Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Морфофункциональная характеристика периферического звена эритрона больных гемофилией

НА ПРАВАХ РУКОПИСИ

ЯСТРУБИНЕЦКАЯ Ольга Иосифовна

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПЕРИФЕРИЧЕСКОГО ЗВЕНА ЭРИТРОНА БОЛЬНЫХ ГЕМОФИЛИЕЙ

14.00.29 - Гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

□□3451652

Москва, 2008

003451652

Работа выполнена в Государственном учревденш

Гематологический научный центр Российской академии медицинских наук Научные руководители:

Доктор медицинских наук, профессор, действительный член РАТН Плющ Ольга Павловна Доктор медицинских наук Сарычева Тереза Георгиевна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Ковалева Лидия Григорьевна Доктор медицинских наук, профессор Чернов Вениамин Михайлович

Ведущее учреждение:

ФГУ «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Росмедтехнологий»

На заседании диссертационного Совета Д 001.42.01. в Гематологическом научном центре РАМН по адресу: 125167, г. Москва, Новый Зыковский проезд, д. 4А

2008 г. в

часов.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ГУ ГНЦ РАМН

Автореферат разослан «_»_2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета, к.м.н._

Е.Е. Зыбунова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Гемофилия - наследственный геморрагический диатез, обусловленный дефицитом или молекулярной аномалией факторов свертывания VIII или IX, при котором больные нуждаются в заместительной терапии на протяжении всей своей жизни (Андреев Ю.Н., 2006, - с. 5-10; Баркаган З.С., 1980-с. 336; Ch. A.Owen, 2001, -p. 119).

За рубежом в течение последних 10-15 лет основным методом лечения гемофилии является заместительная гемостатическая терапия препаратами концентратов дефицитных факторов VIII и IX в домашних условиях (Berntorp Е„ 1995; Szucs T.D., Offner A., Giangrande Р. et al, 1998; Hoots W.K., 2001; Плющ О.П. и соавторы, 2002). Данный метод терапии позволил уменьшить частоту и длительность обострений, а также увеличил продолжительность и улучшил качество жизни. В настоящее время во многих странах мира и в Российской Федерации разработаны и внедрены в клиническую практику Национальные протоколы по лечению больных гемофилией, основанные на профилактическом применении концентратов факторов свертывания VIII и IX. (Плющ О.П., Воробьев А.И. и соавт. Протокол ведения больных «Гемофилия», 2006) На этом фоне количество обострений в виде спонтанных гемартрозов и гематом значительно уменьшилось.

В последнее время на первый у больных план выходят такие осложнения, как массивные желудочно-кишечные кровотечения, кровотечения во время оперативных вмешательств, посттравматические гематомы и гематурии.

Обращает на себя внимание тот факт, что развивающаяся вследствие кровопотери анемия, даже значительная, не требует заместительной терапии компонентами крови.

Работ, посвященных исследованию системы эритрона у больных гемофилией практически нет. Основными причинами, побудившими нас к выполнению данных исследований, является повышенная резистентность

больных к развитию анемии после кровопотери, более легкая ее переносимость и восстановление нормальных показателей крови.

Цель исследования: проанализировать и оценить морфофункциональное состояния периферического звена эритрона у больных гемофилией в группах с обострением и без обострения геморрагического синдрома при наличии или отсутствии анемии для характеристики эритропоэза у этих больных.

Задачи исследования:

- Изучить эритроцитарную формулу для характеристики эффективности эритропоэза у больных гемофилией.

- Исследовать морфологию эритроцитов крови с помощью компьютерной морфометрии и сканирующей электронной микроскопии у больных гемофилией.

- Дать характеристику количественного и качественного состава ретикулоцитов периферической крови у больных гемофилией.

- Оценить функциональное состояние мембраны эритроцитов методом цитоэлектрофореза у больных гемофилией.

- Выявить закономерность корреляционной зависимости между показателями периферического звена эритрона у больных гемофилией (СОЭ, ЭФПэ, МСУ, количество эритроцитов).

Положения, выносимые на защиту:

1. Гемофилия характеризуется морфофункциональными изменениями эритроцитарных индексов и формулы эритроцитов, а также показателей цитометрии эритроцитов, параметров ретикулоцитометрии и электрофоретической подвижности эритроцитов периферического звена эритрона

2. Компенсаторные реакции системы эритрона не допускают развития тяжелой формы анемии у больных гемофилией.

3. У больных гемофилией существует определенная корреляционная зависимость .между отдельными показателями периферического звена эритрона.

Научная новизна работы.

С целью определения адаптационных возможностей эритрона у больных гемофилией в первый раз было изучено его периферическое звено.

Оценен поверхностный заряд клетки методом цитоэлектрофореза с определением морфологической формулы эритроцитов на основании компьютерного анализа их изображения.

У больных гемофилией, вне зависимости от наличия или отсутствия у них анемии на момент исследования, выявлены косвенные признаки повышенной регенераторной способности костного мозга, выражающиеся в виде высокого ретикулоцитоза с левым сдвигом ретикулоцитарного ряда (появления клеток I и II класса по Гельмейру), а также подтверждающиеся изменением эритроцитарной формулы и морфологии эритроцитов.

Теоретическое и практическое значение исследования:

Результаты настоящего исследования способствуют углублению знаний о состоянии периферического звена эритрона у больных гемофилией. Сведения о морфофункциональных особенностях эритроцитов при гемофилии представляются важными, поскольку дают ценную информацию о структурных изменениях клеток в условиях хронической и острой кровопотери или вне обострения геморрагического синдрома. Полученные данные могут в дальнейшем играть существенную роль в изучении адаптационных возможностей эритрона и необходимости проведения трансфузий эритроцитосодержащих компонентов крови при развитии анемии.

Апробация работы состоялась на заседании проблемной комиссии «Патология гемостаза» ГУ ГНЦ РАМН 21 мая 2008 года.

Внедрение в практику.

Основные положения диссертационной работы внедрены в работу Диспансерного научно-методического отделения по гемофилии и отделения реконструктивно-восстановительной ортопедии для больных гемофилией Гематологического Научного Центра РАМН. Данная работа имеет прогностическое значение в плане ведения анемии и коррекции ее течения трансфузиями эритроцитосодержащимх компонентов крови.

Ключевые тезисы работы внедрены в работу лаборатории гемоцитологии Гематологического Научного Центра РАМН для дальнейшего изучения периферического звена эритрона в тематике отделения.

Публикации: по материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 5 в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Основной текст диссертации изложен на 144 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (глава 1), методического раздела (глава 2), изложения результатов собственных исследований (глава 3, разделенная на четыре подглавы), заключения, выводов и указателя литературы, занимающего 16 страниц и содержащего 111 отечественных и 58 зарубежных работ.

Диссертация иллюстрирована 32 таблицами и 34 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований. Представленные в работе исследования выполнены в 2005-2008 гг. в Гематологическом научном центре РАМН (директор - академик РАН и РАМН Воробьев А.И.).

Клинический раздел работы осуществлен в Диспансерном научно-методическом отделении по гемофилии (руководитель отделения - профессор, д.м.н. Плющ О.П.).

Лабораторный раздел работы выполнен в лаборатории гемоцитологии (заведующий лабораторией - профессор, д.м.н. Погорелов В.М.; научный консультант лаборатории - заслуженный деятель науки Российской Федерации, профессор, д.м.н. Козинец Г.И.).

В работе представлены исследования 47 больных с тяжелой формой гемофилии А или В (фактор УШ/1Х < 1), находившихся на обследовании и лечении в обозначенный период и 10 здоровых людей, составивших контрольную группу.

Возраст пациентов колебался от 18 до 59 лет и, в среднем, составил 35,2±1,3 года. Всего было обследовано 47 пациентов, из которых 39 - с гемофилией А, 4 - с гемофилией В и 4 - с гемофилией, осложненной наличием ингибитора.

Пациенты подразделялись на 2 группы в зависимости от наличия или отсутствия геморрагического синдрома на момент обследования.

Пациенты в группе с обострением геморрагического синдрома составили 2 подгруппы: без анемии (уровень гемоглобина выше 121 г/л) и с анемией (уровень гемоглобина ниже 120 г/л), (таб. 1)

Таблица 1. Распределение больных гемофилией по группам согласно наличию обострения

Группа с обострением Группа без обострения

Тип гемофилии геморрагического синдрома геморрагического

Без анемии С анемией синдрома

Гемофилия А 9 11 19

Гемофилия В 1 1 2

Ингибиториая т. 1

гемофилия

Всего 13 12 22

25

Общее количество обострений составило 25 эпизодов. У 6 пациентов геморрагический синдром проявлялся желудочно-кишечными кровотечениями, у 9 - гемартрозами крупных суставов, у 2 - кровотечением из ран, у 2 -десневым кровотечением, у 3 - гематомами мягких тканей различной локализации и у 3 - послеоперационной кровопотерей.

Было исследовано 1197 образцов периферической крови, из них 210 - от здоровых людей и 987 - от больных гемофилией. В группе пациентов с обострением геморрагического синдрома - 525 образца (без анемии - 252, с анемией - 273). В группе без обострения геморрагического синдрома - 462 образца.

В комплекс лабораторных исследований были включены следующие методы:

- коагулограмма с количественным определением уровня факторов VIII или IX (унифицированная методика одностадийного клоттинг-теста) и выявление ингибитора (метод Kasper);

- гемограмма;

- биохимический анализ крови;

- вирусологическое обследование;

По необходимости, с учетом состояния пациента, выполнялись: ультразвуковое, эндоскопическое и рентгенологическое исследования; проводились консультации специалистов: ортопеда, хирурга, стоматолога, невропатолога, проктолога, психотерапевта, кардиолога.

Специфические методы изучения периферического звена эритрона включали в себя:

- Определение эритроцитарных индексов для оценки клеточного состава периферической крови на счетчике клеток периферической крови AVL MICROS ОТ 16 (АВХ Diagnostics, Австрия);

- Компьютерную морфометрию эритроцитов периферической крови для определения содержания гемоглобина в каждом эритроците, построения гистограммы распределения эритроцитов по содержанию гемоглобина, геометрических параметров эритроцитов и их статистических характеристик, «формулы» эритроцитов (процентное содержание клеток разных типов);

- Ретикулоцитометрию для определения активности эритрона и его способности к регенерации и «формулы» ретикулоцитов (процентное содержание клеток разных классов);

- Растровую электронную микроскопию для получения изображения поверхностной архитектоники мембраны эритроцитов периферической крови.

- Метод цитоэлектрофореза в постоянном поле с определением электрофоретической подвижности эритроцитов для оценки функционального состояния мембраны клетки.

Собственные результаты

Характеристика периферического звена эритрона у пациентов с обострением геморрагического синдрома (без анемии)

При изучении эритроцитарных индексов были получены достоверные статистические различия показателей гематокрита, МСУ (средний объём эритроцита), МСНС (средняя концентрация гемоглобина в эритроците) по сравнению с контрольной группой, (таб. 2)

Выявлены признаки ускоренного и неэффективного эритропоэза, проявившегося пойкилоцитозом и анизоцитозом при нормальном количестве эритроцитов и уровне гемоглобина.

Таблица 2. Сравнительная характеристика эритроцитарных индексов

М±ш НЬ, г/л Эр, 1012/л т, л/л МСУ, фл МСН, пг МСНС, г/л

пациенты 146,013,6 5,0±0Д2 44,2±1,0 88,6±1,2 29,2±0,12 331,7±6,8

контроль 141,6±4,7 4,68±0,07 39,64±1,1 84,8±1,6 30,21±0,8 356,3±2,7

достоверная разница 0,2<р<0,1 р<0,5 р<0,05 р<0,05 0,5<р<0,2 р<0,05

Компьютерная морфометрня эритроцитов показала наличие достоверных статистических различий показателей формулы эритроцитов, таких как эхиноциты и сфероциты, и показателя анизохромии по сравнению с группой контроля, (таб. 3, А и Б)

Было подтверждено наличие ускоренного эритропоэза, проявившегося изменением формулы эритроцитов в виде статистически достоверного увеличения эхиноцитов, сфероцитов и умеренного изменения остальных переходных форм клеток при нормальном количестве дискоцитов.

Таблица 3. Сравнительная характеристика данных компьютерной морфометрии

\Iirn Формула эритроцитов,%

днскоциты эхиноциты дакриоциты кодоциты элептоциты дегмациты сфсроцнты прочие формы

пациенты 81,4±б,2 0,58±0,25 0,3±0,15 1,1±1,0 0,25±0,3 0,43±0,35 12,7±6,2 2,4±0,7

контроль 83,17±4,6 0,0 0,1 ±0,02 0,15±0,09 0,2±0,04 0,1±0,0 15,27±4,4 1,22±0,2

достоверная разница 0,5<р<0,2 р<0,05 р<0,5 0,5<р<0,2 р<0,5 р<0,5 р<0,05 0,5<р<0,2

А. - показатели формулы эритроцитов

М±т эритроцитомстрия морфометрии

средний диаметр эритроцита показатель овалоцитоза показатель пойкилоцнтоза показатель анизоцитоза показатель анизохромии

пациенты 7,3±0,09 0,9±0,005 18,2±6Д б,7±0,4 20,7±1,5

контроль 7,18±0,03 0,88±0,01 1б,6±4,3 5,8±0,1 17,0±0,5

достоверная разница р<0,5 р<0,5 0,5<р<0,2 0,5<р<0,2 р<0,05

Б. - показатели морфометрии

Реги кулоцнто мвгрия в группе пациентов с обострением геморрагического синдрома (без анемии) выявила достоверное увеличение как общего количества ретикулоштов, так и увеличение в каждом ряду дифференцирован по сравнению с контрольной группой, (рис. 1)

Итак, в исследуемой группе отмечаются косвенные признаки повышенной регенераторной способности костного мозга, что является доказательством наличия у больных с тяжелой формой гемофилии ускоренного эритропоэза, проявившегося решкулоцитозом до 24,6%о в присутствии молодых форм клеток (ретихулоцитов I и II класса) в периферической крови и левого сдвига формулы.

О

per. J per. II per. Ill per. IV ргт. всего Шбольные контроль

Рисунок 1. Сравнительная характеристика параметров решкулоцитометрии

При исследовании электрофоретической подвижности эритроцитов периферической крови у больных тяжелой формой гемофилии обнаружено умеренное снижение показателя до 0,98 мкм^см^В'^с"1 имевшее по сравнению с группой контроля отличие 0,5<р<0,2. Исследуемая и контрольная группы являются сравнимыми, (рис. 2)

Рисунок 2. Сравнительная характеристика параметров электрофоре™ ческой подвижности эритроцитов.

Характеристика периферического звена эритрона у пациентов с обострением геморрагического синдрома (с анемией)

Пациенты с обострением геморрагического синдрома (с анемией) получали терапию концентратами дефицитных факторов свертывания крови в адекватных дозах, согласно протоколу лечения больных «Гемофилия» (Плющ О.П.: Воробьев А.И. и соавт., 2006).

По сравнению с пациентами, не имеющими патологии гемостаза, постгеморрагическая анемия у больных тяжелой формой гемофилии клинически протекала гораздо легче. Отмечались физическая активность, малая интенсивность одышки или ее отсутствие, а также относительная «мягкость» остальных симптомов анемического синдрома. Отслеживалась динамика показателей уровня гемоглобина и сывороточного железа с выявлением восстановления данных показателей до нормальных цифр у пациентов с острой кровопотерей.

Необходимости в проведении трансфузий компонентов крови, содержащих эритроциты, не было. Восстановление нормальных показателей

уровня гемоглобина и эритроцитов проход и ло самостоятельно вследствие включения естественных механизмов системы эритрона. Как проиллюстрировано на рисунке 3, при изучении динамики показателей уровня гемоглобина выявлено постепенное их повышение к 5-15 дню исследования.

При изучении показателей уровня сывороточного железа определялось постепенное их повышение ко 2-1 дню исследования, (рис. 4)

дни обследования

Рисунок 3. Динамика средних показателей гемоглобина у пациентов с острой кровопотерей

Рисунок 4. Динамика уровня сывороточного железа у пациентов с острой кровопотерей

При изучении эрнтроцитарных индексов в группе пациентов с обострением геморрагического синдрома (с анемией) были получены достоверные статистические различия показателей гемоглобина, количества эритроцитов, гематокрита, МСУ (средний объём эритроцита), МСН (среднее содержание гемоглобина в эритроците), МСНС (средняя концентрация гемоглобина в эритроците) по сравнению с контролем, (таб. 4)

Таким образом, в группе выявлены признаки ускоренного и неэффективного эритропоэза, проявившегося пойкилоцитозом, анизоцитозом и анизохромией при повышенном количестве эритроцитов и уровне гемоглобина.

Таблица 4. Сравнительная характеристика эритроцитарных индексов

М±т НЬ, г/л Эр, 10,2/л т, л/л МСУ, фл МСН, пг МСНС, г/л

пациенты 78,2±6,2 3,37±0,3 23,9±2,1 73,7±3,5 23,9±1,6 299,8±5,8

контроль 141,6±4,7 4,68±0,07 39,64±1,1 84,8±1,б 30,21±0,8 35б,3±2,7

достоверная разница р<0,05 р<0,05 р<0,05 р<0,05 р<0,05 р<0,05

При анализе данных компьютерной морфометрии эритроцитов

выявлено наличие достоверных статистических различий показателей формулы эритроцитов (дискоциты, эхиноциты, сфероциты и прочие формы эритроцитов), а также показателей пойкилоцитоза и анизохромии по сравнению с контрольной группой, (таб. 5, А и Б)

Полученные данные подтвердили наличие ускоренного эритропоэза, проявившегося изменением формулы эритроцитов в виде статистически достоверного увеличения эхиноцитов, сфероцитов и прочих форм эритроцитов и умеренного изменения остальных переходных форм клеток при повышенном количестве дискоцитов.

Таблица 5. Сравнительная характеристика данных компьютерной морфометрии

М±ш Формула эритроцитов,%

дискоциты эхиноциты дакрпоциты кодоциты элентоциты дегмациты сфероциты прочие формы

пациенты 89,7±6,2 1,3±0,8 0,0 1,3±0,82 0,7±0,45 0,73±0,5 3,38±1,4 3,64:1,3

контроль 83,17±4,6 0,0 0,1 ±0,02 0Д5±0,09 0,2±0,04 0,1±0,0 15,27±4,4 1,22±0,2

достоверная разница р<0,05 р<0,05 р<0,05 0,5<р<0,2 0,5<р<0,2 0,5<р<0,2 р<0,05 р<0,05

А. — показатели формулы эритроцитов

М±ш эрптроцитометрия морфометрия

средний диаметр эритроцита показатель овалоцитоза показатель пойкнлощтгоза показатель аиизоцитоза показатель аиизохромии

пациенты 6,9±0,2 0,9±0,02 10,3±2,3 7,7±1,3 24,0±5,7

контроль 7,18±0,03 0,88±0,01 16,6±4,3 5,8±0,1 17,0±0,5

достоверная разница р<0,5 р<(),5 р<0,05 0,2<р<0,1 р<0,05

Б. - показатели морфометрии

Ретн кулоцито метрия у пациентов с обострением геморрагического синдрома {с анемией) выявила достоверное увеличение как общего количества рети кулоцито в, так и их увеличение в каждом ряду ди фферен диров ки клеток но сравнению с контрольной группой, (рис. 5)

В исследуемой группе отмечались косвенные признаки повышенной регенераторной способности костного мозга, что также является доказательством наличия у больных с тяжелой формой гемофилии ускоренного эритропозза, проявившегося ретикулоцитозом до 28,Й%0 в присутствии молодых форм клеток (ретикулоцитов I и II групп) в периферической крови и левого сдвига формулы.

30 25 20 15 10 5 0

| # в I

рет.

рет. II

I больные

рет. III

рет. IV рет. всего

КОНТрОЛЬ

Рисунок 5. Сравнительная характеристика параметров решкулоцитометрии

При исследовании э л ектр оф о р ети ч е с кой подвижности эритроцитов периферической крови выявлено умеренное снижение показателя до 1,04 мкмхсмхЕГхс"1, имевшее достоверное отличие от группы контроля (1,22±0,01 мкмхсмхВ"' хс'1, р<0,05),

Офомную роль в обеспечении стабильности электрического заряда клеток крови и их правильном функционировании играет состояние плазматических мембран. Известно, что на величину отрицательного

электрического заряда клетки влияют такие факторы, как соотношения в крови показателей альбумины/глобулины; взаимодействие клетки с: метаболитами, вирусами и Микроорганизмами, антителами и антигенами; трансфузионная терапия; гипоксия; воспалительные процессы в организме. Все эти процессы происходят по схеме адсорбция-десорбция и уменьшают величину отрицательного заряда клетки.

У больных гемофилией снижение заряда поверхностной мембраны эритроцитов можно объяснить адсорбцией вирусов и антител гепатита С, продуктов трансфузионной терапии, а также наличием хронического рецидивирующего воспалительного процесса в суставах, (рис. 6)

Рисунок 6. Сравнительная характеристика параметров эле ктро ф ор етической подвижности эритроцитов

Характеристика периферического звена эритрона у пациентов без обострений геморрагического синдрома

При изучении эритрошпарных индексов были получены достоверные статистические различия показателей гемоглобина, гематокрита, МСУ (средний

объем эритроцита), МСНС (средняя концентрация гемоглобина в эритроците) по сравнению с контрольной группой, (таб. 6)

В данной группе выявлены признаки ускоренного и неэффективного эритропоэза, проявившегося пойкилоцитозом и анизохромией при нормальном количестве эритроцитов и повышенном уровне гемоглобина.

Таблица 6. Сравнительная характеристика эритроцитарных индексов

М±ш НЬ, г/л Эр, 1012/л Ш, л/л МСУ, фл МСН, нг МСНС, г/л

пациенты 161,1±0,2 5,5±0,09 47,0± 1,02 90,8±0,8 31,0±0,6 342,5±7,04

контроль 141,б±4,7 4,68±0,07 39,64±1,1 84,8±1,6 30,21±0,8 356,3±2,7

достоверная разница р<0,05 0,2<р<0,1 р<0,05 р<0,05 0,5<р<0,2 р<0,05

Компьютерная морфометрия эритроцитов показала наличие достоверных статистических различий в виде снижения таких показателей формулы эритроцитов, как эхиноциты, кодоциты, элептоциты и прочие формы эритроцитов по сравнению с контрольной группой. При этом, количество дискоцитов в исследуемой группе соответствовало, а в отдельных случаях и превышало данные контрольной группы, (таб. 7, А, Б).

Исследование подтвердило наличие ускоренного эритропоэза, в виде статистически достоверного увеличения количества эхиноцитов, кодоцитов, элептоцитов и прочие формы эритроцитов, а также умеренного изменения остальных переходных форм клеток при повышенном количестве дискоцитов.

Таблица 7. Сравнительная характеристика параметров компьютерной морфометрии эритроцитов

М±т Формула эритроцитов,%

дискоциты эхпноциты дакриоциты кодоциты элептоциты дегмациты сфероциты прочие формы

пациенты 91,3±1,8 1,6±0,5 0,3±0,05 1,8±1Д 3,2±0,13 0,66±0Д 9Д±1,6 8,4±б,5

контроль 83,17±4,6 0,0 0,1 ±0,02 0,15±0,09 0,2±0,04 од±о,о 15,27±4,4 1,22±0,2

достоверная разница р<0,05 р<0,05 0,5<р<0,2 р<0,05 р<0,05 0,1<р<0,05 р<0,05 р<0,05

А. - показатели формулы эритроцитов

М±т эритроцитометрия морфометрия

средний диаметр эритроцита показатель овалоцитоза показатель пойкилоцитоза показатель анизоцитоза показатель анизохромии

пациенты 7,5±0,04 0,9±0,01 13,3±1,4 6,4±0,2 17,8±0,8

контроль 7Д8±0,03 0,88±0,01 16,6±4,3 5,8±0Д 17,0±0,5

достоверная разница 0,5<р<0,2 р<0,5 0,2<р<0,1 0,5<р<0,2 р<0,5

Б. - показатели морфометрии

Ретикулонигометрия в исследуемой группе больных гемофилией выявила достоверное увеличение как обще]-о количества ретикулоцитов, так и увеличение в каждом ряду дифференцировки по сравнению с контрольной группой, (рис. 7)

При анализе данных обнаружены косвенные признаки повышения регенераторной активности костного мозга, что доказывает наличие ускоренного эритропозза, проявившегося ретикуяоцитозом до ] 9,2%о в присутствии ретикулоцитоз I и II групп и левого сдвига формулы.

per. I рет. 11 рет, Ш рет. IV рет. всего

рети кулоцитометр ия ■ больные контроль

Рисунок 7. Сравнительная характеристика параметров ретикулоцитометрии

Электрофорстическая подвижность эритроцитов периферической крови у больных без обострения геморрагического синдрома была снижена и равнялась 1,05 мкм^смхс'1-В'1. при нормальном значении (контрольная группа) 1,22±0,01 мш^см^е ХВ~. Однако, статистические различия между группами были не достоверны (р<0,5) (рис. 8)

В больные контроль

Рисунок 8. Сравнительная характеристика параметров электрофорети чес кой подвижности эритроцитов

Была исследована корреляция между показателями периферического звена 'системы эригрона у больных гемофилией, а именно, электрофорети ческой подвижности эритроцитов, скорости оседания эритроцитов, количества эритроцитов, МСУ (средний объем эритроцитов). Самым наглядным примером является соотношение между показателями электрофоретической подвижности эритроцитов (ЭФПэ) и скорости оседания эритроцитов (СОЭ) у этих больных.

В группе с обострением геморрагического синдрома определялись 2 подгруппы с высокими и низкими значениями ЭФП. В обеих подгруппах отмечалась обратная линейная зависимость с высоким значимым коэффициентом корреляции (г), (рис. 9)

0,4 0,5 0,6 0,7 0.8 0,9 1 1,1 1,2 1,3

ЭФШ

Рисунок 9. Соотношение между показателями ЭФПэ и СОЭ

В группе без обострений геморрагического синдрома также исследовались 2 подгруппы с высокими и низкими значениями показателей ЭФП эритроцитов. В обеих подгруппах определялись низкие, незначимые коэффициенты и корреляционной зависимости не определялось, (рис. 10)

18 16 (.14

гУт 8 б 4

0

О 0.2 0.4 0,6 0.8 1 1.2 1.4

ЭФП

Рисунок 10. Соотношение между показателями ЭФПэ и СОЭ

ЖЕН

----

Итак, у больных гемофилией с обострением геморрагического синдрома выявлена определенная зависимость между показателями скорости оседания эритроцитов (СОЭ) и электрофоретической подвижностью эритроцитов (ЭФПэ) периферической крови. При этом были получены два типа кривых, которые соответствуют двум подгруппам пациентов, с легкой и тяжелой степенью кровоточивости. В группе без обострения геморрагического синдрома корреляционной зависимости между данными показателями не определялось.

Таким образом, у пациентов с тяжелой формой гемофилии выявлены определенные изменения в системе периферического звена эритрона. На основании полученных данных можно сделать заключение о том, что на фоне регулярных хронических кровотечений происходит формирование адаптационных механизмов в системе эритрона.

Больным гемофилией при наличии анемии (уровень гемоглобина ниже 80 г/л) без клинических симптомов: одышки, слабости, мелькания «мушек» перед глазами и других, не требуется заместительных трансфузий эритроцитосодержащих компонентов крови.

В целом, эритрон - очень важная система кроветворения, от состояния которой зависят возникновение, развитие и течение анемии, сопровождающей хронические или острые проявления геморрагического синдрома. Проведенное исследование не только углубляет представление о состоянии периферического звена эритрона при гемофилии, но и может иметь значение при проведении коррекционной терапии при анемии у данной категории больных.

Выводы.

1. У больных тяжелой формой гемофилии, вне зависимости от наличия или отсутствия у них анемии на момент исследования, выявлены признаки ускоренного эритропоэза, выражающиеся в изменении эритроцитарной формулы и морфологии эритроцитов.

2. Исследование периферического звена эритрона у больных гемофилией выявило ретикулоцитоз (28,8%о), а также левый сдвиг ретикулоцитарного ряда до появления ретикулоцитов I и II классов, что является косвенным показателем повышенной регенераторной способности костного мозга.

3. У пациентов с тяжелой формой гемофилии в группе с обострением геморрагического синдрома (с анемией) установлено снижение электрофоретической подвижности эритроцитов периферической крови.

4. Соотношение между отдельными параметрами периферического звена эритрона (электрофоретическая подвижность эритроцитов периферической крови, скорость оседания эритроцитов, количество эритроцитов, средний объем эритроцита) указывает на определенные особенности эритропоэза у больных с тяжелой формой гемофилии.

5. На фоне адекватной и своевременной гемостатической терапии на фоне обострений у пациентов с тяжелой формы гемофилии трансфузионная терапии эритроцитосодержащими компонентами крови без наличия для того клинических симптомов не является необходимой.

6. Несмотря на периодическую или регулярную кровопотерю (кровоизлияния в суставы), организм пациентов с тяжелой формой гемофилии адаптируется к ней и включает компенсаторные реакции ее возмещения.

Список работ по теме диссертации

1. Яструбинецкая О.И., Попова О.В., Сарычева Т.Г., Плющ О.П., Козинец Г.И. Исследование эритроцитов больных гемофилией методом цитоэлектрофореза. Проблемы гематологии и переливания крови, 2006, № 1, с. 90.

2. Копылов К.Г., Лихачева Е.А., Плющ О.П., Тенцова И.А., Коняшина Н.И., Северова Т.В., Зозуля Н.И., Яструбинецкая О.И. Клиническая эффективность и фармакокинетика фактора свертывания крови VIII (Wilate) у больных с болезнью Виллебранда (тип III). Проблемы гематологии и переливания крови, 2006, № 2, с. 1316

3. Кудрявцева Л.М., Плющ О.П., Копылов К.Г., Зозуля Н.И., Яструбинецкая О.И. Характеристика алгоритмов гемостатической терапии гемофилии. Проблемы гематологии, 2006, № 2: 41-46

4. Яструбинецкая О.И., Попова О.В., Сарычева Т.Г., Тенцова И.А., Козинец Г.И. Изучение некоторых особенностей периферического звена эритрона у больных гемофилией. Вестник гематологии, том III, № 2,2007 г., с. 86-87 г. Санкт-Петербург

5. Лопатина Е.Г., Яструбинецкая О.И., Тенцова И.А. Домашнее лечение больных гемофилией А и болезнью фон Виллебранда. Тезисы докладов VI съезда гематологов и трансфузио логов респ. Беларусь «Актуальные проблемы гематологии и трансфузиологии», 2007, с. 119

6. Яструбинецкая О.И. Изучение некоторых особенностей периферического звена эритрона у больных гемофилией. Вопросы трансфузиологии и клинической медицины (материалы научно-практической конференции молодых ученых), г. Киров, 2007 г, с. 62.

7. Yastrubinetskaya О., Popova О., Sarycheva Т., Tentsova I. Determination of erythrocytic electrophoretic mobility of peripheral blood with use preservative ethylene-2-amino-4-chlorineacetic acid (EDTA). International Journal of Laboratory Haematology, 2008, 30 (Suppl. 1), p. 79, № 149, Sydney, Australia

8. Яструбинецкая О.И., Сарычева Т.Г., Попова O.B., Козинец Г.И. Исследование зависимости между электрофоретической подвижностью эритроцитов и СОЭ у пациентов с тяжелой формой гемофилии. Клиническая лабораторная диагностика, 2008 г., Кг 9, с. 74

Подписано в печать 17.10.2008 г.

Печать трафаретная

Заказ № 983 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Актуальность проблемы

Гемофилия - наследственный геморрагический диатез, обусловленный дефицитом или молекулярной аномалией факторов свертывания VIII или IX, при котором больные нуждаются в заместительной терапии на протяжении всей своей жизни.

За рубежом в течение последних 10-15 лет основным методом лечения гемофилии является заместительная гемостатическая терапия препаратами концентратов дефицитных факторов VIII или IX в домашних условиях (Bentorp Е., 1995; Szucs T.D., Offner A., Giangrande Р. et al., 1998; Hoots W.K., 2001; Плющ О.П. и соавторы, 2002). Данный метод терапии позволил уменьшить частоту и продолжительность обострений, а также увеличил продолжительность и улучшил качество жизни. Благодаря высокому уровню развития производства концентратов дефицитных факторов VIII или IX в настоящее время во многих странах мира и в Российской Федерации разработаны и внедрены в клиническую практику Национальные протоколы по лечению больных гемофилией, основанные на профилактическом применении концентратов факторов свертывания.На этом фоне количество обострений в виде основных проявлений заболевания - спонтанных гемартрозов и гематом резко уменьшилось.

В последнее время на первый план выходят такие осложнения, как массивные желудочно-кишечные кровотечения, кровотечения во время оперативных вмешательств, посттравматические гематомы, гематурии.

Обращает на себя внимание тот факт, что развивающаяся вследствие кровопотери анемия, даже значительная, не требует заместительной терапии компонентами крови.

Работ, посвященных исследованию системы эритрона у больных гемофилией практически нет. Основными причинами, побудившими нас к выполнению данных исследований, является повышенная резистентность больных к развитию анемии после кровопотери, более легкая ее переносимость и восстановление нормальных показателей крови.

Цель исследования:

Целью данной работы являлись анализ и оценка морфофункционального состояния периферического звена эритрона у больных гемофилией в группах с обострением и без обострения геморрагического синдрома при наличии или отсутствии анемии на момент обследования для характеристики эритропоэза у этих больных.

Задачи исследования:

1. Изучить эритроцитарную формулу у больных тяжелой формой гемофилии в группах с наличием или отсутствием проявлений геморрагического синдрома на момент обследования.

2. Исследовать морфологию эритроцитов крови с помощью компьютерной цитометрии и сканирующей электронной микроскопии в группах с наличием или отсутствием проявлений геморрагического синдрома на момент обследования.

3. Охарактеризовать изменения количественного и качественного состава ретикулоцитов периферической крови больных гемофилией в группах с наличием или отсутствием проявлений геморрагического синдрома на момент обследования.

4. Оценить функциональное состояние мембраны эритроцитов методом цитоэлектрофореза у больных гемофилией в группах с наличием или отсутствием проявлений геморрагического синдрома на момент обследования.

5. Выявить закономерность корреляционной зависимости между показателями периферического звена эритрона у больных гемофилией (СОЭ, ЭФПэ, МСУ, количество эритроцитов).

Научная новизна работы:

С целью определения адаптационных возможностей эритрона у больных гемофилией в первый раз было изучено его периферическое звено.

Оценен поверхностный заряд клетки методом цитоэлектрофореза с определением морфологической формулы эритроцитов на основании компьютерного анализа их изображения.

У больных гемофилией, вне зависимости от наличия или отсутствия у них анемии на момент исследования, выявлены косвенные признаки повышенной регенераторной способности костного мозга, выражающиеся в виде высокого ретикулоцитоза с левым сдвигом ретикулоцитарного ряда (появления клеток I и II класса по Гельмейру), а также подтверждающиеся изменением эритроцитарной формулы и морфологии эритроцитов.

Теоретическое и практическое значение исследования:

Результаты настоящего исследования способствуют углублению знаний о состоянии периферического звена эритрона у больных гемофилией. Полученные сведения о морфофункциональных особенностях эритроцитов при гемофилии представляются важными, поскольку дают ценную информацию о структурных изменениях клеток в условиях хронической и острой кровопотери или вне обострения геморрагического синдрома. Полученные данные могут в дальнейшем играть существенную роль в изучении адаптационных возможностей эритрона и необходимости проведения трансфузий эритроцитосодержащих компонентов крови при развитии анемии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Гемофилия характеризуется морфофункциональными изменениями эритроцитарных индексов и формулы эритроцитов, а также показателей цитометрии эритроцитов, параметров ретикулоцитометрии и электрофоретической подвижности эритроцитов периферического звена эритрона

2. Компенсаторные реакции системы эритрона не допускают развития тяжелой формы анемии у больных гемофилией.

3. У больных гемофилией существует определенная корреляционная зависимость между отдельными показателями периферического звена эритрона.

выводы

1. У больных тяжелой формой гемофилии с наличием или отсутствием геморрагического синдрома выявлены признаки ускоренного эритропоэза, выражающиеся в изменении эритроцитарной формулы и морфологии эритроцитов.

2. Исследование периферического звена эритрона у больных гемофилией определило ретикулоцитоз (28,8%о), а также левый сдвиг ретикулоцитарного ряда до появления ретикулоцитов I и II классов, что является косвенным показателем повышенной регенераторной способности костного мозга.

3. У пациентов с тяжелой формой гемофилии в группе с обострением геморрагического синдрома (с анемией) установлено снижение электрофоретической подвижности эритроцитов периферической крови.

4. Соотношение между отдельными параметрами периферического звена эритрона (электрофоретическая подвижность эритроцитов периферической крови, скорость оседания эритроцитов, количество эритроцитов, средний объем эритроцита) указывает на особенности эритропоэза у больных с тяжелой формой гемофилии.

5. На фоне адекватной и своевременной гемостатической терапии обострений тяжелой формы гемофилии трансфузионная терапии эритроцитосодержащими компонентами крови без наличия для того клинических симптомов не является необходимой.

6. Несмотря на периодическую или регулярную кровопотерю, организм пациентов с тяжелой формой гемофилии адаптируется к ней и включает компенсаторные реакции ее возмещения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленная работа посвящена одной из актуальных проблем гематологии - исследованию эритрона у пациентов, страдающих тяжелой формой гемофилии. На фоне современной гемостатической терапии количество обострений в виде основных проявлений заболевания, спонтанных гемартрозов и гематом, резко уменьшилось. В последнее время на первый план выходят такие проявления кровоточивости, как желудочно-кишечные, почечные кровотечения, кровотечения при оперативных вмешательствах, забрюшинные гематомы. Данные осложнения часто вызывают анемию, переносимую пациентами значительно легче, чем больными с другими заболеваниями. При этом у больных гемофилией с анемией часто не требуется заместительная терапия препаратами эритроцитов.

Целью работы явилось изучение периферического звена эритрона и его морфофункциональной характеристики у больных гемофилией в условиях хронической и острой кровопотери.

Исследование было проведено у 47 пациентов и 10 здоровых людей, составивших группу сравнения.

Пациенты были разделены на 2 группы, согласно наличию или отсутствию обострений геморрагического синдрома на момент обследования. В группу с обострением геморрагического синдрома вошли 25 человек в возрасте от 20 до 59 лет. В свою очередь, данная группа подразделялась на 2 подгруппы: одна подгруппа, с уровнем гемоглобина выше 120 г/л (без анемии) - 12 человек; и другая - ниже 120 г/л (с анемией) -13 человек. В группу без обострений гемофилии были включены 22 человека в возрасте от 18 до 51 года. Контрольную группу составили 10 здоровых людей, сопоставимых с исследуемыми группами по возрасту.

Изучались 1197 образцов периферической крови: 987 полученных от больных гемофилией и 210 - от здоровых людей.

При изучении эритроцитарных индексов у пациентов с обострением геморрагического синдрома (без анемии) отмечалась достоверная статистическая разница при изучении показателей пойкилоцитоза и анизохромии по сравнению с контрольной группой.

У пациентов с обострением геморрагического синдрома и анемией отмечалась достоверная разница по сравнению с контрольной группой при изучении таких показателей, как уровень гемоглобина эритроцитов, гематокрит, МСУ, МСН, МСНС.

В группе пациентов без обострения геморрагического синдрома отмечалась достоверная статистическая разница по сравнению с контрольной группой при изучении показателей гемоглобина, гематокрита, пойкилоцитоза и анизохромии.

Таким образом, в исследуемых группах выявлены признаки ускоренного и неэффективного эритропоэза, проявившегося пойкилоцитозом при повышенном или нормальном количестве эритроцитов и уровне гемоглобина.

При изучении образцов периферической крови методом компьютерной цитометрии в подгруппе пациентов с обострением геморрагического синдрома (без анемии) отмечена достоверная разница по сравнению с контрольной группой различных форм эритроцитов: эхиноциты, сфероциты. Также, при изучении морфометрии эритроцитов выявлена достоверная разница по сравнению с контрольной группой показателя анизохромии.

В подгруппе пациентов с обострением геморрагического синдрома (с анемией) выявлена разница по сравнению с контрольной группой по следующим показателям: дискоциты, эхиноциты, сфероциты и прочие формы эритроцитов. Также, при изучении морфометрии эритроцитов выявлена достоверная разница по сравнению с контрольной группой показателей пойкилоцитоза и анизохромии.

При изучении образцов периферической крови в группе пациентов без обострения геморрагического синдрома выявлена статистическая разница по сравнению с контрольной группой по следующим показателям: дискоциты, эхиноциты, кодоциты, элептоциты, сфероциты и прочие формы эритроцитов.

Следовательно, данным исследованием было подтверждено наличие ускоренного эритропоэза, проявившегося некоторым изменением формулы эритроцитов в виде умеренного увеличения переходных форм клеток.

При рассмотрении данных, полученных при проведении ретикулоцитометрии в подгруппе пациентов с обострением геморрагического синдрома без анемии выявлено увеличение показателей всех групп клеток (по Гельмейру) и, соответственно, их общего количества. Отмечается левый сдвиг ретикулоцитарного ряда: появление ретикулоцитов I и II класса.

У пациентов с обострением геморрагического синдрома и анемией также отмечалось значительное увеличение общего количества ретикулоцитов с левым сдвигом формулы: клетки I класса и II класса.

В группе пациентов без обострения геморрагического синдрома выявлено повышение показателей ретикулоцитов: общего количества. Наблюдался левый сдвиг ретикулоцитарного ряда: ретикулоциты I класса и II класса.

Итак, в исследуемых группах отмечаются косвенные признаки повышенной регенераторной способности костного мозга, что также является доказательством наличия у больных с тяжелой формой гемофилии ускоренного эритропоэза, проявившегося в присутствии молодых форм клеток в периферической крови.

При анализе данных, полученных при исследовании функциональной полноценности мембраны эритроцитов методом цитоэлектрофореза в постоянном электрическом поле с определением электрофоретической подвижности, в подгруппе пациентов с обострением геморрагического синдрома (без анемии) выявлено умеренное снижение показателя, имевшее по сравнению с группой контроля разницу 0,5<р<0,2.

У пациентов с обострением геморрагического синдрома и анемией отмечено снижение ЭФПэ, имевшее достоверную разницу с контрольной группой, что можно объяснить адсорбцией на эритроциты вирусов и антител гепатита С, продуктами трансфузионной терапии и хронического рецидивирующего воспалительного процесса в суставах.

В группе пациентов без обострения геморрагического синдрома выявлено незначительное снижение ЭФПэ с не имевшее статистической разницы с группой сравнения.

Исследование функциональной полноценности мембраны эритроцитов методом цитоэлектрофереза у больных тяжелой формой гемофилии обнаружило снижение электрофоретической подвижности эритроцитов периферической крови во всех изучаемых группах, что можно объяснить адгезией на поверхностную мембрану инородных веществ и, тем самым, изменение ее заряда

Было изучено корреляционное соотношение между отдельными показателями периферического звена эритрона в обозначенных выше группах пациентов с тяжелой формой гемофилии.

Пациенты в группе с обострением геморрагического синдрома подразделялись на 2 подгруппы: с высокими и низкими значениями электрофоретической подвижности эритроцитов.

При изучении соотношения показателей электорофоретической подвижности эритроцитов и скорости оседания эритроцитов отмечалась обратная линейная зависимость с высоким значимым коэффициентом корреляции (г). Эти данные свидетельствуют о наличии в данной группе косвенных признаков неэффективного эритропоэза.

При изучении корреляционного соотношения между показателями ЭФПэ и количеством в обоих подгруппах определялись низкие, незначимые коэффициенты и корреляционной зависимости не определялось

При изучении корреляционного отношения между показателями ЭФПэ и МСУ в подгруппе с высокими показателями ЭФПэ выявлен не являющийся значимым коэффициент корреляции (г), следовательно, корреляционного соотношения между данными показателями в подгруппе не найдено. В подгруппе с низкими показателями ЭФПэ выявлен высокий значимый коэффициент корреляции (г),что говорит о наличии корреляции в данной подгруппе и признаках ускоренного эритропоэза.

При изучении корреляционного соотношения между показателями количества эритроцитов и МСУ в обоих подгруппах определялись низкие, незначимые коэффициенты и корреляционной зависимости не определялось

Группа без обострения геморрагического синдрома также подразделялась на 2 подгруппы с высокими и низкими значениями электрофоретической подвижности эритроцитов.

При изучении соотношения показателей электорофоретической подвижности эритроцитов и скорости оседания эритроцитов в обоих подгруппах определялись низкие, незначимые коэффициенты и корреляционной зависимости не определялось

При изучении корреляционного отношения между показателями ЭФПэ, количеством эритроцитов, МСУ в обоих подгруппах определялись низкие, незначимые коэффициенты и корреляционной зависимости не определялось

При изучении корреляционного отношения между показателями количества эритроцитов и МСУ в подгруппе с высокими показателями ЭФПэ выявлен высокий и являющийся значимым коэффициент корреляции (г), что говорит о наличии признаков ускоренного эритропоэза. В подгруппе с низкими показателями ЭФПэ выявлен коэффициент корреляции (г), не являющийся значимым, следовательно корреляционной зависимости в данной подгруппе не определялось

Таким образом, у пациентов с тяжелой формой гемофилии выявлены определенные изменения в системе периферического звена эритрона. На основании полученных данных можно сделать заключение о том, что на фоне регулярных хронических кровотечений происходит становление адаптационных механизмов в системе эритрона.

В целом, эритрон - очень важная система кроветворения, от состояния которой зависят возникновение, развитие и течение анемии, сопровождающей хронические или острые проявления геморрагического синдрома. Можно высказать предположение, что проведенное исследование не только углубляет представление о состоянии периферического звена эритрона при гемофилии, но и может иметь значение при проведении коррекционной терапии при анемии у данной категории больных.

В частности, можно рекомендовать, что при анемии больным гемофилией не требуется заместительных трансфузий эритроцитосодержащих компонентов крови без наличия для того клинических симптомов.