Автореферат и диссертация по медицине (14.03.02) на тему:Морфофункциональное состояние мезентериальных лимфатических узлов при длительном воздействии золотых наночастиц в эксперименте

На правах рукописи

005012309

ЗЛОБИНА Ольга Вячеславовна

МОРФОФУНКЦИОНАЛЫЮЕ СОСТОЯНИЕ МЕЗЕНТЕРИАЛЬНЫХ ЛИМФАТИЧЕСКИХ УЗЛОВ ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ ВОЗДЕЙСТВИИ ЗОЛОТЫХ НАНОЧАСТИЦ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

14.03.02 - патологическая анатомия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 2 [.!Д? 2С'12

Саратов - 2012

005012309

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный медицинский университет имени В. И. Разумовского» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Бугаева Ирина Олеговна. Официальные оппоненты: .

доктор медицинских наук, профессор Цыплаков Дмитрий Эдуардович; доктор медицинских наук, профессор Федорина Татьяна Александровна.

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации».

Защита состоится « ¿¿о » О^/ЯР 2012 г. в ^^ часов на заседании диссертационного совета Д 208.094.01 при ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В. И. Разумовского Минздравсоцразвигая России по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Б.Казачья, 112.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В. И. Разумовского Минздравсоцразвигая России.

Автореферат разослан« » 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Маслякова Г. Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Использование наноматериалов в медицине привлекает все более пристальное внимание врачей различных специальностей. Предполагается, что их применение приведет к революционным достижениям в лечении многих заболеваний, благодаря способности взаимодействовать с биологическими тканями на молекулярном и клеточном уровнях [Терехов А.И., 2005; Оборотова H.A., 2009; Hoet PH., Nemery В., 2001].

В рамках указанной проблемы использование золотых наночастиц (ЗНЧ) представляется весьма перспективным. В последние годы коллоидное золото широко применяется в онкологии, биохимии, иммунологии и лечении ряда аутоиммунных заболеваний [Дыкман Л.А., 2008; Хлебцов Н.Г., 2009; Blundell G., 1989]. Однако, несмотря на широкое использование золотых наночастиц, многие аспекты их безопасного применения требуют детального анализа. В частности, по отношению к золотым наночастицам недостаточно изучен анализ соотношений между возможной токсичностью, размерами, длительностью и способом введения.

Важное значение в этом аспекте имеют исследования тонких морфофункциональных изменений, происходящих в органах иммунной системы, в частности, в лимфатических узлах [Хаитов Р. М., 2011; Агар W., 1998; Boland S., 1999]. Комплексный анализ динамики клеточных элементов мезентериальных лимфатических узлов в ответ на увеличение длительности перорального введения золотых наночастиц различных размеров не производился.

Важное значение в оценке иммунотоксичности экспериментально исследуемого вещества имеет анализ обратимости клеточных реакций со стороны органов иммунной системы в ответ на прекращение его введения. До настоящего времени анализ обратимости иммунного ответа при прекращении перорального введения золотых наночастиц различных размеров с учетом

длительности их введения не производили. Перечисленные и нерешенные проблемы в области цитотоксичности, иммуногенности и биосовместимости коллоидного золота обуславливают актуальность и необходимость дальнейших исследований в указанной сфере. Цель исследования

Изучить выраженность и обратимость структурно-функциональных изменений в мезентериальных лимфатических узлах крыс с учетом размеров и длительности перорального введения золотых наночастиц. Задачи исследования

1. Изучить влияние размера перорально вводимых золотых наночастиц на клеточный состав мезентериальных лимфатических узлов.

2. Сопоставить кинетику популяционного состава мезентериальных лимфатических узлов с длительностью перорального введения золотых наночастиц различных размеров.

3. Проанализировать скорость восстановления исходного клеточного состава мезентериальных лимфатических узлов после прекращения введения золотых наночастиц различных размеров.

4. Определить сроки восстановления исходного клеточного состава мезентериальных лимфатических узлов при различной длительности перорального введения золотых наночастиц.

5. Провести анализ биораспределения золотых наночастиц в структурных элементах лимфатических узлов с учетом размеров и длительности перорального введения.

Научная новизна

Проведен комплексный анализ структурно-функциональных изменений клеточного состава мезентериальных лимфатических узлов при пероральном введении ЗНЧ различных размеров и изучена обратимость клеточных реакций в ответ на прекращение введения ЗНЧ.

Установлено, что ЗНЧ размерами 1-3 нм обладают иммунотоксичностью только при пероральном введении длительностью 30 дней. Золотые

4

наночастицы размерами 15 нм и 30 нм, независимо от длительности введения ЗНЧ, иммунотоксичностью не обладают.

Накопление ЗНЧ размерами 15 нм и 50 нм происходит преимущественно в зоне мозговых тяжей и лимфатических фолликулов при наличии единичных скоплений в паракортикалыюй зоне. Практическая значимость

Результаты проведенной работы дополняют современные представления о цитотоксичности, иммуногенности и биосовместимости ЗНЧ с учетом их размеров и длительности перорального введения. Получены данные о влиянии ЗНЧ на процессы пролиферации и дифференцировки иммунокомпетентных клеток, что указывает на принципиальную возможность целенаправленной активации лимфоцитов с последующей стимуляцией ими макрофагов, что имеет важное значение для создания вакцин нового поколения. Результаты, полученные при исследовании влияния длительности введения ЗНЧ различных размеров на показатели иммунитета, могут быть использованы для разработки методов безопасного применения коллоидного золота в практической медицине.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Изменения клеточного состава мезентериальных лимфатических узлов наблюдаются при восьмидневном введении ЗНЧ размерами 15 нм и 50 нм и шестнадцати- и тридцатидневном введении ЗНЧ размером 1-3 нм.

2. Восстановление клеточного состава мезентериальных лимфатических узлов до контрольных значений через 21 день после прекращения введения ЗНЧ размерами 15 нм и 50 нм свидетельствует об отсутствии иммунотоксичности.

3. Сохраняющиеся изменения клеточного состава мезентериальных лимфатических узлов после прекращения введения ЗНЧ размерами 1-3 нм в течение 30 дней указывают на их умеренную иммунотоксичность.

4. Независимо от длительности введения ЗНЧ размерами 1-3 нм, они не регистрируются ни в одной из зон лимфатических фолликулов. При

5

введении ЗНЧ размерами 15 нм и 50 нм максимальное скопление ЗНЧ

наблюдается в макрофагалыгой системе.

Внедрение результатов работы в практику

Полученные научные данные используются в учебном процессе на кафедрах гистологии, цитологии и эмбриологии, патологической анатомии, гигиены медико-профилактического факультета ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В. И. Разумовского, Минздравсоцразвития России.

Апробация работы

Основные материалы диссертационного исследования доложены и обсуждены на заседаниях Саратовского отделения Всероссийского научно-медицинского общества анатомов, гистологов и эмбриологов (Саратов, 2009; 2010; 2011); III эмбриологическом симпозиуме Всероссийского научно-медицинского общества анатомов, гистологов, эмбриологов «ЮГРА-ЭМБРИО-2011 » (Ханты-Мансийск, 2011); Третьем Международном форуме по нанотехнологиям - 2010 (Москва, 2010); European Network of Excellence for Biophotonics - 2011 (Saratov, 2011); Saratov Fall Meeting - 2011 (Saratov, 2011); Saratov Local Cluster Meeting 2011 (Saratov, 2011).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов работы, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 24 рисунками. Библиография содержит 243 источника (19 отечественных и 224 зарубежных).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование выполнено на кафедре гистологии и базе научно -образовательного центра «Фундаментальная медицина и нанотехнологии» ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В. И. Разумовского Минздравсоцразвития

6

России на 240 здоровых белых беспородных половозрелых крысах-самцах массой 180-220 г. При разработке модели экспериментального исследования в основу было положено «Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (Хабриев Р.У., 2005).

Эксперимент был разделен на 2 серии. Первая серия включала изучение морфофункционального состояния мезентериальных лимфатических узлов при пероральном введении золотых наночастиц размерами 1-3 нм, 15 нм и 50 нм и длительностью введения 8,16 и 30 суток.

Вторая серия была посвящена анализу обратимости выявленных изменений в мезентериальных лимфоузлах при пероральном введении золотых наночастиц. Забор необходимого материала для оценки обратимости изменений в мезентериальных лимфоузлах при пероральном введении золотых наночастиц размерами 1-3 нм, 15 нм и 50 нм в течение 8, 16 и 30 дней осуществляли через 14 суток после окончания введения.

В эксперименте были использованы ЗНЧ размерами 1-3 нм, 15 нм и 50 нм (концентрация золота во всех образцах - 57 мкг/мл), синтезированные в лаборатории нанобиотехнологии ИБФРМ РАН (г. Саратов). Для увеличения биодоступности и биосовместимости наночастицы были конъюгированы с полиэтиленгликолем PEG-SH (Nektar, USA).

Серийные срезы лимфатических узлов толщиной 5-7 мкм окрашивали гематоксилином-эозином; толуидиновым синим, по Виноградову, при pH - 4,8; метиловым зеленым пиронином по Браше. Для подтверждения выявления ЗНЧ использовали гистохимическую реакцию усиления серебром, по Danscher.

Морфометрический анализ гистологических препаратов проводили в различных функциональных зонах лимфатического узла с помощью компьютерного комплекса для контроля размеров микро- и нанометровых структур Image Analyzer. Применяли также стандартный метод подсчета клеточных элементов при увеличении 200,400,900,1350 с использованием специализированной морфометгрической сетки (Автандилов Г.Г., 1972, 1992).

7

Для анализа и биораспределения золотых наночастиц в исследуемых зонах мезентериальных лимфоузлов применяли метод микроскопии темного поля с использованием микроскопа Leica DM 2500 со специальной приставкой, позволяющей осуществлять боковое освещение при 400-кратном увеличении. Обработка полученных изображений в темном поле производилась с использованием морфометрической программы анализа изображений ImageJ.

Для статистической обработки результатов исследования использовали пакет программы «STATISTICA 6.0» (Stat Soft Inc, США). Проверку нормальности распределения значений в выборке проводили с помощью теста Колмогорова-Смирнова. Рассчитывали среднее арифметическое (М); среднюю ошибку среднего арифметического (т); среднеквадратичное отклонение (ст). Показатель достоверности различий (Р) определяли с использованием критериев Стьюдента (t). Анализ корреляционных связей изучаемых параметров осуществляли по Спирмену. В ходе регрессионного анализа изучали линейную регрессию в рамках пакета STADIA.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенные исследования показали, что реакция клеточных элементов мезентериальных лимфатических узлов при введении ЗНЧ носит размерозависимый характер (табл. 1). В группе, получавшей золотые наночастицы размерами 1-3 нм в течение 8 дней, не наблюдали статистически значимой динамики. Введение ЗНЧ размерами 15 нм и 50 нм приводило к существенным изменениям содержания клеточных элементов лимфатических узлов и в большей мере отражалось в паракортикальной зоне, чем в зонах лимфоидных фолликулов и мозговых тяжей.

Таблица 1

Изменение клеточного состава мезентериальных лимфатических узлов при пероральном введении золотых наночастиц различных размеров в течении восьми дней

Исследуемые Зоны лимфатических узлов Размеры ЗНЧ

объекты (количество на площади 6400 мкм2) Контроль 1-3 нм 15 нм 50 нм

Малые лимфоциты Л.Ф 64,2±2,1 62,3±1,6 77,2±1,6* 80,3±2,3*

П.К 60,1±1,2 61,2±1,2 72,4±1,1* 86,2±1,6*..

М.Т 20,2±1,3 18,3±1,0 19,4±0,7 18,1±0,4*

Средние лимфоциты Л.Ф 18,2±0,4 17,5±1,3 ЗЗД±1,2* 35,3±1,4*

П.К 12,1±1,1 13,3±0,9 24,8±1,0* 36,б±0,8*.»

М.Т 10,2±1,7 9,1±0,2 20,6±1,4* 22,3±1,2*

Большие лимфоциты Л.Ф 0 0,5±0,01 13,2±0,1* 12,5±1,3

П.К 0,75±0,1 0,67±0,1 1,8±0,3* 3,3±0,2*..

М.Т 10Д±0,7 9,5±0,1 13,7±0,1 18,9±0,1*..

Л.Ф 2,5±0,3 2,0±0,3 3,8±0,4* 4,2±0,3*

Иммунобласты П.К 0 0 2,6±0,4 2,9±0,1

М.Т 2,3±0,3 2,3±0,2 4,8±0,6* 5,2±1,0*

Л.Ф 0 0 0 0

Плазмоциты П.К 0,7±0,1 0,7±0,2 1,7±0,2 1,7±0,4

М.Т 15,3±0,б 16,2±1,1 38,4±3,4* 40,5±ЗД*

Л.Ф 0 0 0 0

Тучные клетки П.К 0 0 0 0

М.Т 0,3±0,01 0,4±0,07 1,2±0,5* 1,4±0,4*

Л.Ф 0,2±0,01 0,2±0,02 0,8±0,2 1,1±0,5*

Фигуры митоза П.К 0,8±0,16 0,9±0,02 1,7±0,1 1,9±0,1*

М.Т 0,7±0,1 0,9±0,1 1,4±0,3 1,6±0,6*

Примечание:

* - достоверность различий с группой контроля (Р<0,05);

•• - достоверность различий при размерах 15 нм и 50 нм (Р<0,05).

Реакцию на увеличение размеров ЗНЧ со стороны малых лимфоцитов в различных зонах мезентериальных лимфатических узлов отражает рис. 1. На представленных графиках четко прослеживается отсутствие динамики клеточных элементов в зоне лимфоидных фолликулов и мозговых тяжей в ответ на изменение размеров вводимых ЗНЧ с 15 нм до 50 нм, в то время как в

паракортикальной зоне она сохраняется. Указанную тенденцию наблюдали и со стороны средних лимфоцитов.

Рис. 1. Изменения количества малых лимфоцитов при восьмидневном введении ЗНЧ различных размеров.

Наличие в организме ЗНЧ усиливало процесс бластгрансформации лимфоцитов. Если в контрольной группе в паракортикальной зоне лимфатических узлов иммунобласты отсутствовали, то при введении в организм ЗНЧ размером 15 нм их количество увеличивалось до 2,6±0,4, а на фоне введения частиц размером 50 нм - до 2,9±0,1. Плазмоциты в лимфоидных фолликулах не регистрировали ни в контрольной группе животных, ни в группе, получавших перорально ЗНЧ. Тучные клетки как в контроле, так и при введении ЗНЧ, присутствовали только в зоне мозговых тяжей; их количество возрастало прямо пропорционально размерам ЗНЧ. Во всех исследуемых зонах лимфатических узлов по мере увеличения размера вводимых ЗНЧ отмечали

усиление митотической активности, что находило отражение в повышении частоты встречаемости фигур митоза.

Анализ влияния длительности введения ЗНЧ на клеточный состав лимфатических узлов показал отсутствие динамики при перорапьном введении ЗНЧ размером 1-3 нм в течение 8 дней. При изменении длительности введения ЗНЧ размером 1-3 нм до 16 дней регистрировали изменения клеточного состава в паракортикальной зоне; при 30 - дневном введении ЗНЧ изменения наблюдались во всех структурных зонах лимфоузлов. Данное положение иллюстрирует рис. 2.

Длительность перорального введения (су пси)

Рис. 2. Изменение количества малых лимфоцитов при различной длительности перорального введения ЗНЧ размерами 1-3 нм.

Как следует из рисунка, при длительности приема ЗНЧ размерами 1-3 нм в течение 8 дней количество малых лимфоцитов во всех зонах соответствовало контрольным значениям. При увеличении длительности введения ЗНЧ до 16 дней количество малых лимфоцитов в зоне лимфоидных фолликулов и

мозговых тяжей также соответствовало контрольным значениям, в то время как в паракортикальной зоне регистрировали статистически значимое увеличение содержания малых лимфоцитов с 61,1±2,1 до 81,3±2,2 (Р<0,05). При увеличении длительности приема ЗНЧ до 30 дней изменялось в сторону увеличения количество малых лимфоцитов как в паракортикальной зоне, так и в зонах лимфоидных фолликулов и мозговых тяжей.

Аналогичная динамика в ответ на шестнадцатидневное введение ЗНЧ размерами 1-3 нм наблюдалась и со стороны средних лимфоцитов - их количество в паракортикальной зоне возрастало до 21,6±1,4 (12,1±1,1 в контроле, Р<0,05), в то время как в лимфоидных фолликулах и мозговых тяжах оно не превышало контрольных значений. После 16 дней приема ЗНЧ число больших лимфоцитов в паракортикальной зоне возрастало с 0,75±0,1 до 2,2±0,6 (Р<0,05), в то время как в зоне лимфоидных фолликулов и мозговых тяжей оно практически не менялось. Статистически значимые различия в содержании иммунобластов, плазмоцитов и тучных клеток в ответ на введение ЗНЧ размерами 1-3 нм отмечались лишь после 30 дней их приема.

Ответная реакция со стороны клеточных элементов мезентериальных лимфатических узлов в ответ на введение ЗНЧ размером 15 нм длительностью 8, 16 и 30 дней оказалась менее разнообразной. Независимо от исследуемой зоны при 8- и 16- дневном введениях ЗНЧ указанных размеров отмечали увеличение клеточности лимфоузлов, а при 30-дневном - количество клеточных элементов в изучаемых зонах лимфатических узлов было меньшим (табл. 2). Как следует из таблицы, прием ЗНЧ размером 15 нм в течение 16 дней способствовал увеличению количества малых лимфоцитов в паракортикальной зоне до 72,4±1,1 по сравнению с контролем (60,1±1,2, Р<0,05). Пероральное введение ЗНЧ размером 15 нм в течение 30 дней приводило к изменениям сопоставимым с таковыми при 8-дневном кормлении животных. Аналогичную динамику прослеживали в зоне лимфоидных фолликулов.

Таблица 2

Влияние длительности приема ЗНЧ размером 15 нм на изменение клеточного состава в различных зонах мезентериальных лимфатических

узлов

Исследуемые объекты Зона Группа контроля Изменения клеточного состава мезентериальных лимфатических узлов с учетом длительности введения ЗНЧ размером 15 нм

Длительность введения

8 дней 16 дней 30 дней

Малые лимфоциты Л.Ф П.К м.т 64,2±2,1 60,1±1,2 20,2±1,3 77,2±1,6 72,4±1,1 19,4±0,7 88,7±1,2* 79,4±2,0* 32,3 ±0,8* 68,7±1,4*.. 70,6±2,1 24,8±1,9..

Средние лимфоциты Л.Ф П.К M.T 18,2 ±0,4 12,1±1,1 10,2±1,7 33,1±1,2 24,8±1,0 20,6±1,4 36,2±0,7 30,3±2,1* 26,8±1,4* 30,2±0,6.. 20,4±1,6.. 16,8±0,9*..

Большие лимфоциты Л.Ф П.К M.T 0,3±0,01 0,75 ±0,1 10,2±1,7 13,2±0,1 1,8±0,3 13,7±0,1 18,7±0,9* 2,2±0,4 16,7±0,2* 10,4±0,6.. 1,4±0,7 10,8±0,7.»

Иммуно-бласты Л.Ф П.К м.т 2,5±0,3 0 2,3±0,3 3,8±0,4 2,6±0,4 4,8±0,6 4,5±0,6 3,1±0,6 5,3±0,8 3,1±0,6.. 3,0±0,4 4,9±0,5

Плазмоциты Л.Ф П.К м.т 0 0,71 ±0,1 15,3 ±0,6 0 1,7±0,2 38,4±3,4 0 21,8±0,4* 44,4±0,6 0 16,4±0,2.. 33,5±0,6..

Тучные клетки Л.Ф П.К М.Т 0 0 0,3±0,01 0 0 1,2±0,5 0 0 2,7±0,2* 0 0 1,1±0,09

Фигуры митоза Л.Ф П.К М.Т 0,4±0,01 0,8±0,16 0,7±0,1 0,8±0,2 1,7±0,1 2,4±0,3 2,0±0,2* 2,2±0,2* 2,3±0,6 1,0±0,4.. 1,5±0,2 1,2±0,4*,.

Примечание:

* - достоверность различий с длительностью введения ЗНЧ 8 дней (Р<0,05);

♦» - достоверность различий с длительностью введения ЗНЧ 16 дней (Р<0,05).

При введении ЗНЧ размером 15 нм в течение 8 дней число малых лимфоцитов в мозговых тяжах практически не изменялось, тогда как 16-дневное кормление приводило к значимому увеличению содержания этих клеточных элементов (32,3±0,8 и 20,2±1,3 в контроле, Р<0,05) При введении

ЗНЧ в течение 30 дней выявлялось относительное восстановление клеточного состава лимфатических узлов экспериментальных животных, однако изучаемые показатели не достигали контрольных значений. Подобная кинетика клеточных популяций лимфатических узлов может свидетельствовать об адаптационно -приспособительных процессах, развивающихся при длительном (30 - дневном) введении ЗНЧ в организм экспериментальных животных. Реакция иммунобластов на увеличение длительности приема ЗНЧ размером 15 нм оказалась незначительной по сравнению с показателем 16- дневного введения, однако вдвое превышала контрольную численность(4,9±0,5 и 2,3±0,3 в контроле, Р<0,05).

Реакция мезентериальных лимфатических узлов в ответ на увеличение длительности приема ЗНЧ размером 50 нм носила в целом однонаправленный характер и характеризовалась снижением числа клеточных элементов при длительности введения ЗНЧ более 16 дней. Наглядно данное положение иллюстрирует рис. 3

8 16 Длительность пероредного

введения ЗНЧ (сутки)

Рис. 3. Изменение количества малых лимфоцитов при различной длительности перорального введения ЗНЧ размером 50 нм.

Как следует из рисунка, количество малых лимфоцитов во всех структурных зонах лимфоузлов после 8- дневного введения ЗНЧ размером 50 нм превышало контрольные значения. При увеличении длительности введения ЗНЧ до 16 дней изменение количества малых лимфоцитов было незначительным по сравнению с показателями 8- дневного кормления, но достоверно отличалось от исходного (контрольного) уровня. Дальнейшее увеличение длительности введения ЗНЧ с 16 до 30 дней приводило к существенному снижению количества малых лимфоцитов во всех зонах мезентериальных лимфатических узлов. Аналогичная картина наблюдалась при использовании ЗНЧ размером 15нм.

Представленные выше данные свидетельствуют о выраженном иммуномодулирующем влиянии ЗНЧ на организм животных, зависящем от размеров вводимых ЗНЧ, длительности введения и органной специфичности. В ходе экспериментального исследования выявлена определенная временная динамика развития клеточных реакций.

С другой стороны, известно, что иммунная система способна как к быстрому реагированию на изменение гомеостаза, так и обладает значительными резервами к самовосстановлению. Временной интервал, в течение которого восстанавливаются нарушенные функции, следует рассматривать как важный показатель для характеристики безопасности исследуемого вещества. Если через 3 недели у животных не произошло восстановления исходных показателей иммунной системы, то исследуемое вещество следует отнести к иммунотоксичным соединениям [Мастернак Т. Б., 1998; Хабриев Р.У., 2005; НиББат Ы., 1998]. Результаты исследования показали, что морфофункциональное состояние лимфатических узлов через 14 дней после окончания введения ЗНЧ размерами 1-3 нм в течение 8 дней во всех исследуемых зонах соответствовало контрольным значениям.

После окончания введения ЗНЧ размером 15 нм в течение 8 дней клеточный состав лимфатических узлов в большинстве случаев также соответствовал контрольным значениям. В то же время количество больших

15

лимфоцитов и иммунобластов после прекращения приема ЗНЧ размером 15 нм снижалось менее значимо и не достигало контрольных значений (рис. 4).

■Зона лимфатических фолликул

-Паракортикальная зона

3 6

1. Малые лимфоциты

2. Средние лимфоциты

3. Большие лимфоциты

4. Иммунобласты

5. Плазмоциты

6. Тучные клетки

7. Фигуры митоза О - контрольные значения

По радиальным осям указаны отклонения от контрольных значений (%)

Рис. 4. Отклонение клеточного состава мезентериальных лимфатических узлов от контрольных значений на 14-й день после окончания введения ЗНЧ размером 15 нм в течение 8 дней.

-Зона мозговых тяжей

Таким образом, через 14 дней после окончания введения ЗНЧ размером 15 нм в течение 8 дней в связи с неполным восстановлением исходного

состояния иммунной системы по двум показателям нельзя говорить об отсутствии иммунотоксичности ЗНЧ указанных размеров.

В связи с указанным полученные результаты снижения количества больших лимфоцитов и иммунобластов с помощью регрессионного анализа были пролонгированы на отдаленный период (табл. 3).

Таблица 3

Результаты регрессионного анализа скорости восстановления клеточных элементов лимфатических узлов после прекращения введения ЗНЧ размером 15 нм длительностью 8 дней

Исследуемые объекты (количество на площади 6400 мкм2) Зоны лимфатических узлов Результаты регрессионного анализа

Коэффициенты линейной регрессии Прогнозируемые сроки достижения контрольных значений

Большие лимфоциты Л.Ф П.К м.т 8,5 0,05 0,14 18 20 16

Л.Ф 0,04 20

Иммунобласты П.К 0,08 16

м.т 0,12 18

Как следует из таблицы, по результатам регрессионного анализа достижение большими лимфоцитами контрольных значений после прекращения введения ЗНЧ размером 15 нм в течение 8 дней в зоне лимфатических узлов прогнозируется к 18-му дню наблюдения, в паракортикальной зоне - к 20-му дню и в зоне мозговых тяжей - через 16 дней. По результатам регрессионного анализа, контрольные значения иммунобластов в зоне лимфатических фолликул будут наблюдаться через 20 дней, в паракортикальной зоне - через 18 дней и в зоне мозговых тяжей - через 15 дней.

Таким образом, длительность восстановления исходных показателей клеточного состава лимфатических узлов не превышает 21 дня', в связи с чем можно сделать заключение, что в целом ЗНЧ размером 15 нм при длительности введения 8 дней являются йммунонетоксичными.

Анализируя возможность обратимости реакции со стороны клеточных элементов лимфатических узлов после прекращения введения ЗНЧ размером 50 нм в течение 8 дней, можно отметить, что на 14-й день наблюдения их численные показатели в большинстве случаев не соответствовали контрольным значениям.

При этом максимальное отклонение (84,2%) от контроля в зоне лимфоидных фолликулов наблюдали со стороны фигур митоза, в паракортикальной зоне - со стороны больших лимфоцитов (80,0%) и в зоне мозговых тяжей - со стороны тучных клеток (89%). Однако по результатам регрессионного анализа было установлено, что прогнозируемые сроки достижения клеточными элементами контрольных значений укладываются в 21 день.

В ходе выполнения работы было изучено влияние длительности введения ЗНЧ различных размеров на скорость восстановления исходных значений клеточных элементов мезентериальных лимфатических узлов после окончания кормления экспериментальных животных.

Наглядно различия в количественном составе клеточных элементов лимфатических узлов после прекращения введения ЗНЧ размерами 1-3 нм длительностью 8, 16 и 30 дней иллюстрирует рис. 5. На рисунке не отмечается отклонений состава клеточных элементов в зоне лимфатических фолликул от контрольных значений при длительности введения ЗНЧ размерами 1-3 нм при длительности введения 8 и 16 дней после его прекращения. В то же время в группе животных, длительность введения ЗНЧ у которых составила 30 дней, в зоне лимфатических фолликул после прекращения введения ЗНЧ наблюдались существенные отклонения от нормы.

По результатам регрессионного анализа было установлено, что прогнозируемые сроки достижения клеточными элементами контрольных значений в 61,9% случаев не укладываются в 21 день.

-Длительность введения 8 дней

-Длительность введения 16 дней

Длительность введения 30 дней

1

1. Малые лимфоциты

2. Средние лимфоциты

3. Большие лимфоциты

4. Иммунобласш

5. Плазмошгты

6. Тучные клетки

7. Фигуры митоза

(^У - контрольные значения По радиальным осям указаны отклонения от контрольных значений (%).

Рис. 5. Различия в клеточном составе мезентериальных лимфатических узлов после прекращения введения ЗНЧ размерами 1-3 нм длительностью 8,16 и 30 дней в зоне лимфатических фолликулов.

Таким образом, по результатам исследования клеточного состава мезентериальных лимфатических узлов на 14-й день после окончания введения

19

ЗНЧ размерами 1-3 нм в течение 30 дней и регрессионного анализа их нельзя отнести к иммунонетоксичным.

Увеличение длительности введения ЗНЧ размером 15 нм практически не оказывало влияние на состав клеточных элементов мезентериальных лимфатических узлов через 14 дней после его окончания. Количество малых, средних и больших лимфоцитов при длительности приема ЗНЧ 8, 16 и 30 дней было сопоставимо с контрольными значениями во всех исследуемых зонах. Количество иммунобластов через 14 дней после окончания введения ЗНЧ во всех зонах лимфатических узлов превышало контрольные значения на 45-70%. Наиболее заметными оказались изменения в паракортикальной зоне. Однако по данным регрессионного анализа, снижение их количества прогнозировалось в среднем через 16,7±2,4 дня, что указывает на отсутствие иммунотоксичности.

Длительное введение (30 дней) ЗНЧ размером 50 нм в отдаленные сроки наблюдения не вызывало существенных изменений клеточного состава лимфоузлов экспериментальных животных. Количество малых лимфоцитов в зоне лимфоидных фолликулов после окончания введения ЗНЧ размером 50 нм в течение 8 дней составило 72,6±1,8; 16 дней - 78,6±2,2; 30 дней - 69,4±2,6; что приближалось к контрольным значениям. По результатам регрессионного анализа в целом клеточный состав мезентериальных лимфатических узлов восстанавливается в сроки менее 21 дня, что позволяет сделать вывод, что ЗНЧ размером 50 нм, независимо от длительности их введения, не обладают иммунотоксичностью.

Анализ биораспределения ЗНЧ в различных зонах лимфатических узлов может косвенно свидетельствовать о последовательности развертывания иммунологического ответа на введение ЗНЧ. Проведенные исследования показали, что при 8, 16 и 30- дневном пероральном введении ЗНЧ размерами 1-3 нм ни в одной из зон лимфатических узлов они не регистрируются. Можно предположить, что полученные результаты обусловлены низкой чувствительностью используемого метода для выявления частиц золота указанных размеров. В группе животных, получавших ЗНЧ размерами 15 нм и

20

50 нм, они регистрировались во всех зонах лимфатических узлов, а наибольшее их количество обнаруживали в мозговых синусах.

Более детальный анализ полученных результатов позволил выявить среди клеток иодкапсульного синуса большое количество фагоцитирующих макрофагов, содержащих ЗНЧ. Можно предположить, что усиленный фагоцитоз ЗНЧ макрофагами является пусковым механизмом иммунного ответа организма на введение ЗНЧ.

ВЫВОДЫ

1. Перорапьное введение золотых наночастиц приводит к изменениям клеточного состава мезентериальных лимфатических узлов, выраженность которого и обратимость реакции определяются размерами и длительностью введения ЗНЧ.

2. Изменения клеточного состава мезентериальных лимфатических узлов при размерах золотых наночастиц 1-3 нм наблюдаются только после 16-дневного введения в паракортикальной зоне мезентериальных лимфатических узлов. При 30- дневном введении частиц золота указанных размеров изменения клеточных элементов наблюдаются также в зоне лимфатических фолликулов и мозговых тяжей, что находит отражение в увеличении содержания малых, средних и больших лимфоцитов, в количестве иммунобластов и фигур митоза.

3. Введение животным золотых наночастиц размерами 15 и 50 нм приводит к изменению клеточного состава лимфоузлов уже после 8 суток экспериментального исследования; почти вдвое увеличивается количество средних и больших лимфоцитов в мозговых тяжах; растет содержание плазмоцитов, в подкапсульной зоне появляются тучные клетки с признаками дегрануляции. Кормление животных в течение 16 дней сопровождается аналогичными изменениями, указывающими на повышение пролиферативной активности лимфоцитов, усиление

21

процессов бластгрансформации и дифференцировки. При увеличении длительности введения до 30 дней наблюдается снижение содержания клеточных элементов в лимфатических узлах экспериментальных животных, но они не достигают исходного уровня.

4. Через 14 дней после прекращения введения ЗНЧ размерами 1-3 нм длительностью 8 и 16 дней количество малых и средних лимфоцитов, плазмоцитов, тучных клеток и фигур митоза соответствует исходным значениям; количество больших лимфоцитов и иммунобластов, по данным регрессионного анализа, достигает контрольных значений через 16-18 дней, что указывает на отсутствие иммунотоксичности. Отклонение некоторых элементов клеточного состава мезентериальных лимфатических узлов после прекращения введения ЗНЧ размерами 1-3 нм в течение 30 дней свидетельствует об умеренной иммунотоксичности.

5. Использование в экспериментальном исследовании ЗНЧ размерами 15 и 50 нм независимо от длительности перорального введения показало отсутствие иммунотоксичности - уже к 21-м суткам после окончания экспериментального кормления животных клеточный состав мезентериальных лимфатических узлов полностью восстанавливается.

6. Анализ биораспределения золотых наночастиц в структурных зонах лимфатических узлов экспериментальных животных методом темнопольной микроскопии и автометаллографии показал, что независимо от длительности введения, золотые наночастицы размерами 1-3 нм не регистрируются доступными методами ни в одной из зон лимфатических узлов. ЗНЧ размерами 15 и 50 нм выявляли в виде конъюгатов в цитоплазме макрофагов и лимфоцитов преимущественно в мантийной зоне лимфоидных фолликулов и мозговых тяжах. Внеклеточные скопления ЗНЧ обнаруживали в мозговых синусах.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Результаты приведенной работы значительно дополняют современные представления о цитотоксичности, иммуногенности и биосовместимости ЗНЧ.

2. Полученные при исследовании данные о влиянии и длительности введения ЗНЧ разных размеров на показатели иммунитета могут быть использованы для разработки методов безопасного применения коллоидного золота в практической медицине.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кинетика клеточных популяций мезентериальных лимфатических узлов при длительном воздействии наночастиц золота в эксперименте / О.В. Злобина, С.С. Фирсова, А. Б. Бучарская, Б. Н. Хлебцов // Материалы третьего Международного форума по нанотехнологиям. - 2010. -www.rusnanoforum.ru.

2. Морфологические изменения органов кроветворения и состояние периферической крови при длительном воздействии наночастиц золота /С.С. Фирсова, О.В. Злобина, А. Б. Бучарская, Б. Н. Хлебцов // Материалы третьего Международного форума по нанотехнологиям 2010. -www.rusnanoforum.ru.

3. Изменение морфологических показателей костного мозга и периферической крови при длительном воздействии золотых наночастиц / С.С. Фирсова, А.Б. Бучарская, Г.Н. Маслякова, О.В. Злобина // Известия СГУ. Новая серия. Сер.: Физика. - 2011.- №2, т. 11. - С. 54-57.

4. Кинетика клеточных популяций мезентериальных лимфатических узлов при длительном воздействии наночастиц золота в эксперименте/ О.В. Злобина, И. О. Бугаева, С. С. Фирсова, Г. Н. Маслякова // Саратовский научно-медицинский журнал. - 2011. - №2, т. 7. - С. 353-357.

5. Морфологические изменения в лимфатических узлах при воздействии наночастиц золота / О.В. Злобина, С.С. Фирсова, А.Б. Бучарская, А. Н. Коробейникова // Молодые ученые - здравоохранению: Материалы 72-й межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием. - Саратов, 2011. - С.283.

6. Морфологические изменения в мазке костного мозга при воздействии наночастиц золота / С.С. Фирсова, О.В. Злобина, А.Б. Бучарская, Б. Н. Хлебцов // Молодые ученые - здравоохранению: Материалы 72-й межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием. - Саратов, 2011. - С.293.

7. Изменения показателей периферической крови при длительном воздействии наночастиц золота / С.С. Фирсова, О.В. Злобина, А.Б. Бучарская, И. А. Дорошенко // Молодые ученые - здравоохранению: Материалы 72-й межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием. - Саратов, 2011. - С.293 - 294.

8. Морфометрические методы оценки клеточных популяций мезентериальных лимфатических узлов под влиянием золотых наночастиц в эксперименте / О.В. Злобина, И.О. Бугаева, С.С. Фирсова, А. Б. Бучарская // Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты: Материалы IV Всероссийской научно-практической конференции. - М.,2011. - С.34-36.

9. Морфофункциональное состояние белой пульпы селезенки при пероральном введении наночастиц золота в эксперименте / О.В. Злобина, С.С. Фирсова, А. Б. Бучарская, И. О. Бугаева // Морфология. - 2011. - №5, т. 140.-С. 88.

10. Морфофункциональное состояние мезентериальных лимфатических узлов при воздействии золотых наночастиц в эксперименте / О.В. Злобина, И.О. Бугаева, С. С. Пахомий, Г. Н. Маслякова // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. - 2012. -№1, т. 15. - С. 3-10.

Подписано в печать 21.02.2012. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Roman. Печать RISO. Объем 1,0 печ. л. Тираж 100 экз. Заказ № 119.

Отпечатано с готового оригинал-макета Центр полиграфических и копировальных услуг Предприниматель Серман Ю.Б. Свидетельство № 3117 410600, Саратов, ул. Московская, д.152, офис 19, тел. 26-18-19, 51-16-28