Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Морфо-биологические маркеры (sFas, интерлейкин-6, VEGF, Ki) при раке молочной железы и их связь с прогнозом заболевания

На правах рукописи

ШВЕЦОВА Галина Николаевна

Морфо-биологические маркеры (вЕаэ, интерлейкин-6, \4EGF, К|-67) при раке молочной железы и их связь с прогнозом заболевания

(14.00.14 - онкология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва - 2002

Работа выполнена в Российском онкологическом научном центре им. Н.Н.Блохина РАМН (директор - чпен-корреспондент РАМН, профессор М.И.Давыдов)

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор М.И.Нечушкин член-корреспондент РАМН, профессор Н.Е.Кушлинский

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор З.Г.Кадагидзе доктор биологических наук, профессор Л.Б.Горбачева доктор медицинских наук, профессор А.А.Вишневский

Ведущая организация: Российский научный центр рентгенорадиологии Минздрава России

Защита состоится 27 июня 2002 года в 1400 часов на заседании специализированного совета (Д.001.17.01) при Российском онкологическом научном центре им. Н.Н.Блохина РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 24).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 24)

Автореферат разослан 2002 года.

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук Ю.В.Шишкин

ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы. Рак молочной железы (РМЖ) - одно из самых распространенных онкологических заболеваний у женщин. Статистические данные последних лет свидетельствуют о неуклонном, интенсивном росте заболеваемости и смертности от РМЖ, несмотря на значительный прогресс в лечении заболевания, достигнутый в результате совершенствования хирургических и лекарственных методов.

Более 40% женщин, поступающих в стационары, - это больные с распространенным РМЖ. Лечение данной категории пациенток очень сложно. В связи с этим, не теряет своей актуальности разработка новых подходов к оценке "биологического поведения" опухоли, а также общего прогноза заболевания и выбору наиболее адекватных схем лечения для каждой больной.

В последние годы большое внимание в этой области уделяется различным молекулярным и клеточным маркерам, характеризующим фундаментальные биологические свойства опухоли. Тем не менее, ввиду большого числа молекулярно-биологических факторов и значимых расхождений данных литературы об их прогностической ценности, выбор определенного типа лечения, основанный на биологических характеристиках опухоли, остается затруднительным и неопределенным для врача.

Некоторые исследователи вообще довольно скептически относятся к возможностям практического использования этих показателей у больных РМЖ из-за существующей во многих западных странах тенденции к повсеместному применению адъювантной терапии. Вместе с тем, по крайней мере, в трех ситуациях молекулярно-биологические и морфологические прогностические факторы при РМЖ могут быть полезны: во-первых, для выявления пациентов с хорошим прогнозом, для которых осложнения и стоимость лечения не будут оправданы имеющимся риском рецидива; во-вторых, для выявления группы больных с неблагоприятным прогнозом,

которым требуется более агрессивное адъювантное лечение; в-третьих, для определения чувствительности или резистентности опухоли к конкретным видам терапии.

Кроме того, на основании исследования молекулярно-биологических особенностей РМЖ, может быть создана новая стратегия лечения, непосредственно влияющая на определенные молекулы и процессы. Знание специфических биологических характеристик опухоли может помочь и в усовершенствовании существующих схем терапии, и в развитии новых подходов к лечению, основанных, например, на иммунотерапии, генной терапии или на модификации системы передачи регуляторных сигналов в клетке.

Так, в экспериментальных исследованиях последних десятилетий установлено, что нарушения механизмов программированной гибели клеток (апоптоза) лежат в основе многих заболеваний, в том числе злокачественных опухолей, а среди них - рака молочной железы.

Основной характеристикой злокачественных новообразований является их способность к неограниченному росту, устойчивость к действию факторов, регулирующих процессы пролиферации и дифференцировки, а также инвазии и метастазированию.

Известно, что одним из ключевых рецепторов, запускающих апоптоз в клетке, является Fas/APO-l/CD95 - трансмембранный гликопротеин первого типа, относящийся к семейству рецепторов TNF/NGF (Itoh N. et al., 1991; Oehm A. et al., 1992; С.Г.Аббасова и соавт., 2000). Fas экспрессируется в различных тканях организма, он также экспонирован на поверхности активированных . лимфоцитов, натуральных киллеров, вирус-инфицированных и опухолевых клеток (Nagata S. и Golstein Р., 1995; Ю.М.Степанов и соавт., 2000). Подобно рецептору TNF р55, Fas запускает в клетке апоптоз после взаимодействия со своим лигандом (FasL) или агонистическими моноклональными антителами (МА) против Fas. В

последние годы усилиями многих исследователей были идентифицированы основные белки, участвующие в передаче апоптотического сигнала от активированного Fas, установлены их структура и функции. Взаимодействие Fas с FasL или агонистическими МА против Fas приводит к активации протеаз caspase-8 или caspase-2 через адапторные белки FADD/MORT-1 или RIP и RAIDD. FLICE-ингибирующий белок FLIP блокирует активацию caspase-8, таким образом, ингибируя апоптоз. Активированные протеазы расщепляют жизненно необходимые для клетки субстраты, такие как полиАДФрибозополимеразу, ламин и другие и опосредуют функциональные и морфологические изменения цитоплазмы и ядра клетки, типичные для апоптоза. Выявлены также мутации в генах Fas и FasL, приводящие к неэффективной работе Fas-системы. Причиной устойчивости различных типов клеток к Fas-зависимому апоптозу может быть повышенная продукция растворимого Fas (sFas) этими клетками. sFas связывается с FasL, ингибируя действие последнего, и обеспечивает клеткам-продуцентам растворимого Fas преимущества в выживании и размножении.

С помощью молекулярного клонирования и анализа нуклеотидной последовательности было показано, что sFas является продуктом альтернативного сплайсинга полноразмерной мРНК Fas (Cheng J. et al., 1994; Cascino I. et al., 1995). Показано существование нескольких растворимых форм sFas, среди которых преобладает одна - FasdelTM, а остальные синтезируются в незначительных количествах.

Актуальность настоящего исследования определяется необходимостью количественного определения sFas в сыворотке крови больных РМЖ как одного из возможных факторов, определяющих "биологическое поведение" опухоли, а именно, ее агрессивность, устойчивость к химиогормоиотерапии, а стало быть определяет прогноз опухолевого процесса в каждой конкретной клинической ситуации.

В настоящее время, наряду с процессом апоптоза, большое внимание исследователи уделяют проблеме неоангиогенеза в злокачественных опухолях молочной железы. И это связано с тем фактом, что опухоль не может развиваться и расти без образования в ней разветвленной сети сосудов, обеспечивающих клетки кислородом и питательными веществами.

Интерес к этой проблеме возник более 30 лет назад, и только относительно недавно, в результате изучения молекулярных механизмов ангиогенеза, был продемострирован целый ряд регуляторов ангиогенных факторов, в числе которых - фактор роста эндотелия сосудов (VEGF). Динамический баланс этих факторов обеспечивает формирование и распространение новых сосудов внутри опухоли (Toi M. et al., 1994). В настоящее время VEGF считается важным регулятором ангиогенеза, и называется также фактором проницаемости сосудов. Основными растворимыми формами VEGF являются молекулы размером 121 и 165 аминокислотных остатков, они же считаются и основными биологически активными формами VEGF. В первом иммуногистохимическом исследовании по экспрессии VEGF в опухолях у 103 больных РМЖ было показано, что плотность микрососудов и ее прирост достоверно выше в опухолях с интенсивным окрашиванием на VEGF, чем в опухолях со слабым окрашиванием. В последующем было доказано, что концентрация VEGF в сильно васкуляризированных опухолях достоверно выше, чем в слабо васкуляризированных (Toi M. et al., 1996). Также была предложена классическая модель регуляции неоангиогенеза в РМЖ, она предусматривает наличие паракринной системы, в которой VEGF продуцируется опухолевыми клетками, а его рецепторы, воспринимающие сигнал, находятся на клетках эндотелия сосудов (Brown L.F. et al., 1999). Показано, что VEGF является антиапоптотическим фактором не только для эндотелиальных, но и для опухолевых клеток, индуцируя экспрессию bcl-2 (Pidgeon G.P. et al., 2001).

Цель настоящего исследования - сравнительный анализ клинического значения экспрессии растворимого Раз-антигена и интерлейкина-6 в сыворотке крови больных раком и доброкачественными новообразованиями молочной железы, а также экспрессии фактора роста эндотелия сосудов в опухоли, их связь с чувствительностью опухолей к эстрогенам и основными клиническими и морфологическими характеристиками заболевания, прогнозом.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести сравнительное определение частоты выявления и содержания рецепторов эстрогенов в цитозольной фракции опухоли при РМЖ с учетом стадии заболевания, возраста больных и репродуктивной функции.

2. Изучить частоту выявления и уровни зРаэ в крови больных раком, доброкачественными новообразованиями молочной железы и в крови практически здоровых женщин соответствующего возраста.

3. Проанализировать взаимосвязь частоты выявления и значений растворимого Раз-антигена в сыворотке крови больных злокачественными и доброкачественными новообразованиями молочной железы с основными клинико-морфологическими характеристиками заболевания, возрастом больных, репродуктивной функцией, чувствительностью опухоли к эстрогенам.

4. Изучить частоту выявления и уровни интерлейкина-6 в сыворотке крови больных раком, доброкачественными новообразованиями молочной железы и практически здоровых женщин соответствующего возраста.

5. Провести сравнительный анализ взаимосвязи между показателями ; интерлейкина-6 в сыворотке крови и рецепторами эстрогенов в опухоли с

учетом основных клинико-морфологических характеристик заболевания.

6. Изучить взаимосвязь растворимого Раз-антигена и интерлейкина-6 в сыворотке крови у больных раком молочной железы в зависимости от распространенности опухолевого процесса и гистологического строения новообразования.

7. С помощью иммуногистохимического исследования провести анализ уровней экспрессии фактора роста эндотелия сосудов в первичной опухоли больных раком молочной железы и оценить их значение в прогнозе безрецидивной выживаемости.

8. Изучить взаимосвязь индекса пролиферативной активности антигена Кл-67 с уровнем экспрессии фактора роста эндотелия сосудов в первичной опухоли больных раком молочной железы, выявить их связь с основными клинико-морфологическими характеристиками болезни и прогнозом.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Общая характеристика обследованных больных

Под нашим наблюдением находилось 140 больных РМЖ и 22 доброкачественными новообразованиями молочной железы в возрасте от 26 до 85 лет (53,б±1,0; медиана - 52 года). У 82 больных была сохранена менструальная функция; 80 пациенток были в постменопаузе длительностью от 2 до 38 лет(12,34±0,96; медиана - 10 лет).

Все больные обследовались и получали лечение в отделении радиохирургии Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН с января 1997 г. по февраль 2002 г.

Клинический диагноз новообразования молочной железы у всех подтвержден данными морфологического исследования удаленной опухоли и до проведения настоящего исследования специфического лечения больным не проводили.

Контрольную группу составили 55 практически здоровых женщин соответствующего возраста.

У 23 больных РМЖ диагностирована 1а стадия (T|N0M0), у 47 - Па (T2NoMo), у 35 - Иб (T2N,Mo , T3N0M0), у 11 - Illa (T|N2M0> T2N2M0> T3N,. 2M0), y 22 - III6 (T4N0.3M0 T0.4N3M0), y 2 - IV (T0.4N0.3M,).

При доброкачественных новообразованиях молочной железы у 21 больной была выполнена секторальная резекция молочной железы и в одном наблюдении - туморэктомия с подмышечной лимфоаденэктомией со стороны поражения и торакоскопической лимфоднссекцией парастернальных лимфатических узлов.

При РМЖ 20 больным с I-IIa стадиями болезни выполнена радикальная резекция молочной железы; 61 больной с Ila-IIIa стадиями -радикальная резекция молочной железы с торакоскопической лимфодиссекцией парастернальных лимфатических узлов; у 32 -радикальная мастэктомия с сохранением обеих грудных мышц; у 27 больных в связи с большой распространенностью опухолевого процесса была выполнена радикальная мастэктомия с сохранением обеих грудных мышц и торакоскопическая лимфодиссекция парастернальных лимфатических узлов.

В послеоперационном периоде 36 больных РМЖ не получали никакого лечения; 16 пациенток получали химиотерапию с использованием схем CAF или CMF; 51 больной проведена химиотерапия в сочетании с лучевой терапией на область послеоперационного рубца; 36 - только лучевая терапия на область послеоперационного рубца.

Для лечения 60 больных РМЖ во II6-IV стадии болезни, с рецепторположительными по РЭ опухолями, в комплексное лечение включали тамоксифен, после выключения функции яичников у женщин репродуктивного возраста или находящихся в пременопаузе.

При гистологическом исследовании операционного материала, среди доброкачественных новообразований молочной железы, в 3 наблюдениях

была выявлена внутрипротоковая папиллома, в 10 - фиброаденома, в 9 -фиброзно-кистозная болезнь.

При РМЖ в 97 образцах обнаружен протоковый инфильтративный рак, в 27 - дольковый инфильтративный рак, в 9 - смешанный, в 3 -внутрипротоковый, в 3 - слизистый, в 1 наблюдении - рак Педжета.

Лабораторные методы исследования

Определение растворимого Fas-антигена (sFas). sFas определяли иммуноферментным методом (Sandwich-ELISA) в сыворотке крови больных РМЖ и практически здоровых женщин контрольной группы по ранее разработанному методу в Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН совместно с научными сотрудниками РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.

Рецепторы эстрадиола-17|3 определяли в цитозольной фракции опухолей молочной железы общепринятым радиолигандным методом, разработанным группой EORTC. В настоящем исследовании рецепторположительными (РЭ+) считали опухоли, в которых содержание РЭ было 10,0 и более фмоль/мг общего белка цитозольной фракции.

Иммуногистохимический метод исследования опухолей. Для иммуногистохимических исследований образцы тканей РМЖ фиксировали в 10% забуференном формалине, заливали в парафин с точкой отвердения 56°С, готовили серийные срезы толщиной 3-5 мкм, а затем их депарафинировали по стандартной схеме.

Иммуногистохимическое исследование проводили пероксидазно-антипероксидазным методом (ПАП) с применением антител к VEGF (антитела VEGF (С-1): sc-726; фирма «Santa Cruz Biotechnology, Inc.», США; рабочее разведение антител 1:100); к Ki-67 (антитела Ki-S5; фирма «DAKO», Дания; рабочее разведение антител 1:50).

При использовании антител VEGF с целью демаскировки антигенных детерминант проводили предварительную обработку парафиновых срезов в микроволновом режиме (MW-processing) при мощности 750 Вт 2 раза по 5 мин с перерывом между процедурами 2 мин.

Для Ki-67 использовали микроволновую обработку тканевых срезов 3 раза по 5 мин при 750 Вт и 10 мин при 600 Вт соответствующими охлаждениями в течение 2 мин между каждой процедурой. Затем срезы охлаждали при комнатной температуре не менее 15-20 мин. После этого срезы промывали в ТРИС-буфере 2-5 мин, просушивали и инкубировали с первичными антителами в течение 60 мин при комнатной температуре, затем 18 часов при температуре +4°С. Далее в качестве вторичных антител и пероксидазного комплекса использовали стандартный контрольно-иммунный тест фирмы "DAKO" (StreptABComplex/HRP, Mouse/Rabbit).

Для визуализации иммуногистохимической реакции использовали раствор диаминобензидина с докрашиванием ядер клеток гематоксилином Майера.

Рассчеты интенсивности иммуногистохимического окрашивания образцов тканей рака молочной железы

Количественный метод использовали в оценке иммуногистохимического окрашивания ядер клеток РМЖ при использовании антител к Ki-67. Рассчет проводили общепринятым методом: вычисляли индекс мечения или количество окрашенных ядер опухолевых клеток этим маркером на 100 опухолевых клеток при репрезентативных полях зрения. Этот показатель рассчитывали при анализе не менее 500-1000 клеток.

Полуколичественный метод использовали при анализе иммуногистохимического окрашивания антителами VEGF цитоплазмы раковых клеток и оценивали по 3-балльной системе: 0 баллов - отсутствие окрашивания; + (1 балл) - более 20% клеток со слабой интенсивностью

окрашивания цитоплазмы; ++ (2 балла) — умеренное окрашивание цитоплазмы раковых клеток; +++ (3 балла) - интенсивное окрашивание. Далее выводили среднее число баллов. В тех случаях, когда интенсивность окрашивания варьировала, например от + (1 балл) до ++ (2 балла), среднее получали -1,5 балла. Когда выявляли равномерное окрашивание цитоплазмы клеток РМЖ, тогда цифра, характеризующая интенсивность окрашивания, была округленной - + (1 балл), ++ (2 балла) или +++ (3 балла).

Статистический анализ полученных результатов проводили на персональном компьютере с использованием пакета программ Statistica for Windows, Release 6.0, STARSOFT Inc. Достоверность отличий средних значений оценивали по t-критерию Стьюдента. Во всех случаях различия считали достоверными при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Рецепторы эстрадиола-17р в новообразованиях молочной железы. Известно, что гормоночувствительность физиологических процессов во всех органах и тканях связана с наличием или отсутствием рецепторов. Сравнительное изучение уровней РЭ в новообразованиях молочной железы и сопоставление этих данных с клиническими признаками заболевания, имеет не только теоретическое, но и важное практическое значение, заключающееся в возможности использования адъювантной гормонотерапии при этом заболевании (Л.С.Бассалык., 1987).

Из 140 исследованных нами первичных РМЖ РЭ+ опухолей было 78 (55,7%). Содержание РЭ в первичных опухолях колебалось от 10,0 до 382,5 фмоль/мг белка и в среднем составило 73,8±8,5 фмоль/мг белка (медиана -46,8 фмоль/мг белка).

Анализ уровней РЭ в РМЖ с учетом возраста больных, показал достоверное отсутствие корреляционной связи между указанными параметрами. Частота выявления и уровни РЭ в РМЖ с учетом стадии

заболевания представлены в таблице 1. Из данных, приведенных в таблице 1 следует, что с увеличением стадии заболевания отмечается снижение содержания РЭ в опухолях. Максимальные средние показатели РЭ выявлены в РМЖ при 1а стадии заболевания (105,5±31,1 фмоль/мг белка), а наиболее низкие - в Шб стадии (43,5±13,6 фмоль/мг белка). Однако, несмотря на большие различия в средних показателях РЭ при указанных стадиях РМЖ, статистический анализ достоверных различий не выявил (р=0,08).

Таблица 1.

Частота выявления и уровни РЭ в опухолях молочной железы с учетом стадии заболевания

Стадия Число больных РЭ обнаружены (%) Средний уровень РЭ (фмоль/мг белка) Медиана уропнп РЭ (фмоль/мг белка) Пределы колебании РЭ (фмоль/мг белка)

1а 23 52 105,59±31,11 70,2 10,7-382,5

На 47 62 62,63±12,58 42,0 11,4-331,4

Нб 35 60 89,31±16,69 75,9 12,3-352,8

Illa 11 25 13,2 + 26,4 - 13,2-26,4

Шб 22 54 43,51±13,61 21,8 10,1-126,7

Такие же закономерности выявлены НапБе1тап II. и Сепкт С. в 1983 году при исследовании опухолей молочной железы.

Вероятно, существует ряд факторов, которые могут быть связаны со снижением уровня РЭ в первичной опухоли. Это и местное распространение опухолевого процесса на ранних стадиях, а на поздних стадиях заболевания возможны большие участки некротизированных тканей исследованных образцов опухолей, а также более агрессивное течение процесса на поздних стадиях развития заболевания. В то же время, даже указанные причины могут приводить к резкому нарушению процессов клеточной регуляции и, вероятно, к определенной автономии клеток опухоли и, соответственно, к

снижению гормональной чувствительности РМЖ на более поздних стадиях заболевания.

На основании анализа данных, представленных в таблице 1, можно предположить, что агрессивность опухоли определенным образом связана с содержанием РЭ в первичных опухолях и чем более агрессивна опухоль, тем ниже в такой опухоли содержание РЭ.

Нами проведено сопоставление рецепторного статуса с гистологическим строением РМЖ. У 97 (69,3%) из 140 больных был диагностирован протоковый инфильтративный рак, у 27 (19,3%) - дольковый инфильтративный рак, у 9 (6,4%) — смешанный, у 3(2,1%) — cancer in situ, у 3 (2,1%) - слизистый, у 1 - рак Педжета. Данные по частоте выявления и содержанию РЭ в РМЖ с учетом гистологического строения опухоли представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Частота выявления и уровни РЭ в опухолях молочной железы с учетом гистологического строения опухоли

Морфологические варианты опухоли Число пациентов РЭ обнаружены (%) Средний уровень РЭ (фмоль/мг белка) Пределы колебаний РЭ (фмоль/мг белка), медиана

Протоковый 97 52 82,91±11,88 10,2-382,5

инфильтративный рак медиана 60,6

Дольковый 27 59 65,28±16,56 13,5-254,6

инфильтративный рак медиана 39,8

Смешанный рак 9 77 68,97±14,23 19,0-126,7 медиана 65,2

Рак т ¡¡1и 3 33 42,0 42,0

Слизистый рак 3 100 12,33±1,94 10,1-16,2

Рак Педжета 1 100 11,5 11,5

Наибольшая частота РЭ+ опухолей выявлена при слизистом раке, раке Педжета и смешанном РМЖ, возможно из-за небольшого числа больных.

Наиболее высокие уровни РЭ в опухоли обнаружены при протоковом инфильтративном РМЖ (82,9±11,8 фмоль/мг белка), а самые низкие - при слизистом (12,3±1,9 фмоль/мг белка), однако статистический анализ достоверности этих различий не подтвердил (р=0,15).

При втором по распространенности гистологическом варианте дольковом инфильтративном РМЖ частота выявления РЭ+ опухолей не отличалась от таковой при протоковом инфильтративном раке (59 и 52%, соответственно), а уровни РЭ как по средним показателям, так и по медиане были выше при протоковом инфильтративном раке (табл.2), однако статистических различий между показателями не выявлено (р=0,45).

Обнаружено, что с увеличением стадии заболевания как при протоковом инфильтративном, так и при дольковом инфильтративном РМЖ снижается число РЭ+ опухолей. Кроме того, при протоковом инфильтративном РМЖ, независимо от стадии заболевания, число РЭ+ опухолей было ниже, чем при дольковом инфильтративном раке.

Сравнительный анализ содержания РЭ+ в опухолях при протоковом инфильтративном и дольковом инфильтративном РМЖ с учетом стадии заболевания показал, что при 1-П стадиях заболевания различий в уровнях РЭ между выше указанными гистологическими вариантами опухолей не выявлено. При Ш-Р/ стадиях заболевания уровни РЭ были ниже при обоих рассматриваемых гистологических вариантах опухолей, чем при 1-И стадиях, однако, при протоковом инфильтративном РМЖ различия были более выраженными, чем при дольковом инфильтративном раке.

Под нашим наблюдением находились 63 больные в репродуктивном возрасте и 77 - в постменопаузе.

Среди больных репродуктивного возраста у 23 (37%) имели место РЭ+ опухоли, тогда как у пациенток в постменопаузе РЭ+ опухоли молочной железы обнаружены чаще - в 54 наблюдениях (68%).

Уровень РЭ в опухолях больных в постменопаузе составил 87,0±11,4 фмоль/мг белка (медиана - 69,9) и был достоверно выше, чем в опухолях больных репродуктивного возраста (45,3±8,3 фмоль/мг белка; медиана - 34,1) (р=0,0267).

Анализ частоты выявления и уровней РЭ при протоковом инфильтративном РМЖ также показал достоверные отличия между группами больных репродуктивного возраста и в постменопаузе: у первых частота выявления РЭ составила 33%, средний уровень - 38,9±8,8 фмоль/мг белка, у вторых - частота выявления РЭ - 63%, средний уровень - 98,8±14,9 фмоль/мг белка (р=0,031).

При дольковом инфильтративном РМЖ частота выявления РЭ+ опухолей также была выше у больных в постменопаузе, по сравнению с пациентками в репродуктивном возрасте (соответственно, 86 и 31%). Средний уровень РЭ в первой группе больных был также выше, чем во второй (69,8+19,6 и 51,4+34,2 фмоль/мг белка, соответственно). Однако, достоверных различий в уровнях РЭ при этом варианте РМЖ в двух возрастных группах больных не выявлено (р=0,65).

Таким образом, первичные опухоли у больных РМЖ в 56% случаев были рецепторположительными по РЭ, максимальные средние уровни РЭ отмечены при протоковом инфильтративном РМЖ и обнаружено также снижение уровней РЭ в опухоли с увеличением стадии заболевания. Не отмечено связи между возрастом больных и уровнем РЭ в первичной опухоли, однако у больных в постменопаузе, как частота выявления, так и уровни РЭ в опухоли были достоверно выше, чем у женщин в репродуктивном возрасте. Корреляционной зависимости между уровнем РЭ в опухоли и продолжительностью постменопаузы не отмечено.

Растворимый FAS-антиген в сыворотке крови больных новообразованиями молочной железы. Известно, что как нормальная ткань молочной железы, так и опухолевая экспрессируют рецептор Fas (Ragnarsson G.B. et al., 2000; Mullauer L. et al., 2000). Однако, клинических работ в доступной литературе не много и только Ueno Т. et al. (1999) опубликовали результаты исследования sFas в сыворотке крови больных РМЖ и показали его прогностическое значение в оценке показателей общей и безрецидивной выживаемости.

Нами проведено изучение уровней sFas в сыворотке крови 107 больных РМЖ, 22 - доброкачественными новообразованиями молочной железы и у 55 практически здоровых женщин соответствующего возраста, которые составили группу контроля.

Частота выявления sFas в крови у практически здоровых женщин составила 47% и была ниже, чем у больных раком и доброкачественными новообразованиями молочной железы (59 и 73%, соответственно) (табл.3).

Таблица 3.

Частота выявления и уровни sFas в сыворотке крови больных новообразованиями молочной железы н у практически здоровых женщин

Категории обследованных Число пациентов sFas обнаружен (%) Средним уровень sFas (нг/мл) Пределы колебании sFas (иг/мл), медиана

Здоровые женщины 55 47% 0,76±0,05' 0,56-1,34

(группа контроля) медиана 0,76

Рак молочной железы 107 59% 1,87±0,14" 0,43-5,78 медиана 1,73

Доброкачественные 22 73% 1,65±0,31J 0,40-3,24

новообразования медиана 1,2

молочной железы

Примечание: plvs2 < 0,05; plvs3 < 0,05.

Уровни растворимого Fas-антигена в сыворотке крови практически здоровых женщин также были наиболее низкими, как по средним показателям, так и по медиане (0,76±0,05 нг/мл; медиана - 0,76) и достоверно отличались от значений при РМЖ (1,87±0,14 нг/мл; медиана - 1,73; р=0,000004) и доброкачественных новообразованиях молочной железы (1,65±0,31 нг/мл; медиана - 1,2; р=0,001) (табл.3).

Не выявлено зависимости между частотой обнаружения, уровнем sFas и возрастом в контрольной группе (г=0,22).

Анализ уровня sFas в крови больных РМЖ и его связи с возрастом пациенток также показал отсутствие корреляционной зависимости между указанными показателями (г=-0,05).

Не выявлено зависимости между уровнями sFas в крови и возрастом в группе больных доброкачественными новообразованиями молочной железы (г=0,19).

Однако, подобный анализ с учетом гистологического строения новообразования, показал наличие отрицательной корреляционной связи в группе больных внутрипротоковой папилломой (г=-0,85). При фиброзно-кистозной болезни коэффициент корреляции был равен г=0,35, при фиброаденоме - г=0,37.

Частота выявления sFas в крови больных РМЖ с увеличением стадии заболевания снижалась. Так, при 1а стадии она составила 63%, при На - 68%, при Пб - 58%, при Illa - 55%, при Шб - 40%, а при IV - sFas в крови обследованных нами пациентов не обнаружено.

Уровни sFas в крови больных РМЖ с учетом стадии заболевания представлены в таблице 4. Следует отметить, что максимальные показатели sFas соответствовали 1а стадии заболевания - 2,13±0,48 нг/мл, а наиболее низкие - при Пб стадии (1,64±0,22 нг/мл). Однако несмотря на различия в средних показателях sFas при выше указанных стадиях РМЖ, статистический анализ достоверных различий не выявил (р=0,31).

Таблица 4.

Концентрация вРая в сыворотке крови больных раком молочной железы с учетом стадии заболевании

Стадия Число больных sFas обнаружен (%) Средний уровень sFas (иг/мл) Медиана sFas (нг/мл) Пределы колебании sFas (иг/мл)

1а 16 63 2,13±0,48 1,73 0,54-5,78

На 39 68 2,11±0,24 2,24 0,60-5,10

116 28 58 1,64±0,22 1,72 0,43-3,75

111а 9 55 2,08±0,56 1,49 0,78-3,65

Шб 15 40 . 1,71±0,41 1,76 0,45-2,90

Таким образом, при РМЖ с увеличением стадии заболевании отмечено снижение частоты выявления sFas в сыворотке крови больных, тогда как количественное содержание указанного рецептора в крови не зависело от стадии заболевания.

На следующем этапе исследования нами проведено сопоставление частоты выявления и уровней sFas в крови больных злокачественными и доброкачественными опухолями молочной железы с учетом гистологического строения новообразования.

В группе больных РМЖ у 79 женщин был диагностирован протоковый инфильтративный рак, у 1 б - дольковый инфильтративный рак, у б — смешанный, у 4 - cancer in situ, у 1 - слизистый, у 1 - рак Педжета. Данные по частоте выявления и содержанию sFas при РМЖ представлены в таблице 5.

Как видно из данных, приведенных в таблице 5, при протоковом и дольковом инфильтративном РМЖ, где число пациентов позволяет статистически сопоставить показатели, частота выявления sFas была выше при протоковом инфильтративном раке - 61% против 44% - при дольковом инфильтративном РМЖ. Средние уровни рецептора не различались у

больных протоковым и дольковым инфильтративным РМЖ и равнялись 1,94±0,18 и 1,63±0,24 нг/мл, соответственно, а медиана в обеих группах была одинаковая - 1,76 нг/мл. Следует обратить внимание на тот факт, что высокая частота обнаружения (100%) и низкие средние уровни sFas выявлены при раке in situ (0,91±0,26 нг/мл; медиана - 0,68 нг/мл), однако достоверных отличий с другими гистологическими вариантами РМЖ не отмечено, возможно, из-за небольшого числа наблюдений.

Таблица 5.

Частота выявления и уровни sFas в сыворотке крови больных РМЖ с учетом гистологического строения опухоли

Морфологические варианты опухоли Число больных sFas обнаружен (%) Средний уровень sFas (нг/мл) Пределы колебаний sFas (иг/мл), медиана

Протоковый инфильтративный рак 79 61 1,94±0,18 0,56-5,78 медиана 1,76

Дольковый инфильтративный рак 16 44 1,63±0,24 0,56-2,55 медиана 1,76

Смешанный рак 6 33 1,46+1,63 1,46; 1,63

Рак т¿Ни 4 100 0,91±0,26 0,68

Слизистый рак 1 100 1,27 1,27

Рак Педжета 1 100 2,9 2,9

Среди больных доброкачественными новообразованиями молочной железы у всех пациенток с папилломой был выявлен в крови Брав, тогда как при фиброаденоме, всего у 60% больных в крови присутствовал указанный рецептор апоптоза. Средние уровни Браэ были недостоверно выше при папилломе (2,00±0,61 нг/мл), чем при фиброаденоме (1,53±0,75 нг/мл), и не отличались от этого показателя при фиброзно-кистозной болезни (1,68±0,35 нг/мл).

Таким образом, при доброкачественных опухолях молочной железы, частота выявления Браэ в сыворотке крови больных папиломой и

фиброаденомой ниже, чем при фиброзно-кистозной болезни. Достоверных различий в уровнях Браэ у больных доброкачественными новообразованиями молочной железы нами не обнаружено.

Среди больных доброкачественными новообразованиями молочной железы было 16 женщин в репродуктивном возрасте и 6 - в постменопаузе. Среди больных репродуктивного возраста у 10 (63%) БРаэ выявлен в крови, тогда как у всех пациенток в постменопаузе обнаружены значимые уровни БраБ. Среднее содержание Браэ в сыворотке крови больных в постменопаузе составило 1,30±0,32 нг/мл (медиана 1,39), у женщин репродуктивного возраста - 1,86±0,46 нг/мл, статистический анализ достоверных отличий не выявил.

У 7 пациенток была первая фаза менструального цикла, у 9 - вторая. Частота выявления эРаэ в первой фазе составила 43%, во второй - 77%, средний уровень БраБ в крови был выше во второй фазе менструального цикла и равнялся 2,23±0,61 нг/мл, тогда как в первой, он составил 0,99±0,17 (Р=0,24).

Таким образом, у пациенток с доброкачественными новообразованиями молочной железы, наибольшая частота выявления Браэ отмечена у больных в постменопаузе; у женщин репродуктивного возраста во второй фазе менструального цикла уровень эРаэ в сыворотке крови был выше, чем в первой.

Анализ частоты выявления и уровней Браэ при РМЖ в группах больных репродуктивного возраста и в постменопаузе достоверных различий не показал: у первых частота выявления составила 57%, средний уровень -1,78±0,17 нг/мл; у вторых - частота выявления - 63%, средний уровень -1,86±0,22 нг/мл. Частота выявления Браэ в первой фазе составила 66%, во второй - 52%, уровень бРэб был незначительно выше у больных во второй фазе менструального цикла и равнялся 2,08±0,42 нг/мл, в первой он составил 1,71 ±0,24 нг/мл.

Таким образом, у больных в постменопаузе частота выявления sFas была выше при доброкачественных новообразованиях молочной железы, чем при РМЖ. У пациенток репродуктивного возраста в первой фазе менструального цикла частота выявления sFas была выше при РМЖ, тогда как во второй фазе - при доброкачественных новообразованиях молочной железы. Достоверных различий в уровнях sFas с учетом менструальной функции не отмечено.

Корреляционной зависимости между уровнем sFas в сыворотке крови и продолжительностью постменопаузы у больных РМЖ не отмечено. При доброкачественных новообразованиях выявлена положительная корреляционная связь между уровнем sFas и длительностью постменопаузы, коэффициент корреляции составил г=0,78.

Нами проведен анализ частоты выявления и уровней sFas в крови больных РМЖ с учетом наличия РЭ в опухоли. В крови больных с РЭ+ опухолями частота выявления sFas составила 64%, средний его уровень равнялся 1,93±0,19 нг/мл (медиана - 1,72). При отсутствии РЭ в опухоли частота выявления sFas составила 50%, средний уровень sFas - 1,90±0,25 нг/мл (медиана -1,80).

Таким образом, в крови больных РМЖ с РЭ+ опухолями, частота выявления sFas была выше, чем при РЭ- опухолях, достоверных различий между этими группами пациентов в уровнях sFas не отмечено. Корреляционный анализ показал отсутствие связи между уровнями sFas в сыворотке крови и РЭ в первичной опухоли у больных РМЖ (г=-0,03).

Интерлейкин-6 в сыворотке крови больных новообразованиями молочной железы. К числу известных ингибиторов апоптоза, в том числе и Fas-зависимого, относится интерлейкин-6 (IL-6/BSF-2/IFN beta 2) - мультифункциональный цитокин, который регулирует рост и дифференцировку клеток различных тканей и играет важную роль в иммунном ответе в острой фазе, воспалительного

процесса (Уатаэак! К. е1 а!., 1988; Л1ка И.Ь. е1 а1., 1998; Уазис1а N. е1 а1., 1998).

Нами проведено изучение уровней ИЛ-б в сыворотке крови 50 БраБ-иоложительных больных РМЖ, 13 - доброкачественными новообразованиями молочной железы и у 15 практически здоровых женщин соответствующего возраста.

Частота выявления ИЛ-6 в сыворотке крови у практически здоровых женщин составила 73%, тогда как у больных раком и доброкачественными новообразованиями молочной железы она была равна 100% (табл.6).

Таблица 6.

Частота выявления и уровни ИЛ-6 в сыворотке крови больных новообразованиями молочной железы и у практически здоровых

женщин

Группы обследованных Число больных ИЛ-б обнаружен (%) Средний уропепь ИЛ-6 (пг/мл) Пределы колебаний ИЛ-6 (пг/мл), медиана

Контрольная группа 15 73 1,56±0,23 0,17-2,81 медиана 1,49

Рак молочной железы 50 100 3,55±0,74 1,23-37,40 медиана 2,17

Доброкачественные новообразования молочной железы 13 100 5,96±3,51 1,56-48,08 медиана 2,70

Уровни ИЛ-6 в сыворотке крови практически здоровых женщин были более низкими, как по средним показателям, так и по медиане (1,56±0,23 пг/мл, медиана - 0,76), но достоверно не отличались от значений цитокина при РМЖ (3,55±0,74 пг/мл; медиана - 2,17; р=0,22) и доброкачественных новообразованиях молочной железы (5,96±3,51 пг/мл; медиана - 2,70; р=0,26) (табл.6).

Не выявлено зависимости между частотой обнаружения ИЛ-б, уровнем цитокина и возрастом в контрольной группе.

Анализ уровня ИЛ-6 в крови больных РМЖ в зависимости от возраста, показал отсутствие корреляционной связи между указанными параметрами (г=-0,0965). При протоковом инфильтративном РМЖ коэффициент корреляции между возрастом больных и уровнем ИЛ-6 в крови равнялся г=-0,30, при дольковом инфильтративном - г=-0,23. При протоковом инфильтративном РМЖ количество обследованных пациентов позволило изучить корреляционную связь между возрастом и уровнем ИЛ-6 с учетом стадии заболевания. При 1-Н стадии заболевания г=-0,26, при ПНУ -г=-0,46.

Таким образом, в общей группе больных РМЖ, отсутствовала корреляционная связь между уровнем ИЛ-6 в крови и возрастом больных, тогда как более детальный анализ показал наличие отрицательной корреляционной связи при распространенном протоковом инфильтративном РМЖ (г=-0,49).

В группе больных доброкачественными новообразованиями молочной железы коэффициент корреляции между возрастом больных и уровнем ИЛ-6 составил г=-0,42, а анализ с учетом гистологического строения новообразования показал наличие отрицательной корреляционной связи в группе больных доброкачественными опухолями (внутрипротоковая папиллома и фиброаденома) (г=-0,55) и при фиброзно-кистозной болезни (г=-0,54).

Таким образом, при доброкачественных новообразованиях молочной железы нами обнаружена отрицательная корреляционная связь межу уровнем ИЛ-6 в крови и возрастом больных.

Уровни ИЛ-6 в крови больных РМЖ с увеличением стадии заболевания снижались. При 1-П стадиях заболевания уровни цитокина в крови больных РМЖ колебались в пределах от 1,23 до 37,4 пг/мл и в среднем

составили 3,65±0,85 пг/мл, при НЫУ стадиях - пределы колебаний составили 1,46-7,28 пг/мл, при среднем уровне цитокина - 2,92±0,75 пг/мл.

Таблица 7.

Частота выявления и уровни ИЛ-6 в сыворотке крови больных РМЖ с уметом гистологического строения опухоли

Гистологические варианты опухоли Число больных ИЛ-6 обнаружен (%) Средний уровень ИЛ-6 (иг/мл) Пределы колебании ИЛ-6 (пг/мл), медиана

Протоковый инфильтративный рак 44 100 2,77±0,23 1,23-7,28 медиана 2,21

Дольковый инфильтративный рак 6 100 7,85±5,91 1,36-37,41 медиана 1,79

На следующем этапе исследования нами проведено сопоставление уровней ИЛ-6 в сыворотке крови больных злокачественными и доброкачественными опухолями молочной железы с учетом гистологического строения новообразования. В группе больных РМЖ железы у 44 женщин был диагностирован протоковый инфильтративный рак, у 6 - дольковый инфильтративный рак. Данные по содержанию ИЛ-6 при РМЖ представлены в таблице 7.

Как видно из данных, приведенных в таблице 7, средние уровни ИЛ-6 были выше при дольковом инфильтративном РМЖ, чем при протоковом (7,85±5,91 и 2,77±0,23 пг/мл, соответственно), а медиана - выше при протоковом инфильтративном раке (2,21 и 1,79 пг/мл, соответственно). Достоверных отличий между изучаемыми показателями в указанных группах не получено, возможно, из-за широких пределов колебания уровней цитокина в сыворотке крови.

Среди пациенток с доброкачественными новообразованиями молочной железы, нами обследовано 4 больные фиброзно-кистозной

болезнью и 9 - с фиброаденомой и внутрииротоковой папилломой. Средние уровни ИЛ-6 были недостоверно выше при фиброаденомах и внутрипротоковых папилломах молочной железы (7,69±5,05 пг/мл; пределы колебаний - 1,78-48,08 пг/мл; медиана - 3,07), чем при фиброзно-кистозной болезни (2,05±0,26 пг/мл; пределы колебаний - 1,56-2,71 пг/мл; медиана -1,97).

Таким образом, при доброкачественных новообразованиях молочной железы, достоверных различий в уровнях ИЛ-б с учетом их гистологического строения не отмечено.

Среди больных доброкачественными новообразованиями молочной железы было 9 женщин в репродуктивном возрасте и 4 - в постменопаузе. Среднее содержание ИЛ-6 в сыворотке крови больных в постменопаузе составило 2,74±0,39 пг/мл (пределы колебания - 1,56-3,23 пг/мл; медиана 3,09), у женщин в репродуктивном возрасте - 7,38±5,09 пг/мл (пределы колебания - 1,71-48,08 пг/мл; медиана - 2,24), статистический анализ достоверных отличий не показал. Максимальный показатель (48,08 пг/мл) обнаружен у пациентки 33 лет с папилломой молочной железы. Таким образом, у пациенток с доброкачественными новообразованиями молочной железы в постменопаузе среднее содержание ИЛ-6 в сыворотке крови было ниже, чем у женщин репродуктивного возраста, тогда как по медиане, наоборот, более высокие показатели выявлены у больных в постменопаузе, однако, статистический анализ достоверных различий в уровнях ИЛ-6 с учетом репродуктивной функции не показал. Анализ уровней ИЛ-6 при РМЖ в группах больных репродуктивного возраста и в постменопаузе был несколько выше в первой группе, однако статистический анализ достоверных различий не выявил: у первых средний уровень цитокина - 4,05±1,47 пг/мл, у вторых - 2,91±0,43 пг/мл.

У 15 пациенток была первая фаза менструального цикла, у 9 - вторая. Средний уровень ИЛ-6 в сыворотке крови был выше в первой фазе менструального цикла и равнялся 5,15±2,34 пг/мл, медиана - 2,28, тогда как во второй - ИЛ-6 был равен 2,21±0,24 пг/мл, медиана - 1,79 (р=0,35).

Таким образом, у больных в постменопаузе уровни ИЛ-6 как при доброкачественных новообразованиях молочной железы, так и при РМЖ, были ниже, чем у женщин в репродуктивном возрасте.

Корреляционной зависимости между уровнем ИЛ-6 в крови и продолжительностью постменопаузы у больных РМЖ не отмечено (г=-0,04). При доброкачественных новообразованиях выявлена достоверная отрицательная корреляционная связь между уровнем ИЛ-6 и длительностью постменопаузы, коэффициент корреляции составил г=-0,97.

Нами проведен анализ уровней ИЛ-6 в крови больных РМЖ с учетом наличия РЭ в опухоли. В крови больных с РЭ+ опухолями, средний уровень ИЛ-6 составил 2,91±0,44 пг/мл (медиана - 2,04). При отсутствии РЭ в опухоли средний уровень ИЛ-6 был равен 4,47±1,25 пг/мл (медиана - 2,46). При наиболее часто встречающемся протоковом инфильтративном РМЖ средние уровни ИЛ-6 при РЭ+ и РЭ- опухолях практически не отличались, тогда как по медиане показатели были выше у пациентов с РЭ- опухолями молочной железы: 2,70±0,38 пг/мл, медиана - 2,06 и 2,94±0,30 пг/мл, медиана - 2,58, соответственно.

Таким образом, в крови больных с РЭ+ опухолями уровень ИЛ-6 был недостоверно ниже, чем при РЭ- опухолях (р=0,31).

Корреляционный анализ показал отсутствие связи между уровнями ИЛ-6 в крови и уровни РЭ в опухоли у больных РМЖ (г=-0,14). У пациентов при 1-Н стадиях заболевания коэффициент корреляции между указанными параметрами равнялся г=-0,15, при Ш-1У - г=0,01. Анализ коэффициентов корреляции между уровнями ИЛ-6 в крови и показателями РЭ в опухоли, при

протоковом и дольковом инфильтративном РМЖ, показал, что при протоковом раке он равнялся г=-0,16, при дольковом - г=-0,29.

Таким образом, корреляционная связь между уровнями ИЛ-6 в крови и РЭ - в опухоли при РМЖ отсутствовала, независимо от стадии заболевания и гистологического строения опухоли.

Следующий этап нашего исследования был посвящен анализу содержания ИЛ-6 в крови пациенток с учетом репродуктивной функции и РЭ в опухоли. При РЭ+ опухолях у пациенток в постменопаузе показатели содержания ИЛ-6 были ниже, чем при РЭ- опухолях - 2,76±0,5б пг/мл (медиана - 2,02) и 3,35±0,60 пг/мл (медиана - 2,71), соответственно.

У женщин в репродуктивном возрасте, как и у пациенток в постменопаузе, также при РЭ- опухолях, уровни ИЛ-6 в сыворотке крови были выше, чем при РЭ+ опухолях: 2,84±0,69 пг/мл (медиана - 2,03) и 5,03±2,50 пг/мл (медиана - 2,26).

Таким образом, у больных РМЖ с РЭ- опухолью, независимо от репродуктивной функции, уровни ИЛ-6 в крови были выше, чем при РЭ+ опухолях. Кроме того, у женщин репродуктивного возраста они были выше, чем у пациенток в постменопаузе.

Как было указано ранее, представленные нами данные по исследованию уровней ИЛ-6 в крови больных с патологией молочной железы проводились у пациентов с наличием Браэ в сыворотке крови. Корреляционной связи между уровнями ИЛ-6 и эРаБ крови не обнаружено (г=0,20).

При доброкачественных новообразованиях молочной железы коэффициент корреляции между БраБ и ИЛ-6 в сыворотке крови равнялся г=0,31. Дополнительный корреляционный анализ между уровнями эРаэ и ИЛ-6 в крови больных фиброаденомой и внутрипротоковой папилломой молочной железы не выявил зависимости (г=0,37), тогда как при фиброзно- | кистозной болезни - г=-0,92.

При РМЖ коэффициент корреляции между указанными параметрами составил г=0,06. У пациенток при 1-Н стадиях заболевания, как и в общей группе больных РМЖ, коэффициент корреляции между показателями БРаэ и ИЛ-6 в крови был положительным и равнялся г=0,08, тогда как при Ш-1У -г=-0,54. Еще более высокий показатель отрицательной корреляционной связи между эРаБ и ИЛ-6 был обнаружен у больных протоковым инфильтративным РМЖ при Ш-1У стадиях (г=-0,66). Достоверная корреляционная связь между уровнями эРаэ и ИЛ-6 в крови больных РМЖ с учетом РЭ отсутствовала как при РЭ+, так и при РЭ- опухолях. Однако у РЭ+ пациентов коэффициент корреляции был равен г=0,23, при РЭ-опухолях - г=-0,01.

Таким образом, нами обнаружена отрицательная корреляционная связь между уровнями БраБ и ИЛ-6 в крови больных фиброзно-кистозной болезнью (г=-0,92) и РМЖ - при Ш-1У стадиях опухолевого процесса (г=-0,54).

Экспрессия \ZEGF в первичной опухоли больных раком молочной железы. В настоящее время уже не вызывает сомнения тот факт, что опухоль не может развиваться и расти без образования в ней новой сети сосудов (РтШсы в. е1 а1., 1996). Интерес к этой проблеме возник более 30 лет назад и основоположником теории неоангиогенеза в опухолях большинство исследователей считают Ро1ктап 1. (1985).

Вместе с тем, до недавнего времени основной характеристикой активности неоангиогенеза в опухолях была микроскопическая оценка плотности сосудов в опухолевой ткани, и только в последние 10 лет, в результате изучения молекулярных механизмов ангиогенеза в опухолях, было продемонстрировано наличие целого ряда регуляторных ангиогенных и антиангиогенных факторов, которые обеспечивают формирование и развитие новых сосудов внутри опухоли, в том числе и РМЖ (Е.С.Герштейн, Н.Е.Кушлинский, 2002).

Однако, наиболее значимым стимулятором неоангиогенеза в РМЖ бесспорно является VEGF (Folkman J., 1985). Особенность этого фактора заключается в том, что, в отличие от всех других факторов, положительно стимулирующих неоангиогенез в опухоли, VEGF является активным митогеном Только по отношению к эндотелиальным клеткам (Ferrara N., 1995). Кроме того, считается, что в тканях основной изоформой VEGF является VEGF-165.

С использованием иммуногистохимического метода нами изучены маркер неоангиогенеза - VEGF и параллельно с ним экспрессия маркера пролиферативной активности антигена Ki-67 в 20 первичных злокачественных опухолях молочной железы (в 20 парафиновых гистологических блоках). Все эти больные получали лечение и находились под наблюдением в Российском онкологическом научном центре им. Н.Н.Блохина РАМН с 1997 года.

Иммуногистохимическое исследование VEGF проведено в двух группах больных РМЖ. У всех диагноз подтвержден данными гистологического исследования удаленной опухоли и до проведения иммуногистохимического исследования пациентки не получали специфического лечения.

В I группу вошли 8 больных РМЖ в возрасте от 37 до 69 лет, которые имели следующие стадии заболевания: TjNoMo - 2; T2N1M0- 1; T2N2M0- 1; T3N,M0-2; T4N,M0- 1; T4N2M,- 1.

Дольковый инфильтративный РМЖ выявлен у 3 больных, протоковый инфильтративный рак - у 5.

Больным выполнены следующие операции: радикальная мастэктомия с сохранением обеих грудных мышц - 7, радикальная резекция - 1 пациентке.

Всем больным проведено определение РЭ в цитозольной фракции опухоли общепринятым радиолигандным методом. Рецепторы эстрогенов

выявлены в опухоли у 3 больных (37,5%) и равнялись 12, 31 и 40 фмоль/мг Зелка.

В послеоперационном периоде 4 больным проводили курс лучевой терапии - СОД 46 Гр (РОД - 2 Гр).

Также в послеоперационном периоде 7 больным проводили различные курсы химиотерапии: по схеме CMF - 4 больных, а остальным 3 больным по :хеме FAP, CAF, таксотер + адриабластин. Всем больным был назначен гамоксифен по 20-40 мг ежедневно.

Все больные были оперированы в 1997г. За период наблюдения у Зольных РМЖ I группы возникли рецидивы или отдаленные метастазы в течение 5-30 месяцев от начала лечения. Так, метастазы в кости выявлены у 3 Зольных; метастазы в печени - у 2; метастазы в легких - у 2; у одной 1ациентки обнаружен рецидив в послеоперационном рубце через 7 месяцев эт начала лечения и метастазы в печени и лимфатических узлах ладключичной области.

Во II группу вошли 12 больных РМЖ в возрасте от 35 до 68 лет, которые имели следующие стадии заболевания: T2N0M0 - 3; T2N]M0 - 4; r3N1Mo-3;T4N,Mo-2.

При гистологическом исследовании опухолей дольковый шфильтративный РМЖ выявлен у 4 больных; протоковый инфильтративный }ак - у 7; низкодифференцированный плоскоклеточный рак - у 1 пациентки.

В предоперационном периоде 11 больным специфическое лечение не доводили. Только одной больной РМЖ (стадия - T4N1M0) была проведена 1еоадъювантная терапия - лучевая терапия (СОД - 32 Гр; РОД - 2 Гр) и шмиотерапия по схеме Купера (CMF + винкристин).

Больным выполнены следующие операции: радикальная мастэктомия с охранением обеих грудных мышц - 10 больным; радикальная резекция - 2 [ациенткам.

Таблица 8.

Особенности экспрессии УЕвР и Ю-67 в опухолях молочной железы

№ больного н группы Возраст (годы) Стадия Гистология опухоли Уровень РЭ (фмоль/мг белка) УЕСР Индекс Ю-67

1 1. 37 ТаЫоМо ДИР 31 2 19,9

2. 64 ТзМ|Мо ПИР 0 3 26,5

3- 51 тмо ПИР 0 3 38,5

4. 69 Т4Ы2Мо ДИР 0 4 25,2

5. 69 ТгЫоМо ПИР 7,0 2,5 30,5

6. 67 Т4М2М, ПИР 40 4 29,0

7. 57 ТзМ,Мо ДИР 0 3,5 12,2

8. 56 Т^Мо ПИР 12 3,5 24,5

И 1. 49 Тз^Мо ПИР 18 0,5 14

2. 61 Т2Ы0М0 ДИР 21 1,5 12,3

3. 72 Т2Ы1М0 ДИР 12 1,5 18,5

4. 35 Т3Ы|Мо ПИР 0 1 11

5. 53 Т2Н|М0 ПИР 0 2 11

6. 43 Т4М,М0 *) 20 1 14

7. 68 Т2ЫоМо ПИР 0 0,5 14

8. 59 Т2^Мо ДИР 7,0 2 16,2

9. 44 Т2Ы,М0 ПИР 5,6 2 17,8

10. 41 Тз1Ч,Мо ДИР 16,8 2 13,8

11. 39 ПИР 7,4 1,5 21,8

12. 40 ТзГ^Мо ПИР 0 1 14

Примечание: экспрессия УЕвР выражена в баллах (см. раздел «Материалы и методы исследования»); *) - низкодифференцированный плоскоклеточный рак.

Всем больных проведено определение РЭ в цитозольной фракции опухоли. Рецепторы эстрогенов выявлены у 6 больных (50,5%) в опухоли и их уровни колебались от 12 до 21 фмоль/мг белка.

Больным проводили следующую адъювантную терапию: лучевую терапию - 1; полихимиотерапию - 7 (по схеме СМИ - 5, по схеме САР - 1, по ;хеме САР - 1). У 4 больных была проведена лучевая + полихимиотерапия. Эдна пациентка от проведения адъювантной полихимиотерапии отказалась. Цвум больным назначен тамоксифен по 20-40 мг ежедневно.

Все больные РМЖ II группы прослежены с января 1997 г. по февраль 2002 г. За данный период времени ни у одной из них не выявлено рецидива ¡аболевания.

Результаты сравнительного иммуногистохимического изучения экспрессии УЕвР и индекса пролиферативной активности антигена Кл-67 в эпухолях молочной железы представлены в таблице 8.

Следует отметить, что наиболее высокие показатели экспрессии УЕйР [по степени выраженности окраски цитоплазмы), по данным иммуногистохимической реакции, обнаружены в опухолях молочной железы у больных I группы, у которых рецидив РМЖ выявлен в течение первых лет от начала терапии, по сравнению со II группой пациенток с более благоприятным течением болезни (табл.8).

Так, в I группе больных РМЖ рецидив заболевания возник в сроки от 5 цо 30 месяцев от начала лечения, в основном, это в первый год-у 5 больных; во второй год - у 2 и в третий год - у 1 одной пациентки (табл.8). Тогда как у пациенток II группы в сроки наблюдения 4,5-5,0 лет не было выявлено рецидива болезни.

При сравнении медиан уровня экспрессии УЕвР в опухолях у I и II групп пациенток было выявлено, что они равнялись 3,1 и 1,4 баллов (р<0,05), соответственно (табл.8).

Подобные результаты отмечены и при анализе результатов шмуногистохимического исследования индекса пролиферативной 1КТИВНОСТИ антигена Кл-67 (количественный метод, ядерная окраска) в пухолях больных РМЖ I и II групп. Показано, что медиана индекса Кл-67

была достоверно выше в опухолях молочной железы у больных в неблагоприятной по прогнозу I группе пациенток (25,7) по сравнению со II группой (14,9) (р<0,05).

У больных II группы прогноз заболевания был благоприятным и пациентки этой группы не имели рецидива болезни в течение 4,5-5,0 лет после окончания лечения.

У преобладающего числа больных РМЖ II группы в первичных опухолях отмечена слабая или умеренная экспрессия VEGF. Все эти больные получали лечение в РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН с 1997 года и по настоящее время находятся под наблюдением в поликлинике Центра. При этом, ни у одной из них не выявлено рецидива заболевания за прошедшие 4,5-5,0 лет.

Следует также отметить, что экспрессия антигена пролиферативной ативности Ki-67 в опухолях больных II группы была также слабой или умеренной (табл.8).

Таким образом, представленные нами данные сравнительного иммуногистохимического исследования РМЖ на предмет анализа уровней экспрессии ключевого фактора, положительно стимулирующего неоангиогенез в первичной опухоли, а именно, VEGF, указывают на то, что усиленная его экспрессия характерна для опухолей больных с неблагоприятным прогнозом заболевания. У всех этих пациенток выявлен рецидив болезни в ранние сроки от начала лечения. Параллельно с VEGF в опухолях этой группы больных РМЖ отмечен повышенный индекс пролиферативной активности антигена Ki-67. Данный маркер может быть также использован в оценке прогноза заболевания.

Аналогичные данные получены Kranz А. et al. (1999), однако эти авторы обнаружили рецепторы VEGF (KDR) также и на клетках эпителия протоков молочной железы. Имеются и другие свидетельства того, что на клетках РМЖ находятся рецепторы VEGF (flt-1 и flk-1), причем уровень

экспрессии VEGF и рецептора flk-1 коррелирует с индексом пролиферации опухолевых клеток, определяемым по экспрессии антигена Ki-67 (Xie В. et al., 1999). Показано (Speirs V. & Atkin S., 1999), что как опухолевые, так и стромальные клетки, выделенные из первичных карцином молочной железы человека, продуцируют VEGF ш vitro, и уровень его продукции значительно выше, чем у соответствующих клеток, выделенных из нормальной молочной железы. При этом методом ПЦР анализа показано, что в опухолевых клетках преобладает рецептор VEGF-2 (KDR/flk-1), а в стромальных клетках экспрессируется только рецептор VEGF-1 (flt-1). Таким образом, помимо своей прямой функции - стимуляции неоангиогенеза, VEGF при РМЖ может играть также и роль ауто/паракринного регулятора пролиферации опухолевых и/или стромальных клеток.

Предполагается, что VEGF может играть при РМЖ и еще одну роль: через рецепторы flt-1 он стимулирует миграцию в опухолевую ткань макрофагов, которые, в свою очередь, являются стимуляторами ангиогенеза, так как синтезируют различные ангиогенные факторы, в том числе и сам VEGF. В частности, Leek R. et al. (2000), исследовав образцы тканей 96 больных РМЖ, продемонстрировали положительную корреляцию между индексом инфильтрации опухолевой ткани макрофагами и уровнем экспрессии VEGF.

Учитывая важную роль ангиогенеза в поддержании роста и распространения РМЖ и ключевую роль VEGF в этом процессе, многие авторы уже довольно давно пришли к выводу, что целенаправленное подавление экспрессии VEGF-зависимого ангиогенеза и/или его эффектов может стать мишенью противоопухолевой терапии, а также перспективным подходом к разработке новых схем адъювантного лечения этого заболевания (Harris A. et al., 1996; Harris А., 1998).

Таким образом, проведенный нами иммуноферментный анализ содержания sFas-антигена и ИЛ-6 в сыворотке первичных больных РМЖ

позволил выявить связь исследуемых показателей с основными клиническими и морфологическими характеристиками заболевания, гормональной чувствительностью опухоли и прогнозом болезни. С помощью иммуногистохимического исследования проведен анализ уровней экспрессии УЕОР и антигена пролиферативной активности Кл-67 в первичной опухоли и доказана их важная роль в прогнозе безрецидивной выживаемости больных РМЖ. Кроме того, настоящая работа представляет практический интерес для анализа роли Брав и ИЛ-6 в сыворотке крови больных РМЖ при оценке клинического течения заболевания. При этом, доказано, что сравнительное исследование содержания ББаБ и ИЛ-6 в сыворотке крови больных РМЖ может быть использовано как критерий прогноза болезни, а также в последующем после дополнительных исследований возможно введение в схемы комплексной терапии РМЖ препаратов, влияющих на экспрессию БраБ и ИЛ-6. Количественное определение уровней Браэ и ИЛ-6 в сыворотке крови больных РМЖ в сочетании с другими клиническими, морфологическими и биохимическими показателями позволит дифференцированно подходить к выбору методов лечения этой категории пациентов.

ВЫВОДЫ

¡.Установлено, что частота выявления (47%) и количественные токазатели ингибитора апоптоза - растворимого РаБ-антигена (0,76+0,05 1г/мл, медиана - 0,76) в сыворотке крови практически здоровых женщин 5ыли достоверно ниже (р<0,001), чем у больных раком (59%; 1,87+0,14 иг/мл; медиана - 1,73) и доброкачественными новообразованиями (73%; 1,65+0,31 нг/мл; медиана - 1,2) молочной железы. У пациенток с внутрипротоковой папилломой молочной железы выявлена отрицательная корреляционная связь между уровнем растворимого Раз-антигена в сыворотке крови и возрастом больных (г=-0,85).

2. У больных раком молочной железы с увеличением стадии заболевании обнаружено снижение частоты выявления ингибитора апоптоза - растворимого Раз-антигена в сыворотке крови, тогда как количественное содержание данного рецептора достоверно не изменялось.

3. Показано, что частота обнаружения растворимого Раз-антигена в сыворотке крови больных внутрипротоковой папилломой или фиброаденомой молочной железы в 1,3 раза ниже, чем при фиброзно-кистозной болезни, однако достоверных различий в уровнях исследуемого рецептора между этими группами пациенток не выявлено.

4. При сравнительном анализе не обнаружено достоверных различий в показателях растворимого Раз-антигена и частоты его выявления в сыворотке крови больных раком молочной железы в репродуктивном возрасте и постменопаузе. Тогда как, при доброкачественных новообразованиях молочной железы обнаружено повышение в 1,6 раз частоты выявления Раз-антигена в сыворотке крови у больных в постменопаузе, но без достоверных различий в уровнях рецептора.

5. У больных раком молочной железы с наличием в опухоли РЭ, частота выявления растворимого Раз-антигена в сыворотке крови была выше, чем при РЭ- опухолях, однако достоверных различий в уровнях

исследуемого рецептора апоптоза не отмечено. Не обнаружено также корреляционной зависимости между уровнями растворимого Раз-антигена в сыворотке крови и РЭ в первичной опухоли (г=-0,03).

6. Показано, что у больных раком и доброкачественными новообразованиями молочной железы интерлейкин-6 выявляется в 1,4 раза чаще, чем у практически здоровых женщин соответствующего возраста, однако, достоверных различий между обследованными группами в уровнях цитокина, не выявлено. Не обнаружено зависимости между частотой выявления, уровнем интерлейкина-6 и возрастом в сыворотке крови практически здоровых женщин и больных раком молочной железы. При доброкачественных новообразованиях молочной железы выявлена отрицательная корреляционная связь (г=-0,42) между уровнем интерлейкина-6 и возрастом больных.

7. Не выявлено зависимости показателей интерлейкина-6 в сыворотке крови от гитологического строения рака молочной железы и доброкачественных новообразований этого органа. Однако, у больных доброкачественными новообразованиями молочной железы установлена достоверная отрицательная корреляционная связь (г=-0,97) между концентрацией цитокина в крови и длительностью постменопаузы.

8. Выявлено, что у больных раком молочной железы отсутствовала корреляционная связь между показателями интерлейкина-6 в сыворотке крови и РЭ в опухоли независимо от стадии заболевания и гистологического строения опухоли.

9. Установлено, что у больных раком молочной железы с РЭ-опухолями, независимо от репродуктивной функции, показатели интерлейкина-б в сыворотке крови были в 1,5 выше, чем у пациенток с РЭ+ опухолями. При этом, максимальные показатели цитокина обнаружены в крови у женщин репродуктивного возраста.

10. Выявлена отрицательная корреляционная связь между уровнем бРяб и интерлейкином-б в сыворотке крови у больных фиброзно-кистозной болезнью (г=-0,92) и раком молочной железы в Ш-1У стадиях опухолевого процесса (г=-0,54).

11. С помощью иммуногистохимических исследований молекулярно-биологических маркеров в первичных злокачественных опухолях молочной железы выявлена экспрессия фактора роста эндотелия сосудов и высокий индекс пролиферативной активности антигена Кл-67. Установлена корреляция между индексом пролиферативной активности опухоли и показателем экспрессии фактора роста эндотелия сосудов.

12. Доказана связь между иммуногистохимическими индексом высокой пролиферативной активности антигена Кл-67, экспрессией фактора роста эндотелия сосудов в первичной опухоли и прогнозом рака молочной железы. У больных, опухоли которых характеризовались высокой экспрессией фактора роста эндотелия сосудов и индекса Кл-67, выявлен в течение первого года наблюдения ранний возврат болезни в виде локального рецидива или отдаленных метастазов.

13. Высокий уровень УЕвР является фактором неблагоприятного прогноза рака молочной железы как на ранних, так и на поздних стадиях заболевания, характеризует низкую чувствительность первичной опухоли к химиотерапии.

Работы, опубликованные по теме диссертации

1. Создание тест-системы для количественного определения растворимого Раз-антигена в сыворотке крови человека // Бюлл.экспер.биол. мед. - 1999.-№3.-с.23-53 (в соавторстве с С.Г.Аббасовой, Н.Е.Кушлинским).

2. Растворимый Р аз-антиген в сыворотке крови онкологических больных // Бюлл.экспер.биол.мед. - 1999.-№3.-с.320-323 (в соавторстве с Н.Е.Кушлинским, А.Н.Мурашовым, С.Г.Аббасовой).

3. Современные представления о роли апоптоза в опухолевом процессе и его значение для противоопухолевой терапии // Экспериментальная онкология.-1999.-т.20.-с.250-268 (в соавторстве с Н.Е.Кушлинским, М.И.Нечушкиным).

4. Рецепторы эпидермального фактора роста и их лиганды как молекулярные маркеры прогноза и гормоночувствительности рака молочной железы // Клиническая лабораторная диагностика,-1999.-№2.-с.9-13 (в соавторстве с Н.Е.Кушлинским, Е.С.Герштейн, Е.К.Дворовой, О.И.Костылевой, В.П.Летягиным).

5. Клинические перспективы исследования рецепторов эпидермального фактора роста в опухолях человека // Экпериментальная и клиническая фармакология. - 1999. - №2. - с.74-80 (в соавторстве с Н.Е.Кушлинским, Е.С.Герштейн).

6. Клинические исследования растворимого Раз-антигена в сыворотке крови онкологических больных // Тезисы докладов онкологической научной конференции «Проблемы клинической онкологии». Душанбе.-1999.- с.10-14 (в соавторстве с Н.Н.Трапезниковым, Н.Е.Кушлинским, И.А.Костанян, Ю.Н.Соловьевым, С.Г.Аббасовой, М.Н.Обушевой, С.О.Никогосян, В.М.Липкиным).

7. Интерлейкин-6 в сыворотке крови больных новообразованиями молочной железы // Бюлл.экспер.биол.мед.-2001.-№5.-с.340-346 (в соавторстве Н.Е.Кушлинским, М.И.Нечушкиным).

8. Экспрессия фактора роста эндотелия сосудов (УЕОР) и Кл-67 в первичной опухоли больных раком молочной железы // Вестник РАМН,-2002.-№5.-с.54-58 (в соавторстве с Н.Е.Кушлинским, Л.Е.Гуревич, И.А.Казанцевой).

9. Расворимый РаБ-антиген в сыворотке крови больных новообразованиями молочной железы // Вопросы биологической, медицины и фармацевтической химии.-2002.-№4.-с.38-47 (в соавторстве с Н.Е.Кушлинским, С.Г.Аббасовой).

10. Расворимый Раз-антиген в сыворотке крови больных раком и доброкачественными нововобразованиями яичников и его клиническое значение // Экспериментальная и клиническая фармакология.-2000.-№3.-с.50-55 (в соавторстве с М.Н.Обушевой, Н.Е.Кушлинским).

11. Уровень ингибитора апоптоза - растворимого Раз-антигена в сыворотке крови больных раком молочной железы // Тезисы доклада на IX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство». - Москва, 8-12 апреля.-2002.-с.514 (в соавторстве с С.Г.Аббасовой, Т.Т.Тагиевой, В.М.Липкиным).

12. Экспрессия фактора роста эндотелия сосудов в первичной опухоли больных раком молочной железы // Тезисы докладов в сборнике научных трудов онкодиспансера г.Челябинска. Челябинск, май 2002. - с.21-24 (в соавторстве с Н.Е.Кушлинским, М.И.Нечушкиным).

13. Клинические исследования растворимого РаБ-антигена в сыворотке крови больных раком молочной железы // Тезисы докладов в сборнике научных трудов онкодиспансера г.Челябинска. Челябинск, май 2002.-С.25-27 (в соавторстве с Н.Е.Кушлинским, М.И.Нечушкиным).

14. Рецепторы стероидных гормонов в опухолях молочной железы. Под. Редакцией Н.Е.Кушлинского, С.М.Портного, К.П.Лактионова // Глава в монографии «Рак молочной железы». - Редакционно-издательский совет при Президиуме РАМН.-2002.-С.128-156.