ИПФР-1 были максимальными по сравнению с другими типами Лм. Увеличение размеров клеточной Лм связано с выраженной гипертрофией и увеличением количества лейомиоцитов, вероятно, за счет удлинения срока их жизни.

Митотически активная Лм отличается преобладанием процессов пролиферации над апоптозом опухолевых клеток за счет высокого уровня Ki67, PCNA, С-шус, Bcl-2, ЭФР, ИПФР-1, особенно в клетках периваскулярных зон, что и является основным условием роста данной опухоли. Стромообразование, гипертрофия лейомиоцитов и удлинение сроков их жизни также могут вносить вклад в увеличение размеров митотически активной Лм.

Важную роль в механизме роста Лм играют стромально-паренхиматозные взаимоотношения. Было отмечено, что разные гистологические типы Лм отличаются составом и количеством стромы. В простой Лм обнаруживается зрелая по составу строма с преобладанием коллагеновых волокон и клеток фибробластического ряда, для которой характерны вторичные изменения. В клеточной Лм строма представлена соединительной тканью с небольшим количеством коллагеновых волокон и сосудов. В митотически активной Лм количество стромы меньше по сравнению с паренхимой, она менее зрелая, с признаками неоангиогенеза и наличием «зон роста» клеток фибробластического ряда и лейомиоцитов вокруг сосудов.

Было отмечено, что при сочетании Лм с аденомиозом и гиперплазией эндометрия происходит усиление процессов пролиферации в опухолевых клетках по ауто- и паракринному механизмам.

Данные морфологического и иммуногистохимического исследований позволили выделить группу основных патологических процессов, участвующих в росте Лм: гипертрофию, пролиферацию и апоптоз лейомиоцитов, стромообразование, а также вторичные изменения в опухолях. В разных типах Лм соотношение этих процессов различно. При этом усиление экспрессии ЭФР, ИПФР-I приводит не столько к усилению пролиферации лейомиоцитов сколько к их гипертрофии.

Полученные результаты, показали, что при митотически активных и клеточных Лм, особенно при субмукозной локализации опухоли, обильные кровотечения встречаются чаще, чем при простых Лм. При этом экспрессия гепарин-связанных факторов роста в них выше, чем в простой Лм, что, вероятно, может способствовать не только неоангиогенезу в ткани Лм и в эндометрии, но и местной гипокоагуляции, что приводит к обильным кровотечениям.

Практическая значимость работы.

Результаты исследования могут быть использованы при определении тактики ведения больных с лейомиомой и определения прогноза заболевания. Полученные данные могут служить патогенетической базой для создания органосохраняющего лечения, особнно у женщин репродуктивного возраста, направленного на ингибицию ангиогенеза, пролиферации, гипертрофии лейомиоцитов и усиления в них апоптоза.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Простая, клеточная и митотически активная Лм отличаются морфологическими особенностями строения и механизмами роста. Основные патологические процессы, участвующие в росте Лм это: пролиферация, гипертрофия и апоптоз лейомиоцитов, стромообразование и вторичные изменения в опухоли. В разных типах Лм соотношение этих процессов различно.

2. Рост Лм связан с экспрессией факторов роста (Ш1ФР-1, ЭФР, ТцФР), онкопротеинов C-myc, Вс1-2, которые, судя по низкой экспрессии маркеров пролиферации Ki67 и PCNA, подтверждающих доброкачественный характер опухоли, приводят не столько к пролиферации лейомиоцитов, сколько к их гипертрофии. Максимальный уровень маркеров пролиферации наблюдается в митотически активной Лм и определяет рост данного типа опухоли.

3. Разные гистологические типы лейомиом характеризуются особенностями апоптоза в клетках опухоли. Самый высокий уровень апоптоза лейомиоцтов выявляется в простой Лм. Наименьший уровень апоптоза - в клеточных и митотически активных Лм, что может способствовать удлинению жизни лейомиоцитов и в сочетании с относительно высокой пролиферацией накоплению клеток и росту опухоли.

4. Соотношение процессов пролиферации и апоптоза лейомиоцитов в простой, клеточной и митотически активной Лм различно, что позволяет сделать вывод о разных механизмах их роста. Увеличение размеров простой Лм, является результатом не только пролиферации опухолевых клеток, но и их гипертрофии под влиянием ЭФР, ИПФР-1, а также пролиферации элементов стромы и ее вторичных изменений. Рост клеточной Лм связан с гипертрофией и увеличением количества лейомиоцитов, вероятно, за счет удлинения срока их жизни на фоне относительно низкого уровня апоптоза. Митотически активная Лм отличается преобладанием процессов пролиферации над апоптозом опухолевых клеток, за счет высокого уровня Ki67, PCNA, C-myc, Bcl-2, ЭФР, ИПФР-1, особенно в клетках периваскулярных зон, что и является основным условием роста данной опухоли.

Внедрение результатов в практику.

Результаты исследований используются при чтении лекций и проведении практических занятий со студентами по темам: «Повреждение и гибель клеток и тканей», «Процессы адаптации», «Мезенхимальные опухоли» на кафедре патологической анатомии ММА им. И.М. Сеченова, а также в лечебно-диагностической работе в клиниках ММА им. И.М. Сеченова.

Апробация работы.

Апробация работы проведена 15 декабря 2004 года на заседании кафедры патологической анатомии ММА им. И.М.Сеченова. Результаты работы были доложены на 7 конгрессе Европейского общества клеточной патологии (апрель, 2001г., Франция), на конференции молодых ученых «Татьянин день» (январь, 1999г., Москва).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 6 работ, из них статей в центральных журналах - 1, тезисов в материалах научных конференций - 4 и публикаций в зарубежных изданиях - 1.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, трех глав (обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения), заключения, выводов и списка изпользованной литературы.

Выводы.

1. Разные гистологические типы Лм характеризуются патогенетическими и морфологическими особенностями, вследствие изменения соотношения процессов пролиферации и апоптоза в опухолевых клетках, что обуславливает различия механизмов их роста.

2. Данные морфологического и иммуногистохимического исследований позволили р

3. Рост Лм связан не только с пролиферацией, но и с гипертрофией лейомиоцитов, возникающих под действием факторов роста (ИПФР-1, ЭФР, ТцФР), онкопротеинов C-myc, Вс1-2.

4. Простая Лм отличается преобладанием апоптоза над пролиферацией в лейомиоцитах. Увеличение размеров такой опухоли, вероятно, является результатом не только пролиферации опухолевых клеток, но и их гипертрофии под влиянием ЭФР, ИПФР-1, а таюке пролиферации элементов стромы и ее вторичных изменений.

5. Клеточная Лм характеризуется незначительным преобладанием процессов пролиферации опухолевых клеток над апоптозом. Увеличение размеров клеточной Лм связано с пролиферацией и гипертрофией лейомиоцитов, а также с их накоплением за счет удлинения сроков их жизни на фоне сниженного апоптоза.

6. Митотически активная Лм отличается значительным преобладанием процессов пролиферации над апоптозом опухолевых клеток, что и является основным условием роста данной опухоли. Стромообразование, гипертрофия лейомиоцитов и удлинение сроков их жизни таюке могут вносить вклад в увеличение размеров митотически активной Лм.

7. Важную роль в механизме роста Лм играют стромально-паренхиматозные взаимоотношения. Было отмечено, что разные гистологические типы Лм отличаются составом и количеством стромы. В простой Лм - наиболее зрелая по составу строма с преобладанием коллагеновых волокон и клеток фибробластического ряда, что способствует развитию вторичных изменений. В клеточной Лм строма представлена в виде сосудов с незначительным количеством коллагеновых волокон, что способствует гипертрофии гладкомышечных клеток. В митотически активной Лм количество стромы меньше по сравнению с паренхимой и она менее зрелая с признаками ангиогенеза в виде «зон роста», которые и играют ключевую роль в росте данного типа Лм.

8. При митотически активных и клеточных Лм обильные кровотечения встречаются чаще, чем при простых Лм, что обусловлено более высоким накоплением в них гепаринсвязывающих факторов роста, вызывающих неоангиогенез и, вероятно, местную гипокоагуляцию.

9. При сочетании Лм с аденомиозом и гиперплазией эндометрия происходит усиление процессов пролиферации опухолевых клеток различных гистологических типов Лм.

Заключение.

Исследование проводилось на операционном материале (всего 75 наблюдений) кафедр акушерства и гинекологии лечебного факультета (зав. каф. - проф. Н.М. Побединский) и факультета последипломного образования на базе ГКБ № 40 (зав. каф. - член-кор. РАМН, д.м.н., проф. И.С. Сидорова) ММА им. И.М.Сеченова. По возрасту больные были разделены на 2 группы: 33 пациентки доменопаузального (от 18 до 51 года) и 32 женщины постменопаузального возраста (от 52 до 76 лет)(табл.1). Большинство больных (40 женщин) предъявляли жалобы на обильные и длительные менструации, приводящие к развитию постгеморрагической анемии. Сравнивались группы пациенток, у которых был отмечен быстрый рост миоматозных узлов, то есть увеличение размеров матки на 5 недель беременности менее чем за один год наблюдения, с группой без отмеченного роста. В 30 случаях у пациенток была диагностирована только Лм, у 11 женщин - в сочетании с гиперплазированным эндометрием, в 10 наблюдениях Лм сочеталась с аденомиозом и с гиперплазированным эндометрием; у 14 пациенток Лм сочеталась только с аденомиозом. В контрольную группу вошли 6 пациентов с изолированным аденомиозом и 4 пациентки с выпадением матки без патологии эндометрия и миометрия.

Изучался макропрепарат (удаленная матка и миоматозные узлы). Из каждой опухоли вырезалось от 2 до 5 кусочков, кроме того, исследовался прилежащий миометрий и ткань эндометрия. Проводилось гистологическое исследование парафиновых срезов с окрасками гематоксилином и эозином и пикрофуксином по Ван Гизону. Гипертрофия лейомиоцитов оценивалась по сопоставлению их размеров с размерами лимфоцитов, обнаруживаемых в препарате. Иммуногистохимические реакции ставились по общепринятой методике с демаскировкой антигенов в СВЧ печи на серийных парафиновых срезах из лейомиоматозных узлов, миометрия и эндометрия женщин. В качестве первичных специфических антител использовались моноклональные антитела к Bcl-2 (DAKO), к Вах (Calbiochem), к С-тус (NOVOCASTRA), PCNA (NOVOCASTRA), ЭФР (Santa Cruz Biotechnology), ЭФР-Р (Santa Cruz Biotechnology), ТцФР (Calbiochem), Fas рецептор (DIANOVA), к Ki67 (DIANOVA), и моноспецифических сывороток ИПФР-1 (Pepro Tech EC LTD). При работе с антителами были подобраны рабочие концентрации: первичные антитела Вс1-2, Вах 1:80; C-myc, PCNA, ЭФР, ЭФР-Р, ТцФР, ИПФР-1 1:100; Ki67, FAS 1:50; вторичные антитела: мышинные 1:200. В качестве вторичных антител и визуализирующей системы применялся стрептавидиновый комплекс (LSAB KIT (DAKO)). Ставился отрицательный контроль реакции на срезах без специфических первичных антител. В качестве положительного контроля использовался мелкоклеточный рак легкого человека (с известной экспрессией маркеров). Результаты иммуногистохимических реакции для Вах, Bcl-2, С-тус, ЭФР, ЭФР-Р, ТцФР, ИПФР-1 оценивались в баллах полуколичественным методом по проценту окрашенных клеток. Оценка экспрессии Ki67 и PCNA проводилась путем подсчета процента окрашенных ядер на 3000 клеток. Апоптоз оценивали с помощью Типе1-метода in situ labeling hybridization (ENZO ApopDETEK Cell Death Assay System). Результаты апоптоза оценивались по проценту выявленных апоптозных телец на 3000 клеток с вычислением среднего арифметического и стандартного отклонения.

Проводился статистический анализ полученных результатов. Среднеквадратическая (стандартная) ошибка и доверительные интервалы средних арифметических величин оценивались по таблицам Р.Б. Стрелкова (1999). Уровень значимости доверительного интервала был взят р=0,05, при котором степень достоверности воспроизведения оцениваемого явления равняется 95%. Проводился корреляционный анализ с вычислением коэффициента корреляции.

Проведено сравнительное исследование клинических, морфологических и иммуногистохимических особенностей простой, клеточной и митотически активной Лм.

Для установления гистологического типа Лм нами использовалась рекомендации ВОЗ 2003 г., где выделяется классическая Лм, которая в русскоязычной литературе часто обозначается как простая или обычная Лм, и ее гистологические варианты (клеточная, митотически активная, эпителиоидная, миксоидная, атипическая Лм и липолейомиома и т.д.).

Простая Лм представлена хаотично переплетающимися короткими пучками гладкомышечных клеток с выраженными прослойками зрелой соединительной ткани, содержащей большое количество коллагенновых волокон. Лейомиоциты имеют вытянутую веретенообразную форму и более крупные размеры (гипертрофированы), по сравнению с миометрием контрольных групп. Строма представлена в основном фиброцитами и фибробластами, а также небольшим количеством сосудов, часто со склерозированными стенками. Нередко отмечаются микроскопические признаки вторичных изменений - отека, некроза и гиалиноза. Из 24 простых Лм рост отмечен в 12 случаях, в которых обнаруживается богатая строма и особенно выражены вторичные изменения.

Клеточные Лм построены из плотно расположенных и плохо контурируемых пучков гипертрофированных лейомиоцитов с большими гиперхромными ядрами вытянутой формы и слабо выраженной незрелой стромы. Строма опухоли в основном содержит сосуды и тонкие соединительно-тканные септы. Признаки атипизма клеток и фигуры митозов отсутствуют. Из 22 клеточных Лм рост отмечен в 11, и в них особенно выражены гипертрофия клеток и гиперклеточность. Проведенный анализ показал, что гипертрофия лейомиоцитов в клеточных Лм больше выражена, чем в других типах Лм, а таюке по сравнению с прилежащим миометрием.

Митотически активная Лм характеризуется наличием гипертрофированных лейомиоцитов и незрелой сосудистой стромы. В отличие от простой и клеточной Лм встречались фигуры митоза 5-10 в 10 полях зрения при большом увеличении (х400). При этом митотическая активность носит очаговый характер и выявляется в виде отдельных очагов пролиферации, локализованных, как правило, вокруг сосудов синусоидного типа, так называемых «зон роста», в которых хорошо различима только эндотелиальная выстилка, а мышечный и адвентициальный слои преобразованы в клеточные скопления (периартериолярные клеточные муфты).

В 1 возрастной группе (пременопаузы) преобладали митотически активные Лм (80%), во 2 возрастной группе (постменопаузы) преобладали простые Лм (77%). Клеточные Лм встречались как в 1 (45%) так во 2 (55%) группах. Простые Лм были представлены в основном субсерозными и интрамуральными узлами, клеточные Лм - узлами различной локализации, митотически активные Лм - субмукозными узлами. В 30 Лм был отмечен быстрый рост опухоли. Количество узлов Лм в матке не имело корелляционной связи с гистологическим типом Лм.

Результаты морфологического исследования показали, что рост Лм может осуществляться за счет гипертрофии лейомиоцитов, пролиферации и апоптоза лейомиоцитов, а таюке стромообразования и вторичных изменений, накопления и удлинения жизни лейомиоцитов. В разных типах Лм соотношение этих процессов различно.

Увеличение размеров простой Лм происходит не столько за счет пролиферации лейомиоцитов, сколько за счет гипертрофии, и, в большей степени, стромообразования и вторичных изменений в опухоли. Строма простой Лм может считаться зрелой, так как содержит элементы зрелой соединительной ткани с большим количеством интерстициального коллагена. Эти данные согласуются с результатами исследований Г.И. Брехмана, А.А. Миронова (1986), которые объясняли, что коллагеновые волокна сдавливают капилляры, в результате чего происходит нарушение микроциркуляции, нарастание тканевой гипоксии и отек.

Процесс гипертрофии наиболее выражен в клеточных Лм. Высокая клеточность в клеточных Лм, вероятно, обусловлена накоплением клеток и удлинением их жизни.

Увеличение массы митотически активной Лм происходит за счет повышения пролиферативной активности клеток «зон роста» - перицитов, фибробластоподобных клеток и единичных миоцитов вне сосудов, а также гипертрофии лейомиоцитов.

Пролиферативная активность по Ki67 и PCNA была невысока и отмечалась в основном в митотически активных и меньше в клеточных Лм (р<0,05). При этом пролиферирующие клетки в основном располагались в периваскулярных зонах в основном в подкапсулярной зоне узла Лм. Следует отметить о несоответствии между количеством митотических фигур и уровнем маркеров пролиферации. В литературе этот факт объясняется тем, что клетки вступают в S фазу митотического цикла, который прерывается или растягивается во времени. И результатом такого незавершенного митоза могут быть многоядерные клетки или гипертрофированные клетки с очень крупным ядром. Учитывая локализацию Ki67 и PCNA положительных клеток можно предположить, что источником роста Лм являются очаги пролиферации из периадвентициальной ткани сосудов синусоидного типа («зон роста»), клетки которой обладают выраженной потенцией к дифференцировке в фибро- и миобласты, что подтверждается данными литературы. Различия уровней экспрессии C-myc и Вс1-2 в разных гистологических типах Лм, можно сделать вывод, что в простых Лм С-тус способствует апоптозу при относительно низком уровне Вс1-2, а в митотически активных и клеточных Лм — делению клеток при высокой экспрессии Вс1-2. В митотически активной и клеточной Лм имеется тенденция к повышению содержания ЭФР и его рецептора, ТцФР и ИПФР-1 по сравнению с простой Лм. При этом во всех гистологических типах Лм содержание факторов роста выше, чем в окружающем миометрии (р<0,05).

Полученные результаты о низкой пролиферативной активности опухолевых клеток в простой и клеточной Лм ставит вопрос, за счет каких процессов увеличивается размер опухоли под действием факторов роста. Проведенное нами исследование показало, что высокое содержание факторов роста в тканях Лм сочетается с развитием гипертрофии лейомиоцитов, что особенно выражено в клеточных Лм. Из литературы известно, что ЭФР, ИПФР-I и ТцФР вызывают гипертрофию гладкомышечных клеток (L. Vinter-Jensen, 1997; М. Perrela, 1994). На основании полученных нами данных и анализа литературы можно высказать предположение о влиянии факторов роста не только на миграцию и пролиферацию гладкомышечных клеток в Лм, но и, в большей степени, на их гипертрофию. Экспрессия ЭФР и ЭФР-Р, ТцФР и ИПФР-1 лейомиоцитами, а таюке клетками «зон роста» может свидетельствовать о существовании ауто- и паракринных механизмов регуляции гипертрофии клеток в Лм.

Таким образом в митотически активной Лм факторы роста способствуют пролиферации лейомиоцитов, которая сочетается с их гипертрофией, в клеточной - выраженной гипертрофии лейомиоцитов на фоне низкой пролиферативной активности, а в простой - пролиферации фибробластов и гипертрофии лейомиоцитов на фоне очень низкой пролиферативной активности.

Полученные результаты, показали, что при митотически активных и клеточных Лм обильные кровотечения встречаются чаще, чем при простых Лм.

При этом апоптоз и экспрессия гепаринсвязывающих факторов роста в них выше, чем в простой Лм. Поэтому можно высказать предположение, что ЭФР, ТцФР не только способствуют неоангиогенезу в ткани Лм и в эндометрии, но и, вероятно, за счет повышения количества связанного гепарина, создают условия для местной гипокоагуляции, что приводит к обильным кровотечениям.

В результате проведенных исследований, установлено, что в разных гистологических типах Лм отличался и уровень апоптоза. В клеточной и миотически активной Лм наблюдалось достоверное снижение уровня апоптоза по сравнению с простой (р<0,05), тогда как в простой Лм отмечается наоборот, повышение апоптоза. Вероятно, повышение уровня апоптоза в простых Лм может объяснить их регресс. Снижение уровня апоптоза по сравнению с пролиферацией в митотически активных и клеточных Лм, по всей видимости, играет большую роль, наоборот, в их росте, за счет накопления опухолевых клеток. Полученные результаты согласуются с данными литературы, где указывается, что уровень апоптоза снижается при действии факторов роста, что, по всей видимости, и происходит в клеточных и митотически активных Лм.

Наши результаты показали, что экспрессия FAS рецептора в тканях Лм невысока и в разных типах уровни FAS рецептора различны. Имелась тенденция к более высоким показателям в простой Лм по сравнению с клеточной и митотически активной.

Как показало проведенное нами исследование, экспрессия Вах отражает тенденцию к повышению апоптоза в простой Лм, и его снижении в клеточной и митотически активной Лм. Учитывая невысокую экспрессию Bcl-2 белка по сравнению с Вах в простых Лм, молено предположить, что в данном типе Лм довольно активно происходят процессы апоптоза, поэтому в них возможен регресс. Увеличение размеров простых Лм обусловлено в значительной мере вторичными изменениями и стромообразованием. В митотически активных Лм на фоне сниженной экспрессии Вах и высоким уровнем Bcl-2 и факторов роста, имеется нарушение регуляции апоптоза. Учитывая также наиболее активные по сравнению с другими типами Лм процессы пролиферации, можно предположить, что основную роль в росте митотически активных Лм играет нарушение соотношения процессов пролиферации и апоптоза в пользу пролиферации. Тогда как в клеточных Лм уровень апоптоза по Вах самый низкий по сравнению с другими типами, уровень пролиферации ниже, чем в митотически активных Лм, и довольно высокий уровень факторов роста. Это подтверждает, что рост клеточных Лм происходит главным образом за счет гипертрофии лейомиоцитов.

Полученные результаты показали, что соотношение процессов пролиферации и апоптоза в простой, клеточной и митотически активной Лм различно. В простой Лм пролиферативная активность в лейомиоцитах была наименьшая, а уровень апоптоза максимальный по сравнению с клеточной и митотически активной Лм. Уровень апоптоза в клеточной Лм был наименьший, а пролиферации - средний по сравнению с простой и митотически активной Лм. Максимальная пролиферативная активность отмечалась в митотически активной Лм на фоне среднего уровня апоптоза.

При этом в простой Лм апоптоз значительно преобладает над пролиферацией, тогда как в митотически аквтивной Лм пролиферативная активность лейомиоцитов сравнительно выше, чем апоптоз. В клеточной Лм имеется незначительное преобладание пролиферации над апоптозом.

Следовательно, разные гистологические типы Лм характеризуются особенностями нарушения процессов пролиферации и апоптоза в опухолевых клетках, что обуславливает различия в механизмах их роста.

Таким образом, простая, клеточная и митотически активная Лм отличаются не только морфологическими особенностями, но и механизмами роста.

Простая Лм характеризуется низкой пролиферативной активностью лейомиоцитов в сочетании с их гипертрофией и высоким уровнем апоптоза. Увеличение размеров простой Лм, вероятно, происходит за счет процессов гипертрофии, усиления стромообразования и вторичных изменений в опухоли. Относительно повышенный апоптоз в Лм свидетельствует о возможном регрессе опухоли.

Клеточная Лм характеризуется незначительным преобладанием процессов пролиферации опухолевых клеток над апоптозом. Увеличение размеров клеточной Лм связано с пролиферацией и гипертрофией лейомиоцитов, а также с их накоплением за счет удлинения сроков их жизни на фоне сниженного апоптоза.

Митотически активная Лм отличается значительным преобладанием процессов пролиферации над апоптозом опухолевых клеток, что и является основным условием роста данной опухоли. Стромообразование, гипертрофия лейомиоцитов и удлинение сроков их жизни также могут вносить вклад в увеличение размеров митотически активной Лм.