Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Значение апоптотической активности опухолевых клеток костного мозга у больных множественной миеломой для прогноза течения и оценки эффективности терапии

На праоах рукописи

УДК: 616 - 006.448 - 07: 616. 419

О034Э22 1кг

ЧУБУКИНА ЖАННА ВИКТОРОВНА

ЗНАЧЕНИЕ АПОПТОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА У БОЛЬНЫХ МНОЖЕСТВЕННОЙ МИЕЛОМОЙ ДЛЯ ПРОГНОЗА ТЕЧЕНИЯ И ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ТЕРАПИИ

14.01.21 - гематология и переливание крови 14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 1 ФЕ8 2010

Санкт-Петербург 2010

003492212

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии» Федерального медико-биологического агентства России

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Бубнова Людмила Николаевна доктор медицинских наук, профессор Бессмельцев Станислав Семенович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Афанасьев Борис Владимирович доктор медицинских наук, профессор Калинина Наталья Михайловна

Ведущая организация: ГОУ ДПО «Санкт-Петербургская Медицинская Академия последипломного образования»

диссертационного совета Д-208.074.01 ФГУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии» (193024, Санкт-Петербугр, ул. 2-ая Советская, д.16).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского НИИ гематологии и трансфузиологии.

Защита состоится «.

/» Ж^ЯЛ^ТЪ^ 2010г. в &

ее

_часов на заседании

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук

Глазанова Татьяна Валентиновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Множественная миелома (ММ) - это лимфопролиферативное заболевание, морфологическим субстратом которого являются плазматические клетки различной степени зрелости, продуцирующие моноклональный иммуноглобулин. Значительная часть симптомов данного заболевания обусловлена пролиферацией опухолевых клеток в костном мозге с последующим вытеснением элементов нормального кроветворения (Alexanian R. et al. 1994; Бессмельцев С.С. и соавт. 2007).

Активность патологического процесса обусловлена как биологией опухолевых плазматических клеток (ПК), так и их взаимоотношением с микроокружением (стромой костного мозга), клетками иммунной системы. Многообразие клинических проявлений ММ связано и с нарушениями цитокинового статуса. Показано, что цитокины, выполняющие функции медиаторов межклеточных взаимодействий и продуцируемые мононуклеарными (МНК) и самими опухолевыми клетками, контролируют опухолевый рост: одни - стимулируют остеокласты костного мозга, пролиферацию опухолевых клеток и угнетают процесс их апоптоза (программированной клеточной гибели), тогда как другие - ингибируют рост патологических клеток, индуцируя в них процессы апоптоза, и стимулируют цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ) и естественные киллерные клетки (NK-клетки) противоопухолевого иммунитета (Кетлинский С.А. 2004; Richardson P.G. et al. 2004). Это показывает, что взаимоотношения «опухоль-иммунная сиситема» многогранны и сложны и далеко не на все вопросы есть ответы.

Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в терапии ММ, заболевание до сих пор остается неизлечимым. Отсутствуют точные прогностические факторы, способные предопределить характер течения и выживаемость больных. Это обстоятельство диктует необходимость поиска новых критериев прогноза наряду с известными (уровень содержания Р2-м, ЛДГ, ИЛ-6, хромосомные аберрации и др.), которые позволили бы уже на первом

этапе диагностики прогнозировать течение ММ с целью определения терапевтической тактики (Бессмельцев С.С. и соавт. 2009).

Любой вид специфической терапии зачастую ведет к развитию резистентности, представляющей собой невосприимчивость опухолевых клеток к целому ряду препаратов, и активизации новых опухолевых клонов, скорость пролиферации которых опережает цитостатический эффект используемых препаратов. Исследования последних лет показали, что противоопухолевая терапия, независимо от конкретного механизма действия каждого из препаратов, реализуется путем индукции апоптоза патологических клеток. Полагают, что одним из важнейших механизмов устойчивости является подавление апоптоза. Изучение этого процесса, включая влияние цитокинов и экспрессии рецепторов апоптоза, позволит получить наиболее четкие представления относительно механизмов гибели опухолевых клеток и установить, могут ли быть использованы характеристики апоптотической активности опухолевых клеток на этапе первичной диагностики заболевания для выработки адекватной лечебной тактики.

Целью настоящего исследования явилось изучение апоптоза клеток опухолевого клона костного мозга и иммунных механизмов его реализации у больных множественной миеломой и определение значения апоптотической активности для прогноза течения заболевания и оценки эффективности специфической терапии.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить апоптотическую активность плазматических клеток костного мозга у больных с впервые выявленной множественной миеломой, рецидивом заболевания и достигших ремиссии.

2. Исследовать функциональную способность клеток костного мозга больных множественной миеломой продуцировать цитокины, ингибирующие и стимулирующие апоптоз опухолевых клеток.

3. Оценить экспрессию апоптогенного рецептора Ра8/СБ95 на опухолевых плазматических клетках больных множественной миеломой.

4. Изучить состояние клеточного и гуморального иммунитета, фагоцитарную активность нейтрофилов у больных множественной миеломой.

5. Выявить наиболее значимые критерии прогноза течения заболевания и оценки эффективности терапии на основании установленных закономерностей.

Научная новизна исследования. Впервые на репрезентативном клиническом материале выявлены особенности апоптотической активности опухолевых клеток костного мозга больных множественной миеломой.

Доказана зависимость эффективности специфической терапии от степени исходной апоптотической активности опухолевых плазматических клеток у больных множественной миеломой: высокий уровень спонтанного апоптоза свидетельствует о неблагоприятном течении заболевания, а низкий - определяет положительный ответ на терапию.

Установлено, что показатель спонтанной апоптотической активности опухолевых клеток костного мозга больных множественной миеломой может быть использован в качестве прогностического критерия.

Показано, что в период манифестации и рецидива заболевания определяется высокая спонтанная продукция антиапоптотических цитокинов ИЛ-10 и ИЛ-8 и низкая продукция апоптогенного ФНОа мононуклеарными клетками костного мозга и сниженная экспрессия СБ95 на плазматических клетках, тогда как в период ремиссии определяется высокая продукция ФНОа и высокая экспрессия С095 на плазматических клетках при нормальной продукции ИЛ-1(3 и ИЛ-8.

Практическая значимость. Предложен метод определения апоптотической активности опухолевых клеток костного мозга больных множественной миеломой, по связыванию аннексина V с фосфатидилсерином цитоплазматической мембраны, который может использоваться в качестве критерия прогнозирования ответа на специфическое лечение. Исследование

апоптоза опухолевых клеток костного мозга больных множественной миеломой позволяет своевременно выявить химиорезистентность к проводимой терапии.

Мониторинг цитокинпродуцирующей функции клеток костного мозга и экспрессии СБ95 на плазматических клетках больных, достигших ремиссии, является методом раннего выявления рецидива.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Эффективность индуцированного специфической терапией апоптоза клеток опухолевого клона зависит от спонтанной апоптотической активности клеток: изначально более низкая апоптотическая активность плазматических клеток костного мозга у больных множественной миеломой является показателем эффективности специфической терапии и более благоприятного течения заболевания, и, напротив, высокая активность спонтанного апоптоза плазматических клеток прогностически неблагоприятным признаком. Определение исходного апоптоза плазматических клеток костного мозга у больных может быть использовано как предиктор эффективности специфической терапии.

2. Способность клеток костного мозга продуцировать цитокины ИЛ-1Р и ИЛ-8, подавляющие процесс апоптоза опухолевых клеток, существенно различается в зависимости от периода заболевания: значительно повышена у больных с впервые выявленной ММ и с рецидивом, тогда как у больных с ремиссией она не превышает значений нормы. Для больных, достигших ремиссии, характерна высокая продукция апоптогенного цитокина ФНОа.

3. У больных, ответивших на терапию полной клинико-гематологической ремиссией, наблюдается преобладание процесса апоптоза плазматических клеток над их пролиферацией, чему соответствует высокий уровень ФНОа и высокая экспрессия рецептора апоптоза Рак/СБ95.

Апробация и внедрение результатов исследования. Основные положения диссертационной работы представлены на научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (2004,

СПб), на XI и XIII Всероссийских научных Форумах с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2006 и 2009гг.), на Всероссийской научно - практической конференции с международным участием «Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов» (2008г, СПб); на совместной конференции Рабочей Группы ЕВМТ по Педиатрии и 3-ем Международном Симпозиуме по трансплантации гемопозтических стволовых клеток памяти P.M. Горбачевой (2009г, СПб).

В работу лаборатории иммунногематологии РосНИИГТ внедрен метод оценки апоптоза клеток по связыванию аннексина V с фосфатидилсерином цитоплазматической мембраны, с помощью проточной цитометрии. Разработанный метод прогнозирования эффективности терапии по оценке апоптотической активности клеток опухолевого клона костного мозга больных ММ внедрен в клиническую практику гематологической клиники института.

По результатам работы написана и издана новая медицинская технология «Прогностическое значение клинических признаков и некоторых лабораторных показателей при множественной миеломе», 2010 г.

Новые научные данные об апоптотической активности плазматических клеток больных ММ используются в учебном процессе на курсах повышения квалификации врачей-гематологов и врачей-лаборантов на кафедре клинической лабораторной диагностики СПб МАЛО.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, из них 5 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 134 страницах машинописного текста и состоит из введения, 5-и глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, который включает 141 источник. Диссертация иллюстрирована 19 рисунками и 22 таблицами.

Личный вклад автора. Автором лично выполнены все исследования по изучению апоптотической активности опухолевых клеток костного мозга, состоянию клеточного, цитокинового и гуморального звена иммунитета,

фагоцитоза у всех обследованных больных и доноров. Проведен клинико-лабораторный анализ, статистическая обработка и обобщение полученных результатов исследования.

ОБЪЕКТ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика обследованных больных. Под нашим наблюдением находились 65 больных ММ в возрасте от 39 до 79 лет, среди них - 18 мужчин и 47 женщин. Все они проходили обследование и лечение в гематологической клинике РосНИИГТ в период с 2006 по 2009 пг. Диагноз ММ подтверждался данными миелограммы (количество плазматических клеток при первичной диагностике более 10%), выявлением парапротеина в сыворотке крови и/или в моче (IgG >30г/л, ^А>20г/л или экскреции легких цепей с мочой более 1г/сут), гистологического исследования трепанобиоптатов подвздошной кости и рентгенографией костей скелета. Обязательным было изучение показателей периферической крови, содержания кальция в сыворотке крови и оценка функции почек.

Среди обследованных больных 27 - с впервые выявленной ММ, 22 - с верифицированным рецидивом и длительностью заболевания от 1 до 3 лет; 16 больных с подтвержденной ремиссией и длительностью заболевания от 1 года до 5 лет. По классу секретируемых миеломой патологических иммуноглобулинов у 62,6% (41) больных выявлен G-вариант, у 22% (14) - А-миелома, у 8,8% (6) - миелома Бенс-Джонса и у 6,6% (4) - несекретирующая миелома. В результате обследования у 72% (47) больных определена диффузно-очаговая форма ММ, множественно-очаговая - у 23% (15) и у 5% (3) -диффузная форма. С учетом критериев классификации Durie B.G.M. и Salmon S.E. у 33,3% (22) больных диагностирована IIA стадия ММ, у 2,5% (1) - ПБ, у 50,6% (33) - IIIA стадия и у 13,6% (9) - 1ПБ стадия.

Всем больным проводилась индукционная или противорецидивная терапия по программам ЦМВП и ВЦМП, МОССА, МП, М2, ВАД, ВМП и другим бортезомибсодержащим режимам, использовалась сопроводительная терапия, включавшая бисфосфонаты, компоненты крови, рекомбинантный

эритропоэтин и другие препараты. Оценка эффективности лечения больных ММ осуществлялась с использованием критериев, разработанных Европейской ассоциацией по трансплантации костного мозга (Blade J, 1998).

Группу сравнения составили 48 кадровых доноров крови и 22 донора костного мозга.

Материал исследования. В качестве материала исследования использовали МНК костного мозга, полученного путем стернальной пункции и стабилизированного антикоагулянтом (гепарин, 25 Ед/мл). МНК выделяли методом градиентного центрифугирования с использованием среды для разделения клеток Lympholyte-H («Cederlane» Canada). Также исследовали МНК и сыворотку периферической крови больных.

Для решения поставленных задач в работе были использованы следующие методы исследования.

Определение иммунофенотипипических характеристик МНК костного мозга и периферической крови проводили в двухпараметрическом анализе на проточном лазерном цитофлуориметре «Cytomics FC 500» («Beckman Coulter»,США) с использованием панели моноклональных антител («Beckman Coulter»,США), меченных флуоресцеинизотиоцинатом (FITC) и фикоэритрином (РЕ), к дифференцировочным антигенам, позволяющим идентифицировать следующие популяции клеток: CD3+ - зрелые Т-лимфоциты, CD3+/CD4+ - Т-хелперы, CD3+/CD8+ - цитотоксические Т-лимфоциты, CD3+/CD16+56+ и CD3+/DR+ - активированные Т- клетки, CD19+ и HLA-DR+ - В-лимфоциты, CD16+56+ - натуральные киллерные клетки, CD38+/CD138+ - плазматические клетки и CD95+ - Fas-антиген.

Исследование цитокинпродуцирующей способности МНК костного мозга проводили путем культивирования клеток в течение 24-х часов как без индуктора (спонтанная продукция), так и в его присутствии (стимулированная продукция). В качестве индуктора использовали пирогенал и ФГА. Содержание цитокинов ИЛ-ip, ИЛ-8 и ФНОа в супернатантах клеток определяли иммуноферментным методом (тест-системы «Протеиновый контур», С.Пб).

Содержание сывороточных иммуноглобулинов (Ig) классов G, А, М определяли стандартным турбидиметрическим методом с использованием автоматического биохимического анализатора «Микролаб 300».

Определяли уровни циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) средней и низкой молекулярной массы путем их осаждения в 5% и 7% растворе полиэтиленгликоля 6000.

Оценку функциональной активности нейтрофилов проводили методом Райта с использованием суточной культуры убитых клеток Staphylococcus aureus штамма Р-209. Определяли фагоцитарный индекс (ФИ%), фагоцитарное число (ФЧ) и индекс завершенности фагоцитоза (ИЗФ).

Апоптотическую активность опухолевых плазматических клеток определяли по выявлению одной из основных морфологических характеристик апоптоза: потере асимметричности клеточной мембраны за счет перестройки ее фосфолипидных компонентов. Появление фосфатидилсерина (ФС) на наружной поверхности плазматической мембраны клетки (рис.1) выявляют при связывании рекомбинантного, конъюгированного с флуорохромом протеина аннексина V (35-36 ГО) с отрицательно заряженными молекулами фосфолипида, что позволяет визуализировать клетки, находящиеся в раннем апоптозе. Поздняя стадия апоптоза или некроза клетки определяется по окрашиванию ДНК пропидием йодидом (ПИ), который проникает внутрь клетки через поврежденную мембрану.

Рис. 1 Связывание аннексина V- НТС с фосфатидилсерином мембраны клетки, находящейся в раннем и позднем апоптозе; проникновение пропидия йодида внутрь клетки и связывание его с ДНК в стадии позднего апоптоза и некроза.

Для определения содержания клеток, находящихся в апоптозе, использовали набор реагентов «AnnexinV Kit» (Beckman Coulter, США), учет результатов проводили на лазерном проточном цитофлуориметре.

Взвесь МНК костного мозга в концентрации 1млн/мл ресуспендировали в связывающем буфере. В стандартные пробирки помещали по 100 мкл клеточной суспензии. В первой пробирке клетки оставляли неокрашенными (негативный контроль); во вторую пробирку добавляли 5 мкл реагента annexin V - FITC; в третью - 10 мкл раствора пропидия йодида; в четвертую - 5 мкл реагента annexin V - FITC и 10 мкл раствора пропидия йодида, перемешивали. Инкубировали 15 мин при комнатной температуре (20 - 22°С) в темноте. После инкубации во все пробирки добавляли по 400 мкл связывающего буфера и проводили учет результатов.

/■-■■....... s

fiê-03é. -

j чу С ~

СО

,• • • -

ia1 да

SS Lin CD45-FITC

Рис. 2 Разделение популяции МНК костного мозга больных ММ в активной фазе (F, H - плазматические клетки; A, J - сохранные лимфоциты; G, I - гранулоциты)

Исследование начинали с анализа данных распределения клеточной популяции по каналам прямого и бокового светорассеяния (FSC/SSC), идентифицируя опухолевые ПК по специфическим характеристикам (размер, гранулярность), и под контролем экспрессии панлейкоцитарного антигена CD45 (рис 2).

Осуществляли цитометрию 4 видов клеток (рис. 3): неокрашенных (D3); окрашенных только аннексином V (D4); окрашенных только пропидием йодидом (D1); окрашенных аннексином V и пропидием йодидом (D2).

103"Ё 102— a ioi 4

к

10°-=

Рис. 3 Двухмерная точечная гистограмма, загейтирована по региону плазматических клеток: аннексии V / пропидий йодид

Статистический анализ полученных результатов исследований проводили с помощью персонального компьютера, используя пакет прикладных программ к "Microsoft Office Excel 2003" версия 7,0, применяя методы общей статистики (М, а, процентное распределение), корреляционного анализа, сравнения двух величин по t - тесту Стьюдента. Различия считали достоверными при уровне значимости р < 0,05 (Гублер Е.В., Генкин А.А., 1973).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клеточный, гуморальный иммунитет и фагоцитоз у больных ММ

При исследовании субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови (табл. 1) установлено, что относительное содержание CD3+ клеток у всех пациентов находится в пределах нормальных значений. Соотношение основных иммунорегуляторных фракций нарушено за счет снижения CD4+ и повышения CD8+ клеток, в результате чего ИРИ (CD47CD8+) инвертирован и составил менее 1,2. Повышено содержание активированных Т-клеток CD3+/DR+ и CD3+/CD16+56+. У всех обследованных больных ММ снижено содержание В-лимфоцитов CD19+, HLA-DR+ более чем в 2 раза, по сравнению с контролем. Также у всех больных повышено содержание NK-клеток CD16+56"1", при этом в большей степени - у больных, достигших ремиссии.

D1 0.4% некроз 0.3% Поздний апоптоз/ некроз

90.4% D4 Ранний 8.8% • апоптоз

.......itfi.......i'o1 .......i'o=.......103

Annexin pos

Таблица 1

Субпопуляционный состав МНК периферической крови больных ММ

Иммуно фенотип лимфоцитов Обследованные группы

Контроль ная группа Впервые выявленная ММ(1) Рецидив ММ (2) Ремиссия ММ (3) Р 1-2 Р 1-3 Р 2-3

соз+ 68,4 ±1,14 62,9 ± 7,80 74,2 ± 2,50 70,9 ±6,17 - - -

С03+/С04+ 44,4 ± 1,22 25,5 ± 5,04* 30,5 ± 2,01* 29,2 ± 3,40* - - -

СБЗ+/С08+ 23,0 ± 1,27 30,9 ± 1,80* 41,5 ± 2,94* 42,2 ± 3,24* ** ** -

ИРИ 1,93 ±0,15 0,81 ± 0,15* 0,7 ± 0,28* 0,69 ± 0,16* - - -

СБ19+ 13,2 ±0,90 4,67 ± 1,37* 2,86 ± 0,65* 3,31 ± 1,35* - - -

НЬАШ+ 12,2 + 0,97 5,93 ± 1,65* 2,9 ± 0,56* 5,7 ± 2,31* - - -

СБ16+56+ 13,1 ±1,22 17,4 + 2,48* 17,6 ± 2,19* 23,2 ±6,28* - - -

СОЗ+/СО(16+56)+ 4,26 ±0,66 10,2 ± 1,58* 7,48 ± 0,68* 5,22 ±0,81 - ** -

1,91 ±0,54 7,6 ± 2,75* 11,3 ±2,61* 5,71 ± 2,30* **

Примечание: * - различия достоверны между больными и контрольной группой, р < 0,05

** - различия достоверны между группами больных, р < 0,05

Таблица 2

Субпопуляционный состав МНК костного мозга больных ММ

Иммуно фенотип лимфоцитов Обследованные группы

Контроль ная группа Впервые выявленная ММ(1) Рецидив ММ (2) Ремиссия ММ (3) Р 1-2 р 1-3 Р 2-3

СОЗ+ 37,9 ±2,53 65,5 ± 6,85* 73,5 ±3,68* 66,1 ±4,55* - - -

С03+/С04+ 21,3 ± 1,1 33,4 ± 3,75* 29,3 ± 2,33* 24,2 ± 2,67 - ** -

С03+/С08+ 19,6 ±1,37 29,6 ± 2,63* 45,3 ±3,38* 36,7 ±4,10* ** - -

СШ9+ 13,9 ± 1,03 5,38 ± 0,97* 7,2 ± 1,33* 9,34 ± 2,47 - - -

HLA-DR+ 14,4 ±0,61 5,54 ± 1,19* 8,9 ± 1,22* 10,1 ±2,58 - ** -

СБ16+56+ 8,7 ±1,17 15,7 ± 2,75* 15,1 ± 1,70* 15,0 ±2,49* - - -

СОЗ+/СО(16+56)+ 3,5 ± 1,3 7,93 ± 1,15* 13,0 ± 1,44* 8,2 ± 1,47* ** - **

СОЗ+/ОЯ+ 1,3 ±1,1 4,01 ± 1,54* 5,31 ± 1,18* 5,8 ± 2,03* - -

Примечание: * - различия достоверны между больными и контрольной группой, р < 0,05 ** - различия достоверны между группами больных, р < 0,05

Исследование субпопуляций МНК костного мозга выявило следующие изменения (табл. 2): значительно повышено содержание СОЗ+, СБЗ+/СВ8+, активированных Т-клеток СОЗ+/СБ16+56+ и СБЗ+ЛЖ+ у всех пациентов; увеличена популяция СОЗ+/СБ4+ клеток только у больных с активной фазой заболевания. У этих же пациентов снижено содержание В-лимфоцитов СБ19+, НЬА-БК+ в 2 и более раза, тогда как у больных в ремиссии количество этих

лимфоцитов нормализуется. У всех больных в равной степени повышено содержание ИК-клеток.

Исследование гуморального звена иммунитета показало, что у всех больных содержание нормальных иммуноглобулинов резко снижено (рис.4), при высоком уровне моноклонального иммуноглобулина. Более значительное подавление продукции иммуноглобулинов определено у больных с впервые выявленной ММ и с рецидивом. У больных с ремиссией отмечается тенденция к повышению содержания иммуноглобулинов всех классов, но по-прежнему их уровень не достигает нормальных значений.

..Л

0 корма

и впервые выявленная N □ рецидив ММ ЕЯ ремиссия

В

гни. |

Рис. 4 Содержание сывороточных иммуноглобулинов у больных ММ

Исследование содержания циркулирующих иммунных комплексов выявило повышение уровня как среднемолекулярных, так и низкомолекулярных комплексов у больных с активной фазой заболевания (рис. 5 и 6). В ремиссии содержание ЦИК не превышало контрольных значений.

Рис. 5 Содержание среднемолекулярных Рис. 6 Содержание низкомолекулярных

иммунных комплексов иммунных комплексов

Исследование фагоцитарной активности нейтрофилов у больных выявило

изменение всех изученных показателей, характеризующих процесс фагоцитоза

на этапах его развития. У пациентов с активной фазой ММ практически в 2 раза снижено количество фагоцитирующих нейтрофилов (рис.7), угнетена их поглотительная и переваривающая способность, что свидетельствует о незавершенности фагоцитоза - ИЗФ менее 1 (рис. 8). У больных с ремиссией показатели фагоцитарной активности нейтрофилов значительно первышают показатели больных в активной фазе заболевания.

Рис. 7 Показатели фагоцитарного Рис. 8 Показатели поглотительной и

индекса у больных ММ переваривающей способности

нейтрофилов у больных ММ

Известно, что выведение ЦИК из огранизма обеспечивают фагоцитарные клетки, но у больных в активной фазе функционально неполноценные фагоциты не справляются с элиминацией резко повышенного количества ЦИК. В свою очередь, нарастание количества иммунных комплексов у этих больных угнетает процесс фагоцитоза.

Выявленные нарушения клеточного и гуморального иммунитета и, особенно, угнетение активности фагоцитарной системы у больных ММ обуславливают их подверженность инфекционным осложнениям.

Особенности апоптотической активности опухолевых клеток костного мозга больных множественной миеломой

Иммунофенотипирование МНК костного мозга показало, что относительное содержание ПК с фенотипом СБ38+/СВ138+ у больных с впервые выявленной ММ составило в среднем 63,6 ± 5,0% и с рецидивом - 52,5 ± 1,57%, что многократно превышает показатели нормы (от 0 до 1,8%). У

больных, достигших ремиссии, содержание СВ38+/СВ138+ клеток в среднем составило 1,7 ± 0,28% (рис.9).

Рис.9 Относительное содержание ПК с фенотипом СП38~/СТ) 1 в костном мозге больных ММ

При исследовании апоптотической активности опухолевых ПК установлено, что спонтанный апоптоз у больных с впервые выявленной ММ в среднем составил 25,2 ± 14,6%, при этом индивидуальные показатели апоптотической активности у больных внутри группы значительно различались - от 7,8 до 47,3%.

При детальном рассмотрении показателей спонтанного апоптоза у этих больных (рис. 10, а), мы отметили пациентов с низким и высоким уровнем апоптотической активности относительно среднего уровня в целом по группе. Так, у 41% (11) больных показатели апоптотической активности были значительно ниже среднего уровня и находились в интервале от 7,8 до 15,7%. Тогда как у 59% (16) больных спонтанный апоптоз ПК был значительно выше средней величины в группе, при диапазоне показателей от 29,3 до 47,3%.

У больных с рецидивом ММ (рис.10, б), также как и у больных с впервые выявленным заболеванием, показатели апоптотической активности значительно различались внутри группы: от 9,7 до 44,8%, при этом средний уровень апоптоза ПК был почти таким же и составил 22,1 ± 2,3%.

При анализе индивидуальных показателей апоптотической активности у больных с рецидивом была отмечена та же закономерность: у 36% (8) пациентов показатель апоптоза ПК был ниже среднего уровня по группе, при диапазоне

колебаний от 7,6 до 15,9%. Тогда как у 64% (14) пациентов эти показатели были значительно выше среднего уровня, варьируя от 32,7 до 44,8%.

а б

Рис. !0 Показатели спонтанной апоптотической активности плазматических клеток а - у больных с впервые выявленной ММ; б - с рецидивом

Учитывая однотипность распределения величин спонтанной апоптотической активности ПК у больных с активной фазой заболевания (впервые выявленной ММ и с рецидивом), мы разделили пациентов на две группы: с высоким и низким уровнем апоптоза, относительно среднего показателя по группе, и рассматривали динамику апоптотической активности в соответствии с этим распределением больных.

После проведенного курса специфического лечения, направленного на индукцию апоптоза опухолевых миеломных клеток, у больных с исходно низким показателем апоптоза выявлено его возрастание более чем в 3 раза, что составило в среднем 39,1 ± 2,1% (рис. 11). У этих больных отмечалась положительная клинико-гематологическая динамика, которая выражалась в снижении колическтва ПК в миелограмме до уровня менее 5%, содержания моноклонального иммуноглобулина в сыворотке крови и в моче более чем на 50% и 75% соответственно, и других признаках наступления полной или частичной ремиссии.

Напротив, у пациентов с высоким показателем апоптоза ни в одном из случаев не было отмечено его дальнейшего возрастания после проведенного курса терапии, апоптоз оставался практически на прежнем уровне - около 37% (рис. 11). У этих пациентов отсутствовал клинический эффект от специфической терапии, не было положительной клинико-гематологической динамики.

Полученные нами данные указывают на то, что эффективность апоптоза клеток опухолевого клона, индуцированного специфической терапией, зависит от исходной апоптотической активности клеток.

Рис. 11 Динамика апоптотической активности опухолевых ПК у больных ММ

Известно, что молекулярные механизмы лекарственной устойчивости многочисленны, и резистентность клетки может быть обусловлена ограничении накопления внутри опухолевой клетки лекарственного вещества, или отменой индуцированного терапией апоптоза посредством активации и накопления внутриклеточного белка Вс1-2, мутации гена р53, высокого уровеня СРБ и ИЛ-6. Такими способами опухолевые клетки могут прерывать путь реализации клеточного повреждения на ранних этапах развития апоптоза: клетка, получая сигнал к апоптозу, запускает программу по самоуничтожению, но внутриклеточные белки, блокирующие процесс апоптоза, приостанавливают его, тем самым защищая патологическую клетку от гибели. Вероятно, те клетки, которые уже вступили в спонтанный апоптоз, менее чувствительны к апоптозу, индуцированному терапией, поскольку запускающие рецепторы и внутриклеточные механизмы заблокированы, вследствии чего индуцированный апоптоз неэффективен. У больных с низким спонтанным апоптозом значительно большая часть клеток чувствительна к воздействию лечебных препаратов, что обеспечивает эффективность терапии и наступление ремиссии.

Иммунные механизмы апоптоза Одним из механизмов реализации апоптоза является рецепторный путь, который осуществляется при поступлении внешних сигналов к клетке через специфические рецепторы. Таким рецептором, при активации которого

запускается каскад биохимических реакций, приводящих к гибели клетки, является РайК/СБ95. Но для реализации процесса апоптоза через апоптогенный рецептор, необходимо взаимодействие с клетками, несущими Раэ-лиганд, либо с его растворимой формой, находящейся в свободном состоянии. Такими клетками, экспрессирующими Рав-лиганд, являются СВЗ+/СБ8+ и СБ 16+56+ клетки. Также они запускают апоптоз посредством выделения в межклеточное пространство вблизи патологической клетки-мишени белков перфорина и гранзима. Кроме того, эти клетки секретируют цитокин ФНОа, через рецептор которого передается сигнал апоптоза внутрь клетки-мишени, тем самым индуцируя цитокинопосредованный апоптоз в патологических клетках, и поэтому ФНОа является самым апоптогенным цитокином.

ИЛ-1Р и ИЛ-8, в отличие от ФНОа, являются антиапоптотическими цитокинами. Известно, что ИЛ-1Р блокирует апоптоз через 1СЕ-подобные протеазы, которые, взаимодействуя с цитокином, тормозят образования активных нуклеаз, благодаря чему клетка избегает апоптоза. ИЛ-8 повышает выживаемость опухолевых клеток за счет увеличения в них экспрессии Вс1-2, блокирующего процесс апоптоза.

Исследование содержания ПК (рис. 12), несущих маркер апоптоза -Ра8К/С095, показало, что у больных ММ с активной фазой до лечения только 21,8 - 27,4% ПК экспрессируют СБ95, что свидетельствует о сниженной готовности ПК к апоптозу. В то же время, в ремиссии отмечена высокая экспрессия СБ95 на ПК - около 80%.

В результате исследования продукции ФНОа выявлено (рис. 13), что его спонтанный уровень у больных как с впервые выявленной ММ, так и с рецидивом, сопоставим с показателями в контрольной группе. Тогда как у больных с ремиссией ММ спонтанная продукция ФНОа резко превышает показатели как нормы, так и других групп больных.

Индуцированная продукция цитокина у всех больных была ниже по сравнению с контролем.

|ИСРТ38+/СР95+

выявленная ММ ММ

Рис.12 Относительное содержание ПК с фенотипом Рис.13 Показатели спонтанной продукции ФНОа

С01387С095+ у больных ММ у больных ММ.

Исследование продукции антиапоптотических цитокинов (рис.14 и 15) показало, что у больных в активной фазе заболевания спонтанная продукция ИЛ-8 была повышенной, а ИЛ-1|3 - во много раз превышающей показатели как донорской группы, так и группы больных с ремиссией. При этом, в период ремиссии продукция этих цитокинов была сопоставима с контрольными значениями.

Индуцированная митогеном продукция этих цитокинов у всех больных была ниже нормы, что свидетельствует о снижении реактогенного потенциала клеток костного мозга больных ММ.

ЗООСН'

Рис.13 Показатели спонтанной Рис.14 Показатели спонтанной

продукции ИЛ-8 у больных ММ продукции ИЛ-1Р у больных ММ.

Так, в результате исследования цитокинпродуцирующей способности клеток костного мозга больных ММ показано, что в период манифестации и рецидива заболевания, когда имеется высокая плазмоклеточная инфильтрация косного мозга, выявлена высокая спонтанная продукция антиапоптотических цитокинов ИЛ-1(3 и ИЛ-8. Одними из основных продуцентов этих цитокинов

являются опухолевые плазматические клетки. У больных в ремиссии уровни этих цитокинов не превышали контрольные значения. И напротив, мы установили значительное увеличение продукции апоптогенного ФНОа в период ремиссии, тогда как у больных с впервые выявленной ММ и рецидивом спонтанная продукция данного цитокина не отличалась от нормы.

Исследование популяций цитотоксических/супрессорных Т-лимфоцитов С03+/С138+ и ЫК- клеток СБ1б+56+ костного мозга выявило повышение их содержания у всех больных ММ, при этом, у больных, достигших ремиссии, отмечено наибольшее увеличение количества СЭ16+56+ клеток по сравнению с нормой (табл. 2). Несмотря на выявленную активацию клеток противоопухолевого иммунитета у больных ММ в активной фазе, апоптоз опухолевых плазматических клеток подавлен, что, вероятно, связано с низкой экспрессией РайКУС095 на этих клетках и высокой продукцией антиапоптотических цитокинов опухолевыми клетками. Тогда как у больных в ремиссии апоптоз ПК реализуется через БаБ-рецепторный путь, активную продукцию апоптогенного ФНОа и белков перфорина и гранзима цитотоксическими Т-лимфоцитами и ИК-клетками костного мозга.

Таким образом, нами впервые проведено исследование апоптотической активности опухолевых клеток костного мозга больных ММ методом выявления раннего признака апоптоза - экстернализации фосфатидилсерина, а также иммунных механизмов реализации этого процесса. На активность процесса апоптоза влияет множество факторов, среди которых экспрессия СБ95 на плазматических клетках, продукция апоптогенного ФНОа и антиапоптотических цитокинов ИЛ-1 (3 и ИЛ-8, активность цитотоксических/супрессорных Т-лимфоцитов СБЗ+/СБ8+ и киллерных клеток СБ16+56+, вырабатывающие Бав-Ь, ФНОа, гранзимы и перфорины. При этом установлено, что эффективность специфической терапии зависит от величины спонтанного апоптоза опухолевых плазматических клеток, и показатель апоптотической активности может быть предиктором ответа на терапию и течения заболевания ММ.

22

Выводы

1. Апоптотическая акивность опухолевых клеток костного мозга у больных ММ позволяет с высокой степенью достоверности оценить эффективность проводимой терапии и прогнозировать течение заболевания.

2. Больные с впервые выявленной ММ и с рецидивом по апоптотической активности опухолевых ПК делятся на две группы: у 40% пациентов она ниже среднего уровня (от 7,8 до 15,7%), тогда как у остальных -значительно выше (от 29,3 до 47,3%). Установлено, что у больных с низким уровнем спонтанного апоптоза опухолевых клеток специфическая терапия эффективна, индуцированная апоптотическая активность повышается в 4 раза по сравнению с исходной. У больных с высоким показателем спонтанного апоптоза под воздействием индукционной терапии увеличение апоптотической активности отсутствует.

3. Высокая спонтанная продукция антиапоптотических цитокинов ИЛ-1Р и ИЛ-8 наблюдается только у больных с впервые выявленной ММ и с рецидивом, тогда как для больных с ремиссией характерна высокая продукция апоптогенного цитокина ФНОа. У преобладающего большинства больных ММ, достигших ремиссии, определяется выраженная экспрессия Баз-антигена на плазматических клетках, в то время как при впервые выявленном заболевании или рецидиве она в 3 раза ниже.

4. Особенностями клеточного иммунитета больных ММ являются изменение соотношения основных иммунорегуляторных субпопуляций МНК периферической крови и повышение содержания активированных Т-лимфоцитов СВЗ+ЛЖ+ и СБЗ+/СВ16+56+. Эти же клетки повышены и среди МНК костного мозга.

5. У всех больных ММ резко подавлен гуморальный иммунитет, что характеризуется снижением содержания В-лимфоцитов более чем в 3 раза по сравнению с нормой и количества нормальных иммуноглобулинов всех классов. Фагоцитарная активность нейтрофилов периферической крови у

больных в активной фазе заболевания значительно угнетена: в 2 раза снижен фагоцитарный индекс, подавлены поглотительная и переваривающая функции фагоцитов, процесс фагоцитоза является незавершенным.

Практические рекомендации

1. Исследование исходной апоптотической активности опухолевых клеток костного мозга больных множественной миеломой необходимо использовать в качестве критерия прогноза и оценки эффективности лечения.

2. Изучение характера апоптотической активности опухолевых клеток костного мозга следует проводить при поступлении больных в стационар и в процессе проведения специфической терапии с целью своевременного выявления резистентности.

3. Рекомендуется проводить мониторинг экспрессии Ра5-П/СБ95 на плазматических клетках и цитокинпродуцирующей функции мононуклеарных клеток костного мозга с целью раннего выявления рецидива.

Список публикаций

1. Чубукина Ж.В. Состояние клеточного иммунитета у больных множественной миеломой / Чубукина Ж.В., Бубнова JI.H., Бессмельцев С.С. // Сб. тез. докл. Российской научно-практической конференции"Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии"С.Пб. 2004. - С. 65.

2. Чубукина Ж.В. Состояние клеточного иммунитета у больных различными иммунохимическими вариантами множественной миеломы / Чубукина Ж.В., Бубнова JI.H., Бессмельцев С.С. // Медицинская Иммунология. -2006. - Т.7,№ 2 - 3. - С. 356.

3. Чубукина Ж.В. Особенности апоптоза клеток костного мозга у больных множественной миеломой / Чубукина Ж.В., Бубнова JI.H., Бессмельцев С.С.//Артериальнаягипертензия.-2008. -Т. 14,№ 1.-С. 118.

4. Чубукина Ж.В. Спонтанный и индуцированный апоптоз у больных множественной миеломой / Чубукина Ж.В., Бубнова JI.H., Бессмельцев С.С. // Медицинская иммунология. - 2009. - T.l 1, № 4-5. - С. 440.

5. Chubukina Zh. Prognostic value of apoptosis of tumour clone bone marrow cells in patients with multiple myeloma / Chubukina Zh., Bubnova L., Bessmeltsev S. // Cellular therapy and transplantation. - 2009. - Vol.2,

№ 5. - P. 56.

6. Чубукина Ж.В. Прогностическое значение апоптоза опухолевых клеток костного мозга больных множественной миеломой / Чубукина Ж.В., Бубнова Л.Н., Бессмельцев С.С. // Медико-биологические и социально-психологические проблемы безопасности в чрезвычайных ситуациях. -2009,-№5. -С. 49 -52.

7. Абдулкадыров К.М. Прогностическое значение клинических признаков и некоторых лабораторных показателей при множественной миеломе / Абдулкадыров К.М., Бессмельцев С.С., Чубукина Ж.В., Бубнова Л.Н. // Медицинская технология. - Санкт-Петербург.- 2010. - 23 с.

Подписано в печать 15.01.2010г. Формат 60x84/16 П.л. 1,5 Уч.-изд.л.1,5. Тир.ЮО экз. Отпечатано в типографии ООО «Турусел» 191186, Санкт-Петербург, ул. Миллионная д.1. Тел. 571-5474 Зак. № 13199 от 27.01.2010г.

Множественная миелома (ММ) - это лимфопролиферативное заболевание, морфологическим субстратом которого являются плазматические клетки различной степени зрелости, продуцирующие моноклональный иммуноглобулин. Значительная часть симптомов данного заболевания обусловлена пролиферацией опухолевых клеток в костном мозге с последующим вытеснением элементов нормального кроветворения (Alexanian R. et al., 1994; Бессмельцев С.С. и соавт., 2007).

Активность патологического процесса обусловлена как биологией опухолевых плазматических клеток (ПК), так и их взаимоотношением с микроокружением (стромой костного мозга), клетками иммунной системы. Многообразие клинических проявлений ММ связано и с нарушениями цитокинового статуса. Показано, что цитокины, выполняющие функции медиаторов межклеточных взаимодействий и продуцируемые мононуклеарными (МНК) и самими опухолевыми клетками, контролируют опухолевый рост: одни - стимулируют остеокласты костного мозга, пролиферацию опухолевых клеток и угнетают процесс их апоптоза (программированной клеточной гибели), тогда как другие - ингибируют рост патологических клеток, индуцируя в них процессы апоптоза, и стимулируют цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ) и естественные киллерные клетки (NK-клетки) противоопухолевого иммунитета (Кетлинский С.А., 2004; Richardson P.G. et al., 2004). Это показывает, что взаимоотношения «опухоль-иммунная сиситема» многогранны и сложны и далеко не на все вопросы есть ответы.

Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в терапии ММ, заболевание до сих пор остается неизлечимым. Отсутствуют точные прогностические факторы, способные предопределить характер течения и выживаемость больных. Это обстоятельство диктует необходимость поиска новых критериев прогноза наряду с известными (уровень содержания (32-м,

ЛДГ, ИЛ-6, хромосомные аберрации и др.), которые позволили бы уже на первом этапе диагностики прогнозировать течение ММ с целью определения терапевтической тактики (Бессмельцев С.С. и соавт., 2009).

Любой вид специфической терапии зачастую ведет к развитию резистентности, представляющей собой невосприимчивость опухолевых клеток к целому ряду препаратов, и активизации новых опухолевых клонов, скорость пролиферации которых опережает цитостатический эффект используемых препаратов. Исследования последних лет показали, что противоопухолевая терапия, независимо от конкретного механизма действия каждого из препаратов, реализуется путем индукции апоптоза патологических клеток. Полагают, что одним из важнейших механизмов устойчивости является подавление апоптоза. Изучение этого процесса, включая влияние цитокинов и экспрессии рецепторов апоптоза, позволит получить наиболее четкие представления относительно механизмов гибели опухолевых клеток и установить, могут ли быть использованы характеристики апоптотической активности опухолевых клеток на этапе первичной диагностики заболевания для выработки адекватной лечебной тактики.

Целыо настоящего исследования явилось изучение апоптоза клеток опухолевого клона костного мозга и иммунных механизмов его реализации у больных множественной миеломой и определение значения апоптотической активности для прогноза течения заболевания и оценки эффективности специфической терапии.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить апоптотическую активность плазматических клеток костного мозга у больных с впервые выявленной множественной миеломой, рецидивом заболевания и достигших ремиссии.

2. Исследовать функциональную способность клеток костного мозга больных множественной миеломой продуцировать цитокины, ингибирующие и стимулирующие апоптоз опухолевых клеток.

3. Оценить экспрессию апоптогенного рецептора Fas/CD95 на опухолевых плазматических клетках больных множественной миеломой.

4. Изучить состояние клеточного и гуморального иммунитета, фагоцитарную активность нейтрофилов у больных множественной миеломой.

5. Выявить наиболее значимые критерии прогноза течения заболевания и оценки эффективности терапии на основании установленных закономерностей.

Научная новизна исследования. Впервые на репрезентативном клиническом материале выявлены особенности апоптотической активности опухолевых клеток костного мозга больных множественной миеломой.

Доказана зависимость эффективности специфической терапии от степени исходной апоптотической активности опухолевых плазматических клеток у больных множественной миеломой: высокий уровень спонтанного апоптоза свидетельствует о неблагоприятном течении заболевания, а низкий — определяет положительный ответ на терапию.

Установлено, что показатель спонтанной апоптотической активности опухолевых клеток костного мозга больных множественной миеломой может быть использован в качестве прогностического критерия.

Показано, что в период манифестации и рецидива заболевания определяется высокая спонтанная продукция антиапоптотических цитокинов ИЛ-ip и ИЛ-8 и низкая продукция апоптогенного ФНОа мононуклеарными клетками костного мозга и сниженная экспрессия CD95 на плазматических клетках, тогда как в период ремиссии определяется высокая продукция

ФНОа и высокая экспрессия CD95 на плазматических клетках при нормальной продукции ИЛ-ip и ИЛ-8.

Практическая значимость. Предложен метод определения апоптотической активности опухолевых клеток костного мозга больных множественной миеломой, по связыванию аннексина V с фосфатидилсерином цитоплазматической мембраны, который может использоваться в качестве критерия прогнозирования ответа на специфическое лечение. Исследование апоптоза опухолевых клеток костного мозга больных множественной миеломой позволяет своевременно выявить химиорезистентность к проводимой терапии.

Мониторинг цитокинпродуцирующей функции клеток костного мозга и экспрессии CD95 на плазматических клетках больных, достигших ремиссии, является методом раннего выявления рецидива.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Эффективность индуцированного специфической терапией апоптоза клеток опухолевого клона зависит от спонтанной апоптотической активности клеток: изначально более низкая апоптотическая активность плазматических клеток костного мозга у больных множественной миеломой является показателем эффективности специфической терапии и более благоприятного течения заболевания, и, напротив, высокая активность спонтанного апоптоза плазматических клеток - прогностически неблагоприятным признаком. Определение исходного апоптоза плазматических клеток костного мозга у больных может быть использовано как предиктор эффективности специфической терапии.

2. Способность клеток костного мозга продуцировать цитокины ИЛ-ip и ИЛ-8, подавляющие процесс апоптоза опухолевых клеток, существенно различается в зависимости от периода заболевания: значительно повышена у больных с впервые выявленной ММ и с рецидивом, тогда как у больных с ремиссией она не превышает значений нормы. Для больных, достигших ремиссии, характерна высокая продукция апоптогенного цитокина ФНОа.

3. У больных, ответивших на терапию полной клинико-гематологической ремиссией, наблюдается преобладание процесса апоптоза плазматических клеток над их пролиферацией, чему соответствует высокий уровень ФНОа и высокая экспрессия рецептора апоптоза Fas/CD95.

Апробация и внедрение результатов исследования. Основные положения диссертационной работы представлены на научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (2004, СПб), на XI и XIII Всероссийских научных Форумах с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2006 и 2009 гг), на Всероссийской научно - практической конференции с международным участием «Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов» (2008 г, СПб); на совместной конференции Рабочей Группы ЕВМТ по Педиатрии и 3-ем Международном Симпозиуме по трансплантации гемопоэтических стволовых клеток памяти P.M. Горбачевой (2009 г, СПб).

В работу лаборатории иммунногематологии РосНИИГТ внедрен метод оценки апоптоза клеток по связыванию аннексина V с фосфатидилсерином цитоплазматической мембраны, с помощью проточной цитометрии. Разработанный метод прогнозирования эффективности терапии по оценке апоптотической активности клеток опухолевого клона костного мозга больных ММ внедрен в клиническую практику гематологической клиники института.

По результатам работы написана и издана новая медицинская технология «Прогностическое значение клинических признаков и некоторых лабораторных показателей при множественной миеломе», 2010 г.

Новые научные данные об апоптотической активности плазматических клеток больных ММ используются в учебном процессе на курсах повышения квалификации врачей-гематологов и врачей-лаборантов на кафедре клинической лабораторной диагностики СПб МАЛО.

По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, из них 4 — в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Личный вклад автора. Автором лично выполнены все исследования по изучению апоптотической активности опухолевых клеток костного мозга, состоянию клеточного, цитокинового и гуморального звена иммунитета, фагоцитоза у всех обследованных больных и доноров. Проведен клинико-лабораторный анализ, статистическая обработка и обобщение полученных результатов исследования.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 134 страницах машинописного текста и состоит из введения, 5-и глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, который включает 154 источник. Диссертация иллюстрирована 18 рисунками и 21 таблицей.

ВЫВОДЫ

1. Апоптотическая акивность опухолевых клеток костного мозга у больных ММ позволяет с высокой степенью достоверности оценить эффективность проводимой терапии и прогнозировать течение заболевания.

2. Больные с впервые выявленной ММ и с рецидивом по апоптотической активности опухолевых ПК делятся на две группы: у 40% пациентов она ниже среднего уровня (от 7,8 до 15,7%), тогда как у остальных -значительно выше (от 29,3 до 47,3%). Установлено, что у больных с низким уровнем спонтанного апоптоза опухолевых клеток специфическая терапия эффективна, индуцированная апоптотическая активность повышается в 4 раза по сравнению с исходной. У больных с высоким показателем спонтанного апоптоза под воздействием индукционной терапии увеличение апоптотической активности отсутствует.

3. Высокая спонтанная продукция антиапоптотических цитокинов ИЛ-1(3 и ИЛ-8 наблюдается только у больных с впервые выявленной ММ и с рецидивом, тогда как для больных с ремиссией характерна высокая продукция апоптогенного цитокина ФНОа. У преобладающего большинства больных ММ, достигших ремиссии, определяется выраженная экспрессия Fas-антигена на плазматических клетках, в то время как при впервые выявленном заболевании или рецидиве она в 3 раза ниже.

4. Особенностями клеточного иммунитета больных ММ являются изменение соотношения основных иммунорегуляторных субпопуляций МНК периферической крови и повышение содержания активированных Т-лимфоцитов CD3+/DR+ и CD3+/CD16+56+. Эти же клетки повышены и среди МНК костного мозга.

5. У всех больных ММ резко подавлен гуморальный иммунитет, что характеризуется снижением содержания В-лимфоцитов более чем в 3 раза по сравнению с нормой и количества нормальных иммуноглобулинов всех классов. Фагоцитарная активность нейтрофилов периферической крови у больных в активной фазе заболевания значительно угнетена: в 2 раза снижен фагоцитарный индекс, подавлены поглотительная и переваривающая функции фагоцитов, процесс фагоцитоза является незавершенным.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Исследование исходной апоптотической активности опухолевых клеток костного мозга больных множественной миеломой необходимо использовать в качестве критерия прогноза и оценки эффективности лечения.

2. Изучение характера апоптотической активности опухолевых клеток костного мозга следует проводить при поступлении больных в стационар и в процессе проведения специфической терапии с целью своевременного выявления резистентности.

3. Рекомендуется проводить мониторинг экспрессии Fas-R/CD95 на плазматических клетках и цитокинпродуцирующей функции мононуклеарных клеток костного мозга с целью раннего выявления рецидива.