Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Моноклональные В-лимфоциты и ключевые цитокины у больных множественной миеломой

ГГО 0,1

Российская академия медицинских наух

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИХДЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ОНКОЛОГИИ им.проф.Н.Н.ПЕТРОМ

МОНОНЛОНАЛЬНЫЕ В-ЛИЫФОЩПЫ и ЮШЧЕЕЬЕ ЦИТОКИНЫ У БОЛЬНЫХ МНОЖЕСТВЕННОЙ ИШОМОЙ

Специальность: 14.00.14 - онколошя

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

На правах рукописи

Морозова Елена Владиславовна

Санкт-Петербург

1993

Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамени Научно-исследовательском институте онкологии 1ш.проф.H.H.Петрова Российской академии медицинских наук.

Научные руководители: доктор медицинских наук Б.В.Афанасьев доктор медицинских наук, профессор В.Б.Окулов

Официальные оппоненты: доктор кедицинехих наук, профессор К.Ы.Абдулкадаров доктор медицинских наук В.К.гуркало

Ведущзе учреждение: Еоенно-тедицинская академия им.С.М.Кирова.

Защита диссертации состоится__1993 г.

в _часов на заседании Специализированного ученого со-

Еета К.074.33.01 при Научно-исследовательском институте онкологии иа.проф.H.H.Петрова РАМН (Санкт-Петербург, Песочный-2, ул.Ленинградская, д.68).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан ___ 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор медицинских наук

Е.В.Демин

ВВЕдаШЕ

божественная шеелоаа (КМ) представляет собой В-лкуфопро-лкферативное заболевание, морфологическим субстратом которого являются плазматические клетка н В-лгифоциты различных стадий созревания, сепратнруюцис ионоклональный тлвуноглобулкн ) {tyte &.А., 1985).

Ш гэтерогенна по клиническим проявлениям и выживаемости больных: от нескольких месяцев до многих лет (Яворковский Л.И., 1981). Это обусловлено как биологией самих опухолевых клеток, так и состоянием организма, осуирствлясщаго контроль за пролиферацией злокачественного клона (Андреева Н.Е., 1985; Jos&mi- Q.B., 1988). В последние годы сложились относительно новые взгляды на клеточнуп и молекулярную биологию 131. Пра этом прежние представления о МИ, как терминально дкфферэкцяро-ванной В-клетовдой опухоли уступают место теории о опухоли из ранних гемопоэтичееккх клеток, но проявлявшейся, главным образом, на поздних стадиях В-клеточной диффервнцировки (БарлопгБ. и соавт., 1991).

Ведение больных ММ зависит от активности патологического процесса и тактика его колеблется от выжидательной до интенсивной химиотерапии с последующей аутологичной или аллогенной трансплантацией костного мозга (Барлоги Б. и соавт., 1991). В то же время мнения о применении радикальной терапии при Ш до настоящего времени расходятся, несмотря на очевидные успехи, достигнутые с ее помощью (Яворковский Л.И., 1981; Барлогн Б. и соавт., 1991). Это объясняется, главным образом, различными представлениями о патогенезе ИМ. В связи с этим возникает необходимость поиска новых критериев для определения стадии заболевания, а также специфики патологических сдвигов при них. В последние годн современные молекулярно-биологаческие методы нашли свое место в онкогематологяческой практике. В частности, К.М.Абдулкадоров и соавт. (1991), А.К.Голенков (1989), H.Wettsi&dh и соавт. (1982) на основании выявления монозло-нальных В-лимфоцитов, экспрессирутощих идаотипические детерминанты моноклональных Щ в крови больных Ш за несколько месяцев до четких клинико-лабораторных признаков рецидива, пред-

полежали, что этот показатель отражает размер опухолевой массы. Обсуждается роль фгнокгна супрессии кзотипа легких допой (СИДЦ) в патогенезе 1LÎ (Vos Au a, ¿).£. I9SS). Тают исслодгвания уровня сывороточного jj ^-ижроглобулина (jSg-îj), пак показателя, отражавшего функцию почзк и опухолевый объем-, может являться по иненизэ ô. ô&r&gi-e- ( 1990), 7.A. Chitct н соагт. (1983), едмша параметром, нсполозова-няе которого дает возможность установления вмосте с дргушш показателями стадий процесса, а также выделением групп риска ергди пациентов с ММ.

Прг днола газ г с я, что распространение злокачественных клеток по организму кожет происходить гематогенным путем и это-цу процессу могут способствовать моноциты-макрофаги, а также Т-клетки, е-ыделшгцие различные биологически активные соединения ( -SAoTnim S. aè <2iv 1968). Иззестно, что прогрессия оцухоли может быть связана с участием факторов, продуцируемых актквированнгг.ш какрофагаын, а такав угнетением иммунных противоопухолевых реакций (Окулов Б.Б. и соавт., 1990). Мие-ломные клеткп, покамо ыоноклональннх "Зд , также продуцируют многие цитокины, действуете по аутокрзшноцу и паракринноцу кеханизмои, что в значительной мере определяет симптоматику заболевания. Так, остеокльсталтнвирующие факторы (ОАФ) были идентифицированы как фактор некроза опухолей (ФНО^ ) и интер-лейкнн-I (M-Ij3 ) {§cwreU Mal.; 1987). Экспрессия $Н0р , ИП-Iy и интерлейкина-2 (ИЛ-2) миеломными клетками предполагает возможное участие этих факторов в злокачественном росте и дофференцнровке ( COiioâùu> f-T. 1989; DacSson Met «¿,1988).

В специальной литературе за такими цитокинами закрепилось название "ключевых", так как именно они запускают каскад имцунных реакций и играют в них ключевую роль (Кетлинский С.А. и соавт., 1992; Уо>ие$ £ eé ct£., 1991). Желание еще раз подчеркнуть их значение в связи с нашей работой послужило основанием вынесения этого термина в название диссертации.

Для пролиферации ыиелоыных клонов необходимы интерлей-кин-5 (ИЛ-5) ( СЫп Ь. e-é cd-j 1987), интерлейкин-З (М-3) (èergu-i- U. e-i а£.} 1989 ), интерлейкин-6 (ИЛ-6) {£uurcvn,o M.

tí a¿, 1988). Продукция опухолевыми клеткакн ИД-I, ФИО, ИЛ-5 может поддерживать как аутокрикное ростстимулирующее звено, так и продукцию ИЛ-6 костномозговыми моноциташ, ускоряя дкф-ференцировку ранних В-клетоп в плазматические клетки {^cureiéd.á U a¿-, IS87; Согго&м Г. ñ t¿ ct¿.j 1989 \ CcrvesngétyW

a¿v 1988). Исследование роли цитокннов в прогрессии ММ, а также связей этих нарушений с клинической картиной заболевания пока ииеют фрагментарный характер.

Так:?м образом, для понимания патогенеза Ш необходимо комплексное исследование клинических аспектов заболевания с помощью современных методов обследования иконной и гемопоэти-ческой системы, что способствовало бы выяснению о'.чологак рассматриваемого опухолевого процесса и решенгаз конкретных задач его радикальной терапии.

Цель и задачи исследования.

Целью работы являлось определение диагностически значимых показателей в крови больных КМ и обоснование? возможности использования их в качестве дополнительных критериев для уточнения характера процесса .и роли данных показателей в понимании биологии заболевания.

В соответствии с поставленной цельп наш резались следующие задачи:

1. Определен:^ уровня ноноклональных Е-лимфоцитоп и наличия супрессии изотопа легких цепей у больных с Kí.

2. Оценка содержания ¡} Р-м в сыворотке больных в зависимости от стадии процесса.

3. Установление активности ИЛ—I, ИД-2, содержания ФНО, продуцируемых мононуклеарами периферической кровл больных.

4. Сопоставление полученных показателей с клинической стадией процесса.

Научная новизна.

Впервые проведено комплексное определение продукции ключевых цитокинов, наличия моноклональных В-лимфоцитов и феномена супрессии изотипа легких цепей у больных с разными стадиями ММ. Впервые исследованы секреция ИЛ—I, ФНО моноцитами периферической крови больных и выявлены различия в продукции этих

цитокннов, а также, по мере прогрессии заболевания выявлено отчетливое снижение активности ИЛ-2. Установлено появление в периферической крови моноклональных В-лкмфоцитов у больных со П и 1 стадией, а также отсутствие зависимости между наличием феномена супрессии изотипа легких цепей и стадией ММ. Впервые показана возможность использования упомянутых иммунологических показателей для стадирования заболевания и в выборе программ лечения больных.

Практическое значение.

Проведенный анализ активности ключевых цитокинов, уровня м, а также выявления моноклональных В-лимфоцитов и феномена СИЛЦ закладывает основу для введения в клиническую практику возможности использования дополнительных иммунологических показателей для уточнений стадий процесса.

Результаты работы используются в качестве критериев течения заболевания и определения прогноза у больных ММ в гематологическом отделении и отделении трансплантации костного мозга Клинического центра передовых медицинских технологий (г.Санкт-Петербург) .

Структура диссертации.

Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав и выводов. Текст иллюстрирован рисунками и таблицами. Указатель литературы содержит работ отечественных и зарубежных авторов.

Апробация работы состоялась на совместном заседании отделения гематологии и трансплантации костного мозга, отделения детской онкологии, лаборатории экспериментальной и клинической онкоимцунологии и отделения трансплантации костного мозга Клинического центра передовых медицинских технологий 10 марта 1993 года.

Результаты диссертации были изложены в стендовых докладах на международных симпозиумах "Молекулярные факторы- гемопоэза и стволовая клетка" (Москва, Ленинград, 1990), "УПоЖегл 'Гге-ги/д

Яитьп- </аи&т!а1" (Санкт-Петербург, 1992), доложены на Европейской школе гематологов (Москва, 1993). По материалам -диссертации опубликовано 2 статьи в иностранном сборнике и 2-е тезисов докладов на международных симпозиумах.

Практические ракокандздгул .

Кссжэдованнке п нсаей работе показатели активности ПЯ-1, Я2-2, содзрглнкя: ШО, J, <>-м, а также наличия В-люзфоцитов uoiyT использоваться в качестве дополнительных ккцунологича-ckjk кряторзов в определении стадий заболевания у больных 1-1.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Под наблюдением находилось 66 пациентов с Ш, из нях в I стадии -II, во П - 35, вШ стадии - 14 и в стадии рекяс-сии - б. Стадия заболевания определялась по классификации (Ourle B.(f.M. и JaX/nost- (1975). Определение типа моно-клонального ^ и легких цепей в сыворотке производили кн-муноферментным методом с использованием коноплопальных антител к тяжелым и легким цепям в лаборатории гибрядомной технологии ЦНИРРИ.

Выделение мононуклеаров периферической крови (ИНПК) производили из гепаринизированной крови путем цантркфугированця в градиенте плотности фиколл-верографин по методу А, (1968). Для получения моноцитов периферической крови (ШК) суспензию №ffiK инкубировали в пластикогах чашах Петри, предварительно обработанных аутологичной сывороткой в газопроточном термостате в течение 60 минут. Неприкрэпившиеся к пластику клетки удаляли.

Поверхностный мембранный ^ и легкие цепи определяли с помощью непрямого иммунофлворесцентного ызгода ЯМ.

Coons A.M. 1984), с использованием ионоклональных антител к каппа и лямбда цепям (в разведении 1:4), полученным

из лаборатории гибридомнои технологии ЦНИРРИ. Моноклональныг В-лимфоциты устанавливались при соотношении лимфоцитов, экс-прессирующих каппа-легкиэ цепи, к лямбда-лимфоцитам > 3 при каппа-типе парапротоина и 0,5 при лямбда-типе парапро-теина, что выходило за границы ( Ж 1985). Этими

границами считали соотношение лимфоцитов, экспрессиругацих наппа легкие цепи к лямбда-лтфзцигамк, установленное предварительно при тестирования 20 доноров и находившимися в пределах от 0,5 до 3,0. Относительное содержание положительных

платох при флуоресцентном освещении определяли при наблюд-j-к«« но «гнео ICQ клеток. Абсолютное -^личестзо моноклональньа В-дикроцнтов (клеток и иы") рассчитывали по количеству лимфоцитов в руганной гемограмма.

Наличие феномена СШЩ определяли путем вычисления соот-нооекяя ¿.ссодгпното количества лгдйсцатов, ьяспрессищощих каппа-легкие цепи, к лимфоцитам эжспресенруюадаы лямбда-легкие цепи (И&э\>гпе ¿г/. б£ cJy 1984). Пациенты с каппа-типом пара-протеина были шдслены как имеющие СШЩ, при соотнесении каппа-ишфо^ов к лямбда-яиыфоцитам < 0,5, а при лямбда-типе паралротеина ^ 3,0.

Определение р g-м в сыворотке крови проводили с использованием коммерческих наборов производства института Биоорганической химии Академик наук ЕССР, зав.лаб. д.м.н. Чащин В.Г. Чувствительность катода 3 мкг/л.

Определение активности Ш-1 в супернатантах МПК выполняли по методу S.7ftaet и соавт. (1978). В качестве контроля использовали рекомбинантный Ш-I человека (ВНИИ ОЧБ, г.С.-Петербурга) с удельной активностью

10° ед/мл.

Содержание 3H0 в супернатантах ШК выполняли иммунофер-ыентнш анализом с использованием коммерческих наборов производства ВНИИ ОЧБ г.С.-Петербурга, в качестве эталона применяли рекомбинантный ФНО, с удзльной активностью 5x10^ МЕ?Умл (ВНИИ ПЭ, г.Вильнюс).

Определение активности ИД-2 в супернатантах ШПК производили по методу И. Иос&пил. и соавг. (1981). Контролем служил рекоыбинантный ИЛ-2 с удельной активностью 10 ед/мг (Институт органического синтеза, Латвия).

Статистическую обработку данных производили по методу Стьюдента и непараметрическим методом по Уайту.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

На наличие моноклональных В-лимфоцитов нами было обсле-

IE - международные единицы

довано 40 больных ММ, из них в I стадии - б, во П - 23, в II -В, в стадии ремиссии - 3. Результаты представлены в табл.1, 2, 3, 4. Из 40 обследованных больных моноклональные В-дафоциты были выявлены у 4 пациентов (10£); из них 2 с миелокой-::эппа, 2-е миеломой-лямбда, что в целом согласуется с результатами других исследований по иммунофзнотипировангсо ( Р1всы$Аь

й л/, 1990; е^1989). Обращает на себя внимание,

что ни у одного из больных в I стадии и ни у одного из 3 пациентов в стадии ремиссии моноклональные В-лимфоциты выявлены не были. В то же время среди 23 пациентов во П стадии их наличие установлено у 3 (13%). Моноклональные В-лимфоциты были ■ Еыявлены также у I из 8 пациентов в Ш стадии (12,5$).

Моноклональные В-лимфоциты, выявленные у 4 пациентов, была установлены у больных с П и Ш стадиями именно в период прогрессии заболевания, в связи с чем мы считали целесообразным охарактеризовать эти случаи более подробно. Так, у больной Т., с диагнозом множественной миеломы , диффузной формы

течение заболевания носило агрессивный характер и отличалось ' рефрактерностыо к проводимой терапии. Моноклональные В-лимфоциты у больной были выявлены в период выраженной прогрессии заболевания.

У больной Л. при постановке диагноза установлена миелом-ная болезнь X > I стадии. Однако течение заболевания приняло агрессивный характер, с рефрактерностью к терапии сарко-лизином и импульсной терапии преднизслоном. Содержание незрелых миеломных клеток в костном мозге наросло до 60,95?, прогрессировал остеопороз с патологическими переломами ребер. Именно в этот период у больной были выявлены моноклональные В-лимфоциты. Продолжительность жизни от момента постановки диагноза составила 9 месяцев. *

У больной К. с диагнозом ММ, Зр&Л , диффузно-узловатой формы, П стадии моноклональные В-лимфоциты были выявлены при постановке диагноза. Течение заболевания носило агрессивный характер, несмотря на проводимую терапии отмечалось нарастание количества плазматических клеток в костном мозге, деструктивных изменений в костях, черепе с саркокным ростом, прорастание опухолевой массы в органы малого таза. Продолжительность

•г

Таблица I

Экспрессия каппа и лямбда легких цепей на лимфоцитах у больных с I стадией ММ

п/п

Тип ыонокло-нального Зд

Л-

сщ

Моноклональные В-лимфоциты

х

УйМх

0,75 0,55 1,60 1,16 1,70 1,30

нет нет нет нет нет нет

нот нет нет нет нет нет

Таблица 2

Экспрессия каппа и лямбда легких цепей на лимфоцитах у больных с Ш стадией МЫ

№ п/п Тип моножло-нального а: * я СИлц Моноклональные В-лимфоциты

I. 0 есть нет

2. 0,6 нет нет

3. 0,3 есть нет

4. 1.1 нет нет

5. Ьн & 1,2 нет нет

6. 1,4 нет нет

7. 0,7 нет нет

8. од нет есть

Таблица 3

Экспрессия каппа и лямбда легких цепей на лимфоцитах у больных в стадии ремиссии

№ п/п Тип монокло- а к ПИЛТ! Моноклональные

нального ^ V* В-лимфоциты

I. $5 V- 1,4 нет нет

2. Я 1,3 нет нет

3. 4,0 есть нет

*

Таблица 4

Экспрессия каппа и лямбда летних цепей на лт.тфоцитах у больных со П стадией ка

№ Тип нононло- сищ Мононлональныв

п/п нального ^ л В-лкифоциты

I. г 1.3 кет нет

2. * 2,2 нет нзт

3. 1,3 нот нет

4. 0,89 нет нет

5. 9,8 нет есть

6. 0,5 есть нет

7. 2,5 нет нет

8. Щ^эс 1,8 нет нет

9. 1,2 нет нзт

10. - а? 1,7 нет нзт

II. 1,4 нет нгт

12. х 1,8 нет нет

13.' 0,11 есть нет

14. 2,3 нет нет

15. 0,88 нет нет

16. 1,0 нет нет

17. 1,2 нет нзт

18. % $1Л 5,0 есть нет

19. ЩЖх 0,6 кэт нет

20. 0,25 нет есть

21. 4,4 есть нзт

22. - -х 0,5 есть нет

23. ■ ...... 4,0 нет есть

- Расчет производили по соотношения ^ аг -лимфоцитов к д -лимфоцитам в ей

пизни пациентки от момента постановки диагноза составила 6 месяцев.

У больного К., с диагнозом солитарной мнеломы были проездами курсы лучевой терапии и 8 курсов полихшгиотерапин с зф|>ектои. Б течение 5 лет данных за прогрессию заболевания ¡выявлено на было. Однако в последующая у больного появились признаки гекерадизгции процесса и именно в этот период были выявлены моноклональные В-лимфоциты.

Представленные наш! данные о выявлен*:» коноклональньсс В-лщзфоцатов у больных с П и Ш стадиями согласуются с предположений!.! ЛЛШл^ле и соавт. (1978) о взаимоотношении между появлением нлонотштичзских В-лтафоцитов в крови больных ММ и величиной опухолевой массы, данными/^ и

соавт. (1986), установивших связь между наличием моноклональ-ных В-лимроцигов и активность» заболевания, а такие результата и соаит. (1981), установивших повышение частоты определения этих лимфоцитов у больных по ызре прог-ргссии заболевания.

Таким образом, согласно данным литературы и полученными нами результатами складывается Епачатление, что выход в периферическую кровь монокленальных В-лиифоцитов, изотипичных циркулирующим легким цепям, отражает объем опухолевой массы у больных ИМ, являясь плохим прогностическим признаком в течении заболевания.

Поиск ¡ялгунохпшческюс маркеров и других признаков, позводйзцих своевременно гаявлять изменения в течении патологического процесса особенно важен при !>Ш. Вот почему выявленная ■УУЛас /глла/ь. {¡/лх>н^гс£ <£. е£ ^1979) поликло-нальная супрессия нормальных клеток обратила на себя внимание с точки зрения возможности использования этого феномена при дифференциальной диагностике фазы плато и фазы прогрессии. Нами было обследовано 40 больных ММ для установления наличия у них феномена СИЛЦ. Результаты представлены в табл.1, 2, 3, 4. У 6 больных в I стадии ММ феномен СИЛЦ выявлен не был. При обследовании 3 пациентов в стадии ремиссии СИЛЦ выявлен, у одного больного (33,35?). Больной имел лямбда-миелому.

Из 23 боль¡ccc с П стадазй феномен СИЛЦ выявлен у 5 (21,7%) больных, из них у 3 больных установлена кяолока-каппа, у 2 больных - миелсма-ля!£б*а. Среди 8 пациентов с И стадией СИЛЦ выявлена у 2 (25%) больных, оба пациента икали шелоцу-каппа (рр-0,05).

Эти результаты в целом согласуются с данньшя литературы ( Jt. 1989; IVzo^m Ua£.y 1987). При их сопоставления с результатам обнаружения ионоклональных В-лиггфо-цитов обращает на себя внимание тот факт, что несмотря на отсутствие феномена СШЩ у пациентов в I стадии !".!, у них не была выявлены моноялональные В-лтафсцлты, что можно рассматривать кап косвенный яритер::Я благоприятного прогноза. Что касается больных в стадии раылссии, то среди кях ни один из пациентов нз имел ионоклональных В-л1с.!фоцитоз в периферической крогл, хотя наличка СИЛЦ установлено в 33% случаев. Tea не йене е , эти результаты не позволяют сделать окончательный вывод

0 роли СИЛЦ в сдержнзангс! роста злокачественного клона при Ш и требуют дальнейшее исследований.

Уровни -J>o~n в сыворотке крови больных ММ. Средний уровень J>2~u У доноров составил 1,7+0,8 г/л. У 8 больных с

1 стадией уровень J>2~b,i 3,70+1,7 г/л, что было статистически достоверно шае уровня доноров (р<0,05). Срэдняй уровень J>2~u У пациентов со П стадией равнялся 5,34+2,01 г/л, что также было статистически достоверно выше уровня J, g-м доноров (р<0,01) и больных в I стадии (р<0,05). У II пацизн-тов с Ш стадазй заболевания установлен уровень Ji g-м 10,0+ 5,55 г/л, что было статистически достоверно выше, чем у больных с I и II стадиями, и у доноров (р<0,01). У 6 больных в стадии ремиссии уровень J> был 3,52+1,05 г/л, это оказалось выше уровня J>2~u У доноров (р<0,05). В то же время J>2~u У больных в стадии ремиссии был ниже, чем у больных в

I стадии (р<0,01), и П и Ш стадий (р<0,05) (табл.5)., Полученные результаты согласуются с литературными данными о J, g-м, как о показателе, отражавши величину опухолевой массы при Ш, что послужило основанием для использования его в качества надеяного параметра при определении стадии процесса fictreuJaitM.

at аеу 1984; 6<хШВ£г 1984; eiad.,

1991). Таким образом можно предполагать, что уменьшение опухо-

левой массы в результате лечения будет сопровождаться снижением уровня £ £-м и следовательно этот белок может быть также надежным маркером эффективности лечения при Ш.

Таблица 5

Уровень ^ ^-микроглоб^ли^^ в сыворотке крови больных

^ 2~м (М+€Г )

I стадия С/ь- =8) 3,7+1,?::

П стадия (/>=25) ■5,34+2,01**

Ш стадия (л.-II) Ю.О+б.бб3®

Ремиссия {к. =6) 3,52+1,05*

Доноры =11) 1,70+0,8'

I) Статистическую обработку производили с использованием критерия Стьюдента;

к - Различие достоверно по сравнению с донорами Ср< 0,05);

ех - Различие достоверно по сравнению с донорами (р< 0,01).

Биологическая активность ИД-1 синтезируемого МПК у больных МЫ. Результаты определения спонтанной активности ИД-1 пре£ ставлены в табл.6. Средний уровень активности ИЛ-1 у II доноров разнялся 23,89+7,03 ед/мл, а у '37 больных 55,87+86,72 ед/мл, статистически достоверного различия в этих показателях не было. У 4 пациентов в I стадии средний уровень активности ИЛ-1 был 19,61+11,67 ед/мл, что было статистически достоверно ниже активности ИЛ-1 у доноров (р<0,01), средний уровень спонтанной активности ИЛ-1 у 22 больных со П стадией ММ составил 59,63+72,23 ед.акт., что не отличалось от активности ИЛ-1 у доноров и.больных с I стадией (р>0,05). При исследовании активности ИЛ-1 у больных в Ш стадии средний уровень ИЛ-1 был 26,21+11,69 ед.акт., статистически достоверного различия этого показателя от такового у больных с I и П стадиями не найдено (р^-0,05), однако установлено статистически достоверное повышение уровня ИЛ-1 по сравнению с таковым у доноров

(р .с 0,01). Средний уровень спонтанной активности у б больных в стадии ремиссии составил 22,40+11,06 ед/мл. Активность ИЛ-1 у больных а стадии ремиссии не отличалась статистически достоверно от продукции И1-1 у больных с I, П, Ш стадиями (р^0,05), но была вьше уровня ИЛ-1 доноров (р<0,01).

Таблица 6

Активность ИЛ-1 спонтанно продуцируемого у больных №1 (ед/мл; разведение супернатантов 1:4)

ИЛ-1 (М+б-)

I стадия («• =4) П стадия (^ =22) Ш стадия (и. =5) Ремиссия 0г =6) Все больные ( 37) Доноры (/г =11) 19,61+11,67* 59,63+72,23®* 26,21+11,69* 22,40+11,06х 55,87+86,72?®" 23,89+7,03

Достоверность различий с группой доноров по Уайту: я - р< 0,01; же - р>0,05.

Результаты исследования активности ИЛ-1, индуцированной пирогеналом представлены в табл.7. У II доноров средний уровень активности ИД-1 составил 39,60+26,03 ед/мл, у группы из 37 больных ММ 76,77+98,50 ед/мл, однако различие в активности статистически недостоверно (р>0,05). При разделении больных по стадиям были получены несколько другие результаты. Средний уровень активности ИЛ-1, индуцированной пирогеналом у 4 больных с I стадией был 18,68+5,25 ед/мл, что статистически достоверно было ниже уровня ИЛ-1 у доноров (р< 0,01). У 22 пациентов со П стадией уровень ИД-1 составил 94,99+118,08 ед/мл, что было статистически достоверно вьше активности ИЛ-1 у больных с I стадией (р<0,05), но не отличалось от активности ИЛ-1 у доноров (р? 0,05). Средний уровень индуцированной пирогеналом активности ИЛ-1 у 5 пациентов с Ш стадией быд 63,19+53,01 ед/шг, что было вше активности Ш1-1 у доно-

ров и больных с I стадией (р<0,01), и в то нее время было статистически достоверно ниже активности ИЯ-1 у больных во П стадии (р< 0,01). У б больных в стадии ремиссии уровень ИЛ-1 был 27,82+8,74 ед/мл. Активность ИЛ-1 у больных в стадии ремиссии была ниже активности ИЛ-1 у доноров и больных со Д стадией (р<0,01), но не отличалась статистически достоверно от активности ИЛ-1 у больных с I, II стадиями и стадией ремиссии (р>0,05).

Таблица 7

Активность ИЛ-1, продуцируемого в отбэт на индукцию плрогеналом у больных шчед/мя; разведение супер-натантов 1:4)

ИЛ-1 (М+<?)

I стадия (л =4) П стадия (л =22) Ш стадия (я- =5) Ремиссия {я =6) Все больные Ы=37) Доноры (п =11) 18,68+5,25й 94,99+118,08ш 63,19+53,01* 27,82^8,74* 76,77+98,513® 39,60+26,03)

Достоверность различий с группой доноров по Уайту: к - р< 0,01; - р>0,05.

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о повышении уровня спонтанной и индуцированной пирогеналом активности ИЛ-1 по мере прогрессии заболевания.

Нами была исследована спонтанная продукция ФИО в супер-натантах моноцитов периферической крови у 33 больных ММ. Средний уровень содержания ®0 у больных ММ составил 0,74+1,62 нг/мл, что не отличалось статистически достоверно от содержания ФН0 в супернатантах моноцитов периферической крови у доноров (р>0,05). Результаты исследования представлены в табл.8. У 4 больных в I стадии был устац£влен средний уровень содержания Ш0 0,9+1,8 нг/мл, что было дйстоверно ниже уровня ФйО у доноров (р<0,01). Уровень спонтанной продукции у 20 больных

со П стадией составил 0,68+1,8 нг/мл, что било и: гае уровня данного показателя у доноров (р< 0,01), но не отличалось ста-тчстичесчи достоь.фно от уровня ФИО у больных с I стадией (р>0,05). У бс ьных с Ш стадией ФЮ в пределах разрешавшей способности метода но обнаружен. Уровень содержания ФНО б больных- в стадии ремиссии ММ был 1,22+1,33 нг/мл. Уровень ШО у больных в стадии ремиссии, у доноров и больных с Ш стадией но различался статистически достоверно (р >0,05), в то Я" время содержание ФИО у больных а стадии ремиссии было вьгае, чем у больных с I, П стадиями (р-=:0,01).

Таблица 8

Секреция ШО спонтанно продуцируемого у больных Ш (нг/мл)

Уровень секреции ФНО (М+ег)

I стадия (п, =4) 0,9+1,8*

П стадия (л. =20) 0,68+1,8й

Ш стадия («-=3)

Ремиссия (л- =6) 1,22+1,32?®

Все больные (л-=33) 0,74+1,62^

Доноры («-= 8) 1,08+0,94

Достоверность различий с группой доноров по Уайту: * - р<0,01; г® - р>0,05.

У больных с ММ средний уровень индуцированной пирогена-лом продукции ФНО составил 2,68+3,27 нг/мл, что не отличалось от уровня ФНО у доноров (р^-0,05). Однако при разделении больных по стадиям были получены следующие результаты (табл.9). Средний уровень индуцированной пирогеналом секреции ФНО у 4 больных с I стадией был 3,65+3,28 нг/мл, что не отличалось от уровня ФНО у доноров (р>0,05). У 20 больных со П стадией средний уровень ФЮ составил 2,92+3,28 нг/мл, однако статистически достоверного различия между уровнями ФНО у больных со П стадией, с уровнями секреции у доноров и больных с

I стадкай выявлено не было (р>0,05). У 3 больных с Ш стадазй сргдняй уроЕЭКь содержания £Н0 составил 0,87+1,50 нг/мл, что било статистически достоверно нзсха уровня $Н0 у доноро:. (р<0,01), а гайке ш~е уровня £Н0 у больных с I и П стадкя-ш (р< 0,05). Нами установлен средний уровень селрцик ©НО у больных в стад;1н ремиссии 2,05+1,08 нг/мл. Не выявлено статистически достоверного различия в уровне §Н0 у больных в стадии ремиссии, при сравнении с уровнем ФНО у доноров и больных с I стадией, а также больных с 1П стадией (р?-0,05). В то же время секреция ФИО у больных в стадии ремиссии была достоверно ниже уровня секреции $Н0 у больных со П стадией <р«е0,01).

Таблица 9

Секреция ШО в ответ на индукцию пирогеналоы у больных Ш (нг/мл)

Уровень секреции ФНО (М+СГ)

I стадия (л =4) 3,65+3,28^

П стадия (л =20) 2,92+3,2ВШ ■

Ш стадия (*• =3) 0,87+1,50»

Ремиссия (^ =6) 2,05+1,08й35"

Все больные (д. =33) • г.бв+з.гт3®

Доноры (п. =8) 2,17+1,07

Достоверность различий с группой доноров по Уайту: * - р< 0,01; зве - р>0,05.

Полученные нами данные о повышении активности ИЛ-1 у больных с П, 111 стадиями, а также некоторой повышенной секреции ФНО у пациентов с I и П стадиями ММ мы склонны объяснять паракринным эффектом ИЛ-1 и ФНО на пролиферацию миеломных клеток, что находит подтверждение в работах ¿й.«/¡мо 1Я. и со-авт. (1989), МсАЖ&щ и>ъ. $ и соавт. (1989).

В исследованиях на белковом и генном уровнях получены убедительные доказательства существования нммунорегулятор-ного цитокинового каскада, включающего И1-1 и ФНО, которые усиливают опосредованную Ш-6 пролиферацию миеломных клеток ( Carter &£ сс£., 1990). Также имеются сведения о повышенной продукции ИЛ-1 и ФНО клетками костного мозга, а также повышение уровня ИЛ-6 в сыворотке крови больных ММ {èaiaieia Л. eécU.j 1989; ^¿¿o6Cjvo /: e-é 1989).

Таким образом, выявленная нами чрезмерная активизация Ш1-1 у больных с П и Ш стадиями, а также повышенное содержание ФИО у пациентов с I и П стадиями, возможно приводит к повышению продукции НП-6 и способствует усилению пролиферации опухолевого клона. Можно предполагать также, что повышенный уровень ИЛ-1 и ФНО является следствием вторичной активизации моноцитарно-макрофагальной системы ( FuèàoK oé, té al./ 1988). Кроме того, немаловажным аспектом исследования явилось установление роли ИЛ-1 и ФНО в клинических синдромах при ММ. Нами отмечены пациенты с наиболее высокими уровнями ИЛ-1. В частности, у больного Г. 166,10-181,92 ед.акт. (спонтанная и индуцированная пирогеналом активность ИЛ-1, соответственно); у больной И. 300,11-353,73 ед.акт.; у больной Б. 28,67-61,64 ед.акт.; у больной И. 26,86-147,42 ед.акт.; у больной Б. 117,93-123,18 ед.акт. И именно у этих пациентов отмаченны умеренные и выраженные.костные деструкции (согласно классификации iïiwlc Лабтол S. £. , 1975).

Также нами установлено, что у 3 из указанных больных имеется повышенный уровень содержания ФНО в супернатантах моноцитов периферической крови. Так, у больной М. -6,4 нг/мл, у больной Б. - 3,5 нг/мл, у больной Б. - 12,0 нг/мл (представлены показатели по индуцированной пирогеналом продукции ФНО). Следовательно, полученные нами результаты подтверждают данные о роли ИЛ-1 и ФНО в генезе остеодеструк-тивного синдрома при ММ (¿амЯыго 7?7. ci198?). Таким образом, роль ИЛ-1 и ФНО в патогенезе ММ не вызывает сомнения, хотя полностью пока неясна.

Биологическая активность ИЛ-2, продуиируепого ШПК у больных ММ. Результаты выполненных исследований представлены в табл.10. Средний уровень активности ИЛ-2 у 12 доноров составил 13,97+4,07 ед.акт., при сравнении данных групп обследования статистически достоверного различия выявлено не было (р>0,05). У 8 пациентов с I стадией средний уровень ИД-2 был 13,95+3,92 ед.акт., что также статистически достоверно нз отличалось от группы доноров (р>0,05). Средний уровень активности Ш1-2 у 14 больных во П стадии составил 10,83+2,99 ед.акт., что было нике статистически достоверно уровня активности ИЛ-1 у больных в I стадии (р<0,05), но не отличалось достоверно от уровня М-2 у доноров (р>0,05). У 8 пациентов в Ш стадии средний уровень активности составил 8,79+1,38 ед.акт., что было статистически достоверно ниже активности у больных в I, П стадии, а также у доноров (р<; 0,01). Сродний уровень активности ЙЛ-2 у 5 пациентов в стадии ремиссии равнялся 13,12+2,27 ед.акт., что было статистически достоверно Еыпе активности ИЛ-2 у больных с I, П стадиями (р< 0,01), а также больных с Ш стадией (р<0,05), но не отличалось от активности ИЛ-2 у доноров (р?0,05).

Таблица 10 Активность ИЛ-2 у больных ММ (ед.акт.)

ИЛ-2 (М+Г)

I стадия (п- =8) 13,95+3,92**

П стадия (гс =14) . .10,80+2,ЭЭ3®

Ш стадия (п- =8) . . 8,79+1,38я

Ремиссия (и- =5) 13,12+2,27**

Все больные (л- =35) 11,66+2,64**

Доноры (п- =12) ' 13,97+4,07

Достоверность различий с группой доноров по Уайту: х - р<0,01; же - р^ 0,05.

Таким образом, при исследовании активности ИЛ-2 в супер-натантах МНПК было установлено отчетливое снижение уровня ИЛ-2 по мере прогрзссии заболевания. Полученные нами данные согласуются с результатами работ £оп?/тты 7! и соазт. (1986) и Рсига Л н соавт. (1991), выявивших более высокий уровень Ш-2 у больных со стабильный течением, в отличие от пацизн-тов с прогрэсскрованиэм ИМ. Однако, учитывая результаты исследований пилои соавт. (1989) и ¿'¿¿о£о ^Г, и соазт. (1987), не установившее повышенной экспресса рецептора ИЛ-2 на плазматических клетках при Ш, а также собственные данные складоьается впечатление, что Ж-2 не является сти>-<улятором пролиге^ации миелокных клото::. Также может обсуждаться значение .ровня ИЯ-2 как фактора, характеризующего противоопухолевый иммунитет. По мере прогрессии заболевания (П, Ы стадия) имеет г.гесто снияение активности ИЛ-2, что может отражать снижение активности противоопухолевого иммунитета и дисбаланс в аутокринной система ИЛ-2 и КЛ-2-рвцептор (Уасса-Л, еб а£у 1991). Крона того, нами установлена корреляция между уровнями активности ИЛ-2 и £-и. Так, при уровне .

< 6 мг/л, активность ИЛ-2 оказалась статистически достоверно выше, чем у больных с концентрацией в сыворотке £2~и > 6 мг/л (р<0,01). Эти данные позволяют использовать названные показатели (ИЛ-2 и ^ в качестве диагаостиче-ских при уточнении характера процесса, а также в определении тактики при Ш.

вывода

1. По мере прогрессии множественной миеломы в периферической крови больных нарастает количество В-лимфоцитов, принадлежащих к опухолевому клону.

2. По мере прогрессии множественной миеломы повышается активность интерлейнина-1, синтезируемого моноцитами периферической крови по сравнению с его активностью в начальных стадиях заболевания.

3. На начальных стадиях множественной миеломы наблюдается повышение содержания фактора некроза опухоли и выраженное

CHKS3HH8 его уровня по мере прогрессии заболевания.

4. По ыерз прогрессии повышается уровень J> £-иикро-глобулина в сыворотке крови больных множественной ииеломой и в каждой из последующих стадий достоверно отличается от предыдусрВ.

5. При прогрессии множественной ыиелош достоверно снижается активность интерлейкина-2, синтезируемого моноцук-леарами периферической крови.

6. Не обнаружено взаимосвязи между наличием феномена супрессии изогипа легких цепей и стадиями множественной мие-ломы, что делает невозможным использование этого параметра

в качество прогностического.

7. Наличие моноклональных В-лимфоцитов, уровень j ^-мик-роглобулина и активности ИЛ-I, ИЛ-2, а также содержание ФИО могут использоваться в качестве дополнительных иммунологических критериев при стадировании множественной миеломы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Морозова Е.В.; Подольцева Э.И., Климович В.Б., Кравцова В.М., Афанасьев Б.В. Клиническое и иымунолопгоесков обследование больных с множественной миеломой //Молекулярные факторы гемопоэза и стволовая клетка: Тез.межд.симп. -М., JL, 12-17 июня. - 1990. -.С.123.

2. Подольцева Э.И., Морозова Б.В., Кравцова В.М., Афанасьев Б.В. Связь множественной миеломы и амилоидоза //Молекулярные факторы гемопоэза и стволовая клетка:Тез.межд. сикп. - М., Д.,"12-17 июня. - 1990. - C.I30.

3. Almazov V.A.', Podoltzcva U.I., Korozova E.V., Si.tsk.aya X.O., Kravzo-va V.M., Afatiasiev B.V. Multiple myeloma: immunodeficient, osteolytic, renal and amyloid syndromes. In : Modern Trends in Human Leukemia IX. New results in clinical and biological research including pediatric oncology / Eds.: Neth R., Frolova E. , Callo R.C.,. et.al., Springer-Verlag . - Wilsede. June 17 - 21.

im- f. 41-43.

4. AEanasicv B.V., Podoltzeva E. I.. HorozoMa E.V., Almazov V.A., Zubarovskaya L.S, Kravzo-va V.M. Prognostic factors in patients with multiple myeloma. In : Modern Trends in Human Leukemia IX. New results in clinical and biological research including; pediatric oncology / Eds.: Ketli R., Frolova E., Gallo R.C.. et.al., Springer-Verlag.-Wilsede. - June 17 - 21.- 1990. - p.50-55.