Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Молекулярные маркеры фертильности и состояние свободнорадикального окисления у сотрудников спецподразделений МВД в условиях боевого стресса

На правах рукописи

ГИЗАТУЛЛИН ТАГИР РАФАИЛОВИЧ

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МАРКЕРЫ ФЕРТИЛЬНОСТИ И СОСТОЯНИЕ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ У СОТРУДНИКОВ СПЕЦПОДРАЗДЕЛЕНИЙ МВД В УСЛОВИЯХ БОЕВОГО СТРЕССА

14.03.03. - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Нижний Новгород - 2010

003494106

Работа выполнена в ГОУ ВПО Башкирский государственный медицинский университет Росздрава

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Сергей Борисович Артифексов (Институт ФСБ России, г. Нижний Новгород); доктор медицинских наук, профессор Татьяна Григорьевна Погодина (Академия МВД Российской Федерации, г. Нижний Новгород);

Ведущая организация: Казанский государственный медицинский университет, г. Казань

Защита диссертации состоится « 4 ¿Г» С2010 года в -У/ часов на заседании диссертационного совета Д. 208.061(03 при Нижегородской государственной медицинской академии по адресу: 603005, г. Нижний.Новгород, пл. Минина и Пожарского, 10/1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородской государственной медицинской академии (603104, Нижний Новгород, ул. Медицинская, д.За).

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Рафагат Равильевич Фархутдинов Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор

Шамиль Нариманович Галимов

Автореферат разослан

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор

Дурново Е.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Характерной чертой демографической ситуации в России в последние 15 лет является систематическая убыль абсолютной численности населения, которая происходит вследствие суженного его воспроизводства, когда последующее поколение меньше предыдущего (Римашевская Н.М., 2004; Акопян А.С., 2008). Существенная роль в снижении рождаемости, наряду с социально-экономическими факторами, принадлежит бесплодию, которым страдает до 15 % семейных пар, при этом не менее половины всех зарегистрированных случаев связаны с нарушением репродуктивной функции мужчин (Кулаков В.И., Леонов Б.В., 2ООО; Танахо Э., Маканинч Д., 2005). По расчетам экспертов РАМН, мужская инфертильность явилась причиной нерождения примерно 4,0 млн. детей за последние 15-20 лет (Артюхин А.А., 2007).

Одной из самых потенциально уязвимых категорий мужского населения являются сотрудники органов МВД, служба которых сопряжена с психологическим стрессом, физическим перенапряжением, воздействием неблагоприятных факторов окружающей среды, а нередко и угрозой жизни (Глумова И.В., 2006; Морозов Д.В. и др., 2008).

Немаловажным в социальном и личностном плане и практически не изученным аспектом проблемы является нарушение у этой категории мужчин репродуктивной функции, сексуального здоровья и их регуляции. Имеющиеся сведения о влиянии боевого стресса на мужскую детородную функцию носят отрывочный характер, не дают целостного представления о проблеме, неоднозначно интерпретируются различными авторами, что не позволяет придти к единому мнению о степени утраты фертильности и механизмах репротоксического действия экстремальных факторов в условиях войны (Abou-Donia М. et al., 2003; Maconochie et al., 2004; Abu-Musa et al., 2008).

Этиология и патогенез нарушений мужской репродуктивной функции являются предметом оживленной научной дискуссии. Наиболее распространены гипотезы негативного воздействия факторов окружающей среды, профессионального маршрута мужчины, генетической предрасположенности, поведенческих и социокультурных особенностей, психоэмоциональной и физической перегрузки, стресса и т.д. (Bhasin Sh., 2007; Cavallíni G. et al., 2008). В качестве общего патогенетиче-

ского механизма уменьшения фертильности рассматривается изменение параметров ДНК сперматозоидов, в частности, структуры, степени и плотности укладки хроматина (Deibes G. et al., 2010). Возникать такие повреждения в половых клетках могут путем активации апоптоза, нарушения биохимических реакций, сопровождающих стадию конденсацию хроматина или атаки свободных радикалов на .фоне снижения антиоксидантной активности (Aitken R., De Iuliis G., 2010). Нарушение регуляции свободнорадикального окисления и изменение содержания свободных радикалов имеет место при различных негативных воздействиях на организм. Оно рассматривается как универсальный молекулярный механизм повреждения, ведущий к нарушению структуры и функции биологических мембран, сдвигам метаболизма, вызывающим активацию апоптоза и т.д. (Dowling D., Simmons L., 2009).

Нестабильность свободных радикалов, быстрый распад и включение в метаболизм продуктов окисления затрудняют их обнаружение в биологическом материале. Перспективным является способ исследования свободных радикалов, основанный на регистрации хемилюминесценции - свечения, возникающего при их взаимодействии. С помощью этого метода выявляются наиболее реакционноспо-собные радикалы, которые другими методами не регистрируются (Владимиров Ю.А. и др., 1992). Разработаны хемилюминесцентные методы исследования состояния свободнорадикального окисления в сперматозоидах и определения антиокислительной активности спермоплазмы (Громенко Д.С. и др., 2006), благодаря появлению которых показано патогенетическое значение активации свободнора-дикальных процессов в развитии инфертильности при действии факторов окружающей среды (Божедомов В. А. и др., 2009).

На репродуктивный статус влияет стресс, возникающий в ответ на экстремальное воздействие различного происхождения (Andersen М. et al., 2004; Maeda К., Tsukamura Н., 2006). При этом неспецифическая реакция напряжения вызывает изменения гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы, сопровождается многочисленными физиологическими, патофизиологическими реакциями, нарушениями метаболизма, в том числе и свободнорадикального окисления (Hadany L. et al., 2006; Титов В.Н., 2009).

Несмотря на успехи в изучении механизмов контроля фертильности в норме и патологии, репродуктивные корреляты сложного комплекса реакций различных

органов и систем, сопряженные с регуляцией гонадостата, метаболическими особенностями спермоплазмы, состоянием свободнорадикальных процессов и изменениями эякулята в ответ на стресс, вызванный условиями боевой обстановки, практически не нашли отражения в научной литературе.

Не менее важны вопросы объективизации способов раннего выявления нарушения фертильности, оценка значимости молекулярных маркеров в диагностике и поиск путей профилактики мужского бесплодия. Решение этих проблем и легло в основу постановки цели и задач данного исследования.

Цель исследования: изучение молекулярных маркеров сперматогенной функции и их взаимосвязи со свободнорадикальным окислением у лиц, подвергающихся воздействию факторов боевого стресса. Задачи исследования

1. Провести исследование характеристик эякулята сотрудников спецподразделений МВД до и после пребывания в т.н. «горячих точках».

2. Охарактеризовать гипофизарно-гонадные и гипофизарно-надпочечниковые отношения на фоне боевого стресса.

3. Определить влияние стрессовых факторов на гормональные показатели оплодотворяющих свойств сперматозоидов.

4. Исследовать уровни специфических маркеров фертильности - гликоделина (альфа2-микроглобулина фертильности), ингибина В и акросомального белка акрозина в сыворотке крови и/или сперме до и после командировок в «горячие точки».

5. Изучить воздействие стресса на про- и антиоксидантные показатели эякулята.

6. Оценить влияние биофлавоноидов прополиса на процессы свободноради-кального окисления в эякуляте.

Научная новизна.

1. Осуществлен комплексный углубленный анализ молекулярных механизмов нарушения оплодотворяющих свойств эякулята и их ассоциаций с состоянием гипо-таламо-гапофизарно-гонадной оси и свободнорадикальных процессов у мужчин, подверженных воздействию боевого стресса.

2. Впервые доказано, что развивающаяся при боевом стрессе андрогенная недостаточность и патоспермия тесно сопряжена с перераспределением цитокинового

профиля сыворотки крови и семенной плазмы с повышенной секрецией ИЛ-1|3, ИЛ-6 и ФНОа, а также с окислительным повреждением клеток, обусловленным угнетением антиоксидантной активности на фоне интенсификации генерации активных форм кислорода.

3. Впервые на фоне боевого стресса продемонстрировано значение дефицита молекулярных факторов фертильности - гликоделина, ингибина В, акрозина в развитии патологии эякулята.

4. Обоснована целесообразность применения хемилюминесцентных методов исследования в качестве наиболее эффективного способа экспресс-оценки состояния процессов свободнорадикального окисления в эякуляте при экстремальных воздействиях, сопровождающихся психоэмоциональным и оксидативным стрессом, а также для контроля эффективности проводимой терапии.

5. Впервые показана возможность коррекции биофлавоноидами прополиса процессов липопероксидации в модельных системах, а также в семенной жидкости экспериментальных животных на фоне физического стресса, что позволяет рекомендовать его использование для профилактики и коррекции процессов свободно-радикального окисления при нарушениях фертильности.

Практическая значимость. Определение молекулярных маркеров фертильности (гликоделина, ингибина В и акрозина) у мужчин, подвергшихся воздействию боевого стресса, может служить средством выявления ранних нарушений фертильности. Снижение их содержания в сыворотке крови и эякуляте предшествует изменению рутинных параметров спермограммы и может использоваться в диагностических и прогностических целях.

В опыте на животных, подвергнутых плавательной нагрузке, сопровождающейся оксидативным стрессом, профилактическое введение препарата «про-пофлан» приводило к снижению количества патологических форм сперматозоидов, увеличению их подвижности и жизнеспособности. Одновременно повышалась антиокислительная активность и снижалась избыточная генерация активных форм кислорода в гаметах животных. Полученные результаты позволяют рекомендовать препарат «Пропофлан» в качестве протективного средства нарушения фертальности при оксидативном стрессе, вызванном психоэмоциональной и физической перегрузкой.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Применение рутинного анализа спермограммы имеет низкую диагностическую и прогностическую ценность, что затрудняет выявление различных форм нарушений фертильности в условиях стресса и диктует необходимость поиска более информативных индикаторов оплодотворяющей способности.

2. Перспективными предикторами патологии фертильности при воздействии экстремальных факторов окружающей среды являются баланс про- и антиоксидант-ных систем и цитокиновый профиль спермальной плазмы, а также уровень молекулярных маркеров фертильности (гликоделина, ингибина и акрозина) в крови и эякуляте.

3. Использование комплекса биофлавоноидов прополиса позволяет улучшить характеристики эякулята, ограничить развитие оксидативного стресса в сперматозоидах, что подтверждается увеличением антиокислительной емкости эякулята и ингибированием образования активных форм кислорода.

Внедрение результатов исследования. Материалы диссертации используются в учебной и научно-исследовательской работе на кафедрах нормальной и патологической физиологии, Центральной научно-исследовательской лаборатории ГОУ ВПО Башкирский государственный медицинский университет Росздрава, а также в работе Башкирского республиканского перинатального центра. Апробация работы. Материалы диссертации представлены на VI Всероссийской конференции «Боевой стресс: механизмы стресса в экстремальных условиях» (2007), Всероссийском конгрессе по андрологии (Дагомыс, 2007), Российском научном форуме «Мужское здоровье и долголетие» (Москва, 2007, 2009), IV съезде Биохимического Общества РАН (Новосибирск, 2008), III Всероссийском съезде профпатологов (Новосибирск, 2008), VII Всероссийском конгрессе «Профессия и здоровье» (Москва, 2008), Проблемной комиссии «Научные основы охраны репродуктивного здоровья работников» Научного Совета РАМН «Медико-экологические проблемы здоровья работающих» (Самара, 2008), Всероссийской конференции с международным участием «Медицина труда: реализация Глобального плана действий по здоровью работающих на 2008-2017 гг.» (Москва, 2008), V Российском конгрессе «Мужское здоровье» (Кисловодск, 2009), совместном заседании кафедр патологической физиологии, нормальной физиологии, биологической и биоорганической химии, урологии, психиатрии и наркологии, скорой по-

мощи и медицины катастроф, лабораторной диагностики, Центральной научно-исследовательской лаборатории Башкирского государственного медицинского университета (Уфа, 8 сентября 2009 г., протокол № 24).

Личный вклад автора заключается в самостоятельной постановке и проведении экспериментального и клинического исследования, обработке материалов лабораторного и клинического обследования, а также хемилюминесцентного анализа. Самостоятельно выполнено полное общеклиническое обследование и изучение репродуктивного статуса 136 сотрудников отрядов милиции особого и специального назначения. Вся полученная информация проанализирована, систематизирована и обработана статистическими методами.

Публикация результатов исследований. Опубликовано 8 научных работ, в том числе 1 - в журнале, рецензируемом ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Работа иллюстрирована 13 таблицами, 17 рисунками. Библиографический список содержит 62 работы отечественных и 168 работ зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты, объем и методы исследования. Всего обследовано 136 человек, сотрудников отрядов милиции особого и специального назначения (ОМОН и ОМСН), служба которых сопряжена с выполнением боевых задач в т.н. «горячих точках». Возраст обследованных находился в диапазоне от 21 года до 42 лет, в среднем 26,7±0,2 года. Продолжительность командировки в зону боевых действий - 6 мес. Группу наблюдения составили военнослужащие, сопоставимые по материально-бытовым условиям, обеспеченности медицинской помощью, структуре экс-трагенитальной патологии и социальным факторам.

Об андрогенном статусе судили по содержанию в сыворотке крови тестостерона, эстрадиола, дегидроэпиандростерона сульфата (ДЭАС), сексстероидсвя-зывающего глобулина (ССГ), пролактина, ЛГ и ФСГ, индексу свободных андроге-нов (ИСА), о состоянии гипофизарно-надпочечниковой оси - по уровню кортизола и АКТГ. Содержание гормонов определяли с помощью стандартных тест-систем на иммуноферментном анализаторе '\Anthos-2020".

Концентрацию ингибина В в сыворотке крови находили с помощью имму-ноферментного набора ACTIVE™ Inhibin В ELISA фирмы «DSL» (США). Содержание гликоделина в сыворотке крови и эякуляте определяли с использованием наборов Glycodelin-ELISA фирмы «Bioserv» (Германия). В образцах эякулята исследовалось также количество акрозина с помощью тест-систем «AcroScreen» фирмы «Fertility Technology Resources Inc.» (США).

Лабораторное исследование эякулята включало определение физико-химических свойств и клеточного состава. Микроскопию спермы осуществляли при большом увеличении (объективно, окулярхЮ). Анализ эякулята проводили согласно рекомендациям ВОЗ по исследованию эякулята и спермоцервикальному взаимодействию (2001).

Оценку состояния свободнорадикальных процессов и антиокислительной активности эякулята проводили с помощью хемилюминесцентного анализа с использованием отечественного хемилюминомера ХЛ-003. Метод основан на измерении в видимой и близлежащих областях спектра излучения квантов света, обусловленного межорбитальными переходами электронов из возбужденного состояния в основное исходное (Владимиров Ю.А. и др., 1992). Метод регистрации ХЛ отвечает требованиям экспресс-анализа, отличается высокой чувствительностью (определяется 10*'° М радикалов), позволяет выявить нестабильные, короткожи-вущие радикалы, которые другими методами не регистрируются (Фархутдинов Р. Р., 2005; Tarpey М. et al., 2004).

Об интенсивности люминолзависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ) судили по светосумме и максимальной амплитуде свечения, которые соответствовали скорости образования АФК. При оценке Ре2+-индуцированной ХЛ определялась величина спонтанного свечения, продолжительность латентного периода от момента введения ионов железа до начала развития медленной вспышки. Также оценивалась амплитуда быстрой и медленной вспышки. Обработка полученных результатов проводилась на компьютере с помощью специального пакета программы статистики.

Об интенсивности процессов перекиснош окисления липидов в эякуляте судили по накоплению ТБК-реагирующих продуктов (ТБК-РП) как одного из конечных метаболитов липопероксидации. Количественное определение ТБК-РП проводили с использованием набора «ТБК - Агат» фирмы «Агат-Мед» (Россия). Об-

щую антиокислительную активность (ОАА) эякулята определяли с помощью стандартного тест-набора "Total antioxidant status" фирмы "Randox Laboratories" (Великобритания).

В отдельной серии опытов было исследовано влияние биофлавоноидов прополиса в виде биологически активной добавки «ПропоФлан» на процессы свобод-норадикального окисления в модельных системах in vitro и в эякуляте в эксперименте на животных in vivo. Препарат разработан с целью патогенетической коррекции нарушений мужской репродуктивной функции (Галимов Ш.Н. и др., 2003). Биофлавоноиды прополиса (кверцетин, пиноцембрин, апигенин и др.) обладают высокой антиокислительной активностью.

Для моделирования патологии сперматогенеза использовали плавательный тест. Плавание животных используется в экспериментальной биологии и медицине как адекватная и воспроизводимая модель мышечной работы. Интенсивная физическая работа, включая плавание, сопровождается существенными изменениями гонадостата и ухудшением параметров эякулята (Manna I. et al., 2004; Safarinejad M.etal.,2009).

Опыты выполнены на 30 белых беспородных самцах крыс репродуктивного возраста массой 200-260 г. Животные были разделены на 3 группы по 10 животных в каждой. 1-я группа служила контролем. 2-я группа животных подвергалась физической нагрузке. 3-ю группу составили животные, которым на фоне проведения плавательного теста в желудок вводили комплекс биофлавоноидов прополиса из расчета 30 мг/кг массы.

Состояние сперматозоидов исследовали после окончания опытов. Животных декапитировали с соблюдением правил эвтаназии согласно Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным.

С целью изучения интенсивности свободнорадикальных процессов и антиокислительной активности проводился хемилюминесцентный анализ сперматозоидов крыс. Исследовали люминолзависимую и Fe2+ -индуцированную ХЛ. Параллельно в тех же образцах определяли содержание ТБК-РП и активность супер-оксиддисмутазы (СОД), каталазы и глутатионпероксидазы (ГПО), а также общую антиокислительную активность.

Статистическая обработка данных выполнена с использованием прикладных программ Microsoft Excel 2000, Microsoft Access, STATISTICA 6.0.

Результаты исследования и их обсуждение

Прежде всего, был продемонстрирован один из «маркерных» эффектов стресса - нарушение равновесия гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой и ги-поталамо-гипофизарно-тестикулярной систем с развитием относительного андро-генодефицита. Так, концентрация тестостерона в сыворотке крови бойцов, принимавших участие в локальных конфликтах, снизилась на 18 %, а индекс свободных андрогенов, отражающий уровень биологически активного тестостерона, уменьшился на 39 % (табл. 1).

Таблица1

Содержание гормонов в крови сотрудников спецподразделений МВД до и после участия в боевых действиях

Показатель До После Референтные значения

Тестостерон, нмоль/л 17,7±0,6 14,5+0,8* 12-30

Эсградиол, пмоль/л 88+10,2 143±7,4* 40-161

ССГ, нмоль/л 20,5±3,1 32,9±5,2* 13-71

ИСА, % 79+9,2 48+6,3* 15-95

ЛГ, Ед/л 4,3±1,2 8,9+1,5* 0,8-7,6

ФСГ, Ед/л 2,6+0,6 6,8±1,7* 0,7-11,1

Пролактин, мЕд/л 226±19 - 392±27* 73-407

АКТГ.нг/л 26,4±2,2 35,1±2,5* . <46

Кортизол, нмоль/л 248+17 502±39* 138-635

ДЭАС, мкмоль/л 5,9±0,8 3,0±0,7? 3,3-17,4

Кортизол/ДЭАС (*100) 5,1+1,2 - 15,9±0,8* -

здесь и далее: * - р<0,05 по сравнению с контрольной группой

По литературным сведениям, андрогены в гонадах практически не депонируются и составляют лишь небольшую часть от их общего содержания в крови, поэтому концентрация тестостерона в половых железах отражает скорость сте-роидогенеза (МасИоскэ Б. ег а1., 1993). Следовательно, обнаруженные сдвиги можно интерпретировать как угнетение биосинтеза андрогенов, индуцированное стрессом.

Напротив, концентрация эстрадиола в сыворотке крови комбатантов значительно увеличивалась, что свидетельствует о возникновении условий для ускорен-, ной ароматизации тестостерона в клетках Лейдига и Сертоли, хотя нельзя исклю-

чить вовлечения в эти процессы периферических ферментных систем (печени, адипоцитов и др.).

Именно тестостерону и его дериватам (дигидротестостерону и др.) принадлежит роль истинного стимулятора созревания мужских гамет (Нишлаг Э., Бе-ре Г., 2005); роль ФСГ в этом процессе в настоящее время пересматривается: полагают, что этот гонадотропин лишь ограничивает апоптоз зародышевых половых клеток (Ruwanpura S. et al., 2008).

Уровни ФСГ и ЛГ в сыворотке крови комбатантов после пребывания в зоне боёв увеличивались, соответственно, более чем в 2,5 и 2,0 раза, т.е. отклик гипофиза на повреждение яичек сохранялся, хотя и не обеспечивал в полной мере восстановление стероидо- и гаметогенеза.

Помимо эстрогенов и гонадотропинов, функциональное состояние гипоталамуса определяется пролактином, концентрация которого на фоне боевого стресса существенно возрастала. Высокий уровень пролактина тормозит синтез ЛГРГ вследствие понижения содержания дофамина и увеличения содержания се-ротонина в различных церебральных структурах. По данным Kvetnansky R. et al. (2009), стресс различной природы приводит к изменениям характера распределения биогенных аминов в центральной нервной системе.

Важнейшая роль в регуляции репродуктивных процессов принадлежит ги-поталамо-гипофизарно-адренокортикальной системе, что детерминировано ее специфической ролью в формировании компенсаторно-приспособительных реакций к изменениям внешней и внутренней среды, с которыми взаимодействует го-надостат на различных этапах жизни (McEwen В., 2007).

При воздействии факторов боевого стресса уровни АКТГ и кортизола нарастали, что свидетельствовало о напряжении системы «гипофиз-надпочечники» и было связано, очевидно, с пролонгированной стрессорной реакцией и выбросом в кровь гормонов адаптации. В целом характерной чертой гипофизарно-надпочечниковых взаимоотношений у сотрудников ОМОН и ОМСН явилось ослабление как нисходящих, так и восходящих регуляторных влияний, т.е. сбой механизмов прямой положительной (АКТГ - кортизол) и обратной отрицательной связи (кортизол - кортиколиберин - АКТГ).

Что касается другого надпочечникового гормона - ДЭАС, то падение его уровня на фоне боевого стресса, по-видимому, является отражением неспецифиче-

ской реакции организма на действие неблагоприятных факторов среды пребывания, указывает на снижение его роли как буферного стероида и ограничение участия в компенсации тестикулярной недостаточности, а также, принимая во внимание широкий спектр биологических эффектов (Гончаров Н.П. и др., 2004), уменьшение его значения в адаптационных процессах.

Подавление репродуктивной функции наблюдается в различных стрессовых ситуациях, в том числе при инфекции, иммобилизации, боли, физической нагрузке, травмах и др. Если воздействие стресса на центральное звено гонадостата охарактеризовано достаточно полно, то состояние периферического отдела репродуктивной системы, в первую очередь, сперматогенной функции, изучено менее подробно. Это может быть вызвано отсутствием надежных и чувствительных методов диагностики мужской инфертильности. В настоящее время продолжаются интенсивные поиски биологических маркеров состояния мужского репродуктивного здоровья, имеющих высокую прогностическую ценность и пригодных для экспресс-оценки оплодотворяющей способности эякулята (Perdichizzi A. et al., 2007; Martinez-Pastor F. et al., 2009).

Согласно результатам наших клинических наблюдений, рутинный анализ спермограммы мужчин, подвергшихся воздействию боевого стресса, не выявил статистически значимых изменений большинства стандартных показателей эякулята до и после командировки в «горячие точки», несмотря на наличие тенденции к увеличению процентного содержания морфологически измененных клеток относительно нормативов ВОЗ.

Низкая диагностическая значимость традиционного анализа эякулята не позволяет дать однозначного ответа о репродуктивном статусе мужчин. Изолированная оценка морфофункциональных характеристик сперматозоидов плохо коррелирует с фертильностью (Rodriguez-Martinez Н., 2007). Хотя патоспермия и выступает как основная причина беплодия, в арсенале современной медицины до сих пор наличествует весьма скудный набор методов изучения эякулята, следствием чего является неэффективное лечение мужской инфертильности (Lefievre L., 2007). Эти обстоятельства послужили основанием для вывода о неполноценности базисного анализа спермы и смещения акцента исследований с субъективных на объективные методы, которые учитывают множество переменных параметров, детерминирующих качество мужских гамет (Petrunkina A. et al., 2007; Barratt С., 2008).

Одним из таких ключевых параметров, определяющих фертильность эякулята, признан цитокиновый профиль семенной плазмы (Ingman W., Jones R., 2008). Первостепенной функцией цитокинов является обеспечение выживаемости сперматозоидов в чужеродной среде женского репродуктивного тракта (Останин A.A. и др., 2006). В этой связи представляется закономерным обнаруженное нами перераспределение уровня цитокинов различного класса в семенной жидкости комба-тантов с превалированием ИЛ-lß, ИЛ-6 и ФНОа (табл. 2).

Активация секреции провоспалительных цитокинов, обладающих ингиби-рующим действием на спермато- и стероидогенез (Lui W., Lee W., 2009), совпадала со снижением уровней тестостерона и ДЭАС в сыворотке крови участников контртеррористических операций.

Таблица 2

Содержание некоторых цитокинов в спермоплазме мужчин до и после пребывания в зоне боевых действий (пг/мл)

Сроки наблюдения ИЛ-lß ИЛ-6 ИЛ-4 ФНОа

. до 9,5±0,78 26,8±6,2 8,8±1,3 12,6±0,7

после 23,1±2,7* 42,4±5,4 10,2±0,9 16,9±1,9*

Сравнительный анализ, выполненный у пациентов до и после поездки в зону боев, показал, что снижение качества спермы (главным образом ограничение подвижности) ассоциируется с умеренным, но статистически значимым приростом концентрации ТЫ /провоспалительных цитокинов (ИЛ-1Р и ФНОа).

В норме семенная жидкость индуцирует снижение реактивности женской иммунной системы к спермальным аллоантигенам, причем секрет фертильных мужчин отличается более выраженным ингибиторным потенциалом, нежели спермоплазма бесплодных мужчин (Ни1е1Ье1 М. е1 а!., 1997). Поэтому можно утверждать, что в обычных условиях сперма является одновременно индуктором ТЬ2- и ингибитором ТЫ-ответа. Исходя из этих сведений, можно полагать, что • цитокиновая сеть играет важную роль не только в спермато- или стероидогенезе, но и в репродукции в целом. Найденные сдвиги цитокинового зеркала эякулята

могут представлять собой патогенетическую основу идиопатического бесплодия, когда не удается зафиксировать явных дефектов типа эндокринопатий или вари-коцеле, а стандартные показатели спермограммы варьируют в пределах нормы (CavaUini G. et al., 2008).

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о диагностической ценности определения уровня цитокинов в семенной плазме, особенно при бесплодии неясного генеза. Учитывая собственные и литературные данные, можно предположить, что изучение репертуара цитокинов спермы способны выявить даже минимальные нарушения оплодотворяющей способности, не обнаруживаемые другими известными методами.

Важнейшим модулятором качества эякулята сегодня признается гликоделин (а2-микроглобулин фертильности), к свойствам которого относится способность повышать толерантность иммунной системы матери к оплодотворенной яйцеклетке и индуцировать молекулярные и клеточные изменения в эндометрии, обеспечивающие максимальную рецептивность к имплантации эмбриона (Посисеева Л.В., Герасимов А.Н., 2008; Yeung W. et al., 2007). Согласно полученным данным, содержание гликоделина в биологических жидкостях (крови и сперме) сотрудников ОМОН и ОМСН на фоне боевого стресса статистически значимо уменьшалось, и эти изменения практически не зависели от количественных и качественных характеристик эякулята (табл. 3).

Таблица 3

Молекулярные маркеры фертильности у бойцов спецподразделений МВД до и после пребывания в зоне боевых действий

Показатель До После

Гликоделин (сыворотка крови), мкг/мл 9,4±0,21 6,3+0,12*

Гликоделин (эякулят), мг/мл 17,4±1,6 6,8±0,62*

Ингибин В, пг/мл 166±12,2 93,0+4,7*

Акрозин, мкМЕ/106 сперматозоидов 142±10,2 115,9+9,5

Примечательно, что концентрация гликоделина в эякуляте на фоне боевого стресса уменьшалась в большей степени, чем в сыворотке крови (на 61 и 33 % от контрольных значений, соответственно), что имеет определенное патогенетическое значение. Так, одним из следствий уменьшения гликоделина может быть демаскирующий эффект, сопровождающийся снижением выживаемости сперматозоидов в женском репродуктивном тракте, что предопределено его биологическими свойствами.

Существенная роль в контролировании скорости сперматогенеза принадлежит ингибину В (Muttukrishna S. et al., 2007). Секреция этого пептида - регулятора синтеза ФСГ у комбатантов сильно подавлялась, что согласуется с увеличением сывороточной концентрации гонадотропинов. Еще одним маркером плодовитости у млекопитающих является акросомальный протеолитический фермент акрозин (De Jonge С., 2005), флуктуации уровня которого в эякуляте обследованных мужчин имели отчетливый тренд к уменьшению.

Резюмируя поиски молекулярных коррелятов нарушения фертильности, можно отметить следующее. Во-первых, развивающийся на фоне боевого стресса дефицит иммуносупрессорного белка гликоделина указывает на сбой системы «свой - чужой», в результате чего сперматозоид может восприниматься яйцеклеткой как чужеродная клетка. Во-вторых, недостаточность ингибина В выступает как предиктор угнетения сперматогенеза, а дефицит акрозина - как индикатор снижения оплодотворяющей способности. В совокупности эти факты свидетельствуют о высокой чувствительности мужской детородной системы к боевому стрессу, а также о возможности использования названных тест-систем для раннего выявления патологии фертильности еще до изменения рутинных параметров спермограммы.

На роль биологических маркеров нарушения репродукции могут претендовать и активные формы кислорода, гиперпродукция которых с повреждением ДНК и мембранного аппарата клеток Лейдига, Сертоли и различных поколений созревающих сперматозоидов признается в качестве ведущего механизма ухудшения качества эякулята (Jones D., 2008; Tremellen К., 2008).

С эволюционной точки зрения, АФК рассматриваются как универсальные ограничители и регуляторы количества и качества спермы (Dowling D., Simmons L., 2009). Любой эпизод эмоционального или иного стресса сопровождается «за-

мусориванием» межклеточной среды эндогенными флогогенами, в роли которых выступают белки теплового шока - шапероны (Smith D. et al., 1998), с последующей стимуляцией фагоцитоза, активацией НАДФН-оксидазы нейтрофилов и образованием АФК (Меньшикова Е.Б. и др., 2006). Представляя собой филогенетические древние структуры, шапероны и АФК в норме и патологии выполняют разнообразные регуляторные функции, являясь доказательством того, что «за каждым эмоциональным стрессом тянется длительный биохимический шлейф» (Титов В.Н., 2009). ■

Дисбаланс между продукцией АФК и антиоксидантной способностью различных отделов мужского репродуктивного тракта рассматривается как ключевой индикатор окислительного стресса, который хорошо коррелирует со степенью мужской инфертильности (Turner Т., Lysiak J., 2008). Это послужило побудительным мотивом для анализа ПОЛ в эякуляте бойцов спецподразделений МВД в условиях боевого стресса. Пример записи ЛЗХЛ эякулята обследованных мужчин представлен на рис. 1. В качестве основного параметра интенсивности ХЛ рассматривалась светосумма свечения (СС) за 5 минут измерения.

4". 09 ...........................,....,................

3.69 _L ' j

3.28 ;___:____J

ПО-;

2.89 «^j J 2.43 .!---;--hA^V^

:: | ,

I 1Га ; firfr йуЧ^Ц нщМлМ ^Шщ

| 0.40 4 ^VhM^i ^Wf^WW

°w 8-80 :.... i.... I.... i.........i.... I.... i '■..■■■.. i.... -

0.8 П 27a 3.0 4\0 S.0

Время, мин

I Esc - ВЫХОД 1 P - ПЕЧАТЬ || П - МАСШТАБ [ F - ФИЛЬТР Д

ПО-; си'

Г А А ¡Mmi ^Ij'f' IT iV?

Wi*' » 1 Н^шрМ/

8 1.0 2.0 3.0 4.B S.0

Рис. 1. Типичный пример записи ЛЗХЛ эякулята мужчин до и после командировки в зону боевых действий.

Показатели ЛЗХЛ по группам представлены в табл. 4. Как следует из анализа этих данных, достоверные различия были выявлены только по величине показателя светосуммы, который на фоне пребывания в зоне локальных конфликтов значительно увеличился - более чем в 1,8 раза.

Этот параметр является наиболее информативным критерием генерации АФК в сперме (Громенко Д.С. и др., 2007). На основании определения состояния прооксидантного звена ПОЛ подтверждается гипотеза о влиянии хронического стресса на способность сперматозоидов продуцировать АФК.

Таблица 4

Уровень ЛЗХЛ семенной жидкости мужчин до и после командировки в зону боевых действий (в отн.ед.)

Показатели ЛЗХЛ Светосумма Спонтанная светимость Максимальная светимость

до 4,2±0,72 1,2±0,33 1,9±0,28

после 7,7±1,45* 1,8±0,37 2,5±0,39

Была дана также оценка суммарной антиокислительной активности семенной жидкости до и после участия бойцов спецподразделений МВД в локальных конфликтах. Антиокислительные свойства оценивали в процентах угнетения от максимальной величины свечения модельной системы, генерирующей АФК, при добавлении к последней 0,1 мл спермоплазмы. Типичные примеры записи представлены на рис. 2.

При анализе полученных данных получены статистически достоверные различия между исследуемыми группами. Обращает на себя внимание факт снижения антиокислительной активности образцов эякулята мужчин после возвращения из зоны локальных конфликтов, что свидетельствует об ослабление защитных свойств спермоплазмы.

Сведения, полученные методом регистрации ХЛ, были подтверждены путем прямого определения концентрации ТБК-РП и антиокислительной емкости - накопление конечных метаболитов липопероксидации заметно нарастало при еще большей степени снижения антиоксидаитных резервов (табл. 5).

Рис. 2. Запись ХЛ модельной системы, генерирующей АФК (кривая М), и модельной системы, генерирующей АФК, с добавлением 0,1 мл спермо-плазмы комбатантов до (I) и после командировки (II)

Из сопоставления динамики изменения состояния про- и антоксидатных систем двумя различными методами следует, что стрёссиндуцированное увеличение интенсивности процессов свободнорадйкального окисления в спермоплазме обусловлено как активацией генерации АФК, так и уменьшением антиокислительного потенциала клеток.

Таблица 5

Изменение уровня ТБК-реагирующих продуктов и общей антиокислительной активности спермошшзмы бойцов спецподразделений МВД

Показатель Группы обследованных

До командировки После командировки

Общая ангиокислигельная активность, нМ/мл 5,4±0,42 2,6±0,35*

ТБК-РП, • нМ/мг бежа 0,31±0,04 . 0,45±0,05*.

В отдельной серии- экспериментов была изучена эффективность антиокси-дантного средства «Пропофлан» (Громенхо Д.С. и др., 2008), представляющего собой комплекс биофлавоноидов прополиса, как средства коррекции окислитель-

ного стресса в сперматозоидах. Установлена высокая антиокислительная активность, препарата в различных модельных системах, в которых инициировалось образование АФК. Было показано, что биофлавоноиды прополиса способны дозоза-висимо подавлять генерацию свободных радикалов в модельных системах in vitro вплоть до полного угнетения хемилюминесценции.

Антиоксвдантные свойства пропофлана были исследованы также in vivo в опыте на самцах крыс с использованием теста плавательной нагрузки, которая сопровождается развитием окислительного стресса в семенниках и патологией эякулята (Manna I. et al., 2004). Введение препарата в дозе 30 мг/кг массы тела животного приводило к нормализации морфологических и функциональных свойств сперматозоидов, а также устранению дисбаланса про- и антиоксидантных систем спермоплазмы. На фоне применения пропофлана наблюдалась выраженная стимуляция ферментов первой и второй линии антиоксидантной защиты - СОД и ката-лазы, а также тенденция к активации ГПО - терминального элемента цепочки протекторных белков спермоплазмы.

Таблица 6

Влияние пропофлана на уровень ТБК-РП и состояние системы антиоксидантной защиты сперматозоидов крыс при физической нагрузке

Показатель Контроль Плавательный тест Плавательный тест + «Пропоф-лан»

ТБК-РП, нМ/мл 3,7±0,48 5,9±0,43* 4,3±0,34**

ОАА, нМ/мл 48,3+6,2 . Э4,3±2,0* 49,1+3,5**

СОД, Е/мг белка 217±15,7 152±12,1* 194±10,2**

Катал аза, нКат/мг белка 3,8±0,42 2Д±0,23* 3,9±0,41**

ГПО, Е/мг белка 24,0±2,6 11,0±2,8* 17,9±3,3

* - р<0,05 по сравнению с контрольной группой

** - р<0,05 по сравнению с группой «Плавательный тесгг»

Хотя связь окислительного стресса с бесплодием в настоящее время установлена, многие вопросы остаются без ответа. Во-первых, необходимо разработать недорогие методы анализа окислительного стресса в сперматозоидах, которые бы могли быть выполнены в любой лаборатории. По нашему мнению, таким методом является регистрация хемилюминесценции эякулята. Во-вторых, необходимы

масштабные рандомизированные контролируемые исследования оптимальных комбинаций и дозировок антиоксидантов, позволяющих максимально защитить сперматозоиды от окислительного стресса.

Подводя итоги, можно констатировать, что гипоталамо-гипофизарно-тестикулярная ось представляет собой высокочувствительную мишень для факторов боевого стресса, действие которого сопровождается нарушением метаболических процессов и выраженной активацией свободнорадикального окисления в органах репродуктивной системы, дефицитом тестостерона, гликоделина и ингиби-на, а также дисбалансом цитокинов в спермоплазме на фоне срыва механизмов центральной и периферической регуляции стероидо- и сперматогенеза и, как следствие, ухудшением качества эякулята.

ВЫВОДЫ

1. Лабораторное исследование эякулята сотрудников спецподразделений МВД до и после пребывания в «горячих точках» выявило снижение доли клеток с быстрой и линейной прогрессивной подвижностью (категория А), прирост с медленной линейной и нелинейной прогрессивной подвижностью (категория В) и непрогрессивной подвижностью (категория С) на фоне статистически незначимой убыли неподвижных клеток (категория Д). Морфологические изменения сперматозоидов заключались в увеличении доли патологических форм. Отсутствие выраженного влияния боевого стресса на показатели эякулята продемонстрировало невысокую диагностическую ценность рутинной спермато-граммы и необходимость поиска более информативных индикаторов фертиль-ности.

2. У бойцов спецподразделений МВД после командировки в зону локальных конфликтов отмечается снижение концентрации тестостерона и повышение содержания эстрадиола в крови, увеличение ЛГ и ФСГ, пролактина, снижение ДЭАС на фоне повышения кортизола. Особенностью гормонального профиля обследованных мужчин является развитие гипергонадотропного гипого-надизма, нарушение баланса глюко- и андрокортикоидных стероидов, рассогласование функционирования гипофизарно-надпочечниковой системы с гиперсекрецией кортизола.

3. В патогенезе репродуктивных нарушений при боевом стрессе важная роль принадлежит дисбалансу провоспалительных (ИЛ-13, ИЛ-б, ФНОа) и про-

тивовоспалительных (ИЛ-4) цитокинов в семенной плазме, который отражает ослабление иммуносупрессорной активности спермы в условиях интоксикации.

4. Исследование уровней специфических маркеров фертильности до и после командировки в зону боевых действий выявило дефицит гликоделина в эякуляте, существенное снижение ингибина В и тенденцию к истощению сперматозоидов по акрозину. Обнаруженные изменения маркеров фертильности еще до изменения рутинных параметров спермограммы указывают на их высокую диагностическую и прогностическую ценность. Снижение в крови и эякуляте регуляторов гаметогенеза и фертилизации имеет патогенетическое значение в нарушении оплодотворяющей способности сперматозоидов.

5. Одним из ведущих механизмов развития патоспермии при воздействии боевого стресса является нарушение равновесия про- и антиоксидантных процессов. Установлено усиление образования АФК, интенсификация ПОЛ с накоплением в семенной плазме его конечных метаболитов - ТБК-реагирующих продуктов, а также снижение активности ферментативного и неферментативного звеньев антиокислительной защиты.

6. Препарат «Пропофлан», содержащий комплекс биофлавоноидов прополиса, отличается высокой антиоксидантной активностью - подавляет генерацию АФК и ПОЛ в модельных системах. Введение «Пропофлана» животным на фоне интенсивной физической нагрузки, сопровождающейся оксидативным стрессом, приводит к уменьшению морфологических и функциональных изменений гамет, ингибированию процессов свободнорадикального окисления и увеличению антиокислительной емкости эякулята. Протективное действие пропофлана в эксперименте на животных позволяет рассматривать этот препарат как перспективное средство борьбы с оксидативным стрессом.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Рекомендуется определять уровень молекулярных маркеров фертильности (гликоделина, ингибина и акрозина) в крови и эякуляте у лиц, подвергавшихся действию факторов боевого стресса для выявления ранних нарушений фертильности.

2. Препарат «Пропофлан», содержащий комплекс биофлавоноидов прополиса, может быть рекомендован как антиоксидант натурального происхождения,

ограничивающий развитие оксидативного стресса, вызванного психоэмоциональными и физическими перегрузками. Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Гизатуллин, Т.Р. Анализ гонодостата сотрудников спецподразделений МВД / Ш.Н. Галимов, Р.Х. Гизатуллин, Ш.И. Ибрагимов // Мужское здоровье и долголетие: Мат. 5-го Рос. научного форума. - М., 2007. - С. 33-34.

2. Гизатуллин, Т.Р. Состояние системы гипофиз-гонады у мужчин на фоне стрессовых воздействий // Вопр. теор. и практ. медицины: Мат. 72-й Респ. научной конф. студентов и молодых ученых. - Уфа, 2007. - С. 72-73.

3. Гизатуллин, Т.Р. Влияние боевого стресса на некоторые гормональные и биохимические параметры мужской фертильности / Ш.Н. Галимов, Р.Х. Гизатуллин, Н.Ф. Круговых, Э.Ф. Галимова // Боевой стресс: механизмы стресса в экстремальных условиях: Сб. научных трудов / Под ред. И.Б.Ушакова, Ю.А.Бубеева. - М., 2007.-С. 154-155.

4. Гизатуллин, Т.Р. Мужское здоровье - от констатации проблем до разработки системы мероприятий по профилактике и лечению / О.В. Зыков, Ш. Н. Галимов, Р.Х. Гизатуллин, Д.С. Громенко // Вестник Уфимского юридического института МВД России. - 2008.-№ 1. - С. 68-70.

5. Гизатуллин, Т.Р. Акрозин, ингибин В и гликоделин в диагностике мужской ин-фертильности при некоторых патологических состояниях / Ш. Н. Галимов, A.A. Мукминов ПIV съезд Рос. общества биохимиков и молекулярных биологов. - Новосибирск: 2008. - С. 425.

6. Гизатуллин, Т.Р. «Кризис сперматозоида» на рубеже тысячелетий: факты и гипотезы / Ш.Н. Галимов, Д.С. Громенко, Э.Ф. Галимова, А.З. Абдуллина // Мужское здоровье и долголетие: Мат. 7-го Рос. научного форума. - М., 2009. - С. 24.

7. Гизатуллин, Т.Р. Мужчина в зеркале эволюции, экологии, экономики и эмансипации / Ш. Н. Галимов, Д.С. Громенко, Э.Ф. Галимова, A.A. Мукминов, О.В. Си-вочалова // Мат. V Рос. конгресса «Мужское здоровье». - Кисловодск, 2009. - С. 240-246.

8. Гизатуллин, Т.Р. Молекулярные маркеры фертильности эякулята у сотрудников спецподразделений МВД в условиях боевого стресса / Ш. Н. Галимов, P.P. Фархутдинов, Э.Ф. Галимова, О.В. Сивочалова // Мед. труда и пром. экология. - 2009. - № 10. - С. 36-39.

Подписан в печать 12.03.201 Ог Гарнитура Таймс.Печать RISO RZ 370 ER Усл.печ.л. 1,0, Заказ № 118.Тираж 100 экз. -

Отпечатано в ООО «Соми+», 450001, РБ,г.Уфа, ул. Бабушкина,52, тел.(347) 2924814

Актуальность проблемы. Характерной чертой демографической ситуации в России в последние 15 лет является систематическая убыль абсолютной численности населения, которая происходит вследствие суженного его воспроизводства, когда последующее поколение меньше предыдущего (Римашевская Н.М., 2004; Акопян А.С., 2008). Существенная роль в снижении рождаемости, наряду с социально-экономическими факторами, принадлежит бесплодию, которым страдает до 15 % семейных пар, при этом не менее половины всех зарегистрированных случаев связаны с нарушением репродуктивной функции мужчин (Кулаков В.И., Леонов Б.В., 2000; Танахо Э., Маканинч Д., 2005). По расчетам экспертов РАМН, мужская инфертильность явилась причиной нерождения примерно 4,0 млн. детей за последние 15-20 лет (Артюхин А.А., 2007).

Одной из самых потенциально уязвимых категорий мужского населения являются сотрудники органов МВД, служба которых сопряжена с психологическим стрессом, физическим перенапряжением, воздействием неблагоприятных факторов окружающей среды, а нередко и угрозой жизни (Глумова И.В., 2006; Морозов Д.В. и др., 2008).

Немаловажным в социальном и личностном плане и практически не изученным аспектом проблемы является нарушение у этой категории мужчин репродуктивной функции, сексуального здоровья и их регуляции. В целом имеющиеся сведения о влиянии боевого стресса на мужскую детородную функцию носят отрывочный характер, не дают целостного представления о проблеме, неоднозначно интерпретируются различными авторами, что не позволяет придти к единому мнению о степени утраты фертильности и механизмах репротоксического действия экстремальных факторов в условиях войны (АЬои-Боша М. et а!., 2003; МасопосЫе е1 а1., 2004; АЬи-Мша е1 а1., 2008; и др.).

Этиология и патогенез регистрируемых практически повсеместно нарушений мужской репродуктивной функции являются предметом оживленной научной дискуссии. В порядке хронологического появления рассматриваются гипотезы негативного воздействия химических и физических факторов окружающей среды, профессионального маршрута мужчины, генетической предрасположенности, поведенческих и социокультурных особенностей, включая образ жизни, психоэмоциональной и физической перегрузки, стресса и.т.д. (Bonde J., Storgaard L., 2002; Bhasin Sh., 2007; Cavallini G. et al., 2008). Независимо от этиологии, в качестве общего патогенетического механизма уменьшения фертильности рассматривается изменение параметров ДНК сперматозоидов, в частности, структуры, степени и плотности укладки хроматина как первостепенных параметров оплодотворяющей способности (Delbès G. et al., 2010). Возникать такие повреждения в половых клетках могут посредством трех основных процессов: активации апоптоза, нарушения течения биохимических реакций, сопровождающих стадию конденсацию хроматина или атаки свободных радикалов на фоне снижения антиоксидант-ной активности (Aitken R., De Iuliis G., 2010). Следует подчеркнуть, что нарушение регуляции свободнорадикального окисления, изменение содержания свободных радикалов в биологическом материале имеет место при различных негативных воздействиях на организм. Оно рассматривается как универсальный молекулярный механизм повреждения, ведущий к нарушению структуры и функции биологических мембран, сдвигам метаболизма, вызывающим активацию апоптоза и т.д. (Dowling D., Simmons L., 2009).

В то же время нестабильность свободных радикалов, быстрый распад и включение в метаболизм продуктов окисления затрудняют их обнаружение в биологическом материале. Исследования должны проводиться в строго контролируемых, специально подобранных условиях, исключающих разрушение или образование продуктов окисления и свободных радикалов во время проведения анализа. Перспективным является способ исследования свободных радикалов в биологическом материале, основанный на регистрации хемилю-минесценции - свечения, возникающего при их взаимодействии. С помощью этого метода удается выявить наиболее реакционноспособные радикалы, которые другими методами не регистрируются (Владимиров Ю.А. и др., 1992). Разработаны хемилюминесцентные методы исследования состояния СРО в сперматозоидах и определения АО А спермоплазмы (Громенко Д. С. и др., 2006), благодаря появлению которых удалось показать патогенетическое значение активации свободнорадикальных процессов в развитии инфертильно-сти при действии негативных факторов окружающей среды (Божедомов В. А. и др., 2009).

На репродуктивный статус, судя по данным литературы, влияет стресс, возникающий в ответ на экстремальное воздействие различного происхождения (Calogero A. et al., 1998; Andersen М. et al., 2004; Maeda К., Tsukamura H., 2006). При этом неспецифическая реакция напряжения вызывает изменение гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы, сопровождается многочисленными физиологическими, патофизиологическими реакциями, нарушениями метаболизма, в том числе и свободнорадикального окисления (O'Connor Т. et al., 2000; Hadany L. et al., 2006; Титов B.H., 2009).

Несмотря на определенные успехи в изучении механизмов контроля фертильности в норме и патологии, репродуктивные корреляты сложного комплекса реакций различных органов и систем, прежде всего, сопряженные с регуляцией гонадостата, метаболическими особенностями спермоплазмы, состоянием свободнорадикальных процессов и, в конечном счете, изменениями эякулята в ответ на стресс, вызванный условиями боевой обстановки, практически не нашли отражения в научной литературе.

Не менее важны вопросы объективизации способов раннего выявления нарушения фертильности, оценка значимости молекулярных маркеров в диагностике и поиск путей профилактики мужского бесплодия. Решение этих проблем и легло в основу постановки цели и задач данного исследования.

Цель исследования: изучение молекулярных маркеров сперматогенной функции и их взаимосвязи со свободнорадикальным окислением у лиц, подвергающихся воздействию факторов боевого стресса. Задачи исследования

1. Провести исследование характеристик эякулята сотрудников спецподразделений МВД до и после пребывания в т.н. «горячих точках».

2. Охарактеризовать гипофизарно-гонадные и гипофизарно-надпочечниковые отношения на фоне боевого стресса.

3. Определить влияние стрессовых факторов на гормональные показатели оплодотворяющих свойств сперматозоидов.

4. Исследовать уровни специфических маркеров фертильности - гликоде-лина (альфа2-микроглобулина фертильности), ингибина В и ак-росомального белка акрозина в сыворотке крови и/или сперме до и после командировок в «горячие точки».

5. Изучить воздействие стресса на про- и антиоксидантные показатели эякулята.

6. Оценить влияние биофлавоноидов прополиса на процессы свободнора-дикального окисления в эякуляте.

Научная новизна.

1. Осуществлен комплексный углубленный анализ молекулярных механизмов нарушения оплодотворяющих свойств эякулята и их ассоциаций с состоянием гипоталамо-гипофизарно-гонадной оси и свободнорадикальных процессов у мужчин, подверженных воздействию боевого стресса.

2. Впервые доказано, что развивающаяся при боевом стрессе андрогенная недостаточность и патоспермия тесно сопряжена с перераспределением цито-кинового профиля сыворотки крови и семенной плазмы с повышенной секрецией ИЛ-1р, ИЛ-6 и ФНОа, а также с окислительным повреждением клеток, обусловленным угнетением антиоксидантной активности на фоне интенсификации генерации активных форм кислорода.

3. Впервые на фоне боевого стресса продемонстрировано значение дефицита молекулярных факторов фертильности - гликоделина, ингибина В, акрозина в развитии патологии эякулята.

4. Обоснована целесообразность применения хемилюминесцентных методов исследования в качестве наиболее эффективного способа экспресс-оценки состояния процессов свободнорадикального окисления в эякуляте при экстремальных воздействиях, сопровождающихся психоэмоциональным и окси-дативным стрессом, а также для контроля эффективности проводимой терапии.

5. Впервые показана возможность коррекции биофлавоноидами прополиса процессов липопероксидации в модельных системах, а также в семенной жидкости экспериментальных животных на фоне физического стресса, что позволяет рекомендовать его использование для профилактики и коррекции процессов свободно-радикального окисления при нарушениях фертильности. Практическая значимость результатов исследований. Определение молекулярных маркеров фертильности (гликоделина, ингибина В и акрозина) у мужчин, подвергшихся воздействию боевого стресса, может служить средством выявления ранних нарушений фертильности. Снижение их содержания в сыворотке крови и эякуляте предшествует изменению рутинных параметров спермограммы и может использоваться в диагностических и прогностических целях.

В опыте на животных, подвергнутых плавательной нагрузке, сопровождающейся оксидативным стрессом, профилактическое введение препарата «пропофлан» приводило к снижению количества патологических форм- сперматозоидов, увеличению их подвижности и жизнеспособности. Одновременно повышалась антиокислительная активность и снижалась избыточная генерация АФК в гаметах животных. Полученные результаты позволяют рекомендовать препарат «Пропофлан» в качестве протективного средства нарушения фертильности при оксидативном стрессе, вызванном психоэмоциональной и физической перегрузкой. Основные положения, выносимые на защиту

1. Применение рутинного анализа спермограммы имеет низкую диагностическую и прогностическую ценность, что затрудняет выявление различных форм нарушений фертильности в условиях стресса и диктует необходимость поиска более информативных индикаторов оплодотворяющей способности.

2. Перспективными предикторами патологии фертильности при воздействии экстремальных факторов окружающей среды являются баланс про- и антиок-сидантных систем и цитокиновый профиль спермальной плазмы, а также уровень молекулярных маркеров фертильности (гликоделина, ингибина и ак-розина) в крови и эякуляте.

3. Использование комплекса биофлавоноидов прополиса позволяет улучшить характеристики эякулята, ограничить развитие оксидативного стресса в сперматозоидах, что подтверждается увеличением антиокислительной емкости эякулята и ингибированием образования активных форм кислорода. Внедрение результатов исследования. Материалы диссертации используются в учебной и научно-исследовательской работе на кафедрах нормальной и патологической физиологии, Центральной научно-исследовательской лаборатории ГОУ ВПО Башкирский государственный медицинский университет Росздрава, а также в работе Башкирского республиканского перинатального центра.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на VI Всероссийской конференции «Боевой стресс: механизмы стресса в экстремальных условиях» (2007), Всероссийском конгрессе по андрологии (Дагомыс,

2007), Российском научном форуме «Мужское здоровье и долголетие» (Москва, 2007, 2009), IV съезде Биохимического Общества РАН (Новосибирск,

2008), III Всероссийском съезде профпатологов (Новосибирск, 2008), VII Всероссийском конгрессе «Профессия и здоровье» (Москва, 2008), Проблемной комиссии «Научные основы охраны репродуктивного здоровья работников» Научного Совета РАМН «Медико-экологические проблемы здоровья работающих» (Самара, 2008), Всероссийской конференции с международным участием «Медицина труда: реализация Глобального плана действий по здоровью работающих на 2008-2017 гг.» (Москва, 2008), V Российском конгрессе «Мужское здоровье» (Кисловодск, 2009), совместном заседании кафедр патологической физиологии, нормальной физиологии, биологической и биоорганической химии, урологии, психиатрии и наркологии, скорой помощи и медицины катастроф, лабораторной диагностики, Центральной научно-исследовательской лаборатории Башкирского государственного медицинского университета (Уфа, 8 сентября 2009 г., протокол № 24).

Личный вклад автора заключается в самостоятельной постановке и проведении экспериментального и клинического исследования, обработке материалов лабораторного и клинического обследования, а также хемилю-минесцентного анализа. Самостоятельно выполнено полное общеклиническое обследование и изучение репродуктивного статуса 136 сотрудников отрядов милиции особого и специального назначения. Вся полученная информация проанализирована, систематизирована и обработана статистическими методами. '•

Публикация результатов исследований. Опубликовано 8 научных работ, в том числе 1 - в журнале, рецензируемом ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Работа иллюстрирована 13 таблицами, 17 рисунками. Библиографический список содержит 62 работы отечественных и 168 работ зарубежных авторов.

выводы

1. Лабораторное исследование эякулята сотрудников спецподразделений МВД до и после пребывания в «горячих точках» выявило снижение доли клеток с быстрой и линейной прогрессивной подвижностью (категория А), прирост с медленной линейной и нелинейной прогрессивной подвижностью (категория В) и непрогрессивной подвижностью (категория С) на фоне статистически незначимой убыли неподвижных клеток (категория Д). Морфологические изменения сперматозоидов заключались в увеличении доли патологических форм. Отсутствие выраженного влияния боевого стресса на показатели эякулята продемонстрировало невысокую диагностическую ценность рутинной сперматограммы и необходимость поиска более информативных индикаторов фертильности.

2. У бойцов спецподразделений МВД после командировки в зону локальных конфликтов отмечается снижение концентрации тестостерона и повышение содержания эстрадиола в крови, увеличение ЛГ и ФСГ, про-лактина, снижение ДЭАС на фоне повышения кортизола. Особенностью гормонального профиля обследованных мужчин является развитие гипер-гонадотропного гипогонадизма, нарушение баланса глюко- и андрокорти-коидных стероидов, рассогласование функционирования гипофизарно-надпочечниковой системы с гиперсекрецией кортизола.

3. В патогенезе репродуктивных нарушений при боевом стрессе важная роль принадлежит дисбалансу провоспалительных (ИЛ-1|3, ИЛ-6, ФНОа) и противовоспалительных (ИЛ-4) цитокинов в семенной плазме, который отражает ослабление иммуносупрессорной активности спермы в условиях интоксикации.

4. Исследование уровней специфических маркеров фертильности до и после командировки в зону боевых действий выявило дефицит гликодели-на в эякуляте, существенное снижение ингибина В и тенденцию к истощению сперматозоидов по акрозину. Обнаруженные изменения маркеров фертильности еще до изменения рутинных параметров спермограммы указывают на их высокую диагностическую и прогностическую ценность. Снижение в крови и эякуляте регуляторов гаметогенеза и фертилизации имеет патогенетическое значение в нарушении оплодотворяющей способности сперматозоидов.

5. Одним из ведущих механизмов развития патоспермии при воздействии боевого стресса является нарушение равновесия про- и антиокси-дантных процессов. Установлено усиление образования АФК, интенсификация ПОЛ с накоплением в семенной плазме его конечных метаболитов -ТБК-реагирующих продуктов, а также снижение активности ферментативного и неферментативного звеньев антиокислительной защиты.

6. Препарат «Пропофлан», содержащий комплекс биофлавоноидов прополиса, отличается высокой антиоксидантной активностью - подавляет генерацию АФК и ПОЛ в модельных системах. Введение «Пропофла-на» животным на фоне интенсивной физической нагрузки, сопровождающейся оксидативным стрессом, приводит к уменьшению морфологических и функциональных изменений гамет, ингибированию процессов сво-боднорадикального окисления и увеличению антиокислительной емкости эякулята. Протективное действие пропофлана в эксперименте на животных позволяет рассматривать этот препарат как перспективное средство борьбы с оксидативным стрессом.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Рекомендуется определять уровень молекулярных маркеров фертиль-ности (гликоделина, ингибина и акрозина) в крови и эякуляте у лиц, подвергавшихся действию факторов боевого стресса для выявления ранних нарушений фертильности.

2. Препарат «Пропофлан», содержащий комплекс биофлавоноидов прополиса, может быть рекомендован как антиоксидант натурального происхождения, ограничивающий развитие оксидативного стресса, вызванного психоэмоциональными и физическими перегрузками.