Автореферат и диссертация по медицине (14.03.10) на тему:Оценка прогноза и минимальной резидуальной болезни при В-клеточном хроническом лимфолейкозе с использованием метода многоцветной проточной цитофлуориметрии.

На правах рукописи

Кисиличина Дарья Григорьевна

ОЦЕНКА ПРОГНОЗА И МИНИМАЛЬНОЙ РЕЗИДУАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ ПРИ В-КЛЕТОЧНОМ ХРОНИЧЕСКОМ ЛИМФОЛЕЙКОЗЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДА МНОГОЦВЕТНОЙ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОФЛУОРИМЕТРИИ

14.03.10 - Клиническая лабораторная диагностика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 4 НОЯ 2013

Москва 2013

005537781

005537781

Работа выполнена на кафедре клинической лабораторной диагностики ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздрава России

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор Луговская Светлана Алексеевна

Научный консультант:

кандидат медицинских наук Никитин Евгений Александрович

Официальные оппоненты:

Тупицын Николай Николаевич - доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией иммунологии гемопоэза ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина» РАМН Семикина Елена Леонидовна - доктор медицинских наук, заведующая централизованной клинико-диагностической лабораторией ФГБУ «Научный центр здоровья детей» РАМН

Ведущая организация:

ФГУ «Главный военный клинический госпиталь имени академика H.H. Бурденко» Министерства обороны РФ

Защита диссертации состоится «18» декабря 2013 года в 10:00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.071.04 при ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздрава России по адресу: 123995, г. Москва, ул. Баррикадная, д.2/1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздрава России (125445, г. Москва, ул. Беломорская, д. 19).

Автореферат разослан «_

2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Шабалова И.П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Несмотря на значительные успехи, достигнутые в терапии В-клеточного хронического лимфолейкоза (В-ХЛЛ) за последнее десятилетие, общая выживаемость больных значительно варьирует от 2 до 20 лет и более. Данное заболевание представлено агрессивной и вялотекущей формами, различающимися скоростью развития клинических проявлений и некоторыми молекулярными особенностями опухолевых клеток. В лечении В-ХЛЛ большое значение приобретает индивидуальный подход, который зависит как от показателей соматического статуса больного, так и от точности определения различных прогностических факторов, определяющих течение заболевания |^а1уз Е.М. е1 а1. 2012]. Среди молекулярных характеристик наиболее надежным прогностическим маркером, предсказывающим скорость прогрессирования В-ХЛЛ, является мутационный статус генов вариабельного региона тяжелых цепей иммуноглобулинов, т.е. 1§УН-генов. Наличие соматических мутаций ^УН-генов коррелирует с благоприятным прогнозом, отсутствие таковых - с агрессивным течением В-ХЛЛ [НатЫш ТЛ. е1 а1. 1999]. Однако определение данного параметра остается недоступным для рутинной практики, в связи с чем предлагается использовать суррогатные маркеры - показатели экспрессии С038 и гАР-70 клетками В-ХЛЛ, оцениваемые с помощью лазерной проточной цитофлуориметрии [БИапаГеи Т.О. 2009]. Антиген С038 в норме присутствует на мембране В-клеточных предшественников, В-лимфоцитов терминального центра фолликулов лимфатических узлов и на плазматических клетках [Ма1ауаБ1 Р. й а1. 2008], участвуя в транспорте ионов кальция, оказывая влияние на проведение сигналов с В-клеточного рецептора (ВСЯ) и обеспечивая взаимодействие В-лимфоцитов с микроокружением в результате связывания лигандов - молекул С031 и гиалуроновой кислоты

3

[Deaglio S. et al. 2007, Malavasi F. et al. 2011]. Маркер ZAP-70 представляет собой внутриклеточную тирозинкиназу, которая функционирует в Т- и NK-лимфоцитах, участвуя в фосфорилировании тирозин-содержащих последовательностей при связывании иммунорецепторов, опосредуя таким образом проведение сигнала к клеточному ядру и активацию лимфоцитов {Bene M. et al. 2006]. ZAP-70 не экспрессируется в нормальных циркулирующих В-лимфоцитах, но обнаруживается на ранних стадиях В-клеточного развития [Schweighoffer Е. et al. 2003]. В ряде случаев В-ХЛЛ в опухолевых В-лимфоцитах выявляется экспрессия CD38 и ZAP-70, что способствует усилению передачи сигналов от ВСЯ, активной пролиферации моноклональных В-клеток и ассоциируется с агрессивным течением заболевания [Orchard J.A. et al. 2004, Buschenfelde C.M et al 2010]. Рассмотренные факторы должны определяться при первичной диагностике для оценки варианта течения В-ХЛЛ на ранних стадиях заболевания. Однако данные литературных источников относительно корреляции антигенов CD38 и ZAP-70 с мутационным статусом, а также их индивидуальной значимости весьма противоречивы [Letestu R. et al. 2006, Marti G. et al. 2006, Chiorazzi N. 2012].

Помимо молекулярных особенностей клеток B-XJIJI для индивидуализации терапевтического подхода важное значение имеет анализ показателей ответа на терапию. Последние позволяют выявлять случаи достижения раннего глубокого ответа либо рефрактерности к проводимому лечению [Paietta Е. 2002]. На сегодняшний день качество ремиссии при В-ХЛЛ характеризуется с помощью критерия наличия или отсутствия минимальной резидуальной болезни (МРБ), т.е. остаточного опухолевого клона в крови или костном мозге [Marie С. et al. 2009]. Эрадикация МРБ предопределяет выживаемость, и даже среди пациентов с полной клинико-гематологической ремиссией именно достижение МРБ-негативного статуса ассоциируется с благоприятным прогнозом [Rawstron et al. 2007, Н.А.

4

Купрышина и H.H. Тупицын 2012]. В настоящее время используются два метода определения МРБ при B-XJIJ1 на необходимом уровне чувствительности (10"4, т.е. 0,01% опухолевых клеток от числа проанализированных лейкоцитов) - это ПЦР с использованием пациент-специфичных праймеров и многоцветная проточная цитофлуориметрия. Указанные подходы характеризуются разными преимуществами и недостатками, в связи с чем представляет интерес сравнительный анализ методов для применения в рутинной диагностике МРБ при B-XJIJ1. Кроме того, отсутствие информации о значении используемого биоматериала (периферическая кровь, костный мозг) и данных относительно кинетики элиминации опухолевого клона B-XJ1JI на фоне современной иммунохимиотерапии свидетельствуют о необходимости детальной оценки особенностей мониторирования противоопухолевого ответа с помощью показателя МРБ.

Цель исследования - оценить минимальную резидуальную болезнь и иммунофенотипические маркеры (CD38, ZAP-70) в прогнозировании течения B-клеточного хронического лимфолейкоза.

Задачи исследования

1. Сопоставить результаты иммунофенотипического определения маркеров CD38 и ZAP-70 с данными молекулярно-генетического анализа мутационного статуса IgVH-генов.

2. Исследовать распределение иммунофенотипических маркеров (CD38 и ZAP-70) в прогностически разных группах больных B-XJIJI, выделенных по показателям времени до начала терапии и по критерию наличия МРБ на момент окончания лечения.

3. Провести сравнительный анализ результатов оценки МРБ методами многоцветной проточной цитофлуориметрии и пациент-специфичной ПЦР.

4. Модифицировать стандартизованный четырехцветный протокол оценки МРБ при В-ХЛЛ для 5- и 6-цветного цитофлуориметрического анализа, сравнить возможности различных иммунофенотипических подходов.

5. Оценить кинетику элиминации опухолевого клона B-XJUI в динамике современной иммунохимиотерапии В-ХЛЛ.

6. Определить значение показателя МРБ на основании данных о выживаемости больных В-ХЛЛ.

7. Сопоставить уровень МРБ в костном мозге и периферической крови при мониторировании опухолевой популяции на фоне терапии.

Научная новизна

В работе определено значение иммунофенотипических маркеров CD38 и ZAP-70 в прогнозе качества ответа на терапию у больных В-ХЛЛ. Впервые показана значимость исследования кинетики элиминации опухолевого клона В-ХЛЛ в процессе лечения. Выявлен пороговый уровень показателя минимальной резидуальной болезни, составляющий 0,12% клеток В-ХЛЛ от числа лейкоцитов, оценка которого после первых циклов стандартного курса терапии позволяет определить вероятность достижения МРБ-негативной ремиссии у больных В-ХЛЛ.

Практическая значимость

В работе доказана зависимость результатов исследования иммунофенотипических маркеров от используемого способа интерпретации данных для внутриклеточной тирозинкиназы ZAP-70 и от величины порогового уровня экспрессии для поверхностного маркера CD38. Определены оптимальные подходы к оценке данных параметров методом проточной цитофлуориметрии. Показана хорошая сопоставимость результатов определения МРБ методами проточной цитофлуориметрии и пациент-специфичной ПЦР (93% согласующихся данных). Разработан алгоритм мониторирования противоопухолевого ответа на основе показателя МРБ, оцениваемого с помощью метода многоцветной проточной

6

цитофлуориметрии. Определено значение используемого для оценки МРБ биоматериала (периферическая кровь или костный мозг) на различных этапах терапии B-XJIJI.

Личный вклад соискателя

Автором проведены клинический анализ крови и иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови и костного мозга, осуществлена статистическая обработка полученных данных.

Внедрение в практику

С 2011 г. в практику иммунологического отделения клинико-диагностической лаборатории ГКБ им. С.П. Боткина Департамента здравоохранения г. Москвы внедрены методы оценки прогноза и мониторирования остаточного клона B-XJIJI с помощью многоцветной проточной цитофлуориметрии. Иммунофенотипические маркеры CD38 и ZAP-70 предложены к использованию в отделении гематологии ГКБ им. С.П. Боткина в качестве суррогатных маркеров мутационного статуса генов вариабельного региона тяжелых цепей иммуноглобулинов и, соответственно, показателей агрессивности течения B-XJIJI. Разработанный алгоритм определения МРБ при B-XJIJI с помощью многоцветной проточной цитофлуориметрии успешно применен в практической оценке качества ответа на терапию при данном заболевании. Результаты работы внедрены в учебный процесс на кафедре клинической лабораторной диагностики ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава России.

Апробация работы состоялась на совместном заседании кафедры клинической лабораторной диагностики ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава России и сотрудников ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России, ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина» РАМН, ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России, ФГБУ «Научный центр здоровья детей» РАМН, ГБУЗ «Банк

стволовых клеток» ДЗМ «17» мая 2013 года. Основные положения диссертации были доложены на научно-практических конференциях «Национальные дни лабораторной медицины России 2010» (Москва, 2010), «Высокие технологии и модернизация в лабораторной медицине» (Москва, 2011), BD FACS User's Meeting (Сестрорецк, 2012), XXVIth International Symposium on Technological Innovations in Laboratory Hematology (Toronto, 2013), 18th Congress of the European Hematology Association (Stockholm, 2013). По материалам исследования опубликовано 10 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, входящих в перечень изданий, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста и состоит из следующих глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и их обсуждение», «Заключение», «Выводы». Список литературы включает 23 отечественных и 123 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 41 рисунком и 23 таблицами.

Положения, выносимые на защиту

1. Определение иммунофенотипических маркеров (CD38 и ZAP-70) позволяет прогнозировать течение заболевания и качество ответа на терапию при B-клеточном хроническом лимфолейкозе (В-ХЛЛ).

2. Многоцветная проточная цитофлуориметрия представляет собой наиболее применимый и быстрый метод диагностики минимальной резидуальной болезни при В-ХЛЛ, который может использоваться в широкой практике для мониторирования кинетики элиминации опухолевого клона.

3. Достижение МРБ-негативной ремиссии в результате лечения В-ХЛЛ ассоциируется с достоверным увеличением показателей беспрогрессивной выживаемости вне зависимости от метода терапии.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Пациенты и методы исследования

В работе представлены результаты исследования 163 пациентов с В-XJIJI и 10 условно здоровых лиц, полученные на кафедре клинической лабораторной диагностики ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава России. Группу больных составили 98 мужчин и 65 женщин в возрасте от 43 до 82 лет. Иммунофенотипирование выполнялось в нескольких точках наблюдения: до лечения, а также во время (после 3 курса) и/или после получения специфической ритуксимаб-содержащей терапии (после 6 курса) в соответствии с режимами FCR (fludarabine, cyclophosphamide, rituximab), FCR-lite или LR (leukeran, rituximab). Материалом исследования служили образцы периферической крови и костного мозга, стабилизированные К2ЭДТА.

В каждой точке наблюдения выполняли следующие исследования:

1. Клинический анализ крови

2. Морфологическая оценка препаратов периферической крови

3. Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови и/или костного мозга (с целью подтверждения диагноза и дальнейшего мониторирования остаточного опухолевого клона).

Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови и/или костного мозга проводилось методом многоцветной проточной цитофлуориметрии на приборах FACS Canto II (Becton & Dickinson (BD), США) и Cytomics FC500 (Beckman Coulter (ВС), США).

При первичной диагностике заболевания для подтверждения диагноза В-ХЛЛ и оценки маркеров CD38 и ZAP-70 иммунофенотипирование выполняли с использованием следующих меченных флюорохромами моноклональных антител (МКА) производства ВС: CD45-FITC, CD14-PE, CD20-FITC, CD23-PE, CD19-PeCy5.5, CD5-PeCy7, CD22-FITC, CD43-FITC, CD79b-PE, CD38-FITC, ZAP-70-FITC, а также антител KAPPA-FITC и

9

LAMBDA-PE производства Dako (Дания). После инкубации образцов крови с антителами осуществляли лизирование эритроцитов с помощью раствора «FACS Lysing solution» (BD) с последующим отмыванием фосфатно-солевым буфером (рН=7,4). При проведении измерений на проточном цитофлуориметре в каждой пробе анализировали не менее 104 клеток. Экспрессия определялась как позитивная при наличии антигена на более чем 20% клеток исследуемой популяции. Для маркера CD38 использовали различные пороговые уровни экспрессии антигена на клетках B-XJIJI - 6%, 20% и 30%. При оценке ZAP-70 помимо «процентного» (пороговый уровень экспрессии - 20%) способа анализа данных использовали метод MFI ratio, при котором вычисляли соотношения значений средней интенсивности флюоресценции (Mean Fluorescence Intensity, MFI) ZAP-70 Т-лимфоцитов к значениям MFI ZAP-70 клеток В-ХЛЛ. Пороговой величиной служило среднее значение соотношений MFI ZAP-70 Т-лимфоцитов к значениям MFI ZAP-70 B-лимфоцитов, определенное для группы доноров.

Оценка МРБ В-ХЛЛ проводилась в соответствии с рекомендациями международного стандартизованного подхода [Rawstron et al. 2007], при этом четырехцветная панель МКА была модифицирована для 5-цветного (Cytomics FC500, ВС) и 6-цветного (FACS Canto II, BD) анализа, что позволяло включить CD45 (МКА к панлейкоцитарному антигену) в каждую из исследуемых проб для более точного расчета величины остаточного опухолевого клона среди лейкоцитов (рис. 1, 2). В случае 6-цветного подхода модификация протокола в виде сочетания большего числа маркеров в каждой из комбинаций способствовала уменьшению количества пробирок, что важно при получении небольших объемов костного мозга и низкой клеточности образца.

№ Г ITC PE ECD PC5.5 PC7 № me PK PC5.5 PC7 ЛРС ЛРС-Су7

1 slgk slgX CD45 CD19 CD5 1 slgk slg* CD19 CD5 CD20 CD45

2 CD3 CD14 CD45 CD19 CD5 2 CD22 CD81 CDI9 CDS CD45 CD3

3 CD38 CD20 CD45 CD19 CD5 3 CD43 CD79b CD38 CD19 CD5 CD45

4 CD22 CD81 CD45 CD19 CD5

5 CD43 CD79b CD45 CD19 CD5

Рисунок 1. 5-цветная панель Рисунок 2. 6-цветная панель МКА для МКА для оценки МРБ при В- оценки МРБ при В-ХЛЛ (РАСБ СаЩоТГ, ХЛЛ (СуЮтісв, РС500, ВС). ВБ).

Иммунофенотипирование при оценке МРБ проводилось с использованием следующих меченных флюорохромами МКА производства ВС: CD3-FITC, CD14-PE, CD45-ECD, CD19-PeCy5.5, CD5-PeCy7, CD38-FITC, CD20-PE, CD22-FITC, CD81-PE, CD43-FITC, CD79b-PE, CD38-PeCy5.5, CD19-PeCy7, антител производства Dako (Дания): Kappa-FITC и Lambda-PE, антител производства BD: CD20-APC, CD5-APC, CD3-APC-Cy7, CD45-APC-Cy7. Пробоподготовка включала лизирование эритроцитов образца с помощью раствора "Pharm Lysing solution" (BD), отмывку фосфатно-солевым буфером, инкубирование с МКА и анализ на проточном цитофлуориметре со сбором не менее 500 ООО (5x105 ) леикоцитов в каждой пробе. Выделение остаточной популяции В-ХЛЛ осуществлялось с использованием стратегии последовательного гейтирования. Чувствительность иммунофенотипического определения МРБ В-ХЛЛ составляла 10"4 (0,01% опухолевых клеток от числа проанализированных лейкоцитов).

Оценка мутационного статуса IgVH-генов и определение МРБ методом пациент-специфичной ПЦР проводились в ФГБУ Гематологическом научном центре Минздрава России сотрудниками лаборатории молекулярной гематологии (заведующий д.б.н. Судариков А.Б.).

Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью программы «Statistica 6.0». При сопоставлении групп по количественному признаку применяли непараметрический критерий Манна-Уитни. Для

11

сравнения качественных показателей использовали критерий *£. Различия считали статистически значимыми при р<0,05. Оценку корреляции двух признаков проводили с помощью непараметрического метода Спирмена. При определении порогового уровня (ПУ) исследуемой величины осуществляли анализ с помощью метода характеристических кривых (receiver operator characteristic, ROC-кривых). Выживаемость оценивали с помощью метода Каплана-Мейера и логарифмического рангового критерия.

Результаты исследования и их обсуждение

Оценка маркеров CD38 и ZAP-70 при В-ХЛЛ

Исследование иммунофенотипических маркеров CD38 и ZAP-70 проведено в 55 случаях B-XJIJI. Полученные результаты варьировали в зависимости от способа интерпретации данных (Таблица 1).

Таблица 1

Результаты оценки ZAP-70 и CD38 в сравнении с мутационным статусом IgVH-генов

Благоприятный прогноз (наличие мутаций IgVH-генов) Неблагоприятный прогноз (отсутствие мутаций IgVH-генов) Согласующиеся данные, N (%)

«Процентный» метод ZAP-70«+» 9 (16%) 32 (58%) 38 (69%) р=0,06

ZAP-70«-» 6(11%) 8 (15%)

MFI ratio ZAP-70«+» 4 (7%) 38 (69%) 49 (89%) р-0,001*

ZAP-70«-» 11(20%) 2 (4%)

Cut-ofi=30% CD38«+» 1 (2%) 13(25%) 27 (53%) Р=0,1

CD38«-» 14 (28%) 23 (45%)

Cut-off=20% CD38«+» 1 (2%) 16(31%) 30 (59%) р=0,04*

CD38«-» 14 (28%) 20 (39%)

Cut-of¥=6% CD38«+» 2 (4%) 22 (43%) 35 (69%) р=0,008*

CD38«-» 13 (25%) 14 (28%)

*р<0,05. Тест %2 с поправкой Йейтса

Традиционный «процентный» подход оценки экспрессии ZAP-70 позволил выявить ZAP-70-позитивные случаи в 41 (74%) исследовании, а применение метода MFI ratio свидетельствовало о наличии ZAP-70 в 42 (76%) наблюдениях. При использовании различных пороговых уровней CD38 (30%, 20 % и 6%) экспрессия CD38 характеризовалась как позитивная в 14 (27%), 17 (33%) и 23 (47%) случаях, соответственно. Для маркера ZAP-70 наибольшую корреляцию результатов с показателями мутационного статуса IgVH-генов продемонстрировал метод MFI ratio (соотношение значений MFI ZAP-70 Т-лимфоцитов к значениям MFI ZAP-70 клеток В-ХЛЛ). Согласующиеся данные получены в 49 (89%) случаях по сравнению с 38 (69%) при традиционном «процентном» подходе. Сопоставление трех пороговых уровней экспрессии CD38 на клетках B-XJIJI (6%, 20% и 30%) с результатами мутационного статуса IgVH-генов выявило преимущество использования cut-off=6%. Согласующиеся результаты получены в 35 (69%) случаях по сравнению с 27 (53%) и 30 (59%) при использовании уровня, который соответствовал 30% и 20% СБ38-позитивных клеток, соответственно.

Совпадение иммунофенотипических маркеров (ZAP-70«+»/CD38«+» либо ZAP-70«-»/CD38«-») обнаружено в 37 (73%) случаях В-ХЛЛ при условии использования метода MFI ratio для ZAP-70 и порогового уровня 6% для CD38. Нами показано, что корреляция с данными мутационного статуса IgVH-генов в 37 случаях В-ХЛЛ с однонаправленным изменением имммунофенотипических маркеров составила 92%. Предсказательная возможность теста по определению неблагоприятного прогноза В-ХЛЛ с использованием комбинированного анализа двух маркеров (ZAP-70 и CD38) характеризовалась следующими показателями: ДЭ = 91%, ДЧ = 95% и ДС =87%. Таким образом, одновременно определяемые в качестве рутинного скрининга иммунофенотипические параметры экспрессии CD38 и ZAP-70 могут применяться в качестве суррогатных маркеров мутационного статуса

13

IgVH-генов и, соответственно, идентифицировать группу больных B-XJIJI с неблагоприятным прогнозом.

При исследовании индивидуальной значимости

иммунофенотипических маркеров CD38 и ZAP-70 в определении агрессивного и вялотекущего вариантов B-XJLJI использовали показатель «время до начала терапии» (Time То First Treatment, TTFT) у 55 больных В-XJIJI. Показатель TTFT рассчитывался как временной интервал от момента выявления заболевания до даты начала лечения и значительно варьировал у исследуемых больных (от 1 до 229 мес.). Результаты наших исследований показали, что не наблюдалось различий в показателях TTFT в зависимости от наличия или отсутствия экспрессии CD38 на клетках B-XJIJI (23 мес. и 25 мес. в группах CD38«-» и CD38«+», соответственно), а также от порогового уровня экспрессии данного маркера (cut-off=6%, 20%, 30%). В противоположность CD38 в группе ZAP-70-негативных случаев В-ХЛЛ обнаружено более длительное время до начала терапии, составляющее в среднем 40 мес. по сравнению с 16,5 мес. для группы ZAP-70-позитивных случаев. Наличие ZAP-70 в клетках В-ХЛЛ ассоциировалось с достоверно (р=0,044) более ранним возникновением необходимости в проведении лечения.

У 93 пациентов с В-ХЛЛ на момент окончания терапии были сопоставлены данные оценки мутационного статуса, ZAP-70 и CD38 в группах, выделенных по критерию наличия опухолевого клона (МРБ«+», п=40) либо отсутствия такового (МРБ«-», п=53) (рис.3). Наибольшие различия между МРБ«-» и МРБ«+» группами пациентов демонстрировал показатель экспрессии ZAP-70 в клетках В-ХЛЛ. При наличии ZAP-70 вероятность достижения МРБ-негативной ремиссии была достоверно (р=0,01) ниже, чем при отсутствии данной тирозинкиназы в клетках В-ХЛЛ. Следовательно, информация об экспрессии ZAP-70 уже на этапе первичной диагностики В-ХЛЛ может быть использована не только для определения

14

агрессивности течения заболевания, но и для прогнозирования высокой вероятности рефрактерности к современным терапевтическим режимам.

100% 80% 60% 40% 20% 0%

57%

~ Беч млтаций IgVH, р=0,01

п ZAP-70"+" MFI ratio, ¡>=0,01

а С 1)38"+" Cur-off=6%, |»=0.79

МРБ"-"

МРБ"+'

Рисунок 3. Распределение маркеров неблагоприятного прогноза в МРБ«-» и МРБ«+» группах больных В-ХЛЛ.

В противоположность ZAP-70, достоверных различий по качеству достигнутого ответа между группами С038-негативных и С038-позитивмых случаев не обнаружено. Таким образом, результаты исследования экспрессии CD38 и ZAP-70 на клетках В-ХЛЛ позволили доказать возможность использования только маркера ZAP-70 с целью прогнозирования эффективности ответа на терапию при В-ХЛЛ.

Результаты оценки минимальной резидуальной болезни при В-ХЛЛ

Оценку остаточного опухолевого клона В-ХЛЛ проводили параллельно двумя методами - многоцветной проточной цитофлуориметрией и пациент-специфичной ПЦР в 45 случаях В-ХЛЛ (Таблица 2).

Таблица 2

Сравнение результатов 45 исследований МРБ при В-ХЛЛ двумя методами

Проточная цитофлуориметрия

МРБ«+», N

МРБ«-», N

Пациент- МРБ«+», N

22

2

специфичная ПЦР МРБ«-», N

1

20

Отсутствие детектируемой МРБ (менее 10"4 опухолевых клеток) по результатам двух методов было зарегистрировано в 20 (44%) образцах, одновременное выявление клона В-ХЛЛ имело место в 22 (49%) случаях. Таким образом, результаты проточной цитофлуориметрии и пациент-специфичной ГТЦР в оценке МРБ совпали в 42 образцах (93%). В 3-х из 45 (7%) исследований опухолевые клетки были обнаружены только одним из подходов: в первом случае методом проточной цитофлуориметрии и в двух только методом пациент-специфичной ПЦР. Количественное сопоставление указывало на хорошую сходимость иммунофенотипических и молекулярно-генетических данных оценки МРБ (рис. 4). Обнаруженная корреляция статистически значима - ранговый коэффициент Спирмена составил 0,87 (р<0,0001).

А

И О 5000

3

и

С 0.0500

и

I

н

X ^ 0.0050

к в4

§ И

с <

•

•• •

•

__I

Проточная цитофлуориметрии, МРБ %

Рисунок 4. Количественное сопоставление данных оценки МРБ В-ХЛЛ с помощью проточной цитофлуориметрии и пациент-специфичной ПЦР.

Методы проточной цитофлуориметрии и пациент-специфичной ПЦР в диагностике МРБ при В-ХЛЛ характеризовались различными преимуществами и недостатками. Так, при иммунофенотипировании чувствительность анализа составляла 10"4 опухолевых клеток среди лейкоцитов, а с помощью пациент-специфичной ПЦР достигалось выявление

остаточного клона на уровне 10"5. Однако молекулярно-генетический подход в оценке остаточного клона был применим не для всех пациентов с В-ХЛЛ (в 75% случаев по сравнению с 99,4% для иммунофенотипирования), отличался трудоемкостью и длительностью в исполнении (несколько недель по сравнению с 1 рабочим днем для анализа методом проточной цитофлуориметрии), требовал обязательной работы с биоматериалом от конкретного пациента еще до начала проведения терапии (этап секвенирования и подбора пациент-специфичных праймеров). Таким образом, учитывая хорошую сопоставимость результатов пациент-специфичной ПЦР с данными проточной цитофлуориметрии, можно считать последний подход предпочтительным для широкого использования в оценке динамики сокращения объема опухолевой популяции в клинической практике.

Среди иммунофенотипических вариантов оценки остаточного клона В-ХЛЛ модификация протокола с использованием панели антител для 6-цветного анализа демонстрирует преимущества по сравнению со стандартизированным 4-цветным методом проточной цитометрии, позволяя достигать требуемой чувствительности анализа (10"4) при меньшем объеме исследуемого материала благодаря снижению числа пробирок (3 комбинации маркеров вместо 5). Достоинством данного подхода является возможность подтверждения моноклональной природы остаточной опухолевой популяции даже при наличии в образце поликлонального фона, создаваемого нормальными зрелыми В-лимфоцитами (рис. 5).

Диагностика МРБ в периферической крови методом проточной цитофлуориметрии была проведена у 112 пациентов В-ХЛЛ в двух точках наблюдения: при промежуточной оценке во время терапии (после 3 курсов ритуксимаб-содержащих режимов) и финальном анализе МРБ после 6 курсов терапии (завершению лечения) (Таблица 3).

Рисунок 5. Пример подтверждения моноклональной природы остаточной популяции В-ХЛЛ на фоне зрелых В-лимфоцитов (обозначены черным цветом) с помощью применения 6-цветного протокола оценки МРБ. Моноклональная В-клеточная CD20/CD5+ популяция лимфоцитов с экспрессией kappa легких цепей иммуноглобулинов (обозначена красным цветом).

Таблица 3

Результаты мониторирования МРБ при промежуточной и финальной оценках

ремиссии

Количество курсов терапии МРБ«-» МРБ«+»

N (%) случаев N (%) случаев % МРБ (Me; min-max)

3 курса 32 (29%) 80 (71%) 0,17; 0,01-9,98

6 курсов 87 (78%) 25 (22%) 0,07; 0,01-2,68

На промежуточном этапе оценки ремиссии у 32 (29%) пациентов МРБ в периферической крови не выявлялась, а МРБ-негативный статус сохранялся и при финальном исследовании. У 25 (22%) из 112 больных наблюдалось снижение в крови количества опухолевых клеток от 3-го к 6-му циклу лечения. У 55 (49%) больных с детектируемым остаточным опухолевым клоном после 3 циклов терапии эрадикация МРБ достигнута после окончания лечения. При проведении ШЭС-анализа методом характеристических кривых для показателя уровня МРБ на промежуточном этапе терапии в качестве критерия прогнозирования вероятности достижения молекулярной ремиссии после окончания лечения наибольшую диагностическую ценность (ДЧ=100%, ДС=72%, ДЭ=86%) продемонстрировала величина менее 0,12% опухолевых клеток от числа анализируемых лейкоцитов (рис. 6). Случаи

18

выявления при промежуточной оценке менее 0,12% клеток В-ХЛЛ характеризовались достоверно (р<0,0001) более высокой вероятностью достижения МРБ-негативной ремиссии после завершения лечения по сравнению с вариантами обнаружения более 0,12% опухолевых клеток (рис. 7). Таким образом, уже после 3-х циклов ритуксимаб-содержащей терапии, ориентируясь на пороговую величину 0,12% клеток В-ХЛЛ, можно предсказать возможность эрадикации опухолевого клона по завершению лечения.

Г

ЛЦС = 0,88 р 0.0001

000 025

Чм цоаег ЙОС пга ■ 0 В811

050 1 • ЭрееКйу

МРБ"-" МРБ"+" Статус финальной ремиссии

Рисунок 6. ШЭС-кривая для Рисунок 7. Уровни МРБ после 3

показателей МРБ после 3 курсов курсов терапии в группах пациентов

терапии в качестве критерия В-ХЛЛ различного статуса

достижения молекулярной ремиссии, финальной ремиссии.

У 56 пациентов с В-ХЛЛ при финальной оценке ремиссии исследование МРБ проводилось параллельно в образцах периферической крови и костного мозга, результаты представлены в Таблице 4.

Таблица 4

Сравнение данных оценки МРБ в крови и костном мозге у больных В-ХЛЛ

(п=56)

Периферическая кровь

МРБ«+», N МРБ«-», N

Костный мозг МРБ«+», N 8 13

МРБ«-», N 0 35

В 43 (77%) случаях были достигнуты согласующиеся результаты. Для 35 пациентов анализ костного мозга подтверждал достижение МРБ-негативной ремиссии, определенное по периферической крови. У 8 больных МРБ выявлялась в обоих исследуемых образцах. В 13 (23%) параллельных исследованиях опухолевый клон был обнаружен только в материале костного мозга в количестве от 0,01% до 0,1% (медиана = 0,02%), что может объясняться различием в скорости элиминации опухолевых клеток из крови и костного мозга при терапии В-ХЛЛ моноклональными антителами (ритуксимаб представляет собой МКА к СБ20). Таким образом, нами показано, что костный мозг рекомендуется исследовать в случаях отсутствия клеток В-ХЛЛ в периферической крови и не ранее, чем через 3 месяца после достижения финальной ремиссии (рис. 8).

Рисунок 8. Алгоритм оценки МРБ В-ХЛЛ в периферической крови и костном мозге при достижении полной клинико-гематологической ремиссии.

Оценку прогностической значимости статуса МРБ при В-ХЛЛ проводили на основе показателя беспрогрессивной выживаемости (Progression free survival, PFS), который рассчитывался как временной интервал между первым днем начала терапии и датой регистрации прогрессии, рецидива либо смерти. Кривые выживаемости в зависимости от МРБ-статуса представлены на рисунке 9. Величина PFS у 139 больных В-ХЛЛ, достигших полной клинико-гематологической ремиссии после

завершения лечения, значительно варьировала, составляя от 21 дня до 1624 дней (Ме=797 дней). Группы МРБ«-» и МРБ«+» были выделены как среди всех 139 пациентов, так и в зависимости от применения определенного вида ритуксимаб-содержащего режима терапии: LR (n=24), FCR-lite (п=29) и FCR (п=86).

PFS от МРБ, N=139 (р<0,00001)

б PFS от МРБ при LR, N=24 (р-0,043)

■Г

i а

$ ■

МРБ-• МРБ+

МРБ+ - МРБ-

PFS от МРБ при FCR-lite, N=29 (р=0,016)

Ü

Время, дни

PFS от МРБ при FCR, N=86 (р=0,00001)

§ g щ §

МРБ+ ■ МРБ-

Время, дни

- МРБ+

ею 1200 1М0 . (т,г В00 1000 1400 1В00 - Mrb-

Врсмя, дни

Рисунок 9. Кривые выживаемости больных с В-ХЛЛ с различным МРБ-статусом при применении терапевтических режимов: а. Все режимы; б. LR; в. FCR-lite; г. FCR.

Согласно полученным данным беспрогрессивная выживаемость была достоверно (р<0,0001) выше в группе пациентов с МРБ-негативной ремиссией. Различия в величине PFS, как временного показателя качества достигнутого ответа, выявлены для всех вариантов ритуксимаб-содержащих режимов терапии, что свидетельствует о клинической значимости определения МРБ-статуса для прогноза выживаемости вне зависимости от режима терапии.

Выводы

1. Установлено, что комбинированный анализ антигенов CD38 и ZAP-70 позволяет прогнозировать мутационный статус IgVH-генов и вариант течения В-клеточного хронического лимфолейкоза (В-ХЛЛ) (ДЭ теста = 91%).

2. Выявлено, что ZAP-70-позитивные случаи по сравнению с ZAP-70-негативными случаями ассоциируются с коротким временем до начала терапии (р=0,04) и высокой вероятностью сохранения персистенции опухолевого клона после лечения (р=0,01). Для маркера CD38 подобной зависимости не обнаружено.

3. Многоцветная проточная цитофлуориметрия может использоваться в оценке минимальной резидуальной болезни (МРБ) при B-XJIJI как наиболее быстрый метод, результаты которого согласуются с ПЦР в 93% случаев.

4. Использование модифицированного протокола оценки МРБ при В-XJIJI с помощью 6-цветного анализа позволяет достигать требуемой чувствительности анализа (10"4) при меньшем объеме исследуемого материала и подтверждать клональность остаточной опухолевой популяции.

5. Установлено, что наличие менее 0,12% опухолевых клеток В-ХЛЛ после проведения 3 курсов ритуксимаб-содержащей терапии достоверно (р<0,0001) прогнозирует достижение МРБ-негативной ремиссии после окончания лечения.

6. Случаи достижения МРБ-негативной ремиссии при В-ХЛЛ характеризуются достоверно (р<0,0001) более высокими показателями беспрогрессивной выживаемости вне зависимости от режима терапии.

7. При использовании ритуксимаб-содержащей терапии мониторирование МРБ возможно проводить по периферической крови. Костный мозг рекомендуется исследовать в случаях отсутствия клона В-ХЛЛ в крови и не ранее чем через 3 месяца с момента окончания лечения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАНЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Луговская С.А., Почтарь М.Е., Наумова Е.В., Кисиличина Д.Г., Никитин Е.А., Долгов В.В. Диагностика минимальной остаточной болезни при В-ютеточном хроническом лимфолейкозе методом многопараметрической лазерной проточной цитофлюориметрии // Клиническая лабораторная диагностика, 2010, №9, С.20

2. Кисиличина Д.Г., Наумова Е.В., Луговская С.А., Почтарь М.Е., Никитин Е.А. Сравнительное исследование минимальной остаточной болезни в периферической крови и костном мозге больных с В-ХЛЛ // Клиническая лабораторная диагностика, 2011, №9, С.29

3. Сидорова Ю.В., Сорокина Т.В., Бидерман Б.В., Никулина Е.Е., Кисиличина Д.Г., Наумова Е.В, Почтарь М.Е., Луговская С.А., Иванова В.Л., Ковалева Л.Г., Птушкин В.В., Никитин Е.А., Судариков А.Б. Определение минимальной остаточной болезни у больных B-клеточным хроническим лимфолейкозом методом пациент-специфичной ПЦР // Клиническая лабораторная диагностика, 2011, №12, С.22-35

4. Кисиличина Д.Г., Луговская С.А., Почтарь М.Е., Наумова Е.В., Никитин Е.А., Долгов В.В. Особенности экспрессии CD38 и ZAP-70 как факторов прогноза при лечении B-клеточного хронического лимфолейкоза // Гематология и трансфузиология, 2012, №3, С.51

5. Кисиличина Д.Г., Луговская С.А., Почтарь М.Е., Наумова Е.В., Бидерман Б.В., Судариков А.Б., Никитин Е.А., Долгов В.В. Особенности оценки экспрессии ZAP-70 в опухолевых клетках при В-клеточном хроническом лимфолейкозе методом проточной цитофлюориметрии // Клиническая лабораторная диагностика, 2012, №8, С.47-52

6. Никитин Е.А., Северин H.A., Обухова Т.Н., Кисиличина Д.Г., Наумова Е.В., Луговская С.А., Почтарь М.Е., Варламова Е.Ю. Нарушение гена ТР53 у больных хроническим лимфолейкозом И Клиническая онкогематология, 2012, Т5,№4, С.316-322

7. Pochtar М., Kisilichina D., Naumova Е., Lugovskaya S. Predictive value of CD38 and ZAP-70 immunophenotypic markers on the remission status in patients with chronic lymphocytic leukemia // International journal of Laboratory Hematology, 2013, Vol.35, P.88

8. Луговская C.A., Кисиличина Д.Г., Почтарь M.E., Наумова Е.В., Никитин Е.А., Аль-Ради Л.С. Новые маркеры (CD160, CD200, LAIR-1) в диагностике В-клеточных лимфопролиферативных заболеваний // Клиническая онкогематология, 2013, Т6, №1, С.45-53.

9. Nikitin Е., Kisilichina D., Zakharov О., Lugovskaya S., Varlamova E., Obukhova Т., Biderman В., Kaplanskaya I., Naumova E., Pochtar M., Sudarikov A., Domracheva E., Ivanova V., Kovaleva L., Ptushkin V. Randomised comparison of fcr-lite and clr (chlorambucil plus rituximab) regimens in elderly patients with chronic lymphocytic leukemia // Haematologica, 2013, Vol. 98(s.l), P. 473.

10. Кисиличина Д.Г., Наумова Е.В., Никитин Е.А., Почтарь М.Е., Долгов В.В., Луговская С.А. Значение статуса молекулярной ремиссии в прогнозе выживаемости при B-клеточном хроническом лимфолейкозе // Клиническая лабораторная диагностика, 2013, №9, С.102

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

B-XJIJl - В-клеточный хронический лимфолейкоз

ДС - диагностическая специфичность

ДЧ - диагностическая чувствительность

ДЭ - диагностическая эффективность

МКА - моноклональные антитела

МРБ - минимальная резидуальная болезнь

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

APC - allophycocyanîn

АРС-Су7 - allophycocyanin-cyanine7

BCR - B-cell Receptor

CD - cluster of differentiation

ECD - energy coupled dye

FCR - fludarabine, cyclophosphamide, rituximab

FITC - fluorescein isothyocyanate

IgVH - immunoglobulin heavy chain variable regions

LR - leukeran, rituximab

MFI - mean fluorescence intensity

PE - phycoerythrin

Pe-Cy5.5 - phycoerythrin-cyanine5.5

Pe-Cy7- phycoerythrin-cyanine7

PFS - progression free survival

ROC - receiver operator characteristic

TCR - T-cell Receptor

TTFT - time to first treatment

ZAP-70 - Ç-associated protein-70

Подписано в печать: 29.10.2013 Тираж: 100 экз. Заказ № 1005 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект д.74 (495)790-47-77 www.reglet.ru