Автореферат и диссертация по медицине (14.03.02) на тему:Морфологическая и молекулярно-биологическая характеристика воспалительных заболеваний кишечника у детей на материале эндоскопических биопсий.

На правах рукописи

Андреев Андрей Иванович

МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ КИШЕЧНИКА У ДЕТЕЙ НА МАТЕРИАЛЕ ЭНДОСКОПИЧЕСКИХ

БИОПСИЙ

14.03.02 - патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

о 3 ДПР 2014

Москва - 2014

005546712

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт морфологии человека» Российской академии медицинских наук и в Государственном бюджетном учреждении высшего профессионального образования «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России

Научный руководитель: доктор медицинских наук Тертычный Александр Семенович

Официальные оппоненты:

Заведующая кафедрой патологической анатомии и клинической патологической анатомии №2 педиатрического факультета ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» МЗ РФ, доктор медицинских наук, профессор Туманова Елена Леонидовна

Главный научный сотрудник лаборатории патоморфологии ФГБУ «Государственный научный центр колопроктологии» МЗ РФ,

доктор медицинских наук, профессор Капуллер Леонард Леонидович

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «МГМСУ имени А.И. Евдокимова» Минздрава России

Защита диссертации состоится «_» _2014 года в 12.00 ч. на заседании

диссертационного совета Д 001.004.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт морфологии человека» Российской академии медицинских наук (117418, Москва, ул. Цюрупы д.З).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт морфологии человека» Российской академии медицинских наук

Автореферат разослан "_"_2014 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Михайлова Лилия Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. В последние десятилетия во всем мире регистрируется повышение частоты воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК) и отмечается рост заболеваемости язвенным колитом (ЯК) и болезнью Крона (БК) у детей. По данным итальянского регистра ВЗК частота встречаемости ЯК и БК с 1993 по 2003 годы возросла с 0.89 до 1.39 на 100 тысяч среди населения младше 18 лет. Причем дети младше 6 лет составили в регистре 20% от всех зарегистрированных случаев [Castro M., 2010]. Подобная тенденция отмечается во многих западноевропейских странах, а также в США и Канаде [Karolewska-Bochenek К., 2009, Herrinton L.J., 2011; Cucchiara S., 2012; Denson L.A., 2013]. Россия в этом отношении не является исключением [Шумилов П.В., 2011; Федулова Э.Н., 2012, 2013].

ВЗК, которые традиционно включают ЯК и БК, а также, так называемый, неопределенный или недифференцируемый колит (НК), на сегодняшний день не имеют точно установленной этиологии, несмотря на большое количество работ, в которых детально анализируются возможные патогенетические механизмы и различные этиологические факторы [Белоусова Е.А., 2002; Воробьев Г.И., Халиф И.Л., 2008; Капуллер Л.Л., 2010; Fiocchi С., 2012]. Подобная ситуация крайне затрудняет постановку клинического диагноза, в особенности у детей. Диагноз ВЗК комплексный и обязательно включает данные клинического, рентгенологического, эндоскопического, морфологического,

иммунологического и молекулярно-генетического методов исследования [Dignass А, 2012]. Морфологическая диагностика является неотъемлемым и обязательным компонентом в этом списке диагностических мероприятий. Только после морфологического подтверждения возможно назначение терапии, включающей современные высокотехнологичные схемы лечения. Постановка морфологического диагноза колита и проведение разграничения среди различных групп колитов не всегда возможны, а дифференциальная диагностика между кишечными инфекциями, ЯК и БК в детском возрасте только по результатам изучения биоптатов является крайне сложной задачей. Колоноскопия с прицельной биопсией на сегодняшний день являются основным методом диагностики ВЗК у детей. Материалом для морфологического исследования служат колонобиоптаты, получаемые при проведении эндоскопических исследований. Классические морфологические критерии диагноза ЯК и БК хорошо известны и позволяют поставить точный диагноз в большинстве случаев. Сложности и трудности возникают при отсутствии в биоптатах классической морфологической картины, а также при отсутствии диагностически значимых клинико-лабораторных данных. Такие ситуации могут приводить к неверной трактовке обнаруженных морфологических изменений и к ошибочному морфологическому заключению [Cerilli L.A., 2012; Magro F., 2013].

В связи с этим морфологическая диагностика ВЗК у детей требует крайне взвешенного подхода в оценке обнаруженных структурных изменений. Во многих случаях для постановки окончательного диагноза приходится прибегать к повторным взятиям биопсий, что нежелательно. По сравнению со взрослыми у детей довольно часто ставится диагноз неопределенного или недифференцируемого колита, а также смена первоначально установленного диагноза ЯК на БК и наоборот [Carvalho R.S., 2006; Tsang J., 2012].

Считается, что воспалительные заболевания кишечника развиваются в результате неадекватного иммунного ответа, направленного против собственной бактериальной микрофлоры кишки, который приводит к воспалительному повреждению собственных тканей кишечника [Dupaul-Chicoine J., 2013]. В желудочно-кишечном тракте человека обитает более 450 видов микроорганизмов, общая биомасса которых у взрослого человека составляет 3-4 кг [Овсянников Д. Ю., 2006]. Микробном рассматривают как дополнительный многоклеточный «орган» человека, состоящий из различных линий клеток, которые взаимодействуют как между собой, так и с организмом хозяина [Martin F.P. с савт., 2008].

Многочисленные экспериментальные и клинические данные свидетельствует о вовлечении бактерий в патогенез ВЗК. Однако до сих пор при этих заболеваниях не определены какие-либо диагностически значимые изменения в составе микрофлоры [Yu C.G., 2013]. В связи с этим, выделение и использование в научных исследованиях одной или нескольких культур бактерий не позволяет достоверно оценить роль кишечной микрофлоры в патогенезе ВЗК [Nagalingam N.A., 2012]. Оценить состав и пространственное расположение микрофлоры возможно при применении метода флюоресцентной in situ гибридизации (FISH), при которой в качестве мишени используют рибосомальные РНК. Каждая бактерия содержит 103"5 рибосом, причем определенные участки рибосомальных РНК являются строго специфичными для каждого вида бактерий. Помимо этих участков бактерии содержат участки общие для групп, классов, типов и даже сообществ бактерий. Синтезированные участки комплементарной РНК с добавленной к ним флюоресцентной меткой являются высокочувствительными олигонуклетидными пробами, используемыми для гибридизации. Результаты гибридизации можно оценить в люминесцентном микроскопе без дополнительного усиления сигнала, так как каждая бактерия содержит большое количество РНК [Swidsinski А., 2005, 2008,2009].

Все известные на сегодняшний день олигонуклеотидные пробы имеют свою аббревиатуру и их характеристики подробно представлены в интернет-базе данных probeBase (http:/Awvw.microbial-ecology.net/probebase/credits.asp).

Микрофолора толстой кишки необходима для окончательного расщепления непереваренных остатков пищи, а также для синтеза отдельных витаминов и

короткоцепочечных жирных кислот, которые являются продуктом метаболизма бактерий. К преобладающим и всегда присутствующим в толстой кишке бактериям относятся Eubacterium rectale (Roseburia spp), Faecalibacterium prausnitzii и Bacteroides. Данные бактерии составляют в общей сложности до 70% всей микрофлоры кишечника [Swidsinski А., 2009; Kelly D, 2012; Strober W., 2013]. Другие бактерии присутствуют в небольших количествах и не всегда могут быть обнаружены.

Для того, чтобы избежать иммунного ответа и негативного воздействия бактерий на организм, поверхность слизистой оболочки покрыта слоем слизи с определенными физико-химическими характеристиками. Этот слой слизи имеет постоянную для каждого отдела толщину, не содержит бактерий и препятствует их контакту с поверхностью эпителиальных клеток [Boitin D., 2013].

В настоящее время большинство исследователей считают, что одним из важных звеньев патогенеза ВЗК является нарушение иммунологической толерантности, характеризующееся активацией гуморальных и клеточных иммунных реакций на бактерии кишечной микрофлоры. В развитии иммунного ответа важная роль принадлежит регуляторным Т-клеткам. Нарушение баланса между эффекторными и регуляторными Т-клетками играет ключевую роль в развитии иммунологического дисбаланса и воспалительных изменений в слизистой оболочке толстой кишки у больных с ВЗК [Конович Е.А., 2013; Boden Е.К., Snapper S.B., 2008; van Wijk F., Cheroute H., 2010].

Специфическим маркером регуляторных Т-клеток является недавно описанный транскрипционный фактор FoxP3. Экспрессия FoxP3 коррелирует с супрессорной активностью вне зависимости от экспрессиии CD25 и является определяющей для клеток с регуляторным Т-клеточным фенотипом [Muratov V., 2008].

Цель исследования. Охарактеризовать морфологические и молекулярно-биологические проявления воспалительных заболеваний кишечника с целью оптимизации диагностики этих заболеваний у детей.

Задачи исследования

1. Провести сравнительный анализ патогистологических критериев воспалительных заболеваний кишечника у детей на материале эндоскопических биопсий.

2. Выбрать наиболее достоверные патогистологические критерии воспалительных заболеваний кишечника у детей на материале эндоскопических биопсий.

3. Оценить результаты иммуногистохимического исследования популяции регуляторных Т-лимфоцитов (FoxP3+) и популяции тучных клеток (CD117+) в собственной пластинке слизистой оболочки толстой кишки при ее воспалительных заболеваниях у детей.

4. Провести изучение на биопсийном материале состава и пространственного расположения микрофлоры при воспалительных заболеваниях кишечника у детей методом флюоресцентной in situ гибридизации (FISH).

5. Разработать алгоритм комплексной морфологической, иммуногистохимической и молекулярно-биологической диагностики воспалительных заболеваний кишечника у детей на материале эндоскопических биопсий.

Научная новизна

Впервые разработаны новые диагностические критерии воспалительных заболеваний кишечника у детей, основанные на комплексном морфологическом, иммуногистохимическом и микробиологическом исследовании биоптатов толстой кишки.

Диагностика, основанная на использовании только гистологического метода исследования на материале эндоскопических биопсий у детей, имеет ограничения по окончательной морфологической верификации воспалительных заболеваний кишечника, что связано с отсутствием диагностически значимых морфологических признаков в 25% случаев.

Количественная иммуногистохимическая оценка популяции регуляторных Т-лимфоцитов, принимающих активное участие в контроле иммунного воспаления, позволяет повысить точность морфологической диагностики, а также прогнозировать течение заболевания.

Нарушения микробиоценоза толстой кишки и ее слизистого барьера с помощью метода флюоресцентной in situ гибридизации (FISH) является дополнительным диагностическим критерием воспалительных заболеваний кишечника у детей. Практическая значимость. Полученные данные о характере и составе биопленки, а также о количественном изменении в содержании отдельных клеточных популяций в собственной пластинке слизистой оболочки толстой кишки позволяют подтвердить наличие у больного воспалительного заболевания кишечника и провести дифференциальный диагноз между язвенным колитом, болезнью Крона и недифференцируемым колитом.

Данные о морфологических изменениях в органах пищеварительной и иммунной систем организма, а также динамических изменениях микробиома под влиянием

пробиотиков следует учитывать при оценке эффективности результатов лечения больных и контролировать заболевание в динамике при длительном диспансерном наблюдении.

Внедрение в практику. Результаты исследования внедрены в работу патологоанатомических отделений детской городской клинической больницы №13 им. Н.Ф. Филатова и Тушинской детской городской больницы Департамента здравоохранения города Москвы, а также используется в лекционном курсе кафедры патологической анатомии им. А.И. Струкова Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова.

Апробация результатов исследования.

Основные положения диссертации представлены в докладах на XVI Конгрессе детских гастроэнтерологов России и стран СНГ "Актуальные проблемы абдоминальной патологии у детей" (Москва, 2009), на всероссийской конференции с международным участием «100-летие российского общества патологоанатомов. Научные чтения, посвященные памяти член-корр., з.д.н. РФ, профессора Олега Константиновича Хмельницкого» (Санкт-Петербург, 2009), на Пятнадцатой Российской Гастроэнтерологической Неделе (Москва, 2009), международных научных конференциях «Пед1атрична гастроентеролопя i нутрщюлопя» (Харьков, 2010) и «Falk Symposium 172. -The Keys to IBD 2010: Treatment, Diagnosis and Pathophysiology» (Майами, 2010), на XXXIX Сессии ЦНИИГЭ «Междисциплинарный подход к гастроэнтерологическим проблемам» (Москва, 2013), на межлабораторной конференции в ФГБУ «НИИ морфологии человека РАМН» (Москва, 2013).

Публикации материалов исследования.

По материалам исследования опубликовано 14 научных работ, из них 4 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения и четырех глав: обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов и практические рекомендации; выводы и список литературы. Работа изложена на 140 страницах машинописного текста и проиллюстрирована 28 рисунками и 12 таблицами. Библиографический указатель включает 184 источника (46 отечественных и 138 иностранных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования

В работе были исследованы 580 биоптатов толстой и подвздошной кишки, полученных от 103 детей с направительным клиническим диагнозом ВЗК. Показанием к проведению колоноскопии являлось обнаружение крови в стуле, а также увеличение частоты и изменение характера стула. У всех детей отмечались общие клинические проявления в виде жалоб на боли в животе, снижения аппетита, симптомы интоксикации, снижение массы тела. Продолжительность клинических проявлений симптоматики обычно превышала 3-4 недели. Полученные за это время результаты микробиологического и иммунологического исследования на обнаружение кишечных инфекций были отрицательными. Хирургическая патология была также исключена.

С целью морфологической верификации диагноза проводилось эндоскопическое исследование с прицельным взятием биоптатов из всех отделов толстой и подвздошной кишки, т.н. лестничные биопсии.

Рис. 1. Распределение больных по возрасту и полу (по вертикальной оси и в таблице приведены данные о количестве детей в каждой возрастной группе)

Для сохранения слоя слизи и изучения биопленки биоптаты фиксировали в жидкости Карнуа по К-Шэио (1997). Последующую обработку биоптатов осуществляли по общепринятой методике, заливали в парафин и готовили серийные срезы толщиной 3-4 мкм. Для проведения морфологического исследования биоптаты окрашивали гематоксилином и эозином. Для проведения ИГХ исследования были использованы следующие моноклональные антитела (см. табл. 1).

Таблица I

Характеристика моноклональных антител, использованных для иммуногистохимического исследования

Антитела Клональность; код Разведение Фирма

Ki67 (маркер MIB-1 1:200 Novocastra

пролиферации)

CD3 (Т-клеточный маркер) PS1 1:500 Novocastra

CD 15 (гранулоцитарный 124 1:500 DAKO

маркер)

CD68 CEJ065 1:100 DAKO

(гистиоциты/макрофаги)

CD79a (В-клеточный 1А4 1:200 Novocastra

маркер)

CD117 (c-kit) (тучные 78Е 1:200 DAKO

клетки)

FoxP3 (Т-регуляторные Polyclonal 1:50 Abcam

лимфоциты)

Для проведения FISH исследования использовали меченные флюорохромами пробы фирмы «Interactiva» (Ульм, Германия) к следующим группам бактерий: Bacteroides (сокращенное название ВасЗОЗ), Bifidobacteriaceae (Bifl64), Enterobacteriaceae (Ebacl790), Faecalibacterium prausnitzii (Fprau), Fusobacterium necrophorum (Fnec), Fusobacterium nucleatum (Fnuc), Ruminococcus bromii (Rbro).

В качестве контроля получаемых результатов и исключения очагов артефициапьного свечения была использована проба ко всем группам бактерий - Eubacteria (Eub338). Для оценки структуры слизистой оболочки использовалась дополнительная окраска биоптатов ядерным красителем DAPI.

Просмотр препаратов и фотодокументация были выполнены на микроскопе Nikon Eclipse Ni-U (фирмы «Nikon», Япония), оснащенным цифровой камерой D700FX и программным обеспечением NIS-Elements Вг.

Статистическую обработку показателей проводили с учетом распределения параметрическими (t-критерий Стьюдента) и непараметрическими (U-критерий Манн-Уитни) методами. Различия считали достоверными при р<0.05.

Результаты исследования и их обсуждение

Морфологические изменения слизистой оболочки толстой кишки при воспалительных заболеваниях кишечника

В исследованных биоптатах были обнаружены изменения структуры слизистой оболочки, которые заключались в изменении поверхности, которая становилась неровной и приобретала псевдоворсинчатые очертания. Крипты имели неравномерный характер

распределения, отмечалась деформация, укорочение и почкование крипт. Покровный эпителий характеризовался признаками повреждения, десквамировапся и уплощался. Эпителий крипт помимо дистрофических изменений, характеризовался повышением митотической активности и уменьшением количества и размеров бокаловидных клеток. Воспалительные изменения заключались в повышении плотности, изменении состава воспалительного клеточного инфильтрата собственной пластинки слизистой оболочки. Активность воспаления оценивали по присутствию нейтрофильных лейкоцитов в собственной пластинке, эпителии, в просвете крипт и на поверхности слизистой оболочки. Признаками высокой гистологической активности являлось обнаружение эрозий, язв и участков грануляционной ткани.

На основании клинико-морфологических данных весь изученный материал был распределен на 3 группы. 1 группу составили дети с морфологически подтвержденными признаками ВЗК (55 детей), из них 36 ЯК и 19 БК (в 6 случаях были обнаружены гранулемы). В 22 случаях в результате морфологического исследования были выявлены признаки хронического колита, имевшего диагностические признаки ВЗК. Однако, только на основании данных морфологического исследования эти случаи не могли быть диагностированы как ЯК или БК и поэтому были расценены как случаи неклассифицируемого колита (НК). У 26 детей в колонобиоптатах были выявлены изменения не характерные для ВЗК. Это позволило исключить у этих больных ВЗК и рассматривать данные случаи как проявления других форм колитов неинфекционной природы, так как эти изменения чаще всего носили минимальный характер и не всегда могли рассматриваться как патологические, поэтому мы обозначили изменения в этой группе как минимальные неспецифические (МНСИ).

При направлении биоптатов с подозрением на ВЗК морфологическое исследование позволило точно верифицировать вариант ВЗК в 53,4% случаев, сделать заключение о наличии у ребенка ВЗК в 75% и исключить наличие ВЗК в каждом четвертом случае (Рис. 2).

Рис. 2. Результаты морфологической диагностики ВЗК у детей, представленные в виде диаграммы

ЯК был окончательно установлен в 35% случаев (36 из 55 наблюдений), БК в 18,4% (19 из 55 наблюдений). Для ЯК было характерно сочетание следующих наиболее значимых морфологических проявлений: структурных нарушений слизистой оболочки, диффузного распределения воспалительного инфильтрата и выраженной активности. Основным диагностическим признаком БК было обнаружение гранулем и/или поражение подвздошной кишки.

Таким образом, полученные при морфологическом исследовании данные согласуются с данными других авторов [Geboes К., 2008; Hummel T.Z., 2011], которые показали, что у детей при исследовании биоптатов с подозрением на ВЗК не всегда можно поставить окончательный диагноз и чаще, чем у взрослых, приходится диагностировать неопределенный или недифференцируемый колит.

Если рассматривать распределение детей входивших в исследование по возрастам согласно Парижской модификации рекомендаций по ВЗК 2011 года, то большинство детей в нашем исследовании составили дети в возрасте 10-16 лет (группа Al в). В этой группе детей распределение по полу было приблизительно равным, в отличие от группы Ala, в которой отмечалось преобладание лиц мужского пола (Рис. 3). Полученные данные могут быть объяснены незрелостью иммунной системы до 10-летнего возраста и сложными процессами перестройки и окончательного формирования иммунного ответа.

70 60 50 40

5 зо # 20 10 0

:1

ssssssssss Ш8Ш;

0-1летИнф 1-9 лет Ala 10-16 лет Ale старше 17 лет А2

шдевочки 3 3 34 4

мальчики 2 23 31 3

Рис.3. Распределение больных по возрастам согласно рекомендациям Парижского пересмотра (2011)

При оценке частоты встречаемости ВЗК и других форм колита по возрастным категориям в соответсвии с Парижской модификацией рекомендаций по ВЗК были получены следующие результаты (Рис. 4). Эти результаты показывают отсутствие до 1 года и низкую

частоту встречаемости ВЗК до 10-летнего возраста, что свидетельствует о важности формирования морфофункциональной зрелости иммунной системы для развития ВЗК.

0-1летИнф 1-9летА1а 10-16 лет А1в старше 17 лет

А2

Рис. 4. Распределение морфологических вариантов колита по возрастным категориям в соответствии с Парижским пересмотром (2011)

Полученные результаты исследования согласуются с данными J. Van Limbergen с соавт. (2013), которые показали отличия в клинико-морфологических характеристиках ВЗК у детей в возрасте до 10 лет (группа А 1а) и в старше 10 лет (группа AI в) и обосновывают важность дополнительного выделения групп детей до 10-летнего возраста.

Оценка состава иммунокомпетентных клеточных популяций по результатам илшуногистохнмического исследования

В группе ВЗК отмечалось выраженное и диффузное повышение плотности воспалительного клеточного инфильтрата, за счет увеличения содержания в собственной пластинке слизистой оболочки B-лимфоцитов и плазматических клеток (CD79a+), Т-лимфоцитов (CD3+) и макрофагов (CD68+). Эти изменения затрагивали базальные отделы собственной пластинки слизистой оболочки. Клетки с иммунофеноипом CD79a+ выявлялись вокруг дна крипт и между их базальными отделами, что соответствовало локализации плазмоцитов, обнаруживаемой при гистологическом исследовании.

Во всех случаях БК отмечалось позитивное окрашивание клеток гранулем в реакции с антителами к CD68. Это позволяло выявить гранулемы, особенно микрогранулемы и гранулемы с нечеткими границами.

Характерным признаком активности помимо появления в воспалительном инфильтрате нейтрофильных лейкоцитов (CD 15+) явилось повышение пролиферативной активности эпителия и клеточных элементов собственной пластинки слизистой оболочки (Ki-67+). Пролиферирующие клетки с позитивным окрашиванием ядер определялись среди

клеток покровного эпителия и в клеточном инфильтрате собственной пластинки слизистой оболочки.

В группе НК было увеличено содержание в собственной пластинке слизистой оболочки В-лимфоцитов и плазматических клеток (С079а+), Т-лимфоцитов (СЭЗ+) и макрофагов (С068+). Распределение этих клеток было неравномерным и повышение плотности воспалительного клеточного инфильтрата носило очаговый характер. Накопление СБ79а+ клеток в базапьных отделах не определялось по сравнению со случаями ЯК и БК. Интенсивность выявления позитивно окрашенных ядер клеток антителами к К¡-67 была достоверно ниже, чем в группе с ВЗК.

В группе МНСИ лимфоциты составляли гетерогенную популяцию, которая включала межэпителиальные лимфоциты, лимфоциты собственной пластинки слизистой оболочки и лимфоциты лимфоидных скоплений, которые являются одним из компартаментов лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистыми оболочками (МАЛТ). Межэпителиальные лимфоциты располагались между клетками покровного эпителия в его базальных отделах и по результатам позитивного ИГХ окрашивания в реакции с СОЗ относились к Т-клеткам. Лимфоциты собственной пластинки были представлены В-клетками и Т-клетками в соотношении 1:2. Клетки моноцитарно-макрофагального происхождения (СП6Х+) располагались в поверхностных отделах собственной пластинки слизистой оболочкой - диффузно субэпителиально. Из миелоидных клеток в собственной пластинке слизистой оболочки присутствовали эозинофильные и базофильные лейкоциты, а также СИ117-положительные тучные клетки. Нейтрофильные лейкоциты не обнаруживались.

В группе МНСИ сохранялась преимущественная локализация инфильтрата в верхних отделах собственной пластинки слизистой оболочки. В части случаев (21/34) отмечалось изолированное повышение содержания Т-лимфоцитов (СОЗ+) в покровном эпителии и эпителии крипт. В 18 случаях в собственной пластинке слизистой оболочки как в поверхностных так и в базальных отделах обнаруживались отдельные С068+ клетки. При гистологическом исследовании эти клетки имели обильную эозинофильную или коричневую цитоплазму и позитивно окрашивались при проведении РАБ-реакции. Эти клетки представляли особую группу макрофагов слизистой оболочки толстой кишки -муцинофагов.

Особенности иммунного гомеостаза в собственной пластинке слизистой оболочки у детей с воспалительными заболеваниями кишечника

В развитии хронического воспаления ключевую роль играют Т-регуляторные лимфоциты, маркером которых является транскрипционный фактор РохРЗ [МигаЮу V., 2008]. Эти клетки благодаря своим супрессорным воздействиям на Т-клеточный иммунный

ответ могут влиять на иммунный гомеостаз и контролировать активацию Т-клеток. Поэтому Т-регулятоным лимфоцитам отводится ключевая роль в поддержании иммунного гомеостаза в собственной пластинке слизистой оболочки у больных с ВЗК [Конович Е.А., 2013; Boden Е.К., Snapper S.B., 2008].

Важную роль в поддержании иммунного гомеостаза играют тучные клетки (CD117+), которые осуществляют свое воздействие как посредством выработки биологически активных веществ, так и непосредственным участием в бактерицидных защитных механизмах слизистой оболочки [Кравцов А.Л., 2012; Hofmann A.M., 2009].

При ИГХ исследовании Т-регуляторные лимфоциты характеризовались позитивным окрашиванием ядер. Они локализовались исключительно в собственной пластинке слизистой оболочки. Их количество повышалось в зонах формирования лимфоидных скоплений и лимфоидных узелков.

Тучные клетки (CD 117+) были диффузно распределены в слизистой оболочке. Часто их можно было обнаружить их в непосредственной близости к стенкам капилляров и эпителию крипт. Позитивное иммуногистохимическое окрашивание имело мембранный характер. Преимуществом использования маркера CD 117+ являлось обнаружение как содержащих гранулы, так и дегранулированных тучных клеток. Важной гистологической характеристикой тучных клеток и Т-регуляторных лимфоцитов было их дискретное распределение, и поэтому была возможна их объективная оценка по числу клеток на единицу площади. Другие клеточные элементы в виду особенностей окрашивания или особенностей расположения не могли быть оценены морфометрически.

Был проведен подсчет количества позитивно окрашенных клеток после выведения изображения на экран компьютера (площадь одного поля зрения микроскопа при большом увеличении (х400) составила 0.06 мм2). Полученные результаты представлены в Таблице 2.

Таблица 2

Абсолютное число Т-регуляторных (FoxP3+) лимфоцитов и тучных клеток (CD117+) в слизистой оболочке толстой кишки у больных с ВЗК

Тип клеток ЯК (п=36) БК (п=19) НК (п=22) МНСИ (п=26)

Т-регуляторные клетки 13.6+4.4* ** 14.3+5.3* ** 5.4+2.0** 3.1+1.8»

Тучные клетки 16.7±3.5 11.7±4.2 13.4±0.7 14.6+1.2

Достоверность различий в группах р<0.05

Условные обозначения: * статистические различия в группах ЯК и БК с группой сравнения (МНСИ) и ** статистические различия в группах ЯК и БК с группой Н

Из таблицы видно, что в группах больных с ВЗК отмечалось многократное повышение содержания Т-регуляторных лимфоцитов по сравнению с группой с минимальными неспецифическими изменениями и группой НК. Последний факт может отражать промежуточное положение данной группы и объясняет отсутствие четких гистологических признаков ВЗК в биоптатах. В тоже время РохРЗ-позитивные клетки не обнаруживались в слизистой оболочке у 2 больных с ВЗК и у 14 больных с МНСИ. Следует подчеркнуть, что количество РохРЗ-позитивных клеток в слизистой оболочке у больных с ВЗК колебалось от 5 до 21 в поле зрения. В группе МНСИ количество РохРЗ-позитивных клеток в слизистой оболочке варьировало от 2 до 8 на одно поле зрения. При сравнении полученных результатов различия в группах были статистически достоверными (р[]0.05).

Результаты подсчета содержания тучных клеток показали их наиболее высокое содержание в группе детей с ЯК. Эти результаты согласуются с выраженностью и распространенностью воспалительных изменений в собственной пластинке слизистой оболочки у этой группы больных.

Участие и роль тучных клеток при ВЗК до настоящего времени окончательно не определена. Ряд авторов не выявили существенной разницы в содержании тучных клеток у больных с ВЗК и в контрольной группе (РагЬасИ А., 2007). Однако этими же авторами было отмечено снижение интенсивности окрашивания пламатической мембраны тучных клеток в реакции с антителом С0117. Изучая популяцию тучных клеток при ЯК в стадию ремиссии, 8Ц)уапоуа 1. с соавторами (2002) выявили увеличение количества тучных клеток по сравнению с контролем. Результаты нашего исследования показали высокое содержание тучных клеток у больных ЯК в стадию обострения, но не выявили закономерностей в распределении и постепенном снижении содержания тучных клеток в группе сравнения как в случае с Т-регуляторными лимфоцитами, что отражают данные, приведенные в виде диаграмм на Рисунке 5.

18,00 16,00 14,00 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00

S......

*

Я о

Я

г V V;

j УК

— i Ё - н —

Трег

Тучные клетки

-Линейная (Трег)

• Линейная (Тучные клетки)

ЯК БК ННК МНСИ

Рис. 5. Абсолютное количество и соотношение Т-регуляторных лимфоцитов и тучных клеток в собственной пластинке слизистой оболочки толстой кишки у детей

Таким образом, нами было обнаружено повышение содержания регуляторных Т-лимфоцитов в слизистой оболочке толстой кишки у детей с ВЗК по сравнению с другими морфологическими вариантами колитов. Полученные нами данные подтверждают участие регуляторных Т-клеток в патогенезе ВЗК. Определение их содержания в колонобиоптатах может быть использовано в комплексной диагностике ВЗК.

Состав просветной микрофлоры и морфологические изменения в биоптатах с использованием универсальной пробы ко всем бактериям Eubacteria (Eub338) При проведении флюоресцентной in situ гибридизации во всех исследованных группах в биоптатах обнаружено позитивное свечение. Обнаруживалось высокое содержание бактерий в покрывающем слизистую оболочку слое слизи, причем в подавляющем большинстве случаев отмечалось повреждение защитного слизистого барьера и непосредственный контакт бактерий с поверхностью эпителиальных клеток (Рис. 6). В группе с минимальными неспецифическими изменениями в большинстве случаев (в 22 из 26 случаев, что в общей сложности составило 81% наблюдений в этой группе) количество бактерий было минимальным и слизистый слой оказался интактным. С учетом результатов морфологического исследования изменения в этих случаях трактовали как минимальные воспалительные, которые не следует рассматривать как морфологические проявления ВЗК, и полученные данные по изменениям в пристеночной микрофлоре подтвердили правомочность такой оценки.

ЯК БК НК мнси

□ Нет 0 0 10 46

□ Одиночные бактерии 17 16 46 35

□ Множественные очаги 22 30 26 19

■ Непрерывный слой 61 .......54.............. 18 ..............о.............

Рис. 6. Состав просветной микрофлоры в биоптатах с использованием универсальной пробы ко всем бактериям ЕиЬасГег1а (ЕиЬ338).

Соотношение бактерий, имеющих диагностическое значение

Преобладающим бактериальным компонентом биопленок у больных с ВЗК были Вас1его1с1е8 (ВасЗОЗ^ и ЕпГегоЬасГег1асеае (ЕЬас1790), их высокое содержание отмечалось в

51 из 55 (92.7%) случаев. В группах с другими формами колитов аналогичные изменения бактериальных компонентов биопленок были отмечены только в 10 из 48 (20.8%) наблюдений (Рис. 7 и 8).

Следующим по выраженности «заселения» биопленки в нашем исследовании были бактерии группы РаесаНЬаМегшт ргаизпИги (Рргаи), большое количество их обнаруживалось у 30 из 55 (54.5%) больных с ВЗК и у 12 из 15 (80%) больных с недифференцированными формами колитов. Следует отметить, что бактерии этой группы не были обнаружены в большинстве случаев болезни Крона (в 10 из 19 случаев (52.6%)) и в 9 из 22 (41%) случаев неопределенного колита (Рис.9).

90 ------------------------------------------ - — -..........................................-...................................................

80

70 1

г бо :........;—

? 50 [

5 40

* 30 20 10 0

II» Вас

й Вас 19 26 36 25

8 Вас 0 0 23 63

Рис.7. Содержание бактерий Вас1его111е8 (ВасЗОЗ) в биопленке

Рис.8. Содержание бактерий Еп1егоЬас1ег1асеае (ЕЬас1790) в биопленке

Рис.9. Содержание бактерий Faecalibacterium prausnitzii (Fprau) в биопленке Обнаружение бактерий из группы Bifidobacteriaceae (Bifl 64) отмечалось приблизительно у половины больных в обеих группах. В 34 из 55 (61.8%) случаев ВЗК и в 10 из 22 (45.5%) случаев неопределенных форм колитов.

Бактерии Ruminococcus bromii (Rbro) обычно относятся к минорным компонентам бактериальной микрофлоры кишки. Однако в нашем исследовании отмечалось повышение их относительного содержания в 6 случаях неопределенного колита и в 7 при других вариантах колитов. При этом одновременная оценка содержания бактерий этой группы и бактерий группы Faecalibacterium prausnitzii (Fprau), в частности, одновременное повышение их относительного содержания, наблюдалось только у больных, не имевших морфологических признаков ВЗК.

Пространственное расположение бактериальной микрофлоры и адгезия к поверхности эпителиальных клеток

В норме для предотвращения иммунного ответа и негативного воздействия бактерий на организм, поверхность слизистой оболочки покрыта слоем слизи с определенными физико-химическими характеристиками. Этот слой имеет постоянную для каждого отдела желудочно-кишечного тракта толщину, не содержит бактерий и препятствует контакту бактерий с поверхностью эпителиальных клеток [Boitin D., 2013]. В нашем исследовании в большинстве случаев происходило нарушение слизистого барьера. В результате слой слизи содержал микрофлору и отмечался контакт бактерий с поверхностью эпителиальных клеток. Было обнаружено два типа адгезии: в виде непрерывного слоя и в виде очаговых скоплений бактерий. Вариант адгезии бактерий в виде непрерывного слоя отмечался в большинстве случаев ВЗК и не был выявлен при других формах колитов.

Внутриклеточные бактерии

Внутриклеточно расположенные бактерии были обнаружены в отдельных эпителиальных клетках, а также в цитоплазме клеток собственной пластинки слизистой оболочки у 8 больных с ВЗК (в 7 случаях активного неспецифического язвенного колита и у 1 больного с неопределенным колитом) и у 12 больных с минимальным колитом неустановленной этиологии. Наиболее часто бактерии обнаруживались в покровном эпителии и были представлены бактериями из группы Bacteroides. Максимальное количество клеток, содержащих бактерии в цитоплазме, не превышало 2-3 на один биоптат.

Результаты гибридизации с пробами к Fusobacterium necrophorum (Fnec) и Fusobacterium nucleatum (Fnuc) во всех исследованных биоптатах были отрицательными.

При сравнительной оценке данных морфологического исследования и результатов оценки микробиоценоза, полученных с помощью метода флюоресцентной in situ гибридизации, мы смогли обнаружить характерные для ВЗК изменения в составе и пространственном расположении бактерий. У 51 из 55 (92.7%) больных с морфологически подтвержденным диагнозом ВЗК отмечалось высокое содержание бактерий в покрывающем слизистую оболочку слое слизи, отмечалось повреждение защитного слизистого барьера и непосредственный контакт бактерий с поверхностью эпителиальных клеток в виде непрерывного слоя. Бактерии групп Bacteroides и Enterobacteriaceae являлись преобладающим компонентом биопленок у больных с ВЗК.

Полученные результаты показывают перспективность и достаточно высокую диагностическую ценность при одновременном использовании морфологического метода и метода флюоресцентной in situ гибридизации. Следует подчеркнуть, что одним из условий проведения флюоресцентной in situ гибридизации и получения достоверных и диагностических изменений микрофлоры кишечника являются фиксация материала в безводном фиксаторе (фиксаторе Карнуа), который препятствует нарушению и растворению слизистого барьера. Общеизвестно, что использование антибиотиков приводит к резкому изменению состава микрофлоры, а иногда полному исчезновению бактерий, определяемых с помощью метода флюоресцентной in situ гибридизации. Поэтому перспективное использование методов морфологического и молекулярно-генетического анализа биоптатов требует обязательного соблюдения всех технологических условий, требуемых для проведения флюоресцентной in situ гибридизации.

Таким образом, морфологическое исследование биоптатов в сочетании с клиническими, лабораторными, рентгенологическими и эндоскопическими данными используется для постановки диагноза ВЗК и проведения дифференциальной диагностики между ЯК, БК и другими формами колита. Правильный диагноз ЯК по результатам

морфологического исследования биоптатов у взрослых возможен в подавляющем большинстве случаев. У детей проведение дифференциальной диагностики ВЗК сопряжено со значительными трудностями и возможно не более чем у 2/3 больных. Постановка диагноза неспецифических ВЗК у детей требует обязательного комплексного подхода и не всегда может быть основана только на результатах морфологического исследования биоптатов. У детей редко удается обнаружить классические диагностические морфологические критерии. Очень часто морфологические изменения у детей носят очаговый и слабо выраженный характер. Проведение дифференциального диагноза между ЯК и БК у детей часто оказывается невозможным и приходится прибегать к временному диагнозу неклассифицируемый или неопределенный колит. Это может быть связано с временным фактором, необходимым для развития выраженных воспалительных и структурных нарушений, а также от особенностей иммунного ответа в детском возрасте.

В процессе проведения исследования был разработана визуально-аналоговая шкала и алгоритм диагностики морфологических изменений при ВЗК у детей (Рис.10, 11).

Шаг 1. Есть ли колит? Какой?

С морфологических позиций диагноз «колит» подразумевает повышение плотности и изменение состава клеточного инфильтрата собственной пластинки слизистой оболочки. Этот показатель во многом зависит от качества и толщины гистологических препаратов. Поэтому его оценка требует определенной осторожности. Необходимо помнить, что в норме плотность клеточного инфильтрата выше в правых отделах толстой кишки, помощь в интерпретации может оказать характер распределения клеток. В норме отмечается тенденция к более плотному расположению клеток в верхней трети собственной пластинки слизистой. Изменения в клеточном составе в виде повышения содержания плазматических клеток, диффузный характер распределения клеточного инфильтрата, а также скопление плазматических клеток у основания крипт (базальный плазмоцитоз) являются достоверными признаками колита. Оценка количества эозинофильных лейкоцитов в биоптатах крайне затруднена ввиду вариабельности опубликованных данных в разных странах и в разных возрастных группах. «Нормальные значения» абсолютного числа эозинофилов в собственной пластинке слизистой оболочки кишки варьируют от 15 до 40 в поле зрения микроскопа при большом увеличении микроскопа х400. Альтернативным и легко определяемым критерием можно признать преобладание эозинофильных лейкоцитов в составе клеточного инфильтрата.

Шаг 2. Есть ли хронизация воспалительного процесса со структурной перестройкой слизистой оболочки?

С морфологических позиций хронизация (длительное течение заболевания) дополнительно подтверждается структурной перестройкой слизистой оболочки кишки, которая начинается с изменения формы, размеров и характера распределения крипт и, в конечном итоге, приводит к формированию псевдоворсинчатой поверхности, к укорочению и исчезновению крипт. Все выше описанные изменения являются фоном для развития последующих диспластических и опухолевых изменений, наблюдаемых при ВЗК. Следует отметить, что у детей в норме наблюдается некоторое расширение просвета крипт и незначительное укорочение крипт в слизистой оболочке прямой кишки. Помимо этого, в биоптатах могут обнаруживаться правильно делящиеся, расходящиеся под острым углом на две одинаковые, вновь образованные крипты.

Шаг 3. Изменения носят диффузный или очаговый характер?

К классическим морфологическим признакам ЯК относятся диффузный активный колит с признаками хронизации воспалительного процесса, с поражением прямой и сигмовидной кишки, распространяющимся на выше лежащие отделы толстой кишки.

Шаг 4. Очаговый колит, сочетающийся с гранулематозным процессом и поражением подвздошной кишки - морфологические признаки БК

При ЯК у детей может наблюдаться очаговость поражения в ректосигмоидном отделе, отсутствие признаков хронизации приблизительно в трети случаев и полное отсутствие изменений в биоптатах прямой и сигмовидной кишки в 4-8% случаев. Часто такая ситуация наблюдается у детей младше 10 лет, при коротком анамнезе заболевания до проведения первого эндоскопического исследования. Очаговый активный колит у детей не позволяет провести дифференциальный диагноз между ЯК и БК, поэтому основными морфологическими признаками БК у детей является поражение подвздошной кишки (илеит) и обнаружение типичных саркоидоподобных гранулем.

Шаг 5. Проведение дифференциальной диагностики между ЯК и БК на данном этапе не представляется возможным - недифференцируемый колит.

У детей большой процент составляют случаи так называемого неопределенного колита, который, по нашему мнению, правильнее называть недифференцируемым. Учитывая тот факт, что термин неопределенный колит ранее использовался исключительно для постановки диагноза при изучении операционного материала, а затем в литературе появились разные, иногда несогласованные между собой морфологические описания, относимые в разряд неопределенных колитов, использование термина неопределенный колит может приводить к неправильной трактовке морфологического заключения и этот термин следует признать не совсем удачным.

Диагноз недифференцируемого колита, который ставится лишь небольшому числу больных, подразумевает наличие ВЗК и исключает другие колиты, в частности инфекционный или постинфекционный. Больной с диагнозом недифференцируемого колита нуждается в тщательном длительном динамическом наблюдении для постановки окончательного диагноза.

На Рис. 10 и 11 представлены визуально-аналоговая схема и алгоритм морфологической диагностики колитов у детей.

Рис. 10. Диагностический алгоритм морфологического исследования колонобиоптатов у детей

л-.

Норма: клеточный инфильтрат расположен в верхних отделах собственной пластинки слизистой оболочки ° - лимфоцит О) -г

■ плазматическая клетка

О»)

• макрофаг

Колит:

очаговое повышение плотности клеточного инфильтрата собственной пластинки слизистой оболочки - очаговый колит

М "Л®

уй''П V й^-йЙЭД. У /

Колит: диффузное повышение плотности клеточного инфильтрата собственной пластинки слизистой оболочки - диффузный колит

Структурные изменения

слизистой оболочки: нарушение равномерного распределения, укорочение, почкование, ветвление крипт

Язвенный колит: сочетание диффузных воспалительных и тяжелых структурных изменений слизистой оболочки, включая базальный плазмоцитоз и псевдоворсинчатую поверхность

Болезнь Крона: очаговый характер поражения, обнаружение гранулем

Рис. 11. Визуально-аналоговая схема при изучении колонобиоптатов у детей с ВЗК

выводы

1. По результатам морфологического исследования колонобиоптатов у детей с воспалительными заболеваниями кишечника окончательная диагностика возможна только в половине случаев (53,4%). Дифференциальная диагностика язвенного колита и болезни Крона не может быть проведена в 25% случаев. В каждом четвертом случае направительный клинический диагноз воспалительного заболевания кишечника не подтверждается.

2. Диагностически значимыми критериями воспалительных заболеваний кишечника у детей являются: структурные изменения крипт, регенераторные изменения поверхностного эпителия и эпителия крипт, повышение плотности клеточного инфильтрата в базальных отделах собственной пластинки слизистой оболочки. Для болезни Крона диагностически значимыми являются также обнаружение эпителиоидно-клеточных гранулем и воспалительных изменений в биоптатах слизистой оболочки подвздошной кишки.

3. При воспалительных заболеваниях кишечника у детей в толстой кишке выявлено повышение пролиферативной активности (Ki67+) эпителия крипт и содержания регуляторных Т-лимфоцитов (FoxP3+) в собственной пластинке слизистой оболочки.

4. Методом флюоресцентной in situ гибридизации (FISH) при воспалительных заболеваниях кишечника у детей установлено нарушение структуры слизистого барьера, повышение содержания бактерий и выявлен непосредственный контакт микрофлоры с клетками эпителия.

5. Изменения в пространственном расположении и качественном составе бактериальной микрофлоры при проведении флюоресцентной in situ гибридизации (FISH) позволяют уточнить диагноз колита: отсутствие в биоптатах бактерий Faecalibacterium prausnitzii (Fprau) является важным дополнительным диагностическим критерием болезни Крона.

6. Дифференциальная диагностика воспалительных заболеваниях кишечника у детей должна базироваться на данных морфологического исследования, иммуногистохимического определения в слизистой оболочке регуляторных Т-лимфоцитов и оценки состава и локализации микрофлоры с помощью молекулярно-микробиологического метода флюоресцентной in situ гибридизации.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Предложен алгоритм исследования колонобиоптатов с применением визуально-аналоговой схемы, позволяющий выделить признаки, наиболее характерные для воспалительных заболеваний кишечника, и провести дифференциальную диагностику форм колитов, среди которых при морфологической диагностике у детей в 25% случаев выделяется недифференцируемый вариант.

Для диагностики воспалительных заболеваний кишечника у детей рекомендуется использование дополнительных методов диагностики, включающих оценку микробиоценоза кишечника с помощью молекулярно-микробиологического метода флюоресцентной in situ гибридизации, а также иммуногистохимимческую количественную оценку Т-регуляторных лимфоцитов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. A.C. Тертычный, П.В. Шумилов, Ю.Г. Мухина, Е.Г. Цымбалова, А.И. Андреев. Трудности морфологической диагностики воспалительных заболеваний кишечника на материале эндоскопических биопсий у детей. // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. - 2010. - №1. - С. 48-52.

2. A.C. Тертычный, A.B. Свидзинский, А.И. Андреев. Оценка микробиоценоза кишечника в дифференциальной диагностике колитов у детей. // Российский вестник перинатологии и педиатрии. - 2010. - Том 55. - № 4. - С. 50-53.

3. A.B. Свидзинский, A.C. Тертычный, А.И. Андреев, С.Х. Биче-оол, С.И. Мамченко. Метод оценки бактериальной микрофлоры с помощью флюоресцентной гибридизации in situ. // Архив патологии. - 2010. - Том 72. - № 5. - С. 44-46.

4. A.C. Тертычный, А.И. Андреев, Карел Гебоэс. Современные подходы к морфологической диагностике воспалительных заболеваний кишечника на материале эндосконических биопсий. // Архив патологии. - 2011. - Том 73. - №1. -С. 40-47.

5. A.B. Свидзинский, A.C. Тертычный, А.И. Андреев. Метод флюоресцентной in situ гибридизации (FISH) в изучении материала биопсий желудочно-кишечного тракта у детей. // Материалы XVI Конгресса детских гастроэнтерологов России и стран СНГ "Актуальные проблемы абдоминальной патологии у детей". - Москва, 17-19 марта 2009г. - Под общей редакцией проф. Ю.Г. Мухиной и проф. C.B. Бельмера. - М.: Изд. Медпрактика-М, 2009. - С. 71.

6. A.C. Тертычный, П.В. Шумилов, Ю.Г. Мухина, Е.Г. Цымбалова, А.И. Андреев. Трудности морфологической диагностики воспалительных заболеваний кишечника на материале эндоскопических биопсий у детей. // Материалы XVI Конгресса детских гастроэнтерологов России и стран СНГ "Актуальные проблемы абдоминальной патологии у детей". - Москва, 17-19 марта 2009г. - Под общей редакцией проф. Ю.Г. Мухиной и проф. C.B. Бельмера. - М.: Изд. Медпрактика-М, 2009. - С. 341.

7. A.C. Тертычный, А.И. Андреев. Морфологические особенности экспериментального колита у мышей с иммунной недостаточностью. // Материалы всероссийской конференции с международным участием «100-летие российского общества патологоанатомов. Научные чтения, посвященные памяти член-корр., з.д.н. РФ, профессора Олега Константиновича Хмельницкого», 9-10 октября 2009 года, Санкт-Петербург. - С. 304-305.

8. A.C. Тертычный, А.И. Андреев. Морфологические критерии диагностики неклассифицируемого колита. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2009. - Том XIX - № 5 (Приложение № 34. Материалы Пятнадцатой Российской Гастроэнтерологической Недели, 12-14 октября 2009г., Москва). - С. 63.

9. A.C. Тертычный, А.И. Андреев. Комплексная морфологическая диагностика воспалительных заболеваний кишечника у детей на материале эндоскопических биопсий. // Материалы Восьмого Российского Конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии, 20-22 октября 2009г., Москва. - С. 53.

10. A.C. Тертычный, А.И. Андреев, Герт де Гертох, Карел Гебоэс. Участие регуляторных Т-клеток в патогенезе воспалительных заболеваний кишечника у детей. // Материалы XVII Конгресса детских гастроэнтерологов России и стран СНГ "Актуальные проблемы абдоминальной патологии у детей". - Москва, 10-12 марта 2010г. - Под общей редакцией проф. Ю.Г. Мухиной и проф. C.B. Бельмера. - М.: Изд. Медпрактика-М, 2010. - С. 199-200.

11. A.C. Тертычный, А.И. Андреев, Герт де Гертох, Карел Гебоэс. Участие регуляторных Т-клеток в патогенезе воспалительных заболеваний кишечника у детей. // Детская гастроэнтерология. - 2010. - Том 7. - №1(15). - С. 27.

12. Tertychnyy A.S., Andreev A.I., К. Geboes Morphological diagnostic features of inflammatory bowel disease in children. // Falk Symposium 172. - The Keys to IBD 2010: Treatment, Diagnosis and Pathophysiology. - Miami (USA), March 26 - 27, 2010. -Abstract N 19.

13. A.C. Тертычный, A.B. Свидзинский, А.И. Андреев, С.Х. Биче-оол, С.И. Мамченко, Н.С. Маренич. Использование метода флюоресцентной in situ гибридизации в диагностике заболеваний желудочно-кишечного тракта у детей. // Матер!али науково-практичной конференцп з м!ждународною участю «Педштрична гастроентеролопя i нутрщюлопя». - XapKÎB, 20-21 травня 2010 року. - С. 90-91.

14. А.И. Андреев, Л.С. Селиванова, A.C. Тертычный. Морфологические критерии дифференциальной диагностики воспалительных заболеваний кишечника. // Сборник тезисов XXXIX Сессии ЦНИИГЭ «Междисциплинарный подход к гастроэнтерологическим проблемам», 5-6 марта 2013г., Москва. - С. 109.

Соискатель А.И. Андреев

Заказ № 22-а/03/2014 Подписано в печать 06.03.2014 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1.4

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru