Автореферат и диссертация по медицине (14.00.32) на тему:Клинико-экcпериментальное обоснование разработки тест-систем выявления стрессзависимых маркеров для изучения механизмов адаптации организма в экстремальных ситуациях

на правах рукописи

ВИХА Галина Васильевна

КЛИНИКО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ РАЗРАБОТКИ ТЕСТ-СИСТЕМ ВЫЯВЛЕНИЯ СТРЕССЗАВИСИМЫХ МАРКЕРОВ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МЕХАНИЗМОВ АДАПТАЦИИ ОРГАНИЗМА В ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ СИТУАЦИЯХ

14.00.32 - авиационная, космическая и морская медицина 14.00.14 - иммунология и аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва, 2002

Работа выполнена в Государственном научном центре Росийской Федерации - Институте медико-биологических проблем РАН и Научно-техническом центре ЛЕКБИОТЕХ

Научные консультанты:__

доктор медицинских наук, профессор, Н.Н. Лизько

доктор медицинских наук, профессор А.Ю. Барышников.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В.К. Ильин, доктор медицинских наук, профессор Б.В. Пинегин; доктор биологических наук, профессор М.А. Мягкова.

Ведущая организация:

Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова

Защита диссертации состоится « /¿¿¿,£2002 г.

в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 002.111.01 ГНЦ РФ - Институте медико-биологических проблем РАН, 123007, г. Москва, Хорошевское шоссе, д. 76а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РФ Института медико-биологических проблем РАН

Автореферат разослан « » ¿(Аф^- 2002 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

р/дх?

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Экологическое неблагополучие, возрастание стрессорных воздействий, массовое бесконтрольное применение антибиотиков и химиотерапевтических препаратов, повышенный радиационный фон и неполноценность питания - характерный набор причин, вызывающий острые н хронические дисбиозы и рецидивирующие респираторные заболевания.

Лечить успешно целый ряд серьезных болезней современная медицина может. А вот предупредить заболевание, т.е. определять его признаки на обратимом этапе не в состоянии. Оценка биохимических параметров крови заимствована из клинических нормативов и потому не применима по отношению к здоровому человеку. Нарушение здоровья (не болезнь, а пограничное состояние, т.е. переход к заболеванию) должно описываться не в терминах патологии, а в понятиях состояний, описывающих взаимодействие между основными физиологическими системами организма в условиях нагрузки - физической, интеллектуальной, эмоциональной, экологической.

Пограничное состояние пациента, являющееся предметом мониторинга, должно оцениваться по параметрам взаимодействия всех систем организма. Болезнь возникает тогда, когда нарушаются механизмы регуляции функций. Момент нарушения здоровья и следует уловить в условиях профилактических наблюдений. Реальным путем выведения из пограничного состояния является создание индивидуальных средств профилактики и реабилитации на принципах биологической обратной связи. При отсутствии критериев оценки пограничного состояния невозможна донозологическая диагностика.

Многочисленными микробиологическими обследованиями биотопов организма, проводившимися российскими исследователями, отмечено развитие у космонавтов кишечных дисбактериозов (Лизько H.H. и др., 1987; Ильин В.К. и др., 1997; Бочков И.А. и др., 1997). При нервно-эмоциональном напряжении имеет место снижение уровня бифидобактерий и лактобацилл, в отдельных случаях до полной редукции. Эту реакцию рассматривают, как «пусковой механизм» развития дисбактериоза у человека в экстремальных ситуациях (Лизько H.H., 1987). При исследовании изменений в тканях парадонта у космонавтов отмечено появление парадонтопатогенных бактерий, уменьшение резидентной микрофлоры и увеличение содержания иммуноглобулинов классов А и G в ротовой жидкости (Воложин А.И. и др., 1997). Наличие изменений в системе местного иммунитета при патологических процессах признается большинством исследователей (Хаитов P.M. и др., 1995; Пинегин Б.В., 1997; Козлов Л.В. и др., 1997). Несмотря на многочисленные исследования по изучению процесса адаптации организма человека к измененным условиям среды обитания, следует отметить, что особенности и механизмы адаптации микроэкологической и иммунной систем остаются малоизученными. Причи-

ной тому является отсутствие объективных количественных мстолов оценки изменений этих систем регуляции.

Поэтому актуальной является задача выявления маркеров, позволяющих фиксировать повреждающие стрессорныс воздействия на слизистые покровы органов, непосредственно контактирующих с внешней средой, а также разработка количественных методов диагностики нарушений иммунорегуляторных процессов организма до развития выраженной клинической картины заболевания.

Цель исследования: изучение механизмов адаптации организма в экстремальных ситуациях и создание эффективных диагностических тест-систем выявления стрсссзависнмых маркеров

Задачи исследования.

1. Изучить состояние местного иммунитета и мнкробиоиеноза слизистой оболочки толстого кишечника обезьян в условиях воздействия экстремальных факторов (космический полет, 4-х и 3-х стадийные хирургические операции по вживлению электродов, антнортостатическая гипокинезия, введение пастообразного полетного рациона питания).

2. Изучить состояние местного иммунитета и микробиоценоз слизистой оболочки толстого кишечника космонавтов.

3. Изучить состояние местного иммунитета и микробиоценоз слизистой оболочки толстого кишечника работников наземных служб аэропорта.

4. Выявить общие закономерности изменений состояния слизистых покровов толстого кишечника при экстремальных воздействиях. Обосновать значимость и возможность использования показателя местного иммунитета для оценки естественной резистентности организма к мониторинга пограничных состояний организма человека в экстремальных ситуациях.

5. Разработать тест-системы, обеспечивающие выявление стресс-зависимых маркеров слизистых покровов толстого кишечника и верхних

дыхательных путей (ВДП).

6. Разработать принцип формирования групп риска по патологии слизистых покровов органов, непосредственно контактирующих с внешней средой.

Научная новизна.

Впервые получены доказательства, что в результате воздействия на организм экстремальных факторов (космический полет, хирургический стресс, антнортостатическая гипокинезия, вредные условия труда) общей закономерностью изменения слизистых покровов толстого кишечника является снижение уровня защитных групп микроорганизмов за счет вытеснения их условно-патогенной микрофлорой, формирования дисбактериоза разной степени выраженности на фоне увеличения уровня секреторного иммуноглобулина А ЫвА).

Выдвинуто и экспериментально обосновано новое положение о функциональной сопряженности микроэкологической системы и системы местно-

го иммунитета. Показано существование отрицательной коррелятивной связи между уровням« защитных групп микроорганизмов кишечного мнкробноце-ноза и уровнем б^А слизистых покровов толстого кишечника.

Обоснована возможность использования э^А как маркера для оценки неспецифической резистентности организма, диагностики и прогнозирования дисбактериоза, и разработана оригинальная тест-система для количественного иммуноферментного (ИФА) определения б1£А в секретах.

Разработана эффективная схема выделения нового эпителиального му-цинового антигена CAg25 из фракции мембран секрета молочной железы. Установлены молекулярные свойства антигена: гликопротеин с молекулярной массой 400 кД, с содержанием белка 2,5%, сиаловых кислот 16%, Ы-аиетил-гексозаминов 8%, нейтральных углеводов 16%,. относящийся к группе полиморфных муцнновых эпителиальных антигенов.

Разработаны оригинальные тест-системы для обнаружения эпителиального муцннового антигена СА§25 в сыворотке и цельной крови. Показано диагностическая эффективность разработанных тест-систем в отношении выявления опухолей эпителиального генеза.

Исследованиями уровней з!§А и эпителиального муцинового антигена СА£25 в бронхоальвеолярных смывах (БАС) контингента больных с бронхо-легочной патологией показало, что снижение неспецифической резистентности организма сопровождается появлением в БАС эпителиального муцннового антигена СА§25. Сформулированы критерии формирования групп риска по патологиям слизистых покровов ВДП.

Практическая значимость работы.

Разработаны оригинальные тест-системы для количественного определения б^А в секретах (копрофильтратах и БАС) и нового эпителиального муцинового антигена СА§25 в сыворотке, цельной крови, БАС.

Разработан новый метод диагностики дисбактериоза и внедрен в лаборатории саннтарно-пищевой микробиологии и микроэкологии ГУ НИИ Питания РАМН.

Набор реагентов для количественного иммуноферментного определения б^А в копрофильтратах и слюне «б^А-ИФА ПБМТ» принят к серийному выпуску на предприятии ООО «Прогрессивные Био-Медицннские технологии» и проходит государственную регистрацию в Комитете по новой медицинской технике МЗ РФ.

Обосновано введение новой формы лабораторного контроля анализа б^А в секретах, который является показателем естественной локальной иммунной защиты организма. Это позволит повысить эффективности лекарственной терапии и методов иммунокоррекции соответствующих сдвигов в различных системах регуляции за счет использования принципа обратной связи.

Положения, выносимые на защиту

1. При пребывания человека в условиях воздействия экстремальных факторов (предполетная подготовка, длительный космический полет, вредные условия труда) особенностью состояния слизистых покровов толстого кишечника является появление условно-патогенной микрофлоры, сопровождающееся снижением защитных групп микроорганизмов бифидобактерий и лактоба-цилл, формирование дисбактсриоза разной степени выраженности, на фоне увеличения уровня slgA.

2. Уровень slgA в копрофпльтратах является показателем адаптивных процессов в организме, свидетельствующим о предупреждающих защитных реакциях организма при повреждающих воздействиях, какими являются стресс, вредные условия труда.

3. Продемонстрирована функциональная сопряженность микроэкологи-чсской системы и системы местного иммунитета. Полученная отрицательная коррелятивная связь между уровнем slgA и содержанием защитных групп микроорганизмов (бифидобактерий и лактобацнлл) у человека дает основание для создания нового ИФА метода диагностики дисбактерноза (объективного, менее трудоемкого и с меньшими затратами времени).

4. Выделен н охарактеризован новый эпителиальный муциновый антиген CAg25. Разработаны оригинальные тест-системы для выявления этого антигена в сыворотке, цельной крови, позволяющие диагностировать опухоли эпителиального генеза.

5. Полученный экспериментальный материал по анализу slgA, эпителиального муцинового антигена CAg25 в секретах является основой для создания нового научного направления по целевому поиску маркеров адаптации и естественной резистентности организма, а также методов коррекции соответствующих сдвигов в различных системах организма в донозологнческом периоде болезни на принципах обратной связи н формированию групп повышенного риска по иммунопатологическим состояниям.

Апробация работы и публикации.

Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета НИИ Биотехнологии, НТЦ «Лекбиотех», а также на Международных конгрессах Европейского респираторного общества (ERS) в 1997г. (Берлин), 2000 г. (Флоренция); на Международных конгрессах общества по микробной экологии и болезням (SOMED) в 1996г. (Париж), 1997г. (Флорида); на III Российско-Американском симпозиуме по программе «Нау-ка-НАСА» в 1997г. (Хансвилл, США); на I Национальной конференции Российской ассоциации аллергологов и клинических иммунологов в 1997 г. (Москва); I Международной конференции «Management of Human Intestinal Microflora. Probiotics and Fiber» в 1998г. (Рим); на Международных конференциях «Human Antibodies and Hybridomas» в 1997г. (Вашингтон) и «Спид, рак и ретровпрусы человека» в 1992, 1993 гг. (С.-Петербург); XI конференции по

космической биологии и авиакосмической медицине в 1998г. (Москва); на Международном экологическом форуме в 2001г. Москва).

По материалам диссертации опубликована 41 научная публикация, в том числе 2 патента. Диссертационная работа апробирована на межотдельческой конференции ГНЦ РФ - Института медико-биологических проблем РАН.

Структура н объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 6 глав, содержащих обзор литературы и изложение результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, списка литературы. Материал изложен на 206 страницах машинописного текста, иллюстрирован 14 рисунками, 32 таблицами. Библиография включает 202 наименований (57 отечественных, 145 зарубежных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований

Материалы. Материалами для исследований служили: фекальные массы (первые свежевыделенные порции), БАС и смывы со слизистой оболочки луковицы двенадцатиперстной кишки (СДПК), сыворотка, кровь, женское молоко. В качестве материала для иммуногистохимического исследования использовались срезы опухолевых тканей человека, полученные в ходе хирургических операций в клинической больнице №6 г. Москвы и Московском научно-исследовательском онкологическом институте им. П.А. Герцена МЗ РФ. БАС и СДПК получали из ММА им. И.М. Сеченова и клинической больницы им. С.П. Боткина.

Эксперименты по моделированию стрессовых состояний выполнены на 35 обезьянах Macaca mulata, самцах, массой тела 3-4 кг, возраста 32-40 месяцев. Контрольную группу составили обезьяны, полученные из Института медицинской приматологии (г. Сочи) и находящиеся в приматологическом центре ГНЦ РФ ИМБП, где были проведены эти исследования.

В исследованиях принимали участие:

- 6 космонавтов, участвовавших в длительных космических полетах (185-197 суток).

- 71 пациент медсанчасти аэропорта Шереметьево, чьл работа связана с вредными условиями труда (шум, вибрации, пары топлива, смазочных масел, свинца).

- 27 больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки в стадии обострения, что установлено во время гастродуоденоскопии, контрольную группу составили 11 пациентов, у которых во время гастродуоденоскопии со стороны желудка и двенадцатиперстной кишки не было выявлено признаков заболевания.

- 68 больных хроническими заболеваниями бронхолегочной системы, контрольную группу составили 7 пациентов, у которых со стороны ВДП не было выявлено признаков заболевания.

- 239 больных с опухолями различных локализаций, контрольную группу составили здоровые доноры (п=171).

Субсегментарный БАС проводили с учетом рекомендаций Европейской рабочей группы по изучению БАС, под местной анестезией лидокаином при помощи фнбробронхоскопа «Олимпас» (Япония). Полученный БАС центрифугировали н фильтровали через фильтры миллипор 0,22 ммк.

СДГ1К получали следующим образом: в луковицу двенадцатиперстной кишки вводили 3 мл физиологического раствора с последующей активной аспирацией смыва и центрифугированием.

Таблица 1. Объем проведенных исследований

Исследования Методы исследования

Космический полет (космонавты) Микробиологические. Иммунологические

Космический полет (обезьяны) Микробиологические, иммунологические

Вредные условия труда (работники наземных служб аэропорта) Клинические, микробиологические, иммунологические.

Хирургические операции по вживлению электродов (обезьяны, эксперимент №1, длительность 75 суток, 4 операции по 4-6 час каждая под общим газовым наркозом, антибиотики). Клинические, микробиологические, иммунологические.

Хирургические операции по вживлению электродов (обезьяны, эксперимент №2, длительность 50 суток, 3 операции по 4-6 час каждая под общим газовым наркозом, антибиотики). Клинические, микробиологические, иммунологические.

Антиортостатическая гипокинезия (10°, 13 суток, обезьяны) Микробиологические, иммунологические.

Перевод на пастообразный рацион питания (10 суток, обезьяны) Микробиологические, иммунологические

Методы исследований. Исследование особенностей в состоянии кишечного микробиоценоза осуществляли с использованием общепринятых методов. Изучали качественный и количественный состав фекальной микрофлоры, учитывая общее количество аэробных и анаэробных бактерий, содержание условно-патогенных энтсробактерий родов цнтробактер, энтеробактер,

6

клебсиелла, энтерококков (S.faecalis, S.faecium), протея, кишечных палочек, стрептококков, стафилококков, дрожжей и дрожжеподобных грибов, бактероидов, клостридий, лактобацилл, бифидобактерий. При оценке результатов бактериологического анализа фекальной массы исходили из показателей нормы. При отклонении от нормы состояние микробиоценоза оценивалось согласно микробиологической классификации дисбактериоза толстой кишки (Lizko N.N., Shilov V.M., 1984).

Уровень slgA в фекальной массе обезьян определяли твердофазным ИФА. В работе использовали концентрат поликлональных козьих антител против slgA человека, лиофилизированный препарат slgA из женского молозива, конъюгат из поликлональных кроличьих антител к slgA человека и пе-роксидазы хрена (ТОО «Микрофлора» при Московском НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского). Для анализа использовали 96-луночные планшеты для микротитрования «Flow Laboratories» и набор ТМБ ИФА ЗАО «ДИАплюс».

Моноклональные антитела (МКА) получали перевиванием гибридом -продуцентов ИКО-25 (предоставлена профессором А.Ю. Барышниковым, РОНЦ им. Блохина РАМН) и slgA ПБМТ (получена в лаборатории, руководимой диссертантом). Мышам Balb/c, предварительно примированным 0,5 мл вазелина и выдержанным в течение 5 суток, делали внутрибрюшинную инъекцию суспензии клеток в количестве 5 мл с 3-4 млн.клеток.

Асцитную жидкость отделяли от клеток гибридомы и вазелина центрифугированием при 3000 об/мин 30 мин, после чего подвергали фракционированию сульфатом аммония от 25% насыщения до 45% насыщения. Далее фракцию МКА обессоливали на колонке с акрилексом Р-4 (2,5x60 см) в 100 мМ К, Na-фосфэтном буфере (ЗФР) рН 7,5, затем подвергали ионно-обменной хроматографии на колонке с целлюлозой ДЭАЭ-32 в ЮОмМ ЗФР рН 7,5 с 300 мМ NaCI. Конъюгирование МКА с пероксидазой хрена проводили модифицированным методом Nakane (1974).

Нммуногистологическое окрашивание срезов опухолей

Материалом для исследования служили аутопсийные и биопсийные образцы тканн, которые фиксировали в 10% формалине в течение 20 ч и после отмывки и обезвоживания заключали в парафин. Из парафинизированных образцов тканн готовили срезы толщиной 5-6 микрон.

Иммунофлуоресцентный анализ проводили непрямым методом следующим образом: депарафинизированные срезы инкубировали с МКА ИКО-25 в концентрации 5 мкг/мл в течение 18 ч при 4°С. После 3-кратной отмывки (по 3 мнн) в 10 мМ ЗФР, рН 7,6 с 150 мМ NaCI, срезы инкубировали с антителами кролика к иммуноглобулинам мыши, мечеными флуоресцеином (концентрация 20 мкг/мл) в течение 1 ч при комнатной температуре. Оценку результатов проводили на микроскопах Люмам-2 и Аксиоплан (Opton, Германия).

Препаративные ii аналитические методы исследования антигенов н антител. Фракционирование биологических макромолекул из женского молока и асцита мышей проводили, используя методы осаждения, гель-фильтрации, нониообменной хроматографии, аффинной хроматографии. Анализ полученных антигенов и антител осуществляли электрофорезом в полн-акриламндном геле (ПААГ) в присутствии додецнлеульфата натрия (ДЦС) и мочевины, ИФА.

Антигенный материал исследовали на наличие белка (Bradford О.,1987), нейтральных углеводов (Dubois М. ct а!.. 1956), сиаловых кислот (Murayama J.I. ct al., 1976). Аминосахара определяли на аминокислотном анализаторе ААА-881 (Мicrotcchna, ЧСР).

Все полученные количественные данные разбивались на выборки и подвергались статистической обработке по методу Стыодента н дисперсионного анализа. При обработке результатов использовали стандартный пакет программ Microsoft OfTicc для IBM PC, Excel. Доверительный интервал для коэффициента корреляции определяли с помощью tz критерия Фишера при р=0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Иммунологические ii микробиологические исследования изменений эпителия слизистой толстого кишечника в условиях стресса

Местный иммунитет отражает общую иммунологическую реактивность на уровне слизистых оболочек и проявляется местной продукцией антител, в том числе секреторных. В настоящее время в научной литературе отсутствуют однозначные данные о нормальных показателях местного иммунитета. Широкий диапазон результатов, по-видимому, связан с различием методов определения slgA. Однако, наличие существенных изменений в системе местного иммунитета при патологических процессах признается всеми исследователями (Хаитов P.M. и др., 1995; Пинегин Б.В., 1997; Козлов Л.В. и др., 1997 и др). Отсутствуют и коммерческие наборы для оценки состояния местного иммунитета и степени риска развития патологии в эпителиальных тканях, непосредственно контактирующих с внешней средой.

Для оценки возможности использования slgA как маркера ранних, док-линическн выраженных манифестаций болезни мы провели микробиологическое и иммунологическое исследование копрофильтратов обезьян при стресс-нндуцированном днебактериозе.

В нашу задачу входила комплексная оценка, реакции эпителия слизистых покровов толстого кишечника на воздействия различных экстремальных факторов, включающая микробиологическое исследование и определение параметра местного иммунитета. Иными словами задача была показать, что

э^А отвечает на стресс и может быть использован в качестве маркера изменений эпителия слизистой кишечника в условиях стресса.

1.1. Влияние стрессорных факторов на уровень в^А в фекалиях

обезьян

В качестве стрессорных были изучены факторы предполетной подготовки: антнортостатическая гипокинезия (13 суток), трех- и четырех- стадийные хирургические операции по вживлению электродов, каждая из стадий длилась 4-6 час под общим газовым наркозом, перевод на пастообразный полетный рацион питания, космический полет. Ввиду того, что существующие методы не позволяют прижизненно дать количественную оценку пристеночной микрофлоры, вопрос был изучен нами на примере микробиоценоза просвета толстой кишки.

Влияние факторов предполетной подготовки и 14-суточного космического полета на биоспутнике «БИОН-11» на уровень б^А в фекалиях обезьян представлены на рис. 1 А. Предполетная подготовка представляла собой индивидуальную подготовку обезьян в соответствии с программой исследований на биоспутнике и включавшей приучение к длительному пребыванию в системе фиксации, пользованию мундштуками автоматической подачи сока и пиши, выработку инструментальных рефлексов по ручной и ножной программам, по программам имитирующим операторскую деятельность на тренажерах. При мониторинге уровня в период предполетной подготовки в фекалиях обезьян зарегистрировано увеличение уровня б^А до 135 мкг/г фекалий при дисбактериозе 3 степени выраженности. В реадаптационный период на 10 сутки после окончания полета уровень б^А был высокий 550 мкг/г фекалий, при дисбактериозе 4 степени выраженности. На 21 сутки после окончания 14-суточного космического полета уровень понижался, но оставался еще высоким и составлял 270 мкг/г фекалий при дисбактериозе 3 степени выраженности.

Таким образом, стресс, вызванный предполетной подготовкой и космическим полетом, сопровождался увеличением уровня б^А и развитием дис-бактериоза 3-4 степени выраженности.

Группа обезьян (9 особей) подвергалась на протяжении 75 суток четырем последовательным хирургическим операциям, каждая из которых длилась по 4-6 часов под общим газовым наркозом (рис. 1Б). В фоновом периоде уровень б^А был в пределах 0-5 мкг/г фекалии, на 20 сутки после последней хирургической операции в реадаптацнонном периоде мы регистрировали высокий уровень б^А: в среднем 404169 мкг/г фекалий, на 90 сутки после последней хирургической операции уровень б^А снижался значительно и достигал в среднем 222±29 мкг/г фекалий. Параллельно проведенное микробиологическое исследование зарегистрировало в фоновом периоде отсутствие отклонений в состоянии мнкробиоценоза кишечника обезьян. На 20 сутки реадапта-цпонного периода отмечено развитие дисбактериоза 1-ой степени у 3-х обезь-

ян, днсбактсриоза 2-ой степени у 3-х обезьян, дисбактериоза 3-ей степени у 2-х обезьян, дисбактериоза 4-ой степени у одной обезьяны. На 90 сутки реадап-тационного периода отмечено развитие дисбактериоза I степени у 6-ти обезьян, дисбактериоза 2-ой степени у 3-х обезьян.

500

300

Уровень б^А 2

_ 1

100 80 р

50

20

41

10

6-9

_п

12

А

В

д Условия экспериментов

Рис. I. Сводная гистограмма изучения влияния стресса на уровень б^А в копрофнльтратах обезьян. А - влияние факторов космического полета: 1 -предполетная подготовка, 2-10 сутки реадаптации, 3 - 21 сутки реадаптации; Б - хирургические операции (75 суток, 4 стадии): 4-20 суток после операций, 5 - 90 суток после операций; В - хирургические операции (50 суток, 3 стадии): 6-7 дней после начала первой операции, 7-21 день после начала первой операции, 5-11 дней после начала второй операции, 9-13 дней после начала третьей операции, /0-14 дней после последней операции; Г - перевод на пастообразный рацион питания (10 суток): 11 - 20 суток после эксперимента, 12 -45 суток после эксперимента. Д - антнортостатическая гипокинезия (13 суток): /5-13 суток после начала эксперимента, 14-1 суток после эксперимента.

Б

Г

На рис. 1В представлены результаты исследований на обезьянах, которые подвергались трем последовательным хирургическим операциям в течение 50 суток, длительность каждой из операций была 4-6 часов. Содержание в^А в копрофнльтратах обезьян в фоновом периоде до начала хирургических операций не выходило за пределы значений, установленных для группы обезьян виварийного контроля. В реадаптационный период на 14 сутки после завершения последней из трех последовательных хирургических операций в

копрофильтратах обезьян этой группы мы зарегистрировали повышение уровня б^А с дальнейшей тенденцией к снижению. При этом развивался дис-бактериоз 2-4 степени выраженности.

Обезьяны подвергались также воздействию других по природе стрес-сорных факторов: четыре обезьяны участвовали в эксперименте с введением в рацион питания необычной пастообразной пищи (10 суток) (рис. 1Г) и две обезьяны участвовали в эксперименте с ограничением двигательной активности - антнортостатической гипокинезии (13-суток) (рис. 1Д). В эксперименте с переводом на полетный рацион питания мы регистрировали увеличение уровня $1§А в среднем до 84 мкг/г фекалий на 20 сутки после окончания эксперимента. Через 45 суток после окончания эксперимента уровень б^А снижался в среднем до 10 мкг/г фекалий, что соответствовало значениям уровней б^А группы обезьян виварийного контроля (0-15 мкг/г фекалий).

В эксперименте с антнортостатической гипокинезией на 13 сутки эксперимента наблюдали небольшое увеличение уровня б^А, в реадаптационном периоде на 7 сутки после окончания эксперимента также отмечалось лишь незначительное увеличение уровня б^А по сравнению с фоновым периодом, причем уровень б^А находился в пределах значений, характерных для обезьян группы варийного контроля.

Таким образом, наиболее вксокий уровень 51§А был отмечен на 10 сутки реадаптационного периода в копрофильтратах обезьян, участвовавших в 14-суточном космическом полете, а также в копрофильтратах обезьян после окончания 4-х и 3-х последовательных хирургических операций, перевода на пастообразный полетный рацион питания. Антнортостатическая гипокинезия не вызывала у обезьян резкого увеличения уровня э^А.

Заслуживает внимания тот факт, что при стрессорных воздействиях повышение уровня б^А происходит только в реадаптационный период, т.е. иммунная система включает синтез б^А не сразу, а после определенного периода. До включения механизма иммунной защиты происходит развитие дисбак-териоза 2-4 степени выраженности.

1.2. Исследование уровня б^А у космонавтов в условиях предполетной подготовки и послеполетный период.

Изучены микробиологические показатели и показатели местного иммунитета (б^А), отражающие факторы предполетной подготовки и космического полета на слизистые покровы толстого кишечника космонавтов (рис.2). При исследовании копрофильтратов 6 космонавтов, совершивших космический полет продолжительностью 185-197 суток, нами зарегистрированы уровни б^А в фекалиях: в период предполетной подготовки в среднем 887±282 мкг/'г фекалий, при этом развивался дисбактериоз 1-2 степени выраженности. Выявлен резко увеличенный уровень б^А (2134±367 мкг/г фекалии) и дисбактериоз 2-3 степени выраженности на 1-3 сутки после окончания

полета с дальнейшим понижением на 7 сутки после окончания полета до 10371207 мкг/г фекалий и дисбактериозс 2-3 степени выраженности.

Таким образом, мы обнаружили увеличенный уровень б^А в фекалиях уже в период предполетной подготовки. Характерно, что сохранялся тот же характер зависимости, который был выявлен нами для обезьян после 14-суточного космического полета на биоспутнике «БИОН-11». После прекращения воздействий стрессорного характера в реадаптационный период мы регистрировали резко увеличенный уровень б^А, в дальнейшем уровень б1цА имел тенденцию к нормализации.

2400

1800

1200

600

вровень б^А, мкг/г

Условия экспериментов

Космонавты

4 5 6 7 8 9 Работники аэропорта

Рис. 2. Уровень б^А в копрофнльтратах группы космонавтов и группы работников наземных служб аэропорта. Космонавты (6 человек): /- предполетная подготовка, 2-1-3 сутки после приземления, 3 - 7 сутки после приземления. Работники наземных служб (40 человек): 4 - гастрит, 5 - язвенная болезнь, б - колит, 7 - дерматиты, 8 - ОРЗ, 9 -панкреатит или холецистит.

Обследование микрофлоры толстого кишечника космонавтов в условиях предполетной подготовки, после длительных космических полетов показало, что наиболее выраженные сдвиги наблюдались в бифидо- и лактофлоре. Отмечено существенное снижение содержания бифидобактерий (до 4,2 ^ КОЕ/г) и содержания лактобацилл (до 4,3 1ц КОЕ/г), при норме бифидобактерий 8,5±0,1 КОЕ/г, лактобацилл 6,9±0,2 КОЕ/г. (Лизько Н.Н., 1984).

Таким образом, процесс адаптации организма космонавтов к предполетной подготовке, космическому полету и приземлению реализуется через ряд изменений: снижение защитных групп микроорганизмов (бифидобактерий и лактобацилл), появление условно-патогенной микрофлоры, формирова-

ние дисбактериоза на фоне увеличения в^А в копрофильтратах. Как и в случае модельных экспериментов с обезьянами, б^А в копрофильтратах являлся показателем адаптивных процессов в организме, свидетельствующих о защитных реакциях организма.

1.3. Изучение влияния производственных факторов на уровень 51§А и микрофлору толстого кишечника человека.

Под наблюдением находились 40 пациентов медсанчасти аэропорта. Это работники наземных служб аэропорта, работающие в условиях повышенного шума, вибраций, воздействия паров топлива, смазочных масел, свинца. При обследовании у них был выявлен дисбактериоз от первой до четвертой степени выраженности, снижение защитных групп микроорганизмов - бифи-добактернй и лактобацилл и появление ряда патогенных видов. Уровень б^А в копрофильтратах этого контингента обследуемых был значительно повышен (рис. 2, таблица 2). В группе из 5 пациентов при отсутствии отклонений в микрофлоре от нормы (при эубиозе) даже при наличии заболеваний уровень 51§А не повышался и был в пределах 0-10 мкг/г фекальной массы.

Таблица 2. Уровень б^А в копрофильтратах пациентов с различными заболеваниями, осложненными дисбактериозом 1-4 степени выраженности.

Диагноз $1кА(мкг/г фекалий)

Гастрит (п=9) 727,7+246,1

Язвенная болезнь (п=5) 714,2±286,9

Копит(п=7) 570,7+256,5

Токсикодермия, нейродермит, аллергический дерматит (п=5) 1023,8+472,6

Панкреатит, холецестит (п=5) 1328+456,5

Частые ОРЗ (п=4) 978,8+648,5

Наиболее высокий уровень э^А (1328±456 мкг/г фекалий) был в группе пациентов с патологиями в поджелудочной железе. Высокий уровень sIgA (1023±472 мкг/г фекалий) был при дерматитах. Высокий уровень б1§А (9781648 мкг/г фекалий) был при рецидивирующих острых респираторных заболеваниях (ОРЗ). При остальных патологиях (гастрит, колит, язвенная болезнь) уровень б^А был сравним с показателем его при предполетной подготовке космонавтов.

1.4. Сопряженность микроэкологнческой системы и системы местного иммунитета у человека и животных.

Для того, чтобы установить, существует ли зависимость между микробиологическими показателями и показателями местного иммунитета были вычислены коэффициенты корреляции между уровнем б^А и бнфидобакте-рнями, лактобацилламн, бактероидами, клостридиями, протеем, энтерококка-

13

мп, стрептококками, условно-патогенными энтеробактернями, стафилококками, кишечными палочками, (рис. 3).

КОСМОНАВТЫ г я^А-бифидобактерии " 0-64 г я^А-лактобациллы " 0-37 _для п=20 при р=0.01

РАБОТНИКИ АЭРОПОРТА •"я^А-бнфидобактерии" 0-72 г Б^А-лактобациллы ~ 0-46 _для п=50 при р=0.05

ОБЕЗЬЯНЫ

г я^А-бактероиды " 0-80

г я^А-лактобацилльг 0-50 для п=50 при р=0.05

Рис. 3. Коэффициенты корреляции (г) уровня б^А с защитными группами микроорганизмов

Достаточно сильная отрицательная корреляция у человека получена между уровнем б^А и бнфидобактсриямн, лактобациллами. С остальными группами микроорганизмов (бактероиды, клострндии, кишечные палочки, протеи, стафилококки, стрептококки, дрожжи, условно-патогенные энтеро-бактерии, энтерококки) не было обнаружено достоверной корреляции.

В группе обезьян, находившихся под воздействием стрессорных факторов обнаружена сильная отрицательная корреляция уровня б^А и уровней бактероидов, лактобацилл. С остальным» группами микроорганизмов (бифи-добактерии, клострндии, кишечные палочки, протеи, стафилококки, стрептококки, дрожжи, условно-патогенные энтеробактерии, энтерококки) не было обнаружено достоверной корреляции. Найденная корреляция свидетельствует о сопряженности микроэкологнческой и иммунной систем организма, координация которых обеспечивает устойчивость организма в его взаимодействии с внешней средой. Это локальные реакции сложного регуляторного механизма гомеостаза.

Увеличение уровня б1цА свидетельствует о развитии неспецифического иммунного ответа, направленного на формирование механизмов адаптации к новым условиям существования. При появлении условно патогенной микрофлоры и вытеснении защитных групп кишечного микробиоценоза включается синтез б^А для предотвращения колонизации ЖКТ патогенными микроорганизмами и защиты организма от эскалации инфекционного процесса.

Результаты сопоставления уровня я^А в фекалиях обезьян и содержания бактероидов и лактобацилл в норме и при воздействии изучаемых различных по своей природе стрессорных раздражителей показали, что при сни-

жении защитных групп микроорганизмов повышается уровень э^А, т.е. развивается иммунный ответ, направленный на устранение условно-патогенных бактерий и формирование механизмов адаптации к стрессорным воздействиям (таблица 3).

Таблица 3. Уровни б^А, бактероидов и лактобацилл в копрофильтратах обезьян в норме и в условиях стресса, вызванного космическим полетом, хирургическими операциями, переводом на пастообразный рацион питания, гипокинезией (п=40).

Контроль Содержание бактероидов, 1й КОЕ/г Содержание лактобацилл, Ig КОЕ/г Содержание slgA, мкг/г фекалий

8,2-9,7 6,6-9,5 0-15

Стресс группа 1 6,8-7,9 6,3-9,4 2-110

группа 2 полная редукция 8,6-9,3 135-220

группа 3 полная редукция 6,3-7,9 220-310

фуппа 4 полная редукция 4,8-5,9 460-530

группа 5 полная редукция полная редукция >500

(по литературным данным содержание бактероидов в )екалиях обезьян

в норме составляет 8,25+0,36, содержание лактобацилл в норме - 8,53+0,39 (Лнзько H.H. и др., 1992).

Из таблицы 3 видно, как с понижением уровней бактероидов и лактобацилл повышается уровень slgA. При колебании уровня бактероидов в пределах нормы уровень slgA не выходит за пределы значений, характерных для группы виварийного контроля. В условиях стресса при снижении уровня бактероидов до 6.8 (в логарифмической форме) уровень slgA колеблется в пределах 2-110 мкг/r фекалий. При полной редукции бактероидов уровень slgA определяется уровнем лактобацилл: в зависимости от понижения уровня лактобацилл уровень slgA растет значительно. Уровень slgA повышается параллельно снижению уровня защитных групп микроорганизмов.

Аналогично в группе работников наземных служб аэропорта с понижением уровня бифидобактерий повышается уровень slgA (таблица 4).

Таблица 4. Зависимость уровня slgA от содержания бифидобактерпй в фекалиях человека (п=40).

Содержание бифидобактерпй Ig КОЕ/г Содержание slgA, мкг/г фекалий

7,2-9,4 0-390

6,2-6,8 480-965

5,0-5,9 830-2100

(по литературным данным содержание бис шдобактерий в фекалиях че-

ловека в норме составляет 8,5+0,1 IgKOE/r фекалий (Лнзько H.H. и др., 1984).

При снижении бифидобактерпй на два порядка, уровень slgA повышается до 480-965 мкг/r фекалий. При снижении бифидобактерпй на три порядка уровень slgA повышается до 830-2100 мкг/г фекалий, т.е. до уровня slgA у космонавтов после приземления.

Итак, при комплексном исследовании, включающем изучение микробиоценоза и slgA - показателя местного иммунитета, получены доказательства взаимосвязи уровня slgA и защитных групп микроорганизмов слизистых покровов толстого кишечника. Это значит, что уровень IgA в копрофильтрате практически может служить удобным маркером стрессовых изменений микрофлоры, легко определяемым в секрете.

Уровень slgA является показателем физиологического состояния организма при нагрузках и определяет степень отклонения естественной резистентности организма от индивидуальной физиологической нормы. SlgA образуется и ответ на появление патогенной микрофлоры для зашиты от эскалации инфекционного процесса. Это по сути дела первый универсальный маркер, который позволяет фиксировать воздействия стрессорного характера на организм. Определение уровня slgA может свидетельствовать о том, благоприятно или нет воздействие на организм. Это относится также и к воздействию лекарств. Поиск такого показателя актуален, поскольку в настоящее время на первый план выходят хронические заболевания и воздействия антропогенных факторов, стрессы.

Известно, что изменения иммунных показателей предшествуют клиническим последствиям действия неблагоприятных факторов. В этом смысле результаты, полученные в данном исследовании, имеют общебиологическое значение, поскольку определение slgA позволяет контролировать переходное состояние организма, реакцию системы регуляции - местный иммунитет до наступления болезни.

Суммируя результаты наших исследований и данные литературы по мнкробноценозу слизистых покровов биотопов, можно заключить, что slgA отражает адаптационные изменения в слизистых покровах толстого кишечника, а адаптационные изменения связаны с вытеснением защитной мнкрофло-

16

ры условно-патогенной с последующим развитием дисбактериоза. Наличие высокого отрицательного коэффициента корреляции, характеризующего связь между уровнем б^А и уровнем бифидобактерий в толстом кишечнике человека, позволило нам рассматривать концентрацию б^А в копрофильтрате, как удобный иммунологический прогностический показатель, отражающий состояние микробиоценоза кишечника, и использовать его для диагностики, предупреждения и лечения дисбактериозов.

Исследование показателя местного иммунитета (б^А) у обезьян в условиях космического полета, 4-стадийных (в течение 75 суток) хирургических операций, 3-стаднйных (в течение 50 суток) хирургических операций, перевода на пастообразный рацион питания и 13-суточной гипокинезии позволило проследить динамику изменения этого показателя от силы и продолжительности экстремальных воздействий. Этот процесс носил почти линейный характер и отражал постепенное вытеснение из биотопа комменсапьной микрофлоры условно-патогенной микрофлорой. Сильная отрицательная корреляция уровня б^А с бактероидами и лактобациллами свидетельствует о том, что защитные функции слизистых покровов толстого кишечника обезьян в норме осуществляются этими микроорганизмами.

Таким образом, при снижении защитных групп микроорганизмов и появлении патогенной микрофлоры запускается синтез б^А, как способ защиты от патогенной микрофлоры. Б^А является не только показателем местного иммунитета, но и показателем благоприятных и неблагоприятных последствий различных воздействий на организм.

1.5. Исследование влияния профилактики и лечения дисбактериоза пробнотиками н пребнотиками на уровень

Переносимость повреждающих воздействий сугубо индивидуальна, и далеко не всякие изменения в ответ на воздействие приводит к нарушению состояния здоровья, так как защитные механизмы и приспособляемость организма велики. Однако, компенсированная скрытая стадия дисбактериоза под влиянием любого неблагоприятного фактора, приводящего к ослаблению общего состояния организма может перейти в выраженную клиническую форму, что в конечном счете ведет к нарушению здоровья в целом. В медицинской практике для лечения дисбактериоза используют препараты пробиотиков - это живые микроорганизмы и ими синтезируемые продукты (бифидумбактерин, лактобактерин). Однако, данные о влиянии бифидумбактерина и лактобакте-рнна на уровень б^А в копрофильтратах человека в литературе отсутствуют.

Мы проследили влияние заместительной бактериотерапии на уровень б^А в копрофильтратах пациентов с различными заболеваниями, сопровождавшимися развитием дисбактериоза. Под наблюдением находилась группа из 51 сотрудника наземных служб аэропорта. При обследовании был выявлен дисбактерноз от первой до четвертой степени выраженности. После лечения пробнотиками (бифидумбактерин, лактобактерин) в терапевтических дозах

сроком 3-5 недель было проведено определение уровня б^Л в копрофильтра-тах.

Микроорганизмы, КОЕ, 1д/г

600" 450-

зоо-

9,0 6,03,0-

51еА, мл/г фекалий

900750600450

зоо-

а б а б а б

Бактеро- Бифидо- Лакто-иды бактерии бациллы

а б

Рис. 4. Динамика изменения кишечной микрофлоры и уровня б^А работников наземных служб аэропорта: а - до (п=51), б - после бактериотерапии (п=26).

Как показали результаты наших исследований, под влиянием бактериотерапии имели место не только существенный подъем уровня защитных групп микроорганизмов (бифидобактерий, лактобацилл), но и снижение содержания цитратпозитивных условно-патогенных энтеробактерий, протея, стрептококков и дрожжей; параллельно увеличению бифидобактерий и лактобацилл происходило снижение уровня б^А (рис. 4).

Таким образом, определение концентрации я^А может использоваться для мониторинга бактериотерапии, по снижению этого показателя можно судить о восстановлении уровней бифидобактерий н лактобацилл. Определение уровня б^А может быть использовано для подбора индивидуального курса лечения. По повышению я^А в копрофнльтратах можно судить об изменении

в кишечной микрофлоре, снижении защитных групп микроорганизмов, необходимости проведения курса бактериотерапии, так как уровень slgA является ранним показателем патологии слизистых покровов кишечника.

Пребиотик адаптохит - водорастворимые, олигосахариды, полученные нами гидролизом хитина панцирей крабовых, имеет следующий состав: углеводы (N - ацетилглкжозамин) - 83,9%; белок - 4,08%; вода - 7,1%, зола 4,92% (Виха Г.В. и др., 1995). Он не оказывает токсических воздействий, не проявляет аллергенных свойств и, более того, нормализует аллергологический статус обезьян при сенсибилизации последних эндогенными бактериальными аллергенами (Виха Г.В. и др., 1997). Иммуногенные свойства адаптохита установлены при его использовании в качестве праймера при получении асцита у мышей с привитыми гибридомами (Виха Г.В. и др., 1993).

Даже небольшие дозы адаптохита (3-8 мг/кг массы кролика) обладают заметным иммуностимулирующим действием при получении агглютинирующих антител к клеткам и белковым антигенам, в том числе не обладающим выраженной иммуногенностью (Сахаров P.C. и др., 1998). При оральном способе введения адаптохит способствовал регенерации микробиоценоза у крыс, которым предварительно добавляли в корм антибиотики левомицетин и ампициллин с целью вызвать дисбактериоз (Максимов В.И. и др., 1995).

При использовании флуоресцентной метки нами установлено, что адаптохит связывается с поверхностью мононуклеарных клеток крови, не проникая внутрь клеток. Возможно его участие в регуляции процессов, происходящих на уровне поверхности клеток (рецепторные взаимодействия) (Виха Г.В. и др., 1998). Исследование влияния адаптохита на уровень slgA в копро-фильтратах и микробиоценоз кишечника проводилось на обезьянах (рис. 5 и 6.).

Прежде всего следует отметить, что при хирургическом стрессе у пяти обезьян, получавших с кормом адаптохит в дозе 50 мг на кг массы животного в течение 9-50 суток, не развивались гнойные осложнения. Обезьяны имели нормальный клинико-физиологический статус и показатели крови в пределах нормы. В то же самое время у пяти контрольных обезьян развивались различные осложнения: абсцесс локтя, гнойные воспаления в местах выхода электродов, длительное заживание хвоста. У обезьян опытной группы, которые в течение всего периода операций получали адаптохит, уровень лактобацилл на протяжении всего периода операций колебался в пределах нормы (рис. 5).

Рис. 5. Влияние адаптохита на уровень лактобацилл в фекалиях обезьян при хирургических операциях: О - перед началом операций, 1-1 дней после начала 1-ой операции, 2-21 день после начала 1-ой операции, 3 - 11 дней после начала Н-ой операции, 4 - 13 дней после начала Ш-ей операции, 5-14 дней после завершения эксперимента.

Уровень э1цА в копрофильтратах у обезьян опытной группы повышался значительно уже на 2 и 3 стадиях операций (через 21 день после начала операций) и далее снижался. Через 7 дней после начала операций мы отмечали у этих обезьян развитие дисбактериоза 2 степени выраженности, а через 21 день регистрировали значительное увеличение уровня б^А (рис. 6).

У контрольных животных на два порядка снижался уровень лактобацилл через 21 сутки после начала операций (рис. 5). У них развивался дисбак-териоз 4 степени выраженности, обусловленный резким повышением уровня протея на 33 сутки после начала операций. И только на 14 сутки после завершения операций в рсадаптациоином периоде у контрольных обезьян происходил подъем уровня б^А (рис. 6).

б^А, мкг/г фекалий

200 -

100 -

А 0

д контроль 1 д контроль 2

Д1.Д2 Д2 Д2, Д4 д4

^ ~ I ™ I ~

Д2,ДЗ

I

400' 300'

200' 100'

бГеА, мкг/г фекалий Д1

Д1

Д2

□ экспеоимент 1 и эксперимент 2

Д1 -га,

Д1

J

О

1

3

4

5

Рис. 6. Влияние адаптохита на уровень б^А в фекалиях обезьян после хирургических операций: 0 -фон, 7-7 дней после начала 1-ой стадии операции, 2-21 день после начала 1-ой стадии операции, 3-11 дней после начала Н-ой стадии операции, 4-13 дней после начала Ш-ей стадии операции, 5-14 дней после завершения операции. А - контроль, Б - эксперимент, Д1 - Д4 -степень выраженности дисбактериоза.

Эти данные полностью согласуются с полученными нами результатами о корреляции уровня б^А и уровня лактобацилл у обезьян (таблица 3). Обнаружены два интересных факта: при приеме адаптохита в течение всего операционного периода подъем уровня б^А в копрофильтратах обезьян наступал

раньше и в более резко выраженной форме; уровень лактобацнлл в экспериментальной группе обезьян был стабилен.

В качестве рабочей гипотезы полагаем, что адаптохит индуцирует эффекты, благотворно влияющие на организм обезьян: нормализует уровень лактобацнлл, возможно вследствие того, что является для них ростовым фактором; стимулирует раннюю продукцию б^А, который, как известно, способен предотвращать контакт между патогеном и слизистыми покровами организма хозяина, препятствуют колонизации слизистых покровов кишечника. Возможно, он участвует в рецепторных взаимодействиях, связанных с активацией синтеза б1§А. Эти факты наталкивают на мысль об использовании адаптохита в качестве профилактического средства для предупреждения дис-бактерноза, развившегося в результате стрессорных воздействий.

Таким образом, при приеме бнфидумбактерина и лактобактерина пациентами с различными заболеваниями, осложненными дисбактериозом, уровень б^А снижается как результат подъема уровней защитных групп микроорганизмов. Определение уровня б^А при бактериотерапин может быть полезно для подбора индивидуального курса лечения, а также как показатель необходимости проведения бактериотерапин.

Водорастворимые олигосахариды глюкозамина со степенью полимеризации 4-9 (пребиотик адаптохит) индуцирует синтез на ранних стадиях дисбактериоза, тем самым стабилизирует уровень лактобацнлл толстого кишечника, не допускает колонизации толстого кишечника патогенными микроорганизмами, предупреждает гнойные осложнения у обезьян при хирургическом стрессе.

Адаптохит может рассматриваться как средство для иммунокоррекцни при дисбактернозах. Возможно и другое его применение, основанное на его участии в рецепторных взаимодействиях клеток. Это использование адаптохита и анализа уровня б1цА в копрофильтрате для выявления нарушений в системе местного иммунитета. Естественным завершением этого исследования является создание тест-системы для количественного ммуноферментного выявления я^А в секретах

1.6. Иммунофсрмснтаая тест-система количественного определения э^А в секретах для диагностики дисбактериоза.

Контроль за составом микрофлоры соответствующих экологических ниш даже при неинфекционных заболеваниях и разработка методов коррекции нарушенной микробной экологии макроорганизма является важным этапом профилактики и лечения различных болезней. В практической деятельности врачей-клиницистов в России для диагностики дисбаланса нормальной микрофлоры в настоящее время используется рутинный бактериологический метод. В действующих в настоящее время методических рекомендациях по диагностике дисбактериоза приведены устаревшие способы выделения и идентификации анаэробной микрофлоры. Бактериологический метод имеет

целый ряд существенных недостатков, к которым можно отнестн не только его трудоемкость и длительность проведения необходимых бактериологических тестов, относительную субъективность получаемых результатов, но и недооценку роли многих до настоящего времени некультивируемых представителей кишечного микробиоценоза, а также возможности получения несовпадающих результатов при повторном исследовании, как следствие различного роста бактерии в условиях организма хозяина и на искусственных питательных средах.

До настоящего времени стандартизованные плотные селективные питательные среды для выделения бифидобактерий в России так и не разработаны. Поэтому эти микроорганизмы выделяют на полужидких питательных средах и идентифицируют по морфологическим признакам. Эти среды неудобны при приготовлении, обладают слабыми селективными свойствами и требуют дополнительных тестов для идентификации бифидобактерий (Раевский К.К. и др, 1997).

Изучение состояния микрофлоры кишечника требует количественных оценок, нужны более четкие определения контингентов повышенного риска патологии, показания к обследованию и методические приемы, в том числе и упрощенные для исследований большого количества клинического материала. В связи с этим разработка современного метода диагностики дисбактериоза является актуальной задачей.

Клиническая оценка показателей естественной неспецифической резистентности организма нередко затруднительна. Это обусловлено большой вариабельностью отдельных показателей резистентности, разнообразным и неоднозначным влиянием многочисленных эндогенных и экзогенных факторов на состояние общей резистентности и активность конкретных ее показателей. Поэтому оценка результатов исследования неспецифической резистентности может быть дана при соблюдении целого ряда условий, включающих стандартизацию методов исследования и тщательного выполнения всех этапов (реактивы, обработка проб, проведение анализа, учет результатов). Другим условием, с нашей точки зрения, существует необходимость проведения анализа в динамике, что позволяет нивелировать влияние биологических ритмов и др. Динамические наблюдения уровня б^А позволяют увидеть изменения показателей резистентности под влиянием лечения или других воздействий. Необходимо также учитывать возможности синергического и антагонистического влияния таких факторов, как возраст, пол, сопутствующие заболевания, пребывание в экстремальных условиях внешней среды и др. На российском и зарубежном рынках для клинико-диагностического анализа отсутствуют стандартизированные зарегистрированные набсры для определения б^А. В связи с этим одной из задач данного исследования было создание тест-системы для количественного иммуноферментного определения б^А в секретах.

Используя гмбридомную технологию, позволяющую получать МКА чрезвычайно высокой степени гомогенности и специфичности, мы получили гнбридомы-продуценты специфичных к б^А МКА. МКА обладают тем существенным отличием от поликлональных антител, что они взаимодействуют только с одной, строго определенной антигенной детерминантой на антигене. Это ключевое их качество определяет их высокую практическую значимость в иммунном анализе. Идентичность изотнпа и иднотопа каждой следующей партии антител с предыдущей обеспечивает другое важное для практических исследований требование - воспроизводимость реагента и, следовательно, воспроизводимость процедуры анализа.

Методом твердофазного ИФА отбирали продуктивные клоны со специфичностью к б^А молозива среди гибридных клонов, полученных нами. Для конструирования тест-системы был выбран принцип «сэндвича» с использованием пары МКА. Исследуемые образцы секретов инкубируют с сорбированными на твердой фазе мышиными МКА к б^А и конъюгатом других антимышиных моноклональных антител с пероксидазой. Во время инкубации образца связывается с иммобилизованными на планшете антителами и одновременно с конъюгатом. После отмывания лунок планшета от несвязав-шихся реагентов проводится ферментативная реакция для определения активности перокендазы, сорбированной на лунках планшета. Оценка осуществляется фотометрически при длине волны 450 нм. Интенсивность окраски хромогена прямо пропорциональна концентрации з^А в исследуемых образцах. По калибровочному графику определяют количество б^А в образце.

В результате проведенных исследований получен набор реагентов со следующими характеристиками: диапазон измерений 0-120 мкг/мл 51§А; чувствительность 0.2 мкг/мл, коэффициент вариации 8%, открытие 90-110%, время анализа 1,5 ч (тест одностадийный). Объем пробы 100 мкл. В таблице 5 представлены результаты определения уровня б1£А в секретах этим набором реагентов.

Таким образом, результаты проведенных нами исследований позволяют сделать заключение о некоторых общих тенденциях реакции слизистых покровов толстого кишечника человека на изучаемые экстремальные воздействия: космический полет, специфически измененная среда обитания. Они проявляются в вытеснении защитных групп микроорганизмов условно-патогенными представителями, являющимися причиной развития дисбакте-риоза различной степени выраженности. Этот процесс сопровождается повышением уровня в^А в копрофнльтратах.

Аналогична реакция слизистых покровов толстого кишечника обезьян па изучаемые экстремальные воздействия: космический полет, хирургический стресс различной длительности, перевод на пастообразный полетный рацион питания, антнортостатическая гипокинезия. Также реакция на эти воздействия проявляется вытеснением защитных групп микроорганизмов условно-

патогенной микрофлорой с развитием дисбактериоза разной степени выраженности и повышением уровня б1§А в копрофильтратах.

Таблица 5. Уровень б^А в копрофильтратах и слюне

Возрастная группа 1*А Комментарий

Копрофильтрат (мкг/г фекалий)

1-14 лет (п=14) 1,6-39,0 Условно здоровые

20-60 лет (п= 18) 1,0-82,5 Условно здоровые

45-65 лет (п=5) 190 - 605 Дисбактериоз

Слюна (мкг/мл)

36-52 года (п=15) 40,3 - 800 Парадонтоз

14-60 лет(п=10) 7,1 - 83,5 Условно здоровые

Нами установлено также существование отрицательной корреляции между уровнем б^А и уровнями бифидобактерий (г= -0,72) и лактобацилл (г= -0,46 ) в копрофильтратах человека. Отрицательная корреляция между уровнем б^А и уровнем бактероидов (г= -0,80) и лактобацилл (г= -0,50) показана нами для копрофильтратов обезьян. Полученные данные указывают на наличие видовых различий: если у человека уровень б^А определяется в основном содержанием бифидобактерий и лактобацилл, то у обезьян уровень отражает изменения в количестве бактероидов и лактобацилл.

Наличие корреляции уровня б^А и защитных групп микроорганизмов является доказательством функциональной сопряженности иммунной и микроэкологической систем. Факторы гуморального иммунитета осуществляют контроль за участием микрофлоры в физиологических процессах. Сопряженные иммунная и микроэкологическая динамические системы обеспечивают локальную реакцию, направленную на сохранение гомеостаза восстановлением обычных свойств внутренней среды. Б^А является фактором регуляции и защиты от эскалации инфекционного процесса.

Получены экспериментальные доказательства, что растворимые олиго-сахариды глюкозамина (адаптохит) являются индуктором синтеза б^А, и могут быть использованы как профилактическое средство для адаптации к экстремальным условиям существования, а также для иммунокоррекции возникающих при этом нарушений.

Для целей клинической диагностики дисбактериозов создана тест-система и набор реагентов для количественного иммуноферментного определения б1§А в секретах. Анализ б^А может быть использован для диагностики дисбактериоза, для подбора индивидуального курса лечения, а также для решения целого ряда проблем, связанных с применением антибиотиков, химио-терапевтических препаратов, иммуномодуляторов и биологически активных пищевых добавок. Введение новой формы лабораторного контроля - показа-

25

теля местного иммунитета slgA - повысит эффективность лекарственной терапии, поскольку в данном случае реализуется программа создания индивидуальных средств профилактики и реабилитации на принципах обратной связи. Показатель локальной иммунной защиты слизистых slgA может быть использован в отборе лиц для профессий, связанных с экстремальными условиями труда.

2. Разработка тсст-спстсм для выявления эпителиального муцниового антигена.

Эндогенные условно-патогенные микроорганизмы находятся в постоянной готовности к незамедлительной экспансии при благоприятном стечении обстоятельств. При снижении иммунореактивности (при вторичных иммуно-дефпцнтах, в результате воздействия социальных, экологических, профессиональных и других факторов) или при нарушении целостности естественных механических барьеров (раны, язвы, повреждение кожных покровов и слизистых) они покидают природный биотоп, пытаясь колонизовать весь макроорганизм. Развитие и уровень бактериальной транслокации наряду с другими факторами во многом определяется состоянием иммунной системы и микроэкологии желудочно-кишечного тракта. Дефицит slgA в слизистых оболочках открывает путь для инфекции и макромолекулярных антигенов во внутреннюю среду организма, что влечет за собой развитие инфекционно-воспалительных, аутоиммунных или аллергических болезней и объясняет полиморфизм клинических проявлений дефицита slgA. Вторичные иммуноде-фициты проявляются рецидивирующими инфекционно-воспалительными заболеваниями органов дыхания, пищевого канала, кожи, мочевыделительных путей (Савилов Е.В. и др., 2001, Слатннова О.В. и др., 2001, Федотова Т.А. и др., 2001). С вторичными иммунодефпцптамн может быть также связано проникновение и длительная псрсистенция экзогенных вирусов, либо демаскировка эндогенных, способных приводить к вирусной опухолевой трансформации клеток и возникновению заболеваний, протекающих по типу медленных инфекций (Воробьев A.A. и др., 1997; Emad А., 1997).

Известно, что иммунная система наиболее чутко реагирует и на контакт с химическими веществами. При стаже работы более 5 лет на предприятиях химического производства наблюдается истощение компенсаторных возможностей иммунной системы, увеличение количества измененных параметров. В тот же период происходит увеличение доли хронических сопутствующих заболеваний (стоматит, дисбактериоз кишечника, урогенитальная инфекция, туберкулез легких и почек) (Хаитов P.M. и др., 1995).

Перспективы улучшения ранней диагностики опухолей, имеющих эпителиальное происхождение (опухоли молочной железы, яичников, легких, ЖКТи др.) связаны, в первую очередь, с возможностью выявления предопу-

холевых состояний. Нужны объективные критерии для оценки состояния слизистых оболочек для прогностического определения возможности малигниза-шin клеток эпителия слизистой при различной степени морфологических изменений. Предполагать о возможности существования таких изменений в эпителии вполне логично, поскольку в литературе широко обсуждается факт эндогенного инфицирования посредством транслокации микроорганизмов из желудочно-кишечного тракта в другие органы. Чаще всего условно-патогенные бактерии заселяют легкие. И в патогенезе заболеваний бронхоле-гочной системы ведущая роль принадлежит нарушениям мукозного иммунитета (Борисова A.M., 1997; Пинегин Б.В., 1997).

Диагностика рака легкого - одна из актуальных проблем современной онкологии. Ранние стадии легкого практически не диагностируются, значительный процент клинических ошибок связан с трудностями дифференциальной диагностики рака и неопухолевых заболеваний легкого, клинико-рентгенологические проявления которых напоминают картину злокачественного процесса. Известно, что рак легкого чаще всего развивается в измененной слизистой оболочке бронхов (Молодык A.A. и др., 1992). И задача ранней диагностики новообразований связана с выявлением лиц с предопухолевыми состояниями, с формированием групп высокого риска.

Обоснование выбора IV1KA ИКО-25 для разработки тест-систем. К моменту начала наших исследований гибридомы-продуценты МКА к мембранным антнгенам секрета молочной железы были получены профессором А.Ю Барышниковым (РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН). Одна из них - гибри-дома-продуцент МКА ИКО-25 и привлекла наше внимание, поскольку продуцируемые ею МКА по данным иммуногистохимического анализа были специфичны к опухолям эпителиального генеза. Антиген, узнаваемый МКА ИКО-25, являлся дифференцировочным и был характерен для клеток однослойного эпителия, обладающих секреторной активностью. Антиген широко представлен в тканях злокачественных новообразований(Якубовская Р.И. и др.,1991;Якубовская Р.И.,1992). Приведенные выше факты позволили нам считать перспективным создание на основе МКА ИКО-25 тест-системы для выявления опухолей эпителиального генеза.

Выделение и характеристика эпителиального муцинового антигена CAg25. Выделение мембран жировых глобул женского молока (МЖГ) проводили по методу Якубовской Р.И.и др., (1986). Использование этой методики для получения обогащенной антигеном фракции мембранных гликопро-теннов не увенчалось успехом. Поэтому в серии экспериментов с контролем по связыванию с МКА ИКО-25 нами были найдены детергенты, дающие наибольший выход интересующего нас мембранного антигена, не вызывая при этом его денатурации. Такими детергентами оказались холат и дезоксихолат натрия.

Следующий этап работы заключался в аффинной очистке антигена. Были исследованы условия посадки антигена на колонку с МКА ИКО-25, иммобилизованными на сефарозе 6В: при 4°С, при комнатной температуре, при разных скоростях потока через колонку, а также в статических условиях. Проходящий через колонку материал тестировали по связыванию с ИКО-25 в твердофазном ИФА. Оптимальными оказались следующие условия посадки на аффинный сорбент: инкубация Зч при комнатной температуре в 10 мМ трис-буфере рН 7,6; отмывка колонки этим же буфером.

Наиболее сложным оказался этап работы, связанный с элюированием мембранного антигена САц25. Были подобраны условия элюирования, обеспечивающие высокий выход антигена: 0,05М трис буфер рН 11,5 в присутствии 0,5% дезоксихолата натрия. Инактивацию антигена при высоких рН предупреждали немедленной нейтрализацией антигена 0,1 М глицином рН 3,0. Удаление дезоксихолата и солей было возможно только диализом, поскольку ни гельфильтрация на сефадсксс С-10, 15, 25, ни отмывание на мембране амикон РМ10 не дали удовлетворительных результатов, так как происходила инактивация антигена. После диализа антиген высушивали лиофильно. При этом сохранялась его способность связываться с МКА ИКО-25.

Молекулярные свойства САц25. При изучении молекулярных свойств CAg25 обнаружено, что при электрофорезе в 7,5% ПААГ в присутствии ДДС антиген не окрашивался красителем для белков. При окрашивании фуксином обнаружена размытая диффузная полоса вблизи старта. На колонке с ультрагелем АсА34 антиген выходил одним широким пиком сразу же после фронта буфера, что соответствует молекулярной массе порядка 400 кД (рис. 7а). Определен состав антигена в процентах к сухому веществу: белок 2,5; гексоза-мины-8, Ы-ацетнлнейраминовая кислота-16, нейтральные сахара-16. Для выявления природы антигена его обрабатывали ферментами, и ферментативные гидролизаты были подвергнуты гель-хроматографии на ультрагеле АсА 34, рис. 7а-г.

При обработке CAg25 нейраминидазой холерного эмбриона иммунологическая активность антигена сохранялась, что свидетельствовало о сохранении антигенных детерминант антигена. Следовательно, ацетилнейрамнновая кислота не входит в состав антигенных детерминант антигена. Появившаяся гетерогенность после обработки нейраминидазой, возможно, связана с тем, что М-ацетилнейрамнновая кислота за счет дополнительных связей по типу ионных мостиков участвует в образовании стабильных высокомолекулярных агрегатов. При ее отщеплении эти связи нарушаются, и стабильный агрегат муцина частично разрушается, рис. 76.

Рис. 7 Хроматография аффинно очищенного антигена МЖГ на ультрагеле АсА 34 (колонка 1.5><29 см) в 0.01 М трнс-буфере рН 7.4 (а), после обработки нейроаминндазон (б), смесью гликозидаз (в), протеиназой К или коллагеназон (г). 1- иммунологическая активность, определяемая твердофазным ИФА, 2 - белок по Бредфорду. 3 - нейтральные углеводы.

При обработке смесью гликозидаз (альфа-О-маннозидазы, бета- Э -галактозидазы, бета -О- М-ацетнлгексозаминидазы) также обнаружено изменение хроматографических характеристик антигена. Однако, антигенные детерминанты сохранялись и, напротив, размаскировывались после отщепления части углеводов. Обнаружено появление ннзкомолекулярных фрагментов антигена, обладающих способностью связываться с МКА ИКО-25, рис. 7в. При ограниченном протеннолизе протеиназой К, которая преимущественно расщепляет связи, образованные глицином, лейцином и аланином, разрушаются антигенные детерминанты антигена и снижается его способность связываться с МКА ИКО- 25. Однако появляются ннзкомолекулярные фрагменты со значительной иммунологической активностью, рис. 7г.

Аналогичное изменение хроматографических характеристик антигена происходит при обработке его коллагсназой С1.1ш1о1>1'1сит, которая разрывает связи, образованные глицином и пролином. Обнаружено появление множества низкомолекулярных фрагментов, содержащих гексозы. Также как и при обработке протеиназой К, исчезает иммунологическая активность, тестируемая по связыванию с ИКО- 25. Следует отметить, что образовавшиеся фрагменты обладают сродством к ультрагелю, который представляет собой сетку ПААГ внутри жесткой матрицы агарозы. Возможно, фрагменты антигена за счет отрицательно заряженной 1^-ацетилнейраминовой кислоты связываются с ПААГ.

Для определения типа связи олигосахарндных цепей с полипептидным скелетом антиген подвергали обработке 0,1 N ШОН и 1М ЫаВН4 при 37°С в течение 25 ч с последующим разделением продуктов реакции на ультрагеле АсА34. Отщепление углеводов, обнаруженное фенол-серным методом, свидетельствовало о том, что в структуре антигена имеются олигосахаридные цепи, связанные с полипептидным скелетом посредством О-гликозидной связи. Обработка перйодатом, при которой происходит окислительный разрыв углерод-углеродной связи в гексозах, приводит к резкому снижению способности антигена связываться с МКА ИКО-25. Вероятно, олигосахаридные цепи формируют антигенную структуру, но антигенные детерминанты находятся на по-лнпептидных цепях.

Итак, узнаваемый МКА ИКО-25 эпитоп является муцпновым гликопро-теином с молекулярной массой около 400 кД, имеющем в своем составе 0-гликозидные связи. Антигенные детерминанты находятся на полнпептндном скелете, но олигосахаридные цепи участвуют в формировании антигенной структуры.

Характеристика МКА ИКО-25 по специфичности выявления опухолей. Изучение специфичности МКА ИКО-25 проводили совместно с МНИОИ им. П.А. Герцена. Испытано 20 серий препарата МКА ИКО-25 на 300 образцах нормальных и опухолевых тканей человека.

МКА ИКО-25 взаимодействуют с антигеном специфично, не обнаруживают неспецифических реакций в контрольных образцах, не взаимодействуют со стромальными элементами, клетками крови, эндотелием сосудов. МКА ИКО-25 при иммунофлуоресцентном окрашивании срезов ткани отличают злокачественные и доброкачественные опухоли. Выявлены три .четко выраженных типа реакции, различающиеся по интенсивности и распределению метки. Каждый тип характерен для определенного типа опухолей.

В первом типе реакции наблюдается высокая интенсивность окрашивания за счет выявления значительного количества антигена как на мембране, так и в цитоплазме. Это характерно для клеток как молочной железы, так и рака легкого, низкодифференцированного рака желудка, плоскоклеточных раков матки. Во втором типе наблюдается окрашивание опухолевых клеток по мембране, обращенной в просвет железистоподобных и сосочковых структур, где интенсивность реакции определяется степенью выраженности прн-мембранного компонента (аденокарцинома яичника, легкого, матки, желудка, щитовидной железы и кишечника). В третьем типе наблюдается мембранное специфическое окрашивание. Это злокачественные новообразования почки, мочевого пузыря, яичника.

Тест-система для количественного нммуноферментного определения эпителиального муцинового антигена была сконструирована на принципе сандвича. Поливалентный характер муцинового антигена СА§25 позволил для конструирования ИФА тест-системы использовать одно МКА ИКО-25. Исследуемые образцы сыворотки инкубируют с сорбированными на твердой фазе мышиными МКА ИКО-25 и конъюгатом этих же МКА ИКО-25 с пероксидазой. Во время инкубации эпителиальный муциновый антиген образца связывается с иммобилизованными на планшете антителами и одновременно с конъюгатом. После отмывания лунок планшета от несвязавшихся реагентов проводится ферментативная реакция для определения активности пероксндазы, сорбированной на лунках планшета. Оценка осуществляется фотометрически при длине волны 450 нм. Интенсивность окраски хромогена прямо пропорциональна концентрации антигена в исследуемых образцах. Разработанная тест-система имеет следующие характеристики: твердофазная, одностадийная на основе одного МКА ИКО-25; диапазон измеряемых концентраций 0-200 нг/мл; время анализа 1,5 ч; объем пробы 100 мкл.

Наряду с ИФА тест-системой нами была разработана экспрессная им-муноагглютинационная тест-система (ИАГ) для анализа цельной крови. В качестве носителя антител мы использовали гидрозоль оксида железа. Поверхность частиц гидрозоля нагружали МКА ИКО-25. При образовании иммунных агрегатов частицы гидрозоля играют роль мостиков между молекулами поливалентного антигена. Аликвоту суспензии такого комплекса (гидрозольный реактив) прибавляли к аликвоте исследуемой сыворотки или цельной крови и тщательно перемешивали. Если в сыворотке содержался антиген, то

через 10-15 мин образовывались мелкие, хорошо видимые агглютинаты в виде точки красно-коричневого цвета. В случае образца, не содержащего антиген, гидрозольный реагент равномерно распределялся в виде осадка без агглютинации на дне лунки планшета, образуя зонтик.

Иммуноагглютинационная (ИАГ) тест-система для анализа цельной крови и сыворотки имеет следующие характеристики. Принцип анализа: одностадийный, твердофазный, агглютинационный на основе МКА ИКО-25; твердая фаза: гидрозоль оксида железа (Ш); время анализа: 15 мин; объем пробы: 50 мкл; диапазон измерений: 0,4-10 мкг/мл.

3. Результаты проведения клинических испытаний тест-систем для выявления эпителиального муцннового антигена (CAg25).

Исследование количественной ИФА тест-системы проводили на образцах сыворотки крови от 43 пациентов с опухолями молочной железы различных стадий, от 13 пациентов отделения неврологии и 15 доноров (таблица 6).

Таблица 6. Выявление эпителиального муцинового антигена СА§25 в сыворотке крови.

Сыворотка Содержание САе25 (мкг/мл)

Рак молочной железы

Стадия 1 (п=5) 0-5

Стадия 2 (п=8) 5-15

Стадия 3(п=15) 15-30

Стадия 4(п=15) 30-50

Доноры(п=15) 0

Больные с неонкологической патологией (от- 0

деление неврологнн)(п=13)

В пределах проведенного исследования ИФА тест-система отличала сыворотки онкологических больных от сывороток доноров и больных с неонкологической патологией. Уровень САц25 в сыворотке коррелировал со степенью распространенности процесса злокачественного роста.

Исследовали чувствительность ИФА тест-системы в отношении выявления эпителиального муцинового антигена СА§25 в 86 сыворотках от пациентов с опухолями различной локализации и установленным клинико-морфологическим диагнозом, таблица 7. Особенно высока эффективность выявления САц25 при новообразованиях в органах с хорошо развитой системой васкулярнзацин (молочная железа, легкие), поскольку в этих органах обеспечивается достаточная секреция антигена в кровь. Эти данные находятся

32

в соответствии с данными исследования СА%25 на срезах опухолей с помощью непрямого иммуногистохимического окрашивания с использованием МКА ИКО-25, таблица 7.

Таблица 7. Выявление (процент) эпителиального антигена CAg25 в сыворотке и на срезах опухолей.

Локализация опухоли Сыворотка (% выявления) Срезы опухолей (% выявления)

Молочная железа 72 (43/60) 100 (98/98)

Легкие 73(11/15) 73(14/19)

Яичник 57 (4/7) 94(16/17)

Матка 66 (2/3) 83 (10/12)

Кишечник 100(1/1) 91 (10/11)

Таким образом, по данным иммуногистохимического анализа срезов и результатам серодиагностики в рамках проведенного исследования наиболее высокий процент выявления опухолей в молочной железе, легких, яичнике, матке и кишечнике.

Сравнительные клинические испытания количественной ИФА • тест-системы и коммерческих наборов реагентов для нммуноферментно-го анализа CA 15-3, СА125, СЕА.

В ходе клинических испытаний исследовали сыворотки, отобранные в качестве положительных при анализе наборами фирмы Roche CA 15-3 (используется для мониторинга рака молочной железы), CA 125 (используется для мониторинга рака яичника), раковоэмбрионального антигена (СЕА) (используется для мониторинга опухолей желудочно-кишечного тракта). Близкое совпадение результатов получено при анализе с использованием разработанной нами ИФА тест-системы и набора CA 15-3 с сыворотками от пациентов с опухолями молочной железы до лечения, в начале лечения (п=30), в процессе лечения (п=50). Из 30 сывороток от пациентов в ремиссии коммерческим набором CA 15-3 выявлено 6 сывороток, как положительных. Из 30 сывороток от пациентов в ремиссии разработанной нами тест-системой выявлено 8 сывороток, как положительных. 74,5% сывороток (п=81) от пациентов с опухолями яичника, отобранных как положительные при анализе набором СА125, были положительными при исследовании с помощью разработанной нами ИФА тест-системы. Сыворотки, положительные при анализе набором СЕА, от пациентов с опухолями желудка (п=16), опухолями поджелудочной железы (п=16), опухолями толстой кишки (п=1б) имели совпадения на 38,46 и 60 % соответственно (таблица 8).

Таблица 8. Выявление больных с опухолями молочной железы, яичника, желудочно-кишечного тракта. Процент совпадений результатов, полученных при использовании разработанной ИФА тест-системы и результатов, полученных при использовании коммерческих наборов фирмы Roche CA 15-3, CA 125, CEA.

Группы пациептов Количество пациентов CA 15-3 (за 100%) СА125 (за 100%) CEA (за 100%)

Здоровые 160 100

РМЖ: до и в начале лечения 30 93,3

РМЖ: в процессе лечения 50 95,7

РМЖ: в ремиссии 30 133

Опухоли яичника 81 74,5

Опухоли желудка 16 38,6

Опухоли поджелудочной железы 16 46,6

Опухоли толстой кишки 16 60,2

РМЖ - рак молочной железы

Итак, из секрета молочной железы нами выделен и охарактеризован новый муциновый эпителиальный антиген CAg25.

Результаты иммунопатологических исследований, проведенных нами с использованием 20 серий МКА ИКО-25 на 300 образцах нормальных и опухолевых тканей человека, показали, что МКА ИКО-25 специфичны к опухолям эпителиального генеза. На основе МКА ИКО-25 нами разработана количественная ИФА тест-система для сыворотки и ИАГ экспресс-тест система для капиллярной крови. Как показали наши исследования, проведенные на 111 образцах сывороток, обе тест-системы обнаруживают в сыворотке (крови) эпителиальный муциновый антиген CAg25.

4. Исследование уровня в^А н эпителиального муцинового антигена CAg25 в БАС лиц с заболеваниями бронхолегочной системы Мы исследовали уровень эпителиального муцинового антигена CAg25 ИФА тест-системой и ИАГ тест-системой в БАС от пациентов со злокачественными новообразованиями в легких и от пациентов с хроническими заболеваниями бронхолегочной системы. Исследовали 49 БАС от 35 пациентов с различными заболеваниями и 2 повторных БАС от одного и того же человека без признаков какой-либо патологии (данные комплексного клинического

эбследования). Пациенты были разделены на 3 группы: первая группа - пациенты с опухолями легких и опухолями других локализаций (таблица 9).

Таблица 9. Определение эпителиального опухолевого маркера СА§25 в БАС пациентов с опухолями разных локализаций.

Пациент Диагноз Взятие БАС Результат ИФА (мкг\мл) Результат ИАГ(+\-)

I.X. Рак периферической верхней доли правого легкого (лобэктомия) Л/л 0

Л/л п/о 0 -

П/л д/о 17,0 +

П/л п/о 2,0 +

2.Л. Эпидермоидный рак верхнедолевого бронха справа (лобэктомия) Л/л д/о 10,0 +

П/л д/о 19,0 +

П/л п/о 17,0 +

З.Я. Эпидермоидный рак нижнедолевого бронха слева (лобэктомия) Л/л д/о 18,0 +

Л/л п/о 0 -

П/л д/о 10,0 +

П/л п/о 9,0 +

4.У. Рак легкого С., д/о 12,0 +

5.С. Центральный рак легкого справа(правосторонняя пульмонэктомия) С., д/о 9,0 +

6.Р. Эндогенный аллергический апьвеолит, рак прямой кишки С. 28,0 +

7.П. Рак средней трети пищевода С. 1.0 +

Примечание: п/л - правое легкое, л/л - левое легкое, д/о -до операции,

i/o -после операции, С -БАС, смешанный от правого и левого легкого.

Вторая фуппа - пациенты с хроническим бронхитом и другими неонко-югнческнмн патологиями (таблица 10), третья группа - пациенты с астмой таблица 11).

В группе из 5 пациентов с диагнозом «эпидермоидный рак бронхов легкого» БАС исследовали до и через 24 часа после лоб- или пульмонэктомии в месте локализации опухоли. Было изучено 13 БАС. Высокая концентрация CAg25 (9-19мкг/мл) была обнаружена до операции в БАС из легкого или доли, в которых находилась опухоль. После удаления опухоли в результате ло-бэктомин в двух случаях содержание CAg25 в БАС из оставшихся долен резко снизилось (до 0-2 мкг/мл). Однако в одном случае уровень антигена в БАС после операции почти не изменился (17-19 мкг/мл).

Исследовали 9 случаев хронического бронхита (таблица 10). Эпителиальный опухолевый антиген CAg25 выявлен у одного пациента (11%), как в ИФА тест-системе (3,0 мкг/мл), так и в ИАГ тест-системе. Высокий уровень эпителиального опухолевого антигена выявлен при экзогенном фиброзирую-щем альвеолнте (25,0 мкг/мл), эндогенном аллергическом альвеолите (28 мкг/мл). Этот случай заболевания протекал на фоне опухоли прямой кишки. Высокое значение эпителиального опухолевого антигена CAg25 до 40 мкг/мл отмечено при иднопатическом гемосидерозе с сопутствующим туберкулезом легких. При варикозном расширении вен, активном курении и контактах с медью также зафиксировано значительное повышение уровня эпителиального опухолевого антигена CAg25 до 38 мкг/мл. Курение, болезни ЖКТ относятся к предрасполагающим факторам в отношении заболеваний туберкулезом (Чернеховская Н.Е. и др., 2000).

Активное курение - это тот случай, когда возможны существенные нарушения слизистых покровов верхних дыхательных путей, поскольку известно, что табачный дым приводит к повреждению и высыханию слизистой (Merrill W.W. et al., 1981).

При исследовании БАС у 11 пациентов с бронхиальной астмой было изучено 16 БАС (таблица 11). У одного пациента (1%) обнаружен высокий уровень CAg25 (35 мкг/мл), у 6 пациентов (54,5%) уровень CAg25 был в пределах низких значений (2,5-5 мкг/мл). Сейчас четко сформулирована концепция бронхиальной астмы как хронического иммунного (аллергического) воспаления дыхательных путей, определены роль эозинофилов и эозннофильных белков в повреждении слизистых покровов и эпителия бронхов, регулирующая роль Т лимфоцитов и продуцируемых ими цитокинов в бронхиальном воспалении. Основными патоморфологическими изменениями в бронхоле-гочном аппарате у больных бронхиальной астмой является гипертрофия гладких мышц бронхов н бронхиол, утолщение базалыюй мембраны, отечность слизистой оболочки, гиперплазия подслизистых желез и бокаловидных клеток (Алексеев В.Г. и др., 1998).

Таблица 10. Определение эпителиального опухолевого маркера СА{>25 в БАС от пациентов с хроническим бронхитом, некоторыми заболеваниями верхних дыхательных путей и другими патологиями

Пациент Диагноз Взятие БАС Результат ИФА м кг/мл) Результат ИАГ(+/-)

1.Д. Хронич.бронхит С. 0 -

2. К. С. 0 -

З.С. -II- С. 0 -

4. С. -II- с. 0 -

5. С. с. 0 -

6. Т. -II- с. 0 -

7.4. -II- с. 0 -

8.Ю. Хронич.брон., интерсти-циальный фиброз с. 3,0 +

9.4-в. Хронический бронхит с. 1,5 +/-

10.М. Саркоидоз с. 0 -

11.Б. Карциноид средней доли легкого справа (лобэкто-мия) Л/л, а/о 1,0 +/-

-II- Л/л, п/о 0 -

-II- П/л, д/о 0 -

-II- П/л, п/о 0 -

12.П Карцииноидный синдром С. 0 -

13.А Экзогенный фиброзирую-щий альвеолит С. 25,0 +

14.Б. Идиопатический гемоси-дероз, туберкулез легкого С. 40,0 +

15.Г. Липома переднего средостения С. 0,5 +/-

16.К. Язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки С. 3,0 +

17.М Варикозное расширение вен, много курит, контакт с медью С. 38,0 +

Примечание. Обозначения, как в таблице 9

Таблица 11. Определение эпителиального опухолевого антигена СА^2! в БАС пациентов с бронхиальной астмой

Пациент Диагноз Взятпс БАС Результат ИФА (мкг/мл) Результат ИАГ(+/-)

1.Б-в Норма Первичн. 0,8 -

2. Б-в Норма Повтори. 0 -

3. М. Бронхиальная астма Первичн. 0 -

Повтори. 0 -

4. Б. -II- Первичн. 0 -

5. П. 1991г. 2,5 +

1991г. 3,0 +

1992г. 3.0 +

б. С. -II- Первичн. 3.0 +

Повтори. 3.0 +

7. Ж. -II- Первичн. 0 -

8. И. -II- Первнчн. 0 -

9. Р. -II- Первичн. 0 -

10. Ш. -II- Первичн. 5,0 +

11. Ш-я -II- Первичн. 0 -

Первнчн. 35,0 +

Особо нас заинтересовали группа из 5 пациентов с неопухолевым! бронхолегочными заболеваниями, у которых уровень САз25 при определенш двумя методами был высоким (25-40 мкг/мл) и группа из 7 пациентов, у кото рых уровень эпителиального муцинового антигена СА£25 был повышен (2,5 5,0 мкг/мл). В эту фуппу попадает 6 пациентов с астмой.

Мы полагаем, что эти пациенты составляют группу риска. Высоки! уровень CAg25 (40 мкг/мл) у пациента с туберкулезом вполне понятен, та> как туберкулез является фоновым заболеванием для развития рака легкогс (Алексеев В.Г. и др., 1998). Таким образом, в БАС от 35 пациентов эпители альный опухолевый антиген СА§25 определялся у 17 пациентов с бронхоле точными заболеваниями, включая опухоли, это составляет 48,5%. Мы полага ем, что эти пациенты должны составлять фуппу повышенного онкологиче ского риска. Эти данные побудили нас предпринять расширенное клиниче скос исследование уровней эпителиального опухолевого антигена СА§25 I в БАС от пациентов с бронхолегочными патологиями. На рис. 9 пред ставлены результаты этого исследования.

мкг/мл I_I

50-

40-

30-

20-

10-

п=7

п=28

3-

САе25 мкг/мл

п=17

п=23 ./

-40

^30

- 20

-10

условно бронхит пневмония астма здоровые

Рис. 9. Уровни в^А и эпителиального опухолевого антигена СА§25 в 1АС пациентов с хроническими заболеваниями ВДП.

Как видно из рис. 9, уровень б1§А в БАС при хроническом бронхите, невмонии, бронхиальной астме снижен на 14, 28 и 63% соответственно. При том появляется и нарастает уровень эпителиального муцинового антигена 'А§25. При снижении естественной резистентности организма, определяемой ю уровню б^А и при нарастании изменений в слизистых покровах, высти-аюших бронхолегочные пути, в БАС появляется антиген СА§25, являющий-я, как мы показали ранее, маркером опухолей эпителиального генеза. Это значает, что пациенты со сниженным против нормы уровнем в^А должны оставлять группу онкологического риска. Эти данные подтверждают связь 1ежду патологией бронхолегочной системы и дисфункцией местного имму-ттета, которая обсуждается в литературе в последние годы. Следует отме-нть, что факт выявления опухолевого маркера РЭА отмечается в литературе Етас! А., 1997, Со1с)51ат N. е1 а!., 1985). О том, что дефицит б1£А лежит в снове многих хронических заболеваний слизистых оболочек органов, непо-редственно контактирующих с внешней средой, многократно отмечалось в

литературе (Хаитов P.M., Пинегин Б.В. и др. 1995, Першин Б.Б. и др., 1996; Пииегин Б.В., 1997; Алешкин В.А. и др., 2000). Проведенным нами исследованием мы показали зависимость повреждения слизистых и выявления эпителиального муцинового антигена от уровня slgA.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Одной из основных характеристик процесса адаптации является резистентность - интегральный показатель, характеризующий общее состояние организма, степень его отклонения от физиологической нормы (сугубо индивидуальной) и способность переносить неблагоприятные и необычные воздействия. Адаптационные подготовка систем организма (иммунной и микроэкологической) к экстремальным воздействиям, последствия напряжения адаптационных систем, как количественно их измерить, как оценить возможные последствия в период переходного состояния к болезни - вот те вопросы, которые стояли перед началом этого исследования. При отсутствии критериев оценки переходного состояния, характеризующегося активацией систем регуляции организма, невозможна донозологическая диагностика .

В настоящее время уже общепризнанным и доказанным в экспериментах с безмикробными животными и гнотобнотами с известными наборами бактерий считается факт, что состояние микробной экологии хозяина играет важную роль в возникновении спонтанных и индуцированных злокачественных новообразований человека и животных. Резидентная и транзиторная микрофлора, метаболизируя эндогенные и экзогенные субстраты, способствует формированию канцерогенов, промоторов развития опухолей или предшественников. Предполагается, что канцерогены и промоторы формируются при микробной трансформации проканцерогенов, присутствующих в атмосферном воздухе, воде и пище. Бактериальными ферментами, для которых доказано участие в реакциях превращения проканцерогенов в активные канцерогены, являются глнкозндазы, нитрозосинтстазы, азоредуктазы, 7-альфа-стероид дегидрогеназа, 7-альфа-дегидроксилаза (Thompson М.Н., 1984; Hill M.J., 1986; Шеидеров Б.А., 1990). Значимость микроорганизмов в формировании N-нитрозосоединений с канцерогенным эффектом установлена в 1970 г. и позднее подтверждалась неоднократно (Bartsch Н. et al., 1988). Предшественником N-ннтрозамннов являются нитраты. Их метаболизм осуществляется за счет бактериальных нитрат- и нитрнтредуктаз, наиболее активных в анаэробных условиях. К их продуцентам относятся гемофильные бактерии, пропионобак-терин, клострндин, эубактерии, арахнин, вейллонеллы, бактероиды, актино-мицеты (Hill M.J., 1986).

Многообразные изменения в организме, происходящие при стрессе отражены в обзоре (Лнзько H.H., 1987). Стрессовые ситуации создают условия к изменению адгезивных свойств бактерий и клеточной адгезнвностн макроор-

анизма. Физико-химическое состояние муцина может быть нарушено желч-1ымн кислотами, протеолитическими ферментами и изменениями pH. Снижете содержания мукозной составляющей (муцина) и снижение кислых муко-юлисахарндов на поверхности мукозы и покрывающих его клеток считают юказателем стрессовой реакции. Имеются прямые доказательства существо-ания некоторой предрасположенности к изменению адгезии во время стресс-ждуцированных сдвигов в процессах пищеварения. Сдвиг в гормональном омеостазе может касаться также адгезии. Есть доказательства, что гормоны шдуцнруют изменения в синтезе рецепторов для бактерий и модифицируют пособность клеток связываться с бактериями. Происходят значительные избиения в иммунореактивности на стресс-активацию гипоталамо-ипофизарно-адреналнновой системы. Известно, что кортикостероиды явля-этся иммунодепрессантами. Имеются доказательства участия Т-лимфоцитов I регуляции бактериальной транслокацни. Т-лимфоциты снижают риск выхо-ia бактерий за пределы ЖКТ. Снижение иммунологической резистентности южет оказывать влияние на топографическое распределение некоторых мик-юбных популяций в ЖКТ. Следствие - эндогенная контаминация и метаболи-lecKiie последствия усиленного бактериального роста в тонком кишечнике. В 1сследованиях с созданием стрессовой ситуации на животных инфузией ^КТГ показано, что активное распространение E.coli происходит в прокси-1альные отделы тонкого кишечника. Морфологические изменения характери-овались включением тимуса, атрофией фолликул лимфатических тканей, лнзистой кишечника, которая и определяет бактериальную топографию Schulze F. et al., 1980).

Таким образом, в организме всегда существует угроза злокачественного юста, поскольку фактором агрессии может быть микрофлора хозяина. При-тна - атрибуты современной жизни - стрессы, экологическое неблагополучие 1кружающей среды. Реакция каждого индивидуума зависит от его генетиче-кого и иммунологического потенциала, состояния микробиоценоза. Изме-шть генетические признаки человека на современном уровне развития науки ще невозможно, но разработать критерии оценки ранних стадий изменений лизистых покровов и предупредить возникновение злокачественного роста в пителни возможно, тем более, что современная наука создала целый арсенал [ммунокорректирующих средств, в том числе и природного происхождения.

Основной принцип адаптации живых организмов заложен в концепции уществования иммунохимической функциональной системы гомеостаза ИФСГ), которая включает две основные функционально связанные системы: штохром P-450-зависимую метаболическую систему и иммунную систему Ковалев И.Е., 1985).

ИФСГ охватывает все ткани и клетки и способна узнавать структуры ^ограниченного числа веществ, кодировать полученную информацию, заложи ать ее, активировать адаптационные механизмы, соответствующие данной

экстремальной ситуации. В процессе данного исследования мы создали две иммуноферментные тест-системы для количественного определения slgA в секретах и количественного определения эпителиального муцинового опухолевого антигена CAg25 в сыворотке и БАС.

Одним из подходов решения задач диагностики ранних стадий онкологических заболеваний является поиск маркеров эпителия, онко- и стрессзави-снмых. В результате проведенного исследования было установлено, что о вызванных стрессом и вредными условиями труда, изменениях состояния эпителия слизистых покровов толстого кишечника сигнализирует slgA. SlgA является биологическим маркером, который выявляет изменения системы регуляции организма в ответ на агрессивные факторы внешней среды.

Что касается механизма регуляции адаптационного процесса, то известно, что существует самообновляющаяся популяция CD5+ В-клеток, отличная от других В- клеток. Эти CD5+ В-клетки продуцируют большое разнообразие антител с низкой аффинностью и играют главную роль как первый барьер защиты от чужеродных агентов, таких как вирусы и бактерии (Casali P. et а!.. 1989). CD5+ активационный маркер на поверхности активированных В-клеток регулируется интерлейкином-4. CD5* появляется на определенном этапе диф-ференцировки В-клеток и экспрессируется приблизительно на 20% В-клеток крови здоровых доноров, 10% В-клеток миндалин и 50% В-клеток эмбриональной селезенки. Внеклеточная область CD5* содержит 3 богатых цистеи-ном доменов-скавенджеров (мусорщиков) и по структуре CD5* близок к семейству рецепторов-скавенджеров, включающих рецептор типа 1 макрофагов, комплементный фактор 1 человека (Barclay A.N. et al., 1993). Близость структуры CD5+ с семейством рецепторов «мусорщиков» предполагает близость функциональной роли в устранении чужеродных агентов (бактерий).

Полагаем, что для ранней донозологической диагностики, определение уровня slgA и содержания эпителиального муцинового антигена CAg25 в БАС и секретах более информативным по сравнению с определением его в сыворотке крови. Доказательством тому служит пример одной из последних публикаций. Изучали роль дисбактерноза в формировании иммунной недостаточности у детей с рецидивирующими инфекциями дыхательных путей (острые пневмонии, острые бронхиты, острые респираторные вирусные инфекции). У всех детей выявлены условно-патогенные микроорганизмы (наиболее часто встречались два вида - St.aureus и грибы рода Candida). При этом «достоверных различий в лабораторных показателях крови не выявлено» (по показателям лейкоцитарная формула крови, фагоцитарной активности нейтрофи-лов, определению уровней IgA, IgE, IgG, IgM) (Федотова Т.А. и др., 2001). Естественно, различие должно быть на уровне слизистых покровов ВДП. В ответ на появление патогенной микрофлоры местно в подслизистом слое синтезируется slgA для борьбы с патогенной микрофлорой и защиты целостности слизистых покровов. Именно показатель местного иммунитета должен изме-

)яться при колонизации слизистых покровов условно патогенной микрофло-юй. Поэтому определение б^А имеет существенное значение для диагностики ряда заболеваний кишечника, легких, ротовой полости и др. Величина и так этих изменений зависит от продолжительности неблагоприятных воздействий, от генетических особенностей организма. Возможно превышение исходного уровня, угнетение, восстановление и затем вторичное угнетение. При шрастаннн проявлений истощения процесс переходит в декомпенсированную })орму, а затем в тотальную иммунную недостаточность. Этим и объясняются шстые рецидивы клинических манифестаций. Выбор правильного курса ле-1ения должен идти также при контроле б^А в секретах, но не в крови.

Необходимо определять статус местного иммунитета в секретах для вы-5ора эффективного лекарственного средства в каждом конкретном случае и в 1альнейшем для характеристики активности процесса и прогноза заболевания. Полагаем, что за счет введения новой формы лабораторного контроля (анали-1а б^А в секретах) повысится эффективность лекарственной терапии, по-:кольку будет реализован принцип обратной связи.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что в результате воздействия на организм экстремаль-1ых факторов (космический полет, хирургический стресс, перевод на полет-1ый рацион питания, антиортостатическая гипокинезия, вредные условия тру-1а, связанные с шумом, вибрациями, парами топлива и свинца) общей зако-юмерностью изменений слизистых покровов толстого кишечника является :ниженне уровня защитных групп микроорганизмов за счет вытеснения их условно-патогенной микрофлорой, формирования дисбактериоза разной сте-1ени выраженности на фоне увеличения уровня б^А в копрофильтратах.

2. Функциональная сопряженность микроэкологической системы и системы местного иммунитета доказана на основании найденной нами коррелятивной связи между уровнем б1§А и уровнями бифидобактерий и лактобацилл "олстого кишечника человека (коэффициенты корреляции соответственно -),72 и - 0,46) и коррелятивной связи между уровнем б^А, уровнями бакте-юидов и лактобацилл толстого кишечника обезьян ( коэффициенты корреля-хии соответственно -0,80 и -0,50).

3. Впервые показана возможность использования б^А для оценки не-:пецифнческой резистентности, диагностики изменений слизистой толстого (ишечника и прогнозирования развития дисбактериоза. Создана гибридома-1родуцент моноклональных антител к б^А и на ее основе разработана тест-:нстема для количественного определения б1§А в секретах. Создан коммерче-:кий набор для иммуноферментного определения б^А в секретах. Разработан летод определения б^А в фекалиях и БАС.

4. Впервые показана возможность использования в^А в качестве маркера для оценки состояния слизистых покровов ВДП при хронических заболеваниях бронхолегочной системы.

5. Выделен и охарактеризован новый муциновый эпителиальный антиген (CAg25) из секрета молочной железы. Установлено, что антиген является гликопротеином с молекулярной массой 400 кД. Состав антигена (в процентах на сухой вес): белок-2,5, гексозамины-8, сналовые кнслоты-16, нейтральные углеводы-16. Установлены структурные особенности антигена СА§25: антигенные детерминанты находятся на полипептидном скелете, антиген содержит О-связанные олигосахаридные цепи, олигосахаридные цепи участвуют в формировании антигенной структуры. Разработана ИФА тест-система для количественного определения CAg25 в сыворотке. Разработана ИАГ тест-система для выявления муцинового антигена CAg25 в цельной крови.

6. Установлено, что с помощью разработанных тест-систем ИФА и ИАГ антиген опухолей эпителиального генеза выявляется в сыворотке и крови онкологических больных с высокой долей вероятности (рак молочной железы в 72% случаев, рак легких в 73% случаев, рак яичника в 57% случаев).

7. Показано, что эпителиальный опухолевый антиген CAg25 обнаруживается в БАС пациентов с хроническим бронхитом, пневмонией, бронхиальной астмой и злокачественными новообразованиями легких. Обоснован принцип формирования фупп риска по патологии слизистых покровов ВДП.

8. Полученный экспериментальный материал по анализу э^А и эпителиального муцинового антигена CAg25 может стать основой для создания нового научного направления по целевому поиску маркеров адаптации и естественной резистентности организма с целью раннего выявления и профилактики патологий слизистых покровов органов, непосредственно контактирующих с внешней средой.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Химическая природа биологического действия гликопротеинов. Т., 1>ан», 1988, 148 с. (соавт. Бабаев Т.А., Алимбабаева Н.Т.)

2. Реагенты для диагностики опухолей эпителиального генеза. Сб. тру-эв. «Современные направления создания медицинских диагностикумов». М., 390, с.48 (соавт. Сухно А. А., Якубовская Р.И., Кармакова Т.А. и др.).

3. Иммуногистохимическое изучение моноклональных антител к анти-:ну мембран жировых глобул женского молока. Архив патологии, 1991,т. 53, г.б, с. 11-17 (соавт. Якубовская Р.И., Барышников А.Ю., ¡Кармакова Т.А. и р.).

4. Некоторые аспекты получения моноклональных антител техникой in ivo. Сб.трудов. «Современные направления развития биотехнологии», 1991, I., с. 13 (соавт. Максимов В.И., Савич М. J1., Маврина О.В., Якубовская Р.И., армакова Т.А., Барышников А.Ю.).

5. Получение моноклональных антител ИКО-25 в условиях пристеноч-ого культивирования. Сб.трудов. «Современные направления развития био-:хнологин», 1991, М., с.31 (соавт. Полетаева О.А, Якубовская Р.И., Барыш-нков А.Ю.).

6. Diagnosis of breast cancer. Problems and perspectives. Abstracts Intern, onf. «AIDS, Cancer and Human Retroviruses», 1992,. S-Peterburg, p.72 (соавт. asilov R.G.).

7. Immunological Atlas of Tumors. Abstracts 2-nd Intern. Conf. «AIDS, ancer and Human Retroviruses», 1992, St-Pterburg, p.30 (соавт. Vasilov R.G.).

8. Monoclonal Antibody for Diagnosis of Epithelial Origin Tumors. Histo-iem. J., 1992, v.24, p.547 (соавт. Yakubovskaya R.I., Karmakova T.A., Barish-ikov A.U.).

9. Характеристика муциноподобного антигена, экспрессированного на пухолях эпителиального генеза. Бюлл. экспер. биол. и мед., 1994, №10, 429-432 (соавт. Полетаева О.А., Василов Р.Г.).

10. Агглютинационный диагностикум на основе моноклональных анти-:л для скрининга эпителиального опухолевого маркера в цельной крови он-ологнческих больных. Биотехнология, 1995, №3-4, с.46-47 (соавт. Полетаева I.A., Мешандин А.Г.).

11. An immunoagglutination diagnosticum based on monoclonal antibodies >r the screening of an epithelial tumor marker in whole blood of cancer patients, ussian Biotechnology, 1995, '4, p.24-26 (соавт. Poletaeva O.A., Meshandin ,.G.).

12. Дифференцировочные маркеры. В кн. «Белки и пептиды», М., «Нау-а», 1995, т.1, с. 336-353 (соавт. Пивнюк В.И., Ярилин А.А., Василов Р.Г.).

13. The effect of carbohydrate adaptogen on the state of intestine microbio-:nosis and immune status of primates in the conditions of surgical stress. Abstracts

of «XXI International Congress of Microbial Ecology and Disease», Paris, 1996, p.89 (соавт. Stebeneva S., Rikova M.P., Meshkov D., Suchno A., Lizko N.).

14. Carbohydrate adaptogen for the immune disorder prophylaxis and dysbacteriosis correction». Abstracts of 47lh International Astronautical Congress, 1996, Beijing, China, p.25 (соавт. Lizko N.N., Korolkov V.I.).

15. Effect of carbohydrate adaptogen on the state of intestine microbioceno-sis of primates in the conditions of hypokinesia. Abstracts of XXI International Congress of Microbial Ecology and Disease, 1996, Paris, p.90 (соавт. Lizko N., Korolkov V., Rikova M., Meshkov D., Polctacva O.).

16. The new marker and test-system for screen tumors. The European Resp.J., 1997, v. 10, p.369 (соавт. Poletaeva O.A., Romanova L.K.).

17. A new marker and test-system to screen for tumors. Abstracts of 12л 1FCC European Congress of Clinical Chemistry, 1997, p.214 (соавт. Poletaeva O.A., ShaposhniKova Т. В., Vasilov R.G.)

18. Адаптохнт - препарат для профилактики дисбактерноза и коррекции иммунных расстройств. Сб. «Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологин», 1997, М., с.454 (соавт. Лнзько Н.Н., Василов Р.Г.)

19. Использование нового маркера и тест-систем для диагностики рака легкого при исследовании бронхоальвеолярных смывов. Терапевтический архив, 1997, т.69, №3, с.50-52 (соавт. Романова Л.К., Полетаева О.А., Мешан-дин А.Г., Тимофеева О.И., Овчаренко С.И., Заводнов В.Я.).

20. Влияние нового иммуномодулятора адаптохнт на поддержание колонизационной резистентности у приматов в условиях гипокинезии. Сб. «Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологин», 1997, М., с.484 ( соавт. Лнзько Н.Н., Корольков В.И., Гордеев Ю.В. и др.).

21. Онкологический риск в экстремальных ситуациях. В кн.: Воздействие экстремальных ситуаций на здоровье женщин и их потомства, М.,1997, с.82-84.

22. Метод быстрой индикации мнкроэкологическнх нарушений желудочно-кишечного тракта. Сб. «Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологин», 1997, М.,, с. 248 (соавт. Лизь-ко Н.Н., Полетаева О.А. н др.).

23. The use of new method of disbacteriosis diagnosis. Bioscience and microflora, 1997, v. 18, №2, p.24 (соавт. Vasilijev L.A., Lizko N.N. et al.).

24. Влияние адаптохита на показатель местного иммунитета и функции клеток иммунной системы приматов в условиях стресса. Сб. «Третий российско-американский симпозиум по медико-биологическим исследованиям по программе НАУКА-НАСА», 1997, Алабама, США, с.40 (соавт. Лизько Н.Н., Рыкова М.П., Мешков Д.О., Корольков В.И., Гордеев 10.В., Полетаева О.А., Стебспева С.А.).

25. Влияние адаптохита на микроэкологический статус обезьян в условиях стресса. Сб. «Третий российско-американский симпозиум по медико-биологическим исследованиям по программе НАУКА-НАСА», 1997, Алабама, США, с.46 (соавт. Лизько Н.Н., Корольков В.И., Гордеев Ю.В., Тюрина Д.А., Стебенева С.А.).

26. Prebiotic Adaptohit in prophylactic of disbioses in extrem conditions. Abstracts 2nd World Congress on anaerobic bacteria and infection, 1998, Nice, p. 9 (соавт. Lizko N.N., Gordeev U.V., Stebeneva S.A., Turina D.A., Korolkov V.I.).

27. Средство антиастматического и антиадгезионного действия. Патент N»2117482. Дата регистрации 20.08.98 (приоритет 16.07.97) (соавт. Ковалев И.Е., Ковалева B.J1., Лизько Н.Н.)

28. Prebiotic for disbacteriosis prevention. Gastroenterology International, 1998, v.l 1, p. 148 (соавт. Lizko N.N.).

29. Новый иммуномодулятор для получения агглютинтрующих и пре-цнпитирующих антител. Биотехнология, 1998, №2, с.59-63 (соавт. Сахаров Р.С., Батнщев А.И., Беловодова И.И. и др.).

30. Влияние углеводного адаптогена на аллергические реакции животного организма. Космическая биология и авиакосмическая медицина, 1998, г.1, с. 166-168 (соавт. Лизько Н.Н., Рыкова М.П., Мешков Д.О., Корольков В.И., Гордеев Ю.В., Стебнева С.А.).

31. CAg25: a noval tumor-associated mucin antigen (review). Human Antibodies, 1998, v.l, p.43'-45.

32. Углеводный адаптоген для профилактики иммунных расстройств и коррекции дисбактериозов. Авиакосмическая и экологическая медицина, 1998, 4, с. 21-25 (соавт. Лизько Н.Н., Корольков В.И. и др.).

33. Набор для скринингового анализа онкомаркера в сыворотке и цельной крови. Патент №2119167,-1998. Б.И.№26 (соавт. Полетаева О.А., Мешан-аин А.Г., Шапошникова Т.Б.).

34. Секреторный иммуноглобулин А - показатель нарушений микрофлоры желудочно-кишечного тракта. Биотехнология, 1998, №5, стр.85-87 (со-1вт. Стебенева С.А., Лизько Н.Н.).

35. Коррекция нарушений микрофлоры желудочно-кишечного тракта шаптогеном углеводной природы как альтернатива бактериотерапии. Космическая биология и авиакосмическая медицина, 1998, т.2, с.453-454 (соавт. Стебенева С.А., Лизько Н.Н. и др.).

36. Stress-induced dysbioses and ways to correct them. Gastroenteology In-ernational, 1998, v.ll, p. 141 (соавт. Lizko N.N., Korolkov V.I. et al.).

37. Secretory IgA is the diagnostic indicator of the disbacteriosis. Clinical nicrobiology and infection, 1999, v.5, p. 271 (соавт. Lizko N.N., Stebeneva S.A.).

38. Das sekret slgA - ein stress-marker. Book: «Stressmanagement katastro-)henmedizin regulationsmedizin pravention», «PABST», 1999, p.106-108 (соавт. Jzko N.N.).

39. CAg25: A noval tumor-associated mucin antigen, //Human Antibodies, 1999, v.9, p.139-141 (соавт. Poletaeva O.A.,Vasilov R.S.).

40. Markers of integrity of bronchoalvcolar mucosa defense. The European Resp. J., 2000, v.16, p.430 (соавт. Chcrnekhovskaya N.E., Molodik A.A., Galaeva E.V., Andreev V.G.).

41. Секреторный иммуноглобулин A - маркер стресса и неблагоприятных факторов внешней среды. Кн.: Международный Экологический форум. М., 2001, с. 138-140.