Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Моноклональные антитела к антигенам мембран жировых глобул женского молока и их использование при морфологическом исследовании опухолей человека

Г Г Б ОД 2 3 ВИЗ ¡^

на правах рукописи

Кармакова Татьяна Анатольевна

МОНОКЛОНАЛЪНЫЕ АНТИТЕЛА К АНТИГЕНАМ МЕМБРАН ЖИРОВЫХ ГЛОБУЛ ЖЕНСКОГО МОЛОКА И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПРИ МОРФОЛОГИЧЕСКОМ ИССЛЕДОВАНИИ ОПУХОЛЕЙ ЧЕЛОВЕКА

(14.00.14-онкология, 14.00.15-патологическая анатомия)

АВТОРЕФЕРЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г. Москва - 1996 г.

Работа выполнена в Московском научно-исследовательском онкологическом институте им. П.А.Герцена МЗ и МП РФ (директор -академик РАМН, профессор В.И.Чиссов)

Научные руководители:

доктор биологических наук Р.И.Якубовская

доктор медицинских наук , профессор Г.А.Франк

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Ю.С.Татаринов

доктор медицинских наук, профессор Н.Т.Райхлин

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт морфологии человека, РАМН

Защита состоится в 14 ч. 20 февраля 1996 г. на заседании диссертационного совета при МНИОИ им. П. А. Гер цена МЗ и МП РФ по адресу 125284, г.Москва, 2-й Боткинский проезд, д.З.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке МНИОИ им.П.А.Герцена МЗ и МП РФ.

Автореферат разослан 18 января 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор И.А.Максимов

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы. Современным направлением в разработке новых подходов к решению проблем, связанных со злокачественными новообразованиями, являются исследования с применением моноклональных антител (МКАТ). МКАТ сегодня стали одним из основных инструментов в работе с клеточной культурой, морфологическим материалом, биологическими жидкостями. Применение МКАТ, полученных к антигенам различной специфичности, позволило значительно расширить представления о механизмах канцерогенеза и опухолевой прогрессии [Herlyn М. et al.,1990; Manzo G.,1991]. Широко изучаются возможности использования МКАТ для решения диагностических задач в клинике [Глузман Д.Ф. и др.,1993; Goldenberg D.M., 1993].

Рак молочной железы (РМЖ) - одно из самых распространенных онкологических заболеваний среди женщин. Современные исследования РМЖ все шире привлекают различные методы иммуно-химического анализа [Sterns Е.Е., 1989, Ciambellotti Е., 1993].

Уникальным источником антигенов молочной железы (МЖ) являются жировые глобулы женского молока, так как формирующая их мембрана представляют собой производное от апикальной мембраны секреторной клетки. Среди известных мембранных антигенов МЖ особый интерес представляют высокомолекулярные гликопро-теиды поверхностной мембраны -муцины [Cowaliere А., 1989].

Углеводные антигены муцинов высоко специфичны для эпителия. В норме они выявляются только в апикальной мембране клеток. Изменение внутриклеточного распределения муцинов, как и ряда других мембранных антигенов, ассоциировано со злокачественной трансформацией клеток эпителия. Экспрессия отдельных антигенов муцинов коррелирует с биологическими свойствами опухолевых клеток.

Антитела к антигенам муцинов могут быть использованы при морфологическом исследовании для уточнения гистогенеза новообразований, для поиска злокачественных клеток РМЖ в серозных экссудатах, костном мозге, лимфатических узлах [Абраменко И.В., 1991]; при серологическом мониторинге для раннего выявления прогрессии заболевания [ Bombardiert Е.,1992]. На основе МКАТ к антигенам муцинов разрабатываются методы иммунодетекции РМЖ и рака яичника in vivo, а также методы направленного транспорта к опухоли лекарственных соединений [Goldenberg D.M., 1992; 1993].

За рубежом известно множество МКАТ к антигенам нормальной и опухолевой ткани МЖ [Sterns Е.Е., 1989]. На основе ряда МКАТ созданы иммунохимические системы, которые выпускаются в виде коммерческих реагентов. В нашей стране масштаб подобных исследований ограничен. В то же время приобретение днагностику-мов за рубежом, ввиду их высокой стоимости, проблематично. Таким образом, получение МКАТ к опухоль-ассоциированным антигенам и разработка на их основе методов исследования РМЖ, является актуальным направлением в развитии отечественной онкологии.

Использование для иммунизации животных интактных МЖГ, а также частично очищенных мембранных фракций значительно увеличивает объем работы по тестированию гибридом и выявлению перспективных клонов. Делипидирование мембран в органических растворителях и фиксация их формалином не исключает возможности повреждения антигенных детерминант. В большинстве исследований также отсутствуют сведения о природе и свойствах антигенов, которые узнаются полученными МКАТ, что затрудняет воспроизведение и сравнительный анализ результатов, обобщение огромного фактического материала. Таким образом, целесообразным было получение высокоочищенных антигенных препаратов МЖГ, что позволит получить антитела к конкретным охарактеризованным антигенам.

Цели и задачи исследования.

Целью данного исследования являлось получение МКАТ к антигенам поверхностных мембран клегок молочной железы и их им-муноморфологическое изучение.

Для ее достижения поставлены следующие задачи:

1. Разработка метода получения нативных высокоочищенных препаратов антигенных фракций из мембран жировых глобул (МЖГ) женского молока.

2. Физико-химическая и иммунохимическая характеристика полученных антигенов.

3. Получение поликлональных и моноклональных антител к антигенам МЖГ и их характеристика.

4. Изучение специфичности полученных МКАТ на нормальных тканях и клетках человека.

5. Изучение взаимодействия полученных МКАТ с тканями и клетками злокачественных опухолей человека.

6. Изучение распределения антигенов МЖГ в тканях молочной железы при доброкачественой и злокачественной патологии.

Научная новизна работы. В ходе исследования был разработан оригинальный метод выделения антигенов из МЖГ женского молока и изучены физико- и иммунохимические свойства полученных антигенов: интегрального мембранного гликопротеида АГЗ и высокомолекулярного эпителиального гликолипопротевда АГ4. Для получения гибридом использованы антигены АГЗ и АГ4, выделенные в высо-коочищенном состоянии. МКАТ, полученные к антигену АГЗ ( ги-бридомы ИК021, ИК026, ИК029) и к антигену АГ4 (гибридомы ИК022, ИК025) типированы на широком спектре нормальных тканей взрослого человека и тканей злокачественных новообразований различной локализации. Охарактеризовано новое моноклональное антитело ИК025 к муциноподобному эпителиальному антигену, аналогу полиморфного эпителиального муцина. На основе моно-клонального антитела ИК025 разработана тест-система для выявления АГ4 на гистологическом и цитологическом материале. Впервые с использованием данной тест-системы изучена экспрессия антигена АГ4 в тканях эмбриона, а также в тканях молочной железы при доброкачественных и злокачественных патологических изменениях. Практическое значение. Разработанные на основе МКАТ ИК025 иммунохимические тест-системы могут быть использованы в морфологических исследованиях при изучении процессов злокачественной трансформации в эпителии, для уточняющей дифференциальной диагностики злокачественных опухолей эпителиального и неэпителиального генеза, поиска метастазов антиген-содержащих карцином в лимфатических узлах, костном мозге и других органах, во внутриполостных экссудатах. Специфичность МКАТ ИК025, высокий уровень экспрессии АГ4 клетками РМЖ, яичника, легкого, принадлежность МКАТ ИК025 к классу ^С, делает эти антитела пригодными для создания на их основе препаратов направленного транспорта.

Внедрение результатов работы. Иммунохимический метод с использованием МКАТ ИК025 применяется в иммуноморфологических исследованиях в МНИОИ им. П.А.Герцена, Онкологическом науч-

ном центре РАМН, на кафедре онкологии Астраханского медицинского института.

Диссертация апробирована на семинаре лаборатории модификаторов протекторов противоопухолевой терапии. Основные результаты работы были доложены на 1-й Московской научно-практической конференции молодых ученых (Москва-Обнинск, 1990 г.); на XXX конференции молодых ученых "Актуальные вопросы комбинированного комплексного лечения злокачественных опухолей" (Москва, 1994 г.), на Международном Симпозиуме "Современные тенденци в вирусологии и иммунологии опухолей" (Москва, 1994 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, получено авторское свидетельство на изобретение (A.C.N 1698287 "Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus L. - продуцент моноклонального антитела к антигену мембран жировых глобул женского молока"). Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, разделов "Материалы и методы", "Результаты" (состоящего из 6 глав), "Обсуждение", выводов и списка литературы. Работа изложена на 128 страницах машинописного текста, иллюстрирована 11 таблицами и 21 рисунком. Список литературы содержит 198 источников, в том числе 25 на русском языке.

Материалы и методы.

Объектом исследования служили: женское молоко начальных сроков лактации, полученное из родильных домов г.Москвы; ау-топсийный материал (нормальные дефинитивные (п=540) и эмбриональные (n= 120) ткани человека); операционный материал (ткани опухолей человека, п=1240); мазки-соскобы и мазки пункционного материала, (п=800); сыворотка крови онкологических больных и здоровых доноров (п=10); асцитическая жидкость и плевральный экссудат, полученные у онкологических больных (п=5). Для морфологических исследований использовали гистологический материал архивов лабораторий патоморфологии МНИОИ им. Герцена и ОНЦ РАМН, а также материал, приготовленный самостоятельно. Гистологическая форма опухолей верифицирована по Международной классификации ВОЗ 1981 г.

Антигены получали фракционированием женского молока и гомогенизированных тканей РМЖ методом дифференциального центрифу-

гирования. Во фракциях определяли антигенную активность методом иммунодиффузии по Оухтерлони. Относительный молекулярный вес компонентов методом электрофореза по Weber в 7,5% ПААГ и методом иммуноблота на приборах Multiphor II и Multiphor II NovaBlot ("LKB", Швеция). Природу разделяемых компонентов устанавливали окрашиванием специфическими красителями на белки (Кумасси R-250), на гликопротеиды (ШИК-реакция) и на липвды (судан черный). Для очистки антигенов использовали методы гель-фильтрации на се-фадексе G-50 и иммуноаффинной негативной хроматографии на иммобилизованных анителах к антигенам АГЗ, АГ14 и лактоферрину. Препаративное изоэлектрофокусирования проводили на колонке с использованием амфолинов ("LKB", Швеция) в градиенте плотности сахарозы (50-45%).

Чувствительность антигенных детерминант к действию ферментов устанавливали по изменению титра антигенов в методе иммунодиффузии и титра антител в методе иммуногистохимии.

Получение антител. Для иммунизации животных использовали высокоочищенные препараты антигенов МЖГ. Гибридомы получены методом соматической гибридизации спленоцитов иммунизированных мышей с клетками мышиной миеломы P3X63Ag8.653. Отбор антисывороток, гибридом - продуцентов и асцитов от мышей с привитыми гибридомными клетками осуществляли методами иммуноферментного анализа и иммуногистохимического тестирования. Получение высоко-очищенных препаратов поликлональных кроличьих и моноклональ-ных мышиных антител осуществляли осаждением хлористым аммонием, ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлголозе с последующей гель-фильтрацией на сефадексе G-200, а также иммуноаффинной хроматографией на иммобилизованном мембранном антигене АГЗ.

Для получения иммуноаффинных сорбентов антигены и поликло-нальные антитела иммобилизировали на сефарозе-4В конъюгацией бромциановым методом.

Иммуноферментный анализ проводили по двум модификациям: микро-методом на фиксированных глутаровым альдегидом МЖГ и макро-методом в полистироловых плашках ( г.Ленинград). В качестве вторичных антител использовали ттоликлоиальные антитела меченые пероксидазой хрена: ослиные, против иммуноглобулинов кролика и кроличьи, против иммуноглобулинов мыши (пр-во МНИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи).

Иммуиоморфологические исследования проводили прямым и непрямым методами иммунохимического анализа на парафиновых, криостатных срезах и на мазках с применением как иммунофлурес-центного, так и иммунопероксидазного вариантов анализа. В качестве вторичных антител использовали поликлональные антитела, меченые флуоресцеином (ФИТЦ) и пероксидазой из хрена, (пр-во МНИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи). В прямом методе анализа использовали МКАТ, меченные ФИТЦ (НПО "Биотехнология") и МКАТ, коныогированные с пероксидазой из хрена, полученые перийодатным методом (лабораторный препарат, МНИОИ им.П.А.Герцена). Анализ проводили на микроскопе "Ахюр1ап" ("Орит", Германия)

Результаты и их обсуждение Получение антигенов из мембран жировых глобул. Мембранные антигены эпителиальных клеток МЖ выделяли из мембран жировых глобул женского молока. На первом этапе проводили ступенчатое фракционирование молока с поэтапной солюбилизацией МЖГ агентами с повышающимся хаторопным действием. Разрушение мембран завершали ультразвуком. Выделение проводили при 4°С; при физиологических значения рН растворов с добавлением контрикала и с-аминокапроновой кислоты; мембранный матрикс солюбилизировали неионным детергентом Тритоном Х-100. Это позволило выделить относительно гомогенные фракции МЖГ и максимально сохранить на-тивность выделяемых компонентов

К очищенным фракциям получены антисыворотки, с помощью которых во фракциях, содержащих интегральные компоненты МЖГ, были идентифицированы два основных антигена - АГЗ и АГ4. Имму-нодиффузионный анализ показал, что данные антигены определяются только в мембранных фракциях МЖГ человека, характеризуются видо-специфичностью. Антигены выявлены в цитозольной и мембранной фракциях тканей РМЖ, рака яичника, рака желудка, рака легкого, в плевральной и асцитической жидкости больных РМЖ и раком яичников.

Очистка антигена АГЗ включала 4 основных этапа: солюбилиза-цию МЖГ 1% Тритоном Х-100; препаративное изоэлектрофокусирова-ние в градиенте рН 3,0-10,0 в присутствии 1% Тритона Х-100; гель-фильтрацию в присутствии 1% Тритона Х-100; негативную иммуноаф-финную хроматографию на иммобилизованных антителах к лакто-феррину и АГ14.

Для получения высокоочищенного антигена АГ4 МЖГ солюби-лизировали 1% Тритоном Х-100 и обрабатывали ультразвуком; растворимые компоненты осаждали раствором сульфатом аммония до 30% насыщения; с последущим изоэлектрофокусированием в присутствии 1% Тритона Х-100 в градиенте рН 3,5-5,0 и иммуноаффинной негативной хроматографией на сорбентах с антителами к антигенам АГЗ, лактоферрину и АГ14.

Препараты очищенных антигенов были изучены с использованием методов физико-, био-, и иммунохимического анализов. Полученные характеристики антигенов представлены в таблице 1.

Таблица 1. Свойства антигенов МЖГ.

Свойства АГЗ АГ4

Относит, молекулярная масса (электрофорез в ПААГ, имму-ноблотт) 825001200 О более 250000 Б

Окрашивание специфическим!! реактивами на белки (Кумасси И,-250), гликопротеиды (ШИК-реакция) на липнды (судан черный) + + +-+ +

Изоэлектрическая точка р1 3,6 -3,8, р1 3,38-4,09.

Термостабильность (по имунохимической активности) утрачивается при прогревании в течение 5 минут при 80°С утрачивается после 15-минутного кипячения

Чувствительность к действию ферментов: (по иммунохимической активности) проназа трипсин нейраминидаза липаза чувствителен чувствителен не влияет не влияет не влияет не влияет чувствителен не влияет

Получение и характеристика антител. К высокоочищенным антигенам АГЗ и АГ4 получены поликлональные антитела (ПКАТЗ и ПКАТ4 соответственно). В патологически неизмененной ткани ПКАТЗ реагировали с эпителием МЖ, трахеи, бронха и яичника, а также с клетками эндотелия. ПКАТ4 реагировали с ацинусами и протоками МЖ, эпителием подчелюстной железы, дистальных канальцев почки и железам подслизистого слоя пищевода. Ткани других органов не окраши-

вались специфической реакцией. Антитела не взаимодействовали со стромальными элементами, мышечной тканью и клетками крови.

В опухолевых тканях антигены АГЗ и АГ4 выялялись в подавляющем числе случаев в первичных и метастатических очагах РМЖ (24 из 25 и 28 из 28 случаев соответственно), а также в аденокарциномах яичника (5/7 и 6/7), легкого (7/16 и 6/11), желудка (10/16 и 3/7), толстой кишки (6/6 и 3/4). В отличие от клеток нормального и доброкачественно измененного эпителия, где антигены АГЗ и АГ4 локализовались по апикальному краю, в опухолевой ткани реакция распространялась на всю мембрану клеток и/или цитоплазму. Таким образом, выделенные мембранные антигены представляли интерес для их изучения в тканях злокачественных новообразований.

Задачей следующего этапа являлось получение моноклональных антител. Совместно с академиком РАБН, проф. А.Ю.Барышниковым (ОНЦ РАМН) к очищенным препаратам АГЗ и АГ4 получены мышиные моноклональные антитела. В результате скрининга гибридом-продуцентов были отобраны 3 клеточные линии с относительно высокой продукцией специфических антител: к антигену АГЗ, обозначенные как ИК021, ИК026 и ИК029, а также 2 клеточные линии, продуцирующие антитела к антигену АГ4 - ИК022 ,ИК025. МКАТ, продуцируемые гибридомами ИК021, ИК022, ИК026 и ИК029 относятся к классу ^М, антитела ИК025 - к классу

Полученные МКАТ охарактеризованы методами иммуногиегго-химического анализа на образцах нормальных тканей органов нервной, сердечно-сосудистой, пищеварительной, дыхательной, выделительной, половой, кроветворной систем, кожных покровов, а также клетках крови человека.

Все полученные МКАТ взаимодействовали с клетками железистого эпителия МЖ и ряда других нормальных тканей. Антитела, выявляющие АГЗ, помимо эпителия взаимодействовали с эпидермисом (ИК021), с клетками эндотелия и нефиксированными клетками крови (ИК021, 26, 29). Антиген АГ4 (МКАТ ИК022 и 25) оказался специфичным относительно эпителия.

МКАТ ИК022, 26 и 29 обладали более узким спектром взаимодействия с нормальными тканями , что скорее всего связано с низким титром специфических антител в исследуемых препаратах. Так, МКАТ ИК022 реагировали только с эпителием МЖ, бронхов, эпителием проксимальных канальцев почек. МКАТ ИК026 и 29 реагировали

Таблица 2. Взаимодействие МКАТ ИК021 и ИК025 с нормальными тканями взрослого человека (иммуногистохнмическое исследование)

Органы и ткани Реакция с МКА

ИК021 ИК025

Молочная железа ацинусы + +

протоки + +

Слюнные железы серозные ацинусы + -

протоки + +

Язык многослойный плоский эпит. н\о -

железы н\о +

Пищевод многослойный плоский эпит. - -

железы - +

Желудок покровный эпителий + -

железы + +

Тонкая кишка цилиндрический эпителий + -

дуоденальные железы + +

Толстая кишка цилиндрический эпителий + -

Прямая кишка цилиндрический эпителий + -

Поджелудочная же ацинусы - -

леза протоки + +

Печень желчные протоки - +

Легкие цилиндрический эпит.бронхов + -

серозные ацинусы брон. желез - +

протоки бронхиал.желез - +

альвеолярный эпителий +

Трахея цилиндрический эпителий +

железы +

Почка проксимальные канальцы + -

дистальные канальцы +

собирательные трубочки +

клубочки

Моч. пузырь переходный эпителий н\о +

Яичник поверхностный эпителий + -

интерстиции + -

Матка многосл. плоский эпит. шейки + -

цилиндр, эпит. эндометрия - +

цилиндр, эпит.маточных труб - +

Щитовидная железа фолликулярный эпителий н\о +

Кожа эпидермис + -

потовые железы

сальные железы

Другие органы и ткани** - -

**мезотелий брюшины, плевры, покровный эпителий полости рта, гортани, яичко, клетки и волокна соединительной ткани, скелетная, гладкая и сердечная мышцы, мозг, мозжечок, селезенка, лимфатические узлы, миндалины, аппендикс.

с эпителием МЖ, бронха, слюнных желез, почечных канальцев.

Наиболее высоким титром антител характеризовались гибридомы ИК021 и ИК025, что позволило получить более полную характеристику этих антител. Как видно из данных иммуногистохимического исследования, представленных в таблице 2, МКАТ ИК021 реагировали с эпителием различных типов: однослойным и многослойным, в том числе железистым. В клетках поверхностного эпителия яичников и эпидермиса антиген АГЗ выявлялся в цитоплазме, в то время как в клетках покровного цилиндрического эпителия органов желудочно-кишечного тракта, дыхательной системы, почечном эпителии, ацинусах и протоках желез выкрашивалась только апикальная мембрана клеток.

Реакция с МКАТ ИК025 наблюдалась преимущественно в клетках однослойного эпителия, обладающег о секреторной активностью. При этом антиген локализовался в апикальной мембране клеток ацину-сов и протоков, что косвенно свидетельствовало об отношении АГ4 к секреторной функции эпителия.

Изучение взаимодействия полученных МКАТ с тканями злокачественных новообразований человека показало, что антигены АГЗ и АГ4 сохраняются при малигнизации МЖ и выявляются в клетках злокачественных опухолей других локализаций (табл. 3).

Таблица 3 . Иммунохимическая реакция с МКАТ к антигенам МЖГ в тканях злокачественных опухолей человека.

Реакция с антителами

(число положительных случаев/

Опухоли общее число исследованных случаев)

ИК021 ИК026 ИК029 ИК022 ИК025

РМЖ (первичные) 3+ (15/15) 2+ (10/15) 2+(10/15) 3+ (15/15) 3+(15/15)

РМЖ (метастазы) 3+ (10/10) 2+ (6/6) 2+ (3/6) 3+ (6/6) 3+ (3/6)

АК желудка 1+ (6/6) 2+ (1/6) 2+ (2/6) 1+(3/6) 3+ (5/6)

АК толстой кишки - (0/2) - (0/2) - (0/2) - (0/2) 2+ (2/2)

ПР легкого - (2/2) - (0/2) - (0/2) - (0/2) 3+ (2/2)

АК яичника 3+ (9/9)" 2+ (7/9) 2+ (7/9) 2+ (9/9) 3+ (9/9)

АК матки 1+ (2/2) н/о 1+ (1/2) +- (2/2) 2+ (2/2)

АК слюнной жел. - (0/2) - (0/2) - (0/2) - (0/2) 1 + (2/2)

Остеогенная сарком - (0/2) - (0/2) - (0/2) - (0/2) - (0/2)

Хондросаркома - (0/2) - (0/2) - (0/2) - (0/2) - (0/2)

Лимфогранулематоз - (0/2) - (0/2) - (0/2) - (0/2) - (0/2)

АК- аденокарцинома; ПР - плоскоклеточный рак. Интенсивность реакции: 3+ интенсивная реакция в большинстве клеток; 2+ гетерогенное и умеренное по силе окрашивание более чем в половине клеток; 1+ умеренная реакция в немногочисленных клетках; +- слабая реакция в единичных клетках; - отсутствие реакции.

В новообразованиях неэпителиального происхождения реакции с МКАТ не наблюдали. В отличие от клеток нормальных тканей, в клетках большинства изученных опухолей специфическое окрашивание локализовалось по всей поверхностной мембране и в цитоплазме.

Полученные данные свидетельствовали о перспективности более детального изучения МКАТ ИК025. Это антитело специфично взаимодействовало с эпителием, АГ4 с высокой частотой экспрессировался в клетках РМЖ и других злокачественных опухолей, содержание его в неоплазиях, как правило, значительно превышало соответствующий уровень в нормальной ткани, раковые клетки отличались от нормальных по внутриклеточной локализации антигена. Кроме того, высокая продукция антител гибридомными клетками позволяла избежать возможных ошибок, связанных с чувствительностью иммунохимического метода.

МКАТ ИК025 не имеет полных аналогов по характеру распределения иммунохимической реакции в тканях. Однако, сопоставление полученных результатов с данными литературы дало основания для предположения, что МКАТ ИК025 взаимодействует с муциноподоб-ным соединением - РЕМ (polymorphic epithelial mucin), который в настоящее время привлекает особое внимание исследователей как опу-холь-ассоциированный антиген.

Иммуноморфологичсское исследование нормальных и опухолевых тканей человека с применением МКАТ ИК025.

Тест-система для иммуноморфологического исследования.

АГ4 сохраняется при стандартной фиксации тканей 10% формалином и по Карнуа, при фиксации криостатных срезов ацетоном и 96% этанолом. Наилучший результат фиксации мазков для выявления в них АГ4 был получен при фиксации 96% этанолом в течение 5 мин.

В результате сочетания различных концентраций реагирующих компонентов была выведена стандартная тест-система, пригодная для работы как с гистологическим, так и с цитологическим материалом.

При помощи выведенной тест-системы проведено иммуноморфологическое изучение различных тканей человека.

Взаимодействие МКАТ ИК025 с тканями эмбриона человека, распределение АГ4 в тканях взрослого человека и эмбриона в целом было сходно. Однако, отмечен ряд различий. Так, в отличие от соответствующей дефинитивной ткани, в кишечнике эмбриона МКАТ ИК025 взамодействовали с апикальной мембраной клеток цилиндри-

ческого эпителия в основании ворсинок. Эпителий протоков слюнной, щитовидной и поджелудочной желез, мочевого пузыря эмбриона, в отличие от эпителия соответствующих дефинитивных органов, был негативен по реакции с МКАТ. В эмбриональном легком специфически окрашивались клетки реснитчатого эпителия бронхов и края альвеолярных структур, в то время как в легком взрослого человека МКАТ взаимодействовали только с мембраной пневмоцитов II типа и с апикальной мембраной клеток серозных ацинусов и протоков бронхаль-ных желез. Различия в характере взаимодействия тканей взрослого человека и эмбриона с антителами МКАТ ИК025, свидетельствовали об изменении экспрессии антигена АГ4 в процессе дифференцировки эпителия ряда органов.

Взаимодействие МКАТ ИК025 с тканями злокачественных новообразований. МКАТ ИК025 взаимодействовали с подавляющим большинством изученных злокачественых новообразований эпителия (табл.4). При малигнизации эпителия, как правило, наблюдалось значительное увеличение содержания антигена АГ4 в клетках. Для злокачественных опухолей с преобладанием солидной, скирроподобной формами роста было характерно окрашивание поверхностной мембраны и цитоплазмы. В высокодиференцированных новообразованиях с сохраненной органоидностыо тканевой структуры наблюдалось преимущественное окрашивание по краю сосочковых структур и по просвету железистоподобных образований. В ряде случаев в клетках адено-карцином МЖ, легкого и яичника наблюдалось интенсивное окрашивание внутриклеточных канальцев. Для большинства опухолей была характерна гетерогенность специфического окрашивания клеток и отдельных структур.

Экспрессия АГ4 обнаружена в злокачественных опухолях органов, эпителий которых в норме не содержит антигена: в ткани рака яичника, плоскоклеточного рака органов оро-фарингеальной зоны.

Специфическая реакция в клетках рака различной локализации не имела принципиальных особенностей.

Ни в одном из исследованных образцов меланомы (п=13) и злокачественных опухолей мягких тканей и тканей органов системы кроветворения (хондросаркома, остеосаркома, синовиальная саркома, липо-саркома, фибросаркома, рабдомиосаркома, лейомиосаркома, саркома Юинга, злокачественная фиброзная гистиоцитома, лимфогранулематоз, п=35) реакции не отмечено.

Интенсивная реакция с МКАТ ИК025 была выявлена и в клетках

Таблица 4. Взаимодействие МКАТ ИК025 с тканями злокачественных опухолей человека (нммуногистохимнческое исследование)._

Локализация и гистологический тип опухоли Число исследо-ваныхелучаев Число позитивных случаев

(общее число случаев данной локализации)

Молочная железа инвазивный протоковый рак особые формы 114 52 (166) 114 40 (154)

Легкое аденокарцинома плоскоклеточный рак мелкоклеточный рак бронхиолоальвеолярный_рак 16 7 1 1_________(25)_ 16 5 0 ; __ _ (?2)

Яичник серозная аденокарцинома муцинозная аденокарцинома эндометриоид. аденокарцинома смешанная аденокарцинома 12 1 3 и! 07) 12 0 3 .1________06).

Матаа аденокарцинома тела аденокарцинома шейки желез.-плоскоклет.рак тела плоскоклеточный рак тела плоскоклеточ.^ак шейки 3 4 1 1 _ Ш 3 4 1 0 2_______(10).

Желудок аденокарцинома перстневидноклеточный рак недифференцированный рак 10 2 8 -> 3 (13)

Кишечник аденокарцинома толстой кишки аденокарцинома прямой кишки плоскоклег._рак толстой кишки 7 3 1 „(1Ц_. 7 2 1_________<Ж

Почки и органы мочевывод. путей почечноклеточный рак переходнокл. рак мочев. пузыря переходнокл. рак почеч. лоханки_ Слюнная железа аденокарцинома 4 4 1_________121 1_________Ж 3 3 1__________(!)_. 1 __ _0!

Щитовидная железа фолликулярная аденокарцинома папиллярная аденокарцинома 2 А_________!§)_ 1 2 _(3)

Органы оро-фарингеальной зоны плоскоклеточный рак языка, слиз. полости рта, гортани 5 (5) 3 (3)

Итого (269) (238)

метастазов РМЖ (п=32), яичника (п=12), желудка (п=5), легкого (п=3). По сравнению с соответствующими первичными образованиями, в метастатических клетках отмечено сохранение характерного типа распределения антигена и иммунохимической гетерогенности окрашивания.

В ткани окружающей злокачественные опухоли, независимо от гистологической формы опухоли и содержания ней антигена, была отмечена высокая экспрессия АГ4 в немалигнизированном эпителии.

Таким образом, АГ4 специфичен для опухолей эпителиального происхождения, выявляется в подавляющем большинстве эпителиальных новообразований. Характер внутриклеточной локализации антигена связан с определенными критериями тканевой диф- ференцировки. Цитоплазматическое распределение АГ4 ассоциировано со злокачественной трансформацией клеток эпителия.

Более детально характер экспрессии АГ4 при различных доброкачественных и злокачественных патологических процессах был изучен на одной локализации - молочной железе.

Взаимодействие МКАТ ИК025 с тканью молочной железы. Было изучено более 250 случаев нормальной и патологически измененной ткани МЖ: с мастопатией, доброкачественными опухолями и различными формами РМЖ (см. табл.5).

В нормальной МЖ АГ4 локализовался в апикальной мембране ацинусов и протоков. При пролиферативных формах мастопатии с дисплазией эпителия I-II степени, а также при фиброаденоме и внутри-протоковых папилломах антиген АГ4 выявлялся в апикальной мембране эпителиальных клеток. При мастопатии с дисплазией III степени в эпителии также сохранялся "апикальный" характер реакции, однако в 27,3% изученных случаев были обнаружены отдельные клетки и целые структуры, морфологически неотличимые от соседних, с реакцией в цитоплазме.

Апикальная локализация антигена также наблюдалась в клетках 28,6% исследованных er in situ молочной железы, в клетках высоко дифференцированных форм инвазивного РМЖ- тубулярного, слизистого, папиллярного.

При инвазивных формах РМЖ: протоковом (ИЛ), дольковом, перстневидноклеточном и раке Педжета, а также при МП РМЖ у мужчин выявлено интенсивное окрашивание поверхностной мембраны и цитоплазмы опухолевых клеток. В участках ИП РМЖ, которые имели железистое строение, наряду с мембранным и цитоплазматичес-

Таблица 5. Взаимодействие МКАТ ИК025 с тканями нормальной и

патологически измененной молочной железы.

Изучено Локализация окрашива-

Гистологический диагноз случаев ния в клетках

А м/ц нет окр.

Нормальная молочная железа 23 23 0 0

Мастопатии

непролиферативные формы 5 5 0 0

пролиферативные формы 24 24 3 0

Доброкачественные опухоли

фиброаденома 10 10 0 0

папиллома 2 2 0 0

Злокачественные опухоли

Внутрипротоковый рак 7 2 5 0

Инвазивный рак:

Инфильтративный протоковый

рак (в том числе комбинирован- 114 37 114 0

ные формы)

Инфильтративный дольковый 12 0 12 0

рак

Тубулярный рак 6 6 1 0

Коллоидный рак 1 1 0 0

Перстневидноклеточный рак 3 0 3 0

Папиллярный рак 2 2 2 0

Рак Педжета 6 0 6 0

Медуллярный рак 12 4 8 0

Метапластический рак:

плоскоклеточная метаплазия 8 0 1 7

хондроидная метаплазия 3 0 1 2

остеоидная метаплазия 1 0 0 1

Рак с участками карциноидного 4 0 2 2

строения

Итого РМЖ: 179 50 155 12

Метастазы ИП, долькового, 34 0 34 0

перстневидноклегочного РМЖ в

лимфатические узлы

* А - апикальное, МЩ - по поверхностной мембране и в цитоплазме, нет

окр. - нет окрашивания.

ким окрашиванием опухолевых клеток наблюдали также интенсивную реакцию по краю просвета протоковоподобных структур. Отмечена геерогенность окрашивания клеток и сруктур. ь

Крайне разнородны по характеру окрашивания была группа медуллярных раков: в 2 из 12 случаев специфическое окрашивание в клетках локализовалось преимущественно в мембране; в 8 - в цитоплазме и мембране, по типу реакции в клетках ИП РМЖ; в 2 - по краю железис-топодобных структур; в 1 из 6 - практически отсутствовало.

При РМЖ с плоскоклеточной метаплазией только в одном из исследованных случаев обнаружены немногочисленные клетки с мем-бранно-цитоплазматической реакцией. В РМЖ с хондроидной и остео-идной метаплазией в одном из 4 наблюдений АГ4 выявлен в клетках с хондроидной дифференцировкой. Специфическая реакция обнаружена в трех из четырех рассмотренных случаев РМЖ с участками карциноид-ного строения.

Метастазы ИП, долькового, перстневидноклегочного РМЖ (п=25) в 100% случаев содержали антиген АГ4. В большинстве случаев метастатические клетки имели тот же внутриклеточный характер распределения специфического окрашивания, что и в первичном очаге.

Таким образом, МКАТ ИК025 могут быть использованы при иммуноморфологическом изучении процессов злокачественной трансформации и инвазии в молочной железе, а также, возможно, для иммунотипирования РМЖ.

Иммуноцитохимическос исследование с применением МКАТ ИК025.

Иммуноцитохимический анализ проведен на клетках МЖ с доброкачественной патологией (п=21), первичных злокачественных опухолей МЖ (114), других опухолей в МЖ - липомы(1), лимфомы (3), меланомы (2), злокачественной мезенхимомы (1), рака легкого (21), желудка (10), кишечника (5), яичников (12), матки (4), а также метастазов РМЖ (24), рака яичника (5) в печень и лимфатические узлы, Показано, что МКАТ ИК025 на цитологических препаратах обладали той же специфичностью, что и в гистологическом методе. Антитела ИК025 взамо-действуют только с эпителиальными клеточными элементами и не реагируют с клетками крови, лимфоидной, соединительной ткани. Таким образом, МКАТ ИК025 могут быть использованы для выявления в цитологическом материале метастатических клеток антиген-содержащих злокачественных опухолей, в частности, в пунктатах костного мозга, из лимфатических узлов и печени.

В цитологических препаратах отмечено сохранение внутриклеточного распределения антигена аналогичное тому, что наблюдается при исследовании срезов тканей. Однако клетки РМЖ, аденокарцином яичника, легкого, желудка не имеют принципиальных отличий в характере специфического окрашивания. Поэтому использование реакции с МКАТ ИК025 не может дать дополнительной полезной информации для идентификации источника метастазирования при первично-множественном поражении или при невыясненном первичном очаге.

Специфическое окрашивание клеток РМЖ наблюдалось в 113 из 114 случаев изученных первичных опухолей (99,1%) и во всех 24 изученных случаях метастатических опухолей (100%). В клетках пунктатов из различных опухолей неэпителиального происхождения в молочной железе реакции с МКАТ ИК025 не обнаружено.

Совпадение данных иммуноцитохимического метода о тканевом происхождении опухоли в молочной железе с заключением гистологического планового исследования наблюдалось в 120 из 121 случаев (99,2%), в том числе в случаях резко анаплазированных новообразований, затруднительных для цитологической дифференциальной диагностики. Исключение составил 1 случай ИП РМЖ с резко выраженной анаплазией клеток (степень злокачественности 9 баллов), который, однако не являлся сомнительным при цитологическом анализе. Обобщая полученые данные можно заключить, что МКАТ ИК025 могут быть использованы как дополнительный метод при дифференциальной диагностике злокачественных новообразований для уточнения их гистогенеза.

Специфичность МКАТ ИК025, низкий уровень экспрессии АГ4 в нормальных тканях, и высокое содержание антигена в клетках РМЖ, а также принадлежность МКАТ ИК025 к классу IgG делают возможным создание на их основе препаратов направленного транспорта для иммунолокализации РМЖ in vivo и иммунотерапии.

18

ВЫВОДЫ.

1. Разработаны схемы выделения и очистки антигенов молочной железы человека из мембран жировых глобул женского молока, позволяющие в препаративных количествах получать стандартные образцы антигенного материала без потери их иммунохимической активности.

2. Физико-химическими и иммуноморфологическими методами охарактеризованы два мембранных антигена клеток молочной железы (АГЗ и АГ4). АГЗ является соединением гликопротеидной природы с МВ 8250(Ю, АГ4 - гликолипопротеидом с МВ более 25000(Ю.

3. К высокоочищенным антигенам АГЗ и АГ4 получены монокло-нальные антитела (МКАТ ИК021, ИК022, ИК026, ИК029 (класс 1§М); ИК025 (класс ^в)). На основе МКАТ разработана тест-система для иммуноморфологического выявления АГЗ и АГ4 на срезах и мазках.

4. МКАТ ИК021, ИК026, ИК029 выявляют АГЗ и взаимодействуют с однослойным и многослойным эпителием, слабая реакция наблюдается в эндотелии сосудов, а также с нефиксированными клетками крови. МКАТ ИК022 и ИК025 выявляют АГ4, специфично взаимодействуют с эпителием, преимущественно с однослойным секреторным.

5. АГЗ и АГ4 сохраняются при малигнизации эпителия и экспрес-сируются клетками первичных и метастатических очагов эпителиальных опухолей. Выявлены различия во внутриклеточном распределении АГ4 между клетками нормального эпителия и злокачественных опухолей: в норме АГ4 локализуется в апикальной мембране, в опухолевых клетках - по всей поверхностной мембране и в цитоплазме.

7. В молочной железе антиген АГ4 экспрессируется клетками ацинусов и протоков в норме, при мастопатиях и доброкачественных опухолях, сохраняется при злокачественной трансформации эпителия железы и утрачивается только в ряде случаев метапластических раков, что позволяет отнести его к устойчивым маркерам эпителиальной клетки молочной железы.

8. МКАТ ИК025 могут быть использованы в иммуноморфоло-гических исследованиях при раке молочной железы для изучения процессов злокачественной трансформации и инвазии опухолей; для выявления клеток рака в цитологическом материале (пунктатах лимфатических узлов, костного мозга и др.); для уточняющей уточняющей дифференциальной диагностики злокачественных новообразований эпителиального и неэпителиального происхождения в молочной железе.

Список публикации.

1. Якубовская Р.И., Казачкина Н.И., Кармакова Т.А. и др. Изучение интегрального антигена мембран жировых глобул женского молока Эксперим. онкологогия- 1990r.-T.12.-N4.-c.61-65.

2. Барышников А.Ю., Короткова О.В., Кадагидзе З.Г. и др. Штам гибридных культивируемых клеток мыши, используемый для получения моноклональных антител к антигену мембран жировых глобул женского молока, пригодному для диагностики рака молочной железы и яичника. Бюлл. иммунол,-1992.-N. 1 .-с.7.

3. Кармакова Т.А. Изучение специфичности и диагностической значимости моноклональных антител к антигену мембран жировых глобул. В сб. тезисов 1-й Московской научно-практической конференции молодых ученых. Москва-Обнинск.-1990,- с.30-31.

4. Якубовская Р.И., Барышников А.Ю., Кармакова Т.А., и др. Имму-ногистохимическое изучение антигена мембран жировых глобул женского молока с помощью моноклональных антител ИКО-25. Архив патол. -1991.-N.6.-C. 11-16. _

5.Якубовская Р.И., Кармакова Т.А., Сидорова Н..А. и др. Монокло-нальные антитела ИКО-25 в изучении рака легкого, ъ сб. трудов 2-го Всесоюзного конгресса по болезням органов дыхания, Челябинск.-1991.-C.81-82.

6. Сидорова H.A.J Якубовская Р.И., Кармакова Т.А. и др. Цитологи-сеская диагностика опухолей молочной железы с помощью иммуноци-тохимии. Клин.лаб.диагн.-1992.-М.7-8 -с.33-35.

7. Виха Г.В., Сухно A.A., Якубовская Р.И. и др. Реагенты для диагностики опухолей эпителиального происхождения. В сб.: Современные направления создания медицинских диагностикумов.-3-5 дек.1990., Москва.-с.12.

8. Виха Г.В., Сухно A.A., Ширяев C.B. и др. Меченые технецием 99 моноклональные антитела для локализации опухолей молочной железы. В сб.: Современные направления создания медицинских диагности-кумов.-3-5 дек.1990., Москва.-с.13.

9. Волченко H.H., Кармакова Т.А., Якубовская Р.И. О некоторых формах рака молочной железы.-Архив патологии.-1994.-т.56.-N.4.-С. 18-21.

10. Франк Г.А., Волченко H.H., Якубовская Р.И., Кармакова Т.А. Морфологическая и иммуноморфологическая диагностика предрака и раннего протокового рака молочной железы. В сб.: Ранняя диагностика онкологических заболеваний. Под ред. В.И.Чиссова, В.В.Старинского, Е.Н.Сотниковой.-Москва.-1994г. - с.78-81.