Автореферат и диссертация по медицине (14.03.02) на тему:Морфофункциональные и молекулярно-биологические факторы прогноза рака желудка

Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Московской области «Московский областной научно-исследовательский клинический институт

имени М.Ф. Владимирского»

0520145 3.021 На правах рукописи

Гаганов Леонид Евгеньевич

Морфо-функциональные и молекулярно-биологические факторы прогноза

рака желудка

14.03.02 - патологическая анатомия.

Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор

Казанцева Ирина Александровна

Москва-2014

Оглавление

Введение..............................................................................................................................................................................4

Глава 1 Обзор литературы................................................................................................................................14

1.1 Морфологические классификации и критерии прогноза рака желудка........................................................................................................................................................................................................14

1.2 Иммунофенотипирование карцином желудка на основе маркеров функциональных активности..................................................................................................25

1.3 Возможности морфологического исследования в оценке потенциала злокачественности карцином желудка............................................40

1.4 Заключение........................................................................ 57

Глава 2 Материал и методы исследования......................................................................................60

2.1 Материал исследования......................................................................................................................................................60

2.2 Методы исследования................................................................................................................................................63

Глава 3 Результаты собственных исследований................................................................................................70

3.1 Морфологическая характеристика операционного материала..................70

3.2 Экспрессия маркеров функциональной активности МИС1, М11С2, МиС5АС, МиСб и СЭЮ (иммуногистохимическое исследование) . 77

3.2.1 Варианты экспрессии муцинов и СБ 10 в эпителии внеопухолевой слизистой оболочки и карциномах желудка..............................................................77

3.2.2 Количественная оценка экспрессии муцинов и СБ 10 в карциномах желудка........................................................................................................................................................93

3.2.3 Иммунофенотипические варианты карцином желудка по экспрессии муцинов и СБ 10......................................................................................................................97

3.3 Показатели пролиферации, апоптоза и клеточного обновления............101

3.3.1 Внеопухолевая слизистая оболочка желудка............................................................102

3.3.1.1 Индекс К167............................................................................................................................................102

3.3.1.2 Митотический индекс......................................................................................................................108

3.3.1.3 Индекс апоптоза..................................................................................................................................115

3.3.1.4 Коэффициент клеточного обновления (ККО)..........................................................120

3.3.2 Карциномы желудка........................................................................................................................124

3.3.2.1 Индекс KI67............................................................................................................................................124

3.3.2.2 Митотический индекс......................................................................................................................129

3.3.2.3 Индекс апоптоза..................................................................................................................................135

3.3.2.4 Коэффициент клеточного обновления................................................................................142

3.4 Экспрессия молекулярно-биологических маркеров, ассоциированных с опухолевым ростом (иммуногистохимическое исследование)..............................................................................................................................................................148

3.4.1 Е-кадхерин (E-CAD)........................................................................................................................148

3.4.2 Галектин-3 (GAL3)..............................................................................................................................163

3.4.3 Коллаген базальных мембран (COL4)..............................................................................175

3.4.4 Тенасцин-С внеклеточного матрикса (TN-C)..............................................................180

3.4.5 Матриксные металлопротеиназы 2 и 3 типа (ММР2, ММРЗ)....................183

3.5 Послеоперационная 4-х летняя скорректированная безрецидивная выживаемость больных раком желудка................................................................................................202

3.6 Сравнительная оценка прогностической значимости, исследованных показателей потенциала злокачественности карцином желудка........................................................................................................................................................................212

3.7 Сопоставление данных магнитно-резонансной томографии и патоморфологического исследования операционного материала

при «проксимальном» раке желудка................................................................................236

Глава 4 Обсуждение результатов исследования........................................................................240

4.1 Выводы..........................................................................................................................................................261

4.2 Практические рекомендации....................................................................................................263

Заключение......................................................................................................................................................................264

Список сокращений..................................................................................................................................................268

Список литературы....................................................................................................................................................270

4

Введение

Рак желудка (РЖ) представляет собой гетерогенную группу карцином с высоким злокачественным потенциалом и неблагоприятным прогнозом.

Хотя за период с 1969 по 2012 год в структуре общей онкологической заболеваемости населения России доля РЖ сократилась с 28% до 7,1%, смертность от рака этой локализации в течение последних 15 лет снизилась незначительно — с 14,6% до 11,1% [21, 42].

По данным Я. ЗЬпсШаг с соавторами (2013) послеоперационная 2 летняя выживаемость больных раком желудка, в том числе в развитых странах, не превышает 31,7%, при этом медиана выживаемости составляет всего 16 месяцев [269].

Очевидно, что в изучении РЖ имеется ряд вопросов, требующих дальнейшего углубленного исследования. Отсутствуют комплексные данные о влиянии закономерностей клеточного обновления карциномы и функционального иммунофенотипа опухолевых клеток на злокачественный потенциал РЖ. Остается дискутабельной прогностическая значимость показателей экспрессии молекул межклеточной и клеточно-матриксной адгезии (Е-кадхерина (Е-САБ), коллагена 4 типа (СОЬ4)), протеинов и протеаз внеклеточного матрикса (ВКМ; тенасцина-С (ТК-С), матриксных металлопротеиназ 2 и 3 типа (ММР2 и ММРЗ)), а также регуляторного белка галектина-3 (вАЬЗ), в том числе при различных ИФТ вариантах РЖ. Не разработан общепринятый алгоритм индивидуального прогноза карцином этой локализации, учитывающий ключевые молекулярно-биологические факторы злокачественного потенциала опухоли.

Гистологические варианты карцином желудка определяются клеточным составом, направлениями дифференцировки клеток, способностью формировать железистые структуры, типом роста. Большинство гистологических

классификаций РЖ основано на перечисленных морфологических признаках [75, 137, 173, 288, 317]. Вместе с тем, опухолевые клетки в той или иной степени сохраняют функциональные свойства, присущие исходному типу эпителия желез слизистой оболочки, при этом функциональная активность опухолевых клеток оказывает определенное влияние на злокачественный потенциал новообразования.

Для характеристики функциональных свойств карцином желудка оценивают иммуногистохимическую (ИГХ) экспрессию опухолевыми клетками продуцируемых гликопротеинов, наиболее значимые из которых — муцины (MUC) -1, -2, -5АС и -6 типов, а также CD10 [216, 222, 251, 255]. В ряде исследований было установлено, что ИГХ экспрессия муцинов не коррелирует с гистологическим строением и стадией РЖ [118, 176], но позволяет подразделить карциномы этой локализации на несколько иммунофенотипических вариантов (иммунофенотипов, ИФТ) [268]. Высказывается предположение, что существует зависимость злокачественного потенциала РЖ от ИФТ опухолевых клеток [161, 211, 266, 307]. Вместе с тем, исследования, посвященные этой проблеме малочисленны и противоречивы.

Снижение экспрессии E-CAD и COL4 сопровождается увеличением подвижности и миграционной способности клеток, являясь важными механизмами инвазии [40, 46, 78, 177]. Повышение инвазивного потенциала опухолевых клеток в определенной степени может быть обусловлено нарушением экспрессии регуляторного белка GAL3, уровнем экспрессии матриксных металлопротеиназ и изменением состояния гликопротеинов ВКМ, к которым относится TN-C [155, 315, 341].

Предполагается, что уровень и варианты ИГХ экспрессии перечисленных маркеров могут иметь определенное значение для определения злокачественного потенциала карциномы желудка и прогноза [48, 52, 55, 70, 82, 123, 157, 224, 316, 334]. Следует подчеркнуть, что результаты этих исследований противоречивы, а изучение ММРЗ в РЖ не проводилось. Кроме того, нет сведений о зависимости

ИГХ экспрессии большинства указанных выше маркеров от функционального ИФТ карциномы желудка.

Важнейшей биологической характеристикой опухоли является ее пролиферативная активность и темпы клеточного обновления. В настоящее время большинство исследований в этом направлении основано только на учете индекса К167 (ядерного белка пролиферирующих клеток) [296], в то время как в комплексе с митотическим индексом (МИ) и индексом апоптоза (АИ) можно получить гораздо более полное представление об этих процессах. Заметим, что в имеющихся немногочисленных работах, посвященных этой проблеме, как правило, изучали влияние одного из перечисленных факторов на злокачественный потенциал опухоли [293], комплексного исследования темпов клеточного обновления карциномы желудка не проводилось, в том числе с учетом функциональной характеристики опухолевых клеток.

Ранее при изучении морфологического субстрата рентгенологического «симптома утолщения» стенки при РЖ, нами было установлено, что указанный симптом может быть обусловлен не только раковым инфильтратом, но и реактивным склерозом и/или отеком подслизистого слоя желудка, которые, как правило, искажают подлинные размеры опухоли в среднем на 30±7 мм [31].

Как известно, магнитно-резонансная томография является одним из наиболее точных методов дооперационной лучевой диагностики. По данным ряда исследований, в т.ч. наших, в настоящее время отмечается увеличение заболеваемости карциномами кардии и дна желудка т.н. «проксимального» РЖ, диагностика которого на ранних стадиях наиболее трудна для специалистов [35, 91]. Вместе с тем, исследований, проводивших изучение соответствия протяженности опухолевой инфильтрации при «проксимальных» карциномах желудка, полученной методом магнитно-резонансной томографии с данными патоморфологического исследования операционного материала, не проводилось.

Таким образом, изучение функционального ИФТ карциномы, поиск дополнительных морфологических и молекулярных маркеров биологической

агрессивности опухоли, определение влияния перечисленных факторов на прогноз, а также уточнение протяженности раковой инфильтрации на дооперационном этапе диагностики необходимы для более эффективного лечения и прогноза больных РЖ.

Целью настоящего исследования явилось совершенствование морфологической диагностики РЖ с комплексной оценкой злокачественного потенциала новообразования и выработкой дополнительных критериев прогноза.

Для достижения цели исследования были поставлены следующие задачи:

1. Изучить закономерности ИГХ экспрессии маркеров функциональной активности М11С1, М11С2, М11С5АС, МИСб и СЭЮ в неопухолевой слизистой оболочке и карциномах желудка и выделить иммунофенотипические варианты РЖ, определив возможную взаимосвязь этих факторов с локализацией, гистологическим вариантом и глубиной инвазии опухоли.

2. На основе изучения скорректированной безрецидивной выживаемости больных РЖ после радикальных операций оценить зависимость злокачественного потенциала карциномы от ее функционального ИФТ.

3. Провести комплексную оценку пролиферативной активности опухолевых клеток РЖ по индексу К167 и митотической активности, а также выраженности гибели клеток по типу апоптоза в сравнении с неопухолевым эпителием желудка, определив возможную взаимосвязь их количественных показателей с морфо-функциональной характеристикой РЖ и послеоперационной выживаемостью.

4. Изучить закономерности ИГХ экспрессии молекулярно-биологических маркеров, ассоциированных с опухолевым ростом Е-САЭ, ОАЬЗ, СОЬ4, ТЫ-С, ММР2 и ММРЗ в эпителии неопухолевой слизистой оболочки желудка и клетках РЖ, определить их возможную взаимосвязь с морфо-функциональной характеристикой карциномы и послеоперационной выживаемостью.

5. Установить возможность использования функционального иммунофенотипа карциномы, показателей клеточного обновления и ИГХ экспрессии перечисленных молекулярно-биологических маркеров в качестве независимых факторов прогноза при РЖ.

6. Оценить объективность данных о протяженности опухолевой инфильтрации при «проксимальном» раке желудка, полученных методом магнитно-резонансной томографии на этапе дооперационной диагностики и разработать методику, уточняющую размеры ракового инфильтрата при карциномах этой локализации.

Научная новизна работы определена комплексным патоморфологическим и иммуногистохимическим исследованием с количественной оценкой параметров клеточного обновления, типа продуцируемых муцинов, инвазивного потенциала опухолевых клеток и компонентов внеклеточного матрикса РЖ. Разработаны дополнительные морфо-функциональные критерии злокачественного потенциала РЖ, имеющие высокую прогностическую значимость.

Установлено, что функциональный ИФТ РЖ, определяемый по ИГХ экспрессии опухолевыми клетками М11С1, М11С2, МиС5АС, МИС6 и СБ 10, не связан с локализацией, гистологической стадией и гистологическим вариантом опухоли.

Показано, что карциномам смешанного ИФТ варианта свойственен более высокий злокачественный потенциал и худшая выживаемость, по сравнению с раками желудочного ИФТ, что позволяет использовать функциональный ИФТ в качестве дополнительного фактора прогноза.

Установлено, что параметры клеточного обновления карциномы желудка, определяемые по совокупности митотического и апоптотического индексов, а также показатели индекса К167 статистически значимо ассоциированы с гистологическим вариантом и функциональным ИФТ опухоли. Предложен

условный количественный «коэффициент клеточного обновления» (ККО) РЖ, имеющий прогностическое значение.

Впервые в карциномах желудка изучена иммуногистохимическая экспрессия ММРЗ и определено ее прогностическое значение, а также уточнено прогностическое значение вЛЬЗ.

Показано, что количественные показатели ИГХ экспрессии молекулярно-биологических маркеров инвазивного потенциала ОАЬЗ, ММР2 и ММРЗ статистически значимо ассоциированы только с гистологическим вариантом и функциональным ИФТ РЖ. Перечисленные критерии, а также митотический и апоптотический индексы, ККО и количественные показатели экспрессии Е-САО статистически значимо ассоциированы с выживаемостью и поэтому могут быть использованы в качестве независимых факторов прогноза.

На основании исследования операционного материала показано, что протяженность опухолевой инфильтрации при «проксимальном» раке желудка гистологической стадии Т2-ТЗ, определяемая методом магнитно-резонансной томографии, превышает действительные размеры новообразования и нуждается в коррекции.

Теоретическая и практическая значимость. Проведенное исследование подтвердило предположение о возможности влияния функционального ИФТ опухолевых клеток на злокачественный потенциал РЖ. Внесен определенный вклад в изучение параметров клеточного обновления, а также ИГХ экспрессии опухолевыми клетками ряда молекулярно-биологических маркеров, ассоциированных с опухолевым ростом, в карциномах этой локализации.

Показано, что злокачественный потенциал РЖ обусловлен не только гистологическим вариантом и показателями пролиферативной активности опухолевых клеток, но и другими важными регуляторными механизмами: интенсивностью гибели клеток по типу апоптоза, морфо-функциональной дифференцировкой клеток опухоли и уровнем экспрессии белков и протеиназ,

участвующих в межклеточных и клеточно-матриксные взаимодействиях. Комплексный анализ результатов позволили разработать дополнительные объективные количественные критерии индивидуального прогноза при РЖ, доступные для применения в повседневной практике.

Установлено, что индекс К167 в карциномах желудка не имеет прогностического значения, что по всей вероятности объясняется неадекватностью этого показателя для оценки биологического потенциала опухолей, развивающихся в тканях с непрерывно обновляющимися клеточными популяциями, к которым относится эпителий слизистой оболочки желудка.

Определени