Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Экспрессия интерлейкина-6 человека и его вирусного гомолога при неходжкинских лимфомах и множественной миеломе

На правах рукописи

иазоет27о

ШИРОКОВ Дмитрий Алексеевич

I

ЭКСПРЕССИЯ ИНТЕРЛЕЙКИНА-6 ЧЕЛОВЕКА И ЕГО ВИРУСНОГО ГОМОЛОГА ПРИ НЕХОДЖКИНСКИХ ЛИМФОМАХ И МНОЖЕСТВЕННОЙ МИЕЛОМЕ

(14.00.14 - онкология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2006 г.

003067270

Работа выполнена в ГУ Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина РАМН (директор - академик М.И.Давыдов).

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Н.Н.Тупицын

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук H.H. Мазуренко член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор И.В.Поддубная

Ведущая организация:

ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России»

Государственный научный центр «Институт иммунологии федерального медико-биологического агентства»

на заседании диссертационного совета (К.001.017.01) при ГУ Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 24).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина РАМН

Защита диссертации состоится < AJLQ 200 ^-г.

Автореферат разослан <3i » 200(э \

г.

доктор медицинских наук

Учёный секретарь диссертационного совета

Ю.А.Барсуков

Общая характеристика работы

Актуальность темы исследования.

Регуляторная роль интерлейкина-6 человека (ЫЬ-6) в стимуляции роста опухолевых клеток и развитии их резистентности к химио- и гормонотерапии при множественной миеломе и неходжкинских лимфомах убедительно доказана. Установление этого факта послужило толчком к развитию нового направления фундаментальных научных исследований в области активации трансдуцерного рецептора §р130 и опосредованной им передачи сигнала в нормальных и опухолевых клетках. Прикладным аспектом работы явилось обоснование возможности проведения антицитокиновой (анти-ЫЬ-6) терапии в лечении множественной миеломы с помощью моноклональных антител. В нашей стране такие исследования проведены в ГУ Российском онкологическом научном центре имени Н.Н.Блохина РАМН. Достигаемый положительный эффект был, как правило, транзиторным, что обусловлено сходством биологической активности шести цитокинов, передающих сигнал через молекулу §р130. По этой причине в качестве перспективной мишени антицитокинотерапии рассматривается §р130, проводится исследование активации рецептора при неходжкинских лимфомах.

Проблема осложняется тем, что открыт новый цитокин семейства интерлейкина-6, который способен воздействовать непосредственно на gpl30 и вызывать его гомодимеризацию на нормальных и опухолевых клетках. Это вирусный интерлейкин-6 - цитокин вирусного происхождения, закодированный в геноме герпесвируса человека 8 типа (ННУ-8). Вирусный интерлейкин-6 имеет 24% гомологии по аминокислотному составу с интерлейкином-6 человека, способен действовать на клетки человека и воспроизводить практически те же самые эффекты, что и его гомолог человеческого происхождения.

ННУ-8 является последним из открытых (1994 год) онкогенных вирусов человека. Этиологическая роль этого вируса наиболее хорошо известна при саркоме Капоши и мультицентрической болезни Кастельмана.

Полную ассоциацию с данным вирусом имеет и крайне редкая нозологическая форма периферических крупноклеточных неходжкинских лимфом - первичная лимфома серозных полостей, описанная лишь в последние годы. Важную патогенетическую роль в стимуляции роста этих опухолей играет продуцируемый инфицированными клетками вирусный интерлейкин-6. Ассоциация с HHV-8 документирована не только для первичной лимфомы серозных полостей, но и для иных В-крупноклеточных лимфом, фолликулярных лимфом, мальтом, что не исключает патогенетической роли вирусного интерлейкина-6 в этих случаях.

Особую роль в установлении ассоциации HHV-8 с опухолями иммунной системы занимают исследования в области множественной миеломы. Несмотря на то, что первая работа, подтвердившая HHV-8-инфекцию клеток костного мозга у больных ММ, была опубликована 10 лет назад (Rettig et al, 1996) в журнале Science, полной ясности в данном вопросе нет до настоящего времени. Следовательно, остается неясной и роль вирусного интерлейкина-6 при множественной миеломе. А это очень важно как с точки зрения фундаментальных знаний, так и с точки зрения установления причин возможных неудач анти-ЫЬ-6 терапии множественной миеломы.

С целью поиска ответов на эти вопросы нами в настоящей работе проведено исследование экспрессии интерлейкинов-6 человеческого и вирусного происхождения при различных вариантах периферических неходжкинских лимфом и лимфом из клеток-предшественников. Детальный молекулярный анализ опухолевых клеток в этих случаях проведен методами иммуногистохимии и проточной цитометрии. Экспрессия человеческого и вирусного интерлейкинов-6 при множественной миеломе и первичной лимфоме серозных полостей изучена с подтверждением наличия генов HHV-8 (Kl, К2 и ORF26) в опухолевой ткани.

Целью настоящей работы явилось изучение экспрессии интерлейкина-6 человека (ЫЬ-6) и его вирусного гомолога (у1Ь-6) опухолевыми клетками при различных иммуноморфологических вариантах неходжкинских лимфом, а также при множественной миеломе.

Задачи исследования.

1. Изучить экспрессию мРНК интерлейкина-6 человека и вирусного интерлейкина-6 в клетках неходжкинских лимфом методом ЯТ-РСЯ.

2. Изучить экспрессию мРНК интерлейкина-6 человека и вирусного интерлейкина-6 клетками костного мозга больных множественной миеломой.

3. Охарактеризовать иммунофенотип клеток неходжкинских лимфом, экспрессирующих интерлейкин-6 человека и вирусный интерлейкин-6.

4. Исследовать образцы костного мозга больных множественной миеломой на предмет наличия в них ДНК ННУ-8 по 3 генам-мишеням: К1, К2 и ОЫР26.

5. Изучить нуклеотидные последовательности гена вирусного интерлейкина-6 в случаях его экспрессии при множественной миеломе.

6. Охарактеризовать цитологически клетки костного мозга больных множественной миеломой при экспрессии интерлейкина-6 человека и вирусного интерлейкина-6.

Научная новизна.

В результате проведенных исследований установлен ряд новых научных фактов. Главным из них является установление экспрессии вирусного интерлейкина-6 клетками костного мозга больных множественной миеломой в 20% случаев. Впервые показано, что в части случаев экспрессии вирусного интерлейкина-6 при множественной миеломе структурные гены ННУ-8 в клетках костного мозга отсутствуют. Выявлены случайная

нуклеотидная замена и 2 типа повторяющихся нуклеотидных замен в последовательностях вирусного интерлейкина-6, выделенных из клеток костного мозга больных множественной миеломой. Одна из этих замен приводит к изменению аминокислотного состава вирокина - замене аспарагиновой кислоты на аспарагин в положении 192, что потенциально может сказаться на особенностях третичной структуры и биологической активности вирусного интерлейкина-6 при множественной миеломе. Установлено, что вирусный интерлейкин-6 в 30% случаев его обнаружения экспрессируется опухолевой тканью НХЛ и ММ при отсутствии экспрессии человеческого гомолога. Впервые обнаружена экспрессия вирусного интерлейкина-6 при лимфомах из Т-клеток-предшественников. Напротив, патогенетическая роль вирусного интерлейкина-6 при периферических В-клеточных лимфомах, исходя из результатов наших исследований, представляется маловероятной, так как он обнаружен лишь в 3% случаев (1 из 33, фолликулярная лимфома). Подтверждены экспрессия вирусного интерлейкина-6 и наличие генома ННУ-8 в клетках первичной лимфомы серозных полостей в первом описанном в России ВИЧ-негативном случае.

Практическая значимость.

Практическая значимость работы складывается из 2 аспектов: диагностического и в перспективе иммунотерапевтического. Диагностический аспект заключается в разработке и внедрении в клиническую практику молекулярной диагностики периферичеких В-клеточных неходжкинских лимфом (в первую очередь, первичной лимфомы серозных полостей) и лимфом из Т-клеточных предшественников, основанной на установлении экспрессии опухолевой тканью вирусного интерлейкина-6. Вирусный интерлейкин-6 имеет уникальные антигенные детерминанты, что делает его потенциальной мишенью иммунотерапии в случаях экспрессии вирокина при множественной миеломе и неходжкинских лимфомах. При наличии генов ННУ-8: К1 и ОЯР-26 в случаях

множественной миеломы и первичной лимфомы серозных полостей, кодируемые ими белки также могут явиться потенциальной мишенью иммунотерапии.

Апробация диссертации.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены 20 октября 2006 года на совместной научной конференции с участием лаборатории иммунологии гемопоэза, лаборатории клинической иммунологии опухолей, отделения химиотерапии гемобластозов НИИ клинической онкологии ГУ РОНЦ РАМН им. Н.Н.Блохина, лаборатории иммунологии онкогенных вирусов и лаборатории вирусного канцерогенеза НИИ канцерогенеза ГУ РОНЦ РАМН им. Н.Н.Блохина.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 6 научных работ.

Объём и структура диссертации.

Диссертация изложена на 141 странице, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, заключения, выводов и библиографического указателя. Работа иллюстрирована 24 таблицами и 43 рисунками. Библиографический указатель включает 7 отечественных и 130 заруб- ясных источников.

Содержание работы.

Материалы и методы исследования.

В настоящее исследование включен материал от 74 больных множественной миеломой и различными вариантами неходжкинских лимфом. Распределение больных по нозологиям представлено в таблице 1. Клинический материал в большинстве случаев был представлен: в случае больных множественной миеломой клетками костного мозга и в случае больных неходжкинскими лимфомами биопсией лимфоузла, за исключением больных: ИАК (клетки перикардиальной полости), ЮАВ (бласты крови) и ПНГ (биопсия средостения).

Таблица 1. Характеристика больных.

Диагноз Количество

абсолют. %

Множественная миелома 38 51,3

Фолликулярная лимфома 12 16,2

Диффузная В-крупноклеточная лимфома 10 13,5

Лимфома Бёркитта 2 2,7

Лимфома маргинальной зоны 1 1,4

Кл-1 Крупноклеточная анапластическая лимфома 4 5,3

Лимфома из Т-предшественников 3 4

Лимфома из малых лимфоцитов/ХЛЛ 1 1,4

Первичная медиастинальная В-крупноклеточная лимфома 1 1,4

Периферическая Т-клеточная лимфома 1 1,4

Первичная лимфома серозных полостей 1 ' 1,4

Всего 74 100

При реакциях иммунофлуоресценции препараты просматривали на люминисцентном микроскопе Axioplan-2 (Германия) при увеличении х400. Работа с культурами клеток проводилась в боксе с ламинарным потоком воздуха БОВ-001-АМС (вариант СЛШ). Использовали одноразовую стерильную пластиковую посуду (Corning Costar). Анализ культур клеток проводился с использованием инвертированного микроскопа Carl Zeiss.

Подсчёт клеток производился в камере Горяева. Для электрофореза использовалась горизонтальная камера Хеликон. Секвенирование ДНК проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3100-Avant.

В работе были использованы следующие методы:

Выделение ДНК.

К клеточной суспензии добавляли 0,1 % SDS по объёму и проводили разрушение мембран клеток троекратным замораживанием/ размораживанием. После этого добавляли равный объём фенола, встряхивали содержимое пробирки на вортексе и откручивали при 13400 об./мин. на центрифуге в течение 10 мин. Далее отбирали из пробирки верхнюю фазу и переносили её в пробирку с равным объёмом смеси фенол/ хлороформ/ изоамиловый спирт (смешанных в соотношении 25:24:1), интенсивно встряхивали и центрифугировали при 13400 об./мин. в течение 10 мин. Отбирали верхнюю фазу, добавляли к ней равный объём хлороформа и снова центрифугировали при 13400 об./мин. 10 мин. Далее отбирали верхнюю фазу, переносили её в новую пробирку и добавляли 10% по объёму ЗМ ацетата натрия (рН 5,0) и равный объём изопропилового спирта. После пробирку ставили на ночь в морозильную камеру на -20°С, далее откручивали на центрифуге при 13400 об./мин. 10 мин. Осадок высушивали, а после ресу пендировали деионизованной водой.

Выделение РНК.

К клеточной суспензии добавляли гуанидин-тиоционатный буфер (4М гуанидин тиоцианат, 25 тМ натрия цитрат рН 7.0, 0.5% натрия N-лауроилсаркозидат, 0.1% Р-меркаптоэтанол), держали 10 мин. при комнатной температуре, далее добавляли 10% по объёму ЗМ ацетата натрия (рН 5,0), интенсивно перемешивали содержимое пробирки, добавляли равный объём фенола, 5 мин. держали при комнатной температуре, далее добавляли смесь хлороформа с йзоамиловым спиртом (24:1), интенсивно перемешивали и

центрифугировали при 13400 об./мин. в течение 10 мин. Далее отбирали верхнюю фазу, переносили её в новую пробирку и повторяли экстракцию с фенолом и хлороформом. После этого отбирали водную фазу, добавляли 2,5 объёма этилового спирта и ставили на ночь в морозильную камеру на -20°С. Далее откручивали от спирта на центрифуге при 13400 об./мин. в течение 10 мин, осадок высушивали и ресуспендировали деионизованной водой.

Ведение культур эукариотических клеток.

В работе использована культура клеток множественной миеломы RPMI 8226. Линии клеток первичной лимфомы серозных полостей (BCBL-1 и ВСЗ), содержащих геном HHV-8, были любезно предоставлены профессором В.Э.Гурцевичем (завлаб, вирусного канцерогенеза НИИ канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН). Данные линии не являются H1V-инфицированными. Культуры клеток RPMI 8226, BCBL-1, ВСЗ культивировали во флаконах (25 см2 и 75 см2) в С02-инкубаторе при 37°С и 5% С02. Для ведения этих культур клеток использовали культуральную среду RPMI 1640 с добавлением 10% телячьей эмбриональной сыворотки и антибиотика (гентамицин). Рассевали клетки каждые 3-4 дня.

Полимеразная цепная реакция.

Полимеразная цепная реакция проводилась на амплификаторе «Терцик» (Россия). В случае каждой пары праймеров использовалась индивидуальная программа. Для амплификации использовали следующие пары праймеров: 1) vIL-6 forward: 5'-

CAGCCATATGATGTGCTGGTTCAAGTTGTG-3', vIL-6 reverse: 5'-AGCACTCGAGTTACTTATCGTGGACGTCAG-3'; Условия амплификации: денатурация 94°C 30 сек., отжиг праймеров 58 °С 45 сек, элонгация 72°С 45 сек. Цикл повторялся 35 раз. Продукт амплификации равнялся 615 п.о. 2) ORF26 forward: 5 '-AGCCGAAAGGАТТССАССАТ-3', ORF26 reverse: 5'-CTGGACGTAGACAACACGGA-3'; Условия амплификации: денатурация 94°С 30 сек., отжиг праймеров 55°С 30 сек, элонгация 72°С 30 сек. Цикл повторялся 35 раз. Продукт амплификации равнялся 233 п.о. 3) K1 forward:

5'-GACCTTGTTGGACATCCCGTACAATC-3\ K1 reverse: 5'-AGGCCATGCTGTAAGTAGCACGGTT-3' Условия амплификации: денатурация 94°C 1 мин., отжиг праймеров 55 °С 1 мин., элонгация 72°С 2 мин. Цикл повторялся 35 раз Продукт амплификации равнялся 1073 п.о.; 4) GAPDH forward 5'-AGTCCAGTGAGCTTCCCGTTCAGC-3', GAPDH reverse 5 '-TGGTATCGTGGAAGGACTCATGAC-3' Условия амплификации: денатурация 94°С 1 мин., отжиг праймеров 60°С 1 мин., элонгация 72°С 1 мин. Цикл повторяли 40 раз. Продукт амплификации равнялся 190 п.о. 5) hIL-6 forward: 5' -CCTGAACCTTCCAAAGATGG-3', hIL-6 reverse: 5'-CATTTGCCGAAGAGCCCTCA-3'. Условия амплификации: денатурация 94°C 45 сек., отжиг праймеров 60°С, элонгация 72°С 30 сек. Цикл повторяли 30 раз. Продукт амплификации равнялся 370 п.о.; 6) p-globin forward: 5'-CTGGGCAGGCTGCTGGTG-3(3-globin reverse: 5'-

GCTTGTCACAGTGCAGCTC-3'. Условия амплификации: денатурация 94°C 45 сек., отжиг праймеров 60°С, элонгация 72°С 30 сек. Цикл повторяли 30 раз. Продукт амплификации равнялся 210 п.о. Для разделения ПЦР-амплифицированных фрагментов использовали 1,7% легкоплавкую агарозу на 1х ТВЕ-буфере, содержащую бромистый этидий.

Обратная транскрипция.

Реакцию проводили стандартно в объёме 40 мкл. К 20 мкл РНК добавляли 2 мкл (0,5 мкг) политимидинового олигонуклеотида (18 звеньев). После этого ставили пробирку в термостат на +70°С на 5 мин. Далее добавляли 8 мкл 5х буфера для обратной транскрипции, 4 мкл (1 мМ) смеси дезоксирибонуклеотидов, 4 мкл (20 ед.) ингибитора рибонуклеазы и ставили пробирку в термостат на +37°С на 5 мин. После чего добавляли 2 мкл (400 ед.) фермента MMulV обратной транскриптазы и ставили пробирку в термостат на +42°С на 1 час. Фермент инактивировали 10 мин. при +70°С.

Серологический анализ.

Плевральная жидкость, полученная от больного, была протестирована в реакции непрямой иммунофлуоресценции [Moore et al., 1996] на наличие антител к белкам двух герпесвирусов: 1) латентному ядерному белку LANA HHV-8, и 2) капсидному (два белка VCA - BNRF; р143 и BcLFl, р150) и раннему (две субъединицы белка ЕА - R: BORF2+BaRFl, р85 и D: BMRF, р54) белкам EBV. В качестве тест-клеток, содержащих вирус-специфический антиген LANA-1, использовали перевиваемую клеточную линию BCBL-1 (полученную от Dr. A.Gessain, Pasteur Institute, Paris, France), инфицированную только HHV-8 и свободную от EBV. Присутствие в плевральной жидкости антител к VCA EBV определяли на индуцированной ТРА клеточной линии P3HR-I, являющейся ¡слоновым вариантом линии P3J лимфомы Бёркитта. В качестве положительного контроля для выявления ЕА EBV использовали клеточную линию RAJI, индуцированную совместно ТРА и n-бутиратом натрия. Все нюансы постановки реакции отражены в литературе [Stepina et al., 1976]. Присутствие антител к LANA HHV-8 (класса IgG) в исследуемом плевральном экссудате определяли по специфическому пунктирному внутриядерному ярко-зелёному свечению на фоне негативных клеток, окрашенных в красновато-коричневый цвет. Плевральный экссудат больного считается серопозитивным к HHV-8, если в разведении 1:160 обнаруживают характерное свечение [Gao et al., 1996]. Для подтверждения специфичности проводимых реакций одновременно ставили несколько контролей: в качестве позитивного использовали сыворотки с заведомо высокими титрами антител к соответствующим вирус-специфическим антигенам. При негативном контроле испытуемую сыворотку заменяли раствором PBS. Контакт сыворотки и плеврального экссудата с фиксированными клетками был 60 мин. при 37°С. Для визуализации антител использовали FITC-меченые иммуноглобулины против IgG (Н) человека.

Проточная цитофлуориметрия..

Для проточной цитометрии брали отмытые клетки, которые инкубировали с напрямую мечеными флуорохромами моноклональными антителами, разведёнными в PBS, содержащем 1% BSA и 0,02% NaN3 (PBS-BSA), в течение 30 минут при 4°С. После двойной промывки в PBS-BSA анализировали клетки на проточном цитометре FACScan (Becton Dickinson, Mountain View CA). Использовали моноклональные антитела против маркеров дифференцировки лейкоцитов: CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD10, CD13, CD19, CD20, CD33, CD34, CD38, CD61, CD64, CD138, HLA-DR, гликофорин A (Dako, Glostrup, Denmark), CD45. Для точной идентификации лимфомных клеток использовали тройное флуоресцентное окрашивание.

Непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание опухолевых срезов.

Замороженные срезы (толщина 4-6 мкм) помещали по три среза на поверхность обезжиренных предметных стекол. Срезы фиксировали в ацетоне при комнатной температуре в течение 4 секунд. Перед окраской антителами срезы фиксировали в ацетоне в течение 10 минут при температуре 4°С. Последующие этапы реакции проводили при комнатной температуре во влажной камере. Инкубировали срезы 10 минут в среде 199 рН 7,2-7,4. МКА наносили на 30 минут. Отмывали 10 минут в среде 199. На 30 минут наносили FITC-меченные Р(аЬ)2-фрагменты антисыворотки против глобулинов белой мыши. Отмывали 10 минут в среде 199. Клетки консервировали 50% глицерином на физг алогическом растворе. Срезы закрывали покровным стеклом и характеризовали антигенположительные клетки и структуры. При иммунологическом фенотипировании биопсийного материала опухолевой ткани по криостатным срезам нами использована панель МКА к следующим антигенам: CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD19, CD20, CD21, CD23, CD37, CD38, HLA-DR.

Цитологическое исследование отпечатков опухолевой ткани проведено в лаборатории цитологии (рук. проф. В.Н. Богатырев) вед. науч. сотрудником д.м.н. Т.Т. Кондратьевой.

Морфологическое и цитохимическое исследование пунктатов костного мозга проведено в лаборатории иммунологии гемопоэза (рук. проф. Н.Н.Тупицын) ведущим научным сотрудником д.м.н. профессором М.А.Френкель.

Иммунофенотипирование опухолевых клеток у больных проведено в лаборатории иммунологии гемопоэза (рук. проф. Н.Н.Тупицын) ведущим научным сотрудником к.м.н. E.H. Шолоховой (иммуногистохимия на свежезамороженных срезах) и старшим научным сотрудником к.м.н. Л.Ю. Андреевой (проточная цитометрия).

Гистологическое исследование лимфом проводилось в отделе патологической анатомии опухолей человека ГУ РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН (рук. проф. Н.Н.Петровичев) профессором, д.м.н. Н.А.Пробатовой и в.н.с. к.м.н. А.И.Павловской.

Компьютерная обработка данных проточной цитометрии проводилась на ПК с использованием программы MDI.

Секвенирование ДНК проводили в Межинститутском Центре коллективного пользования «ГЕНОМ» ИМБ РАН (http://www.genome-centre.narod.ru/), организованном при поддержке РФФИ (грант №00-0455000).

Результаты исследования и обсуждение.

Для оценки экспрессии мРНК генов hIL-б и vIL-б при неходжкинских

лимфомах и множественной миеломе нами были подобраны пары праймеров к участкам нуклеотидной последовательности вирусного интерлейкина-6, имеющим невысокую степень гомологии с последовательностью гена hIL-6. Пары праймеров к vIL-б проверялись на мРНК, экстрагированной из клеточных линий BCBL-1 и ВС-3, несущих эписомы с геномом вируса герпеса человека 8 типа (HHV-8). Наилучший результат дала пара праймеров, подобранная к концам открытой рамки считывания гена vIL-6.

Последовательности генома ННУ-8 в клетках костного мозга больных множественной миеломой.

Для исследований по обнаружению ННУ-8 в клетках костного мозга больных множественной миеломой, нами были выбраны 3 гена-мишени: К1, СЖР26 и К2. Ген К1, кодирующий трансмембранный белок, предполагаемо участвует в трансформации клеток, является чрезвычайно вариабельным и играет, скорее всего, важнейшую роль в эволюции данного вируса. ОИР26, в свою очередь, кодирует большой капсидный белок вируса и, в отличии от К1, является консервативным геном. Наконец, уникальный ген К2, кодирующий вирусный интерлейкин-6 - гомолог интерлейкина-6 человека, принадлежит к группе вирусных генов, захваченных ННУ-8 в процессе своей эволюции из клеточного генома. Все 3 гена находятся на значительном расстоянии друг от друга в вирусном геноме: К2 расположен примерно в 17000 пар нуклеотидов от К1, а СЖР26, соответственно, примерно в 30000 пар нуклеотидов от К2.

Ген К2 (ген вирусного интерлейкина-6) был обнаружен нами в 8 образцах костного мозга, что составило 21% от общего количества пунктатов больных множественной миеломой. Сумма клеток плазмоцитарного ряда в костном мозге этих больных колебалась в пределах от 11,6 до 76,2%. Что интересно, у одного пациента наблюдался относительно высокий уровень плазмобластов - 4,8%.

Ген капсидного белка ОИР26 был обнаружен нами лишь у 4 больных из 38, что составляет 11% от всех случаев множествеклой миеломы. Как и в случаях с наличием в клетках гена вирусного интерлейкина-6, сумма клеток плазмоцитарного ряда колебалась в пределах от 11,6 до 76,2%. Особенностей по клеточному составу костного мозга не отмечено.

Ген К1 был обнаружен лишь в 3 образцах костномозговых пунктатов, что составляет 8% от всех случаев множественной миеломы, сумма клеток плазмоцитарного ряда в костном мозге этих больных колебалась в пределах от 14,6 до 76,2%.

Суммарно, данные по обнаружению последовательностей трёх генов ННУ-8 в клетках костного мозга больных множественной миеломой представлены в таблице 2.

Таблица 2. Последовательности генов ННУ-8 в образцах костного мозга больных множественной миеломой.

№№ пациент vlL-6 ORF26 К1

1 В.А. - - -

2 В.П. + - -

3 H.A. - - -

4 З.И + - -

5 А.П. - - -

6 Н.А 2 + - -

7 МА. - - -

8 А.Н. - - -

9 В А 2 + + +

10 Л. А - - -

11 И.Н. - - -

12 В.М. - - -

13 ЕС. - - -

14 С.Н - - -

15 МЕ. + - -

16 AB - - -

17 В.Б. + + +

18 БП - - -

19 А.Ф. - - -

20 A.C. - - -

21 дд. - - -

22 O.A. - - -

23 Л.М. - - -

24 Г.А. + + -

25 Н.В + , + +

26 В.М 2 - -

27 A.A. - - -

28 А.Т. - - -

29 Г.А.2 - - -

30 Е.В. - - -

31 И.А. - - -

32 Ю.К. - - -

33 И А.2 - - -

34 А В 2 - - -

35 С. А - - -

36 Л Г. - - -

37 ЕМ. - - -

38 В М 3 - - -

Экспрессия мРНК МЬ-б и у1Ь-6 в клетках костного мозга больных множественной миеломой.

Экспрессию цитокинов клетками костного мозга больных множественной миеломой мы изучили на уровне мРНК методом ЯТ-РСИ. В исследование были взяты те же 38 образцов костного мозга от больных множественной миеломой, что и в работе по поиску последовательностей ДНК ННУ-8.

Результаты этого раздела нашей работы представлены в таблицах 3 и 4. Из этих данных следует, что экспрессия мРНК вирусного интерлейкина-6 наблюдается в 7 случаях из 38, что составляет 18% от общего количества больных миеломой. Если сравнить эти результаты с данными по поиску ДНК гена у1Ь-6, обнаруживается, что в одном из 8 у1Ь-6+ случаев (по последовательности ДНК) экспрессия вирусного интерлейкина-6 отсутствует. Причём у данного больного (Н.В.) нами были обнаружены сразу 3 исследованных гена: К1, К2 и (ЖР26, что может говорить о наличии в клетках его костного мозга полноценных вирусных геномов.

Экспрессия интерлейкина-6 человека, как и ожидалось, была обнаружена нами в большинстве случаев множественной миеломы: экспрессия мРНК была обнаружена у 32 больных, что составило 84%.

Таблица 3. Экспрессия мРНК у1Ь-6 в образцах костного мозга больных множес~ зенной миеломой.

№№ пациент экспрессия мРНК №№ пациент экспрессия МРНКУ11_-6

1 ВА - 20 А.С. -

2 В П + 21 дд. -

3 НА. - 22 ОА -

4 ЗИ + 23 Л.М. -

5 А П. - 24 ГА +

6 Н А2 + 25 НВ -

7 М.А. - 26 В М.2 -

8 АН - 27 АА -

9 ВА.2 + 28 А.Т -

10 Л А - 29 ГА.2 -

11 И.Н - 30 Е.В -

12 ВМ. - 31 И. А. -

13 Е.С. - 32 ЮК -

14 С.Н. - 33 И.А.2 -

15 М.Е. + 34 А.В2 -

16 АВ - 35 С А. -

17 В.Б. + 36 Л.Г. -

18 Б.П - 37 Е.М. -

19 А.Ф. - 38 В.М.З -

Таблица 4. Экспрессия мРНК ЫЬ-6 в образцах костного мозга больных множественной миеломой.

№№ пациент экспрессия мРНК ЫЬ6 №№ пациент экспрессия мРНКЫЬб

1 ВА + 20 А. С +

2 В П. + 21 ДД +

3 НА. + 22 О А. +

4 З.И. - 23 ЛМ. +

5 А.П. + 24 ГА. +

6 НА.2 + 25 Н.В. +

7 М.А. + 26 В.М.2 +

8 АН. + 27 А А. +

9 В А.2 + 28 А.Т +

10 Л А. + 29 ГА2 +

11 И.Н. - 30 ЕВ. +

12 В.М + 31 И.А. +

13 Е.С. + 32 Ю.К. +

14 С.Н. + 33 И А 2 -

15 МЕ. + 34 А В.2 +

16 АВ + 35 С.А -

17 В.Б. + 36 Л.Г. +

18 Б.П. - 37 ЕМ. +

19 А.Ф. + 38 ВМЗ -

Данные этих исследований позволяют предположить, что полноценные геномы ННУ-8 присутствуют в клетках 3 больных множественной миеломой. В остальных пяти изученных случаях наиболее вероятно наличие в клетке дефектных эписом вируса.

Взаимосвязь наличия последовательностей генома ННУ-8 и экспрессии мРНК у1Ь-6 и Н1Ь-6 в клетках костного мозга больных множественной миеломой с относительным содержанием различных клеточных типов в миелограмме.

Проведено сопоставление данных по экспрессии мРНК ЫЬ-6 и у1Ь-6, обнаружению последовательностей ДНК генов у1Ь-6, СЖР26 и К1 с процентным содержанием различных типов гемопоэтических клеток в миелограмме больных на момент проведения молекулярных исследований. Результаты представлены в таблицах 5-9. Было выявлено 3 достоверных результата (р<0,05). Это зависимость наличия экспрессии мРНК ЫЬ-6 от количества лимфоцитов (см. табл. 5) и взаимосвязь между наличием генов СЖР26 и К1 (см. табл. 8 и 9 соответственно) и содержанием плазмобластов.

Таблица 5. Процентное содержание различных гемопоэтических клеток в пунктатах костного мозга (%%, М+ш) больных множественной миеломой по данным миелограммы в сопоставлении с экспрессией интерлейкина-6 человека.

Экспрессия ЫЬ6 Количество больных Среднее Стандартная ошибка среднего Уровень значимости ! различий (р)

Клетки плазмо- нет 6 38,6667 8,1855 0,96

цитарного ряда есть 32 38,1875 4,2143

Плазмоциты нет 6 19,5667 6,6652 0,707

есть 32 22,4156 2,8841

Проплазмоциты нет 6 18,7333 8,5996 0,703

есть 32 15,0625 3,2646

Плазмобласты нет 6 0,3667 0,2333 0,347

есть 32 0,7094 0,2695

Клетки грануло- нет 6 35,1 5,6315 0,714

цитарного ряда есть 32 32,7219 2,6984

Клетки эритро- нет 6 18,4 4,2942 0,595

идного ряда есть 32 15,7375 2,1371

Лимфоциты нет 6 5,6667 1,2603 0,014

есть 32 10,4969 1,2381

Моноциты нет 6 1,1667 0,3703 0,094

есть 32 2,0813 0,3565

Таблица 6. Процентное содержание различных гемопоэтических клеток в пунктатах костного мозга (%%, М+ш) больных множественной миеломой по

данным миелограммы в сопоставлении с экспрессией вирусного интерлейкина-6.

Экспрессия уЦ-6 Количество больных Среднее Стандартная ошибка среднего Уровень значимости различий (р)

Клетки ллазмо- нет 31 37,8452 3,994 0,847

цитарного ряда есть 7 40,1143 10,6505

Плазмоциты нет 31 21,3516^ 2,6963 0,709

есть 7 24,6857 8,1656

Проплазмоциты нет 31 15,8452 3,2305 0,908

есть 7 14,7429 8,6552

Плазмобласты нет 31 0,6484 0,2421 0,96

есть 7 0,6857 0,6857

Клетки грануло- нет 31 33,4097 2,708 0,794

цитарного ряда есть 7 31,7143 5,7054

Клетки эритро- нет 31 16,1677 2,1419 0,992

идного ряда есть 7 16,1143 4,5069

Лимфоциты нет 31 9,7258 1,1987 0,989

есть 7 9,7714 2,8862

Моноциты нет 31 2,0581 0,3422 0,441

есть 7 1,4 0,7407

Таблица 7. Процентное содержание различных гемопоэтических клеток в пунктатах костного мозга (%%,М+т) больных множественной миеломой по

данным миелограммы в сопоставлении с наличием гена вирусного интерлейкина-6.

Ген vIL-6 Количество больных Среднее Стандартная ошибка среднего Уровень значимости различий (р)

Клетки плазмо-цитарного ряда нет 30 38,62 4,051 0,876

есть 8 36,925 9,7595

Плазмоциты нет 30 21,5767 2,778 0,816

есть 8 23,425 7,1832

Проплазмоциты нет 30 16,3733 3,2951 0,688

есть 8 12,9 7,7188

Плазмобласты нет 30 0,67 0,2493 0,916

есть 8 0,6 0,6

Клетки грануло-цитарного ряда нет 30 33,13 2,7848 0,979

есть 8 32,975 5,0994

Клетки эритро-идного ряда нет 30 15,7933 2,1805 0,719

есть 8 17,525 4,1502

Лимфоциты нет 30 9,63 1,2354 0,864

есть 8 10,125 2,5244

Моноциты нет 30 2,0533 0,3537 0,469

есть 8 1,5 0,6492

Таблица 8. Процентное содержание различных гемопоэтических клеток в пунктатах костного мозга (%%, М+гп) больных множественной миеломой по

данным миелограммы в сопоставлении с наличием гена (ЖР26.

Ген ORF26 Количество больных Среднее Стандартная ошибка среднего Уровень значимости различий (р)

Клетки плазмо-цитарного ряда нет 34 38,2647 3,8657 0,999

есть 4 38,25 15,4442

Плазмоциты нет 34 20,9265 2,6363 0,444

есть 4 30,8 11,0986

Проплазмоциты нет 34 16,6059 3,3145 0,14

есть 4 7,45 4,4026

Плазмобласты нет 34 0,7324 0,2539 0,007

есть 4 0 0

Клетки грануло-цитарного ряда нет 34 33,3912 2,5902 0,739

есть 4 30,6 7,348

Клетки эритро-идного ряда нет 34 15,7824 2,0811 0,486

есть 4 19,35 4,2311

Лимфоциты нет 34 9,7912 1,1771 0,885

есть 4 9,25 3,2979

Моноциты нет 34 1,9941 0,34 0,434

есть 4 1,45 0,55

Таблица 9. Процентное содержание различных гемопоэтических клеток в пунктатах костного мозга (%%, М+т) больных множественной миеломой по

данным миелограммы в сопоставлении с наличием гена К1.

Ген К1 Количество больных Среднее Стандартная ошибка среднего Уровень значимости различий (р)

Клетки плазмо-цитарного ряда нет 35 37,5029 3,8302 0,647

есть 3 47,1333 17,8667

Плазмоциты нет 35 20,6J 2,5737 0,325

есть 3 37,2 12,8234

Проплазмоциты нет 35 16,1314 3,2532 0,367

есть 3 9,9333 5,1411

Плазмобласты нет 35 0,7114 0,2474 0,007

есть 3 0 0

Клетки грануло-цитарного ряда нет 35 33,6429 2,5276 0,521

есть 3 26,733 8,8365

Клетки эритро-идного ряда нет 35 16,0286 2,0357 0,801

есть 3 17,6667 5,4898

Лимфоциты нет 35 9,9914 1,1604 0,397

есть 3 6,7333 3,014

Моноциты нет 35 2,0057 0,3303 0,305

есть 3 1,1333 0,636

Подводя итог этому разделу работы, можно отметить следующее. Нами не отмечено взаимосвязи экспрессии интерлейкина-6 человека и его вирусного гомолога клетками костного мозга больных множественной миеломой с относительным содержанием клеток гранулоцитарного ряда, эритроидного ростка и моноцитов.

Продукция интерлейкина 6 человека наблюдалась в случаях близкого к норме относительного уровня лимфоцитов костного мозга (в среднем 10,5±1,2%) и отсутствовала в случаях снижения процента лимфоцитов (в среднем 5,7±1,3%). Различия статистически значимы, р=0,014. Вполне возможно предположить, что основным источником продукции интерлейкина-6 человека, в случаях обнаружения цитокина, являются лимфоциты. Это хорошо согласуется с физиологической ролью цитокина, продуцируемого Т-хелперами 2 типа, как медиатора дифференцировки В-лимфоцитов в плазмоциты в ходе тимус-зависимых специфических гуморальных иммунных ответов. Разумеется, это предположение, нуждающееся в экспериментальной проверке.

Другим интересным моментом работы явилось обнаружение присутствия генов К1 и ORF-26 только в случаях полного отсутствия плазмобластов в костномозговом пунктате. При поиске клетки-мишени, инфицируемой HHV-8, плазмобласты, по-видимому, могут быть исключены. Однако, здесь мы наблюдаем отчетливую диссоциацию с данными для гена К2 вирусного интерлейкина 6. При об;.аружении гена vIL-б содержание плазмобластов в костном мозге больных множественной миеломой было таким же, как и в группе сравнения (vIL-б- негативных). Иными словами, предполагая возможную частичную интеграцию генома HHV-8 (о чем свидетельствуют результаты PCR), нельзя исключить, что ген vIL-6 присутствует в плазмобластах. Это чрезвычайно интересная гипотеза, так как именно плазмобласты являются наиболее активно пролиферирующей фракцией в пуле злокачественных клеток множественной миеломы, и vIL-б в этих случаях мог бы оказывать аутокринное пролиферативное действие.

Результаты секвенирования последовательностей кДНК у1Ь-6, обнаруженных в клетках костного мозга больных множественной миеломой.

С целью дополнительной проверки результатов ЯТ-РСЛ и детального изучения экспрессии вирусного интерлейкина-6 были отсеквенированы последовательности кДНК, полученные после обратной транскрипции и последующей ПЦР. Были обнаружены следующие нуклеотидные замены в кодонах у1Ь-6 в сравнении с последовательностью у1Ь-6, взятой из генного банка (ОепеВапк):

1. Замена аденина на цитозин в положении 119 (40 аминокислота, 2 положение кодона) у больной З.И., приводящая к замене аспарагина на треонин.

2. Замена тимина на цитозин в положении 306 (102 аминокислота, 3 положение кодона) у больных Н.А.2, М.Е., З.И., В.П. и Г.А., не приводящая к замене фенилаланина.

3. Замена гуанина на аденин в положении 574 (192 аминокислота, 1 положение кодона) у больных Н.А.2, М.Е., З.И., В.П. и Г.А., приводящая к замене аспарагиновой кислоты на аспарагин.

Данные свидетельствуют о том, что ряд замен, по-видимому, носит не случайный характер. В частности, в нуклеотидных последовательностях 5 пациентов найдены идентичные замены. При этом замещение тимина на цитозин в положении 306 не ведет к изменению аминокислотного состава белка, а замена гуанина на аденин в положении 574 приводит к замене аспарагиновой кислоты на аспарагин, что, в свою очередь, приводит к замещению отрицательно заряженной аминокислоты на незаряженную полярную группу в данном участке полипептида. При этом данный аминокислотный остаток находится довольно далеко от сайтов взаимодействия у1Ь-6 с §р130 и 1Ь611, следовательно, скорее всего, не влияет на функциональную активность вирокина. Вполне возможно, что повторяемость этих аминокислотных замен у нескольких больных

объясняется генетическими особенностями штаммов HHV-8, циркулирующих в России.

Нами также была обнаружена уникальная замена в положении 119 нуклеотидной последовательности вирусного интерлейкина-6 у больной З.И., приводящая к замене аспарагина на треонин в 40 положении белка. Интересно, что этот аминокислотный остаток, не участвующий непосредственно во взаимодействии с рецепторными белками, расположен в а-спирали вирусного интерлейкина-6 между двумя аминокислотами, взаимодействующими с IL6R (сайт I vIL-б) и gpl30 (сайт II vIL-б). Это лейцин-39 (сайт I) и триптофан-41 (сайт II). Но, скорее всего, эта замена всё же не ведёт к какому-либо изменению функциональной активности вирусного интерлейкина-6, так как незаряженная неполярная аминокислота заменяется опять же на незаряженную полярную и, следовательно, это не должно сказываться на окружении данного аминокислотного остатка.

Экспрессия вирусного интерлейкина-6 и интерлейкина-6 человека в клетках неходжкинских лимфом.

Результаты исследования экспрессии мРНК hIL-б и vIL-б представлены в таблице 10.

Таблица 10. Экспрессия hIL-б и vIL-б в различных типах неходжкинских

лимфом.

№№ ФИО Больного Диагноз Экспрессия hlL-6 Экспрессия vlL-6

1. ЕМС Фолликулярная лимфома + -

2. ССБ Диффузная В-крупноклеточная лимфома +

3. ВВФ Лимфома маргинальной зоны селезёнки +

4. ВЛК Диффузная В-крупноклеточная лимфома +

5. ЗФК Диффузная В-крупноклеточная лимфома +

6. ААР Фолликулярная лимфома + -

7. ВВЯ Фолликулярная лимфома + -

8. ММС Фолликулярная лимфома - -

9. РАА Лимфома Бёркитта + -

10 ОХМ Периферическая Т-клеточная лимфома +

11 ННЩ Диффузная В-крулноклеточная лимфома +

12 ТИК Фолликулярная лимфома - -

13 ЛСК Лимфома из малых лимфоцитов/ХЛЛ + -

14 АГУ КМ Крупноклеточная анапластическая +

15 НАБ Фолликулярная лимфома + -

16 НИН Фолликулярная лимфома - +

17 АИБ Фолликулярная лимфома + -

18 ВИА Фолликулярная лимфома + -

19 ГКБ Диффузная В-крупноклеточная лимфома +

20 ТПГ Диффузная В-крупноклеточная лимфома +

21 ГЛЗ Диффузная В-крупноклеточная лимфома +

22 ПНГ Первичная медиастинальная В-крупноклеточная лимфома +

23 АЕЗ Диффузная В-крупноклеточная лимфома +

24 ЛНС Фолликулярная лимфома + -

25 ВАС Лимфома из Т-предшественников - +

26 АИК КМ Крупноклеточная анапластическая +

27 ААК КМ Крупноклеточная анапластическая

28 ЮАВ Лимфома из Т-предшественников + +

29 ВИИ КМ Крупноклеточная анапластическая

30 НАД Фолликулярная лимфома + -

31 ЗНО Фолликулярная лимфома + -

32 ИАК Диффузная В-крупноклеточная лимфома

33 ЮБЕ Диффузная В-крупноклеточная лимфома

34 АИЧ Лимфома из Т-предшественников - -

35 КГИ Лимфома Бёркитта + -

Как видно из таблицы 10, экспрессия интерлейкина-6 человека наблюдалась в 26 случаях из 35, что составляет 74%. Экспрессия вирусного интерлейкина-6 была обнаружена нами в 3 случаях из 36: у пациента НИН (фолликулярная лимфома) и у пациентов ВАС и ЮАВ (оба - лимфома из Т-предшественников). Включив в статистику случай первичной лимфомы серозных полостей, описанный нами в отдельной главе, мы получаем

результат - 4 случая неходжкинских лимфом с экспрессией у1Ь-6 из 36, что составляет 11%. Данные по экспрессии обоих цитокинов в каждом типе лифом приведены в таблице 11.

Таблица 11. Экспрессия у1Ь-6 и ЫЬ-6 в клетках неходжкинских лимфом.

Тип лимфомы Общее число случаев Случаи с экспрессией у|1_-6 %% Случаи с экспрессией ЫЬ6 %%

Фолликулярная 12 1 8,3 9 75

Диффузная В-крупноклеточная 10 0 0 8 80

КМ Крупноклеточная анапластическая 4 0 0 2 50

Из Т- предшественников 3 2 66,7 1 33,3

Бёркитта 2 0 0 100

Маргинальной зоны селезёнки 1 0 0 1 100

Первичная медиастинальная В-круп но клеточ н ая 1 0 0 1 100

Из малых лимфоцитов/ХЛЛ 1 0 0 1 100

Периферическая Т-клеточная 1 0 0 1 100

Первичная серозных полостей 1 1 100 1 100

Результаты данного раздела работы являются, с одной стороны ожидаемыми, с другой - совершенно новыми. Ожидаемой явилась высокая частота экспрессии интерлейкина 6 человека при большинстве вариантов НХЛ. Экспрессия вирокина (у1Ь-6) не характерна для наиболее распространенных форм НХЛ. Она практически отсутствует при периферических лимфомах Т-, В-, нулевой (КЫ) природы. Лишь одно наблюдение фолликулярной лимфомы характеризовалось экспрессией у1Ь-6. Этот случай по нашим данным не имел иммунофенотипических особенностей - типичная фолликулярная лимфома. Совершенно неожиданной явилась высокая частота обнаружения у!Ь-6 при лимфомах из

Т-предшественников. Это очень редкие варианты НХЛ, нами изучено 3 случая, в 2 из них присутствовал vIL-6.

Случаи лимфом из Т-предшественников представляют особый интерес потому, что обычным резервуаром для HHV-8 считаются В-лимфоциты, и в меньшей степени - моноциты, эндотелиоциты и эпителиальные клетки. Тем не менее, в литературе описаны случаи Н Н V - 8-ас со ц и и рованных опухолей Т-клеточной природы. Так, в частности, были описаны случаи HHV-8-позитивных первичных лимфом серозных полостей с Т-клеточным фенотипом [Lechapt-Zalcman, 2001; Said, 1999]. Таким образом, наши данные подтверждают возможность присутствия HHV-8 в Т-клетках.

Первичная лимфома серозных полостей.

При цитологическом исследовании осалка плевральной жидкости были обнаружены преимущественно крупные опухолевые клетки с выраженной базофилией цитоплазмы, с наличием светлого ободка вокруг ядра, состоящим из множества мелких вакуолей (см, рис. 1 А, Б). Ядра опухолевых клеток крупные, с резко выраженным полиморфизмом (многодольчатые, «бугристые», почкующиеся), располагаются как центрально, так и слегка эксцентрически, в большинстве из них - заметны крупные нуклеолы. Отмечается большое количество митозов. Часть клеток с более округлыми ядрами напоминают и мм у но- и ллазмобласты.

Рис.1 А, Б. Клетки плеврального выпота больного. Цитоцентрифужный препарат (cytospin), окраска по Лейшману. Увеличение хЮОО

При иммунофенотипировании использованы моноклональные антитела против маркеров дифференцировки лейкоцитов: CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD10, (2D 13, CD19, CD20, CD33, CD34, CD38, CD61, CD64, CD138, HLA-

27

БИ, гликофорин А, СБ45. Для точной идентификации лимфомных клеток использовали тройное флуоресцентное окрашивание. Результаты иммунофенотипирования клеток плеврального выпота представлены в таблице 12.

Таблица 12. Результаты иммунофенотипирования клеток плеврального

выпота больного.

Маркер Процент антиген-позитивных клеток со слабой экспрессией С045 антигена

В-клеточные антигены

СБ19 0,5

СБ20 80,0

СБ138 3,7

Т-клеточные антигены

ст 3,9

СБ5 2,6

СБЗ 2,5

СБ4 1,4

СБ8 1,8

Миелоидные антигены

СБ13 5,1

СБЗЗ 4,5

Моноцитарные антигены

СБ64 4,9

Стволовоклеточные антигены

СБ34 2,3

Мегакариоцитарные антигены

СБ61 0,4

Эритроидные антигены

Гликофорин А 2,7

Прочие

СБ38 63,4

НЬЛ-БИ 82,7

СБ10 0,2

Цитометрически опухолевые клетки характеризовались более высокими в сравнении с лимфоцитами уровнями бокового светорассеяния лазерного луча (ББС). Отмечена слабая экспрессия С045, что расценено как следствие выраженной анаплазии. Высокие уровни экспрессии наблюдали

для B-клеточного антигена CD20, активационного антигена CD38 и молекулы HLA-DR. На основании представленных данных можно признать, что фенотип лимфомных клеток описанного нами пациента достаточно традиционен для такой патологии как первичная лимфома серозных полостей.

Супернатант плеврального экссудата пациента содержал высокие титры анти-ННУ-8-антител (анти-LANA) (1:320). Более того, были найдены высокие титры антител к EBV. Конечные титры антител к комплексу VCA EBV были 1:640 (IgG), 1:20 (IgA); и к комплексу ЕА EBV - 1:80 (IgG).

Для точной верификации диагноза «первичная лимфома серозных полостей» была проведена PCR с ДНК, выделенной из клеток плеврального экссудата. Реакцию ставили с тремя парами праймеров к трём генам HHV-8: Kl, ORF26 и vIL-6 (К2). PCR дала положительный результат со всеми парами праймеров. Позитивным контролем была ДНК, выделенная из клеток линии BCBL-1, для негативного контроля в PCR-смеси вместо ДНК была добавлена бидистиллированная Н20, используемая в экспериментах. Таким образом, можно однозначно заключить, что данная лимфома плевральной полости является HHV-8-ассоциированной. Также оценили экспрессию мРНК гена vIL-6 HHV-8 и сравнили её с экспрессией мРНК hIL-б. Клетки опухоли экспрессировали оба цитокина, что согласуется с литературными данными [Jaffe et al., 2001, Teruya-Feldstein et al., 1998].

Все эти результаты согласуются с описанием первично'" лимфомы серозных полостей в классификации ВОЗ [Jaffe et al., 2001]. Интересно отметить, что по данным обследования больной был ВИЧ-негативным. Это первый в России случай ВИЧ-негативной первичной лимфомы серозных полостей. Помимо того, что эта лимфома сама по себе довольно редка, её тяжело отличить от других В-крупноклеточных лимфом. Единственным чётким подтверждением диагноза первичная лимфома серозных полостей является анализ на наличие в трансформированных клетках ДНК HHV-8.

Выводы.

1. Продукция вирусного интерлейкина-6 (у1Ь-6) клетками опухолевой ткани больных множественной миеломой и неходжкинскими лимфомами не взаимосвязана с экспрессией его человеческого гомолога и зависит от нозологической формы заболевания.

2. Экспрессия гена вирусного интерлейкина-6 наблюдается в ~20% случаев множественной миеломы, которые по составу опухолевых клеток плазматического ряда и нормальных гемопоэтических клеток костного мозга не отличаются от у1Ь-6-негативных случаев.

3. Экспрессия гена у1Ь-6 в большинстве случаев не ассоциирована с наличием генов ННУ-8 К1 и СЖР26 при множественной миеломе: в 50% этих случаев обнаруживается только ген у1Ь-6, в 12,5% - гены у1Ь-6 и 01^-26 и в 37,5% - все 3 изученных гена - у1Ь-6 (К2), 01^-26 и К1. Этот факт свидетельствует о возможном наличии дефектных вирусных геномов в клетках пораженного костного мозга больных множественной миеломой.

4. В 30% случаев экспрессии мРНК вирусного интерлейкина-6 клетками опухолевой ткани множественной миеломы и неходжкинских лимфом вирокин продуцируется при отсутствии человеческого интерлейкина-6, то есть потенциально может замещать интерлейкин-6 человека в качестве онкогена.

5. Ген вирусного интерлей'ина-6, экспрессируемый клетками пораженного костного мозга больных множественной миеломой, имеет ряд повторяющихся изменений нуклеотидной структуры (в сопоставлении с нуклеотидной последовательностью, приводимой вепеВапк). Замена тимина на цитозин в положении 306 не ведет к изменению аминокислоты в структуре вирусного интерлейкина-6 (фенилаланин-102). Замена гуанина на аденин в положении 574 ведет к изменению аминокислотного состава белка (аспарагиновой кислоты-192 на аспарагин).

6. Вероятной мишенью злокачественной трансформации, опосредованной HHV-8, при неходжкинских лимфомах являются пре-Т-лимфоциты, так как при редкой нозологии - лимфомах из Т-предшественников -экспрессия вирусного интерлейкина-6 обнаружена в 2 из 3 случаев.

7. При периферических B-клеточных лимфомах (за исключением первичной лимфомы серозных полостей) этиопатогенетическая роль вирусного интерлейкина-6 представляется маловероятной, так как экспрессия вирокина обнаруживается только в 3% случаев.

8. Клетки первичной лимфомы серозных полостей (описан первый в России ВИЧ-негативный случай) экспрессируют мРНК интерлейкина-6 человека и мРНК вирусного интерлейкина-6. В опухолевых клетках присутствует полноценный геном вируса герпеса человека 8 типа (гены К1,К2, ORF26).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Широков Д.А., Тупицын H.H., Анохина М.М. Экспрессия вирусного интерлейкина-6 при множественной миеломе и неходжкинских лимфомах человека. Материалы IV Симпозиума «Биологические основы терапии онкологических заболеваний». Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии, (2004); т.З, №4:97

2. Широков Д.А., Анохина М.М., Гурцевич В.Э., Кадырова E.JL, Тупицын H.H. Разработка системы определения экспрессии мРНК генов hIL-б и vIL-6. Иммунология гемопоэза (2004); 1:30-36

3. Широков Д.А. Интерлейкин-6 человека и его вирусный гомолог в опухолевом росте. Иммунология гемопоэза (2005); 2: 186-194

4. Тупицын H.H., Анохина М.М., Непряхина O.K., Широков Д.А., Спиридонова В.А., Копылов A.M. Модуляция передачи клеточного сигнала, опосредованного IL-6, с помощью gp!30. Симпозиум

«Достижения нейронауки для современной медицины и психологии» (2005), стр. 87.

5. Широков Д.А., Шолохова Е.Н., Гурцевич В.Э., Тупицын Н.Н. Экспрессия интерлейкина-6 человека и вирусного интерлейкина-6 при неходжкинских лимфомах. Вестник Российского Онкологического Центра им. Н.Н.Блохина РАМН, (2007), №1

6. Shirokov D., Kadyrova Е., Anokhina М., Kondratieva Т., Gourtsevitch V., Tupitsyn N. A case of HHV-8-associated HIV-negative primary effusion lymphoma in Moscow. Journal of Medical Virology (2007) 79(3).

Список сокращений.

1. hIL-6 - интерлейкин-6 человека

2. vIL6 - вирусный интерлейкин-6

3. IL6R - а-цепь IL-6-рецепторного комплекса

4. gpl30 — (3-цепь IL-6-рецепторного комплекса

5. HHV-8 - вирус герпеса человека 8 типа

6. EBV - вирус Эпштейна-Барр

7. HIV - вирус иммунодефицита человека

8. PEL — первичная лимфома серозных полостей

9. PCR - полимеразная цепная реакция

10.RT-PCR - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией

11.FITC — флуоресцеин-изотиоцианат

Подписано в печать 22.12.06 г. Формат 60x84/16. Тираж 100 экз. Заказ № 708

Отпечатано в службе множительной техники ГУ РОНЦ РАМН им. H.H. Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

Актуальность темы исследования.

Регуляторная роль интерлейкина-6 человека (hIL-б) в стимуляции роста опухолевых клеток и развитии их резистентности к химио- и гормонотерапии при множественной миеломе и неходжкинских лимфомах убедительно доказана. Установление этого факта послужило толчком к развитию нового направления фундаментальных научных исследований в области активации трансдуцерного рецептора gpl30 и опосредованной им передачи сигнала в нормальных и опухолевых клетках. Прикладным аспектом работы явилось обоснование возможности проведения антицитокиновой (анти-ЫЬ-б) терапии в лечении множественной миеломы с помощью моноклональных антител. В нашей стране такие исследования проведены в ГУ Российском онкологическом научном центре имени Н.Н.Блохина РАМН. Достигаемый положительный эффект был, как правило, транзиторным, что обусловлено сходством биологической активности шести цитокинов, передающих сигнал через молекулу gpl30. По этой причине в качестве перспективной мишени антицитокинотерапии рассматривается gpl30, проводится исследование активации рецептора при неходжкинских лимфомах.

Проблема осложняется тем, что открыт новый цитокин семейства интерлейкина-6, который способен воздействовать непосредственно на gpl30 и вызывать его гомодимеризацию на нормальных и опухолевых клетках. Это вирусный интерлейкин-6 - цитокин вирусного происхождения, закодированный в геноме герпесвируса человека 8 типа (HHV-8). Вирусный интерлейкин-6 имеет 24% гомологии по аминокислотному составу с интерлейкином-6 человека, способен действовать на клетки человека и воспроизводить практически те же самые эффекты, что и его гомолог человеческого происхождения.

HHV-8 является последним из открытых (1994 год) опухолеродных вирусов человека. Этиологическая роль этого вируса наиболее хорошо известна при саркоме Капоши и мультицентрической болезни Кастельмана.

Полную ассоциацию с данным вирусом имеет и крайне редкая нозологическая форма периферических крупноклеточных неходжкинских лимфом - первичная лимфома серозных полостей, описанная лишь в последние годы. Важную патогенетическую роль в стимуляции роста этих опухолей играет продуцируемый инфицированными клетками вирусный интерлейкин-6. Ассоциация с HHV-8 документирована не только для первичной лимфомы серозных полостей, но и для иных В-крупноклеточных лимфом, фолликулярных лимфом, мальтом, что не исключает патогенетической роли вирусного интерлейкина-6 в этих случаях.

Особую роль в установлении ассоциации HHV-8 с опухолями иммунной системы занимают исследования в области множественной миеломы. Несмотря на то, что первая работа, подтвердившая HHV-8-инфекцию клеток костного мозга у больных ММ, была опубликована 10 лет назад (Rettig et al, 1996) в журнале Science, полной ясности в данном вопросе нет до настоящего времени. Следовательно, остается неясной и роль вирусного интерлейкина-6 при множественной миеломе. А это очень важно как с точки зрения фундаментальных знаний, так и с точки зрения установления причин возможных неудач анти-ЫЬ-6 терапии множественной миеломы.

С целью поиска ответов на эти вопросы нами в настоящей работе проведено исследование экспрессии интерлейкинов-6 человеческого и вирусного происхождения при различных вариантах периферических неходжкинских лимфом и лимфом из клеток-предшественников. Детальный молекулярный анализ опухолевых клеток в этих случаях проведен методами иммуногистохимии и проточной цитометрии. Экспрессия человеческого и вирусного интерлейкинов-6 при множественной миеломе и первичной лимфоме серозных полостей изучена с подтверждением наличия генов HHV-8 (Kl, К2 и ORF26) в опухолевой ткани.

Целью настоящей работы явилось изучение экспрессии интерлейкина-6 человека (hIL-б) и его вирусного аналога (vIL-6) опухолевыми клетками при различных иммуноморфологических вариантах неходжкинских лимфом, а также при множественной миеломе.

Задачи исследования.

1. Изучить экспрессию мРНК интерлейкина-6 человека и вирусного интерлейкина-6 в клетках неходжкинских лимфом методом RT-PCR.

2. Изучить экспрессию мРНК интерлейкина-6 человека и вирусного интерлейкина-6 клетками костного мозга больных множественной миеломой.

3. Охарактеризовать иммунофенотип клеток неходжкинских лимфом, экспрессирующих интерлейкин-6 человека и вирусный интерлейкин-6.

4. Исследовать образцы костного мозга больных множественной миеломой на предмет наличия в них ДНК HHV-8 по 3 генам-мишеням: Kl, К2 и ORF26.

5. Изучить нуклеотидные последовательности гена вирусного интерлейкина-6 в случаях его экспрессии при множественной миеломе.

6. Охарактеризовать цитологически клетки костного мозга больных множественной миеломой при экспрессии интерлейкина-6 человека и вирусного интерлейкина-6.

Научная новизна.

В результате проведенных исследований установлен ряд новых научных фактов. Главным из них является установление экспрессии вирусного интерлейкина-6 клетками костного мозга больных множественной миеломой в 20% случаев. Впервые показано, что в части случаев экспрессии вирусного интерлейкина-6 при множественной миеломе структурные гены HHV-8 в клетках костного мозга отсутствуют. Выявлены случайная нуклеотидная замена и 2 типа повторяющихся нуклеотидных замен в последовательностях вирусного интерлейкина-6, выделенном из клеток костного мозга больных множественной миеломой. Одна из этих замен приводит к изменению аминокислотного состава вирокина - замене аспарагиновой кислоты на аспарагин в положении 192, что потенциально может сказаться на особенностях третичной структуры и биологической активности вирусного интерлейкина-6 при множественной миеломе. Установлено, что вирусный интерлейкин-6 в 30% случаев его обнаружения экспрессируется опухолевой тканью HXJI и ММ при отсутствии экспрессии человеческого гомолога. Впервые обнаружена экспрессия вирусного интерлейкина-6 при лимфомах из Т-клеток-предшественников. Напротив, патогенетическая роль вирусного интерлейкина-6 при периферических В-клеточных лимфомах, исходя из результатов наших исследований, представляется маловероятной, так как он обнаружен лишь в 3% случаев (1 из 33, фолликулярная лимфома). Подтверждены экспрессия вирусного интерлейкина-6 и наличие генома HHV-8 в клетках первичной лимфомы серозных полостей в первом описанном в России ВИЧ-негативном случае.

Практическая значимость.

Практическая значимость работы складывается из 2 аспектов: диагностического и в перспективе иммунотерапевтического. Диагностический аспект заключается в разработке и внедрении в клиническую практику молекулярной диагностики периферичеких В-клеточных неходжкинских лимфом (в первую очередь, первичной лимфомы серозных полостей) и лимфом из Т-клеточных предшественников, основанной на установлении экспрессии опухолевой тканью вирусного интерлейкина 6. Вирусный интерлейкин-6 имеет уникальные антигенные детерминанты, что делает его потенциальной мишенью иммунотерапии в случаях экспрессии вирокина при множественной миеломе и неходжкинских лимфомах. При наличии генов HHV-8: К1 и ORF-26 в случаях множественной миеломы и первичной лимфомы серозных полостей, кодируемые ими белки также могут явиться потенциальной мишенью иммунотерапии.

выводы.

1. Продукция вирусного интерлейкина-6 (vIL-б) клетками опухолевой ткани больных множественной миеломой и неходжкинскими лимфомами не взаимосвязана с экспрессией его человеческого гомолога и зависит от нозологической формы заболевания.

2. Экспрессия гена вирусного интерлейкина-6 наблюдается в -20% случаев множественной миеломы, которые по составу опухолевых клеток плазматического ряда и нормальных гемопоэтических клеток костного мозга не отличаются от vIL-6-негативных случаев.

3. Экспрессия гена vIL-б в большинстве случаев не ассоциирована с наличием генов HHV-8 К1 и ORF26 при множественной миеломе: в 50% этих случаев обнаруживается только ген vIL-б, в 12,5% - гены vIL-6 и ORF-26 и в 37,5% - все 3 изученных гена - vIL-6 (К2), ORF-26 и К1. Этот факт свидетельствует о возможном наличии дефектных вирусных геномов в клетках пораженного костного мозга больных множественной миеломой.

4. В 30% случаев экспрессии мРНК вирусного интерлейкина-6 клетками опухолевой ткани множественной миеломы и неходжкинских лимфом вирокин продуцируется при отсутствии человеческого интерлейкина-6, то есть потенциально может замещать интерлейкин-6 человека в качестве онкогена.

5. Ген вирусного интерлейкина-6, экспрессируемый клетками пораженного костного мозга больных множественной миеломой, имеет ряд изменений нуклеотидной структуры (в сопоставлении с нуклеотидной последовательностью, приводимой GeneBank). Замена тимина на цитозин в положении 306 не ведет к изменению аминокислоты в структуре вирусного интерлейкина-6 (фенилаланин-102). Замена гуанина на аденин в положении 574 ведет к изменению аминокислотного состава белка (аспарагиновой кислоты-192 на аспарагин).

6. Вероятной мишенью злокачественной трансформации, опосредованной HHV-8, при неходжкинских лимфомах являются пре-Т-лимфоциты, так как при редкой нозологии - лимфомах из Т-предшественников -экспрессия вирусного интерлейкина-6 обнаружена в 2 из 3 случаев.

7. При периферических В-клеточных лимфомах (за исключением первичной лимфомы серозных полостей) этиопатогенетическая роль вирусного интерлейкина-6 представляется маловероятной, так как экспрессия вирокина обнаруживается только в 3% случаев.

8. Клетки первичной лимфомы серозных полостей (описан первый в России ВИЧ-негативный случай) экспрессируют мРНК интерлейкина-6 человека и мРНК вирусного интерлейкина-6. В опухолевых клетках присутствует полноценный геном герпесвируса человека 8 типа (гены К1,К2, ORF26).

Заключение.

Целью данной диссертационной работы являлось исследование экспрессии двух белков - интерлейкина-6 человека и гомологичного ему вирусного интерлейкина-6 - при различных иммуноморфологических вариантах неходжкинских лимфом и множественной миеломе. С научной точки зрения, эти исследования в первую очередь были интересны потому, что в России подобных работ до сих пор не проводилось.

Множественная миелома представляет собой одно из самых распространённых онкогематологических заболеваний в мире. Ежегодно регистрируется 30 новых случаев на 1 миллион населения, а среди 80-летних заболеваемость составляет 37 человек на 100000 населения в год. Множественная миелома составляет 1% от всех онкологических заболеваний и немногим более 10% среди всех гемобластозов. При этом этиология данного заболевания до сих пор остаётся не ясной. Работа Rettig et al в журнале Science [Rettig, 1997] пробудила интерес к исследованиям возможного участия вируса герпеса человека 8 типа (HHV-8) в развитии этого заболевания. Не останавливаясь подробно на всех исследованиях, посвящённых этому вопросу и детально описанных в литературном обзоре, необходимо заметить, что результаты этих работ были крайне противоречивы.

Нами была поставлена задача исследовать экспрессию вирусного интерлейкина-6 (vIL-б) на уровне мРНК в образцах костного мозга больных множественной миеломой. Этот вирусный белок представляется наиболее вероятным кандидатом на роль основного фактора прогрессии ММ в случае ассоциации заболевания с HHV-8. Это объясняется, в первую очередь, тем, что vIL-б является гомологом интерлейкина-6 человека и практически идентичен ему по проявляемым биологическим активностям. А интерлейкин-6 человека, в свою очередь, является главным ростовым фактором при ММ. Именно это предопределило выбор vIL-б, как гена-мишени при исследованиях роли HHV-8 в развитии ММ. Также в задачу нашего исследования входило сравнение экспрессии вирусного интерлейкина-6 с экспрессией интерлейкина-6 человека при множественной миеломе.

Всего было исследовано 38 образцов костного мозга больных множественной миеломой. Исследование проводилось методом ПЦР с обратной транскрипцией. Для этой работы нами были подобраны пары праймеров к vIL-б и hIL-б, которые были протестированы на клеточных линиях ВС-3 и BCBL-1, несущих геном HHV-8, с целью исключить возможность ложноположительных результатов. Из 38 образцов костного мозга в 7 была обнаружена экспрессия мРНК vIL-б, что составило 18,4% от общего числа больных ММ. Экспрессия мРНК интерлейкина-6 человека была обнаружена в 32 из 38 случаев, что составило 84,2%. При сравнении результатов экспрессии мРНК этих двух белков выяснилось, что в большинстве случаев экспрессии мРНК vIL-б, в тех же образцах костного мозга наблюдается и экспрессия мРНК hIL-б. Единственным исключением стала больная З.И., у которой наблюдается экспрессия мРНК только вирусного интерлейкина-6. Это позволило предположить, что активность vIL-б скорее всего не является уникальной и жизненно необходимой для поддержания роста опухоли.

С целью подтвердить наличие геномов HHV-8 в костном мозге больных множественной миеломой мы также поставили ПЦР на выявление в клетках ДНК 3 генов-мишеней: К2 (ген, кодирующий vIL-6), ORF26 (ген большого капсидного белка вируса) и К1 (ген, кодирующий трансмембранный белок, предполагаемо участвующий в трансформации клеток). Гены-мишени были подобраны таким образом, чтобы расстояния между ними в вирусном геноме были достаточно большими и, следовательно, можно было с большей вероятностью оценить наличие в клетке полноценных геномов HHV-8. Также известно, что все 3 гена необходимы для продуктивной репликации вируса. Результаты наших исследований оказались довольно интересными. Из 7 образцов костного мозга больных ММ с экспрессией vIL-б наличие всех 3 генов-мишеней наблюдалось только в 2 случаях (больные В.А.2 и В.Б.). Ещё в одном случае (больная Н.В.) были обнаружены 2 гена - vIL-б и ORF26. Наконец, в остальных 4 случаях был найден только ген вирусного интерлейкина-6. Помимо этого, был обнаружен больной (Н.В.) с наличием всех 3 генов-мишеней, но без экспрессии мРНК vIL-6.

Данные этих исследований заставляют предположить, что полноценные геномы HHV-8 присутствуют в клетках 3 больных множественной миеломой. В случае остальных пяти больных можно говорить либо о встраивании части генома HHV-8 в геном клетки-хозяина, что до сих пор не было описано в литературе, либо о наличии в клетке дефектных эписом вируса, что более вероятно. При этом вопрос об участии HHV-8 в этиологии множественной миеломы остаётся открытым. Несомненно, что генетический материал этого вируса в клетках больных ММ встречается с большей частотой, чем в здоровой популяции или в других онкологических заболеваниях (за исключением, разумеется, трёх 100%-ассоциированных с HHV-8 патологий - саркомы Капоши, первичной лимфомы серозных полостей и мультицентрической болезни Кастельмана). Но является ли вирус пусковым механизмом трансформации клеток, участвует ли в поддержании трансформированного состояния клеток, либо является вирусом-сателлитом - это остаётся неясным. С другой стороны, наличие гена вирусного интерлейкина-6 и экспрессия мРНК vIL-б в клетках определённой части больных множественной миеломой позволяет говорить о vIL-б, как о возможной мишени противоопухолевой терапии. С этой точки зрения vIL-б является отличным опухолеассоциированным антигеном, специфичным только для трансформированных клеток.

Также нами были секвенированы нуклеотидные последовательности кДНК (комплементарных копий мРНК) вирусного интерлейкина-6, обнаруженных у больных множественной миеломой. Были обнаружены следующие нуклеотидные замены в кодонах vIL-б. 1)3амена аденина на цитозин в положении 119 (40 аминокислота, 2 положение ко дона, A AT

АСТ) у больной З.И., приводящая к замене аспарагина на треонин. 2)3амена тимина на цитозин в положении 306 (102 аминокислота, 3 положение кодона, ТТТ—>ТТС) у больных H.A.2, М.Е., З.И., В.П. и Г.А., не приводящая к замене фенилаланина. 3)3амена гуанина на аденин в положении 574 (192 аминокислота, 1 положение кодона, GAC—>ААС) у больных H.A.2, М.Е., З.И., В.П. и Г.А., приводящая к замене аспарагиновой кислоты на аспарагин. Проанализировав эти замены мы пришли к выводу, что они могут не влиять на функциональную активность вирусного интерлейкина-6 и могут говорить скорее о генетических особенностях штаммов HHV-8, циркулирующих в России.

Другим большим разделом нашей работы был скрининг образцов опухолевых клеток различных иммуноморфологических вариантов неходжкинских лимфом на экспрессию мРНК вирусного интерлейкина-6. Параллельно, как и в случае с множественной миеломой, изучалась экспрессия мРНК интерлейкина-6 человека. Всего было исследовано 35 образцов от больных HXJ1, в том числе 12 фолликулярных лимфом, 10 диффузных В-крупноклеточных лимфом, 4 Ki-1 крупноклеточных анапластических лимфомы, 3 лимфомы из Т-предшественников, 2 лимфомы Бёркитта, 1 первичная медиастинальная В-крупноклеточная лимфома, 1 лимфома из малых лимфоцитов (хронический лимфолейкоз), 1 периферическая Т-клеточная лимфома и 1 лимфома маргинальной зоны селезёнки. Все диагнозы были верифицированы с помощью метода иммуногистохимии с применением широкой панели моноклональных антител.

Экспрессия мРНК вирусного интерлейкина-6 была обнаружена в 3 из 35 случаев HXJI. Это был 1 случай фолликулярной лимфомы (1 из 12) и 2 случая лимфомы из Т-предшественников (2 из 3). Экспрессия мРНК интерлейкина-6 человека была обнаружена в 26 из 35 случаев неходжкинских лимфом. В vIL-6-позитивном случае фолликулярной лимфомы экспрессии мРНК hIL-б не наблюдали. Также не наблюдалось экспрессии мРНК hIL-6 у одного из больных с vIL-6-позитивным случаем пред-Т-клеточной лимфомы (больной ВАС). У больного ЮАВ с тем же диагнозом экспрессировались оба цитокина. У 7 пациентов не было обнаружено экспрессии ни мРНК vIL-б, ни мРНК hIL-б. Случаи лимфом из Т-предшественников представляют особый интерес потому, что обычным резервуаром для HHV-8 считаются В-лимфоциты, и в меньшей степени -моноциты, эндотелиоциты и эпителиальные клетки. Тем не менее, в литературе описаны случаи HHV-8-ассоциированных опухолей Т-клеточной природы. Так, в частности, были описаны случаи HHV-8-позитивных первичных лимфом серозных полостей с Т-клеточным фенотипом [Lechapt-Zalcman, 2001; Said, 1999]. Таким образом, наши данные подтверждают возможность присутствия HHV-8 в Т-клетках.

Наконец, важным достижением нашей работы стало обнаружение, диагностика и детальное описание первого в России случая HHV-8-позитивной первичной лимфомы серозных полостей (первичной выпотной лимфомы). Эта лимфома достаточно трудна по своей диагностике, так как характерные для этой патологии экссудаты опухолевых клеток в различные полости тела встречаются и при других неходжкинских лимфомах. Помимо этого, будучи В-клеточной по своей природе, эта лимфома может не экспрессировать В-клеточных маркеров. Идентифицированный нами случай первичной выпотной лимфомы отличался высоким уровнем экспрессии В-клеточного антигена CD20, активационного антигена CD38 и молекулы HLA-DR. Необычным было отсутствие экспрессии молекулы синдекана-1 (маркер CD138), которая в принципе является дифференциальным маркером данной патологии.

Плевральный экссудат, полученный от больного, была исследован в реакции непрямой иммунофлуоресценции на наличие антител к белкам 2 герпесвирусов - HHV8 и EBV. Были определены высокие титры антител к белкам обоих вирусов. Также этот случай первичной лимфомы серозных полостей был исследован цитологически. Кроме того, была поставлена PCR на 3 гена HHV8 (Kl, К2 и ORF26) и RT-PCR на экспрессию мРНК интерлейкина-6 человека и вирусного интерлейкина-6. Результат был положительным как на наличие в опухолевых клетках всех генов-мишеней, так и на экспрессию vIL-6 и hIL-6.

Уникальность обнаруженного нами случая первичной лимфомы серозных полостей в том, что он оказался ВИЧ-негативным, хотя из литературных данных было известно, что практически всегда эта патология развивается на фоне СПИДа. Этот случай оказался всего лишь 23-ей ВИЧ-негативной первичной выпотной лимфомой, описанной в мировой литературе.

Подводя итог, можно сказать, что оценка экспрессии вирусного интерлейкина-6 и сравнение с экспрессией интерлейкина-6 человека при множественной миеломе и различных вариантах HXJ1 были проведены в нашей стране впервые. Ещё одним важным достижением явилось детальное описание первого в России случая HHV8+ HIV" первичной лимфомы серозных полостей. Введение в рутинную клиническую практику молекулярно-биологического анализа на HHV8 позволило бы выявлять другие подобные случаи, а также, возможно, новые вирус-ассоциированные гемопоэтические патологии. Результаты нашей работы могут быть использованы в практической деятельности - совершенствовании диагностики лимфом и развитии новых методов биотерапии лимфом и множественной миеломы. Совершенствование диагностики в данном случае подразумевает дополнение стандартных иммуногистохимических и иммуноцитоморфологических признаков молекулярными методами оценки экспрессии цитокинов опухолевыми клетками. Возможная роль данных исследований в развитии методов биотерапии лимфом и множественной миеломы может заключаться в более точной идентификации групп опухолей, характеризующихся продукцией интерлейкина-6, и в частности, вирусного интерлейкина-6 и развитию методов целенаправленного блокирования активности этого цитокина у больных.