Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Моноклональные сапные и мелиоидозные антитела как диагностические реагенты

РГ6 Ой 2 7 МЛЙ «97

На правах рукописи

ПРОХВАТИЛОВА Елена Валерьевна

МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ САПНЫЕ И МЕЛИОИДОЗНЫЕ АНТИТЕЛА КАК ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ РЕАГЕНТЫ

14.00.36 - аллергология н нммунолопи 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учевой степени кандидата медицинских иаук

Волгоград 1997

Работа выполнена в Волгоградском научно-исследовательском противочумном институте

Научные руководители: доктор медицинских наук,

академик РЗА, профессор Н.Г. ТИХОНОВ доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Н.П. ХРАПОВА

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Т.И. АНИСИМОВА

кандидат медицинских наук,

В.А. ФЕДОРОВА

Ведущая организация:

Ростовский научно-исследовательский противочумный институт

Защита состоится "3(?" мао 1997 г. в ^ часов на заседании диссертационного совета К 074.32.01 при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46 )

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РосНИЛЧИ "Микроб".

Автореферат разослан «-¿У» а^/О^Л 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

3-Л.Девдариани

ОБДАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОВШЫ. Сап и мелиовдоз - тяжелые инфекционные заболевания человека и животных с прогрессирующим течением и высокой летальностью, чаще всего протекающие в виде пневмоний и септикопиемий.

На территории России случаи заболеваемости сапом и ыелиои-дозом в настоящее время не регистрируются. Однако, в связи с развитием межгосударственных экономических и политических связей существует потенциальная угроза завоза мелиоидозкой инфекции из эндемичных районов юго-восточной Азии, северных провинций Австралии, Африки, Центральной Америки. Единичные случаи заболевания сапом животных и людей, регистририруемые в странах Центральной Азии, Латинской Америки, также могут явиться причиной распространения этого заболевания в другие регионы. Научные изыскания по сапу и мелдаидозу проводятся сотрудниками Волгоградского противочумного института как раздел федеральной целевой программы по охране территории Российской Федерации от завоза и распространения особо опасных инфекционных заболеваний людей, животных и растений, а также токсических веществ.

Возбудители сапа и мелиоидоза (P.mal lei и P.pseudomallel) являются бактериями 11 группы патогенности и требуют к себе пристального внимания специалистов службы санитарно-эпидемиологического надзора и здравоохранения. Своевременная этиологическая диагностика клинических случаев заболеваний сапом и ме-лиоидозом, а также обнаружение й идентификация указанных возбудителей с неизвестным патогенным потенциалом в пробах из различных объектов предусматривают использование, наряду с традиционным бактериологическим методом исследования, современных высокочувствительных методов имыуноанализа.

Основными лабораторными диагностическими приемами, обеспечивающими быстрое и достоверное обнаружение P.mallei и P.pseudomalle î в пробах из объектов внешней среды, в клиническом и секционном материале, являются метод флуоресцирующих антител (MSA) и реакция непрямой гемагглютинации (РИГА) ( Ширяев Д. Т. и др.,1976. Рыбкин B.C. и др.,1982). Для выявления и иденткфи-

кации патогенных псевдомокад разработаны также высокочувствительные методы: твердофазный имыуиоферментный метод (ТИФМ), радиоиммунный анализ, хемилшинесцевтяый иммуноанадиз (Яковлев А. Т. и др.,1991, Манолов А.Д. и др.,1994, Коваленко A.A. и Др.,1990).

Диагностические препараты для экспресс-методов (МЕА и РИГА) до недавнего времени изготавливали на основе поликло-нальных иммуноглобулинов специфических сывороток различных видов животных. Технологические особенности производства таких препаратов осложняют получение стандартных по свойствам диагностических средств. Кроме того, установлено, что создание ви-доспецифических препаратов на поликдонадъной основе представляет определенные трудности ввиду близкого антигенного родства возбудителей сапа и мелиоидоэа (Алексеев В.В. и др.,1984).

Развитие новейшей технологии получения специфических МКА (Kochler е., Milsteln С.,1975) расширило возможности иммунодиагностики инфекционных заболеваний, в том числе сапа и мелиои-доза.

Принципиально новый подход к усовершенствованию диагностических средств был.успешно реализован в ВолгНИПЧИ Н.П.Храпово! с соавт. (1989). Авторши были использованы сапные моноглональ-ные антитела (МКА) в качестве основы специфических люмияесци-рующих иммуноглобулинов для ША. Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие сапные монаюгакадькые сухие по показателя! активности и специфичности превосходили поликлональныи аналга в отношении бактерий сапа и были включены в перечень кошер ческих диагностических средств, рекомендуемых для применена на этапе обнаружения возбудителя сапа в различных объекта исследования. .

Наряду с эффективным использованием МКА в производстве ди агностических препаратов весьма перспективно применение неме ченых МКА в качестве ингредиентов серологических реакций (ре акции иммунодиффузии (РОД) и реакции агглютинации (РА) для по иска антигенов патогенных псевдомонад. Исследования , прове денные Яковлевой И.В. с соавт.(1994), показали возможное! применения МКА в РИД, а таrate для конструирования' иммунофер ментных тест-систем.

Настоящая работа посвящена получении коллекции гибридом- продуцентов разнообразных сапных и мелиоидозных МКА, включает в себя новые подходы к целенаправленному отбору монокло-нальных иммуноглобулинов, пригодных для их использования в различных серологических методах.

Замена традиционного поликлонального сырья на МКА при изготовлении табельных иымунодиагностических средств для выявления патогенных псевдомонад, возможность получения видоспецифи-ческих сапных и мелиоидозных антител, взаимодействующих с антигенными детерминантами одного из видов бактерий, являются определяющими факторами в решении такой актуальной проблемы, как своевременное обнаружение и идентификация возбудителей сапа и мелиоидоза.

Цель работа заключалась в получении коллекции гибри-дом-продуцентов МКА к антигенным детерминантам возбудителей сала и мелиовдоза и оценке эффективности использования МКА в качестве ингредиентов серологических реакций и основы иммуно-диагностических препаратов для индикации и идентификации патогенных псевдомонад.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: 1) оптимизировать технологию получения гибридом, стабильно продуцирующих антитела, создать коллекцию гибридом-продуцентов моноклональных иммуноглобулинов, "узнающих" эпитопы возбудителей сапа и мелиоидоза;

2) изучить свойства МКА различных типов в традиционных серологических методах (ШМ,К№А,РНГА,РИД,РА), произвести отбор типов МКА для последующего их использования в каждом методе;

3) оценить стабильность роста и антителопрсдукции гибридом при их культивировании in vivo и In vitro;

4) произвести эпитопный анализ антигенных детерминант P.mallel и P.pseudomallei, выявляемых МКА, с помощью конкурентного ТОШ;

5) разработать технологию изготовления иммунодиагностичес-ких препаратов на основе моноклонзльных иммуноглобулинов для обнаружения и идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза с помощью РИГА и МВД, оценить параметры качества препаратов (ак-

-б-

тявность, чувствительность, специфичность) и сравнить их свойства с коммерческими иммунодиагностическими средствами;

6) оценить эффективность использования МКА в РИД и РА на этапе идентификации чистых культур Р.та11е1 и Р.рэеискхпаПе!;

7) разработать иммуноферментную тест-систему с МКА для обнаружения антигенов возбудителей сапа и мелиоидоза.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. В результате выполнения работы был создан уникальный набор МКА различной зпитопной направленности в отношении детерминант диагностически 'значимых биополимеров возбудителя мелиоидоза и сапа. Установлено, что использование серологических реакций с МКА, выявлявших консервативные антигенные детерминанты, зкспрессированные с высокой плотностью на термостабильных компонентах антигенов, повышают эффективность исследований по обнаружению и идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза.

Оптимизированы условия получения гибридом-продуцентов сапных и мелиоидозньи МКА: разработаны рациональные схемы иммунизации животных с использованием внутриселегеночной бустирующей инъекции антигена, позволяющие увеличить эффективность гибридизации до 622, а также осуществлен отбор гибридом, стабильно продуцирующих МКА заданной специфичности.

Представлены доказательства того, что иммуноглобулиновые препараты нового типа по показателям активности и чувствительности не уступают коммерческим поликлональным препаратам (сапному ишуноглобулиновому эритроцитарному диагностикуму и мели-оидозным видоспецифическим и группоспецифическим ЛИГ).

Разработаны новые способы выделения АГ6 и АГ8 возбудителей сапа и мелиоидоза методом аффинной хроматографии на колонках с моноклональным иммуносорбентом.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧЗйОСТЬ: Получена коллекция гибридных клеточных культур, продуцирующих МКА к поверхностным и растворимым антигенам Р.та11е1 и Р.рзешЗотаПе!. Штаммы гибридных культивируемых клеток Ш-2(Ш), 6Уй-3(2в8), МУс1-4(2А6) депонированы в специализированной коллекции клеточных культур института цитологии Российской АН (г.Санкт-Петербург), с присвоением регистрационных номеров ВСКК(П) 648Д, 650Д, 649Д.

Разработаны и испытаны моноклональные флуоресцирующие препараты для MIA и иммуноглобудиновый эритроцитарный диагности-кум на основе МКА для РИГА. Определена эффективность их применения в соответствующем методе.

Установлена эффективность применения РИД и РА с МКА на этапе идентификации чистых культур P.mallei и P.pseudomallei.

Разработана иммукоферментная тест- система на основе МКА (2А6), предназначенная для выявления АГ8 P.pseudomallei и P.mallei в различных объектах исследования.

На полученные иммуноглобулиновые препараты оформлены:

1) "Инструкция по изготовлению и контролю иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих медиоидозных видоспецифических моноклональных мышиных сухих" и "Инструкция по применению иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих медиоидозных видоспецифических моноклональных мышиных сухих", которые одобрены ученым советом ВолгНИПЧИ (протокол N 10) 25.09.96г. и утверждены зам.директора по научной работе А.В.Липницким;

2) "Инструкция по изготовлению и контролю иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих медиоидозных общих моноююнальных мышиных сухих" и "Инструкция по применению иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих медиоидозных общих моноююнальных мышиных сухих", которые одобрены ученым советом ВолгНИПЧИ (протокол N 10) 25.09.96г.и утверждены зам.директора по научной работе А.В.Липницким;

3) "Инструкция по изготовлению и контролю диагностикума эритроцитарного иммуноглобулинового сапного моноклонального сухого" и "Инструкция по применению диагностикума эритроиитлр-ного иммуноглобулинового сапного моноклонального сухого", которые одобрены ученым советом ВолгНИПЧИ (протокол N 125 21.12.95г. и утверждены директором ВолгНИПЧИ Н.Г.Тихоновым;

Испытания новых диагностических препаратов на основе МКА для МФА к РИГА проведены на базе ВолгНИПЧИ в мае 1996г. Налажено экспериментальное мелкосерийное производство иммуноглобулинового сапного моноклонального эритроцитарного диагностикума и иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих медиоидозных видоспецифических и общих моноклональных.

Методические приемы по обнаружению возбудителей сала и ме-лиовдоза с помощью МКА в серологических методах используются при проведении научных исследований в лабораториях иммунодиаг-

ностики и биотехнологии, иммунохимии, экспериментальной биохимии ВолгНИПЧИ.

ОСНОВНЫЕ ПСШМЕНИЯ, ЕШОСИМЬЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Доказательства целесообразности использования сапных и мелиоидозных МКА к термостабильным антигенным детерминантам P.mallei и P.pseudomallel в качестве ингредиентов серологических реакций (РА и РИД), а также основы при изготовлении диагностических препаратов (зритроцитарного диагностикума, ЛИГ, ИПК).

2. Новые данные о более высокой эффективности сапных и мелиоидозных МКА в серологических исследованиях, направленных на выявление и идентификацию возбудителей сапа и мелиоидоза.

3. Новые иммунодиагностические препараты: диагностикум эритроцитарный имыуноглобулиновый сапной моноклональный , иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие мелиоидозные ви-доспецифические и общие моноклонадьные мышиные.

4. Доказательства параметров качества (активность, специфичность, чувствительность) моноклональных иммунодиагностичес-ких препаратов, не уступающих соответствующим коммерческим по-лгеаональным препаратам для РНГА и (<0А.

5. Сведения о способности разработанной на основе МКА им-муноферментной тест-системы обеспечивать обнаружение минимальных ( 0,5-5 нг/мл белка по Лоури, 0,37-3,7 нг/мл ПС антроновым методом) концентраций АГ8, одного из основных факторов пато-генности P.mallei и P.pseudomallei.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ:

Материалы, изложенные в диссертации, обсуждены на Всероссийской научной конференции "Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций" (Волгоград,1992); юбилейной конференции, посвященной 25-летио со дня основания НИИ военной медицины "Актуальные проблемы разработки медицинских средств и методов сохранения и восстановления боеспособности личного состава вооруженнх сил" (Санкт-Петербург,1994); научной конференции, посвященной 25-летию ВолгНИПЧИ (Волгоград, 1995); международной научной конференции, посвященной 150-дети» со дня рождения И.И.Мечникова "Идеи И.И.Мечникова и развитие современного естествознания" (Харьков, 1995).

ПУБЛИКАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ:

Основные положения диссертации отражены в 14 печатных работах, в том числе в 2 патентах на изобретение.

СТРУКТУРА дасОЕРТАЦИИ: диссертация изложена на 182 страницах, иллюстрирована 4 рисунками и 27 таблицами. Состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследовании, заключения и выводов.

Библиографический указатель включает 75 отечественных и 109 зарубежных источников.

I. ИАТШШЫ H КЕТОДЫ

Эгамми микроорганизмов. В работе были использованы 61 штамм возбудителя мелиоидоза (P.pseudomalleí), 16 штаммов возбудителя сапа (P.mallei), 20 штаммов P.aeruginosa, P.cepacia, P.fluorescens, P.putida, 17 штаммов 14 видов представителей семейств Enterobacteriaceae и Vibrionaceae. Все культуры микроорганизмов получены из лаборатории поддержания живых культур ВолгНИПЧИ. На всех этапах исследований в качестве референтных использовали штаммы P.mal lei 10230 и P.pseudomalleí 56830 с типичными культурально-морфологическими, тинкториадьными. биохимическими и антигенными свойствами.

Клеточные линия. При воспроизведении гибридомной технологии в качестве опухолевого партнера использована мышиная мие-ломная клеточная линия P3-X63/Ag.653, полученная из Института цитологии Российской АН (г.Санкт-Петербург).

Лаборатсрнш животные. При выполнении различных этапов работы использованы инбредные мыши BALB/c, аутбредные белые мыши, золотистые хомячки, кролики породы шиноилла, морские свинки.

Антигены. В качестве антигенов применяли: 1) взвеси клеток возбудителей сапа и мелиоидоза, обеззараженные физическими и химическими методами стерилизации (ацетоном, 4Х нейтральным формалином, автоклавированием при 120 °С); 2) ультразвуковые дезинтеграты клеток бактерий; 3) водно-солевые экстракты ; 4) экстрацеллшярный антиген; 5) аффинно очищенные с помощью мо-ноклональных иммуносорбентов фракции антигенных комплексов б (АГб) и 8 (АГ8), выделенные из штаммов P.pseudanalîel 568Э0,

56576, 100 и Р,mallei 10230. Для обозначения антигенных комплексов использована классификация антигенов P.pseudomallel, предложенная H.H.Пивнеы и Б.И.Илюхиным (1981Г). Аффиино очищенный АГб состоял из 162 белка, 142 лкпидов и 702 полисахаридов, АГа включал 102 белка и 902 полисахаридов.

Гибрдозацкн иммунных спленоцитов и мышиной миедсмы проводили на основе "Методических рекомендаций по получению гибридом-продуцентов моноклональкых антител к бактериальным ангиге-кам" (Москва,1986) с привнесением ряда модификаций на этапах подготовки иммунных спленоцитов к слиянию и подборе компонентов для сред культивирования.

Для выращивания гибридом-ородуцентов МКА использовали среды RPMI-1640 ("Gibco", "Flow") с добавлением ингредиентов, соответствующих каждому этапу данной технологии. Отбор клонов-продуцентов МКА производили по результатам скрининга в ТИ©1 и НМФА. Наюэпление МКА осуществляли in vitro и In vivo в виде трансплантируемых асцитяых опухолей в организме мышей BALB/c. Выделение моноклонадьных иммуноглобулинов осуществляли методом осаждения сульфатом аммония ( при 502 насыщения раствора). Концентрацию бедка (МКА) в пробах определяла спектрофотометри-чески. Индивидуальные образцу монокдоналышх иммуноглобулинов ампулировали и хранили при -20 °С.

Специфическую активность всех типов МКА изучали с помощью НМ$А(ТИЗМ,РИД, РА. Оценена гекосеисибилизирующая активность МКА как основы иммуноглобудинового эритроцитарного диагностикума для РИГА.

Кзотипы МКА определяли с помощью икмуноферментных наборов фирмы "Calbipchem" (США) и "Изотим" (г.Санкт-Петербург).

Конкурентную реакцию пар МКА для определения индекса аддитивности проводили согласно методике, предложенной Friqult В. с соавт.(1983).

Различные типы МКА использовали в качестве ингредиентов серологических реакций (РА, РИД), а такясе основы при изготовлении иммунодиагностических препаратов для обнаружения возбудителей сапа и мелиовдоза.

Конъюгирование МКА с флуоресцеинизотиацианагом (ФЙТЦ) осуществляли по методу Godín? J.W. с соавт.(1986). Очистку конъ-югата от несвязавшегося флуорохрома проводили на колонках с сефадексом Г-25 злюирующим буфером 0.01М ФБР, pH 7,2. В прямом

Mï'A оценивали рабочее разведение, специфическую активность и специфичность полученных моноклональных флуоресцирующих иммуноглобулинов.

Для изготовления диагностикума эритроцитарного иммуногло-булинового сапного моноклонального использовали методику, разработанную для коммерческого иммуноглобулинового сапного по-ликлонального диагностикума С Кулаков М.Я. и др., 1984). В РИГА определяли показатели чувствительности и специфичности диагностикума эритроцитарного иммуноглобулинового сапного на основе МКА.

Экспериментальные серии моноклональных иммунодиагностичес-ких препаратов для экспресс-методов обнаружения возбудителей сапа и мелиоидоза (РНГА, MÎ'A) оценивали в экспериментах по выявлению патогенных псевдомонад в пробах из объектов внешней среды и материале от зараженных животных в сравнении с коммерческими поликлональными аналогами.

С помощью VAIU с МКА осуществляли поиск антигена 8 , одного из основных факторов патогенности P.mallei и P.pseudomal-lei, в экстрацеллюлярных фракциях, антигенных смесях и средах культивирования микроорганизмов, используя методику Voiler А. с. соавт.(1976). ИПК на основе МКА (2А6) получали по методу Mathiesen L.R. с соавт.(1987). По результатам сэндвич-варианта ТШМ с МКА рассчитывали концентрации антигена 8 по белку (или полисахарида/), выявляемые данным методом в различных образцах исследуемых проб.

Статастяческуп обработку результатов опытов проводили методами вариационной статистики (Ашмаркн И.П., Воробьев A.A.,1962) с использованием статистических программ для микроЭВМ "Электроника B3-34" и "Электороника МК-56".

II. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Получение гибридом- продуцентов 1Ш к антхгснига детеркн-

кантам возбудителей сапа и келнохдоза

В процессе подготовки к основным экспериментам по гибридизации мышиных слленоцитов и миеломы проведены исследования по подбору антигенного препарата для иммунизации мышеи, изучена динамика накопления гуморальных антител у животных при введении различных антигенов (УЗ дезинтегратов бактериальных кле-

ток, ВСЭ и аффинно очищенных фракции антигенов 6 и 8 P.mallei и P.pseudomallei), подобрана рациональная схема иммунизации, обеспечившая эффективную антигенную стимуляцию В-спленоцитов in vivo. Основными критериями оценки уровня стимуляции иммуно-компетентных клеток считали нарастание титров специфических антител в сыворотках животных в ТИС6М.

Наиболее эффективной схемой поликлональной стимуляции В-спленоцитов являлась: 2-Зх кратная иммунизация ультразвуковыми деаинтегратами клеток Р.mallei к P.pseudomallei,суммарная доза антигена не более 1-2х109 м.к!/мл на цикл иммунизации и введение бустирующих микродоз антигена (10-50 мкг) непосредственно внутриселезеночно аа 3-4 дня до слияния клеток.

Подготовительный этап включал в себя также выбор методов скрининга МКА (TJÍSM и НША), подбор" серий южыогирующего агента (ПЭГ), клеточных партнеров и их соотношения, серий ЭТС как наиболее нестандартного ингредиента ростовой среды гибридом,

С учетом результатов предварительных экспериментов нами проведено 10 опытов по гибридизации мышиных миеломы и сплено-цитов. Сочетанное использование оптимизированных методических приемов позволило достичь высоких показателей эффективности гибридизации: число гибридных клонов увеличилось до 70Z и 62% гибридом продуцировали специфические МКА к растворимым и клеточным антигенным структурам возбудителей сапа и мелиоидоза.

По результатам скрининга антителопродуцентов с учетом ви-до- и группоспецифических свойств МКА было отобрано 137 первичных клонов, из числа которых после этапов клонирования, оценки стабильности признака антителопродукции, сохранения его в процессе культивирования клеток in vitro и криоконсервации была создана коллекция из 14 гибридом, стабильно продуцирующих антитела к диагностически значимым антигенам возбудителей сапа и мелиоидоза. С этой коллекцией были проведены исследования по способности гибридом индуцировать асцит у мышей BALB/c, определены методы очистки моноклональных иммуноглобулинов, условий криохранения гибридом и образцов МКА.

Изотипирование имуноглобулинов выявило принадлежность 4 типов МКА к классу IgM (2G8, 1F5, 1Е10, 1Е12) и 9 типов МКА -к классу IgG (субклассам IgGi -2Н7, IgGab -1G2. 2А7, 1Е5, 1F4, 262, IgG3 - 2А6, 2ES, 1F1Q).

Серологические свойства МКА изучены в РА, РИД, HMSA, ТИФМ. Результаты исследований на ограниченном числе штаммов P.mallei и P.pseudomallei позволило обозначить наиболее активные типы МКА с ввдо- и группоспецифическими свойствами в конкретных серологических методах. Оценена гемосенсибилизирующая активность МКА как основы иммуноглобулинового ЭД для РИГА.

С помощью НЖ>А установлено, что 8 типов МКА (2A7,1F5,1E10»2G2,1E5,1E12,1F10,1A8) обладали группоспецифическими свойствами в отношении эпитопов антигенов, локализованных на клеточной стенке P.mallei и P.pseudomallei, и 4 типа МКА (1F4,1G2,2E5,2A6) взаимодействовали только с антигенами P.pseudomallei.

Результаты TIMM и РИД с аффинно очищенными фракциями антигенов 6 и 8 P.mallei и P.pseudomallei позволили определить 3 типа МКА (162,2Н7,2Аб), идентифицирующих термостабильный компонент биокомплекса АГ8, 4 типа МКА (2A7,1E12,2G2,2A8) - были направлены против эпитопов АГб и 4 типа МКА (2G8,1F5,1F4,1£5) взаимодействовали с антигенными детерминантами, общими для антигенных комплексов АГб и АГ8. Все антигенные детерминанты, выявляемые МКА, относились к термостабильным комплексам анти-г.енов P.mallei и P.pseudomallei. Определены конкурентные взаимоотношения меяду парой антител за места связывания с детерминантами на антигенном комплексе патогенных псевдомонад.

Создание коллекции МКА, разнообразных по специфической направленности, позволило перейти к решению основной задачи настоящего исследования - подбору типов МКА, пригодных для использования в качестве ингредиентов серологических реакций или основы диагностических препаратов.

При этом осуществляли соответствующий подбор наиболее стабильных антитедопродуцирующих гибридных клонов с учетом результатов тиражировании in vivo и in vitro, оценивали специфические свойства МКА после конъюгирования последних с ферментом, флуорохромсм или адсорбции на эритроцитах, изучали показатели спектра специфической активности и специфичности полученных моноклональных препаратов на широком наборе итаммов возбудителей сапа и мелиоидоза и гетерологичных видов микроорганизмов в соответствующих серологических методах.

При этом ванным моментом было решение вопроса о целесообразности замены поликлональных иммуноглобулинов на МКА при

производстве табельных средств обнаружения P.mallei и P.pseu-domallei. В связи с этим все экспериментальные серии монокло-налъных препаратов испытывали в сравнении с коммерческими по-ликлональными аналогами.

Конструирование я характеристика кккукодкагностичесюа

препаратов ва основе МКА дав обнаружения и идеитифиха-

ции возбудителей сапа х мелиоядоза

О возможности получения ЭД на основе сапных и мелиоидозных МКА сообщали Н.П.Храпова (1989) , И.В.Яковлева с соавт. (1995). Однако, технология изготовления стандартных моноклональных сапных ЭД, отвечающих всем требованиям, предъявляемым к средствам обнаружения возбудителей сапа и мелиоидоза, не была разработана.

В данной работе впервые экспериментально показана возможность изготовления мококлонального сапного ЭД для РИГА, не уступающего по параметрам качества (чувствительность, специфичность) коммерческим иммуноглобулиновым сапным ЭД, полученным на основе антител специфических гипериммунных сывороток животных.

На этапе подбора производственного клона-продуцента МКА для изготовления сапного ЭД было установлено, что большинство исследованных типов МКА обладали различной степенью гемосенси-билизирующей активности в РИГА. Однако, более детальное изучение свойств моноклональных эритроцитарных препаратов в РИГА позволило сделать вывод, что гибрвдомой, отвечающей требованиям производственного клона, является 2G8, продуцирующая МКА класса IgU к термостабильной антигенной детерминанте клеточной стенки общей для P.mallei и P.pseudomallei.

В РНГА МКА 2GS проявляли высокую способность к адсорбции на поверхности тонизированных эритроцитов при низких показателях оптимальной геыосенсибкаизкрующей дозы МКА (250-500 мкг/на 1мл 2.5Z взвеси эритроцитов).

На основе МКА 208 были получены 5 серий диагностикуиа эритроцитарного иммуноглобулинового сапного ыонокгонального сухого, позволяющего выявлять в WA 5х105-3х10б м. к. /ил P.mallei и P.pseudomallei (30-50 нг белка для растворимых антигенов), не взаимодействующего с другими видами псевдоионад. В РНГА эритроцитарный диагностикум на основе МКА 2GB обеспечи-

вал обнаружение 93£ штаммов Р.mallei и 82% штаммов P.pseudo-mallei из коллекции живых культур ВолгНИПЧИ.

Результаты комиссионных испытаний сапного моноклонального эритроцитарного диагностикума подтвердили его высокую чувствительность и специфичность, способность обнаруживать в РИГА не более 1хюб м. к./мл. при исследовании чистых культур, п х10б м.к./мл в пробах из различных объектов внешней среды, а также пригодность для исследования суспензий органов биопробных животных. Отмечено, что по показателю чувствительности сапной зритроцитарный диагностикум на основе МКА 2G8 не уступал, а с рядом штаммов P.mallei и P.pseudomallel превосходил возможности поликлонального коммерческого сапного ЗД (табл.1)

Для Ь№А были разработаны препараты иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих мелиоидозных моноклональных двух типов, обеспечивающих специфическое свечение обоих видов патогенных псевдомонад или только возбудителя мелиоидоза в пробах из различных объектов исследования, обладающие высокой удельной активностью (титр/белок) и специфичностью.

На этапе отбора производственных типов МКА для изготовления группо- и видоспецифических флуоресцирующих иммуноглобулинов основным критерием являлся показатель спектра специфической активности и специфичности МКА-ФИТЦ в МЗА. В связи с этим, все экспериментальные образцы моноклональных препаратов оценивали в МЗ>А на иироком наборе типичных штаммов возбудителей са-

Таблица 1

Диапазон чувствительности диагностикумов эритроцитарных имму-ноглобулиновых сапных поли- и моноклональных в РИГА с музейными птаммами возбудителей сапа и мелиоидоза

Наименование иммуноглобу-линового препарата Количество штаммов 00, выявляемых в РИГА при концентрации бактерий (м.к./мл)

P.pseudomallel P.mallei

txlO5 4xl05 ÍXIO6 и более 1x10s 4x10s 1x10е. и более

моноклональ-НЫЙ сД 33 45 22 25 50 25

полкклональ-ный ЭД 5 48 47 0 33 62

-le-

na и мелиоидоза, близкородственных псевдомонад и гетераяогич-ных видов микроорганизмов, в том числе возбудителей особо опасных инфекций. Эти исследования позволили установить перспективность двух типов МКА 1F4 и 2А7 для последующего использования в качестве основы флуоресцирующих иммуноглобулинов.

МКА 1F4 (lg2b). конъюгированные с ФИТЦ, с высокой специфичностью выявляли в МФА до 76% типичных штаммов P.pseudomal-lei, а ФИТЦ- МКА 2А7 (Ig2b) обнаруживали 71% музейных штаммов Р.mallei и 75% P.pseudomallei. В MÍA моноклональные препараты (2А7 и 1F4) специфически окрашивали бактериальные клетки типичных и ряда генетически измененных вариантов P.pseudomallei 56770 (9 штаммов) . Полученные данные свидетельствовали о том, что выявляемые МКА антигенные детерминанты консервативны для данного вида микроорганизмов и подтверждали правильность выбора типов МКА для производства коммерческих препаратов (табл. 2).

Комиссионные испытания подтвердили эффективность использования моноклональных ФЙТЦ-конъюгатов (1F4 и 2А7) на этапах обнаружения патогенных псевдомонад в пробах из различных объектов исследования с помощью М$А. Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие мелиоидозные видоспецифические и общие моноклональные позволяли выявлять в КФА IxlO4 -5х104 м.к./мл при исследовании чистых культур возбудителей сапа и мелиоидоза. По спектру специфической активности в отношении P.pseudomallei моноклональные препараты превосходили коммерческие аналоги (табл.2). Иммунофлуоресцентный анализ с МКА-препаратами обеспечивал обнаружение возбудителей мелиоидоза и сапа в концентрации 5x1О5 -lxlO5 м.к./мл е пробах из объектов внешней среды (смывы с поверхностей предметов, пробы почвы, пыли), не давая перекрестных реакций с близкородственными и гетерологичными видами микроорганизмов. Результаты исследований в МФА свидетельствовали также о том, что моноклональные флуоресцирующие препараты нового поколения могут быть успешно использованы для поиска Р.mallei и_P.pseudomallei в мазках- отпечатках из органов и тканей зараженных животных. При исследовании мазков-отпечатков органов биопробкых животных, инфицированных различными дозами P.mallet 10230 и P.pseudomallei 97 и С-141 эффективность обнаружения микроорганизмов в различных органах и кров; животных зависела от заражающей дозы и сроков поэтапногс

Таблица 2

Определение спектра специфической активности имуноглобулинов диагностических флуоресцирующих мелиоидозных

Виды микроорганизмов Общее количество исследованных штаммов Процент положительных реакций с люминесцирующимя препаратами в МФА

поликлональ- ' ные группо-специфические моноклональ-ные группо-специфические поликлональ-ные видоспе-цифические моноклональ-ные видоспе-цифические

рабочее разведение

1:В С ,1:32 М 1:32 1:16 1:64

Р.та11е1 16 81 81 - -

Р.овеиск)-та11е1, по региональным группам: 1)вьетнамская 2) австралийская, 3)таиландская 4)другие регионы 5)инсерци-онные мутанты 61 24 17 10 10 9 72 79 53 90 70 100 75 83 41 90 100 100 67 75 35 100 70 100" 77 83 41 100 100 100

условно патогенные псевдомо-нзды (4 вида) 20

гетероло-гичные бактерии (14 видов) 17 -

Примечание:

- - отрицательный результат

* - генетически измененные варианты Р.рэеисктаПе! 55770.

вскрытия экспериментальных животных.

Таким образом, в процессе выполнения данного этапа работы на оснозе МКА были разработаны 3 препарата нового поколения

для экспресс-методов обнаружения возбудителей сала и мелиоидо-за (РИГА и №А). Технология их изготовления оформлена в виде первичной нормативно-технической документации, штаммы гибри-дом-продудентов МКА 1F4.2A6 и 2S3 депонированы в "Банке клеточных культур" института цитологии Российской АН (г.Санкт-Петербург) под регистрационными номерами ВСКК(П) 648Д, 649Д, 650Д. Штамм гибридомы, продуцирующей МКА 2А7, подготовлен к депонированию.

Начато мелкосерийное экспериментальное производство данных диагностических средств для нужд специализированных лабораторий, занимающихся санитарно-эпидемиологическим надзором за возбудителями особо опасных инфекций.

МКА Сьии использованы также для разработки иммунофермент-ной тест-системы. Установлено, что в ТИ4М МКА проявили себя, как высокоспецифичные ингредиенты в экспериментах по выявлении детерминант биополимера АГ8, одного из основных факторов пато-генности P.mallei и P.pseudomallei ( с м.м. 800 кД). На основе МКА 2А6, взаимодействующих с зпитопами, экспонированными на АГ8, была разработана иммуноферментная тест-система для обнаружения минимальных концентраций данного антигена в различных объектах исследования ( зкстрацеллюлярных антигенных смесях, фракциях, получаемых в процессе колоночной хроматографии зкстрацеллюлярных антигенов, бактериальных взвесях и средах культивирования P.mallei и P.pseudomallei). Иммуноферментная тест-система с МКА выявляла АГ8 в концентрации 0,5-5 нг/мл по белку (по Лоури), 0,37-3,7 нг/мл по полисахаридам (антроноЕым методом). .

Показана эффективность её использования для изучения культур псевдомонад по признаку продукции АГ8 с целью последующего отбора штаммов P.mallei и P.pseudomallei - продуцентов АГ8, признанного в настоящее время перспективным как одного из возможных компонентов химической вакцины.

Использование ЫКА в качестве ингредиентов прк постановке

серологических реакций

Преимущества применения МКА по сравнению с поликлональными иммуноглобулинами были подтверждены при их использовании в се-

рологических реакциях (РА, РИД) в качестве антительного компонента. Установлено, что МКА 2А7 и 1Е12 обладали способностью преципитировать АГ6 в иммунодиффузионных тестах и обеспечивали обнаружение 60-722 штаммов P.mallei и P.pseudomallei. Эти данные сопоставимы с результатами в МФА при исследовании чистых культур P.mallei и P.pseudomallei.

Эпитопы, распознаваемые указанными типами МКА, локализованы на консервативной термостайильной детерминанте, экспонированной на АГ6 с высокой частотой у большинства типичных штаммов P.mallei и P.pseudomallel. Широкий спектр специфической активности в отношении двух видов псевдомонад, отсутствие перекрестных реакций в РИД с близкородственными псевдомонадами и гетерологичными видами микроорганизмов явились основанием для рекомендаций об использовании РИД с МКА 2А7 и 1Е12 в качестве дополнительного высокоспецифичного теста идентификации бактерий сапа и мелиовдоза на этапе выделения чистой культуры. Эта простая в постановке и учете серологическая реакция вполне доступна любой практической лаборатории.

Кроме того, из набора прецгаитирующих МКА были отобраны два типа МКА к детерминантам АГ8 (МКА 2А6, 2Н7). Установлено, что до 30-312 птаммов P.mallei и P.pseudomallei АГ8 может быть ьыявлен уке на этапе идентификации чистой культуры микроорганизма, то есть до момента подращивания бактерий в жидких питательных средах с использованием более чувствительных методов детекции АГ8, например, ТШ< (табл.3).

Для'идентификация P.mallei и P.pseudomallei на этапе выделения колоний микроорганизмов установлена возможность проведения РА с МКА данного набора. Определены составы смесей МКА из двух и трех типов антител, не конкурирующих за сайты связывания на антигенной комплексе бактерий, для постановки РА на стекле. Использование предложенных смесей МКА ( аналога полик-.Еонагыюй агглютинирующей специфической сыворотки) позволяло быстро и надежно идентифицировать в РА оба ввда патогенных псевдо!Жзнад (табл.4).

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о той, что различные типы МКА к консервативным термостабильным детерминантам АГ6 и АГ8, экспрессированным с высокой плот-

Таблица 3

Эффективность использования РИД с МКА для идентификации возбудителя мелиоидоза и сапа

Название вида микроорганизма Общее количес тво исследованных штаммов Процент выявляемых штаммов в РИД с МКА

1Е12 2А7 2А6 2Н7

P.pseudomallei, по региональным группам: 1)вьетнамская, 2)австралийская 3)таиландская, 4)др. регионы 61 24 17 10 10 72 70 30 100 100 71 79 30 100 90 34 46 35 10 40 28 33 30 0 40

P.mallei 15 53 67 0 0

Условно патоген ные псевдомонады (4 видов) 15 0 . 0 0 0

ностью у большинства типичных штаммов P.mallei и P.pseudomallei, являются высокоспецифичными и активными диагностическими реагентами для обнаружения возбудителей сапа и мелиоидоза в серологических методах исследования (ШМ,РНГА.М5А,РИД,РА), Использование стабильных клеточных линий, способных к неограниченному росту in vitro, продуцирующих гомогеные по составу и свойствам специфические МКА, обеспечивает получение стандартных диагностических препаратов для современных серологических методов, повышает специфичность анализа, устраняет фоновые реакции, присущие поликлональным сывороткам, увеличивает вероятность обнаружения микроорганизмов в пробах из объектов внешней среды и клиническом материале.

Иммунодиагностические препараты, полученные на их основе, стандартны и превосходят по параметрам качества (специфической активности) поликлональные препараты для индикации и идентификации P.mallei и P.pseudomallei в РИГА и М5А.

Таблица 4

Эффективность использования МКА и их смесей в РА на стекле с P.mallel и P.pseudomallei

МКА и их смеси Результаты в РА на стекле

P.pseudomallei P.malleí

56770 57576 132 10230

1Е10 + + •ь +

2Н7 - - - -

2А6 - - - -

2А8 - - - -

1F10 - - - -

2G2 - - - -

1Е12 - - - -

2Н7 + 1F5 + _ + +

2Н7 + 1Е12 + + - +

2А6 + 1F4 + + + +

2А6 + 1G2 + + + -

2А6 + 1Е12 + 2А8 + + + +

2А6 + 1Е5 + 2А8 + + + +

1Е12 + 1F4 + + - +

1Е10 + 2А6 + + +

поликлональная козья сыворотка ¿574 + + + +

Примечание:

+ - мелкохлопчатая агглютинация в течение 3-5 мин - - отрицательный результат в РА на стекле

Результаты исследований подтверждают данные о том, что специфические МКА при рациональном подборе являются полноценной заменой поликлональных сывороток в серологических методах и открывают новые перспективы совершенствования имыунодиагнос-тических препаратов.

вывода

1) Оптимизированы основные методические приемы технологии получения стабильных гибридом-продуцентов моноклональных антител к антигенам возбудителей сапа и мелиоидоза: Получен' набор из 14 типов МКА к разнообразным термостабильным антигенным де-терминанатам P.mallet и P.pseudomallei.

2) Установлено, что использование сапных и мелиоидозных МКА в качестве ингредиентов при постановке серологических реакций (РА,РИД) и основы для конструирования иммунодиагности-

ческих препаратов повышает эффективность исследований, направленных на обнаружение и идентификацию возбудителей сапа и мелиоидоза.

3) Впервые предложен диагностику эритроцитарныи иммуног-лобулиновый сапной ыоноклональный , обеспечивающий обнаружение в РИГА 5хЮ5-1х10б м.к./мл возбудителей сапа к мелиоидоза в различных объектах исследования. Разработана технология изготовления стандартного диагностикума эритроцитарного иммуногло-булинового сапного моноклонального мышиного сухого с группос-пецифическими свойствами, не уступающего по параметрам качества коммерческому поликлональному сапному эритроцитарному диаг-ностикуму.

4) Разработана технология изготовления препарата монок-лональных ЛИГ с группоспецифическими свойствами, применяемых на этапах обнаружения и идентификации P.mallei и P.pseudomal-lei. Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие мелиои-дозкые общие мококлональкые мышиные сухие позволяют выявлять в Шк 1х104-5х104 м.к./мл при исследовании чистых культур возбудителей сапа и мелиовдоаа и 5хЮ5 -1х10б м.к./мл в пробах из объектов внешней среды.

5) Разработана технология изготовления вкдоспецифических монокдональкых ЛИГ нового поколения для обнаружения и идентификации P.pseudomallei в различных объектах исследования с помощью MS А.

6) Ш( с использованием МКА является высокоэффективным методом обнаружения АГ8, одного из основных факторов патоген-ности возбудителей сапа и мелиоидоза. Разработанная иммунофер-ментная тест-система выявляет АГ8 в концентрации 0,5-5 нг/мл по белку и 0,37-3,7 нг/мл по полисахариду.

7) Полученные преципитирующие МКА (2А7.1Е12) обеспечивают обнаружение до 72Х штаммов P.mallei и P.pseudomallei и могут быть рекомендованы для применения в РИД на этапе идентификации чистых культур.возбудителей сапа и мелиоидоза.

8) Смеси МКА являются адекватной заменой поликлональных агглютинирующих специфических.сывороток при постановке РА на этапе идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза.

СПЙСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Смирнова В.И., Храпова H.H., Пивень H.H., Прохватилова Е.В., Подзолкова Г.Г. Выделение поверхностных антигенов P.Pse-udomallei методом аффинной хроматографии с использованием мо-ноклонаяьных антител// Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций: Матер.Рос.науч.конф.- Волгоград, 1992.-С.129.

2. Храпова H.H., Смирнова В.И., Пивень H.H., Прохватилова £,В, Способ выделения Аг8 возбудителя мелиовдоза//Патент на изобретение N 2004.251, март 1994.

3. Храпова Н.П., Смирнова В.И., Пивень H.H., Прохватилова Е.В. Способ выделения Агб возбудителя мелиоидоза// Патент на изобретение N 2004250, март 1994.

4. Прохватилова Е.В., Храпова Н.П. Сапные и мелиоидозные МКА как основа для создания иммунодиагностических средств//Ин-формационный бюллетень.-Саратов, 1994.-Вып.З.-С.38-39.

5. Храпова Н.П., Прохватилова Е.В., Тихонов Н.Г., Кулаков М.Я., Нарбутсвич Н.И. Перспективы расширения перечня монокло-нальпых средств для обнаружения и идентификации возбудителей сапа ,и мелиоидоза//Актуальные проблемы разработки медицинских средств и методов сохранения и восстановления боеспособности личного состава Вооруженных Сил:Тез.докл. научно-практич. конф., посвященной 25-летим со дня основания НИИ военной медицины МО ЯФ (29-30 сентября,1994).-С-Пегербург,1994.- С.134-135.

6. Кулаков М.Я., Храпова Н.П., Прохватилова Е.В. Монокло-нальный сапной эритроцитарный диагностикуы// Идеи И.И.Мечникова и развитие современного естествознания: Тез.докл.междуна-род.науч. конф., посвященной 150-летию со дня рождения И.И.Мечникова.-Харьков,1995.-С.176-177.

7. Ахмедов-А.Н., Прохватилова Е.В., Храпова Н.П. Использование моноклональных антител в качестве сырья при конструировании сапных и мелиоидозныхиммуноферментных тест-систем// Идеи И.И.Мечникова и развитие современного естествознания: Тез. докл. между народ, науч. конф., посвященной'150-летию со дня рождения И.И.Мечникова.-Харьков,1995.-С.12-13.

8. Храпова Н.П., Прохватилова Е.В. Использование конкурентного ТИФМ с МКА для эпитопного анализа антигенов возбудителей сапа и мелиоидоза// Идеи И.И.Мечникова и развитие совре-

менного естествознания: Тез.докл.международ.науч. конф., посвященной 150-летим со дня рождения И.И.Мечникова.-Харьков, 1995.-С.333-334.

9. Хралова Н.П., Тихонов Н.Г., Рыбкин B.C., Липницкий A.B., Яковлев А.Т., Кулаков М.Я., Новицкая И.В., Ахмедов А.Н., Прохватилова Е.В.. Иммунологическая диагностика мелиоидоеа// Мелиоидоз /Под ред.д.м.к., проф. академика РЭА Н.Г.Тихонова: Сб. науч. трудов; Волгогр. н.-и.противочум. ш-т.-Волгоград: Нижне-Волжское книжное издательство, 1995.-С.57-68.

10. Хралова Н.П., Тихонов Н.Г., Прохватилова Е.В., Кулаков М.Я. Перспективы совершенствования иммуноглобулиновых препаратов для обнаружения и идентификации возбудителей сала и мели-оидоза// Мед. паразитол. и паразитар. болезни-1995.-N 4.-С.49-53.

11. Хралова Н.П., Тихонов Н.Г., Прохватилова Е.В. Нарбуто-, вич Н.И., Ломова Л,В. Эффективность использования РИЛ с МКА для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза // Зколо-го--эпидемиологический надзор за природно-очаговыми инфекциями в Северном Прикаспии.-Астрахань,1996.-С.152-153.

12. Хралова Н. П., Прохватилова Е. В., Меринова Л. К., Тимофеева Е.В. Серологические исследования генетически измененных вариантов.мелиовдозных бактерий с помощью МКА // Эколого-эпидемиологический надзор за природно-очаговыми инфекциями в Северном Прикаспии.-Астрахань,1996.-С.149.

13. Прохватилова Е. В., Хралова Н.П. О получении монокло-нальных люминесцирующих иммуноглобулинов для обнаружения воз-' будителя мелиоидоза// Эколого-эпидемиологический надзор за природно-очаговыми инфекциями в Северном Прикаспии.-Астрахань, 1996. -С. 147.

14. Кулаков М.Я., Прохватилова Е.В., Хралова Н.П. Монокло-нальный эритроцитарный диагностикум для обнаружения возбудителей сапа и мелиоидоза// Эколого-эпидемиологический надзор за прирадно-очаговымй инфекциями в Северном Прикаспии.-Астрахань ,1996. -С. 146.