Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему:Морфологическая и молекулярно-биологическая характеристика бронхиолоальвеолярного рака

Актуальность проблемы.

Интерес к раку легкого связан с его лидирующими позициями в списке онкологических заболеваний в развитых странах мира (ВОЗ, 1986). Начиная с 1950 года, от 2 до14% всего рака легких диагностируется как бронхиолоальвеолярный рак (БАР) и эта цифра с годами увеличивается. Главными отличиями БАРа от других форм аденокар-цином легких являются: более молодой возраст пациентов, среди которых имеется большая группа некурящих, преобладание женщин среди больных и лучший прогноз по сравнению с остальными гистогенети-ческими вариантами рака легкого.

В третье издание гистологической классификации опухолей легкого и плевры ВОЗ 1999 года, под редакцией Travis W. D [105], включены три гистологических варианта БАРа: муцинозный, немуци-нозный и смешанный. Однако, помимо перечисленных вариантов, рядом авторов из немуцинозного варианта выделяется склерозирующая форма БАРа со своими морфологическими особенностями [23].

Симптоматика и прогноз БАРа определяются его гистологическим вариантом и распространенностью опухоли. В связи с этим проблема ранней диагностики БАРа и точной морфологической верификации его вариантов имеет первостепенное значение.

В последние годы опухолевый процесс стали рассматривать как нарушение равновесия между процессами пролиферации, дифферен-цировки и клеточной гибели (Петров С.В., Райхлин Н.Т, 2000г).

Регуляция этих процессов осуществляется тремя классами генов: проонкогенами, генами - супрессорами опухолевого роста и генами регуляторами апоптоза. В каждой опухоли имеется определенный набор стойких генетических изменений, при выявлении которых возможно предугадать биологическое поведение опухоли на молекулярном уровне.

Несмотря на то, что клинические различия муцинозного и нему-цинозного вариантов БАРа известны давно, в отечественной и зарубежной литературе больше внимания уделялось сравнительной моле-кулярно-биологической характеристики БАРа со всей группой АК легких, не выделяя при этом его вариантов.

Совершено неизученным остается вопрос о роли лимфоцитар-ной инфильтрации в БАРе в связи с ее различным характером в его вариантах.

Все выше изложенное позволяет считать актуальным детальное изучение морфологических вариантов БАРа и выявление молекулярно-биологические особенности каждого из них.

Это стало возможным в связи с применением помимо рутинных гистологических методов исследования методов иммуногистохимии, что позволяет не только определить фенотип, но и биологическое поведение опухоли, включающие степень злокачественности, прогресси-рование, вероятность инвазии и метастазов.

Целью настоящей работы явилось, изучение морфологических и молекулярно-биологических особенностей процессов пролиферации, дифференцировки, гибели клеток и характера лимфоидной инфильтрации в различных вариантах бронхиолоальвеолярного рака.

Для реализации цели были поставлены следующие задачи: 1. Дать морфологическую характеристику различным вариантам БАРа, включая склерозирующий вариант.

2. Изучить молекулярно-биологические особенности каждого из вариантов БАРа и оценить их злокачественный потенциал на основе соотношения процессов пролиферации и апоптоза.

3. Обосновать по данным иммуногистохимических исследований целесообразность выделения склерозирующего варианта БАРа.

4. Определить фенотип лимфоцитарной инфильтрации в различных вариантах БАРа и оценить ее участие в противоопухолевом иммунитете.

Научная новизна

В результате проведенного исследования расширена морфологическая классификация бронхиолоальвеолярного рака. Помимо муци-нозного, немуцинозного и смешанного вариантов, описанных в классификации ВОЗ 1999 года, следует выделять из немуцинозного варианта БАРа склерозирующую форму, имеющую менее благоприятный прогноз по сравнению с несклерозирующей формой.

Полученные в результате исследования данные позволяют говорить о том, что варианты БАРа обладают различными молекулярно-биологическими особенностями в зависимости от цитогенеза.

Установлено, что для муцинозного варианта характерны высокая пролиферативная активность и способность клеток к репарации поврежденной ДНК, что отражают высокие показатели экспрессии маркеров Ki-67, PCNA. Так же низкая готовность клеток к спонтанному апоп-тозу сопровождающаяся низкими уровнями экспрессии bcl-X, фосфо-рилированной формы bcl-2 и р53.

Немуцинозный вариант БАРа, в частности его несклерозирую-щаяся форма, характеризуется низкой пролиферативной активностью опухолевых клеток и их высокой готовности к апоптозу, что отразили низкие уровни экспрессии Ki-67, PCNA и высокие уровни экспрессии bcl-X и bcl-2. При исследовании именно этого варианта ясно проявилась способность гена bcl-X к образованию гетеродиммеров, таких как bcl-XI-bcl-Xs и их способности стимулировать апоптоз в опухолевых клетках.

Подтверждена целесообразность выделения на микроскопическом уровне склерозирующего варианта из немуцинозного БАРа. Этот вариант отличается низкой пролиферативной активностью опухолевых клеток и вероятно высокой готовностью опухолевых клеток к апоптозу с выраженной аккумуляцией в ядрах онкопротеина р53.

Низкий уровень экспрессии онкопротеина р53 в ядрах опухолевых клеток в муцинозном БАРе по сравнению с немуцинозном, может свидетельствовать о выявлении нами не только мутантного, но и вероятнее всего связанного дикого р53, что может подтверждать участие вирусов в канцерогенезе БАРа.

Установлен низкий уровень экспрессии FAS(APO-1/CD-95) в немуцинозном варианте БАРа и ее отсутствие в муцинозном и склеро-зирующем вариантах, что свидетельствует о нарушении внеклеточной регуляции клеточной гибели.

Установлено, что лимфоцитарная инфильтрация, сопровождающая различные варианты БАРа, фенотипически имеет отличия в зависимости от клеточной дифференцировки опухоли.

Эти различия лежат в основе механизмов противоопухолевого иммунитета. В-клеточная инфильтрация с формированием фолликулов сопровождающая БАР из муцинпродуцирующих клеток, вероятно, морфологически отражает механизмы гуморального иммунитета в опухоли. Т-клеточная инфильтрация, характерная для БАРа с дифферен-цировкой клеток в сторону пневмоцитов II и клеток Клара, отражает включение механизмов Т-клеточного иммунитета вероятно на нарастание инвазивных свойств опухоли, что особенно характерно для склерозирующего варианта.

Практическая значимость работы

Полученные данные могут быть использованы в прогнозировании поведения опухоли и разработке новых методов генной и иммунной терапии. Муцинозный вариант является самым злокачественным из всех вариантов бронхиолоальвеолярного рака и сопровождается высокими уровнями экспрессии Ki-67 (9,6%), PCNA(47,6%) и наиболее низким уровнем клеточной гибели с низкими уровнями экспрессии bcl-X (1,5 балла) и bcl-2 (0,4 балла) в опухолевых клетках.

Внедрение результатов исследования в практику.

Результаты исследования используются в работе пато-морфологических отделов ряда лечебных учреждений г.Москвы (РНЦРР, ГКБ №55, ГКБ №57).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Бронхиолоальвеолярный рак является высокодифференцированной аденокарциномой представленной различными морфологическими вариантами. Помимо му-цинозного, немуцинозного и смешанного вариантов, необходимо выделять среди немуцинозного БАРа склерози-рующий вариант. Склерозирующий вариант характеризуется более выраженной атипией клеток, большей площадью центрального рубца, густой лимфоцитарной инфильтрацией межальвеолярных перегородок.

2. Различные варианты БАРа отличаются между собой не только морфологически, но и по уровню экспрессии различных биомолекулярных маркеров в опухолевых клетках, отражающих нарушения процессов пролиферации и клеточной гибели в них.

3. В зависимости от варианта БАРа меняется пролифератив-ная активность опухоли и уровень апоптоза, что отражает их различный злокачественный потенциал. Муцинозный вариант характеризуется самой высокой пролиферативной активностью и низким уровнем клеточной гибели. Нему-цинозный вариант характеризуется низкой пролиферативной активностью и более высоким уровнем клеточной гибели. Склерозирующий вариант характеризуется самой низкой пролиферативной активностью и вероятно высоким уровнем апоптоза с интенсивной аккумуляцией в опухолевых клетках р53.

4. Характерная для БАРа лимфоцитарная инфильтрация стромы опухоли, является морфологическим отражением противоопухолевого иммунитета. Для БАРа из муцинпро-дуцирующих клеток характерна В-клеточная лимфоцитарная инфильтрация, что подразумевает включение механизмов гуморального иммунитета в опухоли. Для БАРа из клеток Клара и пневмоцитов II характерна Т-клеточная инфильтрация стромы, что позволяет предположить нарастание клеточного иммунитета по мере развития инвазивных свойств опухоли.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на международном научном форуме «Онкология на рубеже XXI века» (1999 г.). По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждений, заключения, выводов, списка литературы и приложения.

Выводы:

1. Морфологически среди вариантов бронхиолоальвеолярного рака (БАР) следует выделять муцинозный и немуцинозный варианты. Немуцинозный вариант БАРа необходимо разделять по характеру стромы на склерозирующую и несклерозирующую формы.

2. Варианты бронхиолоальвеолярного рака отличаются друг от друга не только морфологической картиной, но и молекулярно-биологическими особенностями, отражающими изменения баланса между процессами апоптоза и пролиферации опухолевых клеток, а так же различными морфологическими проявлениями противоопухолевого иммунитета.

3. Муцинозный вариант БАРа характеризуется высокой пролифера-тивной активность опухолевых клеток, сопровождающейся высокими уровнями экспрессии Ki-67, PCNA и низкими уровнями экспрессии bcl-X и bcl-2, вероятно его фосфорилированной формой, что косвенно свидетельствует о низкой готовности опухолевых клеток к апоптозу.

4. Немуцинозный вариант БАРа характеризуется низкой-пролифера-тивной активность опухолевых клеток, судя по уровням экспрессии Ki-67 и PCNA, и усилением процессов апоптоза, что сопровождалось увеличением уровней экспрессии р53, bcl-X и bcl-2, вероятно его фосфорилированной формой.

5. Судя по экспрессии биомолекулярных маркеров в опухолевых клетках, муцинозный вариант обладает самым высоким злокачественным потенциалом среди вариантов БАРа.

6. Склерозирующий вариант БАРа характеризуется низкой пролифе-ративной активность опухолевых клеток и вероятно высокой готовностью опухолевых клеток к апоптозу, что сопровождалось выраженной экспрессией белка р53.

7. Отсутствие экспрессии CD95,Fas (АРО-1) в муцинозном и склеро-зирующем вариантах БАРа и низкая экспрессия в немуцинозном варианте свидетельствует о нарушении восприятия и проведения внеклеточных внешних сигналов вызывающих апоптоз в клетках.

8. Лимфоцитарная инфильтрация в строме муцинозного варианта представлена преимущественно В-лимфоцитами, CD20+ с формированием лимфоидных фолликулов, что свидетельствует об усилении гуморального иммунитета в ткани легких вокруг опухоли и в ее строме.

9. Лимфоцитарная инфильтрация в строме склерозирующего варианта преимущественно представлена Т-лимфоцитами, что свидетельствует об усилении Т-кпеточного иммунитета.

График рассеяния между уровнями экспрессии PCNA и Ki-67 во всей группе БАРа.

PCNAKI 67: i2 = 0,4558; г = 0,6752, р = 0,0000;

PCNA

График рассеяния между уровнями экспрессии bcl-X и bcl-2 в подгруппе немуцинозного несклерозирующего варианта БАРа. bcl-X

График рассеяния между уровнями экспрессии р53 и bcl-X в подгруппе немуцинозного несклерозирующего варианта БАРа

График расеяния между уровнями экспрессии СЕА и стадиями заболевания в подгруппе муцинозного варианта БАРа.

Варианты муцинозный немуцинозный склерозирующий

Варианты муцинозный немуцинозный склерозирующий

Варианты муцинозный немуцинозный склерозирующий

Варианты муцинозный немуцинозный склерозирующий

Варианты муцинозный немуцинозный склерозирующий

Ki 67

Mean 9,642857 3,962500 1,333333

PCNA

Mean 47,61905 23,12500 14,00000 p 53

Mean 1,41905 20,12500 36,98889

Bcl-2

Mean 0,438095 1,612500 0,944444

Bcl-X

Mean 1,519048 4,515625 0,888889

Std.Err. 0,650055 0,526605 0,992976

Std.Err. 2,499145 2,024539 3,817507

Std.Err. 1,991423 1,613237 3,041948

Std.Err. 0,181880 0,147340 0,277827

Std.Err. 0,305166 0,247213 0,466149

-95,00% 8,342100 2,908766 -0,653607

-95,00% 42,61827 19,07391 6,36119

-95,00% -2,56578 16,89692 30,90196

-95,00% 0,074153 1,317673 0,388514

-95,00% 0,908412 4,020954 -0,043873

95,00% 10,94361 5,01623 3,32027

95,00% 52,61982 27,17609 21,63881

95,00% 5,40387 23,35308 43,07581

95,00% 0,802037 1,907327 1,500375

95,00% 2,129683 5,010296 1,821650 Z

О Q.

60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 муцинозныи немуцинозныи варианты БАРа склерозирующий

14 12 10 8 loco

4 2 0 -2

Wilks lambda=06227, F(10, 110)=33,081, p=0,0000 вероятность 95% t муцинозныи немуцинозныи варианты БАРа склерозирующий

50 45 40 35 30 25

СО

Ю 20 а

15 10 5 0 -5 -10 муцинозный немуцинозныи варианты БАРа склерозирующии

Wilks lambda=,06227, F(10, 110)=33,081, р=0,0000 вероятность 95% О ш муцинозный немуцинозный варианты БАРа склерозирующии О муцинозный немуцинозный склерозирующий варианты БАРа

Заключение.

Прогноз БАРа определяется его гистологическим вариантом и распространенностью опухоли подобно другим гистологическим типам немелкоклеточного рака легкого.

В классификации ВОЗ опухолей легких выделено 1999 года три варианта БАРа: муцинозный, немуцинозный и смешанный. Однако помимо перечисленных вариантов в литературе выделяют несклерози-рующий и склерозирующий варианты среди немуцинозного БАРа с характерной для них морфологической картиной и своим прогнозом (Clayton, 1986). Авторами подсчитана общая пятилетняя выживаемость, которая составляет 19% в муцинозном варианте БАРа, 14% немуциноз-ном склерозирующем и 52% несклерозирующем соответственно. Эти параметры могут быть относительны, так как муцинозный вариант БАРа часто ассоциируется с аэрогенным распространением и мультицен-тричностью роста, а мультицентрическая форма имеет худший прогноз, чем локализованная.

Целью данной работы явилось изучение морфологических и молекулярно-биологических особенностей процессов пролиферации, дифференцировки, гибели клеток и характера лимфоидной инфильтрации в различных вариантах бронхиолоальвеолярного рака.

Работа выполнена на операционном архивном материале удаленных легких и их частей от 62 больных, находившихся на лечении больных в РНЦРР с 1985 по 2001 г.г. с диагнозом бронхиолоальвеолярный рак. Изучено 883 образца тканей. Соотношение мужчин и женщин составило 1,7:1. Изучались макропрепараты и серийные парафиновые срезы, окрашенные гематоксилином и эозином, альциановым синим, ставилась PAS-реакция. Иммуногистохимическое исследование авидин-биотиновым методом проводили на серийных парафиновых срезах с пред-варительной обработкой депарафинированных срезов в СВЧ-печке. В качестве первичных антител использовались моноклональ-ные антитела в следующих рабочих концентрациях: Ki-67- 1: 40, PCNA в готовом разведении, с-егВ-2 -1:150, СЕА-1:25, Р 53-1: 75, bcl-2-1:70, bd-X-1:750, APO-1\Fas -1:350, CD 20-1:50, CD 45Ro -1:50. В качестве вторичных антител применяли биотинилированные антитела к иммуноглобулинам мыши и кролика ("DAKO"). Результаты реакции оценивали полу-количественным методом в баллах, крестах и процентах на 300 окрашенных клеток. Статистически выявлялись достоверные корреляции между уровнями экспрессии маркеров с вычислением коэффициента Пирсона. Согласно классификации ВОЗ (1999г) в модификации Clayton [23], в результате морфологического исследования материал был разделен на муцинозный и немуцинозный варианты, а немуцинозный вариант на склерозирующий и несклерозирующий.

В результате проведенного нами исследования обнаружено, что гистологические варианты БАРа имеют различную молекулярно-биологическую характеристику.

Рис № 19. Уровни экспрессии онкомаркеров в опухолевых клетках различных вариантов БАРа. вариант маркер муцинозный немуцинозный несклерозирующий склерозирующий

Ki-67, % 9,6 4 1,3

PCNA, % 47,6 23,1 14

Bcl-2, баллы 0,4 1,6 0,9

Bcl-X, баллы 1,5 4,5 0,9

Р53, % 1,4 20,1 37

CD95\Fas, баллы - 0,4

СЕА, % 36 -

Для муцинозного варианта БАРа характерна самая высокая пролиферативная активность во всей группе БАРа, сопровождающаяся высокими уровнями экспрессией Ki-67 (9,6%) и PCNA (47,6%) в опухолевых клетках. Более высокие цифры PCNA по сравнению с Ki-67 в нашем исследовании, наиболее вероятно отражают не только процессы пролиферации, но и репарации ДНК.

Низкие уровни экспрессии онкопротеина bcl-2 и его не только ци-топлазматическая, но и ядерная локализация свидетельствует о выявление нами фосфорилированной формы этого гена не способной блокировать апоптоз и стимулировать пролиферацию в опухолевых клетках БАРа.

Низкие уровни экспрессии bcl-X (1,5 балла) и р53 (1,4% окрашенных клеток) в опухолевых клетках муцинозного варианта БАРа может свидетельствовать о низкой готовности клеток к апоптозу в данном варианте.

Сочетание высокой пролиферативной активности с низким уровнем апоптоза указывает на высокий злокачественный потенциал муцинозного варианта БАРа.

Выявленная нами при помощи иммуногистохимического метода низкая экспрессия р53 в муцинозном БАРе по сравнению с немуциноз-ным связана или с гистогенетическими особенностями муцинозного

БАРа или с накоплением в ядрах не мутантного, а дикого р53, вероятно блокированного в опухолевых клетках белками вирусов, участвующими в канцерогенезе опухоли.

Биомолекулярная характеристика муцинозного варианта отражает его низкую пятилетнюю выживаемость -19% [29,30]. Плохой прогноз муцинозного варианта так же связан с его способность к аэрогенному распространению и мультицентрическому росту, что еще раз подчеркивает важность ранней диагностики БАРа.

Не выявлена экспрессия CD95/Fas, что свидетельствует о нарушении проведения внеклеточных сигналов через FAS -рецепторы. Этот факт может свидетельствовать о лекарственной устойчивости муцинозного БАРа к химиопрепаратам, необходимости его ранней диагностики и хирургического лечения. Выявленная устойчивая экспрессия СЕА слизьпродуцирующими клетками муцинозного варианта БАРа и ее полное отсутствие в остальных вариантах БАРа, что свидетельствует о близости данного варианта к другим слизистым АК. В дальнейшем это может быть использовано в дифференциальной диагностике данного варианта с другими вариантами БАРа в сомнительных случаях.

Скопление В-лимфоцитов и формирование В-клеточных фолликулов в строме муцинозного варианта и рядом с опухолью отражает механизмы гуморального иммунитета. Формирование высокодифферен-цированного слизьпродуцирующего рака в паренхиме легкого, приводит к повышенной продукции IgA и формированию В-клеточных фолликулов, способных к продукции IgA и транспортировки его на поверхность опухолевого эпителия по аналогии со слизистой желудочно-кишечного тракта. Данный вопрос требует дальнейшего изучения, но эта особенность муцинозного варианта в перспективе может быть использована учеными в изучении вопросов иммунотерапии опухолей.

Для немуцинозного несклерозирующего варианта БАРа характерна низкая пролиферативной активность, что отразили более низкие уровни экспрессии Ki-67(4%) и PCNA (23%) в опухолевых клетках. Выраженная экспрессия bcl-XI -bcl-Xs (4,5 баллов) и фосфорилированой формы bcl-2 (1,6%) опухолевыми клетками отражает их высокую готовность к программированной клеточной гибели. Выявленная обратная зависимость между этими генами может так же свидетельствовать о повышении уровня апоптоза в данном варианте.

Выявлена экспрессия опухолевыми клетками FAS в немуцинозном варианте БАРа, но в менее чем 20% опухолевых клетках. Следует заметить, что FAS- рецепторы работают только при сочетании трех факторов: специфического сигнала, экспрессии антигена FAS и функционирующего внутриклеточного пути апоптоза. Даже при наличии FAS-рецепторов в опухолевых клетках муцинозного варианта БАРа, в них не может осуществляться проведение внеклеточных сигналов, так как в муцинозном варианте лимфоцитарная инфильтрации представлена преимущественно В-лимфоцитами. А как известно киллерные молекулы FAS-лиганд для связи с FAS-рецепторами, переносятся Т-лимфоцитами.

Незначительное преобладание Т-лимфоцитов в очаговых лимфо-цитарных скоплениях в строме немуцинозного варианта, может свидетельствовать о морфологическом проявлении клеточного противоопухолевого иммунитета.

Выделенный из группы немуцинозного варианта склерозирующий вариант БАРа отличался низким уровнем пролиферативной активности, что отразили низкие уровни экспрессии Ki-67 (1,3) и PCNA(14%).

Для него характерна, высокая готовность опухолевых клеток к апоптозу сопровождающаяся высоким уровнем экспрессии р53 (37%) в опухолевых клетках.

Как и в муцинозном БАРе в немуцинозном склерозирующем варианте нами не выявлена экспрессия FAS (CD95) опухолевыми клетками.

Нарастание Т-клеточного противоопухолевого иммунитета в данном варианте БАРа, вероятно вызвано инвазией внеклеточного мат-рикса опухолевыми клетками. Т-клеточная популяция, скорее всего, представлена цитотоксическими клетками, но это требует дальнейшего изучения.

Благодаря экспрессии HLA (главный комплекс гистосовместимо-сти) первого класса на всех клетках содержащих ядра (в т.ч. опухолевых) и их способности связываться с эндогенно синтезированными пептидами CD8+ , цитотоксические Т-лимфоциты могут выполнять важные защитные функции в тканях организма.

Мутации, происходящие в ходе злокачественной трансформации клеток, затрагивают онкогены, гены супрессоры и гены, кодирующие другие нормальные белки. Клетками вырабатываются измененные формы этих белков. Собранный из таких мутантных белков HLA 1-го класса рассматривается лимфоцитами как чужеродный, и может вызывать цитотоксический ответ Т-клеточного иммунитета [43,44]. Факт выраженного Т-клеточного ответа на нарастание опухолевой инвазии подтверждает утверждение Koutoulakis и Kolin [63], что пусковым механизмом в развитии центрального рубца в склерозирующем варианте БАРа является опухолевая инвазия легочных артериол. В результате сосудистой окклюзии возникают тромбоз и ишемический некроз ткани легкого, абсорбция некротических масс из альвеол, коллапс стенок альвеол и как финал, развитие грануляционной ткани.

Наличие признаков инвазии в склерозирующем варианте БАРа, а также более неблагоприятная экспрессия биомолекулярных маркеров по сравнению с несклерозирующем БАРом дают основание выделить его как самостоятельный вариант на морфологическом уровне. Тем более что это не составляет особых трудностей на микроскопическом уровне.

87