Автореферат и диссертация по медицине (14.03.10) на тему:МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И ИММУНОФЕНОТИПИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ЛИМФОЦИТОВ ПРИ ЛИМФОПРОЛИФЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ

На правах рукописи

004605370

НАУМОВА Елена Владимировна

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И ИММУИОФЕНОТИПИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ЛИМФОЦИТОВ ПРИ ЛИМФОПРОЛИФЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ

14.03.10 - Клиническая лабораторная диагностика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 7 ИЮН 7010

Москва 2010

004605870

Работа выполнена на кафедре клинической лабораторной диагностики ГОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования»

Научный руководитель: кандидат медицинских наук,

доцент

Почтарь Маргарита Евгеньевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Резников Юрий Петрович Семикина Елена Леонидовна

доктор медицинских наук

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии медицинских наук Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина РАМН

Защита диссертации состоится «16» июня 20 Юг в 10:00 часов на

заседании диссертационного совета Д 208.071.04 при ГОУ ДПО РМАПО по

адресу: 123995, г. Москва, ул. Баррикадная, д.2/1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» (125445, г. Москва, ул. Беломорская, д. 19).

Автореферат разослан « ДЦ » iltO^1 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор Морозова В.Т.

Актуальность

Лимфопролиферативные заболевания (ЛПЗ) являются одними из часто встречающихся опухолевых заболеваний кроветворной ткани у взрослых. В России неход-жкинские лимфомы составляют 2,55 % от всех злокачественных опухолей; стандартизованный показатель заболеваемости среди мужчин составил 8,2, а среди женщин — 7,2 на 100000 человек [Поддубная И.В. 2005]. Термин ЛПЗ объединяет группу достаточно разнородных по клиническим проявлениям, степени тяжести и прогнозу заболеваний лимфоидной ткани, при которых в результате опухолевой трансформации возникает блок на определенной стадии развития лимфоцитов. Способность лимфо-идных клеток к опухолевой трансформации практически на всем пути клеточной дифференцировки определяет многообразие лимфопролиферативных заболеваний. В настоящее время в соответствии с классификацией ВОЗ 2008г. насчитывается более 30 различных нозологических форм ЛПЗ [4th Edition WHO Classification... 2008]

Изучая особенности иммунологического фенотипа клеток, можно установить стадию дифференцировки, на уровне которой наступила онкогенная трансформация [Stetler-Stevenson М, et al. 2001]. Однако, для волосатоклеточного, пролимфоцитарно-го лейкозов пока не найден нормальный клеточный аналог [Chen YH, et al. 2006], а при ряде В- и Т- клеточных ЛПЗ может наблюдаться утрата типичных антигенов, появление активационных маркеров, либо коэкспрессия антигенов, несвойственных данной стадии дифференцировки лимфоцитов [Луговская С.А. и др. 2005].

Согласно рекомендациям ВОЗ диагноз ЛПЗ базируется на данных морфологических, иммунологических и молекулярно-биологических методах исследования. При верификации диагноза обязательным является установление линейной принадлежности опухолевых клеток (Т или В) и степени их дифференцировки, что невозможно без проведения иммунофенотипического анализа лимфоцитов. В настоящее время установлены основные иммунофенотипические характеристики опухолевых клеток для различных вариантов ЛПЗ. Однако, многочисленные клинические наблюдения показывают, что не у всех больных иммунофенотип опухолевых лимфоцитов соответствует классическому варианту для данного заболевания [Morice W.G. et al. 2008]. Все это указывает на необходимость поиска дополнительных маркеров диагностики, в том числе и иммунофенотипических. Кроме того, учитывая высокую стоимость иммуно-фенотипических исследований и неодинаковую значимость различных антигенов для верификации диагноза ЛПЗ, назрела необходимость разработать оптимальную панель моноклональных антител (МАТ), которая будет наиболее информативна для проведения диагностики и дифференциальной диагностики ЛПЗ.

За последние года в терапии ЛПЗ достгнуш значительные успехи благодаря использованию таких препаратов как Мабтера, Флюдарабин, Кэмпас. Полные ремиссии удается получить у многих больных хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ), волосатокле-точным лейкозом (ВКЛ) и др. ЛПЗ. Вместе с тем, часть больных остаются резистентными к терапии, у многих рано или поздно развивается рецидив заболевания. Все это диктует необходимость исследования биологических особенностей опухолевых клеток с целью проведения максимально прицельной терапии для уничтожения опухолевого клона.

Цель настоящей работы - сопоставление иммунофенотипических характеристик лимфоцитов с морфологическими вариантами В-клеточного хронического лимфолейкоза и выявление дополнительных маркеров, необходимых для проведения дифференциальной диагностики хронического лимфолейкоза от других В-клеточных лимфопролиферативных заболеваний.

Задачами в соответствии с поставленной целью являются:

1. Стандартизировать метод определения плсгшосш экспрессии поверхностных анти-геновлимфоцитов.

2. Установить особенности иммунофенотипа лимфоцитов периферической крови в зависимости от морфологического варианта и клинической стадии В-клеточного хронического лимфолейкоза

3. Исследовать особенности экспрессии поверхностных клеточных маркеров СЭ20 и СЭ45 на В-лимфоцитах хронического лимфолейкоза (ХЛЛ), волосаток-леточного лейкоза (ВКЛ), лимфомы из клеток мантийной зоны (ЛКМЗ), лим-фомы маргинальной зоны селезенки (ЛМЗС) и реактивных лимфоцитозов оценить их информативность в дифференциальной диагностике,

4. Изучить экспрессию С043 на В-лимфоцитах при В-ХЛЛ и В-ЛПЗ в сравнении с практически здоровыми лицами и группой больных с реактивными лим-фоцитозами.

5. На основании полученных данных разработать диагностическую панель мо-ноклональных антител и алгоритм дифференциальной диагностики лимфопролиферативных заболеваний.

Научная новизна

• Определено значение оценки плотности экспрессии поверхностных антигенов СБ20 и СЭ45 на В-лимфоцитах для проведения дифференциальной диагностики В-ХЛЛ от других В-клеточных ЛПЗ.

• Показана диагностическая значимость экспрессии маркера CD43 на В-лимфоцитах в дифференциальной диагностике В-ЛПЗ и реакгавных лимфоци-тазов.

• Показана однородность иммунологического фенотипа опухолевых клеток при различных морфологических вариантах В-ХЛЛ

• Иммунологический фенотип опухолевых клеток существенно не изменяется при разных стадиях В-ХЛЛ.

Практическая значимость

• Разработаны условия стандартизации методики определения плотности поверхностных рецепторов по величине средней интенсивности флюоресценции (МИ -mean fluorescence intensity).

• Разработала ошимальная панель моноклональных ашишл (МАТ) для проведения дифференциальной диапюсшки В-ЛПЗ, включающая: CD45/CD14; CD3/CD16+56; ОЖЮ&ШЗ; CD5/CDIQCD19; CD2Q/CD23; СШЗ/С019; CD38/CD19; Anti-k/Anti-?VCD19; FMC7/CD23/CD19. При подозрении на волосапжлегочный лейюоз к панели необходимо добавлял,: CD19/CD1 lc; CD20/CD25; CD22/CD103.

• Предложен алгориш дифференциальной диагностики В-ЛПЗ с учетом плошосга экспрессии поверхностных ашигеноа

• Предложена модифицированная методика пробоподгоговки, позволяющая снизил, неспецифическое связавание меченых антител, при проведении иммунофеногапирования клеток косшош мозга и периферической крови у больных с парапротсинемиями.

Положения, выносимые на защиту:

• Величина средней интенсивности флуоресценции MFI может использоваться для оценки плотности поверхностных рецепторов при соблюдении стандартных условий.

• Экспрессия CD 19, CD20, CD23 и CD45 не зависит от морфологического варианта В-клеточного хронического лимфолейкоза и не отличается достоверно у больных на разных стадиях В-ХЛЛ в соответствии с классификацией Binet. При переходе в стадию прогрессирования выявляется достоверное увеличение плотности экспрессии только CD20.

• Для дифференциальной диагностики хронического лимфолейкоза, волосатокле-точного лейкоза, лимфомы из клеток мантийной зоны, лимфомы маргинальной зоны селезенки и реактивных лимфоцитозов может использоваться анализ плотности экспрессии CD20 и CD45. Данные маркеры имеют выраженные разнонаправленные изменения при реактивных лимфоцитозах и различных формах В-клеточных лимфопролиферативных заболеваний.

• Оценка экспрессии CD43 может служить дополнительным критерием для дифференциальной диагностики лимфопролиферитивных заболеваний

Личный вклад соискателя

Автором проведены клинический анализ крови и иммунофенотипирование лейкоцитов всех пациентов описаных в работе. Соискатель самостоятельно осуществил всю необходимую статистическую обработку полученных данных. Внедрение в практику результатов исследования

Результаты работы используются при чтении лекций, проведении практических занягайи на кафедре клинической лабораторной диашосшки ГОУ ВПО «РМАПО Росэдрава» (ректор Мошетова JLK, зав. кафедрой - профессор Долгов В.В.) Разработанный алгоритм дифференциальной диагностики лимфопролиферагавных заболеваний применяется на пракплсе при проведении иммунофенотипирования на кафедре клинической лабораторной диагностики ГОУ ВПО «РМАПО Росздрава» Апробация работы

Материалы данной работы были представлены на научно-пракгаческих конференциях «Национальные дни лабораторной медицины России 2008» (Москва 2008r.);BD FACS Lisa's Meeting- (Сесгрорецк 2008); «Технологии и инновации в лабораторной медицине» (Москва 2009г.)

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, собственных данных, обсуждения результатов, выводов, и списка литературы. Работа иллюстрирована 38 рисунками, 9 диаграммами и 28 таблицами. Список литературы содержит 179 источников, из них 38 отечественных и 141 иностранных публикаций.

Материалы и методы

Работа выполнена на кафедре Клинической лабораторной диагностики Российской академии последипломного образования (заведующий кафедрой профессор Долгов ВВ.)

Характеристика пациентов

В настоящей работе представлены результаты обследования 342 пациентов с опухолевыми и реактивными лимфоцитозами, направленных гематологами Московского гематологического центра, 6 и 7 гематологических отделений ГКБ им. С.П. Боткина. Среди обследованных было 164 мужчины и 178 женщин в возрасте от 16 до 89 лет. Верифицировались диагнозы J11В в соответствии с критериями, предложенными ВОЗ. Все исследования проводились до начала терапии. Группу сравнения составили 23 донора.

Материалом исследования служила венозная кровь больных, стабилизированная К2ЭДТА, с конечной концентрацией антикоагулянта 1.66 мг/мл. Взятие венозной крови осуществляли в пластиковые пробирки объемом 5 - 2 мл с К2ЭДТА фирмы Sarstedt (Германия).

Всем больным проводились: клинический анализ крови на гематологическом анализаторе Pentra 60 АВХ, морфологическое исследование лейкоцитов периферической крови с использованием аппарата для фиксации и окраски мазков Hematek фирмы Bayer (США) и микроскопа Axiostar plus фирмы Zeiss, иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови на проточном цитофлуориметре FACS Calibur фирмы Becton Dickinson с использованием реагентов фирм Becton Dickinson и Beck-man Coulter.;

С целью дифференциальной диагностики различных форм лимфопролифера-тивных заболеваний нами предложена стандартная панель МАТ, включающая:

панель меченных монокло-нальныханшгел назначение

CD45CD14 кошроль чисгош выделения гейта лимфоцитов

CD3/CD16+CD56 Опреление

CD4/CD8/CD3 Определение субпопулящш Т-лимфоищов

Anti-k/Anti-A/CD19 Определение клоналыюсги В-лимфоцигов

CD5CDlftOM9 Для проведения дифференциальной диагностики В-ЛПЗ

CD20/CD23

CD43/CD19

CD38/CD19

FMC7/CD23/CD19

CD19/CDllc добавллякжя при подозрении на волосатоклегочный лейкоз

CD20/CD25

CD22/CD1Q3

Учитывая то, что интенсивность флюоресценции от каждой конкретной клетки зависит от количества меченых моноклональных антител, связавшихся со специфическими антигенами на поверхности лимфоцитов, то средняя интенсивность флюоресценции популяции клеток (MFI -mean fluorescence intensity), может служить количественным критерием, характеризующим экспрессию антигенов (плотность рецепторов) на клетках.

Для оценки плотности поверхностных рецепторов мы использовали величину MFI и в качестве метода сравнения коммерческий набор QuantiBRITE® PE*BD, позволяющий калибровать цитофлуориметр по интенсивности флуо-ресцении с последующим перерасчетом в абсолютные единицы плотности поверхностных рецепторов - ABC (antibody bound per cell).

В работе проводился анализ плотности экспрессии по величине средней интенсивности флюоресценции (MFI) таких антигенов, как:

CD19 Мембранный белок B-клеток (М=95 кДа), относящийся к Ig-семейству. Внеклеточный домен состоит из примерно 280 аминокислот и содержит 2 С2-типа Ig-подобных домена. Имеет 5 N-концевых участков гликози-лирования. Цитоплазматический регион состоит из 240 аминокислот. CD 19 необходим для развития, регуляции ответа и дифференцировки В-лимфоцитов. Считается самым "надежным" маркером B-клеток человека, т.к. присутствует на 100% B-клеток (часть корецептора). Появляется на самых ранних этапах развития B-лимфоцитов в костном мозге. Этот белок входит в состав корецептор-ного комплекса B-лимфоцитов, регулируя положительный сигнал. Вместе с CD21 формирует нековалентный комплекс, который, взаимодействуя, с В-клеточным рецептором, усиливает гуморальный ответ на данный антиген.

CD20 Относится к семейству молекул с 4-мя трансмембранными сегментами (тетраспанинов). Молекулярная масса составляет 33-37 кДа. Белок состоит из 297 аминокислот. CD20 участвует в регуляции активации В-лимфоцитов. В процессе B-клеточного развития появляется после экспрессии CD 19 на поверхности и CD22 внутриклеточно. Экспрессия CD20 значительно повышена на B-лимфоцитах зародышевых центров. Олигомеры CD20 участвуют в образова-

нии Са2+ канала в мембране B-клетки. Помимо нормальных В-лимфоцитов, присутствует на клетках лимфом и B-клеточного хронического лимфолейкоза. Антитела к CD20 используются для лечения больных неходжкинскими лимфо-мами.

CD23 Трансмембранный гликопротеид, состоящий из 321 аминокислоты, с молекулярной массой 45 кДа. Лиганд корецептора CD19/CD21/CD81. Низкоаффинный FceRII рецептор IgE, широко распространенный на гемопоэтических клетках, включая B-лимфоциты, некоторые Т-клетки, фолликулярные дендритные клетки, моноциты, тромбоциты, клетки Лангерганса, базофилы, эозинофи-лы, NK-клетки. Есть мнение, что CD23 с низкой плотностью экспрессируется на нормальных В- лимфоцитах и высоко экспрессируется на активизированных В лимфоцитах, лимфобластах трансформированных вирусом Эпштейна-Барр, при хроническом B-клеточном лимфолейкозе, и на B-лимфоцитах миндалин. Регулирует синтез IgE B-клетками. Запускает освобождение провоспалитель-ных цитокинов. У человека в норме присутствуют в небольшом количестве на периферических, но не костномозговых, IgM+IgD+ B-клетках. Мембранные и растворимые CD23 молекулы связывают IgE и могут играть роль в фиксации и представлении антигена. Повышенный уровень растворимого CD23 регистрируется при синдроме воспаления. Экспрессия вызвана IL-4. Антиген утрачивается после изотипного переключения на IgA IgG или IgE.

CD43 (лейкосиалин, сиалофорин) - сиалогликопротеин, полипептидная цепь состоит из 385 аминокислот, молекулярная масса которого равна 95 - 115 кДа (Т-лимфоциты и тимоциты) или 115 - 135 кДа (нейтрофилы и тромсбоци-ты). Внеклеточный участок CD43 состоит из 239 аминокислот и является муци-ноподобпым белком с высоким содержанием Ser и Thr, которые являются потенциальными сайтами О-гликозилирования. Цитоплазматический домен консервативен у разных видов млекопитающих и содержит фосфорилированный Ser. При активации клеток уровень фосфорилирования увеличивается. CD43 экспрессирован у человека на многих типах клеток, а именно: тимоцитах и Т-клетках, гранулоцитах и моноцитах/макрофагах, NK и др. У крыс CD43 найден

в ЦНС. Растворимая форма CD43 (галактогликопротеин) присутствует в сыворотке крови человека. CD43 участвует в антиген-зависимой активации Т-лимфоцитов, усиливая этот процесс. Лигандом CD43 является CD54 (ICAM-1).

CD45 относится к семейству фибронектина типа III, это трансмембранная молекула, состоящая из 1120-1281 аминокислот, из которых 391-552 формируют внеклеточный домен и 707 составляют длинный цитоплазматический уча-сток.[20,33,178] CD45 находится на поверхности всех ядерных гемопоэтиче-ских клеток и их предшественников с крайне высокой концентрацией (более 100000 копий на клетку). Присутствует на большинстве лейкоцитов. На Т- и В-клетках он занимает примерно 10% всей клеточной поверхности. Этот рецептор активирует семейство Src киназ, необходимых для передачи сигнала в клетку, а также супрессирует JAK киназы, регулируя сигналы через цитокиновый рецептор. Таким образом, этот рецептор необходим для активации и развития клетки и контроля сигналов через рецепторы для цитокинов. Существует в нескольких изоформах.

Большое количество белка в плазме больных с парапротеинемиями препятствует нормальному связыванию моноклональныхантител с антигенами на поверхности клеток. Нами была предложена модифицированная методика про-боподготовки включающая, дополнительные отмывания и тем самым позволяющая снизить неспецифическое связывание меченых антител. Статистическая обработка результатов.

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием программы Microsoft Excel. При этом определялись: среднее значение М, стандартная ошибка среднего ш, стандартное отклонение среднего S, коэффициент вариации CV. Достоверность различий исследуемых параметров определялась по t-критерию Стьюдента и с помощью построения доверительного интервала (ДИ). Полученные данные представляли в виде средней арифметической и её стандартной ошибки (М±т).

Результаты.

I. Анализ возможности использования MFI для оценки плотности поверхностных рецепторов.

В работе были подтверждены высокие аналитические характеристики и стабильность работы проточного цитометра. Коэффициенты вариации (CV) для процентного содержания B-лимфоцитов минимальны и составляют 1% для различных флуорохромов, a CV для значений MFI близки по значению и составляют для РЕ и FITC - 7% и 5% соответственно.

Нами проводился анализ следующих факторов: влияние объема вносимого реагента (МАТ, меченных различными флуорохромами), зависимость результатов от типа используемого флуорохрома (РЕ или FITC), влияние на результат исследования использование реагентов МАТ разных фирм-производителей (BECMAN COULTER и BECTON DICKINSON)

В качестве сравнительного метода использовался коммерческий набор Quanti-BRITE®PE BD, позволяющий калибровать цитофлуориметр по интенсивности флюоресценции с последующим перерасчетом в абсолютные единицы плотности поверхностных рецепторов - ABC (antibody bound per cell, количество антигенных молекул на поверхности или внутри клетки). С целью сравнения двух методов были проанализированы образцы крови 20 доноров по Т- и B-клеточным маркерам - CD3, CD8 и CD20 с использованием моноклональных антител меченных РЕ (BD).

Коэффициент корреляции (г) между показателями обоих методов составляет 0,99 независимо от анализируемого антигена. Таким образом, использование MFI для оценки плотности поверхностных рецепторов в рамках одной лаборатории является достаточным при соблюдении стандартных условий.

Провезенные нами исследования показали, что для получения достоверных результатов оценки плотность поверхностных рецепторов по значению M FI, необходимо выполнение следующих условий:

• Использовть прибор с одними и теми же настройками для сравнительного анализа;

• Внесение достаточного и постоянного объема моноклональных антител;

• Использовать для сравнения флуорохромы одного типа;

• Применение реагентов одной фирмы-производителя.

II. Характеристика экспрессии поверхностных антигенов лимфоцитов периферической крови доноров.

Группу доноров составили 23 человека, из них 10 мужчин и 13 женщин, в возрасте от 38 до 62 лет. Общий анализ крови был в пределах нормы. Результаты имму-нофенотипирования лимфоцитов доноров представлены в таблице 1 .

Таблица 1 Результаты иммунофенотипирования доноров (п=23)

Параметры М ± m

Плотность экспрессии С 1)45 (МП) 1ТГС 273,4±7,58

СШ9+ (%) 10,49 ±0,68

Плотность экспрессии С 1)19 (МП) РЕ 305,3 ± 15,45

СП20+ (%) 10,42 ±0,67

Плотность экспрессии С020 (МР1) ПТС 276,55 ± 23,30

С023+ (%) 6,18±0,35

Плотность экспрессии С023 (МП) РЕ 66,5 ± 3,91

III. Морфоиммунологические характеристики лимфоцитов периферической крови больных хроническим лимфолейкозом

Исследуемую группу составили 201 больной ХЛЛ из них 103 мужчины и 98 женщин, в возрасте от 43 до 86 лет (средний возраст 64года). При проведении общего анализа крови у всех больных данной группы отмечался лейкоцитоз с абсолютным лимфоцитозом, причем у 187 (93%) человек более 5><109/л. У 58 (29%) больных наблюдалась анемия, у 73 (36%) больных, тромбоцитопения(РЬТ<180х109/л). Несмотря на то, что у всех больных ХЛЛ был выявлен впервые, стадии заболевания были разные. У большинства больных опухолевый субстрат морфологически был представлен малыми лимфоцитами с правильной, округлой формой ядра и узким ободком базо-фильной цитоплазмы, однако, у 10% больных лимфоциты были представлены нетипичными для ХЛЛ клетками.

Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови у всех больных выявило моноклональную пролиферацию B-лимфоцитов с фенотипом: CD19+ CD5+CD20+CD23+CD43+CD38+/-FMC7-, с экспрессией поверхностных иммуноглобулинов либо с к, либо X типом легких цепей.

3.1 Характеристика поверхностных антигенов лимфоцитов у больных ХЛЛ в зависимости от морфологии опухолевого субстрата.

Учитывая морфологическую неоднородность опухолевого субстрата при ХЛЛ, нами было принято решение сравнить величину экспрессии СЭ19, СЭ20 и СЭ23 у 70 больных с двумя морфологическими формами ХЛЛ. По морфологии опухолевых клеток пациенты, были разделены на 2 группы. Первая группа п=51 (23 жен, 28 муж) у которых в крови преобладали малые лимфоциты: опухолевые клетки размерами около 10 мкм, т.е. несколько большими, чем диаметр эритроцита, с высоким ядерно-цитоплазматическим соотношением, грубой структурой ядра и маленьким ободком цитоплазмы. (Рис. 1а). Вторая группа п=19 (8 женщины, 11 мужчин): опухолевые клетки характеризовались более крупными размерами, диаметр около 2-2.5 диаметра эритроцита, с умеренным ядерно-цитоплазматическим соотношением, выраженным ободком цитоплазмы: в большинстве случаев с краевой базофилией (Рис 16).

» (С < УИгсз» « а

Рис. 1а . ХЛЛ классический морфологический вариант периферическая кровь. Рис. 16 . ХЛЛ атипичный морфологический вариант, периферическая кровь

Данные иммунофенотипирования представлены на диаграмме 1

Диаграмма 1. Сравнение МИ1 СО 19, С020 и СЭ23 у больных с 1 и 2 морфологическими вариантами хронического лимфолейкоза и у доноров

Анализ плотности экспрессии СЭ19, СЕ)20 С023 между больными с различными морфологическими вариантами ХЛЛ достоверных различий не выявил. У пациентов

ХЛЛ наблюдалось достоверное снижение МР1 СЭ19 и СЭ20 (р<0,05) по сравнению с донорами. Достоверных различий в плотности экспрессии С023 лимфоцитами периферической крови доноров и больных ХЛЛ выявлено не было. Поскольку, различия плотности экспрессии СО 19, С020 С023 у больных ХЛЛ двух морфологических вариантов по отношению к донорам носили однотипный характер, в дальнейших исследованиях разделение пациентов по морфологическим вариантам не проводилось.

3.1 Характеристика поверхностных антигенов лимфоцитов больных ХЛЛ в зависимости от стадии заболевания.

В зависимости от стадии заболевания пациентов разделили на группы в соответствии с классификацией Вшей Среди обследованных пациентов с развернутой стадией хронического лимфолейкоза, было: стадия А - 130 человек; стадия В - 38 человека; стадия С - 25 человек. Больных ХЛЛ в стадии прогрессии ХЛЛ было 8 человек (количество пролимфоцитов у них колебалось в пределах 13-25%).

Плотность экспрессии антигенов (МР1) СО 19, С020 и С045 у больных на разных клинических стадиях ХЛЛ и доноров представлена в таблице 2

Таблица 2 Сравнение MFI CD19, CD20 и CD45 у доноров и больных на разных стадиях ХЛЛ

РАЗВЕРНУТАЯ СТАДИЯ СТАДИЯ ПРОГРЕССИИ ДОНОРЫ

СТАДИЯ А СТАДИЯ В СТАДИЯ С

MFI CD19 РЕ 231,57±8,16» 243,65±17,5» 224,5± 17,22* 252,7±23,9* 305,3±15,45

MFI CD20 FITC 49,66±2,02" 57,2±4,63»* 63,12±5,98" 196,55±35,7» 276,5 ±12,5

MFI CD45 FITC 180,4±7,38** 176,6±13,1*» 195,8± 14,5« 208,5±25,5* 273,4 ±7,58

где * р<0,05 по сравнению с донорами ** р<0,001 по сравнению с донорами

Значимые различия в плотности экспрессии ашигенов CD19, CD20, CD45 на стадиях А, В и С (noBinet) получены не были, но наблюдалась тенденция к увеличению MFI CD20 и по мере развития заболевания. Достоверное (р<0,01) увеличение MF1 на стадии прогрессии относительно развернутой стадии наблюдалось только для CD20, в экспрессии CD 19 и CD45 значимых отличий получено не было.

Поскольку значимых различий в плотности экспрессии антигенов CD 19 CD20 CD45, у больных на стадиях А, В и С ХЛЛ выявлено не было, то в дальнейшем все пациенты с развернутой стадией ХЛЛ анализировались единой группой.

Результаты сравнения MFI по CD19, CD20, CD23, и CD45 у доноров и больных ХЛЛ в развернутой стадии заболевания приведены ниже в таблице 3.

Таблица 3 С равнение IV1FI CD19, CD20,CD23, и CD45 доноров и больных ХЛЛ

Параметры Доноры(п-23) ХЛЛ (п=193) доверительный интервал

М± m M ± m <цдон- цХЛЛ<

Плотность экспрессии СШ9РЕ(1УШ) 305,3 ± 15,45 234,2 ±7,31* 32,7 <...<109,5

Плотность экспрессии С020ПТС (МП) 276,55 ± 23,30 52,9 ±1,82** 201,1 <...<246,07

Плотность экспрессии С023 РЕ (МП) 66,5±3,91 72,9 ±2,78 -

Плотность экспрессии С045ПТС (\Ш) 273,5±7,57 184,1± 5,84** 39,7<...< 138,7

где * р<0,05 по сравнению с донорами ** р<0,001 по сравнению с донорами

Таким образом, на В-лимфоцитах больных ХЛЛ наблюдалось достоверное снижение плотности экспрессии CD19 (р<0,05), CD20 и CD45 (р<0,001 ) по сравнению с донорами. Полученные данные позволяют с вероятностью 95% утверждать, что истинное среднее значение MFICD19 (а соответственно, и плотность экспрессии CD19) у доноров будет выше, чем истинное среднее значение MFI CD19 больных ХЛЛ на величину от 32,7 до 109,5. Истинное среднее MFI CD20 у доноров выше, чем MFI CD20 больных ХЛЛ от 201,1 до 246,07. Истинное среднее значение MFI CD45 у доноров выше такового у больных ХЛЛ от 39,7 до 138,7. Достоверных различий в плотности экспрессии CD23 лимфоцитами периферической крови доноров и больных ХЛЛ выявлено не было.

IV Морфоиммунологические характеристики лимфоцитов периферической крови при В-клеточных лимфопролиферативных заболеваниях и реактивных лим-фоцитозах

В работе проанализирована кровь 273 больных лимфопролиферативными заболеваниями и 68 больных с реактивными лимфоцитозами. Распределение больных по нозологическим формам представлены в таблице.

ЗАБОЛЕВАНИЯ п %

Реактивные лимфоцитозы 68 20%

Хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) 201 59%

Волосатоклеточный лейкоз (ВКЛ) 30 8,8%

Лимфома маргинальной зоны селезенки (ЛМЗС) 22 6,4%

Лимфома из клеток мантийной зоны (ЛКМЗ) 20 5,8%

Реактивные лимфоцитозы.

Данную группу составили 68 пациентов с реакгавными лимфоцигозами. Среди них 25 мужчин и 43 женщины, в возрасте от 16 до 82 лет. В гемограмме у 49 (72%) пациентов выявлялся относительный лимфоцшга. У15 пациентов имел место абсолютный лимфоцигоз.

Результаты иммунофенотипирования лимфоцитов периферической крови у пациентов с реакшвными лимфоцигозами не выявило клинически значимых различий с донорами в экспрессии CD19, CD20, CD23, CD45. Даже в тех случаях, когда отмечалось некоторое увеличение популяции В-лимфоцигов соотношение количества клеток экепрессирующих различные типы легких цепей (к или X) оставалось в нормальным, что указывало на поликгтопалытую пролиферацию В-лимфоцигов.

Волосатоклеточный лейкоз

Группу больных с волосатоклешчным лейкозом (BKJI) составили 30 пациентов. Среди них 19мужчини 11 женщин, в возрасте от 37 до 68 лет. У 24 больных наблюдалась спленоме-галия разной степени выраженности, у одного пациента кроме увеличения селезенки отмечалась лимфаденопатия, у пята пациентов клинические проявления заболевания отсутствовали. В общем анализе крови у 18 человек наблюдалась панцигопения, у трех больных выявлены лейкоцитозы выше 10x109/л с анемией и тромбопщопенией, у 9 больных при наличии относительного или абсолютного лимфоцигоза количество лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов было в пределах нормы. Морфологически опухолевый субстрат представлен «волосапыми» клетками среднего размера с обильной светло-голубой цитоплазмой, имеющей отростки, щи имели сглаженную структуру хромал та Количество «волосатых» клеток у пациентов составляло от 1 до 76%. У10 больных опухолевые клетки характеризовались наличием тартрат-резисгетной кислой фосфатазы. У остальных бальных да тая цитохимическая реакция не проводилась в виду низкого содержания опухолевых клеток в периферической крови.

При иммунофенспипировании лейкоцитов периферической 1фови у 29 больных выявлен следующий иммунофеногап опухолевых клеток CD19+CD5-CD20+CD22+CD23-CD25+CD11 c+CD 103+FMC7+ (соответствующий данному заболеванию по классификации ВОЗ) при этом у одного пациента наблюдалась аберрантная экспрессия CD5 опухолевыми клетками.

При проведении иммунофеногапирования периферической крови у 5 больных с BKJI в стандартную панель МАТ нами был добавлен CD 10 в сочетании CD5/CD10/CD19. У обследованных бальных от 70 до 98% опухолевых клеток несли на поверхности CD 10. Таким образом, в диагностическую панель для верификации диагноза BKJI целесообразно добавлял. CD 10.

В некоторых случаях, при иммунофенотипировании лейкоцитов периферической крови больных BKJI опухолевая популяция не опражалась графике FCS/SSC при стандартных настройках прибора Трансформированные клетки детектируются прибором как события с очень высоким значением прямого свегорассеивания, и не отражаются на скегерограмме. Это происходит за счет крупных размеров самих клеток и наличия отростков на цитоплазме в связи с чем, целесообразно изменял, напряжение на канале FSC в соответствии с морфологическими особенностями клеток, либо устанавливал, гейт по CD45, который в качестве дополнительной метки добавляется во все пробирки и регистрируется на свободном флуоресценпюм канале.

Лимфома маргинальной зоны селезенки

Грушу больных с данной нозологией составили 22 пациента, среди них 10 мужчин и 12 женщин, в возрасте от 43 до 89 лег. У всех бальных наблюдалась спленомегалия, разной степени выраженности. У 6 бальных в крови выявлялся моноклональный парапрогеин IgM-типа.

Морфологически опухолевый субстрат у большинства пациентов был представлен средними по размеру клетками с умеренно базофильной, скудной цитоплазмой, имеющей тонкие, короткие щлшлазматические выросты.

При иммунофеногапировании лейкоцитов периферической крови у всех бальных выявлен следующий иммунофеногап опухолевых клеток CD 19+ CD5- CD20+CD22+CD23-CD43-CD25-CD11c-CD103-FMC7+

Лимфома из клеток мантийной зоны

Группу больных с данной нозологией составили 20 пациентов. Среди них 12 мужчин и 8 женщин в возрасте от 52 до 75 лег. В клинической картине у 8-и бальных наблюд алось увеличение только лимфатических узлов, у 4-х только увеличение селезенки, у 5-х - лимфаденопа-тия и спленомегалия, у троих пациентов наблюдалось увеличение лимфоузлов, селезенки и печени. Морфологически опухолевый субстрат у большинства пациентов был представлен

лимфоцитами среднего размера, с неправильной (с вдавлениями или расщеплениями) формой ядер. У одного из обследованных пациентов был выявлен бластоидный вариант ЛКМЗ, с опухолевым субстратом в виде бластов.

При иммунофенотипировании лейкоцитов периферической крови у всех больных был выявлен следующий иммунофенотип опухолевых клеток СШ9+С05+СП)23-С020+С022+С043±РМС7+.

Сравнение экспрессии С020 и СЭ45 на лимфоцитах при ХЛЛ, ВКЛ, ЛМЗС, И ЛКМЗ и реактивных лимфоцитозах.

При анализе плотности поверхностных рецепторов (МР1) лимфоцитов при некоторых формах В-ЛПЗ и реактивных лимфоцитозах наиболее значимые различия были выявлены для МР1 СЭ20 и С045. Полученные результаты оценки плотности экспрессии С020 представлены в таблице 4 и на диаграмме 2.

Таблица 4 Сравнение МП СР20 у доноров и больных с реакшш ими лимфощптами нВ-ЛШ

ДОНОРЫ (п=23) РЕАКЦИЯ (п=68) ХЛЛ (п=201) ВКЛ (п=30) ЛМЗС (п=22) ЛКМЗ (п=20)

CD20FITC (MFI) 276,5±12,6 285,4±9,6*** 52,9±1,8* 907,4±67,1* 427,3±30,0* 375±27,7**

где* р<0,001 ** р<0,05 *** р>0,05 по сравнению с донорами

Кроме расчета коэффициента Стьюдента, который показывает статистическую значимость различий, для оценки клинической значимости различий в плотности экспрессии С020, был рассчитан доверительный интервал (ДИ) для разности истинных средних генеральных совокупностей <ргЦ2 < Таблица 5

Таблица 5 ДИ сравнения разности средних МПСШО июологических групп между собой и донорами

ЛКМЗ ЛМЗС ВКЛ ХЛЛ РЕАКЦИЯ

ДОНОРЫ (п=23) 276,5±12,6 42,05 <Цлкмг рлон< 154,9 t<).05 74,5 <Цлмзс-рлон< 227,0 to.()5 359,4 <цвкл-Цдон< 902,4 to.oill 201,1 <Цдон-Цхлл< 246,07 to.no | -68,0 <цР.я- рЛон< 50,2 t).05

РЕАКЦИЯ (п=68) (М±ш 285,4±9,62) 37,5<Цлкмг Цр- я<141,7 to.ooi 87,5 <рлмзс- Ир-я<196,2 tü.ooi 545,6<Цвкл- Цр-я<698,4 t).(K)l 196,4<рР.я- йхлл^бв^ t(),ooi

ХЛЛ (п=201) (М±т 52,9±1,82) 287,7<Цлкмз-Цхлл< 356,4 to.lXll 328,5<Цлмзс- Цхлл<420,3 to.ooi 760,7<Цвкл- Цхлл<948,2 tii.mi

ВКЛ (п=30) (М±т 907,4±67,1) 207,9<Цвкл- Илкмз<856,8 to.OOl 184,5<рВкл-Цлмзс<775,6 tl.nfll

ЛМЗС (п=22) (М±т 427,3±30) -45,0<Цлмзс-Цлкмз< 149,6 to.05

Таким образом, при оценке ДИ для разности средних показателей плотности экспрессии (МР1) СЭ20 лимфоцитами периферической крови доноров и больных реактивными состояниями, а так же при сравнении экспрессии данного антигена у больных ЛКМЗ и ЛМЗС, доверительный интервал включал в себя ноль, что свидетельствует об отсутствии различий по экспрессии С020 между этими группами.

В то же время, наши данные позволяют говорить о статистически значимых различиях в экспрессии С020 лимфоцитами доноров и больных ЛКМЗ(р<0,05), ЛМЗС(р<0,05), ВКЛ (р<0,001) и ХЛЛ(р<0,001). При сравнении между собой плотности экспрессии СОЮ лимфоцитами пациентов с различными нозологическими формами были также выявлены достоверные (р<0,001) различия.

Диаграмма 2. Сравнение плотности экспрессии С020 на лимфоцитах ириХЛЛ, ВКЛ, ЛМЗС, ЛКМЗ и реактивных лимфоцитозов с донорами

1000

900 -800

700 600 500 400

300 200 100 0

ЛЕИ

■ДОНОРЫ

□ РЕАКЦИЯ О ХМ

□ ВКЛ

□ ЛКМЗ О ЛМЗС

ДОНОРЫ РЕАКЦИЯ ХЛЛ

ВКЛ

ЛКМЗ

ЛМЗС

Таким образом, у пациентов ХЛЛ отмечалось значительное снижение N№1 С020 по сравнению с донорами и больными другими В-ЛПЗ. Экспрессия СБ20 лимфоцитами периферической крови больных ВКЛ, ЛКЗМ и ЛМЗС была достоверно (р<0,001) выше, чем у доноров. При этом самые высокие значения экспрессии зарегистрированны у больных ВКЛ.

Таблица 6 Сравнение МР1 СБ45 у доноров и больных с реактивными лимфоцитозами и В-ЛПЗ

ДОНОРЫ (п=23) РЕАКЦИЯ (п=68) ХЛЛ (11=201) ВКЛ (11=30) ЛМЗС (п=22) ЛКМЗ (п=20)

С045К1ТС (1УШ) 273,5±7,5 242,6±9,6*** ]84,15±5,8* 250,8±36,9*** ]99,8±15,5* 200,1 ±20,8**

где : *р<0,001, **р<0,05, ***р>0,05 по сравнению с донорами,

Полученные результаты оценки плотности экспрессии С045 представлены в таблице 8 и на диаграмме 3

Доверительные интервалы (ДИ) для разности истинных средних по МР1 СЭ45 для генеральных совокупностей <ЦгР2 < представлены в таблице 7.

Таблица 7 ДИ сравнения разности средних \1FICD45 нозологических групп между собой и донорами______

ЛКМЗ(п=20) (М±т200,01±2 0,8) ЛМЗС ВКЛ ХЛЛ РЕАКЦИЯ

ДОНОРЫ (11=23) 273,5±7,5 31,0<Цлкмз- Цдон<115,8 to.05 14,7<Цлмзс-Цдон<132,2 to.ooi -17,9<Цвкл- Цдон<63,1 to.os 39,8<ЦдОН-Цхлл< 138,7 to.ooi -1,14<Цр.я-цдон< 62,7 to,05

РЕАКЦИЯ (п=68) (М±т 242,6±9,6) 13,5<Цлкмз-нр-Я<71,7 to.05 13,5<(Хлмзс-ЦР.Я<71,8 to.OS -19,17<цв,сл-цР.я<35,57 to,05 31,5< цр.я- ^„<85,4 to.ooi

ХЛЛ (п=201) (М±т 184,15±5,8 -18,2<ЦЛКМЗ-Цхлл <74,0 to,05 -10,9<Цлмзс-Цхлл<42,5 to ,05 27,5<цвкл- Ихлл<Ю5,7 to.ooi

ВКЛ (п=30) (М±т 250,8±16,9) 17,2<Цвкл- Цлвю<84,4 Чп5 16,97<Цвкл-ЦЛМЗС<84,7 to.os

ЛМЗС (11=22) (М±т 199,96±15,5) -52,4<Цлмзс- Цлкмз<52,2 to,05

При оценке ДИ по MF1CD45 для разности средних между донорами и больными BKJI и реактивными состояниями, доверительный интервал включал в себя нулевое значение, что говорит об отсутствии различий по экспрессии CD45 между этими группами пациентов. Значимых различий не получено при сравнении плотности экспрессии CD45 между группами больных XJIJI, ЛКМЗ и JTM3C. Однако, было получено статистически значимое (р<0,05) снижение экспрессии CD45 в группе больных ХЛЛ, ЛКМЗ и ЛМЗС по сравнению с экспрессией данного антигена у доноров, больных ВКЛ и пациентов с реактивными лимфощтгозами.

Диаграмма 3. Сравнение плотности экспрессии CD45 лимфоцитами при ХЛЛ, ВКЛ, ЛМЗС, ЛКМЗ и реактивных лимфоцито-зах и доноров

Таким образом, анализ экспрессии С045 может быть полезен для дифференциальной диагностики реактивных лимфоцитозов и ВКЛ от ХЛЛ, ЛМЗС и ЛКМЗ, отличающихся более низкой плотностью данного антигена. Кроме того, оценка экспрессии СЭ45 повышает возможность дифференциальной диагностики таких близких по морфологическим (наличие выростов цитоплазмы на опухолевых клетках) и клиническим (спленомегалия) признакам заболеваний как ВКЛ и ЛМЗС. При ВКЛ МП С045 достоверно выше таковой при ЛМЗС.

V. Характеристика экспрессии СЭ43 опухолевыми лимфоцитами при В-клеточных лимфопролиферативных заболеваниях

В настоящее время продолжаются поиски новых антигенов, анализ экспрессии которых может быть полезен для диагностики или дифференциальной диагностики различных форм ЛПЗ. Одним из таких антигенов является С043, экспрессия которого практически отсутствует на нормальных В-лимфоцитах и появляется при некоторых формах ЛПЗ. Однако данные по исследованию экспрессии этого антигена опухолевыми клетками при ЛПЗ немногочисленны и достаточно противоречивы. В связи с чем мы предприняли попытку оценить характер экспрессии СЭ43 при некоторых формах В-ЛПЗ. Полученные нами данные представлены в таблице8 и диаграмме 4.

Таблица 8 Характер экспрессии С043 больных с ХЛЛ. ВКЛ, ЛМЗС и ЛКМЗ _

ХЛЛ п=201 ВКЛ п=30 ЛМЗС [1=22 лкмз п=20

СЭ43 (%) 76,0± 4.7 0,9 ± 0,1 0,7 ± 0,3 36.4± 14,8

С043ПТС (МП) 49,0 ± 6,4 0,7 ± 0,1 0,5 ± 0,1 16,3 ± 4,1

Диаграмма 4.

СРАВНЕНИЕ ПЛОТНОСТИ ЭКСПРЕССИИ С043 ПРИ ХЛЛ, ВКЛ, ЛМЗС ■ ЛКМЗ

1

ХЛЛ ВО ЛМЗС лк\в

Среди всех обследованных нами больных ХЛЛ определялась экспрессия СЭ43 на опухолевых лимфоцитах (93,6 % - от всех В-лимфоцитов), при этом плотность экспрессии СЭ43 (МР1) составляла 49,0 ± 6,4 . В случаях таких ЛПЗ, как волосаток-леточный лейкоз (ВКЛ) и лимфома маргинальной зоны селезенки (ЛМЗС) экспрес-

сия С043 на В-лимфоцитах отсутствовала. Только 13 у больных с ЛКМЗ из 20 случаев наблюдалась экспрессия СЭ43 на половине В-лимфоцитов, при этом плотность экспрессии данного антигена была ниже, чем у больных В-ХЛЛ. На рисунке 11 приведены графики отражающие экспрессию С043 на В-лимфоцитах у донора, при ХЛЛ и ЛКМЗ.

0й 101 10' 10" CDJjniC

Patient ID: N Tube: CD43/CD19

Quad % Gated X Mean Y Mean

UL 1469 148 36142

UR 0.80 82.50 98.30

LI 0.73 3.73 1.88

LR 83 78 7846 195

Patient ID: CLL Tube: CD43/CD22

Quad % Gated X Шап у Мвэп

UL 0 84 4 01 633 88

UR 86 36 58.83 89.44

LL 0 34 3.70 3.00

1Я 12.46 123.67 2.75

CD43P1TC Patient ID. MCL Tube CD43/CD20 Quad % Gated X Mean У Mean UL 35.91 6 31 134.24 UR 53.37 16.69 131.97 LL 0.50 4.83 2.65 LR 10.22 48.82 2.42

Рис. 2 Точечные графики экспрессии (1)43 лимфоцитами доноров , больных ХЛЛ и ЛКМЗ а- на В-лимфоцитах доноров С043 не экспрессируется в- экспрессия С043 на 86,36% В-лимфоцитов при ХЛЛ, ММ (1)43= 38,83 с- экспрессия С043 на 53,37% В-лимфоцитов (всего 89,28%,) при ЛКМЗ, МР1 С043=16,69

Таким образом, исследование С043 может служить дополнительным критерием в дифференциальной диагностике В-ЛПЗ. Включение в диагностическую панель С043 повышает возможности дифференциальной диагностики В-клеточных лимфопролиферативных заболеваний.

В результате проведенной работы нами предложен вспомогательный алгоритм дифференциальной диагностики наиболее частовстречающихся В-клеточных лимфопролиферативных заболеваний и реактивных лимфоцитозов.

Алгоритм дифференциальной диагностики ХЛЛ, ВКЛ, ЛМЗС, ЛКМЗ и

реактивных лимфоцитозов

МЕ1 С020/МЕ1 СБ45

МИ СБ20и МП СБ451 ХЛЛ++

МП СБ20| МП СТ>45| ЛКМЗ? ИЛИ ЛМЗС?

1

МП СБ20К МИ CD45N

МИ СП20 ТТТ МП CD45N ВКЛ+++

СБ19 СБ5 СБ43

СБ19+ СБ5+СВ43+ МР1 СБ43|

СБ 19+ СВ5+СБ43± МР1 СБ431

СБ 19+ СБ5-СБ43

ЛИМФОМА ИЗ

ХРОНИЧЕСКИИ КЛЕТОК

ЛИМФОЛЕИКОЗ МАНТИИНОИ

ЗОНЫ

ЛИГЛФОМА МАРГИНАЛЬНОЙ ЗОНЫ СЕЛЕЗЕНКИ

ВОЛОСАТО-КЛЕТОЧНЫЙ ЛЕЙКОЗ

РЕАКТИВНЫЙ ЛИМФОЦИТОЗ

Выводы

1) Для оценки плотности экспрессии поверхностных антигенов может использоваться средняя интенсивность флуоресценции (MFI) при условии стандартизации методики включающей в себя:

• стандартный (постоянный и достаточный) объем моноклональных антител вносимых в пробу

• использование для анализа MFI флуорохромы одного типа

• использование для сравнения межу собой реагенты одной фирмы производителя

2) Иммунофенотип опухолевых лимфоцитов не зависит от морфологического варианта хронического лимфолейкоза (XJIJI), и характеризуется экспрессией CD 19, CD20, CD5, CD23, CD43 (к или X). Опухолевые В-лимфоциты при хроническом лимфолейкозе достоверно отличаются от нормальных В-лимфоцитов снижением плотности экспрессии (MFI) CD19 (р<0,05) на величину доверительного интервала (ДИ) от 32,7 до 109,5; CD20 (р<0,001) - ДИ от 201,1 до 246,07 и CD45 (р<0,001) -ДИ от 39,7 до 138,7. Плотность экспрессии CD23 не отличается от таковой у доноров.

3) На стадиях А В и С хронического лимфолейкоза в соответствии с классификацией Binet (развернутая стадия) характер экспрессии антигенов CD19, CD20, CD45 не меняется. При переходе заболевания в стадию прогрессировании выявлено достоверное повышение (р<0.01) плотности экспрессии (MFI) только CD20, в экспрессии CD 19 и CD45 значимых отличий получено не было. При этом экспрессия данных антигенов остается достоверно ниже таковой у доноров. Экспрессия CD23 при прогрессировании заболевания не меняется.

4) Анализ экспрессии CD20 выявил достоверное увеличение плотности данного антигена по сравнению с плотностью его экспрессии у доноров и больных волоса-токлеточным лейкозом (BKJI) 359,4<цяк„-рм < 902,4 (р<0,001), у больных лимфо-мой из клеток мантийной зоны (JIKM3) 42,05<цЛкмз-Цы< 154,9 (р< 0,05), у больных лимфомой маргинальной зоны селезенки (ЛМЗС) 74,5<цЛмзс-Цк<227,1. При этом достоверных отличий в экспрессии CD20 в группах больных ЛКМЗ и ЛМЗС выявлено не было. Экспрессия CD20 у больных ВКЛ была выше таковой у больных ЛКМЗ и ЛМЗС.

5) Показано статистически значимое (р<0,05) снижение плотности экспрессии CD45 в группе больных XJIJI, ЛКМЗ и ЛМЗС по сравнению с донорами, больными ВКЛ и пациентами с реактивными лимфоцитозами. Кроме того, при ВКЛ MFI CD45 достоверно выше 16,97<цВкл-Цлмзс<84,7 (р< 0,05) таковой при ЛМЗС, что улучшаеи дифференциальную диагностику таких близких по морфологическим и клиническим признакам заболеваний.

6) Анализ экспрессии CD43 выявил присутствие данного антигена на В-лимфоцитах у 100% больных ХЛЛ и у 58% больных ЛКМЗ, и отсутствие его у доноров, больных ВКЛ, ЛМЗС и пациентов с реактивными состояниями. Среди опухолевых клеток наиболее высокие показатели плотности экспрессии (MFI) наблюдались у больных ХЛЛ. Оценка CD43 может служить дополнительным маркером в дифференциальной диагностике B-клеточных лимфопролиферативных заболеваний.

Список опубликованных работ:

1. Chronic natural killer cell-type large granular lymphocyte leukemia. Clinical data and surface marker analysis. Lugovskaya S., Doronin V, Pochtar M. Naumova E. Iternationational Journal of Labaratory Hematology 2008, 30(Suppl. 1)

2. Особенности экспрессии CD43 при лимфопролиферативных заболеваниях и реактивных лимфоцитозах. Наумова Е.В.. Почтарь М.Е., Сидорова Е.П., Штацкая Е.И., Луговская С.А. Клиническая лабораторная диагностика. 2008. № 9.С. 72-73.

3. Определение стандартных условий выполнения методики оценки плотности поверхностных рецепторов по значению средней интенсивности флюоресценции. Наумова Е.В.. Почтарь М.Е., Лузин М.Н. Клиническая лабораторная диагностика. 2008. № 10. С. 43-47.

4. Современные подходы к терапии острого лимфобластного лейкоза у подростков и лиц молодого возраста. Сёмочкин C.B., Лория С.С., Куликова С.С., Антипова Л.А., Бобкова М.М., Иванова В.Л., Луговская С.А., Лунин В.В., Наумова Е.В.. Почтарь М.Е. и др. Вопросы гематологии, онкологии и иммунопатологии в педиатрии. 2008. Т. 8. № 1. С. 26-32.

Сокращения

АГ - антиген AT- антитело

BKJI - волосатоклеточный лейкоз

ВОЗ - всемирная организация здравоохранения

ДИ - доверительный интервал

ЛКМЗ - лимфома из клеток мантийной зоны

ЛМЗС - лимфома маргинальной зоны селезенки

ЛМЛ - лимфома из малых лимфоцитов

ЛПЗ - лимфопролиферативные заболевания

МАТ - моноклональные антитела

OAK - общий анализ крови

ХЛЛ - хронический лимфолейкоз

ABC (antibody bound per cell) - количество антигенных молекул на поверхности или внутри клетки

CD (cluster differentiation) - кластер дифференцировки FITC - флюоресцеинизотиоцианат FSC - прямое светорассеивание HGB - гемоглобин

MESF (molecules of equivalent soluble fluorochrome)- молекулы эквивалентного раство' римого флуорохрома

MFI (mean fluorescence intensity) - средняя интенсивность флуоресценции РЕ - фикоэритрин

РегСР - перидинин-хлорофилл протеин PLT - тромбоциты RBC (red blood cells) - эритроциты SSC - боковое светорассеивание WBC (white blood cells) - лейкоциты

к исполнению 11/05/2010 Исполнено 11/05/2010

Заказ № 1235 Тираж 100 экз.

ООО «СМСА» ИНН 7725533680 Москва, 2й Кожевнический пер., 12 +7(495)604-41-54 www.cherrypie.ru

Заключение

Не существует единого мнения по поводу того, как описывать плотность экспрессии. При оценке плотности экспрессии поверхностных антигенов в литературе, как правило, описаны два подхода:

1) Количественный - подсчет точного количества антигенных молекул на поверхности или внутри клетки (ABC - antibody bound per cell), для этого должен использоваться набор QuantiBRITE® РЕ* BD, но есть несколько проблем, затрудняющие его использование повсеместно в диагностической практике:

• Необходимость использования МАТ, для которых эффективное соотношение белок:флюорохром строго соответствует 1:1

• В многоцветной проточной цитофлуориметрни нас интересуют антигены, моноклональные антитела к которым мечены различными флуорохромами, а данная методика возможна только для РЕ меченых МАТ.

• Высокая стоимость набора

2) Качественная - выражение плотности экспрессии в относительных величинах, таких как dim (клетки с низким уровнем экспрессии целевого маркера), moderate (клетки с промежуточным уровнем экспрессии), bright (яркий уровень экспрессии) [15], либо low, average, high [10] Но такой подход не всегда удобен. Например, если уровень экспрессии CD20 при ХЛЛ низкий (dim), в норме CD20 экспрессируется умеренно (moderate), при ЛМЗС и ЛКМЗ - ярко, то при ВКЛ плотность экспрессии CD20 в ~ 3 раза выше, чем при ЛМЗС и ЛКМЗ, что трудно отразить как просто ярко (bright). Но, даже если, при сравнении плотности экспрессии CD между нозологическими группами такой подход, в некотором смысле, уместен, то внутри одного заболевания оценка экспрессии становится затруднительна.

В связи с вышесказанным, мы предлагаем описывая плотность экспрессии того или иного маркера в цифровом выражении MFI, указывать нормальные значения MFI, полученные на донорах в конкретной лаборатории с соблюдением стандартных условий.

Кроме того, при использовании для терапии лимфопролиферативных заболеваний препаратов на основе МАТ, целесообразно учитывать экспрессию АГ для подбора адекватной схемы. Например, уровень экспрессии CD20 у доноров (193,6-366,4), при XJIJI у больного X. MFI CD20 всего 24,8, а у больного У. 104,6. Допустим, масса опухоли одинаковая, лимфоциты обоих больных экспрессируют CD20 с более низкой плотностью, чем доноры, но MFI CD20 больного У практически в 4 раза выше таковой у больного X. Возможно, в такой ситуации, доза препарата для больного У может быть ниже, чем для больного X. Либо, больной У, вероятней всего, лучше ответит на терапию, включающую в себя моноклональные антитела к CD20, чем больной X.

По данным литературы выделяются формы XJIJI в зависимости от морфологии опухолевого субстрата. [7,8,24] В виду близости и субъективизма морфологических признаков дифференциальная диагностика ЛПЗ в настоящее время базируется на данных иммунологических и молекулярно-биологических методов исследований. Разработаны основные иммунологические критерии диагностики различных вариантов ЛПЗ, определен ряд прогностических критериев. Однако не всегда заболевания протекают в классической форме с четкими морфологическими и иммунологическими критериями. Все большее число больных попадают в поле зрения врачей на доклинической стадии развития заболевания при отсутствии клинических и морфологических признаков заболевания, когда опухолевая масса еще не велика и присутствие достаточного количества нормальных лимфоцитов нивелирует признаки опухолевой пролиферации, затрудняя раннюю постановку диагноза.

Мы оценили иммунофенотип опухолевых лимфоцитов с классической и атипичной морфологией опухолевых клеток у 70 больных ХЛЛ. Анализ экспрессии CD 19, CD20 CD23 и CD 45 между больными с различными морфологическими вариантами ХЛЛ достоверных различий не выявил. Изменения иммунофенотипа опухолевых В-лимфоцитов по отношению к донорам носили однотипный характер. У больных с различным по морфологии опухолевым субстратом при ХЛЛ нет различий в иммунофенотипических характеристиках опухолевых клеток.

При оценке изменения плотности экспрессии CD 19 CD20 CD23 CD45 у больных ХЛЛ по отношению к донорам наблюдалось следующее:

• плотность экспрессии CD 19 была достоверно ниже чем у доноров доверительный интервал (ДИ) для разности истинных средних 23,3 <Цдон~

Ц'Хлл< 158,4 (р<0,05)

• плотность экспрессии CD20 была значительно ниже чем у доноров ДИ 201,1<Цдон-Цхлл< 246,07 (р<0,001)

• плотность экспрессии CD45 ниже чем у доноров ДИ 39,7<Цдон~М'Хлл< 138,7 (р<0,05)

Достоверных различий в плотности экспрессии CD23 лимфоцитами периферической крови доноров и больных ХЛЛ выявлено не было.

В течение любой опухоли существуют две стадии: первая моноклональ-ная — доброкачественная и вторая, стадия повышенной мутабельности, характеризующаяся появлением субклона и всеми чертами злокачественной опухоли. Стадии и форма заболевания одновременно являются прогностическими факторами, к которым можно добавлять более глубокие исследования [8]. Современные методы лечения подразумевают различную тактику ведения больных в зависимости от стадии заболевания, что требует более детальной диагностики состояния больного, своевременной оценки признаков прогрессирования заболевания.

Оценка некоторых показателей общего анализа крови, в зависимости от клинической стадии ХЛЛ, показала тенденцию к увеличению количества лейкоцитов и лимфоцитов, а так же к снижению количества эритроцитов и тромбоцитов по мере прогрессирования'заболевания. Однако данные изменения крайне индивидуальны и не могут служить надежным критерием прогрессировать заболевания. Попытка оценить иммунологические изменения опухолевых клеток показала, что значимых различий в плотности экспрессии антигенов CD 19, CD20 и CD45 лимфоцитами больных ХЛЛ на стадиях А, В и С ( по Binet) получено не было, но наблюдалась тенденция к увеличению MFI CD20 и CD45 по мере развития заболевания. Достоверное (р<0,01) увеличение MFI относительно развернутой стадии на стадии прогрессии наблюдалось только для CD20, в экспрессии CD 19 и CD45 значимые отличия не получены. Следовательно, увеличение плотности экспрессии CD20 и CD45 у больных ХЛЛ по мере развития заболевания, совместно с нарастанием клинических симптомов, могу указывать на прогрессирование заболевания и служить в качестве дополнительного прогностического критерия трансформации ХЛЛ в терминальную стадию.

Иммуиофенотипирование лимфоцитов периферической крови у пациентов с реактивными лимфоцитозами не выявило клинически значимых различий с донорами в экспрессии CD 19, CD20, CD23 и CD45. Даже в тех случаях, когда отмечалось некоторое увеличение популяции В-лимфоцитов соотношение количества клеток экспрессирующих иммуноглобулины с различными типами легких цепей (к или X ) оставалось в нормальным, что указывает на поликлональную пролиферацию В-лимфоцитов.

Сравнение MFI CD20 у пациентов разных нозологических групп и доноров выявило значительное снижение плотности экспрессии CD20 у больных ХЛЛ по сравнению с донорами и со всеми В-ЛПЗ. Также были получены значимые отличия в экспрессии CD20 при сравнении MFI CD20 у больных разными формами В-ЛПЗ между собой.

Анализ экспрессии CD45 может быть полезен для дифференциальной диагностики реактивных лимфоцитозов от ХЛЛ, ЛМЗС и ЛКМЗ отличающихся более низкой плотностью данного антигена. Кроме того, оценка экспрессии CD45 может помочь в дифференциальной диагностике таких близких по морфологическим (наличие выростов цитоплазмы на опухолевых клетках) и клиническим (спленомегалия) признакам заболеваний как ВКЛ и ЛМЗС. При ВКЛ MFI CD45 достоверно выше таковой при ЛМЗС.

Помимо заболеваний с классической клинической картиной довольно часто встречаются ЛПЗ со стертым клиническим течением и аберрантным фенотипом. Исследование CD43 может служить дополнительным маркером в дифференциальной диагностике В-ЛПЗ. При ХЛЛ CD43 экспрессируется опухолевыми В-лимфоцитами с более высокой плотностью, чем клетками ЛКМЗ. При таких ЛПЗ, как волосатоклеточный лейкоз (ВКЛ) и лимфома маргинальной зоны селезенки (ЛМЗС) экспрессия CD43 на В-лимфоцитах отсутствует. Добавление, к стандартной диагностической панели CD43 расширяет возможности дифференциальной диагностики В-клеточных лимфо-пролиферативных заболеваний.

В результате проведенной работы нами предложен алгоритм, направленный на улучшение дифференциальной диагностики реактивных лимфоцито-зов, ХЛЛ, ВКЛ, ЛМЗС и ЛКМЗ

Алгоритм дифференциальной диагностики ХЛЛ, ВКЛ, ЛМЗС, ЛКМЗ и реактивных лимфоцитозов о

Для оценки плотности экспрессии антигенов может использоваться MFI при условии стандартизации методики анализа включающей в себя:

• стандартный (постоянный и достаточный) объем моноклональ-ных антител вносимых в пробу

• использование для анализа MPI флуорохромы одного типа

• использование для сравнения межу собой реагенты одной фирмы производителя

Иммунофенотип опухолевых лимфоцитов не зависит от морфологического варианта ХЛЛ, и характеризуется экспрессией CD 19, CD20, CD5, CD23, CD43 (к или X). Опухолевые В-лимфоциты при ХЛЛ достоверно отличаются от нормальных В-лимфоцитов снижением плотности экспрессии (MFI) CD 19 (р<0,05) на величину доверительного интервала (ДИ) от 32,7 до 109,5; CD20(p<0,001) - ДИ 201,1 до 246,07 и CD45 (р<0,001) — ДИ от 39,7 до 138,7. Плотность экспрессии CD23 не отличается от таковой у доноров. На стадиях А В и С по Binet (развернутая стадия) ХЛЛ характер экспрессии антигенов CD 19, CD20, CD45 не меняется. При переходе заболевания в стадию прогрессировании выявлено достоверное повышение (р<0.01) плотности экспрессии (MFI) только CD20, в экспрессии CD 19 и CD45 значимых отличий получено не было. При этом экспрессия данных антигенов остается достоверно ниже таковой у доноров. Экспрессия CD23 при прогрессировании заболевания не меняется.

Анализ экспрессии CD20 выявил достоверное увеличение плотности данного антигена по сравнению с плотностью его экспрессии у доноров и больных волосатоклеточным лейкозом (ВКЛ) 359,4<рвкл-pN < 902,4 (р<0,001), у больных лимфомой из клеток мантийной зоны (JIKM3) 42,05<цлкмз-Цы<154,9 (р< 0,05), у больных лимфомой маргинальной зоны селезенки (ЛМЗС) 74,5<цЛмзс-Цы<227,1. При этом достоверных отличий в экспрессии CD20 в группах больных JIKM3 и ЛМЗС выявлено не было. Экспрессия CD20 у больных ВКЛ была выше таковой у больных ЛКМЗ и ЛМЗС.

Анализе плотности экспрессии CD45 показал статистически значимое (р<0,05) снижение экспрессии данного антигена в группе больных ХЛЛ, ЛКМЗ и ЛМЗС по сравнению с донорами, больными ВКЛ и пациентами с реактивными лимфоцитозами. Кроме того, при

ВКЛ MFI CD45 достоверно выше 16,97<^ВКл-^лмзс<84,7 (р< 0,05) таковой при ЛМЗС, что может быть полезно для дифференциальной диагностике таких близких по морфологическим (наличие выростов цитоплазмы на опухолевых клетках) и клиническим (спленомегалия) признакам заболеваний.

Анализ экспрессии CD43 выявил присутствие данного антигена на В-лимфоцитах у 100% больных ХЛЛ и у 58% больных ЛКМЗ, и отсутствие его у доноров, больных ВКЛ, ЛМЗС и пациентов с реактивными состояниями. Среди опухолевых клеток наиболее высокие показатели плотности экспрессии (MFI) наблюдались у больных ХЛЛ. Оценка CD43 может служить дополнительным маркером в дифференциальной диагностике В-ЛПЗ.