Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Растворимый Fas при онкологических заболеваниях



На правах рукописи

АББАСОВА СВЕТЛАНА ГЕОРГИЕВНА

Растворимый Fas при онкологических заболеваниях

14.00.14. - онкология 03.00.04. - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА-2008

003465553

Работа выполнена в Российском онкологическом научном центре им. H.H. Блохина РАМН

Научные консультанты:

Член-корреспондент РАМН, профессор Н.Е.Кушлинский Член-корреспондент РАН, профессор В.М. Лишаш

Официальные оппоненты:

Заведующий лабораторией молекулярной эндокринологии НИИ канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, доктор биологических наук, профессор Красильников Михаил Александрович

Заместитель Генерального директора ОАО «Всероссийский научный центр диагностики и лечения», заведующий отделом биотехнологии ВНЦЦЛ, доктор биологических наук, профессор Свешников Петр Георгиевич

Заведующий лабораторией прогноза эффективности консервативной терапии опухолей ФГУ «Московский НИИ онкологии им. П.А. Герцена Росмедбиотехнологий», доктор биологических наук, профессор Сергеева Наталья Сергеевна

Ведущая организация:

ФГУ Российский научный центр рентгенорадиологии МЗ и СР РФ

заседании Диссертационного совета (Д.001.017.02) ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН по адресу: 115478, г.Москва, Каширское шоссе, 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН (115478, г.Москва, Каширское шоссе, 24)

Защита диссертации состоится

часов на

Автореферат разослан ¿¿Sfiffitf 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Барсуков Ю.А.

Список условных сокращений

ДОМЖ - доброкачественные опухоли молочной железы

ДОЯ - доброкачественные опухоли яичников

ДТЗ - диффузный токсический зоб

ИФА - иммуноферментный анализ

КРР - колоректальный рак

МА - моноклональные антитела

НК - натуральные киллеры

РМЖ - рак молочной железы

РТМ - рак тела матки

РЩЖ - рак щитовидной железы

РЯ - рак яичников

УКЗ - узловой коллоидный зоб

ЦТЛ - цитотоксические лимфоциты

ЩФ - щелочная фосфатаза

FADD - белок, содержащий домен смерти, ассоциированный с активированным Fas

FasL - Fas-лиганд

FLICE - FADD-подобная ICE-протеаза

FLIP - FLICE-ингибирующий белок

IFN - интерферон

IL - интерлейкин

sFas - растворимый Fas

uPA - активатор плазминогена урокиназного типа VEGF - фактор роста эндотелия сосудов

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы. Гомеостаз многоклеточного организма поддерживается точно выверенным балансом между процессами пролиферации, дифференцировки и гибели клеток. Одним из основных механизмов элиминации опасных для организма клеток, к числу которых относятся вирус-инфицированные, опухолевые клетки, а также клетки, закончившие свой жизненный цикл, является апоптоз, или программированная клеточная гибель. Это очень сложный механизм, на различных этапах которого задействованы многочисленные факторы и рецепторы клеточной гибели, а также ряд адапторных белков, приводящий, в конечном итоге, к активации внутриклеточных протеаз и самоуничтожению опасной для организма клетки. Любые сбои в этом сложном процессе приводят к развитию серьезных патологий, в том числе к возникновению и росту злокачественных опухолей. Злокачественность новообразований определяется не только огромным пролиферативным потенциалом составляющих их клеток, но и устойчивостью этих клеток к действию факторов, регулирующих процессы дифференцировки и клеточной гибели.

Fas/APO-l/CD95 - является одним из ключевых рецепторов, запускающих программу самоуничтожения клетки (Itoh и соавт., 1991; Oehm и соавт., 1992). Экспрессия Fas показана почти во всех органах - в тимусе, почках, печени, сердце, легких, он также экспонирован на поверхности активированных лимфоцитов, натуральных киллеров, вирус-инфицированных и опухолевых клеток (Nagata and Golstein, 1995),

Индукция Fas-опосредовшшого апоптоза в клетке происходит после взаимодействия Fas с его яигандом - FasL. Механизм Fas-опосредованного апоптоза хорошо изучен: идентифицированы основные белки, участвующие в передаче алоптотического сигнала от активированного Fas, установлены их структура и функции. Устойчивость клеток к Fas-зависимому апоптозу определяется как нарушениями в экспрессии, структуре, и функционировании белков, опосредующих Fas-зависимый апоптоз, так и повышенной продукцией растворимого Fas (sFas) этими клетками. Растворимый Fas дистантно ингибирует действие FasL, позволяя клеткам-продуцентам растворимого Fas уйта от противоопухолевой защиты организма. С помощью молекулярно-биологических методов было показано, что sFas является продуктом альтернативного сплайсинга полноразмерной мРНК Fas (Cheng и соавт., 1994; Cascino и соавт., 1995). Идентифицировано несколько растворимых изоформ Fas, среди которых преобладает одна - FasdelTM, или FasExoóDel, остальные изоформы продуцируются в незначительных количествах (Cascino и соавт., 1995; Cascino и соавт., 1996).

Актуальность настоящего исследования определяется необходимостью определения значения растворимого Fas в сыворотке крови при онкологических заболеваниях различного гистогенеза и локализации в прогнозе заболевания, а также в оценке устойчивости опухоли к применяемой терапии в конкретной клинической ситуации.

Цель исследования - Разработка и характеристика сэндвич-ИФА для определения концентрации растворимого Fas в сыворотке крови, изучение связи показателей sFas с основными клиническими, морфологическими и некоторыми биохимическими характеристиками опухолевых процессов и его значения в прогнозе онкологических заболеваний.

Задачи исследования:

1. Охарактеризовать разработанный нами сэндвич-ИФА для количественного определения sFas в сыворотке крови человека - оценить предел детекции тест-системы и воспроизводимость результатов анализа. Дать иммунохимическую характеристику моноклональных антител (МА), на основе которых разработан сэндвич-ИФА.

2. С помощью пептидного фагового дисплея определить структуру эпитопов для МА к полноразмерному Fas человека, на основе которых разработан сэндвич-ИФА, с целью выявления спектра изоформ sFas, которые должна детектировать разработанная тест-система.

3. Определить концентрацию sFas в сыворотке крови онкологических больных с наиболее часто выявляемыми опухолями (новообразования молочной железы, яичников, эндометрия, костей, толстой кишки, надпочечников и щитовидной железы) и провести анализ показателей sFas в зависимости от основных клинических, морфологических и некоторых биохимических критериев опухолевых процессов и определить его значение в прогнозе заболеваний.

4. Изучить корреляцию показателей sFas в сыворотке крови онкологических больных с показателями наиболее важных патогенетических факторов: активатора процесса неоангиогенеза в опухоли - VEGF, провоспалителыюго цитокина, ингибитора Fas-зависимого алоптоза - IL-6, уровня содержания рецепторов эстрогенов в опухоли при раке молочной железы, общей активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови при новообразованиях костей, уровня содержания активатора плазминогена (иРА) в ткани опухолей щитовидной железы.

Научная новизна. Разработана и охарактеризована оригинальная отечественная тест-система для количественного определения растворимого Fas в сыворотке крови человека, не уступающая аналогичным тест-системам, описанным в литературе. С помощью разработанной тест-системы впервые на большом клиническом материале определена концентрация и проведен анализ показателей растворимого Fas в сыворотке крови больных новообразованиями различного морфогенеза и локализации в сравнении с соответствующими показателями практически здоровых людей. Впервые определены связь sFas с основными клиническими, морфологическими и некоторыми биохимическими характеристиками опухолевых процессов и его значение в прогнозе заболевания при раке яичников, раке тела матки, раке коры надпочечников и остеогенной

саркоме, а также предиктивное значение sFas в оценке эффективности неоадъювантной лучевой терапии при колоректальном раке.

Практическая значимость исследования состоит в разработке оригинальной отечественной иммуноферментной тест-системы для количественного определения растворимого Fas в сыворотке крови человека, а также в установлении значения этого белка как фактора прогноза при раке яичников, раке тела матки, раке коры надпочечников и остеогенной саркоме, а также его предиктивного значения в оценке эффективности неоадъювантной лучевой терапии при раке толстой кишки.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработанная тест-система на основе МА SA-7 и SA-8 может применяться для количественного определения sFas в сыворотке и плазме крови человека и других биологических жидкостях. Присутствие sFasL и других компонентов сыворотки крови не влияет на результаты количественного определения sFas. Разработанная нами тест-система должна детектировать основную изоформу sFas - FasExoóDel и три минорных изоформы sFas -FasExo4Del, FasExo4,6Del и FasExo4,7Del.

2. Концентрация и частота выявления sFas в сыворотке крови больных новообразованиями различного морфогенеза и локализации достоверно превышают соответствующие показатели практически здоровых людей.

3. Показатели sFas в сыворотке крови связаны с основными клиническими характеристиками заболевания (стадия опухолевого процесса, размер опухолевого узла, степень дифференцировки опухоли и характер ее роста) при раке яичников, раке тела матки, раке толстой кишки и адренокортикальном раке.

4. Показатели sFas достоверно не различаются при злокачественных и доброкачественных новообразованиях молочной железы, костей, яичников и надпочечников, тогда как рак щитовидной железы характеризуется более высокими показателями sFas в сыворотке крови, чем доброкачественные и гиперпластические процессы щитовидной железы. Одновременно высокие уровни sFas, VEGF и IL-б в сыворотке крови характерны для злокачественных новообразований.

5. Высокий уровень sFas в сыворотке крови является неблагоприятным фактором прогноза для больных остеогенной саркомой, раком яичников, раком тела матки и адренокортикальным раком.

6. Высокая концентрация sFas в сыворотке крови является неблагоприятным предиктивным фактором эффективности применения неоадъювантной лучевой терапии при колоректальном раке в пожилом возрасте.

Апробация работы:

Материалы диссертации доложены на научно-практическом симпозиуме «Клиническая лаборатория на пороге XXI века: синтез традиций и новаций», (Москва, 1214 октября 1999 года); на VII Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 10-14 апреля 2000 года); на 2-ом съезде онкологов стран СНГ (Киев, 23-26 мая 2000 года); на 7th Biennial Meeting of the International Gynecological Cancer Society (Rome, Italy, September 26-30, 1999); на XI Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 19-23 апреля 2004 года); на Конгрессе «Национальные дни лабораторной медицины России-2004» (Москва 20-22 октября 2004г.); на Российской научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 24-25 июня 2004 г.); на XII Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 18-22 апреля 2005 г.); на I Всероссийской научно-практической конференции патологоанатомов «Актуальные вопросы патологической анатомии» (Орел, 31 мая-2 июня 2005 г.); на X Российском онкологическом конгрессе (Москва, 21-23 ноября 2006 г.); на XIII Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 3-7 апреля 2006 г.). Диссертационная работа апробирована на совместной научной конференции лаборатории клинической биохимии, лаборатории клинической иммунологии, х/о опухолей молочной железы, х/о проктологии, х/о диагностики опухолей НИИ КО, лаборатории молекулярной эндокринологии НИИ канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН; кафедры онкологии и кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики ФПДО МГМСУ; лаборатории нейрохимии ФИБХ РАН 14 октября 2008 г.

Полученные результаты используются в практике лаборатории клинической биохимии НИИ клинической онкологии ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН и в учебном процессе на кафедре клинической биохимии и лабораторной диагностики ФПДО ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава».

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 41 работа в отечественных и зарубежных журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов и 8 глав результатов собственных исследований; заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Общий объем диссертации 272 страниц машинописного текста. Список литературы включает 84 отечественных и 448 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 67 таблицами и 26 рисунками.

Материалы и методы исследования Общая характеристика обследованных больных

В настоящее исследование были включены 1061 первичных больных злокачественными и доброкачественными новообразованиями различного гистогенеза и локализации, из них 861 женщины и 200 мужчин, в возрасте от 14 до 80 лет. В общей группе пациентов были больные новообразованиями молочной железы (141), костей (99), яичников (347), тела матки (111), толстой кишки (113), щитовидной железы (141) и коры надпочечников (109).

Группу контроля составили 457 практически здоровых людей, 332 женщины и 125 мужчин, в возрасте от 17 до 76 лет.

Диагнозы всем больным были установлены впервые на основании результатов клинических исследований и подтверждены данными гистологического исследования, определение концентрации sFas в сыворотке крови проводили до начала специфического лечения.

Больных классифицировали по стадиям согласно международной классификации по системе TNM (Cancer TNM Classification of Malignant Tumours VI Ed.).

Группу больных новообразованиями молочной железы составили 119 женщин от 28 до 82 лет с первичным РМЖ и 22 пациентки с доброкачественными новообразованиями и фиброзно-кистозной болезнью в возрасте от 33 до 58 лет, которые были обследованы и получали лечение в НИИ клинической онкологии Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН в период с декабря 1999г. по ноябрь 2003г.

Проводили определение концентрации sFas и общей активности щелочной фосфатазы у 99 больного новообразованиями костей (61 мужчина и 38 женщин) в возрасте от 14 до 59 лет. Определение концентрации VEGF проводили только у больных остеогенной саркомой и опухолью Юинга. Новообразования костей были представлены следующими нозологическими единицами: первичная остеогенная саркома (32), вторичная остеогенная саркома (1), паростальная остеогенная саркома (1), периостальная остеогенная саркома (1), первичная хондросаркома (17), вторичная хондросаркома (1), опухоль Юинга (10), злокачественная фиброзная гистиоцитома кости (9), гигантоклеточная опухоль кости (10), плазмоцитома (1), гемангиоэндотелиома (1), гемангиоперицитома (1), хордома (3), липома кости (1), доброкачественная остеобластома (2), хондробластома (3), хондрома (1), костно-хрящевой экзостоз (2), аневризмальная костная киста (2).

В группе больных новообразованиями яичников было 141 больная злокачественными новообразованиями в возрасте от 24 до 80 лет и 206 пациенток с доброкачественными новообразованиями в возрасте от 18 до 69 лет, которые прошли обследование и лечение в ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН в период с января 2000 по март 2006 г.г. В группе больных ДОЯ были представлены следующие морфологические варианты опухоли: дермоид (24), киста желтого тела (20), фолликулярная киста (14), цистаденома (56), цистаденофиброма (6), простая киста (4), папиллярная цистаденома

(10), опухоль Бреннера (8), пограничная опухоль (18), муцинозная пограничная опухоль (4), эндометриоидная киста (24), муцинозная киста (6), фиброма (8). В общей группе больных РЯ были следующие нозологические единицы: папиллярная цистаденокарцинома (22), серозная цистаденокарцинома (53), эндометриоидная аденокарцинома (27), муцинозная аденокарцинома (26), аденогенный рак (3), серозный рак (10).

В исследование были включены 111 больных раком тела матки (РТМ) в возрасте от 31 до 80 лет. Гистологическое исследование выявило следующие морфологические варианты строения опухолей у больных РТМ: аденокарцинома (102), железисто-плоскоклеточный рак (7), светлоклеточный рак (2). Больные находились в разных стадиях опухолевого процесса, большинство (62.8%) из них было в 1 и 2 стадии.

В исследование были включены 113 больных колоректальным раком, из них 57 мужчин и 56 женщин в возрасте от 35 до 72 лет.

В общую группу больных были включены 141 пациент с различными патологиями щитовидной железы, из них 127 женщин и 14 мужчин, в возрасте от 17 до 73, которые находились на обследовании и лечении в отделении опухолей верхних дыхательно-пищеварительных путей ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН г.Москвы за период с декабря 1998 по январь 2002 года. Новообразования щитовидной железы были представлены следующими морфологическими типами опухолей: 1) рак щитовидной железы - 32; 2) аденома щитовидной железы - 16; 3) узловой коллоидный микро-макрофолликулярный зоб с признаками аденоматоза - 20; 4) узловой коллоидный микро-макрофолликулярный зоб без признаков аденоматоза - 48; 5) диффузный токсический зоб с признаками аденоматоза - 9; 6) диффузный токсический зоб без признаков аденоматоза - 14; 7) аутоиммунный тиореоидит Хошимото - 2.

В общей группе пациентов было 109 больных опухолями надпочечников, из них 59 мужчин и 50 женщин, в возрасте от 45 до 75 лет. Гистологическое исследование выявило следующие нозологические единицы: рак коры надпочечника - 32, аденома коры надпочечника - 52, адренокортикальная опухоль с неопределенным потенциалом злокачественности - 6, феохромоцитома -18 и миелолипома - 1.

Сопутствующая патология выявлена более чем у половины (56%) всех больных новообразованиями. Среди сопутствующих заболеваний были гипертоническая болезнь, хроническая ишемическая болезнь сердца, стенокардия, миома матки, полип матки, мастопатия, хронический гастрит, хронический колит, хронический пиелонефрит, мочекаменная болезнь, сахарный диабет II типа. Сочетание нескольких хронических заболеваний в анамнезе выявлено у 212 (20%) больных.

Лабораторные методы исследования

Определение концентрации sFas в сыворотке крови. МА против Fas SA-8 (IgGl (к); (4.0±0.6)х107 М"') сорбировали на ИФА-планшеты ("Linbro") в 0,05 М карбонатном буфере (рН 9.6) в концентрации 5 мкг/мл в течение ночи при 4°С. Для блокирования остаточных свободных центров связывания планшеты инкубировали с 1% раствором БСА в фосфатно-солевом буфере (PBS) (рН 7.2) 1 час при 37°С. Затем в планшеты вносили сыворотки больных и практически здоровых людей, которые хранили при -20°С до анализа. Для построения калибровочного графика в каждый планшет вносили последовательные двукратные разведения полноразмерного рекомбинантного бакуловирусного Fas от 40 нг/мл до 0.1 нг/мл. Планшеты инкубировали 1.5 часа при 37°С. После инкубации планшеты промывали раствором PBS, содержащим 0.1% Tween 20 ("Sigma") (буфер для отмывки). Процедуру отмывки далее повторяли после каждой стадии теста. После отмывки в планшеты вносили биотинилированные МА против Fas SA-7 (IgGl (к); (5.8±0.7)х108 М'1) в концентрации 10 мкг/мл в буфере для отмывки, содержащем 0.1% БСА и инкубировали 2 часа при 37°С. Затем в планшеты вносили раствор стрептавидин-пероксидазы ("Amersham") в рабочем разведении в буфере для отмывки. Планшеты инкубировали 1 час при 37°С. В качестве субстрата использовали свежеприготовленный раствор 0.04% opmo-фенилендиамина в 50 мМ цитрат-фосфатном буфере (рН 5.0), содержащем 0.03% перекиси водорода. Планшеты иякубировали 15-20 минут при комнатной температуре до развития окраски. Реакцию останавливали 10% серной кислотой, оптическую плотность измеряли при длине волны 492 нм на спектрофотометре MR 700 Microplate Reader ("Dynatech Labs", США). Концентрацию sFas определяли по калибровочному графику, построенному заново для каждого планшета.

Определение энитопов, узнаваемых МА SA-7 и SA-8, проводили с помощью библиотеки гегдашептидов в варианте фагового дисплея - PH.D.-7™ (BioLabs, Cat. #E8100S) по прилагаемой инструкции.

Синтез пептидов проводили твердофазным методом в ручном твердофазном реакторе (Rodionov I.L. и соавт., 1992) с использованием Fmoc-стратегии (Reíd G.E. и Simpson R.J., 1992).

Приготовление сыворотки крови пациентов и практически здоровых людей

Кровь у больных и практически здоровых людей забирали натощак из кубитальной вены с 8 до 9 утра. После свертывания крови пробирки центрифугировали при 500g в течение 10 минут, сыворотку аккуратно отбирали, разливали по промаркированным пробиркам и хранили при -20°С до анализа.

Определение концентрации IL-6 в сыворотке крови проводили с помощью имму-ноферментного набора «human IL-б» компании "R&D", США по прилагаемой к набору инструкции производителя.

Определение концентрации VEGF в сыворотке крови проводили с помощью иммуноферментного набора "CytElisa6" Human VEGF" компании "Cytimmune Science Inc." (США) по прилагаемой к набору инструкции производителя.

Определение концентрации uPA в гомогенизированной ткани опухоли

проводили с помощью иммуноферментного набора реактивов, разработанных в Католическом Университете г. Наймегена в лаборатории проф. T.Benraad'a (Нидерланды).

Определение рецепторов эстрадиола-17Р в экстрактах опухоли молочной железы проводили радиолигандным методом при насыщающих концентрациях лиганда [2,4,6,7-3Н]-эстрадиола-17р ("Amersham Int. PLC", Англия). Неспецифичное связывание определяли при 100-200-кратном молярном избытке диэтилстильбэстрола. Для разделения свободных и связанных с рецептором стероидов пробы после инкубации обрабатывали суспензией активированного угля, покрытого декстраном. Радиоактивность образцов определяли на спектрометре "LS 6500" ("Beckman", США).

Определение общей активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови

проводили оптимизированными методами при использовании автоматического анализатора «Hitachi 911».

Статистический анализ результатов исследования

Выбор центральных характеристик исследуемых количественных данных осуществляли после изучения формы их распределения. Оценку различия формы распределения от формы распределения Гаусса проводили по критерию согласия Колмогорова-Смирнова. При логнормальном распределении проводили математическое преобразование значений. Рассчитывали среднее значение показателя и его 95% доверительные границы, ошибку среднего, а также медианы (для логнормальных показателей) и пределы колебания.

Рассчитывали абсолютные и относительные частоты качественных и ординальных признаков. Оценку различий частот проводили непараметрическим критерием xi-2, для малых выборок - точным критерием Фишера. Расчет доверительных интервалов для малых долей проводили с учетом биноминального распределения.

Для выяснения диагностической способности показателей проводили дискриминантный анализ. Рассчитывали точное значение р. При множественных сравнениях значения р определяли с помощью специальных тестов с поправкой на множественность сравнений (test Scheffe). При корреляционном анализе рассчитывали коэффициент корреляции Пирсона, а также значимость его отличия от нуля. Выживаемость рассчитывали по методу Каплапа-Майера.

При выборе статистических процедур учитывали методологические требования Международного конгресса по гармонизации GGP "Статистические принципы для клинических исследований" (ICH Guidelines//Good Clin.Pract.J.-1998.-Vol.5, №4.-р.27-37).

Все вычисления проводили с помощью математических пакетов «Статистика» и SPSS.

Результаты собственных исследований

Разработка и характеристика сэндвич-ИФА для количественного определения sFas в сыворотке крови на основе моноклональных антител

Получение моноклональных антител против человеческого Fas

Для иммунизации брали 8-недельных мышей линии BALB/c, в качестве антигена использовали полноразмерный рекомбинантный бахуловирусный Fas ("Coultronics", Франция). Гибридизацию иммунных спленоцитов мыши с клетками мышиной линии NSO/1 проводили по стандартной методике. Отбор положительных гибридом проводили методом непрямого ИФА. Одиночные положительные клоны получали методом лимитирующих разведений.

МА нарабатывали в асцитной жидкости мышей линии BALB/c. Выделение МА из асцитной жидкости осуществляли преципитацией сульфатом аммония и последующей жидкостной хроматографией умеренного давления на колонке MonoQ. Определение типов тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов проводили непрямым ИФА с помощью набора для типирования антител ("Amersham", Великобритания).

Иммунохимическая характеристика полученных антител приведена в таблице 1.

Таблица 1. Иммунохимическая характеристика моноклональных антител KFas

Антитело Тип тяжелой и легкой Константа аффинности,

цепи м-'

SA-1 igcwa.) (7.8±1.3)xl07

SA-2 IgGl(K) (4.1±0.3)xl07

SA-3 IgGl(K) (6.4±0.5)xl07

SA-4 IgGl(K) (2.1±0.4)х109

SA-5 IgGl(K) (3.8±0.3)х107

SA-6 Ig01(K) (3.3±0.2)х107

SA-7 IgGl(K) (5.8±0.7)х108

SA-8 IgGl(K) (4.0±0.6)х107

SA-9 IgGl(K) (6.5±0.5)х107

С целью разработки тест-системы для количественного определения растворимого Fas в сыворотке крови были получены конъюгаты МА против Fas с биотином. Были проверены все возможные варианты сэндвич-ИФА, наилучшие результаты определения sFas показала «пара» антител SA-7 и SA-8. МА SA-7 и SA-8 выявляли одну мажорную полосу, соответствующую молекулярному весу полноразмерного Fas в клеточных экстрактах человеческих линий HL-60, MCF-7 и Jurkat, и не взаимодействовали с экстрактом клеток мышиной линии L929 в иммуноблоттинге, что может свидетельствовать о видовой специфичности этих антител.

Проводили определение минимальной концентрации sFas, детектируемой разработанной тест-системой, для этого делали последовательные двукратные разведения полноразмерного Fas от 10 до 0.08 нг/мл. Нижним пределом детекции sFas, определяемым

сэндвич-ИФА, считали концентрацию Fas, достоверно превышающую фоновое значение оптической плотности тест-системы плюс три стандартных отклонения. Минимальный предел детекции sFas тест-системы на основе МА SA-7 и SA-8, определенный в 6 независимых экспериментах, составил 0.3 нг/мл (рис. 1).

Т-1-1-i-1-1-1-1-1-1-г

О 2 4 5 В 10

Fas. ng/ml

Рис. 1. Калибровочный график для определения концентрации растворимого Fas

В литературе описано несколько тест-систем для определения концентрации sFas в варианте сэндвич-ИФА, нижний предел детекции которых колеблется от 2 нг/мл (Tomokuni А. и соавт., 1997) до 0.1 нг/мл (Seishima М. и соавт., 1996), по данному показателю разработанный сэндвич-ИФА не уступает аналогичным тест-системам.

Показали, что присутствие sFasL в концентрации 10 нг/мл не влияет на результаты количественного определения sFas разработанной нами тест-системой (рис. 2).

Г-»- F» -*- Faa*cFasL |

Рис. 2. Определение концентрации sFas в присутствии sFasL

С целью оценки воспроизводимости результатов определения концентрации sFas в сыворотке крови человека с помощью разработанного сэндвич-ИФА проводили определение уровня sFas в 8 различных образцах сыворотки в б параллельных повторах для каждого образца в пределах одного ИФА-планшета (intra-assay) и рассчитывали коэффициент

вариации. Эксперимент повторяли 3 раза в независимых экспериментах (inter-assay) и рассчитывали коэффициент вариации для данного теста, учитывая результаты 18 определений для каждого образца сыворотки. Результаты проведенных экспериментов представлены в таблицах 2 и 3.

Таблица 2. Результаты определения концентрации вРав в сыворотке крови в пределах одного ИФА-планшета__

Образец сыворотки Концентрация sFas, нг/мл Коэффициент вариации, %

1 2.67, 2.75, 2.60, 2.59, 2.73, 2.65 2.5

2 5.45, 5.39, 5.55, 5.59, 5.48, 5.62 1.6

3 0.76, 0.85, 0.70, 0.81, 0.74, 0.77 6.9

4 3.59, 3.48, 3.75, 3.55, 3.67, 3.64 2.6

5 8.40, 8.90, 8.65, 8.56, 8.73, 8.57 2.0

6 1.78, 1.83, 1.64, 1.75, 1.68, 1.67 4.2

7 0.53, 0.64, 0.59, 0.58, 0.61, 0.57 6.3

8 3.67, 3.75, 3.53, 3.58,3.64, 3.52 2.5

Средний коэффициент вариации (М±т), % 3.7±0.7

Коэффициент вариации изменялся от 1.6% до 6.9% и в среднем составил 3.7%. Полученные данные свидетельствуют о хорошей воспроизводимости результатов измерения концентрации Браэ в данном виде теста (т^а-аБвау). Коэффициент вариации был выше при низкой концентрации эРа8 в сыворотке крови, что объясняется бблыпим вкладом ошибки метода (разброс значений оптической плотности, краевые эффекты) вблизи значения минимального предела детекции тест-системы.

Таблица 3. Результаты определения уровня зРаз в независимых экспериментах

Образец Эксперимент Эксперимент №2 Эксперимент Коэффициент

сыворотки №1 №3 вариации, %

1 2.67 2.80 2.50 5.6

2 5.51 5.30 5.45 2.0

3 0.77 0.67 0.73 6.9

4 3.61 3.70 3.55 2.1

5 8.64 8.80 8.54 1.5

6 1.73 1.68 1.65 2.4

7 0.59 0.55 0.63 6.8

8 3.62 3.54 3.58 1.1

Средний коэффициент вариации (М±т), % 3.6±0.8

Проводили сравнение результатов определения концентрации зРаэ в сыворотке и плазме крови онкологических пациентов с использованием сэндвич-ИФА на основе МА 8А-7 и БА-8.

Таблица 4. Сравнительные результаты определения концентрации яКаз в сыворотке и плазме крови онкологических больных в сэндвич-ИФА на основе МА 8А-7 и 8А-8

Тип образца Концентрация sFas, нг/мл Коэффициент вариации, %

Сыворотка 4.28 4.30±0.06 1.3

EDTA-плазма 4.36

Гепарин-плазма 4.25

Из данных таблицы 4 видно, что разработанный нами сэндвич-ИФА дает близкие результаты определения концентрации sFas как в сыворотке, так и в плазме крови человека, при этом метод приготовления плазмы не влияет на результаты определения концентрации.

Определяли, насколько полно разработанный нами сэндвич-ИФА выявляет sFas в сыворотке крови, для этого в сыворотку, в которой первоначально не был выявлен sFas, вносили различные количества Fas и определяли его концентрацию, затем сравнивали определяемый показатель концентрации Fas в сыворотке с ожидаемой величиной. Результаты данных экспериментов отражены в таблице 5.

Таблица 5. Сравнительные результаты выявления привнесенного в сыворотку крови Fas

Концентрация добавленного Fas, нг/мл % выявления добавленного Fas

9.0 86, 98, 93

6.0 88, 105, 99

3.0 87, 118, 113

1.5 102, 112, 95

0.8 105, 95, 98

Средний % выявления Fas 99.6

Из данных таблицы 5 видно, что присутствующие в сыворотке крови компоненты не влияют на выявление sFas с помощью разработанной нами тест-системы.

Определение структуры эпитоиов, узнаваемых MA SA-7 и SA-8, с помощью пептидного фагового дисплея

Растворимый Fas является продуктом альтернативного сплайсинга мРНК Fas. В литературе описано несколько изоформ sFas и показано их количественное соотношение на уровне экспрессии мРНК: Fas » FasExoóDel »> FasExo3,4,6Del > FasExo4Del « FasExo4,6Del « FasExo4,7Del я FasExo3,4Del. Также идентифицированы изоформы FasExo3Del и FasExo8Del (Cascino I. и соавт., 1995,1996).

Поскольку MA SA-7 и SA-8 взаимодействуют с денатурированным Fas в иммуно-блоттинге, то мы предположили, что эпитопы Fas, узнаваемые каждым из этих антител, являются не конформационными, а линейными. Поэтому для локализации минимальных эпитопов, с которыми взаимодействуют антитела, мы выбрали пептидную фаговую библиотеку PH.D.-7™ (New England BioLab) с представленностью около 2х109 возможных

вариантов гепталептидов и проводили четыре раунда аффинной селекции фаговых частиц из данной библиотеки. После клонирования были отобраны фаги, взаимодействующие с МА 8А-7 и БА-8, которые использовали для иммунохимического анализа и определения структуры аминокислотной последовательности пептидов, представленных данными фагами. Первичная структура пептидов, экспонированных фагами, показана в таблице 6.

Таблица б. Структура пептидов, экспонированных фагами библиотеки PH.D.-7™, взаимодействующими с MA SA-7 и SA-8 против полноразмерного человеческого Fas

Название Структура пептида в j, ^j-i клона составе фага " Название Структура пептида .„i клона в составе фага

SA-8/1II-1 А К I Н F Y S 3.9x10° SA-7/IV-1 G К I Н F F R 7.0x10'

SA-8/III-2 D К I Н F К S 5.6x10" SA-7/IV-2 G Y К Р Т F S 1.1x10'

SA-8/III-3 V N К Р Н F Н 7.0x106 SA-7/IV-3 G Y К Р Т F S 1.1x10'

SA-8/V-1 А Y I Н F L Р 1.4x10' SA-7/IV-4 SKI Н F Н Р 8.0x10°

SA-8/IV-2 S Е I Н L М G 5.0x10° SA-7/IV-5 G К I Н F F R 7.0x10'

SA-8/IV-3 А К I Н F Н S 4.5x10° SA-7/IV-6 G К I Н F F R 7.0x10'

SA-8/IV-4 Н К Р Н F Р S 2.6x10° SA-7/IV-7 N К I Н F Y Р 6.6x10°

SA-8/IV-5 А L Q I HTM 3.9x10° SA-7/IV-8 G К I Н F F R 7.0x10'

SA-8/IV-6 А Q ! Н F L Р 4,0x10° SA-7/IV-9 SKI Н F L S 9.4x10°

SA-8/IV-7 D N Р Н Y Т Т 3.6x10° SA-7/1V-10 SKI Н F Н Р 8.0x10°

SA-8/IV-8 G К Р Н F 1 Т 3.4x10° SA-7/IV-11 G К I Н F Н Р 9.8x10°

SA-8/IV-9 S F Н I Y F L 7.5x10° SA-7/IV-12 SKI Н F Р Е 1.8x10'

SA-8/1V-10 S К I Н F Н 1 5.0x10" SA-7flV-13 С К I Н F F R 1.7x10"

SA-8/IV-11 R К Р Н F I G 6.8x10° SA-7/IV-14 D К I Н F Y Р 1.0x10'

SA-8/IV-12 L К L Н F N Т 4.2x10° SA-7/1V-15 R Y Y Р Y F Р 1.1x10'

SA-8/IV-13 А К I Н F Y S 5.8x10° SA-7/IV-16 А К I Н F Р Р 1.5x10'

SA-8/IV-14 R К I Н F Н Р 3.6x10° SA-7flV-17 Е К Р Н F L V 9.8x10°

SA-7/1V-18 А К I HFLP 7.0x10°

SA-7/IV-I9 Н К I Н F L Р 1.5x10'

SA-7/1V-20 R К L Н F L Р 9.3x10°

SA-7/IV-21 SKI Н F Y Н 5.3x10°

Примечание: в таблице жирным шрифтом выделены аминокислотные остатки, совпадающие со структурой предполагаемого эпитопа для антител; подчеркнуты аминокислотные остатки, являющиеся гомологичной заменой аминокислотного остатка в структуре предполагаемого эпитопа для антител.

С целью определения структуры консенсусных мимотопов для антител вычисляли и анализировали частоту встречаемости каждого аминокислотного остатка (а.о.) в пептидах, представленных отобранными фагами. Таким образом, консенсусный мимотоп для антитела SA-7 определили а.о. XKIHFFP. Совмещение консенсусного мимотопа для антитела SA-7 со структурой полноразмерного Fas позволило предположить, что эпитоп для этого антитела определяют а.о. экстраклеточной части Fas 130—134. Из 6 а.о. консенсусной мимотопной последовательности три остатка совпали со структурой предполагаемого эпитопа, Консенсусный мимотоп для антитела SA-8 определяли а.о.: XKIHFXS. Совмещение консенсусного мимотопа с аминокислотной последовательностью полноразмерного Fas позволило сделать предположение, что эпитоп для антитела SA-8

определяют а.о. 94 — 99 экстраклеточной части Fas. Четыре из семи а.о. консенсусного мимотопа соответствовали структуре полноразмерного Fas, а остаток изолейцина между остатками лизина и гистидина может считаться гомологичной заменой остатку аланина в структуре предполагаемого эпитопа для антитела SA-8.

Надо отметить, что структуры консенсусиых мимотопов для МА SA-7 и SA-8 сходны между собой, поэтому мы определяли константы аффинности всех отобранных фагов по отношению к МА, на которых проводили селекцию. Для фагов, специфичных к антителу SA-8, не было обнаружено прямой корреляционной зависимости между числом а.о. в мимотопной последовательности, совпадающих со структурой предполагаемого эпитопа, и значением константы аффинности (табл. 6). В то же время для фагов, специфичных к антителу SA-7, было показано, что константы аффинности фаговых частиц, в составе которых были представлены пептиды XKXXFFX (3 совпадающих остатка из 7), были одними из самых высоких - 7.0х107 М"'. Для фагов, экспонирующих мимотопную последовательность CKXXFFX (четыре совпадающих аминокислотных остатка из семи), определили самую высокую константу аффинности-1.7х108 М"'. Видимо, остаток цис-теина очень важен для взаимодействия антитела SA-7 с Fas, поэтому в предполагаемый эпитоп, узнаваемый МА SA-7, мы включили остаток цистеина. Таким образом, мы предположили, что эпитоп для МА SA-7 определяется а.о. 129—134 экстраклеточной части Fas.

Были синтезированы гексапептиды: пептид №1, соответствующий предполагаемому эпитопу для антитела SA-8 — 94-99: KAHFSS, и пептид №2, соответствующий предполагаемому эпитопу для антитела SA-7 — 129-134: CKPNFF. Для подтверждения структуры эпитопов, узнаваемых антителами, были проведены эксперименты по конкурентному ингибированию синтетическими пептидами №1 и №2 взаимодействия антител SA-7 и SA-8 с полноразмерным Fas (рис. 3).

Из рисунка 3 видно, что пептид №1, соответствующий предполагаемому эпитопу для МА SA-8, предпочтительно ингибирует взаимодействие антитела SA-8 с полноразмерным Fas, а на взаимодействие МА SA-7 с Fas значительного влияния не оказывает. В то же время пептид №2, соответствующий предполагаемому эпитопу для МА SA-7, предпочтительно ингибирует взаимодействие антитела SA-7 с полноразмерным Fas. Отсюда мы сделали заключение, что пептид №1 специфичен к антителу SA-8, а пептид №2 специфичен к антителу SA-7.

Таким образом, была определена структура эпитопов для МА SA-7 и SA-8 против полноразмерного человеческого Fas. Эпитоп для антитела SA-7 определяют а.о. Fas 129-134 — CKPNFF, а для антитела SA-8 - а.о. Fas 94 - 99 — KAHFSS.

25х 50х 1х Ш

молярное соотношение пептидов и Fas

Щ — МА SA-8 + пептид №2;

ГМА SA-7 + пептид №2;

- МА SA-8 + пептид Xsl; МА SA-7 + пептид №1.

Рис. 3. Конкурентное ингибирование взаимодействия антител SA-7 и SA-8 с Fas пептидами №1 и №2

Изоформы sFas являются результатом альтернативного сплайсинга полноразмерной мРНК Fas, состоящей из 9 экзонов. Идентифицировано несколько вариантов спланированной мРНК Fas с делениями различных экзонов, при этом основной изоформой растворимого Fas является FasExoöDel, в которой делетирован только трансмембранный домен, ее экспрессия на несколько порядков превышает суммарную экспрессию остальных минорных изоформ (Cascino I. и соавт., 1995, 1996). Все изоформы sFas содержат а.о., соответствующие первому и второму экзонам полноразмерного транскрипта fas. Эпитоп для МА SA-8 определяют а.о. 94-99, кодируемые нуклеотидами второго экзона fas, т.о. МА SA-8 взаимодействует со всеми изоформами sFas. Делеция третьего экзона происходит при вырезании из полноразмерной мРНК Fas нуклеотидов 391-529, т.е. удаляются а.о. 131-200 первичной аминокислотной последовательности полноразмерного Fas. Эпитоп для антитела SA-7 определяют а.о. 129-134 полноразмерного Fas, кодируемые нуклеотидами, находящимися на границе второго и третьего экзонов fas, поэтому МА SA-7 не способно взаимодействовать с изоформами sFas с делецией а.о., соответствующих третьему экзону.

Таким образом, сэндвич-ИФА на основе антител SA-7 и SA-8 должен детектировать основную изоформу sFas - FasExoöDel и три минорных изоформы: FasExo4Del; FasExo4,6Del; и FasExo4,7Del.

sFas, IL-6, VEGF в сыворотке крови и содержание рецепторов эстрогенов в опухолях при новообразованиях молочной железы

Нами проведено определение концентрации sFas и IL-6 в сыворотке крови 119

больных РМЖ и у 22 больных ДОМЖ в сравнении с соответствующими показателями 55 практически здоровых женщин. Результаты данного исследования показаны в таблице 7.

Таблица 7. Показатели sFas и IL-6 в сыворотке крови больных новообразованиями молочной железы и практически здоровых людей

Категории обследованных Количество пациентов sFas, нг/мл IL-6, пг/мл

М±ш, медиана Пределы колебаний М±ш, медиана Пределы колебаний

Контроль 55 0.8±0.1 0.81 0.3-1.2 1.0±0.1 0.94 1.0-2.0

РМЖ 119 1.9±0.1 1.72 0.4-5.8 1.8±0.1 1.65 0.1-9.7

ДОМЖ 22 1.7±0.3 1.23 0.4-2.4 2.0±0.3 1.96 0.7-3.2

Примечание: p2vsl=0.0004; p3vsl=0.001; p3vs2>0.05; p5vs4=0.0I, p6vs4=0.02.

Частота выявления вРаэ в сыворотке крови у больных РМЖ и ДОМЖ (59% и 73%, соответственно) была достоверно выше, чем у практически здоровых женщин (37%). Концентрация зРаэ в сыворотке крови больных была достоверно выше, чем в контрольной группе, при этом не было выявлено достоверных различий в показателях эРая между больными РМЖ и ДОМЖ. Частота выявления 1Ь-6 у практически здоровых женщин составила 73%, а в группах больных ДОМЖ и РМЖ 1Ь-6 был вьивлен у всех пациенток. Медианы концентрации 1Ь-6 достоверно не различались между больными РМЖ и ДОМЖ, но при этом достоверно превышали соответствующий показатель группы контроля. Уровни Бра^ и 1Ь-6 в сыворотке крови достоверно не зависели от возраста больных РМЖ (г=-0.05) и больных ДОМЖ (г=0.19), однако была выявлена отрицательная корреляционная связь между концентрацией Брав и возрастом в группе больных папилломой (г=-0.85).

У 119 больных первичным РМЖ определяли концентрацию эРаэ, 1Ь-6 и УЕйР в сыворотке крови, а также содержание РЭ в ткани опухоли и проводили анализ определяемых показателей в зависимости от основных клинико-морфологических критериев заболевания. В нашем исследовании рецептороположительными (РЭ+) мы считали опухоли, в которых содержание РЭ было 10 и более фмоль на 1 мг общего белка цитозольной фракции (фмоль/мг белка). Опухоли, содержащие РЭ в количестве ниже 10 фмоль/мг белка, считали рецепторотрицательными (РЭ-). Из 119 первичных опухолей при РМЖ в 102 случаях уровень РЭ был выше нуля (86%), однако РЭ+-опухолей было всего 67 (56%). Результаты проведенных исследований представлены в таблице 8.

Содержание РЭ в первичных опухолях изменялось в широких пределах, при этом не выявили корреляционной связи уровня РЭ в опухоли с возрастом больных (г=0.20).

Показатели вРаэ, УЕОР и 1Ь-6 в сыворотке крови больных РМЖ были достоверно выше, чем в группе контроля (р<0.001), при этом не выявлено зависимости показателей вРаБ, 1Ь-6 и УЕйР от возраста ни в контрольной группе, ни в группе больных РМЖ.

Таблица 8. Показатели яГая, 1Ь-6 и УЕвК в сыворотке крови и гормональной чувствительности опухоли при раке молочной железы_

Исследуемые показатели Практически здоровые люди Рак молочной железы

Частота выявления, % Диапазон колебаний М±т, медиана Частота выявления, % Диапазон колебаний М±т, медиана

РЭ, фмоль/мг - - - 56 10.1382.5 73.9±8.6; 46.9

эРаз, нг/мл 47 0.3-1.2 0.8±0.1; 0.8 59 0.5-2.6 1.9±0.1; 1.7

1Ь-6, пг/мл 73 0.2-2.0 1.0±0.1; 0.9 100 0.6-2.9 1.8±0.1; 1.6

УЕОР, пг/мл 100 15.0-315.0 179.0±13.4 154.0 100 35.61090.0 312.8±27.2; 263.9

Был проведен анализ показателей рецепторного статуса опухоли и эРаБ, 1Ь-6 и УЕОР в сьторотке крови брльных в зависимости от стадии заболевания (табл. 9).

Таблица 9. Показатели вГаз, 1Ь-б и \TEGF в сыворотке крови и гормональной

Исследуемые показатели Стадия РМЖ и количество обследованных больных (п)

1а, п=22 На, п=46 ИЬ, п=20 Illa, п=14 Illb, п=13 IV, п=4

Частота выявления, медиана

РЭ, фмоль/мг 52% 70.3 62% 75.9 60% 42.0 34% 25.6 30% 21.8 не бьшо выявлено

1Ъ-6, пг/мл 0.9 1.7 1.5 1.5 1.8 2.0

эРаэ, нг/мл 63% 1.7 68% 2.2 58% 1.7 55% 1.5 40% 1.8 не был выявлен

УЕйР, пг/мл 173.6 267.4 265.0 286.2 306.4 447.5

1Ь-б и УЕОР были выявлены у всех больных. Прогрессирование РМЖ характеризовало снижение частоты выявления эРаэ в сыворотке крови, при этом концентрация вРаэ достоверно не изменялась. В отличие показателей Брая, медианы концентрации 1Ь-6 и УЕвР достоверно повышались с увеличением стадии заболевания. Корреляционный анализ не выявил зависимости между показателями 1Ь-6 и УЕОР, но при этом была обнаружена отрицательная корреляционная связь между уровнями вБаз и 1Ь-6 при Ш-1У стадии заболевания (г=-0.54). Было также отмечено, что с увеличением стадии заболевания наблюдается снижение частоты выявления и содержания РЭ в опухолях (р=0.08).

Показатели Брав, 1Ь-6 и УЕОР в сыворотке крови и РЭ-статуса опухолей были проанализированы в зависимости от гистологического строения опухолей, данные анализа приведены в таблице 10.

Таблица 10. Показатели вЕав, 1Ь-6 и \TiGF в сыворотке крови и гормональной чувствительности опухоли при РМЖ в зависимости от гистогенеза новообразования

Морфология опухолей РЭ 1Ь-6 вБаз VEGF

% выявления медиана, ' фмоль/мг % выявления медиана, пг/мл % выявления медиана, нг/мл % выявления медиана, пг/мл

Протоковый инфильтратив-ный рак, 73 больных 52 60.6 100 1.7 61 1.8 100 254.5

Дольковый инфильтратив-ный рак, 33 больных 59 39.8 100 1.1 44 1.8 100 259.8

Смешанный рак, 9 больных 77 65.2 100 1.8 33 1.5 100 270.0

Редкие варианты, 4 больных 100 11.5 100 1.6 100 0.7; 0.7; 1.3; 2.9 100 272.0

Статистические методы анализа удалось применить только для групп больных протоковым и дольковым инфильтративным раком, так как остальные морфологические варианты РМЖ были редко представлены. Показатели Брая и УЕйР значимо не зависели от гистогенеза РМЖ, при этом медиана концентрации 1Ь-б была выше при протоковом раке, чем при дольковом (р=0.02).

У больных с сохраненной менструальной функцией частота выявления вРав составила 57%, средний уровень - 1.8±0.2 нг/мл, у больных в менопаузе - 63% и 1.9±0.2 нг/мл, соответственно. Частота выявления Брав в первой фазе менструального цикла составила 66%, во второй - 52%, средний уровень Брав был немного выше во второй фазе (2.1±0.4 нг/мл), чем в первой (1.7±0.2 нг/мл), но достоверных различий показателей «Раз в крови больных РМЖ в зависимости от их репродуктивной функции и фазы менструального цикла не выявили. Концентрация УЕйБ также значимо не отличалась между больными РМЖ в репродуктивном периоде и в постменопаузе. Уровень 1Ь-6 был достоверно выше у больных в постменопаузальном периоде, чем в репродуктивном. У больных РМЖ в репродуктивном периоде выявили слабую, но достоверную (г=-0.32; р=0.048) обратную корреляционную зависимость между возрастом пациенток и уровнем 111-6 в сыворотке крови, причем эта зависимость была более выражена у больных протоковым инфильтративным РМЖ (г=-0.38; р=0.049). Среди больных с сохраненной менструальной функцией только у 37% женщин были выявлены РЭ+ опухоли, тогда как в менопаузе частота выявления РЭ+ опухолей была 68%. Средний уровень РЭ в опухолях больных в менопаузе составил 87.Ш1.5 фмоль/мг (медиана 69.9) и был достоверно выше, чем в опухолях больных репродуктивного возраста - 45.4±8.46 фмоль/мг (медиана 34.1) (р=0.027).

Частота выявления в^аэ у больных с РЭ+ опухолями составила 64%, средний уровень -1.9±0.2 нг/мл (медиана - 1.7). При РЭ- опухолях Частота выявления была ниже - 50%, средний уровень - 1.9±0.3 нг/мл (медиана - 1.8). Таким образом, в сыворотке крови больных с РЭ+ опухолями частота выявления вРаэ была выше (р=0.049), чем у пациенток с РЭ-отрицательными опухолями, при этом достоверных различий концентрации вРаэ между этими группами не отмечено. Корреляционная связь между уровнями зБаз и РЭ отсутствовала (г=-0.03).

Показатели 1Ь-6 и УЕОБ в сыворотке крови не различались при положительном и отрицательном статусе опухолей (р=0.9).

Анализ показателей вРаэ в сыворотке крови больных РМЖ в зависимости от отдаленных результатов лечения показал, что уровень вРаэ в сыворотке крови не был достоверно связан с показателями общей (р=0.213) и безрецидивной выживаемости (р=0.245) за 5-летний период наблюдения.

вРав, УЕСР и общая активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови больных новообразованиями скелета

В настоящем исследовании проводили определение концентрации Брав и общей активности ЩФ у 99 больных новообразованиями костей (61 мужчина и 38 женщин) в возрасте от 14 до 59 лет. Определение концентрации УЕвР проводили только у больных остеогенной саркомой и опухолью Юинга.

Частота выявления БРая в сыворотке крови в общей группе больных новообразованиями костей составила 88%, что в 2.4 больше, чем у практически здоровых людей (табл. 11). Концентрация вРаэ в сыворотке больных колебалась от 0.5 до 24.6 нг/мл, средний уровень составил 4.5±0.5 нг/мл, что в 5.2 раза выше, чем у практически здоровых людей (р=0.0001). Пороговым значением концентрации йБаэ в сыворотке крови считали верхнюю границу диапазона колебаний в контрольной группе - 1.2 нг/мл, уровень эРав, превышающий данное значение, считали повышенным. Не было выявлено, достоверных различий в показателях Браэ между больными злокачественными и доброкачественными опухолями костей: частота выявления 89% и 92%, средний уровень - 4.5+1.7 нг/мл и 3.9±0.8 нг/мл, соответственно. В общей группе больных не было выявлено зависимости уровня эРаэ от локализации опухоли в трубчатых или плоских костях, а также от пола больных (табл. 12). У больных в возрасте до 19 лет средний показатель враз в сыворотке крови равнялся 5.2+0.5 нг/мл, у пациентов старше 19 лет - 3.9±0.4 нг/мл, что в 1.3 раза ниже (р=0.049).

Общая активность ЩФ у пациентов с новообразованиями скелета колебалась в широких пределах - от 102 до 6979 ЕД/л, и в среднем составила 535±106 ЕД/л. Повышение общей активности ЩФ в общей группе больных отметили у 47 пациентов (49%), 11 женщин и 36 мужчин, при этом содержание врав было повышено у 78 пациентов (81%), 32 женщин (33%) и 46 мужчин (48%). В общей группе больных корреляционной связи между уровнем вРаэ и общей активностью ЩФ в сыворотке крови не выявили.

Таблица 11. Показатели вРав в сыворотке крови больных злокачественными и доброкачественными новообразованиями костей___

Категория обследованных Возраст, годы Число наблюдений Частота выявления вРаз, % Браэ, нг/мл (М±т)

Практически здоровые люди 17-67 102 36 0.9+0.3

Новообразования скелета 26.4±1.3 99 88 4.5±0.5

Первичная остеогепная саркома 19.0+1.3 32 87 3.7±0.9

Первичная хондросаркома 32.3+3.8 17 88 4.3±1.1

Опухоль Юинга 19.0±2.5 10 100 8.3+3.4

Злокачественная фибро-гистиоцитома кости 35.1±2.6 9 78 3.4+0.6

Гигантоклеточная опухоль кости 28.1±2.3 10 100 4.9±2.6

Доброкачественные опухоли 31.6±5.7 26 98 4.7+2.5

У 10 пациентов при первичном обследовании были обнаружены одиночные и множественные метастазы опухоли в легких. Средний уровень вРаэ в этой группе был в 2.4 больше, чем у практически здоровых людей и в 2.4 раза меньше, чем средний показатель содержания эРая общей группы больных новообразованиями скелета, однако различия не достоверны (табл. 12). Общая активность ЩФ была повышена у 4 (40%) из них. Выявить достоверной зависимости между уровнем БРаз и общей активностью ЩФ в сыворотке крови больных опухолями костей в стадии прогрессирования не удалось, возможно, из-за незначительного количества обследованных.

Таблица 12. Показатели «Рае в сыворотке крови больных опухолями костей в зависимости от пола, локализации опухоли, возраста и наличия метастазов_

Категория обследованных Число наблюдений Частота выявления враг, % Средний уровень эРав (М±т), нг/мл

Практически здоровые люди 102 36 0.9±0.3'

Новообразования костей 101 88 4.5+0.52

Новообразования костей без метастазов 91 88 4.8+0.63

Новообразования костей с метастазами 10 80 2.1±0.44

Пол Мужчины 53 88 4.3±0.7

Женщины 48 90 4.7 ±0.6

Локализация опухоли Трубчатые кости 61 85 4.3±0.7

Плоские кости 30 93 4.9±0.7

Примечание: р1уз2<0.001; р1\'зЗ<0.001; рЗ\з4>0.05; р5уз6<0.001.

В группе больных опухолью Юинга было 7 мужчин и 3 женщины в возрасте от 15 до 33 лет. эраэ в сыворотке крови был выявлен у всех пациентов, его средний уровень был одним из самых высоких среди всех нозологических форм новообразований скелета, при этом повышенная концентрация эРаэ была отмечена у 7 человек (70%) (табл. 11). Средний уровень концентрации УЕйР больных опухолью Юинга (448.0±98.б пг/мл) достоверно превышал соответствующий показатель контрольной группы, корреляционной зависимости между показателями зБаз и УЕвР и вРаэ и общей активностью ЩФ выявлено не было.

При первичной остеогенной саркоме у 72% (23) больных наблюдали повышенное содержание зРая и у 72% (23) отмечали также повышение общей активности ЩФ. У 6 из них показатели активности фермента во много раз превышали норму и находились в пределах 1165-5394 ЕД/л, повышенное содержание Брав было отмечено у 5 из этих больных (от 1.3 до 5.7 нг/мл). Статистический анализ выявил достоверную положительную корреляцию между показателями ББаБ и общей активности ЩФ при первичной остеогенной саркоме (1=0.75, р=0.049). В этой группе больных проводили определение концентрации УЕОР в сыворотке крови (табл. 13).

Таблица 13. Показатели «Рае и УЕвК в сыворотке крови больных остеогенной саркомой и практически здоровых людей в зависимости от пола_

Категория обследованных Число наблю дений Возраст, годы sFas, нг/мл VEGF, пг/мл

М±т Пределы колебаний М+т Пределы колебаний

Практически здоровые люди Муж. 20 18.0+0.5 0.9±0.4 0.3-1.2 68.4±29.5" 14.4-149.3

Жен. 11 28.0±4.6 0.9±0.3 0.3-1.2 230.2±20.1 190.3-250.3

Остеоген-ная саркома Муж. 23 17.2±1.3 4.0+1.2 0.5-24.6 240.1±75.42 78.5-521.4

Жен. 9 26.3±4.1 3.1±0.6 0.6-16.2 198.0+45.8 110.2-287.6

Примечание: plvs2<0.05.

Средний уровень VEGF у женщин контрольной группы превышал соответствующий показатель мужчин. Средний уровень VEGF у мужчин с первичной остеогенной саркомой достоверно превышал средний уровень VEGF в сыворотке крови практически здоровых мужчин, но не отличался от показателя женщин контрольной группы. Различий в среднем уровне VEGF в сыворотке крови между женщинами с первичной остеогенной саркомой и женщинами контрольной группы выявлено не было. Не было выявлено корреляции между уровнями sFas и VEGF в группе больных первичной остеогенной саркомой.

Мы изучали связь уровня sFas в сыворотке крови больных остеогенной саркомой с прогнозом данного заболевания.

Максимальный срок наблюдения за обследованными больными составил 3 года, за этот период времени удалось проследить только одного больного, который умер от

основного заболевания через 36 месяцев от начала лечения. Общая выживаемость в группе за указанный срок составила 0%, безрецидивная - за 35 месяцев - 15.6%.

У 9 из 32 больных остеогенной саркомой уровень вРаэ в сыворотке крови не превышал 1.2 нг/мл. 4 (44.8%) из них за время наблюдения умерли от основного заболевания, 5 - остались живы. Общая выживаемость, как и безрецидивная, за 35 месяцев в этой группе больных составила 55.2%.

В крови 23 больных при первичном обследовании определили повышенное содержание эРаз, за время наблюдения 20 (87%) из них умерли. Общая выживаемость в этой 1руппе больных за 35 месяцев составила 13%, безрецидивная - 8.7%.

Таким образом, у больных остеогенной саркомой с повышенным содержанием зРаэ (>1.2 нг/мл) в крови показатели общей (р=0.018) и безрецидивной (р=0.012) выживаемости больных первичной остеогенной саркомой за 35 месяцев были хуже, чем у больных с содержанием БраБ в крови в пределах нормы.

Содержание вРав, 1Ь-6 и УЕвР в сыворотке крови больных новообразованиями

яичников

вРаэ выявляли в сыворотке крови у 80.2% (162) больных ДОЯ, у 55.3% (78) больных РЯ и у 40% женщин контрольной группы (48). Концентрация зРаэ в сыворотке крови больных новообразованиями яичников была достоверно выше, чем в группе контроля (р=0.0001), при этом различия уровней БРаэ между группами больных ДОЯ и раком яичников были статистически не достоверны (р=0.58) (табл. 14).

Таблица 14. Показатели вРав, УЕвР и 1Ь-6 в сыворотке крови контрольной группы и больных новообразованиями яичников __

Группы Число больных Пределы колебаний, медиана Браэ, нг/мл Пределы колебаний, медиана УЕвР, пг/мл Пределы колебаний, медиана 1Ь-б, пг/мл

Контроль 120 0.4-1.2 0.9 15.0-323.0 198.0 0.6-3.1 . 1.0

Больные ДОЯ 206 0.7-20.0 2.2 16.9-1098.0 208.4 0.7-13.4 2.9

Больные РЯ 141 0.7 - 20.5 2.5 75.6-1029.0 56.01 0.4 - 40.9 8.9

Концентрация УЕйР в сыворотке крови больных РЯ была достоверно выше, чем у больных ДОЯ и женщин контрольной группы, различий между группой контроля и группой больных ДОЯ не выявили, при этом медиана уровня 1Ь-6 у больных ДОЯ была выше, чем в группе контроля, но ниже, чем у больных РЯ. Были определены пороговые значения показателей, наилучшим образом разделяющих обследованные группы. Так, уровни вРаэ и УЕвР, разделяющие группы больных опухолями яичников и группу контроля, равнялись 1.2 нг/мл и 350.0 пг/мл, соответственно, а уровни 1Ь-6 - 1.5 и 4.0 пг/мл были пороговыми значениями, разделяющими группы контроля и больных ДОЯ, и пациентов ДОЯ и РЯ, соответственно.

Уровни вБав и 1Ь-6 в сыворотке крови достоверно не зависели от возраста и фазы менструального цикла больных во всех обследованных группах, тогда как у больных ДОЯ концентрация УЕОР повышалась пропорционально возрасту пациенток (р=0.005).

Концентрация эРаэ зависела от гистогенеза опухоли у больных ДОЯ и РЯ. Так, при эндометриоидной кисте концентрация эРаэ была достоверно выше, чем при кисте желтого тела (р=0.038) и при фолликулярной кисте (р=0.01). При папиллярной цистаденоме, опухоли Бреннера, муцинозной кисте и муцинозной пограничной опухоли выявляли только «высокие» уровни Брав. Следует отметить, что содержание эРаэ в сыворотке крови больных фибромой и у половины пациенток с фолликулярной кистой, цистаденофибромой, простой серозной кистой яичников соответствовали уровню вРая группы контроля. Уровень бРэб при папиллярной цистаденокарциноме был достоверно выше, чем при серозной (р=0.018). «Низкие» уровни бРэб у больных раком яичников реже выявляли при папиллярной цистаденокарциноме (10.5%), муцинозной аденокарциноме (33.3%) и при эндометриоидной аденокарциноме (35.7%), но различия между группами были не достоверны из-за несопоставимого количества больных в группах (р=0.1).

Концентрация УБвР в сыворотке крови больных ДОЯ также зависела от гистологического строения опухоли (р=0.027). Наибольшие медианы концентрации УЕОР были у больных опухолью Бреннера (733.3 пг/мл), пограничной цистаденомой (454.3 пг/мл) и муцинозной пограничной опухолью (624.4 пг/мл), а наименьшие - у больных дермоидной кистой (84.4 пг/ми), кистой желтого тела (78.0 пг/мл), фолликулярной кистой (67.5 пг/мл), папиллярной цистаденомой (59.5 пг/мл) и простой серозной кистой (73.3 пг/мл). «Высокие» значения эРаБ и УЕОР в сыворотке крови больных этими опухолями позволяют предположить злокачественный потенциал этих новообразований. Наиболее высокую концентрацию УЕОР при РЯ отмечали у больных серозной цистаденокарциномой (796.0 пг/мл), папиллярной цистаденокарциномой (670,5 пг/мл) и серозным раком (625.0 пг/мл), а наименьшие - у больных эндометриоидной аденокарциномой (409.0 пг/мл). При этом у 25% больных серозной цистаденокарциномой уровни УЕОР соответствовали значениям показателя в контрольной группе (все больные с 3 стадией заболевания с выраженным асцитом, с метастазами в сигмовидную и тонкую кншку).

Содержание 1Ь-6 в сыворотке крови больных простыми серозными и фолликулярными кистами яичников достоверно не отличалось от соответствующего показателя контрольной группы. В то же время уровень 11,-6 при серозной и папиллярной цистаденоме и при цистаденофиброме достоверно не отличался от соответствующего показателя больных раком яичников.

Концентрация эРаэ достоверно зависела от размера опухоли у больных ДОЯ и РЯ. Так, в группе больных ДОЯ при размере опухоли до 5 см медиана концентрации Браз составила 1.6 нг/мл, а при размере опухоли более 5 см - 2.5 нг/мл (р=0.001). В группе больных РЯ с опухолью до 5 см медиана концентрации бРэб была 0.8 нг/мл, а при ббльших размерах опухоли - 2.0 нг/мл (р=0.0005). При этом выявили корреляционную

связь уровня Браэ и размера опухоли у больных эндометриоидной кистой яичников (г=0.8б; р=0.003), серозной цистаденомой во II фазе менструального цикла (г=0.8б; р=0.044) и папиллярной цистаденокарциномой (г=0.49; р=0.033). Уровни УЕОР и 11,-6 достоверно не зависели от размера опухоли у больных ДОЯ и РЯ, при этом у больных ДОЯ пропорциональное изменение концентрации 1Ь-6 относительно размера опухоли наблюдали только при «низких» значениях вРаэ в сыворотке крови (г=0.6; р=0.003).

Концентрация эРав также достоверно зависела от стадии заболевания и степени дифференцировки опухоли (табл. 15 и 16).

Таблица 15. Показатели sFas больных РЯ в зависимости от стадии заболевания

Стадия заболевания Число больных sFas, нг/мл М±т Медиана

1 28 1.2±0.4 0.8

2 34 1.8±0.4 1.2

3 74 2.0±0.5 1.4

4 5 2.4±0.9 1.6

Уровни УЕОР и 1Ь-6 достоверно не зависели от стадии заболевания и степени дифференцировки опухоли.

У больных РЯ выявлена прямая корреляционная зависимость между уровнями эРаэ и УЕОР при концентрации 1Ь-6 более 4 пг/мл (г=0.75; р=0.001) и обратная корреляционная зависимость между концентрацией вРая и 1Ь-6 при метастазах в толстую кишку (г=-0.68; р=0.014). В группе больных РЯ с размером первичной опухоли более 10 см обнаружили прямую корреляционную зависимость между содержанием 1Ь-6 и УЕйБ в сыворотке крови (г=0.62; р=0.07).

Таблица 16. Показатели sFas у больных РЯ в зависимости от степени дифференцировки опухоли_____

Степень дифференцировки опухоли Число больных sFas, нг/мл М±т Медиана

Низкая и умеренная 62 2.7±0.5 1.7

Высокая 79 1.6±0.4 1.1

В сыворотке крови практически здоровых женщин преобладали одновременно «низкие» значения как IL-6, так и sFas в 75% наблюдений. У четверти женщин контрольной группы при «низком» уровне sFas концентрация IL-6 колебалась от 1.5 пг/мл до 4 пг/мл. В сыворотке крови больных ДОЯ преобладали «высокие» концентрации sFas, а значения концентрации IL-6 колебались в том же диапазоне - от 1.5 пг/мл до 4.0 пг/мл (63% наблюдений). Таким образом, для ДОЯ характерна высокая концентрация sFas в сыворотке крови при концентрации IL-6, сопоставимой с показателями контрольной группы. Одновременно «низкие» значения sFas и IL-6 были выявлены в сыворотке крови только у 8.6% больных ДОЯ.

Обнаружено, что в сыворотке крови 50% больных РЯ преобладали одновременно «высокие» значения обоих показателей. Одновременно «низкие» значения Брав и 1Ь-6 выявлены только у 8.3% больных раком яичников. Различия между группами больных ДОЯ и РЯ были высоко достоверными (р=0.001) (рис. 4).

больные ДНЯ

больные ЗНЯ

Рис. 4. Распределение больных доброкачественными новообразованиями, раком яичников и женщин контрольной группы в зависимости от пороговых значений и 1Ь-6 в сыворотке крови

Следует отметить, что у 57% больных 1 стадии РЯ обнаруживали повышенные значения всех трех показателей, у 35.7% больных был повышен либо врав, либо 1Ь-б и таким образом, диагностическая ценность показателей была очень высока уже при 1 стадии заболевания.

Была изучена связь первичного уровня врав с показателями общей и безрецидивной выживаемости больных РЯ за 5-летний период наблюдения. Общая выживаемость больных РЯ с концентрацией врав в сыворотке крови выше 5 нг/мл уменьшалась не достоверно (р=0.3). При этом в группе больных папиллярной цистаденокарциномой с уровнем эРаэ выше 5 нг/мл показатели 5-летней общей выживаемости (31.1 ±17.9%) были хуже, чем у этой же категории больных с первичной концентрацией эРаэ менее 5 нг/мл (83.3±15.2%), р=0.01. Выявили также статистически значимое снижение общей выживаемости (р=0.0042) больных РЯ с размерами опухоли 5-10 см при содержании зБав в сыворотке крови более 5 нг/мл: 5-летняя выживаемость в этой группе составила 31.3+25.5%, а при уровне эРаэ менее 5 нг/мл - 89.9±6.9%, Можно предположить, что эРав в сыворотке крови в концентрации выше 5 нг/мл влияет на общую выживаемость больных РЯ в сочетании с некоторыми другими неблагоприятными факторами.

Выявлено достоверное снижение безрецидивной выживаемости больных РЯ без метастазов (р=0.028) при содержании эРаэ в сыворотке крови выше 5 нг/мл. Так, 3-летняя безрецидивная выживаемость больных раком яичников этой группы составила 30.0±9.4%, а медиана срока жизни без рецидива болезни равнялась 2.3 года. В то же время 3-летняя безрецидивная выживаемость больных раком яичников с уровнем БРаБ в сыворотке крови

ниже 5 нг/мл составила 52.8±б.9%, а медиана безрецидивной выживаемости - 3 года (рис. 5).

Срок наблюдения лоел» лечения (мое.)

Рис. 5. Безрецндивная выживаемость больных раком яичников в зависимости от уровня sFas в сыворотке крови

Таким образом, нами показана связь показателей sFas в сыворотке крови больных раком яичников с показателями общей и безрецидивной выживаемости пациенток.

Содержание sFas, VEGF, IL-6 в сыворотке крови больных раком тела матки

Определяли концентрацию sFas, VEGF и IL-6 в сыворотке крови у 111 больных раком тела матки и у 120 практически здоровых женщин в возрасте от 18 до 67 лет. Концентрация всех изучаемых факторов в сыворотке крови больных РТМ высоко достоверно превышала соответствующие показатели контрольной группы (табл. 17).

Таблица 17. Показатели sFas, и VEGF IL-6 в сыворотке крови больных РТМ

Группы, число обследованных sFas, нг/мл VEGF, пг/мл IL-6, пг/мл

М±т Медиана Диапазон колебаний М+т Медиана Диапазон колебаний М±т Медиана Диапазон колебаний

Контроль, 120 0.9+0.1 0.9 0.3 - 1.2 179.7±13. 4 198.0 15.0-323.0 1.1+0.4 1.0 0.56-3.1

Больные РТМ, 111 5.3±0.5 3.7 0.6-21.0 293.1±30. 9 349.0 15.01090.0 13.6+1.2 5.5 0.9 - 40.9

Показатели эРаБ, УЕвР и 1Ь-6 в сыворотке крови высоко достоверно зависели от размера опухоли больных РТМ (табл. 18).

Таблица 18. Показатели вГая, УЕвР и 1Ь-6 в сыворотке крови больных РТМ в зависимости от размера опухоли

Размер опухоли, число больных враз, нг/мл УЕОР, пг/мл 1Ь-6, пг/мл

М±т Медиана Диапазон колебаний М±т Медиана Диапазон колебаний М±т Медиана Диапазон колебаний

До 2 см, 68 3.0±0.3 1.9 0.6-12.0 76.3±18.8 23.3 15-1024 6.0±0.8 3.1 0.9-40.8

2.1 - 5.0 см, 34 8.4±1.0 6.9 0.9-21.0 678.4±37.9 676.5 41-1067 26.5+1.7 27.9 2.0-40.9

5.1 см и более, 9 11.4±1.4 12.6 5.9-18.9 834.0±78.3 915.0 432-1090 35.4±1.6 36.8 25.9-40.5

Обнаружена корреляционная связь между содержанием зБав и размером опухоли (г=0.65; р=0.0001), причем степень тесноты этой зависимости была выше в 1 фазе менструального цикла (г=0.68; р=0.001). Уровень УБОР при РТМ также коррелировал с размером опухоли (г=0.8; р=0.001).

Показатели эРаэ, УЕОР и 1Ь-6 в сыворотке крови больных РТМ достоверно зависели от стадии заболевания (табл. 19).

Таблица 19. Показатели вРав, УЕвР и 1Ь-6 в сыворотке крови больных РТМ в зависимости от стадии заболевания

Стадия заболевания, число больных Браэ, нг/мл УЕОР, пг/мл 1Ь-6, пг/мл

М±т Медиана Диапазон колебаний М±т Медиана Диапазон колебаний М±т Медиана Диапазон колебаний

1, п=24 1.8+0.3 1.0 0.7-6.3 29.0+3.3 19.0 15-123 3.5±0.6 2.5 0.9-21.5

2, п=40 3.4±0.5 2.4 0.6-12.0 50.6±10.9 23.5 15-345 6.0±0.9 3.6 0.9-26.6

3, п=37 8.5±1.0 6.8 0.9-21.0 688.1±36.6 678.0 45.71067.0 26.5±1.8 27.9 1.5-40.9

4, п=10 9.2±1.2 8.4 4.0-14.3 842.7+68.8 906.0 456-1090 35.5±1.4 36.9 25.9-40.5

Частота выявления одновременно «высоких» значений концентрации врав, УЕйР и 1Ь-6 была наибольшей в 3 и 4 стадии болезни, при этом у половины больных 1 стадии обнаруживали одновременно «низкие» уровни изучаемых факторов.

Показатели ББаБ, УЕвР и 11,-6 в сыворотке крови высоко достоверно зависели также от степени дифференцировки опухоли больных РТМ (табл. 20).

Таблица 20. Показатели вРаз, УЕвР и 1Ь-6 в сыворотке крови больных РТМ в зависимости от степени дифференцнровки опухоли__

Степень дифференцировки опухоли, число больных зРаэ, нг/мл УЕйР, пг/мл 1Ь-6, пг/мл

М±т, медиана Диапазон колебаний М±т, медиана Диапазон колебаний М±т, медиана Диапазон колебаний

01, п=34 1.9±0.3 1.4 0.7-6.3 33.9±5.4 23 15-234 4.0±0.5 2.9 0.9-21.5

02, п=40 4.510.6 3.7 0.6-14.1 193.4+44.6 34.0 15-1024 10.7±1.8 3.6 1.3-40.9

вз, п=37 9.3±1.0 7.1 1.0-21.0 717.0+37.5 781.0 156-1090 28.4±1.7 29.6 7.6-40.8

При низкой степени дифференцировки опухоли у больных РТМ частота выявления в сыворотке крови одновременно высоких значений концентрации вРав, УБвР и 1Ь-6 была наибольшей.

Концентрация изучаемых факторов не зависела от морфогенеза опухоли, но достоверно повышалась при увеличении глубины прорастания опухоли в стенку матки (табл. 21).

Таблица 21. Показатели зРаз, \TiGF и 1Ь-6 в сыворотке крови больных РТМ в зависимости от глубины прорастания опухоли в стенку матки_

Глубина прорастания в стенку матки, число больных вРаэ, нг/мл УЕОР, пг/мл 1Ь-6, пг/мл

М±т Медиана Диапазон колебаний М±т Медиана Диапазон колебаний М±т Медиана Диапазон колебаний

До 1 см, п=39 3.3+0.4 2.4 0.6-12.0 61.1±17.4 23.5 15-670 6,2±0.9 3.6 0.9-28.1

Более 1 см, п=10 5.7±1.0 6.6 1.0-9.8 563.2±112. 2 678.0 19-1024 24.6±4.7 28.8 1.5-40.8

Менее 14 миометрия, п=4 9.0+4.1 6.6 1.9-21.0 527.8±45.5 551.5 398-610 33.7±3.4 35.9 23.7-39.1

Более 'Л миометрия, п=2б 8.9+1.1 6.9 1.7-20.5 737.7±42.1 785.0 345-1090 27.8±1.9 27.8 9.6-40.9

В пределах эндометрия, п=32 3.0±0.7 1.4 0.7-14.5 74.6+25.3 23.0 15-895 4.7±0.9 2.8 0.9-31.2

Выявили достоверные корреляционные связи уровней эРаБ и 1Ь-6 (г=0.56; р=0.01), эРаэ и УЕвР (г=0.58; р=0.01) и УЕОР и 1Ь-6 (г=0.79; р=0.01) в сыворотке крови больных РТМ.

У 36.9% больных РТМ обнаружили одновременно «высокие» уровни всех трех показателей в сыворотке крови, у 27.9% пациенток- «высокое» содержание вРаэ при «низких» концентрациях 11,-6 и УЕйР, у 10.8% больных — «высокие» уровни эРаэ и 1Ь-6

при «низком» содержании УЕйР, у 18.9% - одновременно «низкие» значения всех показателей. Наиболее редко выявляли сочетание «высоких» уровней враз и УЕвР при «низком» содержании 1Ь-6 в сыворотке крови больных раком тела матки, а также сочетание «высоких» концентраций УЕвР или 1Ь-6 при «низком» уровне Брав (4.5%) (рис. 6). Частота выявления неблагоприятного уровня эРаБ в сыворотке крови больных раком тела матки составила 76.6% (85) и была выше частоты выявления неблагоприятных уровней 11.-6 и УЕвР.

Рис. 6. Распределение больных раком тела матки в зависимости от уровней УЕвР и 1Ь-6 в сыворотке крови

Важно отметить, что у большинства больных в 1 стадии заболевания концентрация изучаемых факторов не превышала соответствующих значений группы контроля. Повышенную концентрацию эРав наблюдали у 37.5% больных РТМ в 1 стадии, 1Ь-6 - у 4.2%, эРаэ и 1Ь-6 - у 8.4%. Таким образом, при 1 стадии РТМ прогностическая информативность УЕйР составляла 0%, 1Ь-6 - 12.5%, эРаз - 45.9%. Следовательно, при выявлении ранней стадии РТМ наибольшей диагностической ценностью обладал эРаз.

С целью установления диагностической значимости Браз, 1Ъ-6 и УЕвР в сыворотке крови больных РТМ и практически здоровых женщин контрольной группы проводили дискриминанты® анализ. Были получены хорошие результаты распознавания: в классе контрольной группы - 92.3% правильных распознаваний, в классе больных раком тела матки - 91%, общая ошибка составила 8.9% при учете показателей эРав, УЕйР и 1Ь-б и возраста больных. При учете только концентрации эРаэ в сыворотке крови, возраста обследуемой и фазы менструального цикла качество распознавания было несколько ниже, однако также удовлетворительным (1 класс - 85.7%, 2 класс - 92.9%, общая ошибка -

«Высокие» и «низкие» уровни эРаэ в сыворотке крови были достоверно связаны с показателями общей выживаемости больных РТМ (р=0.0021). Так, 5-летняя общая выживаемость больных раком тела матки с «низкими» значениями эРаэ составила

1 -8% т ?.-7%

ВвРа8>1,2; УЕвр>350; ИЛ-6>2 ®вРав>1,2; УЕСР<350; ИЛ-6<2 ИвРав>1,2; УЕ6Р<350; ИЛ-6>2 ЯвРа8>1,2; УЕ6Р>350; ИЛ-6<2 *8Ра8<1,2; УЕвРОбО; ИЛ-6<2 МвРав<1,2; УЕвР>350; ИЛ-6>2 ■ вРав<1,2; УЕйр<350; ИЛ-6>2 □ вРав<1,2; УЕ6Р>350; ИЛ-6<2

27.9%

10.3%).

95.7±4.3% (медиана выживаемости не достигнута), а при «высоких» его значениях — 65.3±5.9% (медиана не достигнута).

Наблюдали также достоверное (р=0.0008) различие показателей безрецидивной выживаемости у больных РТМ при «низких» и «высоких» уровнях sFas в сыворотке крови (рис. 7). У больных раком тела матки с «низким» содержанием растворимого Fas 5-летняя безрецидивная выживаемость составила 19.2±7.7% (медиана 4 года), а при «высоких» — 7.6+3.8% (медиана 2.9 лет).

• развились метастазы □ метастазов нет

Срок наблюдения после лечения (летй

Рис. 7. Безрецидивная выживаемость больных РТМ в зависимости от уровня sFas в сыворотке крови

sFas и VEGF в сыворотке крови больных колоректальным раком

Проводили определение концентрации sFas и VEGF у 113 первичных больных КРР и анализ изучаемых показателей в зависимости от основных клинических характеристик заболевания. Растворимый Fas был выявлен в сыворотке крови 104 больных колоректальным раком (92.5%), концентрация sFas колебалась от 0.6 до 14.5 нг/мл, медиана - 2.3 нг/мл. Эти показатели были достоверно выше, чем в контрольной группе. Большинство значений концентрации sFas у больных КРР находилось в интервалах от 2 до 3 нг/мл - (33.3%), у 8 пациентов (7.0%) sFas выявлен не был. Не было достоверных различий в уровне sFas в сыворотке крови между мужчинами и женщинами, больными колоректальным раком (р=0.45).

VEGF был выявлен у всех обследованных больных КРР. Концентрация VEGF колебалась от 125.0 до 557.0 нг/мл, медиана равнялась 222.5 нг/мл. Большинство значений концентрации VEGF у обследованных нами больных злокачественньми новообразованиями ободочной и прямой кишок находилось в интервалах от 200 до 300 пг/мл (38.2%). Средний уровень VEGF у мужчин, больных КРР был достоверно выше, чем у мужчин группы контроля (72.3±28.3 пг/мл). Различия концентрации VEGF между женщинами, больными КРР, и женщинами контрольной группы были не достоверны -средние уровни VEGF 287.9±34.4 и 227.3+16.4 пг/мл, соответственно.

Уровни sFas и VEGF в сыворотке крови обследованных нами больных колоректальным раком повышались с увеличением стадии заболевания (табл. 22).

Таблица 22. Показатели вРая и УЕйР в сыворотке крови больных колоректальным раком при разных стадиях заболевания_.__________

Стадия заболевания (по Оике'в) Число больных вРаэ, нг/мл УЕОР, пг/мл

М±т медиана М±т медиана

А 30 1.7±0.6 1.2 175.1±9.2 174.0

В 39 1.9+0.3 2.1 223.1±13.7 215.0

С 30 3.5±0.6 2.7 396.2+33.7 405.0

О 14 4.6±0.1 4.7 465.0±39.4 454.0

Не выявлено различий в показателях вБаБ между мужчинами и женщинами при одинаковых стадиях заболевания, тогда как концентрация УЕОР на поздних стадиях болезни была выше у женщин, чем у мужчин.

Дисперсионный анализ не выявил различий в уровнях вРаэ в зависимости от степени дифференцировки опухоли у больных КРР (р=0.8), в то же время концентрация УЕОР при низкой степени дифференцировки опухоли была выше, чем при умеренной и высокой (р=0.036). Не выявлено различий в средних уровнях УЕОР между мужчинами и женщинами в зависимости от степени дифференцировки колоректальной аденокарциномы.

Обнаружили достоверное (р=0.044) повышение концентрации эРаэ при увеличении глубины инвазии опухоли в стенку кишки (табл. 23), при этом значительно более низкие уровни вРаэ были выявлены у больных КРР при прорастании опухоли в мышечный слой (0.7±0.2 нг/мл) по сравнению с прорастанием во все слои кишки (2.3+0.6 нг/мл) (р=0.03). Также выявили достоверное (р<0.05) повышение концентрации УЕОР в сыворотке крови в зависимости от глубины инвазии опухоли.

Таблица 23. Показатели зКаз и УЕСГ в сыворотке крови больных колоректальным раком в зависимости от глубины инвазии_

Глубина инвазии Число больных Браэ, нг/мл УЕОР, пг/мл

М±т медиана М±т медиана

Р2 12 1.7±1.0 1.1 201.4±19.4 195.0

РЗ 15 2.2±0.7 1.4 190.0±19.3 188.0

Р4 54 2.7±0.7 2.4 292.7±25.3 250.0

Средний уровень УЕОР у больных КРР с глубиной инфильтрации Р4 был достоверно выше, чем при Р2-3 (р=0.04). Уровни вРаэ и УЕОР были достоверно выше при инфильтративном характере роста, чем при смешанном типе инвазии (р=0.02).

У больных КРР без метастазов в регионарных лимфатических узлах или при наличии только одного метастаза концентрация эРаэ была достоверно ниже (р=0.03), чем у больных с 2 и более метастазами (1.8±0.3 нг/мл, 1.7+0.7 нг/мл и 3.6±0.4 нг/мл, соответственно).

Концентрация УЕОР у больных КРР также высоко достоверно зависела от наличия и числа метастазов: при отсутствии метастазов средний уровень УЕОР был наименьшим -202.2+9.9 пг/мл, при наличии одного метастаза возрастал до значения 290.0±20.0 пг/мл, а у больных с 2 и более метастазов был наибольшим - 437.5±0.7 пг/мл (р=0.00001). Самый высокий уровень УЕОР (557.0 пг/мл) выявлен у больной КРР с наибольшим числом метастазов (5) в регионарных лимфатических узлах.

Не было обнаружено корреляционной связи уровней эРаэ и УЕОР с возрастом больных во всех группах больных, также не выявили корреляции между значениями концентрации эРаэ и УЕОР при КРР.

Нами оценена эффективность проведения предоперационной лучевой терапии у больных КРР по данным морфологического изучения степени выраженности лечебного патоморфоза после хирургического удаления опухоли в зависимости от первичных показателей Браэ в сыворотке крови. У больных КРР с отсутствием эффекта от лучевой терапии концентрация эРаз до лечения была высокой (4.7±1.3 нг/мл), а при наибольшей выраженности постлучевого патоморфоза опухоли - на уровне показателей контрольной группы (1.0+0.3 нг/мл). Коэффициент корреляции между Браз в сыворотке крови больных КРР и степенью выраженности лечебного патоморфоза составил г5= -0.52 (р=0.049).

Наилучшие результаты предсказания ответа больных колоректальным раком на предопреционную лучевую терапию (р=0.005) получили при использовании в модели уровня Брая (р=-0.72±0.23; р=0.017) и возраста пациента (р=-0.51±0.23; р=0.06). Приводим уравнение регрессии:

Величина лечебного патоморфоза = 5.47 - 0.05хвозраст - 0.56хзРа$

Не выявлено достоверной связи между степенью выраженности лечебного патоморфоза опухоли после лучевой терапии и значениями концентрации УЕОР в сыворотке крови больных КРР (р=0.3).

Таким образом, пожилой возраст и высокие показатели Браэ в сыворотке крови больного колоректальным раком являются неблагоприятными предиктивными факторами ответа пациента на предоперационную лучевую терапию.

sFas в сыворотке крови и иРА в опухолевой ткани при новообразованиях щитовидной железы

Проводили количественное определение sFas в сыворотке крови и иРА в опухолевой ткани у больных с различными патологиями щитовидной железы. Обследовали 141 больного в возрасте от 17 до 73 лет.

Растворимый Fas в сыворотке крови и иРА в опухоли больных РЩЖ

Частота выявления sFas и его средний уровень в сыворотке крови больных РЩЖ были достоверно выше, чем в группе контроля (р=0.001). Так, частота выявления sFas при РЩЖ составила 96.8%, а в контрольной группе -36.0%. Концентрация sFas у больных изменялась от 0.8 до 13.9 нг/мл (средний уровень 3.1±0.5 нг/мл), в контрольной группе диапазон колебаний sFas был значительно уже - 0.3-1.4 нг/мл (средний уровень 0.9±0.30 нг/мл). Надо отметить, что у 62% обследованных больных РЩЖ уровни sFas в сыворотке крови были выше верхнего предела этого показателя в группе контроля.

У женщин, больных РЩЖ, обнаружена более низкая концентрация sFas в возрасте от 41 до 52 лет (1.9±0.5 нг/мл), при этом в возрастной группе от 45 до 52 лет показатели sFas в сыворотке крови не отличались от соответствующих показателей контрольной группы (0.9±0.1 нг/мл). У больных женщин старше 53 лет средний уровень sFas был достоверно выше (3.4±0.9 нг/мл, р<0.05). Выявлена обратная корреляционная зависимость между уровнем sFas в сыворотке крови и возрастом больных РЩЖ женщин в возрасте 45-52 лет.

Показатели иРА в ткани опухоли при РЩЖ не зависели от возраста пациентов. Не выявили корреляционной связи между показателями sFas в сыворотке крови и содержанием иРА в опухоли.

Показатели sFas в сыворотке крови и иРА в ткани опухоли были проанализированы в зависимости от стадии опухолевого процесса (табл. 24).

Таблица 24. Содержание вРаз в сыворотке крови и иРА в опухоли больных РЩЖ в зависимости стадии опухолевого процесса __

Стадия заболевания Число наблюдений Пределы колебаний М+ш

I стадия

sFas* 6 1.0-5.7 2.3±0.7

иРА** 6 0.11-0.43 0.2±0.05

II стадия

sFas 12 0.9-13.9 4.0±1.0

uPA 12 0.03-1.68 0.52±0.15

III стадия

sFas 11 0.8-4.6 2.4±0.4

uPA 12 0.03-2.17 0.85±0.26

Примечание: * концентрация БРаэ - нг/мл; **содержание иРА - нг/мг белка.

Уровень Браз в сыворотке крови больных РЩЖ не зависел от стадии болезни, в то же время отмечали достоверное повышение содержания иРА в цитозольной фракции опухоли при увеличении стадии опухолевого процесса (р<0.05). Достоверной корреляционной

зависимости между показателями эраэ и иРА у больных РЩЖ в различных стадиях болезни не выявлено (I стадия - г=-0.33; II стадия - г= -0.42; III стадия - г= 0.34).

Было обнаружено, что уровень Браэ в сыворотке крови больных РЩЖ зависел от размера опухолевого узла (р=0.035) (табл. 25).

Таблица 25. Содержание эРав в сыворотке крови и иРА в опухоли больных РЩЖ в зависимости от размера опухоли___

Размер опухолевого узла, см Число наблюдений Пределы колебаний М±т

<2.5

sFas* 16 0.9-5.7 1.9±0.4'

иРА** 16 0.09-1.68 0.50±0.20

=>2.5

sFas 16 0.8-6.8 3.6±0.7¿

uPA 16 0.03-2.17 0.89±0.40

Примечание: *концентрация sFas - нг/мл; **содержание иРА - нг/мг белка; plvs2<0.05.

Была выявлена достоверная корреляционная зависимость (г=0.71) между уровнем sFas в сыворотке крови и размером опухоли при I и II стадиях заболевания. Следует отметить, что в группе больных женщин во II стадии РЩЖ в возрасте 45-65 лет эта зависимость носила более выраженный характер (г=0.9). В этой группе больных при размере опухоли менее 2.5 см средний уровень sFas составил 1.1±0.4 нг/мл, а при размере новообразования, равном или превышающем 2.5 см, - 5,5±1.б нг/мл. Уровень содержания иРА в цитозоле опухолей достоверно pie зависел от размера опухоли.

Уровень sFas в сыворотке крови и содержание иРА в опухоли не зависели от гистогенеза опухоли больных РЩЖ'. Средний уровень sFas при папиллярном раке был равен 3.1±0.8 нг/мл, а при фолликулярном - 3.2±0.5 нг/мл, показатели иРА тоже практически не различались между собой. Статистический анализ не выявил корреляционной зависимости между изучаемыми показателями.

Изучали зависимость показателей sFas в сьшоротке крови и иРА в ткани опухоли от степени дифференцировки новообразования (табл. 26).

Таблица 26. Содержание sFas и иРА у больных РЩЖ в зависимости от степени дифференцировки опухоли ___

Степень дифференцировки опухоли Число наблюдений Пределы колебаний М±т

Высоко дифференцированный рак

sFas* 25 0.8-13.9 2.9±0.6

uPA** 25 0.03-2.17 0.55±0.14

Умеренно дифференцированный рак

sFas 7 1.8-6.1 3.7±0.7

uPA 7 0.08-2.17 0.84±0.39

Примечание: ^концентрация эРаБ - нг/мл; ** содержание иРА - нг/мг белка.

Отмечали более высокие уровни вРаэ в сыворотке крови и иРА в опухоли при умеренно дифференцированном раке (р=0.1).

При множественных узлах опухоли в щитовидной железе обнаружили более высокие уровни Брав в сьшоротке крови больных РЩЖ, чем при одиночном опухолевом узле,

однако эти различия статистически не достоверны. Содержание иРА в опухоли также не зависело от характера ее роста.

При наличии метастазов в регионарных лимфатических узлах содержание иРА в опухоли было значительно выше, тогда как средние показатели sFas в сыворотке крови этих двух групп пациентов достоверно не различались. Кроме того, выявлена обратная корреляционная связь между уровнями sFas и иРА у больных с наличием метастазов опухоли в регионарных лимфатических узлах (г= -0.85).

Не было выявлено достоверной зависимости показателей общей (р=0.23) и безрецидивной (р=0.35) выживаемости больных РЩЖ от показателей sFas в сыворотке.

Растворимый Fas в сыворотке крови больных аденомой щитовидной железы В общей группе больных новообразованиями щитовидной железы было 16 пациентов с аденомой. Из 16 обследованных больных sFas в сыворотке крови был выявлен у 12, что составило 75% против 36% в группе контроля (табл. 27).

Таблица 27. Показатели вРав в сыворотке крови здоровых людей, больных раком и аденомой щитовидной железы__

Группы обследованных больных Число наблюдений Возраст (годы) Частота выявления sFas, % sFas, нг/мл (M+m)

Группа контроля 60 50.0±2.3 36.0 0.9±0.3'

Рак щитовидной железы 32 51.7±2.7 96.9 3.0±0.52

Аденома щитовидной железы 16 53.4±2.4 75.0 1.4+0.43

Примечание: р1уз2<0.05; р1узЗ>0.05; р2\-зЗ<0.05.

Показатели врав у больных аденомой были достоверно выше, чем в контрольной группе и ниже, чем в группе больных РЩЖ. Экспрессия иРА при аденоме щитовидной железы была выявлена в 93% случаев, уровни иРА колебались в широких пределах, среднее содержание составило 0.15+0.02 нг/мг. Корреляционной зависимости между показателями зРая в сыворотке крови и содержанием иРА в опухоли в общей группе больных аденомой щитовидной железы не выявлепо.

Не было выявлено зависимости показателей врав в сыворотке крови и иРА в опухоли от возраста больных аденомой щитовидной железы. У больных в возрасте от 40 до 52 лет значения иРА колебались от 0.11 до 0.23 нг/мг (0.16±0.03 нг/мг), а в возрасте более 70 лет - от 0.03 до 0.3 нг/мг (0.13±0.03 нг/мг). Вместе с тем, нами обнаружена положительная корреляционная связь между уровнем эРаз в сыворотке крови и показателями иРА в опухоли у больных аденомой щитовидной железы в возрасте старше 55 лет (г=0.95; р=0.03).

Показатели эРая и иРА не зависели от длительности анамнеза заболевания, хотя диапазон колебаний концентрации вРаэ у пациентов с коротким анамнезом был значительно шире.

Не было выявлено различий показателей иРА в опухолях больных аденомой щитовидной железы женщин в зависимости от их репродуктивной функции: у больных

репродуктивного возраста содержание uPA - 0.15±0.02 нг/мг белка; в постменопаузе -0.14±0.02 нг/мг белка. Однако показатели sFas в сыворотке крови у больных репродуктивного возраста имели более широкие пределы колебания (от 0.8 до 7.3 нг/мл), по сравнению с группой пациенток в постменопаузе (0.4-2.4 нг/мл). Средние значения sFas в этих группах больных равнялись: в постменопаузе - 1.2±0.2 нг/мл, в репродуктивном возрасте - 3.4±2.0 нг/мл белка, однако различия статистически не значимы.

Не выявлено существенных различий в показателях sFas и uPA в зависимости от характера роста аденомы щитовидной железы. Так, у больных аденомой щитовидной железы с солитарной опухолью показатели sFas и uPA равнялись 2.2±0.9 нг/мл и 0.16±0.03 нг/мг, соответственно, а при многофокусном росте - 1.3±0.3 нг/мл и 0.13±0.04 нг/мг, соответственно.

Средний уровень sFas в сыворотке крови пациентов при размере аденомы до 4.0 см был достоверно ниже - 1.1±0.3 нг/мл, (пределы колебания - 0.4-2.4 нг/мл), чем при размере опухоли более 4 см - 3.3±1.3 нг/мл (диапазон колебаний от 1.4 до 7.3 нг/мл). Частота выявления sFas в сыворотке крови первой группы пациентов была 55%, во второй группе - 100%, (р<0.05). Показатели uPA при аденоме щитовидной железы не зависели от размера опухолевого узла.

Растворимый Fas в сыворотке крови и uPA в опухоли больных узловым коллоидным зобом и диффузным токсическим зобом щитовидной железы

В группе пациентов, страдавших узловым коллоидным зобом, было 68 больных в возрасте 15 до 72 лет. Эту группу мы разделили на две подгруппы по одному из важных морфологических признаков, а именно, наличию пролиферативных аденоматозных очагов на фоне узлового коллоидного зоба (табл. 28). К аденоматозным пролиферативным очагам относили небольшие (средний диаметр 2-3 мм) очаги пролиферации тиреоидного эпителия, выявляемые на фоне УКЗ и диффузного токсического зоба (ДТЗ).

Таблица 28. Показатели вРав в сыворотке крови здоровых людей и больных узловым коллоидным зобом

Обследованные группы Число наблюдений Возраст (годы) Частота выявления sFas, % sFas, нг/мл (М±га)

Группа контроля 60 48.0±2.5 36.0 0.9±0.3'

Узловой коллоидный зоб с признаками аденоматоза 20 49.1±2.9 45.0 2.9±1.32

Узловой коллоидный зоб без признаков аденоматоза 48 47.7±2.2 70.8 2.7±0.43

Примечание: plvs2<0.05; plvs3<0.05; p2vs3>0.05.

врав в сыворотке крови достоверно чаще выявляли при УКЗ без признаков аденоматоза, чем с таковыми признаками, достоверных различий в среднем уровне эРав между этими группами не отмечено.

Показатели sFas в сыворотке крови больных УКЗ без аденоматоза не зависели от репродуктивной функции пациенток, а при наличии аденоматозных признаков частота выявления и средний уровень sFas в репродуктивном периоде (50% и 4.б±2.7 нг/мл) были выше, чем в менопаузе (36% и 1.7±1.0 нг/мл), р=0.047.

иРА выявляли практически во всех исследованных образцах больных УКЗ без аденоматоза, так частота обнаружения иРА в постменопаузе была 100%, в репродуктивном периоде - 86%, при этом среднее содержание иРА в опухоли было выше в постменопаузе (0.33±0.13 нг/мг белка) по сравнению с репродуктивным возрастом (0.2±0.1 нг/мг белка), но различия статистически не значимы.

Средний уровень содержания иРА при УКЗ с аденоматозом в солитарных узлах был выше (0.3б±0.16 нг/мг белка), чем при многоочаговом характере роста опухоли (0.21±0.04 нг/мг). Подобная закономерность была характерна и для показателей sFas в сыворотке крови. Так, например, в группе больных с одиночным узлом средний уровень sFas был равен 3.9±1.0 нг/мл (пределы колебания - 0.6-12.7 нг/мл), а при мультифокальном росте опухоли - 2.1±0.8 нг/мл (диапазон колебаний - 0.5-4.8 нг/мл). Вместе с тем, достоверных различий в показателях sFas в сыворотке крови между этими группами пациентов не выявлено.

В группе больных ДТЗ было 23 больных - 9 с признаками аденоматоза и 14 без признаков аденоматоза. Частота выявления sFas в группе больных ДТЗ была достоверно выше, чем в группе контроля и достоверно ниже, чем в группах больных раком, аденомой и УКЗ щитовидной железы. Концентрация sFas в сыворотке крови больных ДТЗ достоверно не отличалась от уровня sFas контрольной группы и не зависела от наличия или отсутствия признаков аденоматоза в опухоли (табл. 29).

Таблица 29. Показатели вРав в сыворотке крови здоровых людей, больных диффузным токсическим зобом и аутоиммунным тиреоидитом Хошимото

Обследованные группы Число наблюдений Возраст (годы) Частота выявления sFas, % sFas, нг/мл (M±m)

Группа контроля 60 48.0±2.5 36.0 0.9±0.3'

Диффузный токсический зоб с признаками аденоматоза 9 45.7±4.0 55.5 1.9±0.72

Диффузный токсический зоб без признаков аденоматоза 14 41,9±2.9 42.8 2.2Í1.03

Аутоиммунный тиреоидит Хошимото 2 55.0±3.0 50.0 1.0±0.2

Примечание: plvs2>0.05; plvs3>0.05; p2vs3>0.05.

Изучаемые показатели не зависели от репродуктивной функции пациенток этой группы.

вРаз, 1Ь-б, УЕвР в сыворотке крова больных опухолями надпочечников

Определяли концентрацию врав, УЕОР и 1Ь-6 в сыворотке крови 109 больных опухолями надпочечников и 60 практически здоровых людей соответствующего пола и возраста.

Показатели вРая в общей группе больных опухолями надпочечников были достоверно (р=0.0001) выше, чем в контроле (табл. 30). Концентрация вРаэ в контрольной группе не превышала 1.2 нг/мл, при этом у больных новообразованиями надпочечников уровень Брав менее 1 нг/мл был выявлен у 9.4%, от 1 до 3 нг/мл - у 28.4%, от 3 нг/мл и более - у 46.9% пациентов. Уровень вРаэ - 1.2 нг/мл считали пороговым уровнем, разделяющим группы больных новообразованиями надпочечников и контроля.

Показатели УЕОР и 1Ь-6 в общей группы больных опухолями надпочечников были также выше, чем в контрольной группе (р=0.002). Пороговыми значениями, разделяющими группы практически здоровых людей и больных опухолями надпочечников, считали уровень УЕОР, равный 300 пг/мл, и уровень 1Ь-6, равный 3 пг/мл.

Таблица 30. Показатели вРая, УЕвР и 1Ь-6 в сыворотке крови больных опухолями

надпочечников и в группе контроля

Группы, число наблюдений вРаБ, нг/мл УЕОР, пг/мл 1Ь-6, пг/мл

М±т, медиана Диапазон колебаний М±т, медиана Диапазон колебаний М+т, медиана Диапазон колебаний

Больные, 109 3.0±0.7 1.9 0.6-24.7 302.7±56.2 254.3 80.0-1052.0 5.0±1.3 3.1 0.3-33.5

Контроль, 60 0.9±0.3 0.8 0.3-1.2 150.9±45.3 156.5 20.6-321.0 1.7±0.8 1.3 0.2-8.0

Показатели яРаэ и УЕОР не зависели от пола и возраста в общей группе больных новообразованиями надпочечников, тогда как концентрация 1Ь-6 в сыворотке крови достоверно зависела от пола пациентов, но не зависела от их возраста. Так, у больных мужчин средний уровень цитокина составил 7.3±1.6 пг/мл (медиана - 4.0 пг/мл), у женщин - 3.9±0.5 пг/мл (медиана - 3.0 пг/мл), р=0.03. При этом в группе больных раком коры надпочечников уровень цитокина в сыворотке крови у мужчин был в 3 раза выше (11.4±3.6 пг/мл; медиана -10.0 пг/мл), чем у женщин (3.2±0.8 пг/мл; медиана-3.1 пг/мл).

Вместе с тем, при анализе показателей вРаэ в зависимости от гистологического строения опухоли и пола больных было отмечено, что у мужчин, больных феохромоцитомой, показатели вРая были достоверно (р=0.05) выше, чем у женщин. При адренокортикальном раке значения Браэ у мужчин также были значительно выше, чем у женщин, однако различия были статистически не значимы (р=0.08). Кроме того, у мужчин, больных раком коры надпочечника, выявлена прямая линейная зависимость между уровнем зраз и их возрастом (г=0.74; р=0.03) и у больных адренокортикальным раком наблюдали линейную зависимость между концентрацией УЕОР и их возрастом (г=0.5; р=0.049). При феохромоцитоме содержание эРая в сыворотке крови также увеличивалось прямо пропорционально возрасту пациентов, хотя и в меньшей степени (г=0.49; р=0.04).

Показатели эРаэ и 1Ь-6 не зависели от длительности основного и наличия сопутствующих заболеваний в анамнезе в общей группе больных, вместе с тем, у больных феохромоцитомой надпочечника с сопутствующими заболеваниями, концентрация 1Ь-6 была выше (5.5±1.1 пг/мл; медиана - 5.9 пг/мл), чем без сопутствующих заболеваний (1.4±0.5 пг/мл; медиана - 1.4 пг/мл) (р=0.005). Концентрация УЕвР была достоверно выше (353.2±41.1 пг/мл, медиана - 270.8 пг/мл) при наличии сопутствующих заболеваний, чем без них (226.0±35.3 пг/мл, медиана - 198.3 пг/мл) (р=0.025).

В общей группе больных опухолями надпочечников не было выявлено достоверной зависимости показателей эРаэ в сыворотке крови от размера первичной опухоли. При этом у больных адренокортикальным раком отмечали достоверное повышение медианы концентрации Брав при увеличении размера опухоли (р=0.041) (табл. 31).

Таблица 31. Показатели вРав в сыворотке крови больных раком надпочечников

в зависимости от зазмера опухоли

Размер опухоли Число больных вРав, нг/мл (М±т) Медиана, нг/мл Пределы колебаний, нг/мл

До 5.0 см 7 1.8±0.5 1.6 1.4-2.8

5.0-9.9 см 15 2.7±0.5 2.1 2.5-7.2

10.0 см и более 10 3.5±0.5 2.4 5.5-8.0

Обнаружили достоверную зависимость концентраций УЕОР (г=0.4; р=0.009) и 1Ь-6 (г=0.41; р=0.0009) в сыворотке крови от размера первичной опухоли в общей группе больных опухолями надпочечников.

Не было выявлено достоверных изменений показателей вРаз в сыворотке крови в зависимости от гистогенеза опухоли, при этом уровни УЕвР и 1Ь-б у больных раком коры надпочечника были достоверно (р=0.04) выше, чем у больных феохромоцитомой и адренокортикальной аденомой. Статистически значимых различий изучаемых показателей между группами больных аденомой и феохромоцитомой надпочечников выявлено не было.

Изучали зависимость определяемых показателей от стадии заболевания при адренокортикальном раке (табл. 32).

Таблица 32. Показатели зРаз, УЕвР и 1Ь-6 в сыворотке крови больных адренокортикальным раком в зависимости от стадии заболевания _

Стадия заболевания Число больных вРаз, нг/мл (медиана) УЕОИ, пг/мл (медиана) 1Ь-6, пг/мл (медиана)

1 3 1.4 181.0 2.8

2 6 1.8 256.0 3.1

3 17 2.1 439.0 3.9

4 6 3.0 730.0 6.2

Как видно из данных таблицы 32, концентрация всех изучаемых факторов достоверно повышалась при увеличении стадии заболевания. При этом уровни УЕОБ и 11,-6 не зависели от стадии заболевания при раке с синдромом Кушинга.

Уровень вБаз достоверно повышался с увеличением распространенности опухолевого процесса, р=0.023. У больных адренокортикальным раком с наличием метастазов в регионарных лимфоузлах, печени и легких медиана концентрации эРаз (4.2 нг/мл) была достоверно выше (р=0.02), чем у пациентов без регионарных и отдаленных метастазов (1.4 нг/мл).

В общей группе больных опухолями надпочечников не было выявлено достоверной зависимости показателей эРаз в сыворотке крови от ИМТ, в то же время у женщин, больных феохромоцитомой, уровень вРаэ в крови увеличивался прямо пропорционально величине ИМТ (г=0.64; р=0.017).

Выявлена недостоверная корреляционная зависимость между уровнем БРаБ и УЕвР в сыворотке крови при адренокортикальном раке (г=0.56; р=0.2) и феохромоцитоме (г=0Л6\ р=0.2), а у женщин, больных адренокортикальным раком, уровни 1Ь-6 и эРаз были связаны прямой линейной зависимостью (г=0,78, р=0.023).

Обнаружена достоверная корреляционная зависимость между уровнями УЕйР и 1Ь-6 в сыворотке крови у больных феохромоцитомой (г=0.6; р=0.045).

Концентрация изучаемых факторов в сыворотке крови не зависела от гормональной активности опухоли.

У больных адренокортикальной аденомой общий фактор, объясняющий 39.8% общей дисперсии, включал в себя согласованное изменение зБаБ и 1Ь-6. У больных феохромоцитомой выявили первый общий фактор, объяснявший 55.4% общей дисперсии указанных признаков и включавший в себя согласованное изменение УЕйР, возраста, БРаэ и 1Ь-6. У больных раком коры надпочечника первый общий фактор также объяснял почти половину всей изменчивости указанных признаков (49.0%) и включал в себя согласованное изменение ББав и 1Ь-6, второй общий фактор отражал изменение УЕЭР и возраста пациентов (24% общей изменчивости). Таким образом, для всех групп больных было наиболее характерно связанное изменение эРаз и 1Ь-б, особенно ярко выраженное у больных адренокортикальным раком и феохромоцитомой. Кроме того, показатель УЕвИ также входил в число главных общих факторов в группе больных раком коры надпочечника и феохромоцитомой.

Выживаемость оценена у 31 больного раком надпочечника, максимальный срок наблюдения составил 84 месяца. У одного больного смерть наступила в раннем послеоперационном периоде от сердечно-сосудистой недостаточности. 9 больных умерли от прогрессирования заболевания в сроки от 2 до 18 месяцев. Еще у 1 пациентки со злокачественной феохромоцитомой была ранняя послеоперационная смерть от ОССН. Эту больную в расчеты не включали. Медиана срока жизни за 5-летний период наблюдения не была достигнута, однако четверть больных умерла в короткие сроки - до 12 месяцев. Оценка функции риска смерти показала, что повышенный риск смерти у

больных раком надпочечников наблюдался в раннем периоде (до 1 года), и значительно возрастал через 5 лет после операции.

Повышенная концентрация ярая в сыворотке крови достоверно ухудшала показатели общей выживаемости больных раком надпочечников (р=0.049), таблица 33. При концентрации эРаэ менее 2 нг/мл медиана выживаемости не была достигнута, при концентрации враз более 2 нг/мл - половина больных умерли до 9.2 месяцев.

Таблица 33. Показатели общей выживаемости больных раком надпочечников в зависимости от концентрации «Га» в сыворотке крови_

sFas, нг/мл Число больных Выживаемость (%)

1-летняя 3-летняя 5-летняя

<2 16 87.5+14.9 62.5±17.1 62.5±17.1

2 и более 15 41.7±22.2 - -

Количество больных с рецидивом заболевания составило 10, сроки развития рецидива были от 2 до 42 месяцев, медиана срока до развития рецидива равнялась 36.7 месяцев. 3-х летняя выживаемость до рецидива составила 40.5±18.0%. Повышенная концентрация sFas в сыворотке крови была достоверно связана с ухудшением показателей безрецидивной выживаемости (р=0.048).

Таким образом, повышенное содержание sFas (более 2 нг/мл) в сыворотке крови больных раком надпочечников было достоверно связано с уменьшением показателей общей и безрецидивной выживаемости пациентов.

В заключение необходимо отметить, что в результате проведенного нами исследования разработана высоко чувствительная и специфичная тест-система на основе МА для определения концентрации растворимого Fas человека в сыворотке и плазме крови, с помощью которой определили концентрацию sFas у 1061 больного новообразованиями различного гистогенеза и локализации и 457 практически здоровых людей. Сравнительный анализ полученных данных позволил выявить связь уровня sFas в сыворотке крови онкологических больных с основными клиническими, морфологическими, некоторыми биохимическими критериями болезни, определить прогностическое и предиктивное значение уровня sFas в сыворотке крови онкологических пациентов в конкретной клинической ситуации. Выявленные корреляционные связи уровня sFas с показателями ключевого активатора неоангиогенеза - VEGF и мультифункционального цитокина, обладающего способностью ингибировать Fas-зависимый апопотоз, - IL-6, с общей активностью щелочной фосфатазы при остеогенной саркоме отражают важные биологические особенности опухолевых процессов, одновременно высокие уровни sFas, IL-6 и VEGF определяют высокий потенциал злокачественности новообразований.

выводы

1. Впервые разработана оригинальная отечественная тест-система на основе МА SA-7 и SA-8, которая позволяет надежно определять концентрацию sFas в сыворотке и плазме крови человека. Предел детекции сэндвич-ИФА - 0.3 нг/мл sFas, диапазон линейности измерения концентрации составляет 0.3-10.0 нг/мл sFas, коэффициент вариации при определении концентрации sFas в сыворотке и плазме крови не превышает (3.7±0.7)%.

2. МА SA-7 (IgGl(K); (5.8±0.7)х108 М"1) взаимодействует с эпитопом полноразмерного Fas человека, определяемым аминокислотными остатками 129-134, эпитоп для МА SA-8 (IgGl(K);(4.0±0.6)xl07 М"1) определяют аминокислотные остатки 94-99. Таким образом, разработанный сэндвич-ИФА на основе МА SA-7 и SA-8 должен детектировать основную изоформу растворимого Fas - FasExoöDel и три минорных изоформы sFas: FasExo4Del, FasExo4,6Del и FasExo4,7Del.

3. Показатели sFas определены у 457 практически здоровых людей, (332 женщины и 125 мужчин) в возрасте от 17 до 78 лет, при этом частота выявления sFas равнялась 40%, концентрация sFas колебалась от 0.3 нг/мл до 1.2 нг/мл, средний уровень составил 0.9±0.3 нг/мл, медиана концентрации - 0.8 нг/мл. Показатели sFas достоверно не зависели от возраста и пола обследованных, а у женщин не зависели от репродуктивной функции, длительности посшенопаузы и фазы менструального цикла.

4. Изучены показатели sFas в сыворотке крови у 1061 больного новообразованиями молочной железы, костей, яичников, матки, щитовидной железы, толстой кишки и надпочечников. Частота выявления и концентрация sFas в сыворотке крови во всех обследованных группах пациентов превышала соответствующие показатели контрольной группы (р=0.00001). Так, в общей группе онкологических больных частота выявления sFas равнялась 78%, средняя концентрация - 6.7±1.4 нг/мл, медиана концентрации - 2.9 нг/мл. Показатели sFas у подавляющего числа больных достоверно не зависели от возраста, пола, сопутствующих заболеваний в анамнезе, а у женщин - от репродуктивной функции, длительности постменопаузы и фазы менструального цикла.

5. Высокий уровень sFas был связан с поздними стадиями болезни при раке яичников, тела матки, толстой кишки и коры надпочечников, с низкой степенью дифференцировки опухоли при раке яичников и тела матки, с наличием регионарных метастазов при колоректальном и адренокортикальном раке, а также с глубиной прорастания опухоли в ткань миометрия, стенку кишки и в окружающие ткани при раке тела матки и толстой кишки.

6. Показатели sFas зависели от гистогенеза опухолей при злокачественных и доброкачественных новообразованиях яичников, повышенную концентрацию sFas выявляли при больших размерах опухоли у больных раком яичников, раком тела

матки, раком толстой кишки, аденомой и раком щитовидной железы, а также у пациентов с раком коры надпочечников.

7. Уровень sFas в сыворотке крови более 1.2 нг/мл достоверно ухудшал показатели общей и безрецидивной выживаемости больных остеогенной саркомой и раком тела матки, а также был неблагоприятным предиктивным фактором ответа больных колоректальным раком пожилого возраста на неоадьювантную лучевую терапию. Уровень sFas в сыворотке крови более 2 нг/мл определял неблагоприятный прогноз болезни у больных адренокортикальным раком. Уровень sFas в сыворотке крови более 5 нг/мл был связан с неблагоприятным прогнозом болезни для пациенток с папиллярной цистаденокарциномой и раком яичников с размером опухоли более 5 см.

8. Выявлена прямая корреляционная зависимость уровня sFas от концентрации ключевого активатора процесса неоангиогенеза - VEGF у больных раком яичников (при концентрации IL-6 более 4 пг/мл) (г=0.75; р=0.001) и раком тела матки (г=0.58; р=0.01), от концентрации мультифукционального цитокина - IL-6 при раке тела матки (г=0.56; р=0.01) и адренокортикальном раке (г=0.78, р=0.023) и общей активностью щелочной фосфатазы в сыворотке крови при первичной остеогенной саркоме (г=0.75, р=0.049). Одновременно высокие уровни sFas, IL-б и VEGF определяют высокий потенциал злокачественности новообразований.

Практические рекомендации

Разработанная тест-система может применяться в клинических и лабораторных исследованиях для определения концентрации sFas в сыворотке и плазме крови человека, а также в других биологических жидкостях, содержащих растворимый человеческий Fas.

Уровень sFas в сыворотке крови онкологических больных достоверно превышает этот показатель у практически здоровых людей. Концентрация sFas у больных злокачественными новообразованиями яичников, тела матки, коры надпочечника и толстой кишки зависит от основных клинических характеристик заболевания - размера опухоли, степени ее дифференцировки и стадии болезни. Растворимый Fas является фактором прогноза болезни для некоторых категорий онкологических больных. Высокая концентрация sFas в сыворотке крови связана с ухудшением показателей общей и безрецидивной выживаемости больных остеогенной саркомой, раком яичников, раком тела матки и адренокортикальным раком. Высокий уровень sFas в сыворотке крови следует считать неблагоприятным предиктивным фактором ответа пациента с колоректальным раком на неоадьювантную лучевую терапию. Определение концентрации sFas в сыворотке крови онкологических больных имеет большое практическое значение для выбора препаратов и назначения индивидуальной схемы лечения.

Показатели sFas, VEGF и IL-6 в сыворотке крови с учетом основных клинических и морфологических критериев болезни могут быть использованы для оценки степени

злокачественности новообразований яичников и эндометрия, а также для дифференцированного выбора адекватных методов лечения этой категории пациенток. Работы, опубликованные по теме диссертации

1. Аббасова С.Г., Липкин В.М., Трапезников Н.Н., Кушлинский Н.Е. Fas-FasL-система в норме и при патологии // Вопр.биол.мед.фарм.химии.-1999.-№2.-с.78-94.

2. Kushlinsky N., Abbasova S., Nikogosyan S., Obusheva M., Kostanyan I., Lipkin V., Laktionov K., Kozachenko V. Soluble Fas-antigen (sFas) in the serum of patients with ovarian tumors. Seventh Biennial Meeting of the International Gynecologic Cancer Society (September 26-30, Rome, Italy) // Int. J. Gynecol. Cancer.-1999,-Vol.9, Supp.l.-p.l86.

3. Аббасова С.Г., Кушлинский H.E., Мурашсв A.H., Костанян И.А., Обушева М.Н., Никогосяп С.О., Бритвин Т.А., Багирова Н.Ф., Соловьев Ю.Н., Липкин В.М., Трапезников Н.Н. Растворимый Fas в сыворотке крови онкологических больных // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины,-1999.-N.3.-с. 328-331.

4. Pirogov А.V., Abbasova S.G., Dyakova N.A., Kushlinsky N.E., Deichman G.I. In vivo dissemination of tumor cells and acguisition of sFas-secreting activity // The 27th Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine (ISOBM, 1999). (Kyoto, Japan, October 31-November 4). (Abstract book).-1999.-Suppl. 2.-p-56.

5. Обушева M.H., Аббасова С.Г., Кушлинский H.E., Никогосян С.О., Ермилова В.Д., Чеспокова А.В., Костанян И.А. Растворимый Fas-антиген (sFas) в сыворотке крови больных злокачественными и доброкачественными новообразованиями яичников // Клиническая лабораторная диагностика,-1999.-№9.-с.7-8.

6. Аббасова С.Г., Кушлинский Н.Е., Степанов Ю.М., Костанян И.А., Липкин В.М.. Ингибитор апоптоза - растворимый Fas-антиген в сыворотке крови больных хроническим гастритом и раком желудка // Журнал "Академия медицинских наук Украины".-1999.-том 2, №2-с.347-351.

7. Кушлинский Н.Е., Бабкина И.В., Аббасова С.Г., Соловьев Ю.Н., Изгородин А.С., Алиев М.Д., Липкин В.М., Трапезников Н.Н. Ингибитор апоптоза - растворимый Fas-антиген (sFas) в сыворотке крови больных хондросаркомой, с механическими травмами костей и у здоровых людей // Кремлевская медицина (клинический вестник).-2000.-№4,-с.70-72.

8. Кушлинский Н.Е., Соловьев Ю.Н., Бабкина И.В., Аббасова С.Г., Костанян И.А., Липкин В.М., Трапезников Н.Н. Лептин и ингибитор апоптоза - растворимый Fas-антиген - в сыворотке крови больных остеосаркомой и опухолями костей нейроэктодермального происхождения // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-2000.-№5.-с.583-586.

9. Kushlinsky N., Abbasova S., Solovyev Yu., Kostanyan I., Babkina I., Izgorodin A., Lipkin V., Trapeznikov N. Soluble Fas-antigen (sFas) in the serum of bone tumour patients. European Musculoskeletal Oncology Society // Abstracts and Poster Presentations.-2000.-p.65.

10. Аббасова С.Г., Кушлинский Н.Е., Липкин В.М., Трапезников H.H. Факты и перспективы изучения Fas-FasL-системы в норме и при патологии // Успехи современной биологии.-2000.-том 120, №3.-с.303-318.

11. Kushlinsky N.E., Prorokov V.V., Britvin T.A., Abbasova S.G., Kostanyan I.A., Lipkin V.M. Soluble Fas-Antigen (sFas) in the sera of colon cancer patients. 10-th International congress on anti-cancer treatment (Paris, January 31st to February 3rd, 2000).-2000.-p.240.

12. Бабкина И.В., Кушлинский H.E., Аббасова С.Г., Соловьев Ю.Н., Трапезников H.H. Fas-антиген в сыворотке крови больных опухолями костей. В материалах II съезда онкологов стран СНГ (Киев, 23-26 мая 2000г.) // Киев.-2000.-М.112.

13. Кушлинский Н.Е., Бритвин Т.А., Аббасова С.Г., Перевощиков А.Г., Пророков В.В., Костанян И.А., Кныш В.И., Липкин В.М. Растворимый Fas-антиген в сыворотке крови больных раком толстой кишки // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-2001.-том 131,№4.-с.430-433.

14. Kushlinsky N.E., Britvin Т.А., Polyakova O.A., Abbasova S.G., Bogatyryev O.P., Kalinin A.P., Lipkin V.M. Soluble Fas-antigen (sFas) in the serum with tumors of adrenal gland // XXIX International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine (ISOBM, 2001) (Barcelona, Spain, September 29th-October 3rd, 2001) (Abstract book).-2001 .-p.208.

15. Кушлинский H.E., Соловьев Ю.Н., Бабкина И.В., Аббасова С.Г., Костанян И.А., Липкин В.М., Трапезников H.H. Экспрессия ингибитора апоптоза - растворимого Fas-антигена у больных со злокачественными и доброкачественными новообразованиями костей // Вестник Российской Академии медицинских наук.-2001.-№3.-с,3-8.

16. Кушлинский Н.Е. Бритвин Т.А. Полякова Г.А. Аббасова С.Г. Баронин A.A. Богатырев О.П. Калинин А.П. Липкин В.М. Растворимый Fas-антиген (sFas) в сыворотке крови больных с опухолями надпочечников // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-2001 .-том 132, №10.-с.443-445.

17. Кушлинский Н.Е. Бабкина И.В. Аббасова С.Г. Любимова Н.В. Изгородин A.C. Алиев Б.М. Костанян И.А. Соловьев Ю.Н. Липкин В.М. Трапезников H.H. Изучение взаимосвязи между активностью щелочной фосфатазы и содержанием растворимого Fas-антигена (sFas) в сыворотке крови больных первичными и вторичными новообразованиями костей // Воронеж 2001 "Новое в онкологии" (под ред. И.В.Поддубной и Н.А.Огнерубова), выпуск 5. Изд-во Воронежской государственной медицинской академии им.Н.Н.Бурденко.-2001.-с.597-609.

18. Пирогов A.B., Аббасова С.Г., Дьякова H.A., Кушлинский Н.Е., Дейчман Г.И.. Изменения в соотношении мембраносвязанной и растворимой форм CD95 (Fas) при отборе опухолевых клеток in vivo //Биохимия.-2002.-том 67, вып. 2.-C.286-292.

19. Кушлинский Н.Е., Бритвин Т.А., Полякова Г.А., Аббасова С.Г., Баронин A.A., Тишенина P.C., Молчанова Г.С., Сельчук В.Ю., Пирогов Д.А., Богатырев О.П., Липкин В.М., Калинин А.П. Сравнительное исследование уровней растворимого Fas-антигена в сыворотке крови больных опухолями и опухолеподобными поражениями надпочечников // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-2002.-том 134, №8.-с.197-201.

20. Аббасова С.Г., Липкин В.М., Трапезников Н.Н., Кушлинский Н.Е. Fas-опосредованный апоптоз при раке предстательной железы // Глава в кн.: «Рак предстательной железы» (под ред. Н.Е.Кушлинского, Ю.Н.Соловьева, М.Ф.Трапезниковой) // М.-Редакционно-издательский совет при Президиуме РАМН.-2002.-С.250-280.

21. Kushlinsky N.E., Britvin Т.A., Polyakova G.A., Abbasova S.G., Pirogov D.A.. Seltchuk V.Yu., Bogatyryev O.P., Lipkin V.M., Lyakina L.T., Baronin A.A., Kalinin A.P. Comparative study of sFas levels in the sera of patients with adrenal gland tumors and hyperplastic processes // Twelth international congress on anti-cancer treatment. - Proceeding book. - (Paris, February 4th-7th, 2002).-p.244.

22. Кушлинский H.E., Аббасова С.Г., Бабкина И.В., Соловьев Ю.Н., Тарасова Т.А., Петраев Ю.Г., Липкин В.М. Трапезников Н.Н. Стимуляторы ангиогенеза - фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), ангиогенин (ANG) и ингибитор апоптоза - растворимый Fas-антиген в сыворотке крови больных остеосаркомой и опухолью Юинга. Сборник научных трудов конференции "Проблемы патологии сосудов у онкологических больных" под ред. проф. А.Н.Фокина и проф. А.В.Важенина // Челябинск.-2002.-с.63-64.

23. Кушлинский Н.Е., Полякова Г.А., Аббасова С.Г., Бритвин Т.А., Сельчук В.Ю., Пирогов Д.А., Богатырев О.П., Лякина Л.Т., Баронин А.А., Калинин А.П. Изучение механизмов апоптоза в первичных опухолях и при гиперпластических процессах надпочечников - основа разработки новых методов их патогенетической лекарственной терапии // Тезисы докладов IX Российского национального конгресса "Человек и лекарство" (Москва, 8-12 апреля 2002г.) // М.-2002.-С.255.

24. Чеснокова А.А., Аббасова С.Г., Обушева М.Н., Лактионов К.П. Сравнительный анализ уровней растворимого Fas-антигена (sFas) в сыворотке крови больных раком и доброкачественными новообразованиями яичников // Тезисы докладов IX Российского национального конгресса "Человек и лекарство" (Москва, 8-12 апреля 2002г.) // М.-2002.-С.503.

25. Кушлинский Н.Е., Бритвин Т.А., Полякова Г.А., Аббасова С.Г., Баронин А.А., Сельчук В.Ю., Поликарпова С.Б., Калинин А.П. Система активации плазминогена и ингибиторы апоптоза при патологии надпочечников. Труды Всероссийской конференции "Проблемы медицинской энзимологии. Современные технологии лабораторной диагностики нового столетия" (Москва, 28-31 мая 2002г.) // М.-2002.-С.133-134.

26. Kushlinsky N.E., Britvin Т.А., Abbasova S.G., Polyakova G.A., O.P. Bogatyrev O.P., Kalinin A.P., Lipkin V.M. Comparative study of soluble Fas-antigen (sFas) serum levels in patients with adrenal tumors // 18th UICC International Cancer Congress (30 June-5 July) (Abstract book).-2002.-p.361.

27. Аббасова С.Г., Даман А.Г., Шепеляковская A.O., Щепрова Ж.М. Эпитопное картирование Fas-антигена // Тезисы докладов VI чтений, посвященных памяти академика Ю.А.Овчинникова.-2002.-с.80.

28. Арзыкулова М.Ж., Кушлинский Н.Е., Никогосян С.О., Обушева М.Н., Ермилова В.Д., Аббасова С.Г., Горелова И.А. Растворимый Fas-антиген у больных новообразованиями яичников // «Вестник Казахского национального медицинского университета».-2002.-том 23, №3.-с.148-150.

29. Аббасова С.Г., Липкин В.М., Трапезникова М.Ф., Кушлинский Н.Е. Fas-опосредованный апоитоз при раке предстательной железы. Глава в книге: «Рак предстательной железы» под ред. Н.Е.Кушлинского, Ю.Н.Соловьева, М.Ф.Трапезниковой // М.-Редакционно-издательский совет при Президиуме РАМН.-2002.-С.250-280.

30. Бритвин Т.А., Кушлинский Н.Е., Аббасова С.Г., Пирогов Д.А., Поликарпова С.Б., Богатырев О.П., Калинин А.П., Сельчук В.Ю. Молекулярно-биологаческие исследования при опухолях надпочечников. Тезисы докладов X Российского Национального конгресса «Человек и лекарство» (Москва, 7-14 апреля 2003г.) // M.-2003.-C.127.

31. Высоцкий М.М., Верулашвили Т.Г., Аббасова С.Г., Обушева М.Н., Липкин В.М., Манухин И.Б. Растворимый Fas-антиген (sFas) в сыворотке крови больных раком и простыми кистами яичников. В материалах докладов XI Российского Национального Конгресса «Человек и лекарство» (Москва 19-23 апреля 2004г.) // М.-2004.-С.115,

32. Аббасова С.Г., Обушева М.Н., Высоцкий М.М., Чеснокова A.B., Манухин И.Б. Растворимый Fas-антиген у больных серозной аденокарциномой яичников. В материалах Российской научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии», посвященной 25-летию НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН (Томск, 24-25 июня 2004г.) // Томск.-2004.-Часть II.-c.l60-161.

33. Чеснокова A.B., Высоцкий М.М., Обушева М.Н., Карабеков У.К., Аббасова С.Г., Лактионов К.П. Показатели sFas и лептина, а также их соотношение у больных с новообразованиями яичников с учетом основных клинико-морфологических характеристик заболевания. В материалах Конгресса «Национальные дни лабораторной медицины России-2004» (Москва, 20-22 октября 2004г.) // М.-2004.-С.120.

34. Чеснокова A.B., Высоцкий М.М., Обушева М.Н., Карабеков У.К., Аббасова С.Г., Лактионов К.П. Показатели sFas и лептина, а также их соотношение у больных с новообразованиями яичников с учетом основных клинико-морфологических характеристик заболевания // Клиническая лабораторная диагностика.-2004.-№9.-с.12.

35. Кушлинский Н.Е., Сандыбаев М.Н., Казанцева И.А., Сомасундарам С., Скрипниченко М.Л., Джабаров А.К., Аббасова С.Г., Тулеуов А.Е. Растворимый Fas-антиген в сыворотке крови здоровых людей, больных раком и аденомой щитовидной железы. В материалах третьего Всероссийского тиреоидологического конгресса «Диагностика и лечение узлового зоба» (Москва, 29-30 ноября 2004г.) // М.-С.185-186.

36. Борисов Д.А., Аббасова С.Г., Соловьев Ю.Н., Кузнецов И.Н., Бабкина И.В., Липкин В.М., Дурнов Л.А., Кушлинский Н.Е. Растворимая форма ключевого рецептора апоптоза -Fas-антигена (sFas) у детей, больных остеосаркомой и опухолью Юинга. В материалах III Российского Конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 26-28 октября 2004г.) И М.-2004.-С.403.

37. Аббасова С.Г., Обушева М.Н., Лякина JI.T., Ермилова В.Д., Чеснокова A.B., Лактионов К.П. Растворимый Fas-антиген в сыворотке крови больных с эпителиальными опухолями яичников // Клиническая лабораторная диагностика.-2005.-№9.-с.18.

38. Сандыбаев М.Н., Казанцева И.А., Аббасова С.Г., Лякина Л.Т., Тулеуов А.Е. Растворимый Fas-антиген при заболеваниях щитовидной железы // Клиническая лабораторная диагностика.-2005.-№9.-с.23-24.

39. Обушева М.Н., Ермилова В.Д., Аббасова С.Г., Лякина Л.Т., Сатенова Ж.К., Тулеулов А.Е. sFas у больных новообразованиями яичников. В материалах XIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство» (Москва, 3-7 апреля 2006 г.) // М.-2006.-С.232.

40. Обушева М.Н., Ермилова В.Д., Аббасова С.Г., Лякина Л.Т., Костанян И.А., Липкий В.М. Интерлейкин-6 (ИЛ-6), растворимый Fas-антиген (sFas) и фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) в сыворотке крови больных новообразованиями органов женской репродуктивной системы. В материалах X Российского онкологического конгресса (Москва, 21-23 ноября 2006 г.) // М.-2006.-С.224.

41. Аббасова С.Г., Щепрова Ж.М., Ламан А.Г., Шепеляковская А.О., Байдакова Л.К., Родионов И.Л., Кушлинский Н.Е. Эпитопное картирование человеческого Fas с помощью пептидного фагового дисплея // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины,-2007.-ТОМ 44, №10.-с.395-400.

Подписано в печать 9.12 .0 8 г. Формат 60x84/16. Тираж 100 экз. Заказ 876 ■ Отпечатано в службе множительной техники ГУ РОНЦ РАМН им. Н.Н. Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

Актуальность проблемы. Апоптоз, или программированная клеточная гибель - исключительно важный механизм элиминации опасных для организма клеток, к числу которых относятся вирус-инфицированные, опухолевые клетки, а также клетки, закончившие свой жизненный цикл. Это очень сложный механизм, на различных этапах которого задействованы многочисленные факторы и рецепторы клеточной гибели, а также ряд адапторных белков, приводящий, в конечном итоге, к активации внутриклеточных протеаз и самоуничтожению опасной для организма клетки. Любые сбои в этом многоступенчатом процессе приводят к развитию серьезных патологий, таких как болезнь Альцгеймера, множественный рассеянный склероз, амиотрофный латеральный склероз, некоторые лимфопролиферативные нарушения, а также к возникновению и росту злокачественных опухолей. Основной характеристикой этих новообразований является их способность к неограниченному росту и устойчивость к действию факторов, регулирующих процессы пролиферации и дифференцировки и клеточной гибели.

Одним из ключевых рецепторов, запускающих программу самоуничтожения клетки, является Fas. Fas/APO-l/CD95 - трансмембранный гликопротеин, относящийся к семейству рецепторов фактора некроза опухоли (Itoh и соавт., 1991; Oehm и соавт., 1992). Fas продуцируется почти всеми тканями организма, его экспрессия выявлена в тимусе, почках, печени, сердце, легких, он также экспонирован на поверхности активированных лимфоцитов, натуральных киллеров, вирус-инфицированных и опухолевых клеток (Nagata and Golstein, 1995).

Индукция Fas-опосредованного апоптоза в клетке происходит после взаимодействия Fas с лигандом (FasL). Механизм Fas-опосредованного апоптоза хорошо изучен: идентифицированы основные белки, участвующие в передаче апоптотического сигнала от активированного Fas, установлены их структура и функции. Показано, что взаимодействие Fas с FasL приводит к активации каспазы-8 или каспазы-2 через адапторные белки FADD/MORT-1 или RIP и RAIDD. FLICE-ингибирующий белок FLIP блокирует активацию каспазы-8, таким образом, ингибируя апоптоз. На конечном этапе происходит протеолиз жизненно важных для клетки белков, таких как поли(АДФ-рибо-зил)полимераза, ламин и других, что приводит к функциональным и морфологическим изменениям цитоплазмы и ядра клетки, типичным для апоптоза.

Неэффективная работа Fas-системы определяется нарушениями в экспрессии, структуре, и функционировании белков, опосредующих Fas-зависимый апоптоз. Мутации белков, задействованных в передаче Fas-зависимого апопто-тического сигнала, были выявлены при таких заболеваниях как злокачественные опухоли, СПИД, тиреоидиты, гепатиты, миокардиты и др. Другой причиной неэффективной работы Fas-системы, определяющей устойчивость различных типов клеток к Fas-зависимому апоптозу, является повышенная продукция растворимого Fas (sFas) этими клетками. Растворимый Fas дистантно ингиби-рует действие FasL, позволяя клеткам-продуцентам растворимого Fas уйти от противоопухолевой защиты организма. С помощью молекулярно-биологи-ческих методов было показано, что sFas является продуктом альтернативного сплайсинга полноразмерной мРНК Fas (Cheng и соавт., 1994; Cascino и соавт.,

1995). Идентифицировано несколько растворимых изоформ Fas, среди которых преобладает одна - FasdelTM, или FasExoóDel, остальные изоформы продуцируются в незначительных количествах (Cascino и соавт., 1995; Cascino и соавт.,

1996).

Актуальность настоящего исследования определяется необходимостью разработки тест-системы для измерения концентрации растворимого Fas в сыворотке крови больных новообразованиями различного морфогенеза и локализации и определения его значения при онкологических заболеваниях. Цель исследования - Разработка и характеристика сэндвич-ИФА для определения концентрации растворимого Fas в сыворотке крови, изучение связи показателей sFas с основными клиническими, морфологическими и некоторыми биохимическими характеристиками опухолевых процессов и его значения в прогнозе онкологических заболеваний.

Задачи исследования:

1. Охарактеризовать разработанный нами сэндвич-ИФА для количественного определения sFas в сыворотке крови человека - оценить предел детекции тест-системы и воспроизводимость результатов анализа. Дать иммунохимическую характеристику моноклональных антител (МА), на основе которых разработан сэндвич-ИФА.

2. С помощью пептидного фагового дисплея определить структуру эпитопов для МА к полноразмерному Fas человека, на основе которых разработан сэндвич-ИФА, с целью выявления спектра изоформ sFas, которые должна детектировать разработанная тест-система.

3. Определить концентрацию sFas в сыворотке крови онкологических больных с наиболее часто выявляемыми опухолями (новообразования молочной железы, яичников, эндометрия, костей, толстой кишки, надпочечников и щитовидной железы) и провести анализ показателей sFas в зависимости от основных клинических, морфологических и биохимических критериев опухолевых процессов и определить его значение в прогнозе заболеваний.

4. Изучить корреляцию показателей sFas в сыворотке крови онкологических больных с показателями наиболее важных патогенетических факторов: активатора процесса неоангиогенеза в опухоли - VEGF, провоспалительного цитокина, ингибитора Fas-зависимого апоптоза — IL-6, уровня содержания рецепторов эстрогенов в опухоли при раке молочной железы, общей активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови при новообразованиях костей, уровня содержания активатора плазминогена (иРА) в ткани опухолей щитовидной железы.

Научная новизна. Разработана и охарактеризована оригинальная отечественная тест-система, не уступающая аналогичным тест-системам для количественного определения растворимого Fas в сыворотке крови человека, описанным в литературе.

С помощью разработанной тест-системы впервые на большом клиническом материале определена концентрация и проведен анализ показателей растворимого Fas в сыворотке крови больных новообразованиями различного морфогенеза и локализации в сравнении с соответствующими показателями практически здоровых людей. Впервые определены связь показателей sFas с основными клиническими, морфологическими и некоторыми биохимическими характеристиками опухолевых процессов и его значение в прогнозе заболевания при раке яичников, раке тела матки, раке коры надпочечников и остеосаркоме, а также предиктивное значение sFas в оценке эффективности неоадъювантной лучевой терапии при колоректальном раке.

Практическая значимость исследования состоит в разработке иммуноферментной тест-системы для количественного определения растворимого Fas в сыворотке крови человека, а также в установлении значения этого белка как фактора прогноза при раке яичников, раке тела матки, раке коры надпочечников и остеосаркоме, а также его предиктивного значения в оценке эффективности неоадъювантной лучевой терапии при раке толстой кишки.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработанная тест-система - сэндвич-ИФА на основе МА SA-7 и SA-8 может применяться для количественного определения sFas в сыворотке и плазме крови человека и других биологических жидкостях. Присутствие sFasL и других компонентов сыворотки крови не влияет на результаты количественного определения sFas. Разработанная нами тест-система должна детектировать основную изоформу sFas - FasExoóDel и три минорных изоформы sFas - FasExo4Del, FasExo4,6Del и FasExo4,7Del.

2. Концентрация и частота выявления sFas в сыворотке крови больных новообразованиями различного морфогенеза и локализации достоверно превышают соответствующие показатели практически здоровых людей контрольной группы.

3. Показатели sFas в сыворотке крови связаны с основными клиническими характеристиками заболевания (стадия опухолевого процесса, размер опухолевого узла, степень дифференцировки опухоли и характер ее роста) при раке яичников, раке тела матки, раке толстой кишки и адренокортикальном раке.

4. Показатели sFas достоверно не различаются при злокачественных и доброкачественных новообразованиях молочной железы, костей, яичников и надпочечников, тогда как рак щитовидной железы характеризуется более высокими показателями sFas в сыворотке крови, чем доброкачественные и гиперпластические процессы щитовидной железы. Одновременно высокие уровни sFas, VEGF и IL-6 в сыворотке крови характерны для злокачественных новообразований.

5. Высокий уровень sFas в сыворотке крови является неблагоприятным фактором прогноза для больных остеогенной саркомой, раком яичников, раком тела матки и адренокортикальным раком.

6. Высокая концентрация sFas в сыворотке крови является неблагоприятным предиктивным фактором эффективности применения неоадъювантной лучевой терапии при колоректальном раке в пожилом возрасте.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на научно-практическом симпозиуме «Клиническая лаборатория на пороге XXI века: синтез традиций и новаций», (Москва, 12-14 октября 1999 года); на VII Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 10-14 апреля 2000 года); на 2-ом съезде онкологов стран СНГ (Киев, 23-26 мая 2000 года); на 7th Biennial Meeting of the International Gynecological Cancer Society (Rome, Italy, September 26-30, 1999); на XI Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 19-23 апреля 2004 года); на Конгрессе «Национальные дни лабораторной медицины России-2004» (Москва 20-22 октября 2004г.); на Российской научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 24-25 июня 2004 г.); на XII Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1822 апреля 2005 г.); на I Всероссийской научно-практической конференции патологоанатомов «Актуальные вопросы патологической анатомии» (Орел, 31 мая-2 июня 2005 г.); на X Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2123 ноября 2006 г.); на XIII Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 3-7 апреля 2006 г.). Диссертационная работа апробирована на совместной научной конференции лаборатории клинической биохимии, лаборатории клинической иммунологии, х/о опухолей молочной железы, х/о проктологии, х/о диагностики опухолей НИИ КО, лаборатории молекулярной эндокринологии НИИ канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН; кафедры онкологии ФПДО МГМСУ, кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики ФПДО МГМСУ; лаборатории нейрохимии ФИБХ РАН 14 октября 2008 г.

Полученные результаты используются в практике лаборатории клинической биохимии НИИ клинической онкологии ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН и в учебном процессе на кафедре клинической биохимии и лабораторной диагностики ФПДО ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава».

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 41 работа в отечественных и зарубежных журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов и 8 глав результатов собственных исследований; заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Общий объем диссертации 272 страницы машинописного текста. Список литературы включает 84 отечественных и 448 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 67 таблицами и 26 рисунками.

ВЫВОДЫ:

1. Впервые разработана оригинальная отечественная тест-система на основе МА SA-7 и SA-8, которая позволяет надежно определять концентрацию sFas в сыворотке и плазме крови человека. Предел детекции сэндвич-ИФА — 0.3 нг/мл sFas, диапазон линейности измерения концентрации составляет 0.3-10.0 нг/мл sFas, коэффициент вариации при определении концентрации sFas в сыворотке и плазме крови не превышает (3.7±0.7)%.

2. МА SA-7 (IgGl(K); (5.8±0.7)х108 М"1) взаимодействует с эпитопом полноразмерного Fas человека, определяемым аминокислотными остатками 129-134, эпитоп для МА SA-8 (IgGl(K);(4.0±0.6)xl07 М"1) определяют аминокислотные остатки 94-99. Таким образом, разработанный сэндвич-ИФА на основе МА SA-7 и SA-8 должен детектировать основную изоформу растворимого Fas - FasExoóDel и три минорных изоформы sFas: FasExo4Del, FasExo4,6Del и FasExo4,7Del.

3. Показатели sFas определены у 457 практически здоровых людей, (332 женщины и 125 мужчин) в возрасте от 17 до 78 лет, при этом частота выявления sFas равнялась 40%, концентрация sFas колебалась от 0.3 нг/мл до 1.2 нг/мл, средний уровень составил 0.9±0.3 нг/мл, медиана концентрации - 0.8 нг/мл. Показатели sFas достоверно не зависели от возраста и пола обследованных, а у женщин не зависели от репродуктивной функции, длительности постменопаузы и фазы менструального цикла.

4. Изучены показатели sFas в сыворотке крови у 1063 больных новообразованиями молочной железы, костей, яичников, матки, щитовидной железы, толстой кишки и надпочечников. Частота выявления и концентрация sFas в сыворотке крови во всех обследованных группах пациентов превышала соответствующие показатели контрольной группы (р=0.00001). Так, в общей группе онкологических больных частота выявления sFas равнялась 78%, средняя концентрация - 6.7±1.4 нг/мл, медиана концентрации - 2.9 нг/мл. Показатели sFas у подавляющего числа больных достоверно не зависели от возраста, пола, сопутствующих заболеваний в анамнезе, а у женщин - от репродуктивной функции, длительности постменопаузы и фазы менструального цикла.

5. Высокий уровень sFas был связан с поздними стадиями болезни при раке яичников, тела матки, толстой кишки и коры надпочечников, с низкой степенью дифференцировки опухоли при раке яичников и тела матки, с наличием регионарных метастазов при колоректальном и адренокортикальном раке, а также с глубиной прорастания опухоли в ткань миометрия, стенку кишки и в окружающие ткани при раке тела матки и толстой кишки.

6. Показатели sFas зависели от гистогенеза опухолей при злокачественных и доброкачественных новообразованиях яичников, повышенную концентрацию sFas выявляли при больших размерах опухоли у больных раком яичников, раком тела матки, раком толстой кишки, аденомой и раком щитовидной железы, а также у пациентов с раком коры надпочечников.

7. Уровень Браэ в сыворотке крови более 1.2 нг/мл достоверно ухудшал показатели общей и безрецидивной выживаемости больных остеосаркомой и раком тела матки, а также был неблагоприятным предиктивным фактором ответа больных колоректальным раком пожилого возраста на неоадъювантную лучевую терапию. Уровень эБаз в сыворотке крови более 2 нг/мл определял неблагоприятный прогноз болезни у больных адренокортикальным раком. Уровень Брав в сыворотке крови более 5 нг/мл был связан с неблагоприятным прогнозом болезни для пациенток с папиллярной цистаденокарциномой и раком яичников с размером опухоли более 5 см.

8. Выявлена прямая корреляционная зависимость уровня Браэ от концентрации ключевого активатора процесса неоангиогенеза - УЕОБ у больных раком яичников (при концентрации 1Ь-6 более 4 пг/мл) (г=0.75; р=0.001) и раком тела матки (г=0.58; р=0.01), от концентрации мультифукционального цитокина — 1Ь-6 при раке тела матки (г=0.56; р=0.01) и адренокортикальном раке (г=0.78, р=0.023) и общей активностью щелочной фосфатазы в сыворотке крови при первичной остеосаркоме (г=0.75, р=0.049). Одновременно высокие уровни эРаБ, 1Ь-6 и УЕСР определяют высокий потенциал злокачественности новообразований.