Автореферат и диссертация по медицине (14.00.21) на тему:Морфологические аспекты репаративного остеогенеза при переломах нижней челюсти на фоне хронического эндотоксикоза

На правах рукописи

Бармин Валерий Витальевич

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РЕПАРАТИВНОГО ОСТЕОГЕНЕЗА ПРИ ПЕРЕЛОМАХ НИЖНЕЙ ЧЕЛЮСТИ НА ФОНЕ ХРОНИЧЕСКОГО ЭНДОТОКСИКОЗА (экспериментальное исследование)

14.00.21 - стоматология

14.00.15 - патологическая анатомия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских ш

Волгоград - 2008

003170644

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Росздрава

Научные руководители: Заслуженный врач РФ,

доктор медицинских наук, профессор Фомичев Евгений Валентинович

доктор медицинских наук, профессор Новочадов Валерий Валерьевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Каливраджиян Эдвард Саркисович

доктор медицинских наук, профессор Маланин Дмитрий Александрович

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Саратовский государственный

медицинский университет» Росздрава

Защита состоится «30j> СШР^иЯ 2008 года в часов на заседании диссертационного совета Д 208 008 03 при Волгоградском государственном медицинском университете по адресу 400131, г Волгоград, пл Павших борцов, 1

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Волгоградского государственного медицинского университета

Автореферат разослан « /А» 2008 года

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор

Д Вейсгейм

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы.

В настоящее время среди причин смертности и инвалидности в России, травмы вышли на второе место, уступая лидерство лишь сердечнососудистым заболеваниям Травмы челюстно-лицевой области составляют до 8% всех травматических заболеваний человека [Вернадский Ю И , 1999, Фомичев Е В , 1999, 2002, Робустова Т Г , 2000, 2004, Нарциссов А Т , Зан-делов В Л , 2001, Ефимов Ю В , 2004, Puelacher W С et al, 1996, Woelfel J В et al, 1997, Schliephake H, et al, 2001, Budai M , et al, 2003, Julien К С , et al, 2004, Schimming R, Schmelzeisen R, 2004, Valenzuela A P , et al, 2005, Yuan H, et al, 2006]

В регуляции репаративной регенерации костной ткани после переломов и комбинированных травм существенное значение имеет соотношение нервных, эндокринных и иммунных механизмов регуляции остеогенеза, которые на тканевом уровне реализуются целым пакетом биологически активных медиаторов [Шапошников Ю Г, 1997, Маланин Д А, 2002, Корнилов H В , Грязнухина Э Г, 2006, Lane J M et al, 1999, Ying Q L , 2002] Именно они регулируют рост и дифференцировку остеобластического, ос-теокластического, сосудистого и соединительнотканного ростков, в итоге формирующих функционирующую кость При нарушениях регуляторных механизмов репаративного остеогенеза происходит патологическое ремоде-лирование костной ткани и формирование структурно и функционально неполноценного регенерата [Ревелл ПА, 1993, Рожинская ЛЯ, 2006, Petite H et al, 2000, Cancedda R et al, 2003, Aghaloo T, et al, 2006, Grazmno A et al, 2007, Meijer G J et al, 2007]

Одним из факторов, влияющих на регенерацию костной ткани, является воздействие различных токсических веществ, в том числе и эндогенных токсических соединений Хронический эндотоксикоз (ЭТ) относится к многокомпонентным процессам, который наблюдается при различных фоновых заболеваниях, конкурирующей патологии, развиваясь на фоне вегетативной и эндокринной дисрегуляции [Бондаренко В M, с соавт, 2002, Мишнев О Д, с соавт , 2001, 2003, Фролов В И, 2004, Новочадов В В , Писарев В Б , 2005, Богомолова H В , 2005, Аниховская И А , с соавт , 2006, Гринберг Л M , Руднов В А, 2006, Diomede L , et al, 2001, Bolger A P , et al, 2002, Foster J A, et al, 2002, Karayaylali I, et al, 2003, Baron RM et al, 2006, Daniel G Remick, M D , 2007]

В силу этого, представляет интерес разрешение актуальной задачи установления особенностей остеорегенерации на фоне хронического ЭТ Данное решение на настоящем этапе знаний возможно только в эксперименте

Цель работы - установить особенности репаративного остеогене-за при переломах нижней челюсти у крыс на фоне хронического эндо-токсикоза

Задачи исследования

1 Изучить влияние хронического эндотоксикоза на регенеративный потенциал клеток костной ткани нижней челюсти интактных крыс

2 Выявить особенности репаративной регенерации костной ткани при переломе нижней челюсти на фоне хронического эндотоксикоза

3 Сопоставить характер морфологических нарушений репаративного остеогенеза с длительностью и выраженностью хронического эндотоксикоза

4 Разработать количественные критерии для оценки костного регенерата с целью прогнозирования нарушений репаративного остеогенеза при переломах нижней челюсти

Научная новизна.

В работе впервые показано влияние хронического эндотоксикоза различной выраженности и продолжительности на процессы остеорегенера-ции Выявлены наиболее информативные особенности репаративного остеогенеза при переломах нижней челюсти на фоне хронического эндотоксикоза длительное присутствие очагов соединительнотканного замещения, потеря или позднее формирование зональности костного регенерата, низкий уровень РСКА-позитивных клеток и высокое содержание остеобластов в костном регенерате, относительно малая васкуляризация регенерата

Выявлены сильные корреляционные связи между основными количественными характеристиками костного регенерата и маркерами хронической эндогенной интоксикации

Научно-практическая значимость.

Полученные данные расширяют современные представления о характере и динамике заживления переломов костей при наличии хронической эндогенной интоксикации Нестабильность клеточного состава и минерализации при переломах челюстей на фоне хронического эндотоксикоза являются основанием для коррекции не только процесса репаративного остеогенеза, но и уровня эндогенной интоксикации

Наличие хронической эндогенной интоксикации у больных с переломами нижней челюсти и сопутствующей соматической патологии требует выявления структурно-функциональных изменений костной ткани с проведением дополнительных методов исследования (рентгеноденситометрии)

Предложенные автором количественные критерии для оценки костного регенерата позволят прогнозировать нарушения процессов репаративного остеогенеза и осуществлять их профилактику

Основные положения, выносимые на защиту.

1 Хроническая эндогенная интоксикация приводит к нарушениям ре-паративной регенерации костной ткани челюстей, в результате чего формируется структурно и функционально неполноценный регенерат

2 Регенерация костной ткани после перелома в существенной степени зависит от уровня хронической эндогенной интоксикации, на фоне которой формируется остеопороз и снижается регенераторный потенциал ткани

3 Оценка регенераторного потенциала, васкуляризации и остеобласти-ческого представительства в регенерате позволяет прогнозировать его структурные и функциональные свойства как в условиях спонтанного заживления, так и на фоне хронической эндогенной интоксикации

Апробация работы и публикации.

Основные результаты исследования докладывались и обсуждались на УШ-Х конференциях молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, 2004-2006), VI Общероссийской конференции «Гомеостаз и эндоэко-логия» (Хургада, 2006), научно-практической конференции, посвященной 75-летию со дня рождения В Ю Миликевича (Волгоград, 2007), научно-практической конференции «Современные проблемы патоморфологии», посвященной 110-летию со дня рождения Л Н Попова (Тверь, 2007)

Апробация работы проведена на расширенном заседании кафедр терапевтической, хирургической, ортопедической стоматологии, стоматологии детского возраста, пропедевтики стоматологических заболеваний, стоматологии ФУВ, патологической анатомии с секционным курсом и курсом патологии Волгоградского государственного медицинского университета 22 апреля 2008 года

По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе одна - в журнале «Вестник Волгоградского государственного медицинского университета», включенном в действующий «Перечень ВАК»

Внедрение результатов исследования.

Материалы диссертации внедрены в учебный процесс кафедр хирургической стоматологии, стоматологии детского возраста, патологической анатомии, судебной медицины Волгоградского государственного медицинского университета Практические рекомендации используются в работе Волгоградского научного центра РАМН и администрации Волгоградской области и Волгоградского областного патолого-анатомического бюро

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста, содержит 12 таблиц, иллюстрирована 11 рисунками Она состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов исследования, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов Список использованной литературы содержит 185 источников (95 на русском и 90 на иностранных языках)

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа носила экспериментальный характер и была выполнена с использованием белых крыс обоего пола

Протокол экспериментов в разделах выбора, содержания животных, моделирования патологических процессов и выведения их из опыта был составлен в соответствии с принципами биоэтики, правилами лабораторной практики (йЬР) и был согласован с Локальным независимым этическим комитетом по этической экспертизе диссертационных исследований (протокол № 34-2006 от 20 марта 2006 года)

Закономерности морфофункциональных преобразований в костной ткани были изучены при спонтанном заживлении переломов нижней челюсти у животных вне эндогенной интоксикации и на фоне хронической эндогенной интоксикации различной продолжительности (табл 1)

Таблица 1

Общая характеристика материала исследования по сериям

Модель Характеристика серии Кол-во животных

в всего

п/гр

Контрольная группа (иитактные животные) 15 15

Группа сравнения (спонтанное заживление переломов) 14 суток 30 суток 60 суток 5 6 5 16

Хроническая эндогенная 30 суток 5

интоксикация 60 суток 90 суток 5 5 15

Основная группа (заживление переломов на фоне хронической эндогенной интоксикации) 30 +14 суток 30 + 30 суток 30 + 60 суток 6 6 6 18

Всего животных 64

Все болезненные процедуры и выведение животных из эксперимента проводили с использованием нембутала (наркоз в дозах 30-50 мг/кг массы, эвтаназия - 100-150 мг/кг массы тела

Перелом нижней челюсти проводили у крыс в месте, общепринятом для экспериментальных исследований [Moos К F et al, 2002, Zhang X, Teng Y -T A, 2006] Операцию завершали микрошинированием резца и альвеолярного отростка к одноименным прилежащим структурам слева Мягкие ткани не ушивали для контроля дренажа в первые часы после one-

рации, в дальнейшем мягкие ткани закрывались спонтанно в течение суток, скобки снимали на 7-е сутки

Проводили рентгенографию образцов всех групп животных, а у 12 животных на нативных образцах кости, освобожденных механическим путем от эндооста и периоста, проводили рентгеноденситометрические измерения в двух точках каждого образца в центре костного дефекта и его крае

Моделирование хронической эндогенной интоксикации проводили путем многократного введения тетрахлорметана (ТХМ) и бактериального липополисахарида (ЛПС) по схеме, разработанной на кафедре патологической анатомии Волгоградского государственного медицинского университета [Новочадов В В , Писарев В Б , 2005] В качестве маркеров эндогенной интоксикации было использовано определение веществ средней молекулярной массы (ВСММ), а также их олигопептидной фракции в сыворотке крови [Малахова M Я , 1995] В плазме крови крыс были также определены концентрации продуктов свободнорадикального окисления липидов - малонового диальдегида (МДА) по реакции с тиобарбитуровой кислотой [Андреева JIИ, с соавт, 1988] Расчет производили в мкмоль/л

Перед изготовлением микропрепаратов проводили фиксирование фрагментов регенерата в течение 48 ч в 10%-ном растворе нейтрального формалина Затем проводили декальцинацию блоков в 4%-ном растворе ЭДТА (трилона Б) в течение 10 суток и дофиксировали вновь в 10%-ном растворе нейтрального формалина После фиксации материал проводили по общепринятой гистологической методике через батарею спиртов возрастающей концентрации, хлороформ и заливали в парафин С парафиновых блоков готовили срезы толщиной 4-6 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином по общепринятой методике Для выявления соединительной ткани использовали окраску по ван Гизону и по Масону [Саркисов Д С , Перов Ю JI 1996, Коржевский Д Э , 2005]

Фотосъемка части препаратов проведена на микроскопе Micros (Германия) с фотокамерой Pixera (Япония) В дальнейшем съемка сочеталась с количественным морфологическим исследованием

Для выявления пролиферативной активности в регенерате и окружающей костной ткани использовали моноклональные антитела к ядерному антигену пролиферирующих клеток (PCNA, DakoCytomation, Дания) Для иммуногистохимического исследования использовали моноклональные антитела к виментину (клон V9) и остеонектину (клон 15G12) (Novocastra, Великобритания) Для достоверности полученных результатов применяли позитивные и негативные конгроли антигенов, а так же негативные контро-

ли антител [Петров С В , Райхлин H Т, 2004, Kelman Z , 1997, Rosa M А, et al 2000, Paunesku T et al, 2001]

Морфометрическое исследование было проведено в соответствии с принципами системного количественного анализа [Автандилов Г Г, 1996, 2002] Для этого использовали автоматическую систему обработки изображений «Видеотест-Морфо 3 0» (Россия) В регенерате с помощью количественных методов определяли объемные доли соединительной ткани, сосудов и костных балок, а также численную плотность клеточных элементов

Результаты исследования регенератов дополняли с помощью оригинального метода радиальной морфометрии, разработанного в Волгоградском научном центре РАМН и администрации Волгоградской области Использовали коэффициенты, характеризующие графическую функцию распределения плотности костного материала [Новочадов В В , 2005]

Ki - тангенс угла наклона кривой до экстремума функции (>0), Кг - тангенс угла наклона кривой после экстремума функции (<0), Im - интенсивность окраски в точке экстремума, усл. ед , R - расстояние от центра измерения до зоны с Im Vm- максимальная вариабельность но секторам, уел ед

Математическую обработку данных проводили непосредственно из общей матрицы данных EXCEL 7 0 (Microsoft, USA) с привлечением возможностей программ STATGRAPH 5 1 (Microsoft, USA) с учетом общепринятых требований для медико-биологических исследований [Петри А, Сабин К , 2003, Зайцев В M, с соавт, 2003, Новиков Д А, Новочадов В В , 2005]

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты спонтанной регенерации переломов нижней челюсти.

Регенераты костной мозоли на 14-е сут представляли собой легко кровоточащие при прикосновении мягкотканные образования розового цвета и эластической консистенции, расположенные между нормальной костной тканью К 30-м суткам эксперимента место перелома было заполнено тканью бледно-розового цвета, которая несколько выступала над уровнем окружающей кости и была полностью сращена с ней По прошествии 60 суток макроскопически у крыс группы сравнения место перелома было неотличимо от окружающей костной ткани нижней челюсти, и регенерат уже не выступал над ее поверхностью

Ткань регенерата на 14-е сутки эксперимента состояла из тонких пучков коллагеновых волокон и плотно прилежащих друг к другу широких

пучков, имеющих продольную ориентацию, многочисленных групп мало-дифференцированных клеток, большого количества сосудов капиллярного типа Вокруг последних отмечалась выраженная пролиферация других клеток - перицитов В промежутках между волокнистыми структурами наблюдались очаги свободно расположенных эритроцитов Образование новой ткани можно было условно разделить на два типа Первый тип (до 20-30% от общего количества) составляли овальной формы клетки с гиперхромным ядром, которые находились в рыхлой аморфной эозинофильной массе Второй тип (70-80%) представляли клетки вытянутой формы, имеющие менее интенсивно окрашенное ядро

На 30-е сутки больший объем регенерата был представлен очагами энхондрального остеогенеза Он заключался в образовании скелетогенных клеточных элементов - остеобластов и трабекул, направленных вдоль основных пучков коллагеновых волокон Грубоволокнистая костная ткань встречалась очагами в виде первичных костных балок, ориентированных вдоль широких коллагеновых волокон и вертикальных сосудистых петель, и клеток остеобластического ряда с большим ядром и светлой цитоплазмой Менее зрелые формы остеобластов находились в эозинофильно окрашенном основном веществе, имеющем нитевидную волокнистую структуру В краевых отделах регенерата имело место значительное усиление пролиферативной и синтетической активности клеток хондрального ряда, которые формировали типичные изогенные группы и продуцировали межклеточный матрикс, выступающий за пределы границы суставной поверхности

На 60-е сутки регенерат был представлен преимущественно зрелой костной тканью (на 60-70% объема) и волокнистой хрящевой, которая располагалась по наружным краям бывшего перелома и мелкими очагами - в глубине регенерата

При морфометрии было показано, что заживление переломов нижней челюсти проходит определенную стадийность, легко различимую при анализе объемных долей основных компонентов регенерата и плотности его клеточных элементов На 14-е сутки в регенерате преобладает соединительная ткань (55,2±4,1%), а количество остеобластов и остеоцитов невелико (289±35, 1/мкм3) К 30-м суткам уменьшается представительство соединительной ткани (27,3±2,2%), значительно возрастает доля сосудов (11,2±1,0%) в объеме регенерата, появляются элементы костной ткани К 60-м суткам в количественном отношении регенерат мало отличим от обычной костной ткани Полученные количественные данные свидетельствуют о том, что при спонтанном заживлении переломов нижней челюсти у крыс группы сравнения в течение 60 сут происходит полное восстановление структуры костной ткани При этом происходит восстановление баланса ос-теосинтетического и остеорезорбтивного потенциалов ткани (рис 1)

Рентгеноденситометрическое исследование выявило восстановление оптической плотности ткани регенерата до средних значений с окружающими тканями к 21-м суткам эксперимента.

Эти данные были использованы как сравнительные при исследовании процессов заживления переломов нижней челюсти в условиях хронической эндогенной интоксикации.

□ ОК/ОБ

□ ОД костн

Рис. 1. Изменения объемной доли костного матрикса и остеорезорбтивного потенциала при спонтанном заживлении переломов нижней челюсти. За единицу принято значение у интактных животных. ОК- остеокласты, ОБ-остеобласты, ОД костн -объемная доля костной ткани.

При спонтанном заживлении переломов на 14-е сутки эксперимента процент РСМД-позитивных клеток оказывался многократно выше как в периферической, так и внутренней зоне регенерата (до 42,2±2,7%), в сравнении с аналогичным показателем у интактных крыс. К 30-м суткам он значительно уменьшался, что свидетельствовало о практически полном завершении процессов клеточного деления в зоне регенерата. К 60-м суткам спонтанной репаративной регенерации процент РСИА-позитивных клеток повсеместно не отличался от такового у интактных крыс. Полученные данные свидетельствуют о фазовом изменении пролиферативного потенциала клеток в костной ткани по мере спонтанной регенерации костной ткани после перелома. В целом, этот процесс завершался за 60 суток.

Показатели радиальной и векторной морфометрии количественно подтверждали формирование нормальной костной мозоли в процессе заживления перелома (табл. 2).

Это в основном выражалось в появлении градиентов плотности радиальной морфометрии (показатель tgK) и повышении вариабельности яркости по секторам (Ут) в течение первых 14 суток после перелома. В даль-

нейшем показатели радиальной морфометрии приближались к таковым у интактных животных

Таблица 2

Показатели радиальной морфометрии поперечных срезов нижней челюсти (М+т) при спонтанном заживлении переломов

До Сроки эксперимента

Область исследования перелома 14 сут 30 сут 60 сут

(п=7) (п=5) (п=5) (п=5)

Тангенс К 0,64+0,04 0,11+0,02* 0,53+0,04* 0,66+0,07

уел ед 4,11+0,24 2,93+0,18* 3,76+0,37 4,12+0,33

К 0,35+0,02 0,45+0,05* 0,39+0,03 0,33+0,02

V» 2,21+0,15 1,12+0,15* 1,72+0,20* 2,20+0,15

* - достоверные различия с показателями в контрольной группе

Таким образом, в процессе спонтанного заживления переломов тела нижней челюсти у животных группы сравнения путем репаративной реге-ненерации формировалась зрелая костная ткань Закономерности ее формирования не отличались от хорошо известных в литературе описаний заживления костных переломов другой локализации

Репаративная регенерация костной ткани нижней челюсти при хронической эндогенной интоксикации.

При обнажении костной ткани нижней челюсти интактных крыс и животных на 14-30 сутки эндогенной интоксикации макроскопически она представляла собой белесоватую однородную структуру с относительно гладкой поверхностью Каких-либо дефектов на поверхности не обнаруживали На 60-е сутки хронического ЭТ обращали внимание на появление сероватой окраски ткани, а механически выглядела менее прочной

При микроскопическом исследовании костной ткани челюстей в ранние сроки (14 суток) было отмечено умеренное уменьшение плотности костных балок без нарушений трехмерной организации костной ткани В ткани тела нижней челюсти и вблизи височно-нижнечелюстного сустава выявлялись начальные признаки патологического ремоделирования кости с явлениями остеокластической резорбции матрикса и возрастанием доли деминерализованных участков

На 30-е сутки хронической эндогенной интоксикации обращало на себя внимание относительное увеличение размеров лакун, которое к 60-м суткам эксперимента позволяло на основании гистологической картины кости говорить о наличии истинного остеопороза Вначале выявлялось только умеренное уменьшение плотности костных балок без нарушений трехмерной организации костной ткани В периапикальной области в нагружаемых участках кости выявлялись выраженные признаки патологического ремоделирования кости с явлениями остеокластической резорбции матрикса и возрастанием доли деминерализованных участков

Количество фиброзных клеток и остеокластов в составе клеточных лакун возрастало, а на поздних сроках опыта было отчетливо заметно при-

сутствие относительно большего количества микроциркуляторных элементов К 60-м суткам развитие остеопороза и патологического ремоделирова-ния, затрагивало практически все отделы кости Имелись обширные очаги полной деминерализации Большее кровоснабжение костной ткани нижней челюсти на 60-е сутки ЭТ можно было связать как с новообразованием сосудов микроциркуляторного русла (местами - с явлениями ангиоматоза), так и с их повышенным кровенаполнением по типу хронического венозного полнокровия

При окраске по ван Гизону среди костных балок, начиная с 30-х суток ЭТ, выявляли прирост соединительнотканных элементов, в дальнейшем с формированием мелких очагов истинной соединительной ткани Территориально они располагались преимущественно с лингвальной поверхности нижней челюсти, были соединены с надкостницей и занимали место вблизи перехода ткани тела в ткань дуги нижней челюсти При окраске по трихром Масону выявлялся плотноволокнистый характер данной соединительной ткани и ее относительная зрелость Каких-либо воспалительных явлений в ткани тела нижней челюсти при моделировании хронического ЭТ не выявлялось

При количественном исследовании было показано, что развитие хронической эндогенной интоксикации сопровождается достоверным уменьшением объемной длины костных балок, начиная с 30-х суток эксперимента Параллельно возрастает объемная доля соединительной ткани и сосудов Численная плотность остеобластов и остеоцитов уменьшается в ткани к 60-м суткам эксперимента на 32,5% (Р<0,05), численная плотность фибробла-стов и фиброцитов увеличивается на 24,5%, а остеокластов - более, чем вдвое Полученные количественные данные убедительно свидетельствуют о том, что при хроническом ЭТ происходит развитие остеопороза нижней челюсти, что сопровождается уменьшением остеосинтетического потенциала ткани и увеличением - остеорезорбтивного (рис 2)

При исследовании экспрессии остеонектина у интактных крыс выявлялась умеренная экспрессия костноматричного протеина Его равномерное расположение и повсеместное выявление в костных балках свидетельствовали о нормальном характере остеосинтетических процессов По мере формирования хронического ЭТ экспрессия остеонектина в матриксе костной ткани несколько уменьшалась, а к 90-м суткам в ней выявлялись относительно негативные участки, свидетельствующие об относительной неравномерности процессов остеогенеза

При определении пролиферативной активности в костной ткани у крыс контрольной группы процент РОЧА-позитивных клеток оказывался выше во внутренней зоне костного вещества (11,2+0,7%), в сравнении с аналогичным показателем в наружной зоне При развитии хронического ЭТ к 14-м сут эксперимента процент РСМА-позитивных клеток возрастал, а затем в значительной степени снижался, составляя к 60 сут менее половины от соответствующих значений в контрольной группе Полученные данные

свидетельствуют о фазовом изменении пролиферативного потенциала клеток в костной ткани по мере развития хронического ЭТ.

□ ОК/ОБ

□ ОД костн!

Рис. 2. Снижение объемной доли костного матрикса и увеличение остеоре-зорбтивного потенциала при хронической эндогенной интоксикации. За единицу принято значение у интактных животных. О К- остеокласты, ОБ-остеобласты, ОД костн -объемная доля костной ткани.

Показатели радиальной и векторной морфометрии количественно подтверждали усугубление патологической перестройки костной ткани (табл. 3).

На языке функции распределения свойств объектов при компьютерной морфометрии это выражалось в повышении градиентов плотности радиальной морфометрии (показатель tgK) и вариабельности яркости по секторам (Ут).

Таблица 3

Показатели радиальной морфометрии поперечных срезов нижней челюсти (М+ю) при хроническом эндотоксикозе у крыс

Контроль- Сроки эксперимента

Область исследования ная группа 14 сут 30 сут 60 сут

(п=7) (п=5) (п=5) (ч=5)

Тангенс К 0,64+0,04 0,61+0,05 1,25+0,07* 1,04+0,07*

1ш, усл. ед. 4,11+0,24 4,72+0,26 4,97+0,37* 4,05+0,33

И 0,35+0,02 0,36+0,03 0,21+0,03* 0,28+0,02*

Ут 2,21+0,15 2,75+0,20 3,13+0,24* 2,75+0,17*

* - достоверные различия с показателями в контрольной группе,

Таким образом, при хроническом ЭТ костная ткань челюстей становится мишенью эндогенных токсических соединений с нарушением естественных процессов тканевого ремоделирования, что может стать основой системной патологии челюстно-лицевой области.

Регенеративный остеогенез при переломах нижней челюсти на фоне хронической эндогенной интоксикации.

При макроскопической оценке область перелома на 14-е сутки после его моделирования была представлена структурой белесоватый цвета, плотной консистенции и полностью закрывала диастаз бывшей области травмы К 30-м суткам процесса плотная ткань регенерата заполняла область дефекта, представляя собой типичную фиброзно-костную мозоль, местами с явлениями дефигурации, цвет регенерата приобретал слегка сероватый оттенок Костная ткань по краям области травмы областью дефектов находилась в состоянии активного ремоделирования На 60-е сутки процесса область сращения перелома была морфологически неотличима от окружающей ткани

При микроскопическом исследовании на 15-е сутки эксперимента в группе с заживлением переломов на фоне хронической эндогенной интоксикации ткань регенерата была представлена свежей грануляционной тканью От сохранившейся надкостницы вглубь грануляционной ткани проходили сосуды, вокруг которых происходила интенсивная резорбция фрагментов костной ткани Остеокластическая резорбция сочеталась с пролиферацией соединительнотканных, хрящевых и остеогенных элементов, но интенсивного построения матрикса не происходило

На 30-е сутки область регенерата представляла собой мозаично смешанный конгломерат соединительной волокнистой, хрящевой и костной ткани Зоны резорбции кости выявлялись повсеместно, но их интенсивность не была столь выраженной, как на предыдущем сроке эксперимента Сохранялась богатая васкуляризация регенерата, местами - до явлений ангио-матоза Волокнисто-хрящевые фрагменты регенерата не имели четко оформленного зонального строения, их многочисленные клетки и коллаге-новые волокна располагались беспорядочно и прерывались в поверхностных слоях единичными большими и малыми полостями Ремоделированию подвергались и костные балки по краю перелома, но ни они, ни вновь сформированные костные балки по своим размерам не достигали и 60% от показателей при спонтанном заживлении перелома

На более поздних сроках основным источником остеогенеза становилось энхондральное окостенение По краям образовавшегося волокнистого хряща формировались костные балки, а проявления остеорезорбции сохранялись лишь по периферии регенерата

При окрасках по ван Гизону и Маллори было отчетливо видно, что даже на 60-е сутки после перелома в условиях хронической эндогенной интоксикации формируется смешанный тип ткани Его можно было охарактеризовать как костную ткань со значительным присутствием грубоволокни-стой соединительной ткани и элементов волокнистого хряща

При количественном исследовании было показано, что регенерация костной ткани в условиях хронической эндогенной интоксикации сопрово-

ждаегся определенной задержкой прироста костного компонента в регенерате и выраженными нарушениями клеточного строения ремоделируемой ткани

На 14-е сутки в объеме регенерата у крыс основной группы преобладала соединительная ткань, причем ее присутствие было больше, чем при-аналогичном сроке у крыс с переломами без ЭТ Характерное для регенерации увеличение объемной доли сосудов (5,6±0,5%) было более выраженным и выявлялось на всем протяжении эксперимента (у крыс группы сравнения - только до 30-х суток) Регенерация сопровождалась более ранним и значительным приростом численной плотности остеокластов в объеме ткани регенерата (372±29, 1/мкм3) и задержкой прироста численной плотности остеобластов и остеоцитов (4824±293, 1/мкм3), который и на 60-е сутки не достигал 70% от показателя при спонтанном заживлении переломов

Полученные данные в совокупности отражают общий дефицит остео-синтетических процессов в регенерате после переломов, заживающих в условиях хронической интоксикации при доминировании процессов остеоре-зорбции (рис 3)

з/Г

□ ОК/ОБ

□ ОД костн

Исх 14сут ЗОсут бОсут

Рис 3 Снижение объемной доли костного матрикса и увеличение остеоре-зорбтивного потенциала при заживлении переломов на фоне хронической эндогенной интоксикации За единицу принято значение у интактных животных

В целом эти процессы весьма напоминают таковые в интактной кости при моделировании хронического ЭТ, но выражены резче и существенно влияют на общий процесс заживления перелома

При заживлении переломов челюсти в условиях хронического эндо-токсикоза на 14-е сутки эксперимента процент РСМД-позитивных клеток оказывался многократно выше как в периферической, так и внутренней зоне регенерата (до 42,2±2,7%), в сравнении с аналогичным показателем при спонтанном заживлении переломов К 30-м суткам он значительно уменьшался, что свидетельствовало о практически полном завершении клеточно-

го деления в зоне регенерата К 60-м суткам при репаративной регенерации при переломах нижней челюсти на фоне хронической эндогенной интоксикации процент РСМД-позитивных клеток составлял 5,7±0,3% по сравнению с контрольной группой

На ранних сроках в регенерате доминировала соединительная ткань с высокой пролиферативной активностью фибробластов Эта ткань хорошо визуализировалась в окраске на виментин, который являлся позитивным для фибробластов и эндотелиальных клеток сосудов, богато васкуляризи-рующих регенерат В последующем количество соединительной ткани в объеме регенерата уменьшалось, равно как и несколько менее богатой представлялась ангиоархитектоника ткани

В противовес этому, иммуногистохимическое исследование на остео-нектин, выявляло замедленнее, а местами - патологическое ремоделирова-ние костной ткани с тенденцией к снижению содержания остеонектин-позитивных структур в регенерате

Показатели радиальной и векторной морфометрии количественно подтверждали формирование патологического ремоделирования костной ткани и неадекватное течение регенераторного процесса на месте перелома (табл 4)

Таблица 4

Показатели радиальной морфометрии поперечных срезов нижней челюсти (М+т) при заживлении переломов на фоне хронического эндотоксикоза у крыс

До Сроки эксперимента

Область исследования перелома 14 сут 30 сут 60 сут

(п=7) (п=5) (п=5) (п=5)

Тангенс К 1,25+0,07# 0,25+0,06 0,78+0,07# 0,96+0,09

1ш,усл ед 4,97+0,37 2,28+0,31 3,31+0,30 3,73+0,31#

И 0,21+0,03# 0,40+0,03 0,32+0,03# 0,38+0,03#

V. 3,13+0,24 1,17+0,15 2,55+0,24 2,62+0,28#

# - достоверные различия с аналогичным показателями в группе сравнения

Это в основном выражалось в появлении градиентов плотности радиальной морфометрии (показатель tgK) и повышении вариабельности яркости по секторам (Уш) в течение первых 14 суток после перелома В дальнейшем показатели радиальной морфометрии приближались к таковым при спонтанном заживлении переломов

Рентгеноденситометрическое исследование выявило неполное восстановление оптической плотности ткани регенерата и отсутствие однород-

ности оптической плотности в тканях регенерата до самых поздних сроков наблюдения

Таким образом, заживление перелома нижней челюсти в условиях хронической эндогенной интоксикации сопровождается формированием структурно и функционально неполноценного регенерата, патологическим ремоделированием костной ткани с развитием выраженного остеопороза вплоть до образования ложного сустава Корреляционный анализ.

Содержание веществ средней молекулярной массы и их олигопептид-ной фракции в плазме крови при моделировании хронической эндогенной интоксикации было увеличено на всех сроках эксперимента К 30 суткам они превышали аналогичные значения у животных контрольной группы в 1,44 раза (Р<0,05) и 2,06 раза (Р<0,01), соответственно, к 90-м суткам - уже в 2,06 и 2,63 раза (Р<0,01) Концентрация малонового диальдегида, как отражение общей активности ПОЛ, возрастала примерно в 1,5 раза по сравнению с контрольной группой и сохранялась на всех сроках эксперимента

При моделировании перелома на фоне хронической эндогенной интоксикации выявлялись прирост веществ средней молекулярной массы и их олигопептидной фракции, происходил аналогично основной серии в 1,221,35 раза к 14-м суткам, в 1,44-1,56 раза - к 30-м суткам (все Р<0,05) с 30-х суток эксперимента выявлялся относительно высокий прирост уровня малонового диальдегида, превышавший таковой у крыс контрольной группы почти двукратно Эти признаки свидетельствовали о дополнительном вкладе самого перелома и процессов его регенерации в формирование пула эндогенных токсических соединений

Мы провели исследование связей между этими тремя относительно независимыми количественными показателями, характеризующими развитие хронической эндогенной интоксикации, и показателями морфометрии регенерата с помощью корреляционного анализа Среди показателей морфометрии были отобраны только те, которые образовывались прямым измерением или подсчетом, то есть не были связаны друг с другом с помощью математических формул В случайно отобранном морфологическом материале контрольных животных и при 3 сроках процесса в каждой группе оказывалось не менее 10 полностью сформированных матриц для корреляционного анализа

Результаты корреляционного анализа выявили тесную взаимосвязь между показателями эндогенной интоксикации и морфометрии костной ткани, а также тканей регенератов после переломов (табл 5)

Так, уменьшение объемной доли костных балок при хронической эндогенной интоксикации зависело от уровня ВСММ и МДА в плазме крови

(г= -0,810 и -0,635, соответственно) Аналогичные связи выявлялись для объемной доли сосудов (в пределах от -0,729 до -0,671), но не для объемной доли соединительной ткани В отношении численной плотности остеобластов, остеоцитов, фибробластов и фиброцитов сколько-нибудь убедительных корреляций получено не было, а ряд из них были разнонаправленными для отдельных показателей эндогенной интоксикации Но для численной плотности остеокластов выявлены сильные положительные корреляции (г от 0,702 и 0,873)

Таблица 5

Матрица корреляций маркеров хронического ЭТ и показателей морфометрии костной ткани у крыс (г)

Показатели морфометрии Маркеры ЭТ

костной ткани ВСММ Олигопептиды МДА

ОД костных балок -0,810* -0,612 -0,635

ОД соединительной ткани 0,355 0,348 -0,236

Объемная доля сосудов 0,729* 0,721* 0,671*

ЧП остеобластов и остеоцитов -0,425 -0,304 -0,622

ЧП остеокластов 0,873* 0,711* 0,702*

ЧП фибробластов и фиброцитов -0,294 0,157 0,252

PCNA-пoзитивныe остеобласты 0,352 0,494 0,722*

* - сильные достоверные корреляционные связи (>0,669)

При корреляционном анализе маркеров эндотоксикоза и показателей морфометрии регенерата после переломов нижней челюсти были выявлены несколько иные взаимоотношения (табл 6)

Таблица 6

Матрица корреляций маркеров хронического ЭТ и показателей морфометрии тканевых регенератов при спонтанном заживлении переломов нижней челюсти у

крыс (г)

Показатели морфометрии регенератов Маркеры ЭТ

ВСММ Олигопептиды МДА

ОД костных балок -0,538 -0,474 -0,701*

ОД соединительной ткани 0,771* 0,697 0,714

Объемная доля сосудов 0,238 -0,149 0,692*

ЧП остеобластов и остеоцитов -0,425 -0,304 -0,622

ЧП остеокластов 0,654 0,582 0,693

ЧП фибробластов и фиброцитов -0,276 -0,120 0,272

РСКА-позитивные остеобласты 0,352 0,394 0,482

* - достоверные различия с показателями в контрольной группе

Уменьшение прироста объемной доли костной ткани в результате заживления перелома в этой серии в меньшей степени зависело от уровня

веществ средней молекулярной массы и олигопептидов в плазме крови (г= -0,538 и -0,474), соответственно), но в большей - от уровня МДА (г= 0,701) В отношении ОД соединительной ткани также имелась зависимость с сильными положительными корреляциями (г в пределах 0,697-0,771) Присутствовала сильная положительная связь между уровнем МДА (но не с ВСММ и олигопептидами) и объемной долей сосудов регенерата (0,692) Выявлены отрицательные корреляционные связи для численной плотности остеобластов и остеоцитов и положительные - для остеокластов, но не столь сильные, как в сериях без моделирования перелома С процентом РСМД-позитивных клеток связи не были столь сильными, и не превышали по модулю 0,482

Полученные данные отражают известное представление о существенном вкладе системной и местной активации перекисного окисления ли-пидов в инициации тканевого повреждения в ответ на эндогенную интоксикацию и участие этих факторов в нарушениях репаративного остеогене-за после костных переломов

Таким образом, проведенное исследование убедительно показало, что эндогенные токсические соединения способны изменять как характер репаративной регенерации костной ткани нижней челюсти вне ее повреждения, так и в значительной степени нарушать ход репаративной регенерации после переломов Пато- и морфогенез таких нарушений, безусловно, имеет комплексный характер и включает в себя воздействие токсических соединений непосредственно на эндотелий сосудов, остеобласты и остеокласты, обусловливая структурную перестройку костной с преобладанием диффузного компенсированного остеопороза Основу процесса составляют снижение остеосинтетического и увеличение остеорезорбтивного потенциала ткани, возрастание объемной доли соединительной ткани и сосудов, снижение объемной доли костного матрикса и изменение пролифератив-ного потенциала клеток костной ткани

ВЫВОДЫ

1 Репаративная регенерация костной ткани нижней челюсти у ин-тактных крыс на фоне хронической эндогенной интоксикации характеризуется уменьшением экспрессии остеонектина, снижением численной плотности остеобластов и остеоцитов со снижением процента пролиферирующих клеток среди них Параллельное увеличение численной плотности остеокластов и общее возрастание резорбтивного потенциала реализуется в развитии остеопороза с постепенным уменьшением объемной доли костных балок более чем в 1,5 раза по сравнению с контрольной группой

2 Для репаративного остеогенеза при переломе нижней челюсти на фоне хронического эндотоксикоза, характерны относительно длительное (до 30-ти суток после травмы) присутствие очагов соединительнотканного и хондрального замещения, относительно высокая и длительная васкуляриза-ция регенерата, потеря или позднее формирование зональности костного регенерата, пролиферирующих остеобластов (З651±256/мкм3) и остеокластов (785±44/мкм3)

3 Формирование остеорегенерата при переломе нижней челюсти у крыс на фоне хронического эндотоксикоза, сопровождается уменьшением прироста объемной доли костной ткани и стромально-сосудистого компонента, что по данным корреляционного анализа, связано с уровнем веществ средней молекулярной массы и малонового диальдегида в плазме крови Присутствует сильная положительная связь между объемной долей сосудов регенерата и уровнем малонового диальдегида (г=0,671-0,692) Выявлены отрицательные корреляционные связи для численной плотности остеобластов и остеоцитов (1= -0,622) и положительные — для остеокластов (г=0,654-0,873)

4 Разработанные количественные критерии для оценки костного регенерата (объемная доля соединительной ткани, сосудов и костных балок,, численная плотность остеобластов и остеокластов) и рентгеноденситомет-рическое исследование позволили дать точную характеристику процессам остеорегенерации на фоне хронического эндотоксикоза, которая может служить основой для разработки целенаправленной профилактики выявленных нарушений репаративного остеогенеза

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 В связи с замедлением процессов регенерации в костной ткани при переломе нижней челюсти на фоне хронической эндогенной интоксикации рекомендуется увеличение срока иммобилизации и включение в комплексную терапию стимуляторов остеогенеза

2 Для оптимизации репаративного остеогенеза при переломах нижней челюсти у больных с клиническими признаками хронической эндогенной интоксикации, обусловленной соматической патологией (заболевания печени, почек и др) необходимо определять ее уровень и проводить деток-сикационную терапию

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Качественные и количественные показатели остеорегенерации вокруг имплантатов // Материалы 9-й научно-практической конференции молодых исследователей Волгоградской области Направления 18-19 -Волгоград Изд-во ВолГМУ, 2004 - С 52-53 (соавт Е А Крайнов)

2 Оценка костного регенерата методом радиальной и векторной мор-фометрии //Материалы 10-й научно-практической конференции молодых исследователей Волгоградской области Направления 18-19 - Волгоград Изд-во ВолГМУ, 2005 -С 116-117

3 Нарушения ремоделирования костной ткани в условиях хронического эндотоксикоза // Современные наукоемкие технологии - 2006 - №2 -С 32-33 (соавт В М Забазнов)

4 Кристаллография сыворотки крови крыс с хроническим эндотокси-козом // Верхневолжский мед журнал - 2007 - №1-2 - С 59-61 (соавт С А Калашникова, А Н Горячев, Л В Полякова, Н В Ермолаев, В В Ново-чадов)

5 Нарушения физиологического ремоделирования костной ткани челюстей при экспериментальном хроническом эндотоксикозе // Актуальные вопросы современной стоматологии (морфологические, экспериментальные, клинические и социальные аспекты) - Труды ВолГМУ - Т 64, вып 2 - Волгоград, 2007 -С 142-147 (соавт В В Новочадов)

6. Выбор метода реконструкции альвеолярного отростка челюсти для имплантации с использованием анализа ортопантомограмм и телерентгенограмм // Вестник Волгоградского гос. мед. ун-та. - 2008. -№1. - С. 83-86. (соавт. А.П. Кибкало, С.Б.Фищев, И.Ю. Пчелин, Ицхак Назир Ахмед). - журнал «Перечня ... ВАК»).

Подп. в печать 24.04.08. Формат 60х 84/16 Бум. пл. 80 г/м2.

Печать офсетная. Усл. печ. л. 1.0 Тираж 100. Заказ 248. Волгоградский государственный медицинский университет, 400131, Волгоград, Пл. Павших борцов, 1.