Автореферат и диссертация по медицине (14.01.10) на тему:Молекулярные маркеры в прогнозировании клинической эффективности инфликсимаба у больных псориазом

На правах рукописи

Знаменская Людмила Федоровна

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МАРКЕРЫ В ПРОГНОЗИРОВАНИИ КЛИНИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ИНФЛИКСИМАБА У БОЛЬНЫХ ПСОРИАЗОМ

14.01.10. — Кожные и венерические болезни

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

3 МАЙ 2012

Москва-2012

005018934

005018934

Работа выполнена в отделах дерматологии и лабораторной диагностики инфекций, передаваемых половым путем, и болезней кожи Федерального государственного бюджетного учреждения «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии» Минздравсоцразвития России и в отделе проте-омных исследований Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Оре-ховича» Российской академии медицинских наук.

Научный консультант

доктор медицинских наук,

профессор Кубанов Алексей Алексеевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор,

заведующий кафедрой кожных и венерических

болезней ГБОУ ВПО «Московский

государственный медико-стоматологический

университет» Минздравсоцразвития

России Перламутров Юрий Николаевич

доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры кожных и венерических болезней ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского»

Минздравсоцразвития России Бакулев Андрей Леонидович

доктор медицинских наук, профессор, Главный эксперт Федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр экспертизы средств медицинского применения»

Минздравсоцразвития России Авдеева Жанна Ильдаровна

Ведущая организация: Российский университет дружбы народов, г. Москва

Защита диссертации состоится 2012 г. в 12 часов на заседа-

нии Диссертационного совета (Д 208.115.01) при ФГБУ «ГНЦДК» Минздравсоцразвития России по адресу: 107076, Москва, ул. Короленко, д.З,стр.6. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ГНЦДК» Минздравсоцразвития России 1 уу л , л л Ґ1

Автореферат разослан «_»__2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат медицинских наук Наталия Константиновна Иванова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы.

Псориаз - хроническое воспалительное иммуноопосредованное заболевание кожи. Существующие методы лечения псориаза (фотохимиотерапия, применение циклоспорина, ацитретина, метотрексата и др.) в ряде случаев оказывают недостаточный эффект и обычно не позволяют достичь продолжительных ремиссий, а их длительное применение связано с риском развития тяжелых осложнений, что определяет актуальность разработки новых методов лечения и прогнозирования их эффективности.

Одним из основных звеньев патогенеза псориаза является избыточная продукция медиаторов иммунного ответа - цитокинов, обладающих провоспали-тельной активностью. Важную роль в возникновении воспаления играет фактор некроза опухоли альфа (TNF-a), который, в свою очередь, индуцирует синтез других провоспалительных цитокинов, включая IL-8, IL-6, INF-y и др., а также способствует экспрессии молекул адгезии, миграции дендритных клеток в лимфатические узлы и рециркуляции активированных иммунокомпетентных клеток.

С учетом патогенетической роли TNF-a в развитии воспаления при псориазе биотехнологическими методами были разработаны принципиально новые лекарственные средства - так называемые генно-инженерные терапевтические антитела, блокирующие действие этого провоспалительного цитокина. Селективное связывание TNF-a препятствует его взаимодействию со специфическими рецепторами и проявлению биологических эффектов: блокируется синтез других провоспалительных цитокинов и простагландинов, в результате чего подавляется воспалительная реакция, инфильтрация кожи, а также уменьшается пролиферация кератиноцитов (Weinberg J.M., Buchholz R., 2006; Cordoro K.M., Feldman S.R., 2007). Кроме того, блокада TNF-a, связанного с мембраной лим-

фоцитов и макрофагов, приводит к подавлению пролиферации иммунокомпе-тентных клеток (Veale D.J et al., 2005; Galindo M.P. et al., 2008).

В сравнении с другими методами системной терапии генно-инженерные биологические препараты обладают рядом преимуществ: они характеризуются целенаправленным воздействием на конкретные звенья патогенеза псориаза, являясь высокоэффективными средствами терапии; предотвращают развитие тяжелых инвалидизирующих форм псориаза, в большинстве случаев их отличает хорошая переносимость и отсутствие выраженных гепатотоксических и неф-ротоксических побочных эффектов, характерных для других современных методов терапии.

Одним из блокаторов TNF-a является генно-инженерный биологический препарат инфликсимаб, представляющий собой комплексный химерный моно-клональный иммуноглобулин класса G| состоящий из константных участков иммуноглобулина человека и вариабельных участков мышиных иммуноглобулинов. Инфликсимаб блокирует эффекты как растворимого, так и сцепленного с мембраной TNF-a. Показанием к его применению является лечение больных псориазом тяжелой степени, подлежащих системной терапии, больных псориазом средней степени тяжести при неэффективности или наличии противопоказаний к ПУВА-терапии, а также лечение больных прогрессирующим псориати-ческим артритом в активной форме.

Опубликованы результаты крупных контролируемых рандомизированных исследований, посвященных применению инфликсимаба: IMPACT, IMPACT-2, SPIRIT, EXPRESS, подтвердивших высокую эффективность применения препарата у больных среднетяжёлой и тяжёлой формами псориаза и псориатиче-ским артритом (Antoni С. et al., 2005; Voulgari P.V. et al. 2007; Menther A. et al., 2007).

Однако установлено, что блокаторы TNF-a не у всех больных псориазом оказывают выраженный положительный эффект.

Аналогичные данные получены при лечении инфликсимабом больных

другими хроническими воспалительными иммуноопосредованными заболеваниями, такими как ревматоидный артрит, болезнь Крона. При лечении данных заболеваний проведены исследования по изучению полиморфизма генов, кодирующих Т№-а и его рецепторы, которые позволили установить наличие связи между определенными нарушениями нуклеотидной последовательности генов и степенью клинического ответа на терапию инфликсимабом (МавсЪегеШ Б., 2002; Огск\ Т., Ригауа У. ^ а!., 2006; Ма1Бикига Р., 2008), однако у больных псориазом таких исследований в доступной литературе не обнаружено.

Механизмы действия инфликсимаба затрагивают белковые взаимодействия, поэтому адекватным подходом для решения проблемы резистентности к этому препарату следует считать протеомные исследования. При сравнении протеома кожи пациентов, отвечающих на терапию инфликсимабом, и резистентных к ней, могут быть обнаружены белковые биомаркеры, характеризующие механизм лекарственной устойчивости.

Учитывая высокую стоимость лечения больных псориазом генно-инженерными антителами, особую актуальность представляет персонализированный подход к назначению таких препаратов, а также разработка методов, позволяющих прогнозировать эффективность терапии. Исследований, посвященных изучению данных вопросов, в доступной литературе не найдено.

Цель исследования.

Поиск молекулярно - биологических критериев прогнозирования эффективности терапии больных псориазом генно-инженерным препаратом инфлик-симаб.

Задачи исследования:

1. Оценить возможность использования клинико-анамнестических данных больных псориазом в качестве маркеров эффективности лечения биологическим генно-инженерным препаратом инфликсимаб.

2. Определить прогностическую ценность исследования исходного содержания цитокина Т№-а, его растворимых рецепторов ЮТ-ВД, ТОТ-КЛ и цитокинов 1Ь-6, ГЬ-8 и 1Ь-10 в биообразцах больных при терапии инфлик-симабом.

3. Провести исследования протеома кожи у больных с различным клиническим ответом на терапию инфликсимабом с целью выявления потенциальных белковых биомаркеров эффективности лечения.

4. Изучить полиморфизм генов цитокина ТЫР-а и его растворимых рецепторов ТИР-Ш, TNF-R.II у больных псориазом и сопоставить результаты исследований с клинической эффективностью терапии инфликсимабом.

5. На основе проведенных исследований разработать метод прогнозирования клинического ответа больных псориазом на лечение препаратом ин-фликсимаб.

Научная новизна.

Впервые в отечественной дерматовенерологии у больных псориазом изучен полиморфизм генов фактора некроза опухоли альфа (ТЫР-а) и его рецепторов первого и второго типа (ТИР-Ш и ШР-Ш1), а также исследовано содержание рецепторов "ШР-Ы и ТОТ-РШ в биообразцах кожи и крови.

Установлено, что генотип в положении 676 в шестом экзоне гена ТЫР-ЯИ у больных псориазом может быть ассоциирован с различным клиническим ответом на лечение инфликсимабом. Выявлено, что частота встречаемости ТТ генотипа гена в 676 положении у больных с выраженным ответом на лечение инфликсимабом достоверно выше, чем у пациентов с недостаточно выраженным ответом на препарат (р<0,01). Частота встречаемости вв генотипа гена ГМ7-/?// в 676 положении шестого экзона достоверно выше у больных с недостаточным клиническим ответом на терапию инфликсимабом по сравнению с больными, у которых отмечался выраженный клинический ответ на лечение (р<0,01).

Показана прогностическая ценность определения в сыворотке крови больных среднетяжелыми и тяжелыми формами псориаза содержания интерлейкина 10 для прогнозирования эффективности лечения препаратом инфликсимаб: уровень интерлейкина 10, превышающий 2,7 пг/мл, ассоциируется с высокой эффективностью лечения, уровень менее 1,0 пг/мл - с низкой эффективностью лечения.

При исследовании протеомного профиля кожи больных псориазом обнаружены белки-маркеры эффективности терапии препаратом инфликсимаб.

Разработано новое направление в дерматовенерологии, заключающееся в прогнозировании эффективности терапии больных псориазом генно-инженерным биологическим препаратом инфликсимаб на основе определения молекулярно-генетических маркеров клинического ответа на лечение.

Данные, полученные в исследовании, открывают новые возможности в персонализированном подходе к выбору адекватных методов терапии больных псориазом.

Практическая значимость. На основе комплексных исследований разработан и научно обоснован метод прогнозирования эффективности терапии больных среднетяжелыми и тяжелыми формами псориаза биологическим генно-инженерным препаратом инфликсимаб. Внедрение в клиническую практику разработанного метода позволит оптимизировать отбор пациентов для целенаправленного проведения лечения инфликсимабом и улучшить тем самым терапевтические результаты.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Обнаружение у больных псориазом генотипа ТТ в позиции 676 шестого экзона гена рецептора второго типа фактора некроза опухоли альфа (ТЫР-ШГ) позволяет прогнозировать выраженный клинический эффект при лечении биологическим генно-инженерным препаратом инфликсимаб.

2. Выявление у больных генотипа вв в позиции 676 шестого экзона гена рецептора второго типа фактора некроза опухоли альфа (TNF-R.II) ассоциируется с недостаточным ответом на терапию инфликсимабом.

3. Содержание интерлейкина 10 в сыворотке крови больных, превышающее 2,7 пг/мл ассоциируется с выраженным клиническим ответом на терапию инфликсимабом, содержание менее 1,0 пг/мл - с недостаточным ответом на проводимое лечение.

4. Клинический ответ больных псориазом на лечение препаратом инфлик-симаб связан с определенным составом протеома кожи. Недостаточная клиническая эффективность лечения коррелирует с наличием в протеоме кожи таких белков, как кератин П типа цитоскелетный 5, кератин П типа цитоскелетный 80, гистон Н1.3, аполипопротеин А-1, пироксиредоксин-2, АТФ-зависимая ДНК-хеликаза 2 (субъединица 1) и один неохарактеризованный белок С17ой68. Выраженный терапевтический эффект имеет корреляционную связь с наличием в протеоме кожи белков 8100-А8 и глутатион 5-трансферазы Р.

5. Разработанный метод прогнозирования эффективности терапии инфликсимабом с использованием молекулярно-генетических маркеров клинического ответа позволяет повысить результаты лечения больных среднетяжелыми и тяжелыми формами псориаза.

Внедрение результатов исследования.

Разработанный метод прогнозирования эффективности лечения инфликсимабом больных со среднетяжелыми и тяжелыми формами псориаза с использованием молекулярных методов исследования внедрен в работу отдела лабораторной диагностики инфекций, передаваемых половым путем и болезней кожи ФГБУ «ГНЦЦК» Минздравсоцразвития России, а также в практику работы кафедры дерматовенерологии с клиникой ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский Государственный Медицинский Университет им. академика И.П. Павлова».

Материалы проведенных исследований по изучению молекулярных маркеров прогнозирования клинической эффективности инфликсимаба у больных псориазом внедрены в учебный процесс и используются при составлении образовательных программ для клинических ординаторов, аспирантов, слушателей сертификационных курсов ФГБУ «ГНЦЦК» Минздравсоцразвития России по специальности «дерматовенерология» и «клиническая лабораторная диагностика»; для студентов, клинических ординаторов и интернов ГОУ ВПО «Тверская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России по специальности «дерматовенерология»; применяются в учебном процессе кафедры дерматовенерологии ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский Государственный Медицинский Университет им. академика И.П. Павлова».

Подана заявка на патент «Способ прогнозирования эффективности лечения больных псориазом инфликсимабом» (№200901243/13), получено уведомление из патентной организации о готовности выдать патент.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на итоговых конференциях по результатам выполнения мероприятий за 2008 и 2009 гг. в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2008, 2009); на научно-практических конференциях ФГУ «ГНЦЦ Росмедтехнологий» (Москва, 2008; 2009 гт.), на конференции дерматовенерологов г. Москвы в 2009 г., в Федеральном агентстве по науке и инновациям (Москва, 2009 г.), на Ш Всероссийском конгрессе дерматовенерологов (Казань, 2009), на ХУП Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2010 г.), на научно-практических конференциях «Актуальные вопросы оказания дерматовенерологической помощи в Архангельской области» (Архангельск, 2010г.), «Актуальные вопросы дерматовенерологии и косметологии» (Томск, 2010 г.), 40th Annual Meeting EADR. (Helsinki, Finían,

2010 г.), на IV Российской научно-практической конференции, посвященной 125-летию Санкт-Петербургского научного общества дерматовенерологов имени В.М.Тарновского (Санкт-Петербургские дерматологические чтения, 2010 г.), 2 Continental Congress of Dermatology of the International Society of Dermatology and 4 Russian Congress of Dermatovenereology (St. Peterburg, Russia 6-9 July 2011), на конференциях дерматовенерологов и косметологов Южного (Краснодар, сентябрь 2011) и Приволжского (Казань, ноябрь 2011) федеральных округов, на форуме дерматологов и косметологов (Москва, декабрь 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 36 работ, из них 16 в изданиях и журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Личный вклад автора в проведенное исследование. Автором подготовлен аналитический обзор отечественных и зарубежных источников литературы по теме исследования, разработан дизайн исследований. Проведен отбор пациентов для исследования с учетом критериев включения и исключения. Осуществлен отбор больных псориазом для проведения терапии различными системными препаратами, методами физиотерапии или лечения инфликсимабом с оценкой терапевтической эффективности. Проведен анализ полученных результатов на основании данных статистической обработки. Разработан метод прогнозирования эффективности лечения больных псориазом генно-инженерным препаратом инфликсимаб, а также практические рекомендации по его применению, сформулированы выводы, научная и практическая значимость проведенных исследований.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 155 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 5 рисунками и 11 таблицами и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 5 глав, содержащих результаты собственных исследований, заключения,

выводов и списка литературы, включающего 72 источника отечественных авторов и 184 источника зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

Под наблюдением находилось 83 больных псориазом (35 женщин, 48 мужчин) в возрасте от 18 до 70 лет. У подавляющего большинства пациентов (78 чел.) была прогрессирующая стадия заболевания, у 5 больных - стационарная стадия. У 12 пациентов отмечена псориатическая эритродермия, у 9 -экссудативный характер поражения кожи, у 1 - пустулезный псориаз,. Длительность заболевания колебалась от 1,5 до 47 лет (в среднем 19,3+2,8). Средний возраст начала псориатического артрита составил 32,65+6,53 года. Наследственная отягощенность по псориазу выявлена у 35 больных.

У всех больных кожный процесс имел распространенный характер и был представлен очагами поражения на верхних, нижних конечностях, туловище, волосистой части головы, реже на лице в виде мелких узелковых высыпаний розового или красного цвета с тенденцией к периферическому росту (в прогрессирующей стадии) с образованием бляшек различных размеров с ровными или фестончатыми очертаниями, с различной степенью интенсивности эритемы, инфильтрации кожи и шелушения, с наличием чешуйко-корок при экссу-дативном характере поражения кожи и множественных пустул с образованием «гнойных озер» на отечном эритематозном фоне при пустулезном псориазе. У 43 больных, помимо поражения кожи, диагностирован псориатический артрит. У этих больных имелось поражение мелких и/или крупных суставов, проявлявшееся болевыми ощущениями различной интенсивности, утренней скованностью и припухлостью.

Степень тяжести и распространенности кожного процесса оценивали по величине индекса PASI (Psoriatic area and severety index), основанного на оценке распространенности высыпаний и степени выраженности эритемы, инфильтра-

ции и шелушения в очагах поражения. До лечения индекс РАБ1 у больных варьировал от 12 до 65.

До поступления в стационар ФГБУ «ГНЦДК» Минздравсоцразвития России все больные получали разные виды терапии, из них 74 пациента получали дезинтоксикационную терапию, 40 больным назначалась цитостатическая терапия (метотрексат), циклоспорин - 19 больных, ацитретин (неотигазон) - 20 больным. Парентеральное введение глюкокортикостероидных препаратов было проведено 43 больным, фототерапию получали 47 больных: ПУВА - терапию — 40, селективную фототерапию - 7. Все больные, страдающие псориати-ческим артритом, получали различные нестероидные противовоспалительные препараты. Кроме того, в терапии 69 больных применялись кортикостероидные препараты для наружного применения.

Методы лечения.

Терапия препаратом инфликсимаб была проведена 29 больным, соответствовавшим определенным критериям включениям: они страдали тяжелыми или среднетяжелыми формами псориаза, у которых стандартные методы и средства системной терапии не приносили желаемого результата или у них имелись противопоказания к их проведению; имели возраст не моложе 18 лет; женщины включались в исследование при отсутствии беременности и вне периода лактации. Инфликсимаб не назначали пациентам при наличии тяжелых инфекционных процессов (например, сепсиса, абсцесса, туберкулеза, сифилиса, гепатитов В и С, ВИЧ), при соматических заболеваниях в стадии декомпенсации, а также значимых отклонений от нормы показателей лабораторных исследований (общий анализ крови, мочи, биохимический анализ крови). Из 29 больных, получавших инфликсимаб, у 1 диагностирован экссудативный псориаз, у 9 -псориатическая эритродермия, у 19 пациентов, помимо поражения кожи, отмечалась патология суставов (псориатический артрит).

Доза инфликсимаба рассчитывалась в зависимости от массы тела пациента из расчета 5 мг на кг. Инфликсимаб вводили согласно инструкции по медицин-

скому применению препарата внутривенно капельно в течение не менее 2-х часов, со скоростью не более 2 мл/мин, с использованием инфузионной системы со встроенным стерильным апирогенным фильтром. Во время всех инфузий препарата обязательно присутствовал врач.

Остальные 54 пациента в зависимости от характера клинических проявлений заболевания, пола, возраста, наличия сопутствующей патологии и эффективности предшествующего лечения получали следующие виды терапии: ме-тотрексат, циклоспорин, ацитретин, фототерапию, дезинтоксикационную терапию и средства для наружного применения.

Эффективность терапии инфликсимабом и другими методами лечения оценивали на основании динамики индекса РА81. Величину уменьшения индекса РА51 выражали в процентах и вычисляли по следующей формуле:

ГРА81 до лечения - РАЯ! после лечения! х 100% РА81 до лечения

Выраженный клинический эффект констатировали при уменьшении величины индекса РА51 на 75% и более (РА51 >75%), что соответствовало клиническому выздоровлению или значительному улучшению кожного процесса. Слабый клинический эффект констатировали при уменьшение величины индекса РА51 менее, чем на 75% (РА51<75%). В зависимости от величины уменьшения индекса РАЯ! больные были разделены на две группы. Первую группу составили 54 пациента, у которых был достигнут выраженный клинический эффект от проведенного лечения (величина уменьшения РА81 > 75%). Из них 18 пациентов получали лечение препаратом инфликсимаб, 36 больных — другие средства системной терапии. Вторую группу составили пациенты со слабым клиническим эффектом, у которых величина уменьшения индекса РАБ! составила менее 75%. Из них 11 пациентов получали терапию инфликсимабом, 17 - другие

виды системной терапии. Один пациент выбыл из исследования, его данные не учитывались при анализе полученных результатов.

Методы исследования.

Материалом для исследования служили биоптаты пораженной кожи больных, а также образцы сыворотки крови, полученные стандартным способом (табл. 1).

Таблица 1. Материалы, изучаемые параметры и методы исследования

Биообразцы пораженной кожи

■ Изучаемые параметры ]

Молекулярная структура генов TNF-a, TNF-RI и TNF-RII с анализом наличия и частоты нуклеотидных замен в промоторной области гена TNF-a и в гене TNF-a. в промоторной области и первом экзоне гена TNF-RI ПЦР с последующим автоматическим секвенированием ДНК

Молекулярная структура гена TNF-RII в положении 676 (6 экзон) ПЦР с последующим рестрикционным анализом

Протеом кожи Жидкостная хроматография с последующей тандемной масс-, спектрометрией

Биообразцы пораженной

кожи и сыворотки крови Содержание ТЫР-а и растворимых Иммуноферментный анализ, технология

больных псориазом рецепторов (эТ^-Р! и вТЫР-РИ) хМАР

и здоровых добровольцев

Л _ Уровеньцитокинов ТЫР-а. _

Сыворотка крови оольных „ _ „ „ „ „_ Технология хМАР

11_-Ь. 11--о. 1и-Ю

В биоптатах кожи проводилось изучение молекулярной структуры генов ТИР-а, ТИР-Ш и ТИР-ЯП с анализом наличия и частоты нуклеотидных замен в промоторной области гена ТИР-а и в гене ТИР-а, в промоторной области и первом экзоне гена ТИР-Ш, в положении 676 (6 экзон) гена ТИР-ЮГ, содержания цитокина ТЫР-а и его растворимых рецепторов - бТИР-Ы и

RII; протеомного состава биообразцов. Помимо этого, в сыворотке крови больных определяли содержание цитокина TNF-a, растворимых рецепторов sTNF-RI и sTNF-RII, а также уровень интерлейкинов IL-6, IL-8, IL-10.

До начала исследования биологический материал помещали в низкотемпературный холодильник и хранили при температуре минус 70 - 80°С. Повторное замораживание и размораживание образцов не допускалось. Оттаивание образцов перед исследованием производилось в условиях комнатной температуры (при + 18-25°С).

Молекулярно - генетические исследования осуществлялись путем выделения ДНК из биообразцов с последующим определением нуклеотидной последовательности промотора и гена TNF-a, промоторной области и первого экзона гена TNF-RI, основанным на автоматическом секвенировании ДНК, а также с определением генотипа TNF-RII в позиции 676 6-го экзона с использованием рестрикционного анализа. Выделение геномной ДНК производилось с помощью коммерческого набора реагентов Diatom™ DNA Prep 100 фирмы "IsoGen" (Россия).

Референсные нуклеотидные последовательности исследуемых генов были найдены в базе данных NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). Праймеры к исследуемым генам были подобраны с помощью компьютерной программы Oligoö, а условия амплификации генов были определены эмпирическим путем.

Секвенирование генов проводили на приборе 3130 Genetic Analyzer фирмы "Applied Biosystems" (США) с использованием наборов реагентов фирмы производителя (рис. 1). Рестрикционный анализ проводили с применением ГТЦР с последующей обработкой амплификатов рестриктазой МаШ.

Протеомный профиль биоптатов кожи определяли с помощью жидкостной хроматографии с последующей индентификацией белков с применением тан-демной масс-спектрометрии (LC-MS/MS). Обработка масс-спектрометрических данных проводилась с использованием программы SpectrumMill. Достоверно

индентифицированными считали только те белки, которые индентифицирова-лись в трех повторных экспериментах.

240 250

TATCGTCGCGCi CGCSA

Определение содержания TNF-a, а также растворимых рецепторов (sTNF-RI и sTNF-RII) в сыворотке крови и элюатах из биопсированных образцов кожи осуществляли в иммуноферментном анализе с набором реагентов производства фирмы «Bender MedSystems» (США), а также с использованием технологии хМАР на анализаторе Bio-Plex 200 System фирмы «Био-Рад» (США).

Для определения цитокинов TNF-a, IL-6, IL-8, IL-10 в сыворотке крови также применялась технология х-МАР, принцип которой основан на использовании полистирольных 5,6-нм микросфер, связанных с антителами к определяемым молекулам (например, к цитокинам). Каждый тип микросфер отличается по относительному содержанию двух красителей, что дает возможность определять до 100 аналитов в одной пробе одновременно. Метод обладает высокой аналитической чувствительностью и позволяет выявить достаточно низкие концентрации вещества (до 0,6 пг/мл). Исследование проводилось на приборе Bioplex-200 фирмы "BioRad" (США) по протоколам и с использованием реактивов фирмы производителя.

Для статистической обработки анамнестических и клинических данных использовали следующие показатели: возраст пациента, возраст больного в начале заболевания, длительность заболевания, возраст больного при дебюте псо-риатического артрита и длительность артрита, значения индекса РА81.

Для статистической оценки данных, изученных на молекулярном уровне, были использованы показатели, характеризующие:

- наличие и частоту нуклеотидных замен в промоторе гена ТЫР-а и в гене ГА^-а;

- наличие и частоту нуклеотидных замен в ТЫР-Ш (экзон 1), промоторе ТШ-Ш, TNP-R II (6 экзон);

- уровень цитокинов ТОТ1-а, 1Ь-6, 1Ь-8, 1Ь-10 при их определении в сыворотке крови больных методом х-МАР.

Статистический анализ осуществлялся с использованием пакета программ к^айвПса 6». Анализ полученных данных проводили с применением параметрических и непараметрических методов статистики. Оценку корреляционных связей осуществляли с помощью непараметрического рангового коэффициента корреляции Спирмена и гамма-коэффициентом.

Для молекулярно-генетических показателей (нуклеотидные замены в генах) и данных, полученных с помощью протеомных методов исследования (спектр белков в биоптате кожи больного псориазом), при расчете корреляционных связей с результатами лечения больных псориазом препаратом инфлик-симаб величину уменьшения индекса РАБ1 преобразовывали в бинарный код. За 1 считали значения уменьшения индекса РАБГ от 0 до 75 (неудовлетворительный вариант ответа больных на лечение инфликсимабом), за 0 - значения А РА51 от 75 до 100 (выраженный положительный ответ на инфликсимаб). Корреляционный анализ осуществляли с использованием гамма-коэффициента (коэффициент изменялся в пределах от -1 до 1). Положительные значения коэффициента характеризовали генетические и полученные методами протеомики параметры, присутствие которых связано с ослаблением ответа на инфликси-

маб и, напротив, отрицательные значения коэффициента характеризовали параметры, присутствие которых связано с выраженным положительным ответом на инфликсимаб. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты исследования.

Проведен анализ анамнестических и клинических данных с целью определения их значимости для прогнозирования эффективности лечения больных псориазом инфликсимабом. Для статистической оценки были использованы следующие данные: возраст пациента во время исследования, возраст больного в начале заболевания и при дебюте псориатического артрита, длительность заболевания, длительность артрита и значения индекса РАБ! до лечения.

Средний возраст больных с выраженным клиническим эффектом терапии инфликсимабом (уменьшение РАБ1 >75%) составил 41,9+2,3 года, с ослабленным терапевтическим ответом (уменьшение РАБ1 <75%) 38,8±4,4 года (р=0,68). Возраст больных при дебюте псориаза у пациентов с динамикой индекса РАБ1 >75% и <75% статистически не отличался (соответственно в 22,7±2,2 и в 18,6±2,8 года; р=0,36). Длительность заболевания у пациентов первой группы в среднем составила 20,1+1,6 лет, второй - 20,1±3,9 лет (р=0,7). Средний возраст начала псориатического артрита (29,8+4,1 лет и 23,4±6,4 лет) и длительность псориатического артрита (8,0±1,5 лет и 6,6+2,9 лет) в изучаемых группах статистически не отличались. Индекс РА81, отражающий тяжесть и распространенность кожных проявлений до начала лечения, у пациентов обеих групп также не имел статистических отличий (35,2+4,1 и 22,5+5,6; р=0,11) (табл. 2).

Результаты статистической обработки показали, что сравниваемые группы больных, получавших инфликсимаб, были близки по клиническим и анамнестическим признакам.

Коэффициенты корреляционной связи между клинико-анамнестическими данными и клиническим ответом на инфликсимаб были невысокими и колебались в пределах от 0,04 до 0.24.

Таблица 2. Клинико-анамнеетические показатели больных псориазом в зависимости от эффективности терапии инфликсимабом (М±т)

PASI >75% 41,9±2,3 22,7±2,2 20,1±1.6 29,8 ±4,1 8,0±1,5 35,2±4,1

PASI <75% 38,8±4,4 18,6±2,8 20,1±3,9 23,4±6,4 6,6±2,9 22,5±5,6

Лостоверносгь различий между группами (р) 0,68 0,36 0,70 0.41 0,37 0,11

Таким образом, на основании анализа клинико-анамнестических данных установлено отсутствие их прогностической роли в оценке эффективности терапии генно-инженерным биологическим препаратом инфликсимаб.

Для оценки прогностической значимости терапевтического эффекта ин-фликсимаба проводилось исследование уровня цитокинов TNF-a, IL-6, IL-8, ILIO и растворимых рецепторов TNF-RI, TNF-RH в биообразцах больных псориазом.

Определение уровня цитокина ФНО и его растворимых рецепторов в сыворотке крови проведено у 55 пациентов (37 мужчин и 18 женщин) в возрасте от 19 до 57 лет со среднетяжелыми и тяжелыми формами псориаза. Индекс PASI, колебался в пределах от 12 до 48,9. Длительность заболевания варьировала от 4 до 35 лет. Девятнадцать пациентов, помимо поражения кожи, страдали псориатическим артритом, 36 больных имели только кожные проявления заболевания. Контрольную группу составили 40 здоровых добровольцев.

Содержание TNF-a и его растворимых рецепторов в образцах кожи определялось у 19 больных псориатическим артритом, у 16 - только с поражением кожи и у 17 здоровых добровольцев.

При исследование уровня ФНО-a (TNF-a) ИФА показал, что в биоптатах пораженной кожи и сыворотке крови содержание цитокина оказалось ниже порога чувствительности методики исследования. В то же время применение автоматического анализатора Bio-Plex 200 System позволило определять присутствие ФНО-a в биообразцах больных псориазом и у здоровых лиц.

Обнаружено, что в сыворотке крови пациентов, страдающих псориазом, исследованные параметры были достоверно повышены, по сравнению с показателями здоровых лиц. В коже содержание растворимых рецепторов TNF-RI и TNF-RII у больных псориазом достоверно не отличалось от такового у здоровых лиц, в то время как количество ФНО-a было повышено.

Анализ содержания ФНО-a в коже и сыворотке крови больных в зависимости от наличия или отсутствия поражения суставов показал, что у больных псориатическим артритом количество ФНО-a в коже оказалось более низким (5,76+1,05пг/мл), чем у больных псориазом без поражения суставов (11,88±4,19пг/мл, р>0,05). Содержание этого цитокина в сыворотке крови больных, страдавших только кожными формами псориаза (7,62±1,21пг/мл), также было несколько выше, чем у пациентов с псориатическим артритом (4,92+1,21пг/мл; р>0,05). Полученные данные согласуются с исследованиями Т. Hohler и соавт. (2002), которые обнаружили, что мононуклеарные клетки больных псориатическим артритом секретируют ФНО-a значительно меньше, чем клетки больных, не имевших поражения суставов. Авторы считают, что сниженная продукция ФНО-a генетически детерминирована (Reich K.et.al., 2002; Nedoszytko B.et.al.,2007; Kaluza W. et.al., 2000) и может быть связана с возникновением и развитием артрита. Ранее было продемонстрировано, что высокий уровень ФНО-a наблюдается в суставной жидкости пациентов, подтверждая ре-

зультаты исследований, обнаруживших повышенную выработку цитокина клетками тканей суставов (Уеа1е Б. }. е1. а1„ 2004).

Содержание растворимых рецепторов в сыворотке крови пациентов с псо-риатическим артритом (бЮТ-Ю 1,66 ±0,27 нг/мл, бТОТ-КП 6,98+ 2,13 пг/мл) и без него (бТЫ^-Ш 1,48 ±0,26 нг/мл, р>0,05; бТМЧШ 6,44+ 1,57 пг/мл.; р>0,05) статистически значимо не отличалось.

Таким образом, в результате проведенных исследований показано статистически достоверное повышение содержания ТЫБ-а в сыворотке крови и коже, в то время как уровень растворимых рецепторов был повышенным (яТ№-М и вТЫБ-КП) только в сыворотке крови больных псориазом по сравнению с показателями здоровых лиц. У больных с наличием псориатического артрита уровень ТОТ-а в коже был ниже, чем у больных, страдающих только псориатиче-ским поражением кожи без поражения суставов.

Кроме того, проведено изучение прогностической значимости уровня ЮТа, растворимых рецепторов (бТОТ-М и йТ№-1Ш), провоспалительных цитоки-нов (1Ь-6,Ь-8), противовоспалительного цитокина 1Ь -10 с учетом результатов лечения инфликсимабом.

При изучении методом ИФА у больных с выраженным эффектом от проводимой терапии инфликсимабом (динамика индекса РАЯ! >75%) средний уровень рецепторов ЮТ-а, определявшихся в биоптатах кожи, составил соответственно: вТТОЧН - 1,6+0,1 нг/мл, вЮТ-Бт - 7,4±1,1нг/мл.

В группе пациентов с недостаточно выраженным эффектом при уменьшении РАБ1 <75% средний уровень рецепторов ТОТ-а составил: бТЬТР-Ш - 1,9±0,6 нг/мл, бТИБ-Ш! - 5,7±0,5 нг/мл. Статистически достоверных различий между больными с уменьшением РА81 >75% и <75% не обнаружено (р>0,05) (табл. 3).

Известно участие ЕИ0 в реализации иммунных реакций в организме, в том числе в регуляции других цитокинов, а именно в подавлении секреции провоспалительных цитокинов 1Ь-1(3, ТЫБ-а, 1Ь-6 (АзаёиИаЬ К. е1 а1.,1998).

Таблица 3. Уровень цитокинов и растворимых рецепторов ТОТ-а у больных псориазом в зависимости от эффективности терапии ин-фликсимабом

Уменьшение

величины индекса sTNF-RI sTNF-RH TNF-a IL6 IL8 IL10 PASI

7,4±1,1 4,9±0,9 64,9±12.2 29,8±4,0 2,9±0,3

5.7J-0.5 4,7±3,4 27.3±7.1 13.6±7.6 0.7+0,3

>0.05 >0.05 <0,05 >0,05 <0,001 Г 0 12 0,01 -0,10 -0,12 0.53 0,68

При использовании технологии х-МАР у больных с выраженным эффектом от проводимой терапии уровень цитокинов в сыворотке крови составил соответственно: TNF-a - 4,9+0,9 пг/мл, IL-6 -64,9+12,2 пг/мл, IL-8 - 29,8±4,0 пг/мл, IL-10 - 2,9+0,3 пг/мл. У больных с низкой отвечаемостью на инфликси-маб уровень цитокинов составил соответственно: TNF-a - 4,7+3,4 пг/мл, IL-6 -27,3+7,1 пг/мл, IL-8 - 13,6+7,6 пг/мл, IL-10 - 0,7+0,3 пг/мл.

Между группами больных с разным ответом на лечение препаратом ин-фликсимаб установлены достоверные различия для цитокинов EL-6 (р<0,05) и IL-10 (р<0,001). Статистически достоверных различий между этими группами для TNF-a, sTNF-RI, sTNF-RII и IL-8 обнаружено не было.

При расчете корреляционных связей между уровнем интерлейкинов и результатами проведенной терапии с использованием коэффициента Спирмена было установлено, что концентрация IL-10 в сыворотке крови больных до лечения имела прямую корреляционную связь с эффективностью лечения препа-

PASI >75% (п=18)

1,6±0,1

PASI <75% <П=11)

1.9+0.6

>0,05

ратом инфликсимаб (г=0,68; р<0,001). Вместе с тем, корреляционная связь между уровнем 1Ь-6 и эффективностью терапии инфликсимабом оказалась слабой (г=-0,12; р<0,05).

Таким образом, в результате изучения уровня выбранных для исследования цитокинов в сыворотке крови больных псориазом было установлено, что единственным значимым критерием, позволяющим прогнозировать эффективность терапии больных псориазом препаратом инфликсимаб, является определяемый до лечения в сыворотке крови содержания ГЬ-10. Результаты исследования показали, что содержание цитокина в циркулирующей крови более 2,7 пг/мл позволяет прогнозировать высокую эффективность лечения больных препаратом инфликсимаб, менее 1,0 пг/мл - низкую. Результаты, полученные при изучении уровня других цитокинов, а также растворимых рецепторов ТЫ!3-а при их определении в биоптате кожи не позволили выявить различий между группами пациентов с выраженным эффектом от проводимой терапии инфликсимабом и пациентов с недостаточно выраженным ответом на лечение препаратом инфликсимаб. Следовательно, определение содержания интерлейкина 10 с помощью технологии х-МАР может быть использовано для прогнозирования эффективности лечения больных псориазом препаратом инфликсимаб.

У 20 больных псориазом проведено сравнительное исследование спектра белков кожи при различном клиническом эффекте на терапию инфликсимабом для выявления потенциальных белковых биомаркеров, характеризующих наличие или отсутствие резистентности к препарату.

В результате масс-спектрометрического исследования биоптатов пораженной кожи было идентифицировано 369 белков. Наличие девяти из числа идентифицированных белков имело умеренную корреляционную связь с ответом на лечение (значения гамма-коэффициента 0,47). При этом наличие в коже двух белков (белка 8100-А8 и глутатион-Б-трансферазы Р) было связано с выраженным положительным ответом на введение инфликсимаба. Наличие остальных 7 белков (кератин П типа цитоскелетный 5; кератин II типа цитоскелетный 80;

гистон Н1.3; аполипопротеин A-I; пероксиредоксин-2; АТФ-зависимая ДНК-хеликаза 2, субъединица 1; ^охарактеризованный белок C17orf68) было связано с ослабленным ответом на лечение инфликсимабом.

Белок S100A8, известный также как кальгранулин А, является внутриклеточным кальций-связывающим белком, который продуцируется миелоидными клетками. В его функции входит привлечение иммунных клеток в очаг воспаления. Этот белок рассматривается как маркер воспаления при ряде заболеваний. Участие S100A8 в молекулярных механизмах развития псориаза подтверждается тем, что кодирующий данный белок ген расположен в сопряженном с псориазом участке PSORS 4. Предполагаемый механизм индукции воспаления заключается в активации экспрессии интегринов (например, CD lib/CD 18) белками S100A8/S100A9, а также в привлечении клеток в очаг воспаления путем активации экспрессии IL-8 и ICAM-1 ( Foell D. et. al., 2007). Белки семейства S100A играют роль в патогенезе псориаза (Zibert J.R. et.al.,2009).

Другой белок, наличие которого коррелирует с выраженной положительной динамикой заболевания, глутатион-Б-трансфераза Р, относится к семейству метаболических ферментов клетки. Имеются данные об участии этой группы ферментов в воспалительных реакциях (Luo L. et.al. 2009, Zhou J. et.al. 2008), a также показано присутствие глутатион-Б-трансферазы Р в кератиноцитах при псориазе (Aceto A. et al., 1992).

Среди белков, сопряженных с ослабленным ответом на терапию инфликсимабом, представлены кератины (кератин П типа цитоскелетный 5, кератин П типа цитоскелетный 80). Роль различных типов кератинов в патогенезе псориаза остается не до конца изученной.

Выявлено также, что с ослабленным терапевтическим ответом на инфлик-симаб связана экспрессия гистона Н1.3, ядерного белка, формирующего нук-леосомы, и ДНК-хеликазы-2. Возможно, эти белки участвуют в формировании псориатического процесса, участвуя в альтернативных TNF-a процессах воспаления. Большие надежды в настоящее время возлагаются на препараты-

ингибиторы гистоновых ацетилаз, потенциально эффективных при онкологических и аутоиммунных воспалительных заболеваниях, в том числе при псориазе (БЬиШечуоПЬ БЛ., е1.а1.,2010).

Белок кератиноцитов пероксиредоксин-2 может являться потенциальным аутоантигеном и мишенью для Т-лимфоцитов при псориазе в результате формирования аутоиммунного ответа после перенесенной стрептококковой инфекции (Besgen Р., а.а1., 2010).

Аполипопротеин А-1 входит в состав липопротеидов высокой плотности (ЛПВП), тем самым участвуя в метаболизме холестерина, и является маркером сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе у предрасположенных к ним, пациентов с псориазом. В некоторых исследованиях показано участие холестерина в поддержании или формировании воспаления в коже, тогда как аполипо-протеин-А косвенно играет противовоспалительную роль (7аЬа1а\у1 М. е1.а1.,2007).

В настоящее время природа взаимосвязи экспрессии выявленных белков с клиническим эффектом терапии больных псориазом генно-инженерным препаратом инфликсимаб остается неясной и подлежит дальнейшему изучению. Вместе с тем, данные, полученные в настоящем исследовании, создают предпосылки для формулирования концепции взаимосвязи белков-предикторов с различным клиническим ответом на лечение больных псориазом инфликсимабом.

Анализ количественного содержания приведенных белков может привести к их валидации в качестве используемых в клинике биомаркеров.

В результате исследования молекулярной структуры выбранных для изучения генов у 29 больных псориазом, получавших лечение инфликсимабом, был обнаружен ряд нуклеотидных замен с разной частотой встречаемости, (табл. 4).

Таблица 4. Частота нуклеотидных замен в генах TNF-a, промоторе TNF-a, TNF-RI (экзон 1), промоторе TNF-RI, TNF-RII ( экзон 6) больных псориазом в зависимости от эффективности терапии инфликсимабом (%)

■шмп* - -

PASI 275% 238GA- 14.3 (П=18) 376GA-7.1 572АА- 100 857АА- 7.1 859ТТ- 21.4 861СС -21.4 409GA - 7.7: 478GA - 30.8 478 АА - 15.4; 40GA-7.7 1164ТТ-7.7; 1213СТ-7.7 1293GG - 7.7 ; 1372delA - 7.7 1741 TT - 7.7; 2729GG-23.1 Замены не обнаружены - 30.8

PASI <75% (п=11)

238GA- 12.5 308GA- 12.5 572АА - 87.5 859ТТ- 25 861СС- 12.5 Замены

не обнаружены ■ 12.5

409GA - 12.5; 478GA - 12.5 1293AG-12.5: 1371GG-12.5 2729GG - 12.5

Замены не обнаружены - 50

609ТТ- 7.7 609GG - 92.3

609TT- 12.5 609GG - 87.5

317АА-30.8 676GG-16.7 317AG-61.5 ОЁВХ—5Л 317GG-7.7 (о7 6ТТ -

Достоверность различий между группами (Р) 238GA >0.05 376GA >0.05 572АА >0,05 857АА >0.05 859ТТ >0,05 861СС >0,05 308GA >0.05 Замены не обнаружены >0.05 403GA >0,05; 478GA >0,05 47S АА >0 05; 840GA >0.05 1164ТТ>0.05: 1213СТ>0.05 1293GG>0 05: 1293AG>0.05 1371GG>0.05. 1372delA >0.05 1741TT>0.05: 2729GG>0.05 Замены не обнаружены >0,05 609ТТ>0.05 609GG>0.05

Сравнение частоты встречаемости нуклеотидных замен в изучаемых генах между пациентами, получавшими инфликсимаб, первой (18 чел.) и второй (11 чел.) групп (уменьшение индекса РА81 >75% и <75%) показало отсутствие достоверных отличий по абсолютному большинству показателей, что было подтверждено также результатами корреляционного анализа и указывало на отсутствие взаимосвязи между обнаруженными нуклеотидными заменами и характером терапевтического ответа больных псориазом на лечение инфликсимабом. Достоверные отличия по частоте регистрации нуклеотидных замен между пациентами первой и второй групп, получавшими инфликсимаб, были зарегистрированы лишь при изучении одного показателя, отражающего генотип в позиции 676 в 6 экзоне гена ГМ7-./?//. При этом частота встречаемости гомозиготного ТТ в позиции 676 генотипа в 6 экзоне гена TNF-RII у больных с выражен-

ным ответом на инфликсимаб была достоверно выше, чем у пациентов с недостаточным ответом на введение препарата (соответственно 77,8% против 27,3%; р<0,01). Напротив, частота встречаемости гомозиготного Св генотипа в позиции 676 генотипа в 6 экзоне гена ТИР-Я-П была достоверно выше у больных с низким ответом на инфликсимаб в сравнении с больными с выраженным положительным ответом на данный препарат (соответственно 72,7% против 16,7%; р<0,01).

Полученные данные были подтверждены результатами корреляционного анализа: ТТ генотип в позиции 676 генотипа в 6 экзоне гена TNF-R11 ассоциировался с выраженным клиническим ответом больного на терапию препаратом инфликсимаб (г=0,45), а ИС генотип - с ослабленным ответом на лечение (г=0,55). Таким образом, проведенные исследования позволили установить, что генотип 77VF-7?^^ в положении 676 в шестом экзоне может быть ответственен за различный клинический ответ на инфликсимаб у пациентов с псориазом.

Для определения прогностической значимости генотипа в положении 676 в шестом экзоне 'ГИГ-ЯН молекулярно-генетические исследования проведены также у 54 больных псориазом, не получавших инфликсимаб, у которых проводились другие методы системной терапии. Эти больные получали ПУВА - терапию (21 больной); Ре - ПУВА -терапию (6 пациентов); ПУВА - терапию с ме-тотрексатом (2 пациента); метотрексат (6 пациентов); циклоспорин (6 пациентов); неотигазон (7 пациента); УФВ 311 нм (2 пациента); неотигазон в сочетании с УФВ 311 нм (2 пациента), дезинтоксикационную, гипосенсибилизирую-щую терапию (1 пациент). Один пациент выбыл из исследования. Данные по этому пациенту в дальнейшем не учитывались.

Снижение индекса РАБ1 на 75 % и более наблюдалось у 36 пациентов из 53: у 16, получавших ПУВА-терапию, у 5 - метотрексат; у 4— циклоспорин, у 3 -Ре - ПУВА - терапию, у 3 - неотигазон, у 2 - метотрексат и ПУВА - терапию, у 2 - неотигазон и УФВ 311 нм, у 1 - УФВ 311 нм.

Снижение индекса РАБ1 менее чем на 75% отмечалось у 17 пациентов из 53: у 5, получавших ПУВА - терапию, у 3 - Ре - ПУВА - терапию, у 4 - неоти-газон, у 2 - циклоспорин, у 1 - метотрексат, у 1 - УФВ 311 нм, у 1 - дезинтокси-кационную, гипосенсибилизирующую терапию.

При сравнении частоты встречаемости нуклеотидных замен между группами пациентов с разным клиническим ответом на терапию стандартными (небиологическими) методами системной терапии не удалось выявить различий генотипа гена ГЛУ-Я// в позиции 676 шестого экзона При этом частота встречаемости ТТ или вй генотипа TNF-R.II в 676 положении (6 экзон) у больных с выраженным клиническим эффектом терапии достоверно не отличалась от пациентов с недостаточным эффектом (р>0,05).

Проведенные исследования позволили установить, что генотип TNF-RII в положении 676 в шестом экзоне может быть ответственен только за различный клинический ответ на лечение инфликсимабом у пациентов с псориазом и не может быть использован в качестве критерия отбора больных для других видов системной терапии.

На основании результатов выполненных исследований разработан метод прогнозирования эффективности лечения больных псориазом инфликсимабом. Метод заключается в определении молекулярного состава биообразца кожи и сыворотки крови больного псориазом до начала лечения и предусматривает:

- получение и исследование биоптата кожи больного псориазом с целью определения полиморфизма в позиции 676 шестого экзона гена ШР-ШГ,

- получение и исследование сыворотки крови больного псориазом до начала лечения по стандартной методике для определения содержания ГЬ-10.

Определение полиморфизма в позиции 676 шестого экзона гена TNF-RII выполняется с помощью метода ПЦР с последующей рестрикцией. Данное исследование включает следующие этапы: выделение ДНК из биообразцов; амплификацию ДНК фрагмента 6 экзона гена TNF-RH; детекцию и визуализацию продуктов амплификации ДНК фрагмента 6 экзона гена TNF-RII (оценочный

электрофорез); обработку амплификатов рестриктазой Nlalll; детекцшо и визуализацию продуктов рестрикции (оценочный электрофорез 2) и анализ полученных результатов.

Для определения содержания IL-10 применяется технология хМАР, которая включает построение калибровочной кривой с использованием стандартов и проведение исследования в соответствии с протоколом Bio-Plex Human Cytokine 8-Р1ех A Assay (Bio-Rad) с последующим определением концентрации цитокина с помощью калибровочной кривой и автоматической регистрацией результата на приборе Bio-Plex (Bio-Rad). Результат получают автоматически, концентрация выражается в пг/мл.

В результате проведения исследований получают данные о генотипе больного псориазом в позиции 676 шестого экзона гена TNF-RII и данные о концентрации IL-10 в сыворотке крови.

Прогнозирование эффективности терапии больных псориазом препаратом инфликсимаб осуществляют следующим образом: при выявлении гомозиготного генотипа TT в позиции 676 шестого экзона гена TNF-RII и высоком (> 2,7 пг/мл) содержании IL-10 в сыворотке прогнозируют высокую эффективность лечения, а при выявлении гомозиготного генотипа GG позиции 676 шестого экзона гена TNF-RII и низком (<1,0 пг/мл) содержании IL-10 в сыворотке прогнозируют низкую эффективность лечения.

На основании полученных данных по результатам изучения генотипа больных псориазом в целях прогнозирования эффективности терапии инфлик-симабом составлено техническое задание на выполнение опытно-конструкторских работ по изготовлению набора реагентов «Определение аллелей гена TNF-RII у больных псориазом методом ПЦР с последующей рестрикцией». Набор предназначен для исследования ДНК в биоптатах кожи больных псориазом путем анализа GG/TT генотипа в позиции 676 шестого экзона гена TNF-RII и рассчитан для анализа 100 образцов ДНК, включая положительные и отрицательные контроли.

ВЫВОДЫ

1. При изучении у больных псориазом связи клинического ответа на терапию генно-инженерным препаратом инфликсимаб с клинико-анамнестическими данными установлено, что такие показатели, как возраст пациента при дебюте псориаза и псориатического артрита, длительность псориаза и псориатического артрита, степень тяжести и распространенности кожного процесса, не являются маркерами клинической эффективности инфликсимаба.

2. Анализ возможности использования в качестве маркеров клинического ответа на терапию инфликсимабом определения содержания фактора некроза опухоли (TNF-a), его растворимых рецепторов первого и второго типа (TNF-RI, TNF-RII) и цитокинов IL-6, IL-8 и IL-10 в биообразцах больных выявил прогностическую значимость исследования в сыворотке крови исходного уровня ILIO: содержание цитокина, превышающее 2,7 пг/мл, ассоциируется с выраженным клиническим эффектом лечения, уровень менее 1,0 пг/мл - с низким клиническим эффектом.

3. При исследовании протеома кожи в биоптатах пораженной кожи больных псориазом идентифицировано 369 белков, 9 из которых связаны с клиническим ответом на терапию инфликсимабом. Наличие в протеоме кожи белков S100-A8 и глутатион-8-трансферазы Р ассоциируется с выраженным клиническим эффектом лечения. Наличие остальных 7 белков (кератин П типа цитоске-летный 5; кератин П типа цитоскелетный 80; гистон Н1.3; аполипопротеин A-I; пероксиредоксин-2; АТФ-зависимая ДНК-хеликаза 2, субъединица 1; неохарак-теризованный белок C17orf68) ассоциируется с низким эффектом лечения инфликсимабом.

4. Определение у больных генотипа TNF-RII в положении 676 в шестом эк-зоне может служить одним из предикторов эффективности терапии препаратом инфликсимаб: TT генотип ассоциируется с выраженным клиническим ответом на лечение (р<0,01), GG генотип - со слабым ответом на лечение (р<0,01).

5. Разработан метод прогнозирования эффективности лечения больных псориазом биологическим генно-инженерным препаратом инфликсимаб на основе исследования генотипа ТЫР-Ш1 в положении 676 шестого экзона и определении исходного уровня 1Ь-10 в сыворотке крови: при выявлении генотипа ТТ и содержании 1Ь-10 более 2,7 пг/мл прогнозируют высокую эффективность лечения, при выявлении генотипа СО и содержания 1Ь-10 менее 1,0 пг/мл прогнозируют низкую эффективность лечения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Перед назначением больным псориазом терапии препаратом инфликсимаб для достижения выраженного клинического эффекта рекомендуется определение следующих маркеров эффективности лечения: исследование в биоптате пораженной кожи полиморфизма гена рецептора второго типа фактора некроза опухоли (TNF-R.II) в позиции 676 шестого экзона и исходного содержания в сыворотке крови 1Ь-10.

При выявлении у больного генотипа ТТ в позиции 676 шестого экзона гена TNF-RII вероятность достижения выраженного клинического эффекта лечения инфликсимабом следует рассматривать как высокую. При выявлении генотипа ОС в позиции 676 шестого экзона гена TNF-RII вероятность достижения выраженного клинического эффекта следует рассматривать как низкую.

При обнаружении в сыворотке крови пациента уровня 10, превышающего 2,7 пг/мл, вероятность достижения выраженного клинического эффекта следует считать высокой, при содержании 1Ь-10 менее 1,0 пг/мл следует прогнозировать недостаточный клинический эффект.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Самсонов В.А. Псориаз / В.А. Самсонов, Л.Ф. Знаменская // Медицина для всех. - 2001. - №2. - С.9-12.

2. Знаменская Л.Ф. Псориаз: клиника и лечение / Л.Ф. Знаменская // Лечащий врач. - 2002. - №12. - С.12-16.

3. Альтмайер П. Терапевтический справочник по дерматологии и аллергологии: Пер. с нем. / Под ред. A.A. Кубановой. - Ред.: В.Ю. Халатов, Л.Ф. Знаменская, В.А. Самсонов и др. - М.: Гэотар-МЕД, 2003. - 1248 с ил.

4. Кубанов A.A. Общественная организация больных псориазом - Межрегиональное общество больных псориазом / A.A. Кубанов, Л.Ф. Знаменская, О.В. Надгериева и др. // 2-й Всероссийский конгресс дерматовенерологов: Тезисы научных работ - Спб., 2007. - С. 14-15.

5. Кубанов A.A. Создание Всероссийского регистра больных хроническими заболеваниями кожи / A.A. Кубанов, Л.Ф. Знаменская, О.В. Надгериева и др. // 2-й Всероссийский конгресс дерматовенерологов: Тезисы научных работ -Спб., 2007.-С. 15.

6. Кубанов A.A. Генетические исследования в ходе создания Всероссийского регистра больных хроническими заболеваниями кожи / A.A. Кубанов, Л.Ф.Знаменская, О.В. Надгериева и др. // 2-й Всероссийский конгресс дерматовенерологов: Тезисы научных работ - Спб., 2007. - С. 15. 7.3иаменская Л.Ф. Роль молекулярно-генетических маркеров в прогнозировании терапевтического ответа на генно-инженерные биологические препараты / Л.Ф.Знаменская, Н.В. Фриго, Н.Л. Каганова и др. // Вестник дерматологии и венерологии - 2008. - №6. - С.56-59.

8.3наменская Л.Ф. Современные представления о клинических особенностях и терапии псориаза / Л.Ф. Знаменская, Е.В. Пирогова // Эстетическая медицина. - 2008. - №1. - С.87-92.

9. Лесная И.Н. Разработка молекулярных методов повышения эффективности лечения псориаза препаратами биологических модификаторов иммунного ответа / И.Н. Лесная, A.A. Кубанов, Л.Ф. Знаменская и др. // Итоговая конференция по результатам выполненных мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 годы»: Сборник тезисов - М„ 8-10 дек. 2008 г. - С.88-89.

10. Псориаз: Клинические рекомендации / Под ред. А.А.Кубановой. - М.: ДЭКС-Пресс, 2008. - 56с. (Экспертный совет: A.A. Кубанова, Л.Ф.Знаменская и др.)

11. Каганова Н.Л. Возможность прогнозирования клинического ответа на лечение больных псориазом инфликсимабом на основе проведения молекулярно-генетических исследований / Н.Л.Каганова, Н.В.Фриго, Л.Ф.Знаменская и др. // Ш Всероссийский конгресс дерматовенерологов. - Казань, 2009. - С.99.

12. Каганова Н.Л. Генетические аспекты псориаза / Н.Л.Каганова, Н.В.Фриго, Л.Ф. Знаменская и др. // Вестник дерматологии и венерологии - 2009. - №4. -С.20-26.

13. Лесная И.Н. Разработка молекулярных методов повышения эффективности лечения псориаза препаратами биологических модификаторов иммунного ответа / И.Н. Лесная, A.A. Кубанов, Л.Ф. Знаменская и др. // Сборник тезисов итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2009 г. в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы». - М., 25-27 ноября 2009. - С.5-6.

14. Кубанова A.A. Иммунные механизмы псориаза. Новые стратегии биологической терапии / A.A. Кубанова, A.A. Кубанов, Л.Ф. Знаменская и др. // Вестник дерматологии и венерологии - 2010. - №1. - С.35-47.

15. Лесная И.Н. Молекулярные маркёры в прогнозировании клинической эффективности инфликсимаба у больных псориазом / И.Н. Лесная, Н.В. Фриго,

Л.Ф. Знаменская и др. // Вестник дерматологии и венерологии - 2010. - №1. -С.57-66.

16. Братцева Е.В. Поиск потенциальных биомаркеров хронических дерматозов с помощью протеомного анализа / Е.В. Братцева, С.А. Мошковский, Л.Ф.Знаменская и др. // Вестник дерматологии и венерологии - 2010. - №2. -С.13-19.

17. Заявка на евразийский патент 200901243. Способ прогнозирования эффективности лечения больных инфликсимабом / A.A. Кубанова, A.A. Кубанов, Л.Ф. Знаменская и др.

18. Резайкина A.B. Фактор некроза опухоли альфа у больных средне-тяжелыми и тяжелыми формами псориаза в процессе иммунотерапии / A.B. Резайкина, Л.Ф. Знаменская, C.B. Ротанов // Российский аллергологический журнал. -2010. - №1. - вып. 1. - С.232-234.

19. Знаменская Л.Ф. Клиническая эффективность инфликсимаба в терапии больных псориазом / Л.Ф. Знаменская, В.В. Бондаренко, З.Г. Фаттяхетдинова // Санкт-Петербургские дерматологические чтения: Материалы конференции 2122 окт.2010. - Спб., 2010. - С.67-68.

20. Знаменская Л.Ф. Персонализированный подход к выбору терапии больных псориазом с учетом результатов молекулярно-генетических исследований / Л.Ф. Знаменская, Н.В. Фриго, C.B. Ротанов и др. // Вестник дерматологии и венерологии - 2010. - №5. - С.-77-83.

21. Фриго Н.В. Основные направления развития диагностических технологий в дерматовенерологии / Н.В. Фриго, И.Н. Лесная, Л.Ф. Знаменская и др. // Вестник дерматологии и венерологии - 2010. - №5. - С.-35-44

22. Знаменская Л.Ф. Фактор некроза опухоли альфа и его растворимые рецепторы у больных псориазом / Л.Ф. Знаменская, C.B. Ротанов, Е.Л. Васильева // Dermatovenerologia va Estetik Tibbiyot [Дерматовенерология и эстетическая медицина] (Узбекистан). - 2010. - № 3. - С.12-13.

23. Знаменская Л.Ф. Препараты ингибиторов фактора некроза опухолей альфа в терапии больных псориазом / Л.Ф. Знаменская // Вестник дерматологии и венерологии - 2010. - №6. - С.7-15.

24. Кубанова A.A. Псориаз / (Авт.:И.Н.Авдиенко, В.А. Волнухин, Л.Ф. Знаменская и др.) // Дерматовенерология, 2010. Псориаз - с. 135-183 - М.: ДЭКС-Пресс, 2010. - 428 с. - (Клинические рекомендации / Российское общество дерматовенерологов) .

25. Знаменская Л.Ф. Современные представления о клинике, диагностике и лечении псориаза / Л.Ф. Знаменская // Труды XVII Росийского Национального Конгресса «Человек и лекарство» М„ - 2010. -Т.2 - С.404-414.

26. Знаменская Л.Ф. Современные методы терапии больных псориазом / Л.Ф. Знаменская, C.B. Яковлева, В.А. Волнухин и др. // Вестник дерматологии и венерологии - 2011. - №1. - С. 11-14.

27. Знаменская Л.Ф. Механизм реализации биологического действия фактора некроза опухоли-альфа при псориазе / Л.Ф. Знаменская, Ю.Ю. Егорова, C.B. Зитнер // Вестник дерматологии и венерологии - 2011. - №2. - С.13-17.

28. Надгериева О.В. Случай из практики: сочетание листовидной пузырчатки и псориаза. Вопросы диагностики / О.В. Надгериева, Л.Ф. Знаменская, И.Н. Ав-диенко и др. // Вестник дерматологии и венерологии - 2011. - №2. - С.54-57.

29. Яковлева C.B. Инфликсимаб в лечении больных псориазом: эффективность и безопасность / C.B. Яковлева, Л.Ф. Знаменская, Н.В. Кожевникова // Тезисы докладов 2-го Континентального конгресса дерматологов международного дерматологического общества / 4-го Всероссийского конгресса дерматовенерологов. СПб,2011.-С. 395.

30. Знаменская Л.Ф. Протеомные технологии в изучении патогенеза псориаза / Л.Ф. Знаменская // Вестник дерматологии и венерологии - 2011. - №3. - С.27-33.

31. Катунина O.P. Исследование пораженной кожи больных псориазом в процессе лечения инфликсимабом (морфологический анализ) / О.Р.Катунина, Л.Ф.

Знаменская, Ю.И. Матушевская // Вестник дерматологии и венерологии -2011. - №3. - С.58-62.

32. Мартынов А.А. Псориатический артрит: особенности клинического течения / А.А. Мартынов, Л.Ф. Знаменская, М.М. Бутарева и др. // Вестник дерматологии и венерологии - 2011. - №3. - С.94-98.

33. Кубанова А.А. Маркеры эффективности инфликсимаба у больных псориазом / А.А. Кубанова, Л.Ф. Знаменская, Н.В. Фриго и др. // Вестник дерматологии и венерологии - 2011. - №5. - С.64-69.

34. Знаменская Л.Ф. Клинический пример успешного лечения больного псориазом с применением инфликсимаба / Л.Ф. Знаменская, Ю.И. Матушевская // Ремикейд. Приложение к Вестнику дерматологии и венерологии - 2011. - С.4-7.

35. Kubanova А.А. Molecular markers in forecasting of the efficiency of treatment with Infliximab in patients with psoriasis / A.A. Kubanova, N.V. Frigo, L.F. Zna-menskaya at al // 40th Annual Meeting EADR. 8-11.09.2010. Helsinki, Finland II J. Invest. Dermatol. - 2010 (Sept). - V.130, Suppl 2. - P. 78.

36. Kokhan M. Reasoning for therapeutic modes choice for psoriasis patients / M. Kokhan, A. Kubanov, L. Znamenskaya at al // Abstracts 2 Continental Congress of Dermatology of the International Society of Dermatology and 4 Russian Congress of Dermatovenerology, St. Peterburg, Russia 6-9 July 2011. - P. 21.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ИФА - иммуноферментный анализ

LC - liquid chromatography (жидкостная хроматография)

MS - mass spectrometry (масс-спектрометрия)

MS/MS - tandem mass spectrometry (тандемная масс-спектрометрия)

PASI - Psoriasis Area and Severity Index (индекс распространенности и тяжести псориаза)

SNP - single nucleotide polymorphisms (однонуклеотидные замены)

sTNF-RI - растворимый рецептор фактора некроза опухоли с молекулярной

массой 55 kD (р55, CD 120а)

sTNF-RII — растворимый рецептор фактора некроза опухоли с молекулярной массой 75 kD (р75, CD120b)

TNF-a (ФНО) — Tumor Necrosis Factor а (фактор некроза опухоли)

Усл.п.л. - 2.0 Заказ № 08527 Тираж: 110 экз.

Копицентр «ЧЕРТЕЖ.ру» ИНН 7701723201 107023, Москва, ул.Б.Семеновская 11, стр.12 (495) 542-7389 www.chertez.ru

Псориаз является одним из наиболее распространенных заболеваний кожи. В последние годы значительно увеличилась частота встречаемости тяжелых форм заболевания, резистентных к различным видам терапии. Существующие методы лечения (фотохимиотерапия, циклоспорин, ацитретин, метотрексат и др.) в ряде случаев оказывают недостаточный эффект и обычно не позволяют достичь продолжительных ремиссий, что определяет актуальность разработки новых методов лечения и прогнозирования их эффективности.

Одним из основных звеньев патогенеза псориаза является избыточная продукция медиаторов иммунного ответа - цитокинов, обладающих провоспалительной активностью. Важную роль в возникновении воспаления играет фактор некроза опухоли альфа (TNF-a), который, в свою очередь, индуцирует синтез других провоспалительных цитокинов, включая IL-8, IL-6, INF-y и др., а также способствует экспрессии молекул адгезии, миграции дендритных клеток в лимфатические узлы и рециркуляции активированных иммунокомпетентных клеток.

Учитывая важную патогенетическую роль TNF-a в развитии воспаления при псориазе, биотехнологическими методами были разработаны принципиально новые лекарственные средства - генно-инженерные терапевтические антитела, блокирующие действие этого провоспалительного цитокина.

Селективное связывание TNF-a препятствует его взаимодействию со специфическими рецепторами и проявлению биологических эффектов: блокируется синтез других провоспалительных цитокинов и простагландинов, в результате чего подавляется воспалительная реакция, инфильтрация, а также уменьшается пролиферация кератиноцитов [J.M.Weinberg, R. Buchholz, 2006; K.M.Cordoro, S.R. Feldman , 2007]. Кроме того, блокада связанного с мембраной лимфоцитов и макрофагов TNF-a приводит к подавлению пролиферации иммунокомпетентных клеток и угнетению иммунной реактивности в целом [D.J. Veale et al., 2005; М.Р. Galindo et al., 2008].

В сравнении с другими методами системной терапии (фототерапией, циклоспорином, ацитретином, метотрексатом) генно-инженерные биологические препараты на основе моноклональных антител обладают рядом преимуществ: быстрое наступление клинического эффекта, длительный контроль над симптомами заболевания, предотвращение развития тяжелых инвалидизирующих форм псориаза, в большинстве случаев хорошая переносимость и отсутствие выраженных гепатотоксических и нефротоксических побочных эффектов, характерных для других методов современной терапии.

Одним из блокаторов TNF-a является генно-инженерный биологический препарат - инфликсимаб, который представляет собой комплексный химерный моноклональный иммуноглобулин класса Gi, состоящий из константных участков иммуноглобулина человека и вариабельных участков мышиных иммуноглобулинов. Инфликсимаб блокирует эффекты как растворимого, так и связанного с мембраной TNF-a.

Показанием к применению является лечение больных псориазом тяжелой степени, подлежащих системной терапии, больных псориазом средней степени тяжести при неэффективности или наличии противопоказаний к ПУВА-терапии, а также лечение больных прогрессирующим псориатическим артритом в активной форме.

Опубликованы результаты крупных контролируемых рандомизированных исследований, посвящённых применению инфликсимаба - IMPACT, IMPACT-2, SPIRIT, EXPRESS, подтвердивших высокую эффективность применения препарата у больных псориатическим артритом и среднетяжёлой и тяжёлой формами псориаза [С. Antoni et al., 2005; P.V. Voulgari et al. 2007;

А. МепЛег е1 а1., 2007]. Однако установлено, что блокаторы ТТ\ГР-а не у всех больных псориазом оказывают выраженный положительный эффект.

Аналогичные данные получены при лечении инфликсимабом больных другими хроническими воспалительными иммуноопосредованными заболеваниями, такими как ревматоидный артрит, болезнь Крона. При указанной патологии проведены исследования по изучению полиморфизма генов, кодирующих ТИБ-а и его рецепторы, которые позволили установить наличие связи между определенными нарушениями нуклеотидной последовательности генов и степенью клинического ответа на терапию инфликсимабом [8. МазсИегеИл, 2002; Т. Огекл, У-Бшпуа е1 а1., 2006; Р. Ма1зикига, 2008]. У больных псориазом таких исследований в доступной литературе не обнаружено.

Механизм действия инфликсимаба затрагивает белковые взаимодействия, поэтому протеомные исследования можно считать адекватным подходом для решения проблемы резистентности к этому препарату. При сравнении протеома кожи пациентов, отвечающих на терапию инфликсимаб, и резистентных к ней, могут быть обнаружены белковые биомаркеры, характеризующие механизм лекарственной устойчивости.

Учитывая высокую стоимость лечения больных псориазом генно-инженерными терапевтическими антителами, особую актуальность представляет персонализированный подход к назначению таких препаратов, а также разработка методов, позволяющих прогнозировать эффективность терапии. Исследований, посвященных изучению данных вопросов, в доступной литературе не найдено.

Цель исследования.

Поиск молекулярно - биологических критериев прогнозирования эффективности терапии больных псориазом генно-инженерным препаратом инфликсимаб.

Задачи исследования:

1. Оценить возможность использования клинико-анамнестических данных больных псориазом в качестве маркеров эффективности лечения биологическим генно-инженерным препаратом инфликсимаб.

2. Определить прогностическую ценность исследования исходного содержания цитокина ТЫБ-а, его растворимых рецепторов ТЫБ-М, ТКР-КЛ и цитокинов 1Ь-6, 1Ь-8 и 1Ь-10 в биообразцах больных при терапии инфликсимабом.

3. Провести исследования протеома кожи у больных с различным клиническим ответом на терапию инфликсимабом с целью выявления потенциальных белковых биомаркеров эффективности лечения.

4. Изучить полиморфизм генов цитокина ТИЕ-а и его растворимых рецепторов ТИГ-Ш, ТЫЕ-Ш1 у больных псориазом и сопоставить результаты исследований с клинической эффективностью терапии инфликсимабом.

5. На основе проведенных исследований разработать метод прогнозирования клинического ответа больных псориазом на лечение препаратом инфликсимаб.

Научная новизна.

Впервые в отечественной дерматовенерологии у больных псориазом изучен полиморфизм генов фактора некроза опухоли альфа (ТЫЕ-а) и его рецепторов первого и второго типа (ТЫЕ-Ш и ТЫР-ЯП), а также исследовано содержание рецепторов ТКР-Я! и ТМР-1Ш в биообразцах кожи и крови.

Установлено, что генотип в положении 676 в шестом экзоне гена ТЫГ-Ш1 у больных псориазом может быть ассоциирован с различным клиническим ответом на лечение инфликсимабом. Выявлено, что частота встречаемости ТТ генотипа гена в 676 положении у больных с выраженным ответом на лечение инфликсимабом достоверно выше, чем у пациентов с недостаточно выраженным ответом на препарат (р<0,01). Частота встречаемости вО генотипа гена ТИР-ЯП в 676 положении шестого экзона достоверно выше у больных с недостаточным клиническим ответом на терапию инфликсимабом по сравнению с больными, у которых отмечался выраженный клинический ответ на лечение (р<0,01).

Показана прогностическая ценность определения в сыворотке крови больных среднетяжелыми и тяжелыми формами псориаза содержания интерлейкина 10 для прогнозирования эффективности лечения препаратом инфликсимаб. Уровень интерлейкина 10, превышающий 2,7 пг/мл, ассоциируется с высокой эффективностью лечения, уровень менее 1,0 пг/мл - с низкой эффективностью лечения.

При исследовании протеомного профиля кожи больных псориазом обнаружены белки-маркеры, ассоциированные с эффективностью терапии препаратом инфликсимаб.

Разработано новое направление в дерматовенерологии, заключающееся в прогнозировании эффективности терапии больных псориазом генно-инженерным биологическим препаратом инфликсимаб на основе определения молекулярно-генетических маркеров клинического ответа на лечение.

Данные, полученные в исследовании, открывают новые возможности в персонализированном подходе к выбору адекватных методов терапии больных псориазом.

Практическая значимость

На основе комплексных исследований разработан и научно обоснован метод прогнозирования эффективности терапии больных среднетяжелыми и тяжелыми формами псориаза биологическим генно-инженерным препаратом инфликсимаб. Внедрение в клиническую практику разработанного метода позволит оптимизировать отбор пациентов для целенаправленного проведения лечения инфликсимабом и улучшить тем самым терапевтические результаты.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Обнаружение у больных псориазом генотипа ТТ в позиции 676 шестого экзона гена рецептора второго типа фактора некроза опухоли альфа (ТЫР-ШГ) позволяет прогнозировать выраженный клинический эффект при лечении биологическим генно-инженерным препаратом инфликсимаб.

2. Выявление у больных генотипа вО в позиции 676 шестого экзона гена рецептора второго типа фактора некроза опухоли альфа (ТЫР-ШТ) ассоциируется с недостаточным ответом на терапию инфликсимабом.

3. Содержание интерлейкина 10 в сыворотке крови больных, превышающее 2,7 пг/мл ассоциируется с выраженным клиническим ответом на терапию инфликсимабом, содержание менее 1,0 пг/мл - с недостаточным ответом на проводимое лечение.

4. Клинический ответ больных псориазом на лечение препаратом инфликсимаб связан с определенным составом протеома кожи. Недостаточная клиническая эффективность лечения коррелирует с наличием в протеоме кожи таких белков, как кератин II типа цитоскелетный 5, кератин II типа цитоскелетный 80, гистон Н1.3, аполипопротеин А-1, пироксиредоксин-2, АТФ-зависимая ДНК-хеликаза 2 (субъединица 1) и одного неохарактеризованного белка 17ог£68. Выраженный терапевтический эффект ассоциируется с наличием в протеоме кожи белков 8100-А8 и глутатион 8-трансферазы Р.

5. Разработанный метод прогнозирования эффективности терапии инфликсимабом с использованием молекулярно-генетических маркеров клинического ответа позволяет повысить результаты лечения больных среднетяжелыми и тяжелыми формами псориаза.

Внедрение результатов исследования.

Разработанный метод прогнозирования эффективности лечения инфликсимабом больных со среднетяжелыми и тяжелыми формами псориаза с использованием молекулярных методов исследования внедрен в работу отдела лабораторной диагностики инфекций, передаваемых половым путем, и болезней кожи ФГБУ «ГНЦДК» Минздравсоцразвития России, а также в практику работы кафедры дерматовенерологии с клиникой ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский Государственный Медицинский Университет им. академика И.П. Павлова».

Материалы проведенных исследований по изучению молекулярных маркеров прогнозирования клинической эффективности инфликсимаба у больных псориазом внедрены в учебный процесс и используются при составлении образовательных программ для клинических ординаторов, аспирантов, слушателей сертификационных курсов ФГБУ «ГНЦДК» Минздравсоцразвития России по специальности «дерматовенерология» и «клиническая лабораторная диагностика»; для студентов, клинических ординаторов и интернов ГОУ ВПО «Тверская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России по специальности «дерматовенерология»; применяются в учебном процессе кафедры дерматовенерологии ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский Государственный Медицинский Университет им. академика И.П. Павлова».

Получен евразийский патент №016240. Название изобретения: «Способ прогнозирования эффективности лечения больных псориазом инфликсимабом».

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на итоговых конференциях по результатам выполнения мероприятий за 2008 и 2009 гг. в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2008,

2009); научно-практических конференциях ФГУ «ГНЦД Росмедтехнологий» (Москва, 2008, 2009 ), конференции дерматовенерологов г. Москвы (2009), в Федеральном агентстве по науке и инновациям (Москва, 2009), на III Всероссийском конгрессе дерматовенерологов (Казань, 2009), на XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2010), научно-практических конференциях «Актуальные вопросы оказания дерматовенерологической помощи в Архангельской области» (Архангельск,

2010), «Актуальные вопросы дерматовенерологии и косметологии» (Томск,

2010), 40th Annual Meeting EADR (Helsinki, Finían, 2010 г.), на IV Российской научно-практической конференции, посвященной 125-летию Санкт-Петербургского научного общества дерматовенерологов им. В.М.Тарновского (Санкт-Петербургские дерматологические чтения, 2010), 2 Continental Congress of Dermatology of the International Society of Dermatology and 4 Russian Congress of Dermatovenerology (St. Peterburg, Russia 6-9 July

2011), конференциях дерматовенерологов и косметологов Южного (Краснодар, 2011) и Приволжского (Казань, 2011) федеральных округов, на форуме дерматологов и косметологов (Москва, 2011), конференции дерматовенерологов и косметологов Северо-Кавказского федерального округа (Ставрополь,2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 36 работ, из них 16 в изданиях и журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 155 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 5 рисунками и 11 таблицами и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 5 глав, содержащих результаты собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 72 источника отечественных авторов и 184 источника зарубежных авторов.

ВЫВОДЫ

1. При изучении у больных псориазом связи клинического ответа на терапию генно-инженерным препаратом инфликсимаб с клинико-анамнестическими данными установлено, что такие показатели, как возраст пациента при дебюте псориаза и псориатического артрита, длительность псориаза и псориатического артрита, степень тяжести и распространенности кожного процесса, не являются маркерами клинической эффективности инфликсимаба.

2. Анализ возможности использования в качестве маркеров клинического ответа на терапию инфликсимабом определения содержания фактора некроза опухоли (ЮТ-а), его растворимых рецепторов первого и второго типа (Т№-Щ, ЮТ-ЬШ) и цитокинов 1Ь-6,1Ь-8 и 1Ь-10 в биообразцах больных выявил прогностическую значимость исследования в сыворотке крови исходного уровня 1Ь-10: содержание цитокина, превышающее 2,7 пг/мл, ассоциируется с выраженным клиническим эффектом лечения, уровень менее 1,0 пг/мл - с низким клиническим эффектом.

3. При исследовании протеома кожи в биоптатах пораженной кожи больных псориазом идентифицировано 369 белков, 9 из которых связаны с клиническим ответом на терапию инфликсимабом. Наличие в протеоме кожи белков S100-A8 и глутатион-8-трансферазы Р ассоциируется с выраженным клиническим эффектом лечения. Наличие других 7 белков (кератин II типа цитоскелетный 5; кератин II типа цитоскелетный 80; гистон Н1.3; аполипопротеин A-I; пероксиредоксин-2; АТФ-зависимая ДНК-хеликаза^2, субъединица 1; ^охарактеризованный белок C17orf68) ассоциируется с низким эффектом лечения инфликсимабом.

4. Определение у больных генотипа TNF-RII в положении 676 в шестом экзоне может служить одним из критериев эффективности терапии препаратом инфликсимаб: ТТ генотип ассоциируется с выраженным клиническим ответом на лечение, GG генотип - со слабым ответом на лечение.

5. Разработан метод прогнозирования эффективности лечения больных псориазом биологическим генно-инженерным препаратом моноклональных антител инфликсимаб на основании исследования генотипа TNF-RII в положении 676 шестого экзона и определения исходного уровня IL-10 в сыворотке крови: при выявлении генотипа ТТ и содержании IL-10 более 2,7 пг/мл прогнозируют высокую эффективность лечения, при выявлении генотипа GG и содержания IL-10 менее 1,0 пг/мл прогнозируют низкую эффективность лечения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Перед назначением больным псориазом терапии препаратом инфликсимаб для достижения выраженного клинического эффекта рекомендуется определение следующих маркеров эффективности лечения: исследование в биоптате пораженной кожи полиморфизма гена рецептора второго типа фактора некроза опухоли альфа (Т№-ШГ) в позиции 676 шестого экзона и исходного содержания в сыворотке крови 1Ь-10.

При выявлении у больного генотипа 7Т в позиции 676 шестого экзона гена ТИР-КИ вероятность достижения выраженного клинического эффекта лечения инфликсимабом следует рассматривать как высокую. При выявлении генотипа ОО в позиции 676 шестого экзона гена ТИЕ-Ш1 вероятность достижения выраженного клинического эффекта следует рассматривать как низкую.

При обнаружении в сыворотке крови пациента уровня 1Ь-10, превышающего 2,7 пг/мл, вероятность достижения выраженного клинического эффекта следует считать высокой, при содержании 1Ь-10 менее 1,0 пг/мл следует прогнозировать недостаточный клинический эффект.