Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Муцин MUC1 как биологический маркер в морфологических и серологических исследованиях у онкологических больных

На правах рукописи

КАРМАКОВА Татьяна Анатольевна

МУЦИН МиС1 КАК БИОЛОГИЧЕСКИЙ МАРКЕР В МОРФОЛОГИЧЕСКИХ И СЕРОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ У ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ

14.01.12 - Онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

г г мая ¿014

Москва - 2014

005548746

005548746

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении «Московский научно-исследовательский онкологический институт имени П.А. Герцена» Министерства здравоохранения Российской Федерации

(директор- член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор А.Д. Каприн) Научные консультанты:

доктор биологических наук, профессор Якубовская Раиса Ивановна

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Франк Георгий Авраамович

Официальные оппоненты:

Волгарева Галина Михайловна, доктор биологических наук

ведущий научный сотрудник лаборатории механизмов гибели опухолевых клеток Научно-исследовательского института канцерогенеза федерального государственного бюджетного учреждения «Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохина» РАМН

Боженко Владимир Константинович, доктор медицинских наук, профессор руководитель отдела патоморфологии и лабораторной диагностики федерального государственного бюджетного учреждения "Российский научный центр рентгенорадиологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Куликов Евгений Петрович, доктор медицинских наук, профессор

заведующий кафедрой онкологии с курсом лучевой диагностики Рязанского государственного медицинского университета имени академика И.П. Павлова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Ведущая организация:

федератьное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт онкологии имени H.H. Петрова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится 24 июня 2014 г. в _ часов на заседании

диссертационного совета Д 208.047.01 при ФГБУ «МНИОИ им.П.А.Герцена» Минздрава России по адресу: 125284, г.Москва, 2-ой Боткинский проезд, д.З

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «МНИОИ им.П.А.Герцена» Минздрава России и на сайте www.mnioi.ru

Автореферат разослан « » _2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

Немцова Елена Романовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Достижения в области современных биологических наук - молекулярной биологии и молекулярной генетики, биохимии и биотехнологии к настоящему времени значительно расширили представления о сложных процессах, лежащих в основе возникновения и прогрессии неоплазии [Pecorino L., 2012]. Предметом активных исследований является поиск биологических маркеров, определение которых в тканях организма может способствовать оценке риска возникновения заболевания, выявлению злокачественной опухоли, служить индикатором ее биологических особенностей или отражать распространенность опухолевого процесса [Karley D. et al., 2011; Duffy M.J., 2013].

Муцин MUC1 в этом отношении на протяжении многих лет привлекает к себе особое внимание. В норме в организме человека MUC1 преимущественно экспрессируется клетками эпителия желез и протоков [Baldus S.E. et al., 2004]. Структура MUC1 отличается высокой изменчивостью, что обусловлено генетическим полиморфизмом, свойственным муциноподобным гликопротеинам, а также вариабельным гликозилированием его молекулы [Hanisch F.G. & Müller S., 2000]. Физиологическая роль MUC1 тесно связана с защитой целостности эпителиального барьера при инфекционном поражении [McGuckin М.А. et al., 2007; McAuley J.L. et al., 2007].

В эпителиальных злокачественных опухолях обнаруживают повышенную, по сравнению с нормальным эпителием, экспрессию MUC1, изменение его внутриклеточной локализации и преобладание гипогликозилированных форм муцина [Baldus S.E. et al., 2004; Hanisch F.G. & Müller S., 2000]. По результатам экспериментальных исследований, эти особенности могут приводить к увеличению инвазивного и метастатического потенциала злокачественных клеток [Jonckheere N. & Van Seuningen I., 2010; Albrecht H. & Carraway K.L., 2011]. По данным клинико-морфологических исследований, высокий уровень экспрессии и деполяризованный характер

распределения MUC1 в клетках опухоли коррелирует с неблагоприятным прогнозом заболевания [Rahn JJ. et al., 2001; Kocer В. et al., 2004; Situ D. et al., 2011; Hamada T. et al., 2012].

Изменения характера экспрессии MUC1, аналогичные тем, что наблюдаются в ткани инвазивных опухолей, описаны при внутриэпителиальных карциномах в ряде органов. Однако повышенный интерес к изучению экспрессии MUC1 при предопухолевых нарушениях в эпителии наметился только в последние годы [Garbar С. et al., 2008; Do S.I. et al., 2013; Remmers N. et al., 2013; Xiong L. et al., 2012].

При заболевании раком молочной железы (РМЖ), злокачественными эпителиальными опухолями легкого, поджелудочной железы, яичников, печени обнаруживают увеличение содержания MUC1 в циркулирующей крови [Duffy M.J. et al., 2010; Molina R. et al., 2008; Gold D.V. et al., 2007; Dupont J. et al., 2004; Xu H. et al., 2008].

Мониторинг сывороточного уровня MUC1 (CAI5-3, CA27.29) y больных метастатическим РМЖ, в сочетании с оценкой клинических факторов и результатов других диагностических тестов, в настоящее время рекомендован Американским обществом клинической онкологии (ASCO) и Европейской группой по опухолевым маркерам (EGTM) для контроля эффективности консервативного лечения [Duffy M.J. et al., 2013; Harris L. et al., 2007]. Данные о сывороточном уровне MUC1 у первичных больных раком легкого немногочисленны и трудно поддаются сравнительному анализу вследствие разнородности групп обследованных больных и различий использованных методологических подходов [Inata J. et al., 2008; Molina R. et al., 2008; Tanaka S. et al., 2012; Yoshimasu T. et al., 2012]. Работы, целенаправленно характеризующие сывороточный уровень MUC1 при раке желудка, в опубликованной литературе не представлены.

Неоднозначность и недостаточность сведений о клинической значимости MUC1 как опухоль-ассоциированного антигена в отношении ряда актуальных для онкологии направлений определили цель и задачи настоящей работы.

Цель исследования

Целью работы являлась оценка значимости муцина МиС1 как биологического маркера при эпителиальных злокачественных опухолях и изучение аспектов его возможного применения в морфологических и серологических исследованиях у онкологических больных.

Задачи исследования

1. Охарактеризовать оригинальное анти-МиС1 моноклональное антитело (МКА) ИК025 по эпитопной специфичности, взаимодействию с нормальными тканями человека и тканями злокачественных опухолей различного гистогенеза и локализации.

2. Исследовать экспрессию МиС1, узнаваемого ИК025 (М11С1/ИК025), а также различных по гликозилированию форм МиС1 в ткани молочной железы при доброкачественных заболеваниях, предопухолевых изменениях и злокачественных опухолях методами иммуногистохимического анализа.

3. Охарактеризовать особенности экспрессии МиС1/ИК025 в нормальном бронхиальном эпителии, при реактивных и предопухолевых изменениях бронхиального эпителия и при плоскоклеточном раке легкого методами иммуногистохимического и иммуноцитохимического анализа.

4. Изучить возможность использования М1ЛС1/ИК025 в цитологических исследованиях как биологического маркера патологических нарушений бронхиального эпителия.

5. Методами иммуноцитохимического анализа исследовать особенности экспрессии МиС1/ИК025 при предопухолевых изменениях в эпителии шейки матки, в том числе, в аспекте вирус-ассоциированной этиологии заболевания.

6. Разработать тест-систему для количественного определения М11С1 в сыворотке крови человека методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) на основе ИК025 и апробировать ее на клиническом

материале.

7. Исследовать уровень М11С1/ИК025 в сыворотке крови при первичном НМРЛ и первичном раке желудка, провести анализ клинико-лабораторных данных и оценить информативность сывороточного уровня МиС1/ИК025 как серологического маркера у данных больных.

Научная новизна исследования

С использованием оригинального моноклонального антитела ИК025, полученного к высокомолекулярному гликопротеиду мембран жировых глобул женского молока, впервые детально охарактеризована экспрессия гипогликозилированного М11С1 (МиС1/ИК025) в бронхиальном эпителии в норме, при реактивных изменениях и предопухолевых нарушениях.

На основании данных, полученных при мониторинге больных раком легкого, впервые установлено, что аномальная экспрессия МиС1/ИК025 в бронхиальном эпителии является патогенетическим маркером скрытых предопухолевых изменений, характеризующихся высокой вероятностью прогрессии до плоскоклеточного рака. Показана целесообразность определения характера экспрессии МиС1/ИК025 в бронхиальном эпителии у больных плоскоклеточным раком легкого в целях раннего выявления рецидива опухоли и прогноза развития первично-множественного центрального рака.

На цитологическом уровне исследования впервые выявлена корреляция между особенностями экспрессии МиС1/ИК025 в клетках цервикального эпителия, цитологическими признаками, патогномоничными для инфекции вирусом папилломы человека (ВПЧ), и положительным результатом определения ДНК ВПЧ высокого канцерогенного риска. Полученные данные свидетельствуют о возможном вирус-ассоциированном характере изменений экспрессии МиС 1 в клетках эпителия шейки матки.

На основе ИК025 разработана оригинальная тест-система для количественного определения М11С1 в сыворотке крови человека методом

твердофазного ингибиторного ИФА. Охарактеризована значимость МиС1/ИК025 как серологического маркера для уточняющей диагностики у первичных больных НМРЛ при различной гистологической и клинико-анатомической форме опухоли, а также в зависимости от возраста пациентов.

Впервые показано, что при первичном раке желудка низкое относительно среднестатистической нормы содержание М11С1 в сыворотке крови больных ассоциировано с большей распространенностью опухолевого процесса.

Установлена корреляция между низким дооперационным сывороточным уровнем МиС 1 и развитием послеоперационной пневмонии у больных злокачественными опухолями органов верхних отделов желудочно-кишечного тракта, что указывает на возможную клиническую значимость уровня циркулирующего МиС1 как показателя состоятельности местной системы резистентности в ткани легкого.

Научно- практическая значимость работы

Выявленные особенности экспрессии МиС1/ИК025 в эпителии молочной железы, бронхов и шейки матки являются основой для дальнейшего изучения МиС1 как иммуногистохимического маркера в клинических исследованиях, направленных на определение показаний к проведению органосохраняющего лечения и оценку его эффективности.

Разработан метод оценки характера экспрессии МиС1/ИК025 в цитологических образцах бронхиального эпителия, который может быть использован в дополнение к комплексному обследованию и при активном мониторинге больных плоскоклеточным раком легкого после специализированного лечения, в целях прогноза и раннего выявления местного рецидива заболевания. Предложен алгоритм оценки результатов иммуноцитохимического исследования бронхиальных мазков-скарификатов, который позволяет оптимизировать схему включения данного теста в программу планового обследования индивидуальных больных. Метод может

быть использован в лечебных учреждениях онкологического и пульмонологического профиля, оснащенных бронхофиброскопической аппаратурой, при поддержке лабораторных подразделений. Применение данного подхода перспективно при формировании групп повышенного риска в целях ранней диагностики центрального рака легкого при обследовании больных хроническими неспецифическими заболеваниями легких.

Результаты, полученные при исследовании содержания МиС1/ИК025 в сыворотке крови онкологических больных, являются предпосылкой для углубленного клинического изучения МиС1 как серологического маркера при первичном раке легкого, а также в клинических группах больных, характеризующихся повышенным риском развития послеоперационных инфекционно-воспалительных легочных осложнений. Высокий уровень корреляции между сывороточным уровнем МиС1/ИК025 и СА15-3 делает возможным использование в этих целях существующих коммерческих диагностических наборов.

Положения, выносимые на защиту

1. Изменения в характере экспрессии МиС1, отличающие клетки нормального эпителия и клетки злокачественных эпителиальных опухолей -повышенный уровень экспрессии антигена и его деполяризованное внутриклеточное распределение, в эпителии молочной железы, бронхиальном эпителии и эпителии шейки матки возникают на этапе предопухолевых нарушений до появления морфологических признаков злокачественности.

2. Аномальная для бронхиального эпителия в норме экспрессия гипогликозилированного М11С1 (МиС1/ИК025) в клетках метаплазированного плоского эпителия и резервных клетках пролиферирующего цилиндрического эпителия является патогенетическим маркером ранних предопухолевых нарушений, характеризующихся высоким риском прогрессии до плоскоклеточного рака.

3. Анализ характера экспрессии MUC1/MK025 в цитологических образцах бронхиального эпителия в комплексе с бронхоскопическим исследованием позволяет формировать группу риска развития первично-множественного центрального плоскоклеточного рака и местного рецидива заболевания после хирургического и/или эндоскопического лечения у больных плоскоклеточным раком легкого.

4. Высокая экспрессия MUC1/MK025 в дискератоцитах, патогномоничных для папилломавирусной инфекции, корреляция между MUC1-положительными дискератоцитами и инфекцией вирусом папилломы человека высокого канцерогенного риска, а также высокий уровень экспрессии антигена в атипических клетках при цервикальной интраэпителиальной неоплазии косвенно указывают на вирус-ассоциированный характер изменений экспрессии MUC1 в эпителии шейки матки.

5. При первичной аденокарциноме легкого увеличение уровня MUC1/HK025 в сыворотке крови коррелирует со стадией заболевания. Значимость повышенного сывороточного уровня MUC1/HK025 при раке легкого как серологического маркера для уточняющей диагностики зависит от клинико-анатомической локализации новообразования и возраста больных.

6. При первичном раке желудка с распространенной стадией заболевания коррелирует низкий (относительно среднестатистических значений показателя в норме) сывороточный уровень MUC1/MK025. Низкий дооперационный уровень MUC1/HK025 в сыворотке крови у больных раком желудка и раком пищевода является независимым фактором риска развития послеоперационной пневмонии.

Апробация научных положений. Основные результаты исследований доложены на V съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Санкт-Петербург, 2003); XIII World Congress for Bronchology (Barselona,

Spain, 2004); Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2005; 2006; 2007; 2009;) III Российской конференции по иммунотерапии (Москва, 2006); VIII Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2007); 35th Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine, ISOBM (Prague, 2007); 25th International Papillomavirus Conference (Malmo, Sweeden. 2009); Первой Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы флюоресцентной диагностики и фотодинамической терапии» (Москва, 2012); Втором Конгрессе Евро-Азиатской ассоциации дерматовенерологов, ЕААД (Москва, 2012); Второй Всероссийской конференции. «Актуальные вопросы фото динамической терапии и фотодиагностики» (Москва, 2013); Научно-практическом симпозиуме «Новые медицинские технологии в эндоскопической диагностике и лечении раннего рака желудка и раннего центрального рака легкого» (Москва, 2013); 15th World Conference on Lung Cancer (Sydney, Australia, 2013); VIII Всероссийском съезде онкологов (Санкт-Петербург, 2013).

Апробация состоялась 26.09.2013 г. на межотделенческой конференции ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» МЗ РФ.

Внедрение результатов исследования в практику. Полученные результаты, относящиеся к исследованию экспрессии MUC1 в бронхиальном эпителии, используются в работе эндоскопического отделения ФГБУ «МНИОИ им.П.А.Герцена».

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 44 печатные работы: 14 статей в рецензируемых журналах, 1 статья в сборнике научных трудов, 25 тезисов в материалах научных форумов, 4 патента Российской Федерации.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, раздела, содержащего собственные результаты (4 главы), выводов и практических рекомендаций.

Материалы диссертации изложены на 368 страницах машинописного текста, иллюстрированы 75 таблицами и 81 рисунком. Библиографический указатель включает 510 источников (35 отечественных, 475 зарубежных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

Объектом исследования служили: женское молоко начальных сроков лактации и его компоненты; мышиные анти-MUCl моноклональные антитела (МКА); ткани человека - нормальные дефинитивные и эмбриональные ткани (аутопсийный материал); ткани органов, удаленных при хирургическом вмешательстве у онкологических больных; образцы биопсии и цитологический материал, полученные со слизистых оболочек при диагностическом или профилактическом обследовании пациентов и здоровых лиц; периферическая венозная кровь доноров и онкологических больных (сыворотка, плазма, клетки крови).

МКА ИК025 выделяли из асцитической жидкости мышей линии BALB/C с привитой внутрибрюшинно гибридомой ИК025 (№ВСКК/П/465Д, депонирована в лаборатории экспериментальных моделей ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН), методом высаливания с последующей ионообменной хроматографией. Биотинилирование ИК025 осуществляли с использованием N-гидроксисукцинимидного эфира D-биотиноил-Е-аминокапроновой кислоты.

Антиген (MUC1) получен из освобожденной от казеина закислением плазмы женского молока, последовательной очисткой методами ионообменной хроматографии, иммуноаффинной хроматографии на BrCN-сефарозе, конъюгированной с МКА ИК025, и гель-фильтрацией.

Образцы антигена и антител характеризовали методами спектрофотометрии, определением белка по Лоури, методом электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих и неденатурирующих условиях,

методами иммуноблота и твердофазного

Иммунопероксидазное или иммунофлуоресцентное окрашивание клеток и тканей проводили согласно общепринятым методикам; при исследовании клинического материала применяли стандартизованные условия процедуры. В качестве реагентов использовали: МКА ИК025, серию мышиных моноклональных антител к различным по гликозилированию формам MUC1 (п=28; предоставлена лабораторией иммунологии ФГУП «ГосНИИ Генетика», руководитель лаборатории к.м.н. B.JI. Юрин); коммерческие первичные МКА, контрольные неспецифические иммуноглобулины, вторичные антитела и системы детекции от производителей (поставщиков) «Медгамал», «Novocastra», «Dako Cytomation», «BD Bioscience».

Определение экспрессии MUC1 на клетках крови проводили методом проточной цитофлуориметрии (BD FACSCalibur™), идентификацию субпопуляций лейкоцитов - с использованием МКА к антигенам кластеров дифференцировки («Сорбент ЛТД»).

Микроспектральные исследования и микроскопический анализ эпифлуоресценции 5-АЛК-индуцированного протопорфирина IX выполнялись на базе лаборатории спектрального анализа ИБОХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (руководитель лаборатории д.б.н. А.В.Феофанов).

Образцы ткани опухолей человека для типирования моноклональных антител (п=378), предоставлены отделением патологической анатомии ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» МЗ РФ и отделом патологической анатомии ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН (архивный материал).

Иммуногистохимическое исследование тканей молочной железы и легкого выполнено на архивном операционном материале отделения патологической анатомии ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» МЗ РФ.

В числе исследованных образцов тканей молочной железы: РМЖ - 179 клинических случаев, железисто-фиброзная мастопатия - 30, доброкачественные опухоли молочной железы — 18. В 40 случаях исследованы ткани

молочной железы, окружающие злокачественную опухоль.

Образцы тканей легкого, пораженного плоскоклеточным раком (ПКР), исследованы у 37 больных (центральный рак - 30, периферический рак - 7; стадия заболевания T1.3N0.2M0). Всего исследовано 117 образцов ткани, в том числе, 86 разных тополого-анатомических участков слизистой оболочки бронхов. Очаги прединвазивных патологических нарушений в бронхиальном эпителии были представлены в 26 исследованных образцах ткани (17 клинических случаев).

Клинико-экспергшенталъные исследования выполнены в рамках текущих клинических протоколов, анализ полученных результатов - с использованием данных клинической документации.

Иммуноцитохшшческое исследование бронхиального эпителия выполнено на базе отделения эндоскопии ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» МЗ РФ, на образцах мазков-скарификатов, полученных у 80 больных хроническими неспецифическими заболеваниями легких (ХНЗЛ) и 208 больных раком легкого: начальный центральный рак легкого (НЦРЛ, T1N0M0 или Tis)- 41, первично-множественный НЦРЛ - 49, местно-распространенный рак легкого (T^No-зМо) - 118; центральный рак - 168, периферический рак -40; ПКР - 177, другие гистологические типы опухоли -31.

У 102 больных раком легкого исследование выполнено до начала лечения, у 106 больных - после хирургического или эндоскопического лечения (169 и 147 участков слизистой оболочки бронхов, соответственно).

Клиническое состояние после диагностического обследования прослежено у всех больных ХНЗЛ, после специализированного лечения у 93 больных раком легкого. Длительность наблюдения, в зависимости от клинического состояния пациентов, в группе больных ХНЗЛ варьировала от 3 месяцев до 5 лет (медиана [МЕ] 40 месяцев), в группе больных раком легкого - от 3 месяцев до 17 лет (МЕ 21 месяц). У больных раком легкого с применением иммуноцитохимического исследования мазков-скарификатов 84 участка слизистой оболочки бронхов прослежены в динамике на

протяжении времени от 3 месяцев до 5,5 лет (МЕ 12 месяцев). Кратность исследования определялась клинически показаниями (всего - 451 исследование).

Иммуноцитохимическое исследование цервикального эпителия выполнено совместно с отделением онкогинекологии ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» МЗ РФ и клиникой при кафедре акушерства и гинекологии ФПГТОВ ГОУ ВПО ММУ им. И.М. Сеченова МЗ РФ, на образцах мазков-соскобов, взятых со слизистой оболочки шейки матки у 308 женщин в возрасте от 18 до 72 лет (МЕ 33 года). В числе обследованных лиц: здоровые женщины - 70 (группа I); пациентки с фоновыми и воспалительными заболеваниями шейки матки - 86 (группа II); больные начальным раком шейки матки (НРШМ, TlaN0M0; плоско клеточный) - 15 и пациентки с диагнозом цервикальная интраэпителиальная неоплазия (ЦИН) до начала специализированного лечения — 80 (группа III); пациентки после органосохраняющего лечения ЦИН методом фотодинамической терапии — 105, из них у 55 пациенток иммуноцитохимическое исследование выполнено в динамике, в течение года после органосохраняющего лечения ЦИН, на сроки 1, 3, 6, 9 и 12 месяцев после лечения (группа IV; всего - 198 исследований), у 50 пациенток с гистологически подтвержденным положительным эффектом лечения исследование выполнено через 15 месяцев и более (МЕ 36 месяцев).

Результаты определения ДНК ВПЧ высокого канцерогенного риска (ВКР) были доступны для анализа у 277 пациенток в группах II, III, IV и V, данные о других урогенитальных инфекциях - у 50 больных в группе II.

Серологическое исследование выполнено с использованием образцов сыворотки периферической венозной крови 93 условно здоровых лиц (мужчины - 36, женщины - 57; возраст 20 - 63 года, МЕ 40 лет) и 678 больных, проходивших обследование или получавших лечение в ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» МЗ РФ. В числе обследованных больных:

- 115 пациенток с заболеванием молочной железы: мастопатия - 11, доброкачественные опухоли -11, первичный РМЖ до начала лечения — 52 (I-

IV стадия заболевания), метастатический РМЖ, консервативное лечение на фоне прогрессирования заболевания — 41.

- 359 пациентов с заболеванием легкого: злокачественная опухоль легкого - 296 (I-IV стадия заболевания; центральный рак - 117, периферический рак - 179), доброкачественная опухоль - 10, хронические воспалительные заболевания - 43, интерстициальное заболевание легких - 10.

- 204 больных первичным раком желудка (I-IV стадия заболевания).

У 167 больных раком желудка, а также у 27 больных раком пищевода (II - III стадия заболевания), получавших хирургическое лечение, выполнен анализ частоты случаев послеоперационной пневмонии в зависимости от известных клинических факторов риска, содержания MUC1/HK025 в сыворотке крови и лабораторных показателей общего анализа крови до операции.

Методы статистического анализа. Для математической обработки данных использовали базовые статистические показатели - среднее, стандартное отклонение (Sx), медиана (ME), интерквартильный размах (р25-р75 или р10-р90). Для сравнения бинарных показателей применяли %2' критерий согласия Пирсона, точный двусторонний критерий Фишера; для выявления различий в уровне исследуемого признака - парный t-критерий Стюдента, U-критерий Манна-Уитни; для оценки корреляционных отношений - ранговый тест корреляции Спирмена (rs), линейную регрессию; для оценки диагностической или прогностической значимости признака -ROC-анализ, расчеты величин диагностических показателей и относительного риска (RR). Расчеты выполнены с использованием программ Primer of Biostatistics 4.03 (Stanton A. Glantz, McGraw Hill), Analyse-it® (Microsoft Excel), MedCalc 12.3.0 (MedCalc Software, Mariakerk, Belgium).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Характеристика моноклонального антитела ИК025

Результат определения М11С1 в тканях и биологических жидкостях в значительной степени зависит от природы и эпитопной специфичности используемых антител. В рамках данной работы основным инструментом иммунохимического анализа являлось оригинальное МКА ИК025, полученное к высокоочищенному МИС1, выделенному из мембран жировых глобул женского молока [Якубовская Р.И. с соавт., 1990; Якубовская Р.И. с соавт., 1991].

Экспрессия МиС1/ИК025 в нормальных тканях и тканях злокачественных опухолей человека. По данным, полученным в ходе иммуногистохимического исследования аутопсийного материала, в тканях взрослого человека ИК025 взаимодействует с клетками однослойного эпителия ацинарных и/или протоковых отделов желез органов дыхательной, пищеварительной, репродуктивной и эндокринной систем, кожного покрова, альвеолоцитами II типа, с клетками эпителия желчных протоков печени и желчного пузыря, эндометрия и эпителия маточных труб, дистальных канальцев и собирательных трубочек почки, клетками уротелия.

МиС1, узнаваемый ИК025 (МиС1/ИК025), определяется на апикальной поверхности дифференцированных клеток.

Специфическая реакция с ИК025 не окрашивает многослойный плоский эпителий слизистых оболочек и кожных покровов, покровный цилиндрический эпителий бронхов и органов желудочно-кишечного тракта, структуры и клетки соединительной, мышечной, нервной и лимфоидной ткани, эндотелий сосудов, Т-лимфоциты (С04+ и С08+) и клетки миелоидного ряда (СО 13+ и СОЗЗ+) периферической крови, но определяется на части В-лимфоцитов (от 5 до 50% от общего количества СБ 19+ клеток).

Сравнение характера окрашивания дефинитивных и эмбриональных тканей человека показало, что в эпителии ряда органов, в частности, в

проводящих отделах легкого, в желудке, кишечнике, мочевом пузыре экспрессия М11С1/ИК025 носит дифференцировочный характер.

Специфическое окрашивание с ИК025 выявлено в клетках большинства исследованных злокачественных эпителиальных опухолей человека (85%; 282/330) и не обнаружено в клетках злокачественных новообразований соединительной или гемопоэтической ткани (п=35) и клетках меланомы (п=13).

При РМЖ (п=178) экспрессия М11С1/ИК025 выявлена в 92% случаев, при аденокарциноме (п=78) других органов - в 92%, при ПКР (п=59) - в 46% случаев. В ткани умеренно и низко дифференцированных аденокарцином, а также при ПКР различных органов наблюдалось не характерное для нормы деполяризованное распределение МиС1/ИК025 на поверхностной мембране и/или в цитоплазме опухолевых клеток.

М11С1/ИК025 при доброкачественных, предопухолевых и злокачественных изменениях в эпителии молочной железы. При наиболее часто встречающейся гистологической форме РМЖ -инфильтративном протоковом раке (п=120), экспрессия МиС1/ИК025 выявлена в подавляющем большинстве случаев (98%), среди них деполяризованное распределение антигена в опухолевых клетках - в 79% случаев. Полное отсутствие специфического окрашивания с ИК025 при РМЖ наблюдалось в случаях, характеризующихся выраженной анаплазией клеток.

Высокий уровень экспрессии МиС1/ИК025 в сочетании с деполяризованным внутриклеточным распределением антигена выявлен при клинически агрессивных гистологических типах РМЖ - инфильтративном дольковом и перстневидноклеточном раке (п=15), в то время как при прогностически благоприятных гистологических вариантах РМЖ -тубулярном, папиллярном и слизистом раке (п=9) доминировал апикально-люминальный тип окрашивания ткани опухоли с ИК025.

При доброкачественных опухолях молочной железы (п=12),

непролиферативных формах мастопатии (п=5), гиперпластических изменениях с дисплазией слабой или умеренной степени (п=13) экспрессия М11С1/ИК025 в эпителии во всех случаях была ограничена апикальной поверхностью клеток. Появление деполяризованного распределения МиС1/ИК025 в клетках эпителия молочной железы было ассоциировано с тяжелой формой пролиферативных нарушений и обнаружено в 27% случаев при тяжелой дисплазии эпителия (п=11) и в 71% наблюдений при внутрипротоковом раке РМЖ (п=7).

Экспрессия различных по гликозилированию форм М11С1 в нормальных и опухолевых тканях человека. Сравнительная оценка способности ИК025 взаимодействовать с М11С1 (высокоочищенный МиС1, иммобилизованный на полистироловом планшете; серийные срезы ткани РМЖ) после обработки антигенного материала ферментами различной специфичности или реакцией периодатного окисления, показала, что ИК025 узнает сиалированный углевод-зависимый эпитоп, частично экранированный олигосахаридами в нативном секреторном муцине. Высокое содержание в составе молекулы М11С1 антигенных детерминант с подобными свойствами, по данным литературы, характерно для гипогликозилированного муцина.

В сравнительном исследовании, выполненном на образцах нормальных тканей человека, ИК025 и анти-МиС1 МКА, полученные к рекомбинантному пептиду МиС1, полностью дегликозилированному (анти-ароМиС1), частично дегликозилированному (анти-ёеМиС 1) или нативному секреторному муцину молочной железы, отличались по взаимодействию с эпителием молочной, слюнной, поджелудочной железы, желудка, легкого, почки, мочевого пузыря и яичника, что соответствует известной вариативной экспрессии МиС 1 в различных органах.

Тестирование образцов тканей эпителиальных злокачественных новообразований (п=23) показало, что наиболее высокая по интенсивности специфического окрашивания и частоте положительных случаев иммунохимическая реакция наблюдается при использовании ИК025 и

антител анти-apoMUCl и анти-deMUCl, что также согласуется с представлениями о повышенной экспрессии гипогликозилированного муцина в клетках злокачественных опухолей человека [Hanisch F.G. & Müller S., 2000].

При сравнительном исследовании образцов РМЖ, ткани молочной железы, окружающей опухоль (п=14) и тканей доброкачественных опухолей молочной железы (п=6) отмечено, что повышенное содержание гипогликозилированного MUC1 в клетках не является отличительной особенностью малигнизированного эпителия молочной железы.

Обнаруженные особенности внутриклеточного распределения антигена при тяжелой форме пролиферативных изменений в эпителии молочной железы, стали предпосылкой для более пристального изучения экспрессии MUC1/HK025 при предопухолевых нарушениях в эпителии проводящих отделов легкого и слизистой оболочки шейки матки.

II. Экспрессия MUC1 в бронхиальном эпителии при раке легкого

MUC1/HK025 в бронхиальном эпителии при плоскоклеточном раке легкого (гистологическое исследование). При исследовании операционного материала в ткани ПКР легкого специфическое окрашивание с ИК025 - более 25% ИК025-положительных (ИК025+) опухолевых клеток -выявлено в 41% случаев. Частота ИК025+ случаев снижалась с уменьшением степени гистологической дифференцировки опухоли, не зависела от клинико-анатомической локализации новообразования, не коррелировала со степенью распространенности опухолевого заболевания и экспрессией в опухолевых клетках белков р53 и Ki-67.

При исследовании тканей бронхов пораженного опухолью легкого установлено, что экспрессия MUC1/MK025 не характерна для морфологически неизмененного и гиперплазированного покровного бронхиального эпителия, а также зрелого метаплазированного плоского эпителия. Специфическая реакция с ИК025 окрашивала клетки незрелого

метаплазированного плоского эпителия и базалъные клетки в участках десквамации цилиндрического эпителия.

При предопухолевых нарушениях в покровном бронхиальном эпителии, сопутствующих ПКР легкого, экспрессия MUC1/HK025 выявлена в 55% наблюдений: при слабой или умеренной дисплазии (п=10) — в 80% случаев, при тяжелой дисплазии (п=9) - в 56% случаев, при CIS (п=12) - в 33% случаев. Соответствие специфического окрашивания с ИК025 в очагах CIS и в ткани инвазивного ПКР у тех же пациентов по относительной доле ИК025+ опухолевых клеток отмечено в 67% случаев.

В эпителии, прилегающем к CIS или участкам дисплазии, независимо от характера экспрессии MUC1/HK025 в очагах атипии, наблюдалось аномальное для эпителиального покрова бронхов окрашивание с ИК025 - в метаплазированном плоском эпителии и/или в базальных и промежуточных клетках цилиндрического эпителия (рис.1).

Рис.1. Ткани бронха пораженной опухолью доли легкого (центральный ПКР).

Окрашивание гематоксилином и эозином (1, 3, 5), иммунопероксидазное окрашивание с ИК025 (2, 4, 6). Экспрессия МиС1/ИК025 в фокусе тяжелой дисплазии (2У; 3, 4), в истонченном метаплазированном плоском эпителии (2Т) и в базальных клетках реснитчатого эпителия рядом с очагом поражения. Негативный цилиндрический эпителий (2Т1; 5, 6).

Патологические нарушения достоверно чаще обнаруживались на фоне экспрессии МиС1/ИК025 в клетках бронхиального эпителия, чем в ИК025-негативных участках: в 60% и 9,8% наблюдений, соответственно (р<0,001).

МиС1/ИК025 в бронхиальном эпителии при плоскоклеточном раке легкого (цитологическое исследование). В ходе сравнительного исследования образцов биопсии и бронхиальных мазков-скарификатов, взятых с одного и того же участка слизистой оболочки бронхов у больных НЦРЛ (39 наблюдений), отработаны критерии оценки характера экспрессии МиС1/ИК025 в цитологических образцах бронхиального эпителия. На основании обобщения полученных результатов, совокупность признаков, включающая оценку морфологии клеток и характер иммуноцитохимического окрашивания с ИК025, объединены под условным названием «МиС1-тест».

Результат М11С1-теста считали положительным (МиС1-тест <+>), т.е. свидетельствующим о наличии аномальной экспрессии МиС1/ИК025 в исследованном участке бронхиального эпителия, если в цитологических препаратах присутствовали:

0 ИК025+ клетки метаплазированного плоского эпителия, как атипические, так и без признаков атипии, с деполяризованным окрашиванием мембраны и/или цитоплазмы;

° расположенные группами или разрозненные ИК025~ промежуточные (резервные) клетки цилиндрического эпителия с цитоплазматическим окрашиванием;

° расположенные группами ИК025 базальные клетки с увеличенным в размере или гиперхромным ядром и цитоплазматическим окрашиванием.

В остальных случаях, а именно, при наличии в цитологических образцах единичных ИК025+ разрозненных базальных клеток, цилиндрических клеток с окрашиванием апикальной поверхности или ИК025+ бокаловидных клеток, результат МиС1 -теста считали отрицательным (МиС1-тест <->).

Примеры картины иммуноцитохимического окрашивания, соответствующей МиС1-тест <+>, представлены на рис.2.

I

Рис.2. Мазки-скарификаты, взятые со слизистой оболочки бронхов у больных центральным ПКР легкого (индивидуальные случаи). Иммунофлуоресцентное окрашивание с ИК025 (нечетные номера) и окрашивание гематоксилином и эозином (четные номера). Положительный результат М11С1-теста.

При иммуноцитохимическом исследовании скарификатов слизистой оболочки бронхов у больных ХНЗЛ аномальная экспрессия МиС1/ИК025 в клетках эпителия бронхиального выявлена в 19% случаев. Положительный результат МиС1-теста не коррелировал с цитологическими признаками плоскоэпителиальной метаплазии, базальноклеточной гиперплазии или воспаления.

В ходе клинического обследования в течение последующих 3-6 месяцев, среди пациентов, у которых получен положительный результат МиС 1 -теста, в 40% (6/15) случаев морфологически верифицирован НЦРЛ или тяжелая дисплазия бронхиального эпителия. Пациенты, у которых получен отрицательный результат МиС1-теста, по данным клинической документации в дальнейшем наблюдались от 3 до 5 лет без опухолевой патологии в проводящих отделах легкого.

При исследовании цитологических образцов, полученных со слизистой

оболочки бронха пораженной опухолью доли легкого (п=78) или в участке роста НЦРЛ (п=33) у больных с клинически установленным диагнозом рака легкого, аномальная экспрессия MUC1/MK025 в клетках бронхиального эпителия, не имеющих признаков атипии, выявлена в 70% наблюдений, что достоверно превышало частоту подобных случаев в группе больных XH3JI (р<0,001)•

Положительный результат MUC1-теста достоверно чаще наблюдался при центральном, чем при периферическом раке легкого (в 82% и 38% случаев, соответственно; р<0,001), при ПКР легкого - достоверно чаще, чем при злокачественных опухолях легкого других гистологических типов (в 81% и 6,3% случаев, соответственно; р<0,001).

При исследовании материала, полученного со слизистой оболочки бронхов не пораженных опухолью отделов легкого (п=58), аномальная экспрессия MUC1/MK025 в клетках бронхиального эпителия выявлена в 48% случаев, в том числе, при центральном раке легкого - в 50% случаев, при периферическом раке легкого - в 11% случаев (р=0,002).

У 12 больных центральным ПКР легкого результаты исследования экспрессии MUC1/MK025 в мазках-скарификатах бронхиального эпителия сопоставлены с данными спектральной лазерной флуоресцентной диагностики (33 участка слизистой оболочки бронхов). Выявлено, что в участках, характеризующихся высоким или умеренно повышенным показателем нормированной 5-АЛК-индуцированной флуоресценции, при гистологически верифицированном CIS или дисплазии аномальная экспрессия MUCl/nK025 наблюдалась достоверно чаще, чем при отсутствии морфологических признаков патологических изменений (р<0,001). При визуальном исследовании специфической флуоресценции протопорфирина IX в бронхиальных мазках-скарификатах, а также с использованием метода микроспектрофлуориметрии установлено, что ложно-положительный результат флуоресцентной бронхоскопии обусловлен повышенным накоплением 5-АЛК-индуцированного протопорфирина IX в цилиндрических клетках бронхиального эпителия.

При исследовании цитологических образцов, полученных у больных раком легкого с участков слизистой оболочки бронха после специализированного лечения - в зоне эндоскопического лечения НЦРЛ (п=70) или на стороне оперированного легкого (п=45), аномальная экспрессия МиС1/ИК025 в клетках бронхиального эпителия достоверно чаще наблюдалась при рецидиве ПКР, чем при отсутствии эндоскопических и морфологических признаков рецидива опухоли (в 90% и 41% случаев, соответственно; р<0,001).

В мазках-скарификатах, взятых со слизистой оболочки бронхов вне зоны лечения (п=32), положительный результат МиС1-теста получен в 50% наблюдений, в большинстве случаев - при положительном результате М1_1С1-теста в зоне лечения у тех же больных.

В группе больных, у которых при контрольном обследовании не установлено эндоскопических и морфологических признаков местного рецидива заболевания и которые были прослежены после лечения на протяжении времени 12 месяцев и более (68 пациентов), сопоставлены данные клинического мониторинга и иммуноцитохимического исследования мазков-скарификатов с ИК025. В ходе анализа выделены следующие группы больных:

° группа БР - пациенты, у которых за все время наблюдения не выявлено местного рецидива заболевания;

° группа МР - пациенты, у которых в ходе мониторинга обнаружен продолженный рост опухоли или рецидив НЦРЛ в зоне лечения (Рец), либо первично-множественный метахронный НЦРЛ (ПМЦР).

Отдельным наблюдением считали результаты, полученные при исследовании топологически независимых участков слизистой оболочки бронхов. В группе МР как отдельные наблюдения рассматривали результаты, полученные при исследовании участка слизистой оболочки до клинического выявления Рец или ПМЦР и после его эндоскопического лечения. Характеристика наблюдений представлена в таблице 1, результаты, полученные при динамическом исследовании - в виде диаграммы на рис.3.

Таблица.1.

Характеристика групп больных раком легкого, прослеженных в динамике после лечения, и параметров мониторинга___

Характеристика групп Группа MP Группа БР

Число больных 21 47

Интервал времени, прошедший после предшествующего лечения, мес 1-84 (ME 2,0) 1-108 (ME 3,0)

ИЦХИ исследование у больного выполнено:

однократно неоднократно (в динамике) 3 18 12 35

Количество наблюдений (прослеженных участков слизистой оболочки бронхов), в том числе: 52 60

местный рецидив ПКР 18 -

первично-множественный НЦРЛ без патологии 15 19 60

Длительность клинического мониторинга, мес 3-120 (ME 13) 12-204 (ME 36)

Продолжительность «иммуноцитохимнческого» мониторинга, мес 1-54 (ME 9,0) 1-66 (ME 22)

Кратность иммуноцитохимнческого исследования (1 исследование в интервале времени), мес 1 - 12 (ME 2,3) 1-12 (ME 2,8)

Всего исследований 191 234

Анализ полученных данных показал, что в общем количестве исследований положительный результат MUC1-теста достоверно чаще наблюдался у больных в группе MP, чем у больных в группе БР (в 76% и 16% случаев, соответственно; р<0,001).

В группе MP положительный результат MUC1-теста с большей частотой наблюдался в участках слизистой оболочки бронхов, в которых выявлен рецидив в зоне лечения или первично-множественный метахронный НЦРЛ, чем в участках, прослеженных у этих же больных без местного рецидива заболевания (в 89% и 59% случаев, соответственно; р<0,001).

Аномальная экспрессия MUC1/HK025 в клетках бронхиального эпителия в 94% (17/18) случаев непосредственно предшествовала клиническому выявлению местного рецидива НЦРЛ в зоне эндоскопического лечения и в 100% случаев (15/15) - первично-множественному НЦРЛ, в том числе, в 2-х случаях - ИК025-негативному ПКР.

Наблюдения в группе МР

_(а)__(Ь)

[3 - 36 мес] [3 - 24 мес] ' [7-36 мес] ' '[12-60 мес;

Первично-множеств. Рецидив ПКР Без патологии

НЦРЛ (п=12) (п=18) (п=16)

п=45

Рис.3. Распределение индивидуальных результатов МиСЛ-теста, полученных при исследовании мазков-скарификатов бронхиального эпителия у больных раком легкого в динамике.

Больные, у которых иммуноцитохимическое исследование в ходе мониторинга выполнено неоднократно (группа МР - 18 больных, группа БР - 35 больных). По оси X - наблюдения (участки слизистой оболочки бронхов); по оси У -количество выполненных исследований. Результаты МиС1-теста представлены в хронологическом порядке, независимо от интервала времени, прошедшего между исследованиями, (а) местный рецидив заболевания у тех же больных установлен в других отделах бронхиального дерева; (Ь) участки слизистой оболочки бронхов, прослеженные после успешного лечения местного рецидива заболевания. Я -МиС1-тест <+>;■ - МиС1-тест <->; ■- морфологически верифицированный ПКР. В квадратных скобках - длительность клинического мониторинга.

Интервал времени от первого за время наблюдения положительного результата МиС1-теста до морфологической верификации рецидива ПКР в зоне эндоскопического лечения составлял от 2 до 18 месяцев (МЕ 7 мес); до морфологической верификации первично-множественного метахронного НЦРЛ - от 2 месяцев до 10 лет (МЕ 15 мес).

По результатам математической обработки данных, в группе

наблюдений, ограниченной результатами, полученными в течение 24 месяцев мониторинга, аномальная экспрессия МиС1/ИК025 в бронхиальном эпителии достоверно ассоциирована с повышенной вероятностью клинического выявления Рец или ПМЦР (табл.2). Положительный результат МиС1-теста, полученный неоднократно (в двух и более последовательных исследованиях), выделяет случаи местного рецидива заболевания с чувствительностью 95% и специфичностью 72% (предсказательная значимость положительного и отрицательного результата теста 63% и 97%, соответственно).

Таблица 2

Относительный риск (ЯЛ) клинического выявления рецидива центрального плоскоклеточного рака или метахронного НЦРЛ на фоне аномальной экспрессии МЦС1/ИК025 в бронхиальном эпителии.__

МиС1-тест п Рец или ПМЦР БР (ДИ 95%)

Первое исследование за время наблюдения 48 24 24 3,7 (1,7-8,1) р=0,001

<-> 44 6 38

В динамике <+> <+> 33 21 12 20,4 (2,9 - 142) р=0,002

32 1 31

Таким образом, обобщение полученных результатов позволяет заключить, что появление экспрессии МиС1/ИК025 в резервных клетках бронхиального эпителия и в метаплазированном плоском эпителии связано с ранними этапами патогенеза неопластических нарушений и является предиктивным маркером развития плоскоклеточного рака в проводящих отделах легкого.

На основе полученных данных разработан алгоритм включения исследования экспрессии МиС1/ИК025 в скарификатах бронхиального эпителия в схему обследования больных плоскоклеточным раком легкого после специализированного лечения, направленный на формирование группы повышенного риска местного рецидива заболевания (рис.4).

Хирургическое или эндоскопическое лечение

Контрольное бронхоскопическое исследование

Зона эндоскопического лечения Линия хирургической резекции

Вне зоны эндоскопического или хирургического лечения

Рис.4. Алгоритм формирования группы высокого риска местного рецидива заболевания у больных плоскоклеточным раком легкого.

III. Экспрессия MUC1 при предопухолевых изменениях в эпителии шейки матки (цитологическое исследование)

Исследование цитологического материала, полученного с неизмененной слизистой оболочки шейки матки, показало, что экспрессия МиС1/ИК025 не характерна для клеток плоского эпителия поверхностного типа. Деполяризованное по характеру распределения и различное по интенсивности окрашивание поверхностной мембраны и цитоплазмы с ИК025 наблюдалось в клетках незрелого метаплазированного плоского эпителия. Поляризованное окрашивание цитоплазмы клеток плоского эпителия в ряде случаев отмечено при возрастных атрофических изменениях слизистой оболочки шейки матки.

Аналогичный характер экспрессии ]УШС1/ИК025 в клетках плоского эпителия наблюдался при воспалительных и фоновых заболеваниях шейки матки.

При НРШМ и ЦИН атипические ИК0254 клетки с деполяризованным окрашиванием поверхностной мембраны и/или цитоплазмы (рис.5, 1 — 4) выявлены в 94% случаев. Высокой интенсивностью специфического окрашивания с ИК025 отличались дискариотические клетки базального и парабазального типа, а также клетки с выраженной гиперхромазией ядра.

Рис.5. Мазки из эктоцервикса. Клинический диагноз: рак шейки матки (1 -

4), карцинома in situ (5, 6). Иммунофлуоресцентное окрашивание с ИК025 (1,3,

5), докрашивание гематоксилином (2, 4, 6). Экспрессия М11С1/ИК025 в атипических клетках плоского эпителия (1, 3); ИК025+ дискератоцит-подобные клетки, ДПК+ (5).

При исследовании неполноценного материала прицельный анализ морфологии ИК025 клеточных элементов существенно облегчал обнаружение клеток с дискариозом на фоне негативных нормальных клеток плоского эпителия, воспалительного или аморфного компонента мазка (рис.5; 3 и 4).

Одной из особенностей картины иммуноцитохимического окрашивания

цервикальных мазков при НРШМ и ЦИН являлись мелкие, округлые, разрозненные ИК025" дискератоцит-подобные клетки (ДПК+) с интенсивным деполяризованным окрашиванием поверхностной мембраны и/или цитоплазмы (рис.5; 5 и 6).

ДПК+ в цервикальных мазках при ЦИН и НРШМ обнаружены в 80% случаев, что достоверно превышало частоту подобных наблюдений у клинически здоровых женщин и у пациенток с фоновыми и воспалительными заболеваниями шейки матки (рис.6).

р=0,170_

Рис.6. Частота наблюдения ИК025+ дискератоцит-подобных клеток (ДГЖ+) в цервикальных мазках: у здоровых женщин (I), женщин с фоновыми и воспалительными заболеваниями шейки матки (II), при НРШМ и ЦИН до лечения (III), у клинически здоровых пациенток после органосохраняющего

лечения ЦИН (V).

■ - единичные или множественные ДПК' (доля случаев); р - уровень значимости отличий (х2-критерий), *отличия статистически достоверны.

^ -I— _г ——

р<0,001* ~р<0,00Г

к 100 -Г----1-н----

\ш&

Среди пациенток, прослеженных в динамике после органосохраняющего лечения ЦИН (группа IV), выявление на промежуточных сроках мониторинга или на этапе контрольного обследования в цервикальных мазках ИК025+ дискариотических клеток, комплексов ИК025+ резервных клеток и ДПК+ коррелировало с клинически установленным рецидивом заболевания или неполной регрессией патологических изменений в эпителии шейки матки.

Среди клинически здоровых пациенток, обследованных после успешного лечения ЦИН (группа V), картина иммуноцитохимического окрашивания цервикальных мазков с ИК025 в подавляющем большинстве

случаев не отличалась от таковой у женщин в группе I, ДПК+ обнаружены только в 6% случаев (рис.6).

Известно, что обнаружение в цитологических препаратах цервикального эпителия одиночных дискератоцитов патогномонично для инфекции ВПЧ [Титмушш Э., Адаме К., 2009]. В ходе сравнительного анализа данных иммуноцитохимического исследования с ИК025 и лабораторного исследования на урогенитальные инфекции выявлено, что наличие ДПК+ в цервикальных мазках достоверно коррелирует с положительным результатом теста на ДНК ВПЧ ВКР при фоновых и воспалительных заболеваниях шейки матки (группа II), а также у пациенток, обследованных после органосохраняюгцего лечения ЦИН (группы IV и V; табл.3).

У пациенток в группах IV и V ДПК" достоверно чаще наблюдались при наличии в числе определяемых типов ВПЧ ДНК вируса 16 и/или 18 типа (табл.4), как правило, в случаях, в которых имела место неполная эрадикация вируса, обнаруженного до лечения.

Таблица 3

Частота наблюдения ИК025+ дискератоцит-подобных клеток (ДПК+) в цервикальных мазках в зависимости от наличия инфекции ВПЧ ВКР_

Группы п ВПЧ ВКР+ ВПЧ ВКР- Р

п ДПК+ (%) п ДПК+ (%)

II 77 34 17(50%) 43 6 (14%) 0,001

III 95 81 68 (84%) 14 8 (57%) 0,051

IV 198 40 25 (63%) 158 16(10%) <0,001

V 50 7 3 (43%) 43 0 0,003

ВСЕГО 420 162 113 (70%) 258 30 (12%) <0,001

Таблица 4

Частота наблюдения ИК025+ дискератоцит-подобных клеток (ДПК+) в цервикальных мазках в зависимости от наличия ДНК вируса 16 и/или 18 типа в числе определяемых типов ВПЧ ВКР___

Группы N ВПЧ 16/18 + ВПЧ 16/18 - Р

11 ДПК+ (%) п ДПК+(%)

II 34 21 12 (57%) 13 5 (39%) 0,481

III 81 60 51 (85%) 21 17(81%) 0,733

IV 40 23 19(83%) 17 6 (35%) 0,003

V 7 3 3 (100%) 4 0 0,029

ВСЕГО 162 107 85 (79%) 55 28(51%) <0,001

Не обнаружено корреляции между наличием в мазках ДПК+ и положительным результатом на геном ВПЧ низкого канцерогенного риска, Н.внпркх, цитомегаловируса, С.ТгасЬотайз, и.игеа1у1лсшп, а также бактериальным вагинозом (р>0,05). ДПК+ достоверно чаще наблюдались при инфекции М.Ъотнш (р=0,010), чем при ее отсутствии, однако в 7 из 11 случаев данный вид инфекции сочетался с ВПЧ ВКР.

При положительном результате на геном ВПЧ 16 и/или 18 типа, независимо от установленного у пациенток клинического диагноза, в пуле ДПК+ отмечены выраженные признаки цитопатических изменений.

Высокая экспрессия М11С1 в клетках, наличие которых характерно для папилломавирусной инфекции, обращает на себя внимание в связи с известной физиологической функцией МиС1 в защите эпителия от инвазии патогенных микроорганизмов. Корреляция между М11С1-положительными дискератоцитами и инфекцией ВПЧ ВКР, а также высокий уровень экспрессии антигена в атипических клетках при ЦИН дают основания предположить вирус-ассоциированный характер изменений экспрессии МиС1 в эпителии шейки матки.

IV. Серологические исследования Разработка тест-системы

Тест-система для количественного определения МиС1 в сыворотке крови («ИФА-ИК025») разработана в формате твердофазного ингибиторного ИФА с использованием лабораторных образцов ИК025, меченных биотином, и высокоочищенного МиС1 из женского молока. Высокая чистота образца антигена подтверждена методами прямого и непрямого твердофазного ИФА с использованием поликлональных антител к ^М и лактоферрину

человека, специфичность антигена - методом иммуноблота, в том числе, в сравнительном исследовании с использованием коммерческого МКА МСЬ-МиСЬСОЯЕ (клон Ма695).

Технические параметры и аналитические характеристики тест-системы «ИФА-ИК025» (сходимость, воспроизводимость, точность, надежность) приведены в соответствие с требованиями, которые предъявляются к иммуносорбентным количественным методам анализа [ГОСТ Р 51352-99].

В сыворотке крови доноров уровень MUC1 /ИК025 варьировал от 8 до 43 Ед/мл и в среднем составлял 25±7 Ед/мл (± Sx), ME [р25-р75]: 24 [20 - 30] Ед/мл. Дискриминационный уровень, соответствующий верхнему 95% доверительному интервалу (срсднсе+25х), составил 40 Ед/мл (ДУ40).

Прямое сравнительное тестирование образцов сыворотки крови здоровых лиц и онкологических больных с использованием «ИФА-ИК025» и коммерческих диагностических наборов («CA 15-3 ELISA», DRG Instruments Gmbh; «CanAg CA15-3 EIA», CanAg Diagnostics) показало высокую корреляцию между содержанием в сыворотке крови MUC1/HK025 и СА15-3 (г=0,990, р<0,001; коэффициент отличия количественных величин 1,66). Заключение о том, что MUC1, который определяется в сыворотке крови с использованием «ИФА-ИК025», является близким аналогом СА15-3, подтверждено анализом клинико-лабораторных данных, полученных при исследовании сывороточного уровня MUC1/MK025 в группе пациенток с заболеванием молочной железы.

MUC1/HK025 в сыворотке крови при неопухолевых заболеваниях легкого и раке легкого

При неопухолевых заболеваниях или доброкачественной опухоли легкого уровень MUC1/MK025 в сыворотке крови больных варьировал от 7 до 134 Ед/мл (ME 29 [22 - 36] Ед/мл). Сывороточный уровень МиС1>ДУ40 выявлен в 19% случаев, преимущественно при интерстициальных заболеваниях легких (в 50% наблюдений).

При злокачественных опухолях легкого уровень MUC1/HK025 в сыворотке крови больных до начала лечения составлял от 9 до 920 Ед/мл (ME 40 [29 - 60] Ед/мл). Доля случаев М0С1>ДУ40 среди больных

аденокарциномой легкого (АК; п= 101) составила 66%, в том числе, при бронхиолоальвеолярном раке (n= 12) - 25%; среди больных аденоплоскоклеточным раком (п=21) - 62%; ПКР легкого (п=136) - 46%; при карциноиде легкого (n= 17) - 24%; анапластическом раке (п=8) - 50%; крупноклеточном раке (п=3) и мелкоклеточном раке (п=4) - 100%; при саркоме легкого (п=5) - 17%.

Методом логистической регрессии (ROC-анализ) установлено, что случаи, в которых у больных раком легкого морфологически верифицированы регионарные или отдаленные метастазы опухоли, со специфичностью 90% (при чувствительности 35%) могут быть идентифицированы по показателю, превышающему 60 Ед/мл (ДУ60). Величина площади под ROC-кривой (AUC) для этого распределения составила 0,63 (0,52 - 0,72; /><0,001), что соответствует средней по качеству модели.

При немелкоклеточном раке легкого (HMPJI) уровень М11С1>ДУ60 в сыворотке крови больных до начала лечения наблюдался достоверно чаще, чем при неопухолевых заболеваниях или доброкачественных опухолях легкого: в 28% против 4,8% случаев, соответственно (р<0,001); при АК легкого - достоверно чаще, чем при ПКР (в 43% и 17% случаев, соответственно; р<0,001).

В отдельно взятой группе больных АК легкого уровень MUC1/MK025 в сыворотке крови у пациентов до начала лечения варьировал от 10 до 920 Ед/мл (ME 52 [34 - 75] Ед/мл). При анализе клинических данных обнаружено, что корреляция между частотой случаев М11С1>ДУ60 и стадией заболевания преимущественно выражена в старшей возрастной группе больных (>64 лет; рис.7, А).

При этом сывороточный уровень МиС1>ДУ60 у больных АК легкого старшего возраста был достоверно ассоциирован с отдаленными метастазами опухоли (табл.5). Аналогичная тенденция наблюдалась и в отношении регионарных метастазов при местно-распространенном заболевании.

А.

р=0.129

р<0.001

р=0,546

100%

75%

50% -25%

0%

В.

0%

I II ША ШВ IV

(20) (8) (19) (6) (26)

_р<0,00Г

I И ША ШВ IV

(17) (2) (5) (2) (17)

юо%

75% -50% -25% -

ш

__

г

I II ША ШВ IV

(13) (30) (19) (10) (6)

I И ША ШВ IV

(19) (9) (13) (7) (8)

Возрастная группа <64 лет Возрастная группа >64 лет

Рис.7. Распределение случаев с повышенным сывороточным уровнем М11С1/ИК025 в группах больных АК (А) и ПКР (В) легкого, в зависимости от клинической стадии заболевания и возраста пациентов. МиС1/ИК025, Ед/мл: □ <40, Я40 - 59; И>60; в скобках - число больных; р - уровень значимости отличий по частоте случаев М11С1>ДУ60.

Таблица 5

Относительный риск наличия отдаленных (М1) или регионарных (Ы+) метастазов при сывороточном уровне МиС1>ДУ60 в различных возрастных группах больных аденокарциномой легкого_

Клинические группы п миоэдубо К К Р

<64 лет М1 МО 26 53 13 (50%) 18 (34%) 1,5 (0,8-2,9) 0,168

>64 лет М1 МО 17 26 14(82%) 8(31%) 4,5(1,5-13,3) 0,008

<64 лет ^мо ммо 32 21 12(38%) 5 (24%) 1,3 (0,8-1,9) 0,368

>64 лет тмо шмо 8 18 5 (63%) 3 (17%) 3,8(1,2-12,0) 0,026

При ПКР легкого уровень М11С1/ИК025 в сыворотке крови больных до начала лечения варьировал от 9 до 366 Ед/мл (МЕ 37 [28 — 52] Ед/мл). Сывороточный уровень МЕ1С1>ДУ60 достоверно чаще встречался у больных ПКР легкого в возрасте <64 лет, чем у больных старшей возрастной группы (р=0,021; рис.7, В) и коррелировал с высокой степенью местно-регионарной распространенности опухоли {р<0,05).

Вследствие описанных выше особенностей, в общей группе наблюдений диагностическая значимость сывороточного уровня МиС1>ДУ60, как показателя аденогенной природы новообразования, при локализации злокачественной опухоли в периферических отделах легкого среди пациентов старше 64 лет оказалась значительно выше, чем среди больных младшей возрастной группы (табл.6).

По результатам анализа ЯОС-кривых, рассчитанных для уровня МиС1/ИК025 в сыворотке крови при дифференциации случаев АК от других гистологических типов периферического рака легкого в старшей возрастной группе пациентов, величина АиС составила 0,78 (0,68 - 0,89; р < 0,001), что соответствует хорошей по качеству модели.

Таблица 6

Диагностические показатели для сывороточного уровня МиС1>ДУ60 как показателя аденогенной природы новообразования в зависимости от клинико-анатомической локализации опухоли в легком и возрастной группы больных

Клинические группы п С, % Ч, % РРУ, % ^У, %

Поражение центральных отделов 119 78 52 38 87

легкого

Поражение периферических 179 89 40 82 55

отделов легкого, в том числе:

<64 лет 97 78 34 72 41

>64 лет

I - IV стадии заболевания 72 97 50 95 63

III и IV стадии заболевания 34 94 80 94 80

Примечание: С — специфичность, Ч - чувствительность, РРУ и 1ЧРУ -предсказательная ценность положительного и отрицательного результата, соответственно.

У 100 больных раком легкого определение сывороточного уровня MUC1/HK025 выполнено до и после хирургического лечения (7-10 день после пневмонэктомии или лобэктомии). Результаты анализа динамики показателя в зависимости от исходных значений до операции, клинико-морфологических особенностей заболевания и объема хирургического вмешательства показали, что источником повышенного содержания MUC1 в сыворотке крови, как при АК, так и при ПКР, с наибольшей вероятностью являются пораженные опухолью ткани легкого.

Полученные нами результаты согласуются с известными опубликованными данными в том, что определение сывороточного уровня MUC1, в панели с другими серологическими маркерами, в качестве дополнительного метода исследования, может быть полезным для уточняющей диагностики гистологического типа опухоли у неоперабельных больных раком легкого [Molina R. et al, 2008]. При этом, по нашим наблюдениям, достоверность этой оценки будет выше в старшей возрастной группе пациентов.

Установленная корреляция между повышенным содержанием MUC1/HK025 в сыворотке крови, клинически агрессивным гистологическим типом злокачественного новообразования в легком и степенью распространенности опухоли у первичных больных обосновывает прогностическую значимость сывороточного уровня MUC1, выявленную работами других авторов, в том числе, при обследовании больных, получающих таргетное лечение [Ohara G. et al., 2008; Ishikawa N. et al., 2008].

MUC1/HK025 в сыворотке крови при раке желудка

У больных раком желудка сывороточный уровень МиС1/ИК025 варьировал от 8 до 66 Ед/мл. МиС1>ДУ40 выявлен только в 11% случаев, МиС1>ДУ60 - в 1,5% наблюдений. При этом отмечена сравнительно высокая доля случаев (25%), в которых содержание MUC1/MK025 в сыворотке крови пациентов не превышало 18 Ед/мл - нижнего предела интервала [р10-р90],

охватывающего 80% значений показателя в группе доноров (ДУ18).

Среди больных раком желудка сывороточный уровень МиС1<ДУ18 наблюдался достоверно чаще, чем у доноров, а также среди пациентов других обследованных нами клинических групп (р<0,001), а частота подобных случаев возрастала с увеличением стадии заболевания (рис.8).

Доноры

8,6%

п=93

Больные раком желудка

I стадия (п=58)

II стадия (п=23)

III-IV стадия (п=123)

■ <18 Ед/мл; □ 18-39 Ед/мл; >40 Ед/мл.

Рис.8. Распределение случаев, отличающихся по сывороточному уровню МиС1/ИК025 (Ед/мл), в группе доноров и в группе больных раком желудка (% - относительная доля случаев М11С1<ДУ18).

Увеличение частоты случаев МиС1<ДУ18 прямо коррелировало с местной распространенностью опухоли (Т1 и Т2 против ТЗ и Т4: 17% и 33%, соответственно; р=0,028). Среди пациентов, у которых местное распространение карциномы желудка соответствовало параметрам ТЗ или Т4, а уровень метастатического поражения - М1 (48 больных), доля случаев MUC1 <ДУ 18 достигала 38%.

По данным литературы, на результат количественного определения муцина в сыворотке крови человека существенное влияние оказывает генетически детерминированный полиморфизм MUC1, при этом низкие значения показателя ассоциированы с вариантом генотипа, который определяет синтез «короткого» полипептида MUC1 (SNP rs4072037 АА) [Janssen R. et al., 2006; Kruit A. et al., 2009; Shigemura M. et al., 2013]. Лица-

носители данного аллельного варианта в некоторых популяциях отличаются повышенным риском заболевания раком желудка [Carvalho F., et al., 1997; Saeki N. et al., 2011; Palmer A.J. et al., 2012; Zheng L. et al., 2013]. Эту корреляцию объясняют неспособностью «короткого» MUC1 обеспечить эффективную защиту эпителия желудка при поражении Helicobacter pylori и переходом инфекции в хроническую форму, на фоне которой возрастает вероятность возникновения неопластических нарушений [Silva F. et al., 2001]. Обобщение данных литературы позволяет связать высокую долю случаев с низким относительно среднестатистических значений в норме сывороточным уровнем MUC1 среди обследованных нами больных с предрасположенностью к заболеванию раком желудка у соответствующего круга лиц.

MUC1/HK025 и послеоперационная пневмония у больных злокачественными опухолями органов верхних отделов ЖКТ

По данным клинической документации, в обследованной нами группе больных раком желудка и раком пищевода, которым выполнялась радикальная или паллиативная циторедуктивная операция открытым хирургическим доступом (п=194), осложнения II или III степени тяжести (по классификации Clavien-Dindo [Dindo D. et al., 2004]), в течение 2-10 дней послеоперационного периода зафиксированы у 26% больных; всего - 57 клинических эпизодов осложнений различного характера, среди которых наиболее частым послеоперационным осложнением являлась пневмония (п=22).

В ходе ретроспективного анализа выявлено, что общая частота случаев послеоперационных осложнений не зависела от сывороточного уровня М11С1/ИК025 до операции, однако пневмония после хирургического вмешательства достоверно чаще наблюдалась при МиС1<ДУ18, чем при МиС1>ДУ18: в 25% и 6,8% случаев, соответственно (р<0,00/, х2-критерий; RR=3,7 [1,7-1,9], p=0,00J).

Частота случаев послеоперационной пневмонии (ПП) в общей группе больных не зависела от возраста пациентов и интегральной оценки физического состояния по шкале ASA (American Society of Anesthesiologists; p>0,05), была достоверно выше среди мужчин (р=0,01), среди больных с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ; р<0,001), а также после выполнения хирургического вмешательства торакоабдоминальным доступом (р<0,001).

Дифференцированный анализ показал, что при уровне MUC1<18 Ед/мл в сыворотке крови до операции вероятность развития ПП значительно выше у пациентов в возрасте 60 лет и старше (RR=10,4 [2,3-46,9], р=0,002), чем у пациентов моложе 60 лет (RR=2,0 [0,7-5,4], р=0,187).

ХОБЛ и дооперационный сывороточный уровень МиС1<ДУ18 являлись независимыми факторами риска развития ПП в общей группе больных, а их сочетание существенно увеличивало вероятность данного вида осложнений (RR=12,5 [4,5-34,3], р<0,001).

Частота случаев ПП не зависела от абсолютного количества лейкоцитов в периферической крови больных до операции (р=0,492). Сочетание у больных до операции лимфопении (<0,8x109/л) и низкого уровня MUC1 в сыворотке крови приводило к выраженному синергичному эффекту в отношении вероятности развития ПП (RR=8,7 [3,8-20,\],р<0,001).

Развитие послеоперационной пневмонии, главным образом, связывают с процедурой искусственной вентиляции легких и, в частности, с эндотрахеальной интубацией, которая открывает прямой доступ потенциальной инфекции в нижние отделы дыхательных путей [Kollef М.Н., 2004]. Существуют данные о прямой корреляции между результатами количественного определения MUC1 в сыворотке крови, содержанием антигена в бронхиолоальвеолярном лаваже и вариантами упомянутого выше генетического полиморфизма MUC1 (SNP rs4072037) [Shigemura М. et al„ 2012; 2013]. Полученные нами результаты свидетельствуют в пользу того, что низкое относительно среднестатистических величин показателя в норме

содержание MUC1 в циркулирующей крови может быть фенотипическим проявлением варианта генотипа, с которым связана уязвимость слизистых оболочек при инфекционном поражении.

ВЫВОДЫ

1. Оригинальное моноклональное антитело ИК025, полученное к высокомолекулярному гликопротеину мембран жировых глобул женского молока, взаимодействует с сиалированным углевод-зависимым эпитопом в составе гипогликозилированного муцина MUC1. В злокачественных опухолях эпителиального генеза наблюдается повышенная, по сравнению с нормальными тканями, экспрессия MUC1/HK025 и не характерное для нормального эпителия деполяризованное внутриклеточное распределение антигена.

2. При предопухолевых изменениях в ткани молочной железы деполяризованная локализация MUC1/TIK025 в клетках эпителия появляется при тяжелой форме пролиферативных нарушений, при инфильтративном протоковом раке молочной железы (РМЖ) - наблюдается в 79% случаев, при других гистологических формах РМЖ - ассоциирована с клинически агрессивным типом опухоли.

3. Экспрессия MUC1/HK025 не характерна для нормального покровного бронхиального эпителия, гиперплазии цилиндрического эпителия и дифференцированного метаплазированного плоского эпителия бронхов. При дисплазии бронхиального эпителия экспрессия MUC1/HK025 наблюдается в 81% случаев, в очагах карциномы in situ — в 36%, в ткани плоскоклеточного рака легкого - в 41% случаев.

4. Аномальная экспрессия MUC1/HK025 в клетках цилиндрического и/или метаплазированного плоского покровного бронхиального эпителия у больных раком легкого после хирургического и/или эндоскопического лечения является фактором высокого риска развития местного рецидива опухоли и первично-множественного центрального рака (RR= 20,4 [2,9 -

142], р=0,002). Оценка характера экспрессии МиС1/ИК025 в бронхиальном эпителии в ходе мониторинга пациентов, в комплексе с бронхоскопическим и цитологическим исследованием слизистой оболочки бронхов, позволяет с чувствительностью 95% при специфичности 72% прогнозировать местный рецидив заболевания.

5. МиС1/ИК025 в норме не экспрессируется в клетках эпителиального покрова эктоцервикса, но определяется в клетках незрелого метаплазированного плоского эпителии у женщин репродуктивного возраста и при возрастных атрофических изменениях слизистой оболочки шейки матки. При цервикальной интраэпителиальной неоплазии (ЦИН) экспрессия М11С1/ИК025 в атипических клетках наблюдается в 95% случаев.

6. ИК025-положительные дискератоцит-подобные клетки без признаков атипии в цервикальном эпителии у клинически здоровых женщин обнаружены в 16% случаев, при фоновых и воспалительных заболеваниях шейки матки - в 30%, при ЦИН - в 80%, у пациенток после успешного органосохраняющего лечения ЦИН - в 6% случаев. Наличие подобных клеток в цервикальном мазке коррелирует с положительным результатом определения ДНК вируса папилломы человека высокого канцерогенного риска, как при ЦИН, так и при отсутствии неопластических нарушений в эпителии шейки матки.

7. На основе ИК025 разработана и валидирована тест-система для количественного определения МиС1 в сыворотке крови человека методом твердофазного ингибиторного иммуноферментного анализа. Выявлено, что М11С1/ИК025 является близким аналогом СА15-3 (г=0,990, р<0/)01); вариация сывороточного уровня МиС1/ИК025 у условно здоровых лиц соответствует интервалу 16 — 37 Ед/мл (р5 — р95).

8. Значительно повышенное содержание М1ЛС1/ИК025 в сыворотке крови (МиС1>60 Ед/мл) при первичном немелкоклеточном раке легкого наблюдается достоверно чаще, чем при доброкачественных опухолях и неопухолевых заболеваниях легкого (в 27% и 4,8% случаев, соответственно;

р<0,001), при аденокарциноме - достоверно чаще, чем при плоскоклеточном раке (43% и 17%, соответственно; р<0,001). При аденокарциноме легкого увеличение частоты случаев МиС1>60 Ед/мл коррелирует со стадией заболевания (р<0,004). Информативность сывороточного уровня МиС1>60 Ед/мл для уточняющей диагностики при раке легкого зависит от клинико-анатомической локализации новообразования и возраста пациентов.

9. При локализации злокачественной опухоли в периферических отделах легкого специфичность МиС1>60 Ед/мл, как показателя аденогенной природы новообразования, в старшей возрастной группе больных (>64 лет) составляет 97% (чувствительность 50%, РРУ 95%, ЫРУ 63%). При аденокарциноме легкого у больных данной клинической и возрастной группы сывороточный уровень М11С1>60 Ед/мл ассоциирован с высокой вероятностью наличия отдаленных метастазов (Ш1=4,5 [1,5 - 13,3], р =0,008). При плоскоклеточном раке легкого у больных младшей возрастной группы (<64 лет) уровень МЕГС1>60 Ед/мл коррелирует с местно-регионарной распространенностью опухолевого процесса (р<0,05).

10. При раке желудка значительно повышенное содержание МиС1/ИК025 в сыворотке крови обнаружено только в 1,5% случаев. С распространенной стадией заболевания коррелирует низкий относительно среднестатистических значений показателя в норме сывороточный уровень МиС1/ИК025 (<18 Ед/мл; р=0,041).

11. У больных раком желудка и раком пищевода низкий дооперационный сывороточный уровень МиС1/ИК025 является независимым фактором риска развития послеоперационной пневмонии (1Ш= 3,7 [1,7-7,9]; р<0,001).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Больным центральным плоскоклеточным раком легкого в ходе мониторинга после специализированного лечения рекомендуется проводить дополнительное исследование — определение характера экспрессии МиС1/ИК025 в клетках покровного бронхиального эпителия.

2. Исследование выполняется на материале бронхиальных мазков-скарификатов, полученных при плановой фибробронхоскопии.

3. Мазки-скарификаты получают в зоне лечения - по линии хирургической резекции бронхов или в области, которая подвергалась эндоскопическому лечению, а также в участках, подозрительных на опухолевое поражение по эндоскопическим признакам.

4. Иммуноцитохимическое окрашивание проводят на мазках, фиксированных 95% этиловым спиртом, методом иммунофлуоресцентного анализа с использованием моноклонального анти-МиС1 антитела, продукта гибридомы ИК025 (№ВСКК/П/465Д).

5. Исследование включает оценку распределения специфического окрашивания в клетках бронхиального эпителия и анализ цитограммы, в том числе, после докрашивания мазков стандартными гистохимическими красителями (гематоксилином и эозином).

6. Результат иммуноцитохимического исследования мазков-скарификатов с ИК025 считают положительным, т.е. свидетельствующим о наличии аномальной экспрессии М11С1/ИК025, если в цитологических препаратах при анализе иммунофлуоресценции обнаруживают не характерные для нормального бронхиального эпителия клеточные элементы: ° ИК025-положительные (ИК025+) клетки метаплазированного плоского эпителия, в том числе, без признаков атипии, с деполяризованным окрашиванием мембраны и/или цитоплазмы; ° расположенные группами или разрозненные ИК025+ промежуточные клетки цилиндрического эпителия с окрашиванием цитоплазмы; ° расположенные группами ИК025+ базальные клетки с увеличенным в размере или гиперхромным ядром и окрашиванием цитоплазмы.

7. Положительный результат иммуноцитохимического теста учитывают при планировании индивидуальной тактики дальнейшего наблюдения за больными, как фактор, связанный с высоким риском рецидива опухоли или развитием первично-множественного плоскоклеточного рака в исследованном участке слизистой оболочки бронхов.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Кармакова Т.А. - Изучение интегрального антигена мембран жировых глобул женского молока / Якубовская Р.И., Казачкина Н.И., Кармакова Т.А., Немцова Е.Р., Коростелева М.Д., Александер С.К., Авдеев Г.И., Соркин Э.Е., Барышников А.Ю., Короткова О.В., Кадагидзе З.Г. - Экспериментальная онкология, Т.12, №4 — Москва, 1990: стр. 6165.

2. Кармакова Т.А. - Реагенты для диагностики опухолей эпителиального происхождения / Виха Г.В., Сухно A.A., Кармакова Т.А., Якубовская Р.И., Барышников А.Ю., Короткова О.В. - Современные направления создания медицинских диагностикумов - Москва, 1990: стр.12.

3. Кармакова Т.А. - Иммуногистохимическое изучение антигена мембран жировых глобул женского молока при помощи моноклональных антител ИКО-25 / Якубовская Р.И., Барышников А.Ю., Кармакова Т.А., Казачкина Н.И., Авдеев Г.И., Делекторская В.В., Короткова О.В., Кадагидзе З.Г., Ермилова В.Д., Жордания К.И., Волченко H.H., Франк Г.И., Виха Г.В., Сухно A.A. - Архив патологии, №6- Москва, 1991: стр. 11-16.

4. Кармакова Т.А. - Моноклональные антитела ИКО-25 в изучении рака легкого / Кармакова Т.А., Якубовская Р.И., Сидорова Н..А., Телегина Л.В., Соколов В.В., Франк Г.А. - Труды 2-го Всесоюзного конгресса по болезням органов дыхания — Челябинск, 1991: стр.81-82.

5. Кармакова Т.А. - Штамм гибридных культивируемых клеток мыши, используемый для получения моноклональных антител к антигену мембран жировых глобул женского молока, пригодному для диагностики рака молочной железы и яичника / Барышников А.Ю., Короткова О.В., Кадагидзе З.Г. Якубовская Р.И., Кармакова Т.А., Казачкина Н.И., Авдеев Г.И., Жордания К.И. - Бюллетень иммунологии, №1 - Москва, 1992: стр.7.

6. Кармакова Т.А. - Цитологическая диагностика опухолей молочной железы при помощи иммуноцитохимии / Сидорова H.A., Кармакова Т.А., Якубовская Р.И., Франк Г.А. - Клиническая лабораторная диагностика, №7 - Москва, 1992: стр. 33-35.

7. Кармакова Т.А. - О некоторых формах рака молочной железы / Волченко H.H., Кармакова Т.А., Якубовская Р.И. - Архив патологии, Т.56, №4 - Москва, 1994: стр. 18-21.

8. Кармакова Т.А. - Эндоскопическая и иммуноцитохимическая диагностика ранних форм метахронного рака легкого. Проблемы современной онкологии / Телегина Л.В., Соколов В.В., Кармакова Т.А., Якубовская Р.И. - Материалы IV Всероссийского съезда онкологов - Ростов-на-Дону, 1995: стр.341-342.

9. Кармакова Т.А. - Метапластический рак молочной железы / Волченко Н.Н., Франк Г.А., Якубовская Р.И. Кармакова Т.А. - Архив патологии, Т.58, №1 - Москва, 1996:стр. 10-14.

Ю.Кармакова Т.А. - Морфологическая и иммуноморфологическая диагностика предраковых изменений и раннего протокового рака молочной железы / Франк Г.А., Волченко Н.Н., Кармакова Т.А., Якубовская Р.И. - В сб. Ранняя диагностика онкологических заболеваний, ред В.И.Чиссов, В.В.Старинский, Е.Н.Сотникова, МНИОИ им.П.А.Герцена - Москва, 1994: стр.78-82.

1 ¡.Кармакова Т.А. - Семилетнее наблюдение успешного эндоскопического удаления множественных очагов раннего синхронно-метахронного рака легких / Соколов В.В., Телегина JI.B., Кармакова Т.А. Филоненко Е.В. - Российский онкологический журнал, №2 - Москва, 1996: стр. 39-40.

12.Кармакова Т.А. - Направленный транспорт противоопухолевого ингибитора протеиназ из соевых бобов / Ларионова Н.И., Казанская Н.Ф., Гладышева И.Л., Паписова А.И., Воробьева Д.А., Кармакова Т.А., Якубовская Р.И. - Материалы III Российского национального конгресса "Человек и лекарство" - Москва, 1996: стр.150.

13.Кармакова Т.А. - Прогнозирование развития рецидивов и метахронных очагов начального центрального рака легкого с использованием МКАТ ИКО-25 / Чиссов В.В., Соколов В.В., Телегина JI.B., Кармакова Т.А., Якубовская Р.И., Франк Г.А., Трахтенберг А.Х. -Российский онкологический .журнал, №3 — Москва, 1997: стр.32-37.

14.Karmakova Т.А. - Prognosis and early detection of metachronous lung cancer using IC025 monoclonal antibody / Sokolov V.V., Telegina L.V., , Karmakova T.A., Yakubovskaya R.I., Frank G.A., Trakhtenberg A.C., Chissov V. I. - The 8th International Congress on Anti-Cancer Treatment - Paris, 1998: p.209.

15. Karmakova T.A. - Antitumor efficiency of monoclonal antibody in therapy of nude mice with xenograft of human colon carcinoma / Karmakova T.A., O.Bezborodova, E.Nemtsova, R.Yakubovskaya - The 10th NCI-EORTC Symposium on New Drugs in cancer therapy - Amsterdam, 1998: p.88.

16.Кармакова Т.А. - Исследования локализации и молекулярных взаимодействий биологически активных соединений в живых клетках и срезах тканей на основе метода конфокальной микроспектроскопии и реконструкции спектральных изображений / Феофанов А.Ф., Куделина И.А., Шитова Л.А., Гришин А.И., Кармакова Т.А., Р.И.Якубовская. -Биоорганическая химия, №12, Т.25 - Москва, 1999: стр.892-902.

17.Karmakova Т.А. - Inhibition of human colon cancer growth in nude mice by epithelium specific IC025 monoclonal antibody / Karmakova T.A.,

Bezborodova О., Yakubovskaya R., Nemtsova E. - The 9th International Congress on Anti-cancer Treatment - Paris, 1999: p. 284.

18. Кармакова T.A. - Моноклоналыше антитело ИК025, специфичное к антигену MUC1, противоопухолевое средство / Чиссов В.И., Якубовская Р.И., Кармакова Т.А., Немцова Е.Р., Юрин B.JL, Бобринева Р.А., Барышников А.Ю., Блохин Д.Ю., Иванов П.К., Чмутин Е.Ф. - Патент на изобретение RU 2198681, 2000.

19. Karmakova Т.А.- Immunoconjugates of Soybean Bowman-Birk Protease Inhibitor as Targeted Antitumor Polymeric Agents / Gladysheva I.P., Moroz N.A., Karmakova T.A., Nemtsova E.R., Yakubovskaya R.I., Larionova N.I.- Journal of Drug Targeting, V.9 - London, U.K., 2001: p. 303316.

20.Кармакова T.A. - Имутеран - новый препарат для иммунотерапии рака / Кармакова Т.А., Немцова Е.Р., Безбородова О.А., Якубовская Р.И. -Биотерапия рака. Материалы I Всероссийской научно-практической конференции - Москва, 2002: стр.33-35.

21.Кармакова Т. А - Предварительные результаты клинических испытаний имутерана - нового препарата для биотерапии рака / Артамонова, Е. В., Манзюк, JI. В., Барышников А.Ю., Якубовская, Р. И., Иванов, П. К., Чмутин, Е. Ф., Немцова, Е. Р., Кармакова, Т. А. -Российский биотерапевтический журнал, №3, Т.2 - Москва, 2003: стр.7073.

22.Кармакова Т.А. - Опухоль ассоциированный муцин MUC1 как основа для разработки новых подходов в диагностике и терапии злокачественных опухолей эпителиального генеза / Кармакова Т.А., Плютинская А.Д., Немцова Е.Р., Якубовская Р.И., Южакова Т.В., Бобринева Р.А., Юсифов А.И., Юрин B.JI. - Материалы V съезда иммунологов и аллергологов СНГ - Санкт-Петербург, 2003: стр.32.

23.Karmakova T.A. - Endoscopic and immunocytochemical diagnosis of primary recurent and metachronous lung carcinoma / Sokolov V.V., Telegina L.V., Karmakova T.A., Chisov V.I., Frank G.A., Yakubovskaya R.I. - Proceedings of the XIII World Congress for Bronchology - Barselona, Spain, 2004: p.56.

24. Кармакова T.A. - Опухоль-ассоциированый муциноподобый антиген MUC1: патофизиологическая роль, диагностические и терапевтические возможности / Якубовская Р.И., Кармакова Т.А., Волченко Н.А. -Российский биотерапевтический журнал, Т. 4, № 1 - Москва, 2005: стр. 19.

25. Кармакова Т.А. - Роль и место антител в терапии злокачественных новообразований / Якубовская Р.И., Кармакова Т.А - Вопросы онкологии, Т. 51, № 1 - Санкт-Петербург, 2005: стр. 28.

26. Karmakova Т.А. - Distribution of photosensitizers in human basal cell carcinoma tissue / Karmakova T.A., Filonenko E.V., Feofanov A.V., Sokolov

V.V., Yakubovskaya R.I., Luk'yanets E.A., Chissov V.I. - The 10th World Congress of the International Photodynamic association - Munich, Germany, 2005: p.59.

27.Кармакова T.A. - Результаты I-II фазы клинических испытаний препарата Имутеран / Манзюк JI.B., Артамонова Е.В., Кармакова Т.А., Якубовская Р.И. - Российский биотерапевтический журнал, №2 — Москва, 2006: стр.93-97.

28.Кармакова Т.А. - Биораспределение AJIK-индуцированного протопорфирина IX в ткани базальноклеточного рака человека / Кармакова Т.А., Филоненко Е.В., Феофанов А.В., Соколов В.В., Якубовская Р.И., Чиссов В.И. - Материалы Всероссийской-научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» - Российский биотерапевтичесий журнал, №1 - Москва, 2006: стр.26.

29. Кармакова Т.А. - Критерии отбора онкологических больных на терапию препаратом имутеран / Кармакова Т.А., Немцова Е.Р., Якубовская Р.И., Болотина Л.В., Артамонова Е.В., Манзюк Л.В. - Материалы III Российской конференции по иммунотерапии - Аллергология и иммунология, Т. 7. № 3 - Москва, 2006: стр.367а-367.

30.Кармакова Т.А. - Имутеран - первый отечественный препарат на основе моноклональных антител (I-II фаза клинических испытаний) / Манзюк Л.В., Артамонова Е.В., Бородкина А.Г., Болотина Л.В., Кармакова Т.А., Немцова Е.Р., Якубовская Р.И. - Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» - Российский биотерапевтичесий журнал, Т.6. №1 - Москва, 2007: стр. 59.

31. Кармакова Т.А. - Имутеран - препарат для иммунотерапии рака на основе моноклонального антитела к муцину MUC1 / Кармакова Т.А., Артамонова Е.В., Манзюк Л.В., Бородкина А.Г., Болотина Л.В., Королева Л.А., Немцова Е.Р., Безбородова О.А., Якубовская Р.И. - Материалы VIII Конгресса «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» - Москва, 2007: стр.245.

32. Karmakova Т.А. - Alteration in MUC1 expression in bronchial epithelium is an early marker for recurrent and metachronous bronchial carcinoma / Karmakova T.A., Yakubovskaya R.I., Telegina L.V., Filonenko E.V., Sokolov V.V., Frank G.A., Chissov V.I. - The 35th Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine, ISOBM, Tumor Biology, Vol.28(Suppll) - Prague, 2007: p. 97.

33.Karmakova T.A. - High-risk HPV infection and MUC1 mucin in cervical intraepithelial lesions / Karmakova T.A., Trushina O.I., Balachonceva O.S.. Vorobieva M.S., Volchenko N.N., Novikova E.G., Yakubovskaya R.I., Chissov V.I. - The 25th International Papillomavirus Conference - Malmo, Sweeden, 2009: p.18:19.

34. Кармакова Т.А. - Опухоль-ассоциированный муцин MUC1: новый взгляд на роль в патогенезе злокачественных новообразований эпителия / Кармакова Т.А., Якубовская Р.И. - Материалы VIII Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» - Российский биотерапевтичесий журнал, №2 - Москва, 2009: стр.9.

35. Кармакова Т.А. - Способ формирования группы риска неопластических нарушений в эпителии шейки матки / Якубовская Р.И., Кармакова Т.А., Волченко H.H., Новикова Е.Г., Трушина О.И. Патент на изобретение RU 2437096,2010.

36. Кармакова Т.А. - Способ оценки риска прогрессирования немелкоклеточного рака легкого после хирургического лечения / Якубовская Р.И., Кармакова Т.А., Скрипник В.В., Пикин О.В., Рудаков Р.В. Патент на изобретение RU 2472161,2011.

37. Кармакова, Т.А. - Муцин MUC1 в сыворотке крови и гуморальный ответ на MUC1 у больных раком легкого / Скрипник В.В., Кармакова Т.А., Рудаков Р.В., Амиралиев A.M. - OHKOxnpypnM=Oncosurgery, №2, Т.З -Москва, 2011: стр.84-85.

38. Кармакова Т.А. - Тест-система для определения муцина MUC1 в сыворотке крови человека методом иммуноферментного ингибиторного анализа на основе моноклоналыюго антитела ИК025 / Кармакова Т.А., Воронцова М.С., Скрипник В.В., Безбородова O.A., Якубовская Р.И. -Клиническая лабораторная диагностика, №2 - Москва, 2012: стр.53-56.

39. Кармакова Т.А. - Иммуноцитохимическое исследование экспрессии муцина MUC1 в цервикалыюм эпителии в норме и при патологических нарушениях / Кармакова Т.А., Якубовская Р.И., Трушина О.И., Новикова Е.Г., Волченко H.H., Мельникова В.Ю., Воронцова М.С., Балахонцева О.С. -Российский онкологический журнал, №2 - Москва, 2012: стр.23-28.

40. Кармакова Т.А. - ИК025-реактивный муцин MUC1 в сыворотке крови у больных раком легкого / Кармакова Т.А., Скрипник В.В., Якубовская Р.И., Воронцова М.С., Пикин О.В., Рудаков Р.В., Вурсол Д.А., Амиралиев A.M., Мокина В.Д., Чиссов В.И. - Онкология, №2 -Москва, 2012: стр.35-41.

41.Кармакова, Т.А. - Новые подходы в эндоскопической диагностике раннего центрального рака легкого (РЦРЛ): комбинация флуоресцентной бронхоскопии, локальной флуоресцентной спектроскопии, флуоресцентной микроскопии, скарификатов слизистой оболочки бронхов с иммуноцитохимическим исследованием на MUC1 / Соколов В.В., Телегина Л.В.. Якубовская Р.И., Кармакова Т.А., Франк Г.А.. Белоус Т.А., Волченко H.H., Булгакова H.H., Василевский И.А. - Материалы I Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы флюоресцентной

диагностики и фотодинамической терапии» - Фотодинамическая терапия и фотодиагностика, №1 - Москва, 2012:стр.34.

42. Кармакова, Т.А. - Роль флуоресцентных методов исследования при комплексной бронхологической диагностике скрытых форм раннего центрального рака легкого / Соколов В.В., Телегина JI.B., Якубовская Р.И., Кармакова Т.А., Франк Г.А., Волченко Н.Н. - Материалы II Всероссийской конференции «Актуальные вопросы фотодинамической терапии и фотодиагностики» - Фотодинамическая терапия и фото диагностика, №3 — Москва, 2013: стр. 62.

43. Karmakova Т.А. - Serum levels of MUC1 glycoprotein (IC025) in primary lung cancer patients / Karmakova T.A., Skripnik V.V., Yakubovskaya R.I., Pikin O.V., Voursol D.A., Amiraliev A.M., Vorontsova M.S. - The 15th World Conference on Lung Cancer - Sydney, Australia, 2013: p.767.

44. Кармакова, Т.А. - MUC1 при реактивных и предопухолевых нарушениях в бронхиальном эпителии у больных плоскоклеточным раком легкого / Кармакова Т.А., Франк Г.А., Скрипник В.В., Соколов В.В., Якубовская Р.И. - Материалы VIII Всероссийского съезда онкологов -Вопросы онкологии, Т.З, №59 - Санкт-Петербург, 2013: стр.374.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

АК - аденокарцинома

БР - Без (местного) Рецидива заболевания (группа больных раком легкого) ВКР - папилломавирус высокого канцерогенного риска ВПЧ — вирус папилломы человека,

ДПК+ - ИК025-положительные дискератоцит-подобные клетки, ДУ - дискриминационный уровень. ИФА - иммуноферментный анализ. ME - медиана

МКА - моноклональное антитело.

MP - Местный Рецидив заболевания (группа больных раком легкого)

НМРЛ - немелкоклеточный рак легкого

НРШМ - начальный рак шейки матки

НЦРЛ - начальный центральный рак легкого

ПКР - плоскоклеточный рак.

ПМЦР - Яервично-множественный Метахронный начальный Z/ентральный Рак

легкого (группа больных раком легкого) ПП - послеоперационная пневмония

Рец - Рецидив опухоли в зоне лечения (группа больных раком легкого) РМЖ - рак молочной железы

ХНЗЛ - хронические неспецифические заболевания легких. ЦИН - цервикальная интраэпителиальная неоплазия CIS - преинвазивный рак (Carcinoma In Situ).

MUC1/HK025 - MUC1, узнаваемый моноклональным антителом ИК025. RR - относительный риск (Relative Risk)

•г

ч

Подписано в печать 24.04.2014 г.

Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 100 Экз. Заказ № 2488 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39