Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Молекулярные и клеточные основы иммунопатогенеза Helicobacter pylori-ассоциированных заболеваний у населения Республики Хакасия

На правах рукописи

АГЕЕВА Елизавета Сергеевна

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ И КЛЕТОЧНЫЕ ОСНОВЫ ИММУНОПАТОГЕНЕЗА HELICOBACTER PYLORI-АССОЦИИРОВАННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У НАСЕЛЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ ХАКАСИЯ

14.03.03 - патологическая физиология 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Томск 2012

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный университет Минздравсоцразвития России», федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Хакасский государственный университет им. Н. Ф. Катанова»

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук

Рязанцева

Наталья Владимировна

Штыгашева

Ольга Владимировна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук,.. профессор

Агафонов

Владимир Иванович

Савченко

Андрей Анатольевич

Плешко

Раиса Ивановка

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт терапии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (г. Новосибирск).

Защита состоится «_»__2012 г. в_часов на заседании

диссертациошюго совета Д 208.096.01 при Сибирском государственном медицинском университете (643050, г. Томск, ул. Московский тракт, 2)

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке Сибирского государственного медицинского университета

Автореферат разослан «_»_2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Петрова И. В.

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА

2012_

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Helicobacter pylori является ведущим этиологическим фактором язвенной болезни и хронического гастрита [FConturek P.C., 2006; Хомери-ки С.Г., 2008]. Результаты широкомасштабных исследований показали, что на долю язвенной болезни, ассоциированной с инфекцией Helicobacter pylori, приходится 70-80 % случаев выявления дуоденальных язв и 50-60 % язв желудка [Suerbaum S., 2002]. Появляется все больше доказательств той роли, которую играет инфекция Helicobacter pylori в возникновении и развитии рака желудка [Malekzadeh R., 2004; Hansen S., 2007; Янкин A.B., 2010]. Исследователи связывают с инфицированием Helicobacter pylori 100 % случаев выявления проксимального рака желудка у японцев [Uedo N.. 2003].

Ключевым звеном в развитии гастродуоденальной патологии является не только длительная инфекция Helicobacter pylori в макроорганизме, но и непосредственное участие в этом процессе клеток иммунной системы. Механизмы дизрегуляции иммунного ответа макроорганизма при длительном инфицировании Helicobacter pylori связаны с прямым цитопатическим действием патогена, приводящим к поляризации иммунного ответа по Thl-пути и выработке соответствующего спектра цитокинов (IFNy, TNFa, IL-1, IL-2, IL-8, IL-10). Детерминация иммунного ответа no Thl-клеточному типу оказывает решающую роль в иммунопатогенезе заболеваний, связанных с Helicobacter pylori-инфекцией [Lohoff М., 2000; Кондрашина Э.А., 2002]. Действие цитокинов, с одной стороны, вызывает неадекватную активацию иммунной системы: усиление апоптоза иммунных клеток с их последующей элиминацией [Согтеа Р., 1997; Suares G., 2006], а, с другой, - дисбаланс между процессами программированной гибели желудочных эпителиоцитов и их пролиферацией [Васильев Ю.В., 2006; Хоме-рики С.Г., 2006]. Усиление гибели эпителиоцитов приводит к усугублению язвенных дефектов слизистой оболочки желудка. И, наоборот, преобладание про-лиферативных процессов при хроническом воспалении эпителия слизистой оболочки желудка увеличивает риск развития рака [Нургалиева Б.К., 2005].

Характер взаимодействия Helicobacter pylori и организма человека имеет популяционные отличия. В литературе описаны феномены «африканская загадка», «азиатская загадка», «северная загадка», сущность которых заключается в «консервации» макроорганизмом патогенных штаммов Helicobacter pylori при хронической инфекции [Mitchell Н., 2002; Hellmig S., 2003; Perez-Perez G.L, 2004; Цуканов В.В., 2007, 2011]. Подобные результаты были выявлены при эпидемиологическом исследовании распространенности язвенной болезни у населения Республики Хакасия [Штыгашева О.В., 2004, 2005]. Было установлено, что распределение цитотоксических штаммов Helicobacter pylori и ассоциация

bacter pylori-сопряженными хроническим гастритом и язвенной болезнью, характеризующиеся снижением базальной и резервной продукции IL-2 у хакасов и увеличением продукции IL-4, IL-10 - у европеоидов. Выявлены нарушения реализации спонтанного и индуцированного перекисью водорода in vitro апоп-тоза лимфоцитов крови, полученных у хакасов и европеоидов, больных Helicobacter pylori-ассоциированными хроническим гастритом и язвенной болезнью. Показано, что иммунофенотипический состав лимфоцитов крови характеризуется снижением числа CD3+-, CD4+- и СБ8+-лимфоцитов у хакасов как при хроническом гастрите, так и при язвенной болезни. У европеоидов изменения субпопуляционного состава лимфоцитов характеризуются увеличением количества CD4+- и С08+-лимфоцитов крови у пациентов с хроническим гастритом и язвенной болезнью.

Впервые проведено исследование распределения частоты полиморфизма генов цитокинов (С+3953Т IL-lß, IL-lRa VNTR, -330 T/G IL-2, -174 G>C IL-6, -251 T>A IL-8) у коренных и пришлых жителей Республики Хакасия. Установлена связь между предрасположенностью к Helicobacter pylori-ассоциированным язвенной болезни и хроническому гастриту и носительством полиморфизмов генов С+3953Т IL-lß, IL-lRa VNTR, -330 T/G IL-2, -174 G>C IL-6, -251 T>A IL-8 у хакасов и европеоидов. Впервые выявлены ассоциации между носительством полиморфизма генов интерлейкинов и инфицированием этиологически-значимыми для развили.язвенной болезни генотипами возбудителя (cagA Helicobacter pylori - у хакасов и vac A sls2 Helicobacter pylori - у европеоидов).

Теоретическая и практическая значимость. Результаты проведенного исследования позволили выявить взаимосвязь между генетическими особенностями патогена и ДНК-маркеров вовлеченности полиморфных вариантов генов цитокинов, их роль в иммунопатогенезе Helicobacter pylori-ассоциированных хронического гастрита и язвенной болезни с учетом этно-популяционных различий у коренного и пришлого населения Республики Хакасия.

Полученные фундаментальные знания об иммуногенетических факторах, обладающих протективным эффектом и определяющих риск прогрессирования и хронизации язвенной болезни и хронического гастрита представляют основу для разработки новых подходов к прогнозированию клинического течения Helicobacter pylori-ассоциированных заболеваний, у хакасов и европеоидов, а также технологии персонализированной терапии иммунных нарушений. Идентификация полиморфизмов генов позволит в дальнейшем обоснованно определить показания для назначения эрадикационной терапии, что является достаточно важным фактором в условиях возрастающей резистентности к антибиотикам.

Положения, выносимые па защиту:

1. Различия гастродуоденальной патологии (хронического гастрита, язвенной болезни) у европеоидов и хакасов обусловлены генетическими особенностями Helicobacter pylori. V хакасов при язвенной болезни превалируют cagA, при хроническом гастрите - m2 vacA штаммы Helicobacter pylori. У европеоидов при язвенной болезни чаще встречаются sls2 vacA, при хроническом гастрите - ml vacA штаммы Helicobacter pylori.

2. Нарушения функциональных свойств компонентов локального (на уровне органа-мишени) и системного иммунитета у пациентов с хроническим гастритом и язвенной болезнью, ассоциированными с Helicobacter pylori, носят однонаправленный характер и различаются у представителей разных этнических групп (хакасы, европеоиды).

3. Распространенность полиморфизмов генов цитокинов у коренного и пришлого населения Республики Хакасия различается. У хакасов риск развития язвенной болезни ассоциирован с полиморфизмами -330 T/G IL-2 (генотип GG) и -251 Т>А IL-8 (генотип А А); у европеоидов - с С+3953Т IL-ip (генотип СС), IL-IRa VNTR (генотип R2R3) и -174 G>C IL-6 (генотип СС). Предикторами хронического гастрита у хакасов являются полиморфизм гена - С+3953Т IL-ip (генотип СТ); у европеоидов - IL-IRa VNTR (генотип R2R3) и -330 T/G IL-2 (генотип GT).

Апробация и реализация работы. Результаты проведенного исследования докладывались и обсуждались на межрегиональной научно-практической конференции «Этносы развивающейся России: проблемы и перспективы» (Абакан, 2008, 2011), научной конференции с международным участием, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Е.Ф. Ларина «Нейрогуморальные механизмы регуляции органов пищеварительной системы в норме и патологии» (Томск, 2007), международной конференции «Генетика человека и патология» (Томск, 2007), VIII, EX, X, XI Восточно-Сибирских гастроэнтерологических конференциях с международным участием «Клинико-эпидемиологичсские и этно-экологические проблемы заболеваний органов пищеварения (Красноярск, 2008; Иркутск, 2009; Абакан, 2010; Иркутск, Чита, 2011), Всероссийской научной конференции «Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» (Санкт-Петербург, 2008), XI, XII, XIII, XIV научно-практических конференциях «Актуальные проблемы медицины» (Абакан, 2008; 2009; 2010; 2011), итоговой научно-практической конференции ГУ НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН «Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири» (Кызыл, 2008; Абакан, 2009; Красноярск 2010), XXIth, XXIIth, XXIIIth, XXIVth International Workshop on Helicobacter and related bacteria in chronic digestive inflammation and gastric cancer (Рига, 2008; Порто, 2009; Роттердам, 2010; Дублин, 2011), XIV и XV Российских Гастроэнтерологических Неделях (Москва, 2008; 2009), Всероссийской научно-практической конференции «Вопросы патогенеза

типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2009; 2010), Всероссийской конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные экологические и клинические аспекты» (Новосибирск, 2009), Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» (Красноярск, 2010; Абакан, 2011), Третьем съезде военных врачей медико-профилактического профиля Вооруженных сил Российской Федерации (Санкт-Петербург, 2010), Международной конференции «3-е тысячелетие: Взгляд молодых ученых» (Санкт-Петербург, 2010), XII International Euroasian Congress of Surgery and Gastroenterology (Баку, 2011).

Исследование выполнено в рамках проекта ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (проект «Разработка технологической платформы молекулярной диагностики и лечения социально значимых заболеваний и подготовка на ее основе научно-исследовательских кадров для молекулярной медицины», ГК № 02.740.11.0311; фанта РФФИ № 09-04-98011 р_сибирь._а - Региональный конкурс Сибирь «Исследование роли патогенных фаеторов Helicobacter pylori для превенции язвенной болезни и рака желудка у коренного и пришлого населения Хакасии» (2009-2010).

Основные положения и выводы диссертационной работы используются в учебном процессе кафедры фундаментальной медицины и гигиены в курсе «Патофизиология», в курсе «Микробиология, иммунология и вирусология», кафедры внутренних болезней для студентов, обучающихся по специальности «Лечебное дело» Медико-психолого-социального института ФГБОУ ВПО «ХГУ им. Н.Ф. Катанова»; внедрены л. учебный процесс кафедры фундаментальных основ клинической медицины ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцраз-вития России в разделах «Современные проблемы медико-биологической науки» и «Молекулярные основы патологии».

Публикации. По теме диссертации опубликованы 64 работы, из них 15 статей в ведущих рецензируемых журналах и изданиях, определенных ВАК РФ, монография «Гены и болезни хакасов» и 45 статей и тезисов в материалах конференций, конгрессов и съездов.

Личный вклад автора. Автором были выполнены следующие этапы работ: анализ данных отечественной и зарубежной литературы по теме диссертации, выделение и культивирование лимфоцитов крови, оценка содержания TNFo, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 в сыворотке крови и в супернатантах клеточных культур методом иммуноферментного анализа, оценка апоптотической гибели лимфоцитов крови (спонтанного и индуцированного перекисью водорода), выделение ДНК и проведение рестрикционного анализа полиморфизма генов интерлейкинов С+3953Т IL-lß, ILl-Ra VNTR, -330 T/G IL-2, -174 G/C IL-6, -251 T/A IL-8, выделение ДНК из биоптатов слизистой оболочки желудка и определение субтипов cagA, sls2 и mlm2 vacA Helicobacter pylori методом поли-меразной цепной реакции, статистический анализ результатов, написание диссертации.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 256 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов и библиографического списка. Работа содержит 63 рисунка и 51 таблицу. Библиографический указатель включает 363 источника (98 - отечественных и 265 -иностранных).

ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В основу работы положены результаты комплексного клинико-лабораторного обследования 201 (102 мужчин и 99 женщин) больного хроническим гастритом и язвенной болезнью, в возрасте от 18 до 55 лет (средний возраст - 42,0±4,1 года). Обследованный контингент представлен двумя популяциями: хакасы (монголоиды или коренное население) и остальные жители Республики Хакасия. С учетом того, что во второй популяции более 95 % составляли русские, украинцы и белорусы, мы обозначили данную группу как «европеоиды». В качестве синонима мы применяли термин «пришлое население»,

Набор клинического материала осуществлялся при непосредственном участии врачей ГУЗ «Хакасская Республиканская больница им. Г.Я. Ремишев-ской»: д-ра мед. наук, врача высшей категории, заведующей Ш терапевтическим отделением (1993-2009 гг.) О.В. Штыгашевой, врача этого же отделения H.A. Россовай, канд. мед. наук, врача высшей категории, заведующего эндоскопическим отделением H.H. Буторина, врача высшей категории, заведующего клинико-диагностической лабораторией В.М. Иптышева.

Ряд обследованых пациентов находились на стационарном лечении в III терапевтическом отделении ГУЗ «Хакасская Республиканская больница им. ГЛ. Ремишевской» (главный врач - В.Ф. Костюш). Также были обследованы жители Таштыпского (Матур, Анчуль, Таштып), Аскизского (Усть-Есь, Есино, Усть-Чуль, Оггы, Нижняя и Верхняя Тея, Иммыш, Кызлас) и Ширинского (Шира, малый Спирин, Топаново) районов Республики Хакасия в ходе научно-медицинских экспедиций (ноябрь 2007 г., март 2008 г.).

Исследование проводилось на кафедре фундаментальной медицины и гигиены ФГБОУ ВПО «ХГУ им. Н.Ф. Катанова» (ректор - д-р мед. наук О.В. Штыгашева, г. Абакан), в Научно-образовательном центре молекулярной медицины ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России (ректор - академик РАМН, д-р мед. наук, профессор В.В. Новицкий, г. Томск). Иммуногисто-химическое исследование выполнено под руководством заведующего кафедрой патологической анатомии с курсом клинической патологии д-ра мед. наук, профессора A.B. Кононова ГБОУ ВПО ОмГМА Минздравсоцразвития России

(ректор - д-р мед. наук, профессор А.И. Новиков, г. Омск). Рестрикционный анализ был выполнен на базе лаборатории популяционной генетики НИИ медицинской генетики СО РАМН под руководством д-ра биол. наук В.А. Степанова (директор - академик РАМН, д-р мед. наук, профессор В.П. Пузырев, г. Томск) и на кафедре фундаментальной медицины и гигиены ФГБОУ ВПО «ХГУ им. Н. Ф. Катанова».

В I группу обследованных был включен 71 пациент (36 хакасов и 35 европеоидов) с диагнозом язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки (ЯБ), во II группу - 130 пациентов (61 хакас и 69 европеоидов) с хроническим поверхностным антральным гастритом (ХГ).

Диагноз ЯБ устанавливался в период обострения заболевания на основании клинических, эндоскопических и морфологических данных. Материал для морфологического исследования забирался во время ЭФГДС с прицельной биопсией из пилорического отдела, большой кривизны и малой кривизны (области угла) тела желудка аппаратом «Olympus-10» (Япония). Для исследования брали 3 биоптата из антрального отдела и тела желудка в каждой контрольной точке на границе здоровой и пораженной ткани.

Диагноз ХГ в острый период заболевания устанавливался при морфологическом исследовании биоптатов слизистой из трех отделов желудка (пилориче-ский отдел, малая кривизна, большая .кривизна) в соответствии с классификацией, разработанной на основе Сиднейской системы [Dixon M.F., 2005].

Обязательным критерием включения в группу исследования было наличие у пациентов Helicobacter pylori (HP). Больным, включенным в группы исследования, не должна была проводиться эрадикационная терапия, а также лечение следующими препаратами: антибактериальными, нестероидными противовоспалительными, ингибиторами протонной помпы, кортикостероидами (в течение шести предшествующих месяцев). Обязательным было информированное согласие на участие в исследовании.

Контрольной группой служили 60 здоровых доноров-добровольцев (30 хакасов и 30 европеоидов), сопоставимых по полу и возрасту.

Материалом для исследования являлась венозная кровь и биоптаты слизистой оболочки желудка. Кровь забирали утром натощак из локтевой вены в количестве 10 мл в пробирку, содержащую 2,5 % раствор ЭДТА. Биоптаты для выделения ДНК помещали в сухой эппендорф и затем замораживали при температуре -20 "С. Для гистологического исследования биопсийный материал фиксировали в 10 % нейтральном формалине, забуференном по Р. Лилли.

На первом этапе исследования проводили идентификацию HP. Присутствие бактерий должно было быть подтверждено с помощью хотя бы одного из четырех методов: быстрого уреазного теста, серологического - определение

специфических IgG HP в сыворотке крови («Им-Ди Спектр», г. Новосибирск), бактериоскопического исследования биоггтатов слизистой оболочки желудка и/или определения видов и субтипов HP cagA, vacA si, vacA s2, vacA ml, vacA m2 в биоптатах слизистой оболочки желудка методом ПЦР («Хеликопол» НПФ «Литех», г. Москва) (табл. 1).

На втором этапе исследования проводили оценку наличия маркеров CD4+ (клон RTU-CD4-1F6 «Novocastra», Великобритания), CD8+ (клон RTU-CD8-295 «Novocastra», Великобритания), CD20+ (клон L26 «DAKO», Дания), Ki-67 (клон «М1В-1 DAKO», Дания), Вс1-2 (клон 124 «DAKO», Дания), СРР-32 (клон JHM62 «Novocastra», Великобритания) в лимфоцитах клеточного инфильтрата слизистой оболочки желудка в биоптатах иммуногистохимическим методом. Ядра клеток докрашивали гематоксилином Майера в течение 15 сек. -1 мин. Учет содержания маркеров в мононуклеарных клетках собственной пластинки слизистой оболочки желудка проводили определением процента положительно окрашенных клеток (с ядерной и цитоплазматической метками в зависимости от использованного маркера) (табл. 1).

В крови оценивали иммунофенотипический состав лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD8+) методом проточной лазерной цитофлуориметрии с применением моноклональных антител («R&D Systems», США). Параметры напряжения для регистрации показателей на проточном цитометре задавали согласно указаниям в инструкции к набору. Результаты выражали в относительных (%) и абсолютных (тыс./мкл) значениях.

Содержание цитокинов (TNFa, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10) в сыворотке крови определяли методом ИФА согласно приложенной инструкции («Ргосоп», г. Санкт-Петербург). Затем проводили оценку содержания цитокинов (IL-2, IL-4, IL-10) в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов крови (без добавления митогена для определения спонтанной продукции цитокинов и с добавлением 10 мкг/мл фитогемагглютинина (ФГА) («Difco», Германия) для активации лимфоцитов при определении индуцированной продукции цитокинов (Хаитов Р.М., 2005]). Учет результатов проводили с использованием спектрофотометра Immunochem 2100 («ThermoLabSistems», Финляндия). Результаты выражали в пкг/мл.

Оценивали спонтанный и индуцированный апоптоз лимфоцитов крови. Для индукции апоптотической гибели использовали неспецифический индуктор апоптотической гибели - перекись водорода в концентрации 0,01 %. Учет апоптотической гибели лимфоцитов крови проводили с использованием световой микроскопии и окрашивания гематоксилин-эозином [Меньшиков В.В., 1997]. При анализе использовали критерии, характеризующие кариопатологи-ческие и цитопатологические изменения в клетках.

Таблица 1

Распределение здоровых доноров и пациентов в зависимости от методов исследования

Методы исследования Европеоиды Хакасы

Здоровые дошры Больные Здоровые доноры Больные

ХГ | ЯБ ХГ | ЯБ

1. Идентификация Helicobacter pylori

Быстрый уреазный тест Не проводилось 69 35 Не проводилось 61 36

Цитологический метод определения НР в мазках-отпечатках биоптатов слизистой оболочки желудка Не проводилось 20 20 Не проводилось 20 20

Определение специфических ДО к НР в сыворотке крови метолом иммуно-ферментаого анализа 30 69 35 30 61 36

Определение видов и субтипов НР в биоптатах слизистой оболочки желудка методом полимеразной цепной реакции Не проводилось 29 18 Не проводилось 27 21

IL Оценка морфо-фуякциональньа свойств слизистой оболочки желудю

Морфометрия структурных элементов слизистой оболочки желудка Не проводилось 30 19 Не проводилось 28 22

Определение маркеров апоптоза (Вс1-2, СРР-32) и пролиферации (К>67) в биоптатах методом иммуно-гистохимии Не проводилось 20 20 Не проводилось 20 20

Определение СС>-маркеров (СГН+, С08+, С020+) в биоптатах слизистой оболочки желудка методом иммуно-гистохимии Не прОвск" дилось 20 20 Не проводилось 20 20

III. Оценка клеточных и молекулярно-генггических показателей нмм уиитета

Определение общего количества лимфоцитов крови 30 60 35 30 60 36

Оценка CD-маркеров (CD3+, CD4+, CD8+) в лимфоцитах крови методом проточной шпофлуориметрии 20 25 20 20 24 21

Определение уровней IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, TNFa в сыворотке крови методом имму но ферментного анализа 20 60 35 30 60 35

Определение спонтанпой и индуцированной (ФГА) цитокинпродуцирую-щей способности лимфоцитов 1L-2, IL-4, IL-10 в супернатантах методом иммуноферментного анализа 20 20 20 20 20 20

Оценка спонтанного и индуцированного (перекись водорода) апоптоза лимфоцитов крови методом световой микроскопии 30 60 35 30 60 36

Анализ полиморфизма генов интер-лейкинов IL-ip, IL-IRa, IL-2. IL-4, IL-6, IL-8 методом рестрикциомного анализа 50 60 35 50 60 36

Морфологически апогттоз проявляется в конденсации и маргинации хроматина, уменьшении объема клетки, пуэырчатости и фрагментации клеточного ядра [Allen R.T., 1997; Kroemer G., 2009]. Подсчитывали не менее 200 клеток, учет результатов проводили путем определения процента клеток с апоптотиче-ской морфологией (табл. 1). Для сравнительного анализа степени прироста индуцированного апоптоза в разных группах определяли апоптотический индекс (АИ) как отношение между разницей спонтанного и индуцированного апоптоза к спонтанному, выраженное в процентах.

Полученные показатели подвергали статистическому анализу. Результаты измерений представлены в виде медианы (Me) и интерквартильного размаха в виде 25 и 75 процентилей (Q25 и Q75). Для проверки нормальности распределения данных использовали критерий Колмагорова-Смирнова. Для выявления статистической значимости различий показателей в сравниваемых группах использовали непараметрические критерии: W-критерий Вилкоксона для независимых выборок и Т-критерий Вилкоксона - для зависимых выборок. Различия считались достоверными при уровне значимости р<0,05.

На третьем этапе исследования был проведен анализ полиморфизма генов цитокинов (IL-lß, IL-lRa, IL-2, IL-6, IL-8) методом рестрикционного анализа продуктов амплификации специфических участков генома (табл. 1). ДНК из клеток крови выделяли фенольным методом. Смесь для амплификации содержала: по 0,5 мкл R- и F-праймера (С+3953Т IL-lß F: gttgtcatcagactttgacc и R: ttcagttcatatggaccaga; IL-lRa VNTR F: ctcagcaacactcctat и R: tcctggtctgcaggtaa; -330 T/G IL-2 F: cacaatatgctattcacatgttcagttagtcata и R: taccttcatttttcctcttctgatg; -174 G>C IL-6 F : tgacttcagctttactctttgt и R : ctgattggaaaccttattaag; -251 1>A IL-8 F: tgttctaacacctgccactctagta и R : ttatgcaccctcatcttttcattat) («Сибэнзим», г. Новосибирск). К амплификату добавляли смесь для рестрикции, содержащую фермент (Taq I для С+3953Т IL-lß, FauND I для -330 T/G IL-2, SfaNI для -174 G>C IL-6, Mfe I для -251 T>A IL-8), 0,15 мкл BSA, 1,5 мкл буфера из расчета на одну пробу. Инкубировали в зависимости от температурного оптимума фермента при 37 или 56 °С в течение 12 ч.

Детекцию продуктов амплификации проводили в 4 % агарозном геле, в качестве маркера размера ДНК использовали плазмиду pUC19, расщепленную ре-стриктазой Mspl («Сибэнзим», г. Новосибирск). Распределение генотипов по исследованным полиморфным локусам проверяли на соответствие равновесию Харди-Вайнберга (РХВ) с помощью критерия хг- Для проверки значимости общей меры связи использовали критерий х2 Мантела-Ханзела, для оценки значения критерия отношения шансов (OR - Odds Ratio) с расчетом для него 95% доверительного интервала (CI - Confidence Intervals) [McHugh M.L., 2009].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Генетические особенности Helicobacter pylori у хакасов и европеоидов, страдающих хроническим гастритом и язвенной болезнью

В России инфицированность HP взрослого населения колеблется в пределах 50 80 %, а в некоторых регионах приближается к 100 %. Показатели распространенности инфекции у детей не отличаются от таковых у взрослого населения [Лазебник Л.Б., 2006; Хомерики С.Г., 2006]. В Республике Хакасия этот показатель составляет 96,2 % для европеоидов и 96,4 % для хакасов [Штыгаше-ва О.В., 2005].

Разную географическую распространенность имеют и субтипы HP (рис. П.

Рис. L Распространенность аллельных вариантов vac А субтипов Helicobacter pylori в мире (по данным R Morales-Espinosa, 1999, L, J A van Doom, 1999; X.-J. Chen, 2001)

Изучение распределения генотипов HP показало, что у европеоидов cagA штаммы достоверно чаще встречались у больных ЯБ, чем при XI4 (94,4 и 79,3 %, соответственно, х2~9,6; р<0,05). VacA штаммы встречались у 100,0 % больных ЯБ и XI'. У европеоидов, больных ЯБ и ХГ, содержание vacA si штаммов HP не имело различий. Частота субтипов s2 и ml vacA штаммов HP преобладала у больных ХГ, а при ЯБ - vacA s 1 s2 и m2, различия носили статистически значимый характер. Смешанные изоляты vacA mlm2 достоверно чаще встречались у больных ЯБ, по сравнению с их содержанием у больных ХГ (х2=20,7; р<0,05).

У хакасов, больных ЯБ, доминировали cagA штаммы HP (рис. 2). VacA штаммы HP были одинаково высоко распространены у хакасов как с ЯБ, так и с ХГ. Однако соотношение распределения vacA штаммов в обследованных популяциях различалось. Большая часть больных (как ЯБ, так и ХГ) были инфицированы смешанными изолятами HP s 1 s2 vacA. Однако встречались больные.

инфицированные только или только уасА НР. При этом, если частота уасА %2 штаммов не различалась у больных ЯБ и ХГ, то чаще диагностировались у больных ХГ, чем у больных с ЯБ. Распространенность уасА ш1 не имела статистически значимых различий у больных ЯБ по сравнению с больными ХГ. Содержание уасА ш2 у хакасов с ЯБ было достоверно ниже, по сравнению с больными ХГ (х2=12,5; р<0,05). Содержание сразу же двух видов штаммов НР - уасА т1ш2 - не имело статистически значимого увеличения значений показателей у больных ЯБ, по сравнению с их содержанием у больных ХГ.

При межпопуляционном сравнении нами было выявлено, что са§А штаммы НР при ХГ чаще встречались у европеоидов, чем у хакасов (х2=36,2; р<0,05; рис. 2). При ЯБ частота встречаемости са£А штаммов НР не имела статистически значимых различий между европеоидами и хакасами.

0 Хакасы Ü Европеоиды

cagA

vacA

vacAsI

\acAs2 vacAsls2 vacAml

»acAm2 vacAmlm2

100 80

60 -t—H 40 20

0 Хакасы □ Европеоиды

Ш

Ь.

cagA

vacA

vacAsI vacAs2 vacAsIs2 vacAml vacAm2 vacAmlm2

Рис. 2. Распределение генов cagA и vacA Helicobacter pylori у больных язвенной болезнью (а) и хроническим гастритом (б) среди хакасов и европеоидов. * - р<0,05 - достоверность различий при сравнении значений показателей у хакасов и европеоидов

При ХГ нами было выявлено достоверное увеличение частоты генотипа vacA ml у европеоидов, по сравнению с его встречаемостью у хакасов [х2=66,9 (р<0,05)], и, наоборот, достоверное снижение частоты генотипов vacA m2 и mlm2 у европеоидов, по сравнению с хакасами [х2=60,6 (р<0,05) и х2=11,1 (р<0,05), соответственно]. При ЯБ у хакасов и европеоидов подобных закономерностей выявлено не было (рис. 2).

Значения критерия отношения шансов OR=5,2 при 95 % CI (2,3-11,6) и OR=3,3 при 95 % CI (1,7-6,2) позволили предположить о наличии положительной ассоциации между инфицированием mlm2 и sls2 субтипами vacA HP и риском развития ЯБ у европеоидов.

У хакасов, учитывая значения критерия отношения шансов, нами было высказано предположение о взаимосвязи инфицирования cagA штаммами ИР и риске развития язвенной болезни - OR=32,3 при 95 % CI (11,3-99,6). Риск развития ХГ у хакасов, предположительно, был связан с vacA m2 штаммами HP (OR=2,8 при 95 % CI (1,5-5,1)).

В настоящее время доказано, что между штаммами cagA и vacA sl ИР существует четкая корреляция, то есть большинство vacA sl позитивных штаммов HP являются носителями cagA-rena - штаммы I типа (цитотоксические). Для них характерно более агрессивное воздействие на макроорганизм (высокая вирулентность, адгезия и внутриклеточная_рцвазия). Интерес представляет тот факт, что штаммы I типа ИР стимулируют наибольшую секрецию IL-8 эпите-лиоцитами слизистой оболочки желудка по сравнению со штаммами II типа HP (vacA+/cagA-). Цитотоксические штаммы вызывают выраженное воспаление в слизистой оболочке желудка, способствуют развитию деструктивных процессов - язвообразованию, за счет увеличения инфильтрации нейтрофклами, выделения ими свободного кислорода и развития окислительного стресса. Показано, что vacA slml в присутствии гена cagA HP увеличивает риск развития ЯБ [Bindayana K.M., 2010]. В отличие от них штаммы II типа (vacA+/cagA-) очень быстро фагоцитируются, что снижает их патогенное воздействие на организм.

Сопоставляя полученные нами результаты с данными литературы, можно отметить, что при обследовании хакасов было выявлено сходство с распространенностью инфекции в других азиатских странах [Dabiri Н., 2009; Liao Y.L., 2009]. Так, например, во Вьетнаме CagA штаммы HP встречаются у 96,2 % жителей Ханоя, в то же время, риск развития ЯБ связан с vacA ml генотипом HP [Nguyen T.L., 2010]. Китайские ученые показали в своем исследовании ассоциацию ЯБ с аллелем vacA с sla HP [Liao Y.L., 2009].

Генетические различия этиологического фактора ЯБ и ХГ у хакасов и европеоидов имели отражение и в клиническом течении заболеваний. При ретроспективной оценке жалоб и анамнеза нами были показаны различия в частоте

обострений и длительности заболевания. Так, в ходе опроса больные ЯБ предъявляли жалобы на голодные боли и ночные боли - язвенноподобная форма диспепсии (европеоиды - 22,6 % и хакасы - 12,3 %, р<0,05); тошноту и отрыжку - дискинетическая форма диспепсии (европеоиды - 44,9 % и хакасы - 48,3 %); боль в эпигастрии - неспецифическая форма диспепсии (европеоиды - 32,5 % и хакасы - 39,4 %). Пациенты с ХГ в ходе опроса предъявляли жалобы на быструю утомляемость, раздражительность (43 % хакасов и 52 % европеоидов), слабость, головную боль (18 % хакасов и 24 % европеоидов), боль в области эпигастрия (72 % - хакасов и 81 % европеоидов), диспепсические расстройства (92 % хакасов и 95 % европеоидов).

В целом, анализ клинических проявлений HP-ассоциированных заболеваний у европеоидов и хакасов продемонстрировал выраженные этнические различия в структуре ЯБ. У европеоидов ЯБ чаще регистрировалась с более тяжелым характером течения, что может быть связано с присутствием гена vacA sls2. У хакасов более легкое течение ЯБ ассоциировано с наличием гена cagA HP. Таким образом, мы еще раз подтвердили тезис о взаимосвязи между генетическими особенностями инфекта у хакасов и европеоидов, страдающих Helicobacter pylori-ассоциированной гастродуоденальной патологией, и клиническими фенотипами заболеваний.

2. Закономерности н особенности изменения локального м системного иммунитета у хакасов и европеоидов, страдающих Helicobacter pylori-ассоциированными хроническим гастритом и язвенной болезнью

Инициация антибактериальной защиты организма связана с выделением HP в окружающую его среду продуктов микробного происхождения, что приводит к выработке Thl-цитокинов (IL-1, IL-8, TNFa, IFN7) [Meyer F., 2000; Та-guchi А., 2005; D'Ellios М.М., 2007]. Одновременно инициируется запуск Th2-пути иммунного ответа, сопряженный с экспрессией лимфопоэтина эпителиальными клетками, хемокина М1Р-За и фактора активации B-клеток дендритными клетками [Kido М., 2010]. По мнению R. Göll et al. (2005), различия Т-клеточного ответа можно рассматривать как различия в активации иммунной защиты при HP-ассоциированных ХГ и ЯБ. Вместе с тем некоторые авторы считают, что инициация воспалительного процесса при ХГ и ЯБ имеет выраженные различия только в раннем периоде инфицирования, а соответствующий цитокиновый профиль предопределяет различия позднего периода инфекции [Царегородцсва Т.М., 2003].

В результате CD-типирования лимфоцитов слизистой оболочки желудка было выявлено, что у европеоидов с ЯБ значения количества CD4+- и CD8+-

лимфоцитов в биоптатах слизистой оболочки антрального отдела желудка составили 26,0±0,8 и 19,3±0,7 %, соответственно. Их количество было выше, чем у больных ХГ (17,8±0,9 и 16,5±0,4 %, соответственно). Увеличение числа С04+-лимфоцитов у пациентов с ЯБ носило достоверный характер (р<0,05). Доля С020+-лимфоцитов у пациентов с ЯБ была ниже, чем у больных ХГ (32,4±0,7 и 36,4±0,8 %, соответственно, р<0,05).

У хакасов с ЯБ отмечалось увеличение числа С04+- и СЮ8+-лимфоцитов (33,6±С,9 и 16,3±0,5 %), по сравнению с их количеством у пациентов с ХГ (24,1 ±0,4 и 12,1±0,2 %, соответственно, р<0,05) (рис. 3). Количество С020+-лимфоцитов у пациентов с ЯБ составило 38,8±0,9 %, что было выше относительно данного показателя у пациентов с ХГ (34,4±0,7 %),

Рис. 3. Микрофотография препарата слизистой оболочки желудка антрального отдела больного К., хакаса, 41 год, диагноз: язвенная болезнь. Па препаратах - метки, содержащие маркеры С 04+-лимфоцитов (1) и СП8+-лимфоцитов (2). Иммуногистохимический метод с докраской гематоксилином, ув. х 400 (а), х 900 (б)

При межпопуляциоином анализе было показано, что у хакасов, больных ЯБ и ХГ, доля С04+-лимфоцитов в слизистой оболочке желудка была достоверно выше, чем у европеоидов (р<0,05). Относительное количество СБ20+-лимфоцитов было статистически значимо выше у хакасов с ЯБ, по сравнению с европеоидами (р<0,05). Среди пациентов с ХГ у европеоидов число С08+- и С020+-лимфоцитов было достоверно выше, чем у хакасов (р<0,05).

ТЫ-ответ играет наиболее значимую роль в антибактериальной защите, так как препятствует колонизации НР в слизистой оболочке. Однако при длительном воспалительном процессе вместо ограничения роста патогена происходит гибель собственных клеток, в то время как детерминация ТЪ2-пути протекает без выраженного повреждения слизистой [Кондрашина ЭЛ., 2002;

Ивашкин В.Т., 2008; Кононов A.B., 2009]. В связи с этим увеличение численности популяции С020+-лимфоцитов у хакасов больных ЯБ может рассматриваться как протективная форма антихеликобактерной защиты.

Факторами, объясняющими выявленные нами различия иммунного реагирования у хакасов и европеоидов, больных ЯБ и ХГ, может быть недостаточное активирующее либо депрессивное действие HP на иммунную систему (низкая иммуногенность мембранных антигенов и продуктов жизнедеятельности HP, явление бактериальной мимикрии). После инвазии ИР в эпителиоциты микроорганизм становится недоступным для антител. В этот момент наибольшее значение приобретает ТЫ-путь иммунного ответа, в результате которого возможно уничтожение эпителиальных клеток вместе с внутриклеточными патогенами. Трансформация Th-ответа сопровождается изменением содержания цито-кинов в крови и слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта. Соответственно, развивается цитокин-опосредованная поляризация иммунного ответа по Thl-пути. Определенную роль в изменении численности СЕ)4+-лимфоцитов в слизистой оболочке желудка играет TGF-ß, вырабатываемый эпителиальными клетками в ответ на инфекцию HP [Beswick E.J., 2011].

Фундаментальным механизмом, регулирующим постоянство клеточного состава иммунной системы, является апоптоз. Модуляция программированной гибели, индуцированная ИР, детерминирует прогрессию ХГ и ЯБ [Labbé К., 2008; Chattopadhyay R., 2010].

Исследование содержания про- и антиапоптических белков (СРР-32 и Bcl-2, соответственно), а также антигена пролиферации (Ki-67) в лимфоцитах слизистой оболочки желудка у хакасов и европеоидов с ЯБ и ХГ позволили зарегистрировать различия значений данных показателей в зависимости от клинических форм заболевания. У хакасов и европеоидов уровень Ki-67 имел тенденцию к увеличению у пациентов с ЯБ (1,6±0,2 и 1,3±0,7 %, соответственно) по сравнению с таковыми у больных ХГ (1, 1±0,2 и 0,8±0,2 %, соответственно).

Содержание Вс1-2 в лимфоцитах собственной штастинки слизистой оболочки желудка было наибольшим при ЯБ (28,7±1,2 % - у хакасов, 30,9±1,6 % -у европеоидов), по сравнению с его уровнем в лимфоцитарных клетках у больных ХГ (21,4±1,3 % - у хакасов, 24,3±1,8 % - у европеоидов, р<0,05). Необходимо отметить, что частота встречаемости молекул Вс1-2 в лимфоцитах была выше у европеоидов, по сравнению с хакасами.

Более значимая частота встречаемости СРР-32 (каспаза-3) была отмечена у европеоидов, больных ХГ (52,1±1,9 %), по сравнению с таковыми у пациентов с ЯБ (38,3±2,7 %, р<0,05). Такая закономерность была характерна для обеих этнических популяций. У хакасов больных ХГ частота встречаемости СРР-32 составила 55,5±2,1 %, у пациентов с ЯБ - 40,0±1,8 % (р<0,05).

Факторами, модифицирующими апоптоз лимфоцитов клеточного инфильтрата слизистой оболочки желудка, выступают HP, интерлейкины и окислительный стресс [Rolig A.S., 2011]. При этом в ранний период инфицирования HP происходит угнетение апоптоза за счет стимуляции экспрессии ингибиторов апогттоза с1АР2, в более позднем периоде - VacA HP-зависимое усиление апоптоза [Kim J.M., 2010]. Эффекты CagA- и VacA-белков сопряжены с транслокацией цитоплазматического белка Вах в митохондрию, высвобождением цито-хрома с и активацией каспазы-3. Вероятно, выявленное нами увеличение содержания антиалоптотического белка Вс1-2 в слизистой оболочке желудка ассоциировано со способностью VacA HP активировать транскрипционный фактор NF-kB. Кроме того, VacA модулирует трансдукцию сигнального пути: активирует р38 МАРК, запускает синтез IL-8, PGE2 и PI3K/Akt, супрессирует активность GSK-Зр [Isomoto H., 2010]. CagA штаммы усиливают Fas-опосредованный апоптоз СТ)4+-лимфоцитов [Souza H., 2006; Wisniewski P., 2008]. В низких концентрациях происходит стимуляция клеточного роста и угнетение апоптоза за счет активации антиапоптотического белка Bcl-2, МАР-киназы и NF-kB. В больших концентрациях CagA+, наоборот, приводит к увеличению аполтотической гибели за счет активации ¡NOS, р53, Вах и каспазы-3 и -8 [Boonyanugomol W., 2010].

При исследовании системного иммунитета нами было выявлено, что ряд показателей у хакасов и европеоидов также различались. У европеоидов, страдающих ЯБ и ХГ, имело место увеличение относительного и абсолютного числа лимфоцитов крови, по сравнению со здоровыми донорами. Кроме того, при ЯБ количество лимфоцитов было ниже, чем при ХГ. У хакасов, наоборот, отмечалось увеличение относительного и абсолютного количества лимфоцитов крови у больных ЯБ, по сравнению с таковыми у здоровых доноров и больных ХГ.

У больных ЯБ, относящихся к европеоидной популяции, было выявлено увеличение числа CD3+ и С04+-лимфоцитов, по сравнению со здоровыми донорами. У больных ХГ было установлено увеличение абсолютных значений количества CD3+- и CD8 ^-лимфоцитов крови, по сравнению с ЯБ. У хакасов, наряду с увеличением числа лимфоцитов крови, нами было выявлено выраженное снижение численности CD3+-, CD4+-, СТ)8+-субпопуляций лимфоцитов, по сравнению с аналогичными показателями у здоровых лиц, причем, при ЯБ указанные изменения были более выражены, чем при ХГ.

Одной из важных причин снижения количества лимфоцитов и/или их субпопуляций может служить угнетение процессов лимфопролиферации, связанные с недостаточностью активирующего сигнала (низкая концентрация активирующих цитокинов либо с гиперпродукция ингибирующих цитокинов) [Царе-городцева Т.М., 2003]. Это может быть обусловлено многими факторами, среди

которых: соотношение рецепторов-агонистов и антагонистов, инактивация циркулирующих цитокинов, величина рН, антиоксидантный потенциал клетки, истощение цитокин-продуцирующей способности клеток при длительной антигенной стимуляции [Ивашкин В.Т., 2008]. Имеет значение и локализация патологического процесса. При локализации язвы в желудке уровень продукции цитокинов ниже, чем при локализации в двенадцатиперстной кишке [Барановский А.Ю., 2001; Звягинцева Т.Д., 2002; Царегородцева Т.М., 2003].

Собственные результаты исследования показали, что содержание 1Ь-8 в сыворотке крови у европеоидов, больных ХГ и ЯБ [210,0 (150,0-527,5) и 225,0 (121,0—390,0) пкг/мл, соответственно], выше, чем у здоровых доноров [169,0 (100,0-198,5) пкг/мл]; при этом наиболее значимое увеличение отмечалось при ЯБ. У хакасов при ХГ уровень 1Ь-8 в сыворотке крови был выше, чем при ЯБ [400,0 (76,3-912,5) и 118,0 (52,5-337,5) пкг/мл, соответственно]. Оба показателя были выше, по сравнению с содержанием 1Ь-8 в сыворотке крови у здоровых доноров [167,5 (44,3-530,0) пкг/мл].

1Ь-8 идентифицируется как маркер «адаптивного иммунитета» на перси-стенцию НР в организме [Шейег в., 2001]. Этот цитокин является ключевым медиатором ТЫ-пути иммунного ответа, фактором дифференцировки и рекрутирования клеток-эффекторов воспаления, следовательно, и выраженности иммунной защиты. При НР-инфекции увеличение концентрации 1Ь-8 стимулирует хемотаксис нейтрофилов. Синтез ГЬ-8 может быть вызван воздействием провос-палительных медиаторов (1Ь-1Р, ТОТа). В свою очередь, 1Ь-8 стимулирует продукцию ТТЧРа, и 1Ь-1р.

В проведенном нами исследовании было выявлено, что у европеоидов и хакасов уровень ТЫГа в сыворотке крови был значительно выше у больных, чем у здоровых доноров (р<0,05). У больных ХГ увеличение ТОТа более значимо у хакасов [1350,0 (400,0-2250,0) пкг/мл], чем у европеоидов [1200,0 (760,0-1900,0) пкг/мл]. При ЯБ концентрация цитокина также была выше у хакасов, чем у европеоидов [1400,0 (520,0-2160,0) и 1000,0 (439,0-1585,0) пкг/мл, соответственно] (рис. 4). Считается, что максимальное содержание ТЫРа отмечается на пике обострения заболевания, при этом стойкое увеличение продукции ТОТа свидетельствует о деструктивно-воспалительных процессах, замедлении репарации, рубцевании язвенных дефектов, усилении апоптотической гибели клеток [Царегородцева Т.М., 2003; Би^тою М., 2010].

Вероятно, что выявленная нами прямая корреляционная взаимосвязь между увеличением уровня продукции ТОТа и снижением численности субпопуляций лимфоцитов (СЭЗ+, С04+, СЭ8+) у хакасов, больных ХГ, можно объяснить ци-ютоксическим влиянием ТОТа на иммунные клетки либо снижением активаци-онного сигнала в результате ТКТа-зависимой гибели эпителиоцитов.

лкг/мл 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 о

0 Хакасы П Европеоиды

ТОТа

И.-2

11-4

П.-6

11.-8

[НО

И Хакасы О Европеоиды

ТОТа

Ш-2

П^»

1Ь-6

1Ь-8

1Н0

Рис. 4. Содержание интерлейкинов в сыворотке крови у хакасов и европеоидов, больных язвенной болезнью (а) и хроническим гастритом (б), * -р<0,05 - достоверность различий при сравнении значений показателей у хакасов и европеоидов

Концентрация 1Ь-6 в сыворотке крови у европеоидов была выше у больных ХГ и ЯБ [75,0 (54,0-113,5) и 69,0 (36,0-105,5) пкг/мл, соответственно], чем у здоровых доноров [34,0 (19,5-104,5) пкг/мл]. У хакасов различий между больными [32,0 (20,0-44,0) пкг/мл при ХГ и 20,0 (8,3-60,0) пкг/мл при ЯБ] и здоровыми донорами [19,0 (10,0—50,0) пкг/мл] выявлено не было. Вместе с тем у хакасов, больных ХГ, была обнаружена обратно пропорциональная зависимость между уровнем 1Ь-6 и числом С1)8+-лимфоцитов у больных.

Считается, что при запуске специфического иммунитета в ответ на инфекционный агент активно увеличивается продукция IL-2, происходит дифферен-цировка ТЫ-лимфоцитов. Снижение продукции IL-2 может свидетельствовать о развитии вторичной иммунологической недостаточности [Rudnicka К., 2011]. Основным фактором в определении дифференцировки стимулированных антигеном наивных С04+-Т-клеток в Th2 является IL-4 [Nasta F., 2006; Khaled W.T.,

2007]. Физиологическим антагонистом и ингибитором ТЫ-ответа также является IL-10, увеличение которого приводит к снижению противоинфекционной защиты и развитию хронического воспаления [Jung М., 2004; Ивашкин В.Т.,

2008].

У европеоидов с ЯБ содержание IL-2 в сыворотке крови составило 139,0 (67,0-256,0) пкг/мл, у больных ХГ - 110,0 (29,5-189,5) пкг/мл, что статистически не отличалось от такового у здоровых доноров - 197,0 (120,0-225,0) пкг/мл. У хакасов наименьшие значения регистрировались у больных ЯБ - 15,0 (3,540,5) пкг/мл (по сравнению с контролем - 140,0 (28,5-500,0) пкг/мл, р<0,05). У больных ХГ содержание цитокина в сыворотке крови составило 28,0 (8,5-50,0) пкг/мл, что также было статистически ниже, чем в контроле (р<0,05). Межпопу-ляционное сравнение показало, что содержание IL-2 при ЯБ и ХГ было достоверно выше у европеоидов, по сравнению с хакасами (р<0,05) (рис. 4).

Содержание IL-4 в сыворотке крови у европеоидов составило при ХГ и ЯБ 350,0 (175,0-568,0) и 241,0 (168,0-370,0) пкг/мл, соответственно, что было достоверно выше, чем в группе здоровых доноров [37,0 (20,5-56,0) пкг/мл, р<0,05]. Среди хакасов было выявлено достоверное увеличение содержания данного интерлейкина при ХГ и ЯБ [262,5 (150,0-410,0) и 220,0 (100,0-400,0) пкг/мл, соответственно], по сравнению с группой здоровых доноров [32,5 (19,0-101,0) пкг/мл, р<0,05]. У европеоидов выше, чем у хакасов, однако, различия не были статистически значимы (рис. 4).

Значения уровней IL-10 в сыворотке крови у европеоидов при ХГ были достоверно выше, по сравнению с таковым у здоровых доноров [425,0 (210,0— 1145,0) и 60,0 (26,0-215,5) пкг/мл, р<0,05, соответственно], в то время как при ЯБ концентрация IL-10 составила 181,0 (90,0-312,0) пкг/мл (р>0,05). У хакасов, больных ХГ, величина содержания в сыворотке крови IL-10 была достоверно выше, по сравнению с уровнем цитокина в контрольной группе [307,5 (175,5600,0) и 32,0 (10,0-250,0) пкг/мл, соответственно, р<0,05]. При ЯБ значения показателя не отличались от такового в контрольной группе [42,5 (7,3-125,0) пкг/мл] и были достоверно ниже, чем у больных ХГ (р<0,05). Сравнительный анализ уровня IL-10 между хакасами и европеоидами показал, что концентрация FL-10 у европеоидов была выше, чем у хакасов; при этом при ЯБ различия носили статистически значимый характер (р<0,05) (рис. 4).

Более полная информация о направлении процесса дифференцировки мо-нонуклеарных лейкоцитов была нами получена при определении спонтанной и стимулированной продукции IL-2, IL-4 и IL-10 лимфоцитами крови. У здоровых лиц спонтанный синтез цитокинов низок, а при индуцированном действии различных стимуляторов (LPS, ФГА и др.) многократно возрастает [Фрейдлин И.С., 1998]. Индуцированная секреция цитокинов характеризует потенциальную (резервную) способность клеток иммунной системы отвечать на стимуляцию различными антигенами [Ржавичева О.С., 2006].

Нами было показано, что у европеоидов, больных ЯБ и ХГ, базальная продукция IL-2 не имела статистически значимых различий с таковой в контрольной группе, в то время как резервная была выше, чем в контрольной группе (табл. 2).

Таблица 2

Спонтанная и ФГА-стимулированная продукция IL-2, IL-4 и IL-I0 мононукпеарными лейкоцитами крови у европеоидов, больных с Helicobacter pylori-ассоциированными хроническим гастритом и язвенной болезнью

Продукция (пкг/мл) Здоровые доноры Больные ЯБ Больные ХГ

IL-2 спонтанная 124,4 (89,4-167,0) 169,0 (118,6-205,6) 113,4 (84,6-237,5)

ФГА- стимулированная 218,9 (189,6-280,0)2 290,0 (234,6-312,9)2 289,5 (210,2-425,1)

IL-4 спонтанная 50,1 (24,8-79,3) 34,9 (20,7-45,8) 69,2 (45,2-89,5)'

ФГА- стимулированная 99,3 (78,9-123,6>2" 78,0 - (64,0-91,8)2 108,6 (75,0-211,7)2

IL-10 спонтанная 5,0 (3,0-6,9) 10,8 (3,9-15,9) 8,5 (4,1-16,4)

ФГА- стимулированная 9,0 (6.5-15,4)2 15,8 (7.8-21.8) 11,3 (7,6-14,0)

Примечание ' - р<0,05 - достоверность различий по сравнению с язвенной болезнью, 1 - р<0,05 - достоверность различий при сравнении спонтанной и ФГА-стимулированной продукции цитокнна

Возможными причинами низкой концентрации 1Ь-2 у хакасов, больных ЯБ и ХГ, может служить высокая рецепторная активность клеток-мишеней (эндо-телиоцитов, эпителиоцитов, париетальных клеток и др.) в очаге воспаления, наличие растворимых рецепторов в кровотоке, эффективно связывающих циркулирующие цитокины. Подтверждением этому служит увеличение ФГА-стимулированной продукции 1Ь-2 у хакасов, больных ЯБ и ХГ (табл. 3).

Нами было установлено, что у хакасов и европеоидов повышена спонтанная и ФГА-стимулированная концентрация цитокинов 1Ь-4 и 1Ь-10 в суперна-тантах мононуклеарных лейкоцитов при ХГ и ЯБ (табл. 2, 3). Данный факт можно рассматривать как фактор, способствующий хронизации заболеваний, связанных с НР-инфекцией.

Таблица 3

Спонтанная и ФГА-стимулированная продукция 1L-2,1L-4 и IL-10 мононуклеарными лейкоцитами крови у хакасов, больных Helicobacter pylori-ассоциированными хроническим гастритом и язвенной болезнью

Продукция (пкг/мл) Здоровые доноры Больные ЯБ Больные ХГ

IL-2 спонтанная 141,7 (39,0-220,0) 45,0 (30,0-112,0) 89,0 (75,1-93,0)

ФГА- стимулированная 190,0 (70,0-279,0) 119,0 (90,0-205,9) 139,0 (112,0-164,9)1

IL-4 спонтанная 35,0 (16,0-44,3) 98,0 (84,0-131,6)' 101,0 (89,0-109,5)1

ФГА- стимулированная 123,3 (69,0-147,6)2 197,0 (176,0-342,7) u 189,0 (167,0-262,0)1,1

IL-10 спонтанная 57,3 (32,0-78,2) 342,9 (289,0-402,0)1 309,0 (239,0-369,8)'

ФГА- стимулированная 128,0 (90,0-134,0)г 509,0 (470,0-549,0) u 443,5 (397,0-535,0)u

--1-■--а---!—*--i--- <--1---

Примечание: - р<0,05 - по равнению с показателями у здоровых доноров, - р<0,05 -

достоверность различий при сравнении спонтанной и ФГА-стимулированной продукции ци-токина.

Определенное значение в дизрсгуляции иммунитета при длительной пер-систенции бактериальных патогенов имеет повышение интенсивности апоптоза клеток иммунной системы. При этом, в зависимости от концентрации, интер-лейкины могут оказывать проапоптотический или антиапоптотический эффект. Под действием IL-2 усиливается индукция клеточных рецепторов и образование FasL и TNFa - рецепторный механизм активации апоптоза. IL-2-индуцированный апоптоз может происходить при участии митохондрий [Чечи-на O.E., 2009]. В высоких концентрациях IL-2 обеспечивает устойчивость клеток к апоптотической гибели, особенно - СЕМ+-лимфоцитов. Инфицирование vacA штаммами HP оказывает иммуносупрессирующее действие на Т-лимфоциты через ингибирующее влияние на клеточную пролиферацию и IL-2 [SewaldX., 2011].

Проведенный нами анализ апоптотической гибели лимфоцитов крови (рис. 5) показал, что у больных ЯБ и ХГ, европеоидов, имеет место достоверное увеличение апоптотически измененных лимфоцитов крови [21,4 (19,4-23,6) и 24,3 (21,8-27,1) %, соответственно], по сравнению со здоровыми донорами [17,9 (16,5-19,0) %, р<0,05]. Число лимфоцитарных клеток крови, подвергшихся индуцированному апоптозу, у европеоидов, больных ЯБ, составило 26,4 (22,028,6) %, у больных ХГ - 29,6 (27,8-33,8) %. Значения обоих показателей были ниже таковых в контроле - 31,6 (27,1-34,8) %, р<0,05.

а б ■ г

Рис. 5. Микрофотографии лимфоцитов крови, полученных у больных, диагноз язвенная болезнь. Представлены - нормальный лимфоцит (а), клетки с признаками спонтанного (6-в) и индуцированного перекисью водорода (г) апоп-тоза. Световая микроскопия, окрашивание гематоксилин-эозином, ув. х 1500

У больных ЯБ, хакасов, значения числа лимфоцитов крови с морфологическими признаками апоптоза составили 18,5 (16,7-20,0) % и были достоверно выше, чем количество апоптотически измененных клеток крови у лиц контрольной группы [15,7 (13,6-16,4) % (р<0,05)]. У больных ХГ апоптоз лимфоцитов соответствовал 14,8 (11,2-21,0) %. Анализ числа клеток, вступивших в индуцированный апоптоз у хакасов, страдающих ЯБ, соответствовал 23,7 (21,927,6) %, у больных ХГ 22,9 (19,8 25,6) %. Оба показателя статистически не отличались от такового у здоровых доноров [27,9 (23,0 30,1) % (р>0,05)].

Для оценки степени прироста индуцированного апоптоза нами был рассчитан апоптотический индекс (АИ): при ЯБ АИ у хакасов соответствовал 36,4 %, в то время как у европеоидов - 16,7 % (р<0,05). У хакасов, больных ХГ, АИ составил 63,8 %, у европеоидов 33,3 % (р<0,05). У здоровых доноров АИ не имел достоверных отличий у хакасов, по сравнению со значениями указанных параметров у европеоидов (85,0 и 79,1 %, соответственно).

Безусловно, что процесс индукции апоптоза клеток локального иммунитета связан с непосредственным взаимодействием эффекторов воспаления с HP, развитием окислительного стресса, в то время как апоптоз лимфоцитов крови является результатом воздействия других апоптозмодифицируюших факторов,

В частности, апоптоз клеток иммунной системы может быть инициирован не только самим возбудителем, но и нарушениями метаболических процессов макроорганизма. Необходимо отметить, что в ряде случаев Thl-лимфоциты более чувствительны к апоптозу, чем ТЬ2-клетки. Возможно, это следует рассматривать как дополнительный механизм ограничения возможных патологических последствий I -опосредованного иммунного ответа [Morris S.C., 2009] и формирования различий в реализации апоптоза у больных ЯБ и ХГ" коренного и пришлого населения Хакасии.

3. Распределение аллельных вариантов и генотипов генов цитокинов у хакасов и европеоидов, страдающих Helicobacter pylori-

ассоциирова иными хроническим гастритом и язвенной болезнью

Известно, что способность реализовывать адекватный иммунный ответ является отражением генетической структуры макроорганизма [Frodham A.J., 2004]. Наиболее распространенным вариантом наследственной предрасположенности является сочетание у индивида аллелей генов, совокупный эффект которых определяет особенности иммунитета, повышающих риск развития инфекционных заболеваний [Casanova J.-L., 2002; Гончарова И.А., 2006]. В литературе данные касательно частоты встречаемости определенных полиморфизмов генов и их ассоциации с HP-зависимыми заболеваниями довольно противоречивы. Одни авторы не обнаружили статистически значимой связи между IL-ip (-511 С/Т и -31 Т/С), 1L-6 (-174 G/C), IL-8 (-251 Т/А, +396 T/G и +781 С/Т), IL-10 (-819 С/Т, -592 С/А, -1082 A/G) и TNFA (-308 G/A, -238 G/A) и риском развития HP-ассоциированной гастродуоденальной патологии [Кашап-gar F., 2006; Kim N., 2006; Shin W. G., 2008]. Другие, наоборот, придают большое значение в развитии HP-индуцированных заболеваний наличию определенных полиморфизмов генов цитокинов [Rad R., 2004; Wu M.S., 2003; Lu C.C., 2005; Lu W„ 2005; Zambón C.F., 2005; Hollegaard M.V., 2006].

Оценка распределения полиморфизмов C+3953T гена IL-ip показала, что у европеоидов наиболее частый генотип СС +3953 IL-ip. Его доля была достоверно выше у больных ЯБ по сравнению с контролем (х2=Ю,9; р<0,05). Доля ге-терозигот СТ +3953 IL-ip и гомозигот ТТ +3953 IL-ip у больных ЯБ и ХГ - у представителей европеоидной популяции - была ниже, чем у здоровых доноров. В группе ЯБ различия, по сравнению с контролем, носили статистически значимый характер (х2=4,3; р<0,05 и х2=3,9; р<0,05, соответственно).

У хакасов, больных ЯБ, количество гомозигот СС +3953 IL-ip было выше, чем у пациентов с ХГ и здоровых доноров (р<0,05). Генотип СТ +3953 IL-ip статистически значимо чаще встречался при ХГ, по сравнению с группами больных ЯБ (х2=11,3; р<0,05) и здоровых доноров (xJ=4,7; р<0,05). Гомозиготы ТТ +3953 IL-ip среди хакасов были редким генотипом и выявлялись только у здоровых доноров.

Анализ полиморфизма гена IL-lRa VNTR показал, что у хакасов и европеоидов наиболее распространенным генотипом являлся R4R4 IL-tRa. Однако частота R4R4 у европеоидов была значительно ниже, чем у хакасов. В отношении R3R4 нами были получены совершенно противоположные результаты. Доля генотипа была выше у европеоидов, по сравнению с хакасами. Редкими были генотипы R2R2 IL-lRa и R2R3 IL-lRa, которые чаще встречались у европеои-

дов, чем у хакасов. Межпопуляционный анализ показал, что у европеоидов с ЯБ была увеличена частота R2R2, R2R3, R2R4 и R3R3 (х2=8,9; р<0,05) и снижена частота R3R4 и R4R4 (х2=65,0; р<0,05) по сравнению со встречаемостью данных генотипов у хакасов. У европеоидов, больных ХГ, по сравнению с аналогичной группой хакасов повышена частота встречаемости R2R2 {¿=5,1\ р<0,05), R2R3, R2R4 (Х2=9,8; р<0,05), R3R4 и снижена - R4R4 (¿=35,5; р<0,05)

Полученные нами результаты распределения полиморфных вариантов гена подтверждаются и данными литературы. Исследования, проведенные в китайской популяции, показали, что только 16 % здоровых доноров были носителями R2 IL-IRa, в то время как в Швеции и Польше - 56,0 %, в Португалии - 47,3 % [El-Omar Е.М., 2000; Machado J.C., 2001; Shin W.G., 2008].

Представляют интерес результаты анализа распределения частот аллель-ных вариантов полиморфизма -330 T/G гена IL-2. Необходимо отметить, что роль полиморфизма -330 T/G гена IL-2 рассматривается в НР-ассоциированных заболеваниях не только с позиций регуляции иммунного ответа, но и одной из причин развития атрофии слизистой оболочки желудка при НР-индуцированном воспалении [Кондрашина Э.А., 2002]. Эффекты потенцируются при генетически детерминированной продукции цитокина. Известно, что замена аллеля Т в позиции -330 промоторной зоны гена IL-2 на G приводит к увеличению экспрессии интерлейкина [Hoffmann S.C., 2001].

Среди европеоидов, больных ХГ, нами зарегистрировано увеличение частоты GT и снижение ТТ -330IL-2. У хакасов, больных ХГ и ЯБ, увеличивалось содержание высокопродуцирующего варианта GG -330 IL-2. В то же время генотип ТТ -330 IL-2 встречался значительно реже у больных ХГ и ЯБ, по сравнению с группой здоровых доноров. Изменения частот генотипов у хакасов, больных ХГ и ЯБ, не были одинаковыми.

Ранее другими исследователями были получены фактические данные частоты встречаемости данного полиморфизма в разных этнических группах. Так, W.G. Shin et al. (2008) показали, что в японской популяции генотип ТТ -330 IL-2 встречался у 72,0 % обследованных в контрольной группе, в то время как у корейцев, по данным S. Togawa (2005), только у 39,6 %. В корейской популяции аллель Т -330 IL-2 встречался у 76,2 % обследованных контрольной группы [Руо C.W., 2003]. По результатам двух независимых исследований W.G. Shin et al. (2008) и J. Wu et al. (2009), среди китайцев, больных ХГ и ЯБ, доминирующим генотипом также был ТТ -330 гена IL-2, хотя различия, по сравнению с генотипами GT и ТТ, в этих же группах больных ХГ и ЯБ не были статистически значимыми [Shin W.G., 2008; Wu J., 2009].

Различия касались и роли генотипов в риске развития заболевания. S. Togawa et al. (2005) продемонстрировали связь между генотипом ТТ -330 IL-2 и

риском развития атрофии слизистой оболочки желудка. По результатам исследования проведенного научной группой D.M. Queiroz и соавторами (2009), показано, что у носителей аллеля G полиморфизма -330 T/G гена IL-2 снижен риск развития НР-ассоциированной гастродуоденальной патологии.

Анализ полиморфизма -174 G>C гена IL-6 показал, что у европеоидов при ЯБ доля GG -174 IL-6 снижалась с одновременным увеличением СС -174 IL-6 (Х2=3,90; р<0,05). У больных ХГ достоверных различий частот генотипов относительно контроля выявлено не было. У хакасов, больных ХГ и ЯБ, не было выявлено статистически значимых отличий по сравнению с группой здоровых доноров. Генотип СС -174 IL-6 в группе пациентов с ХГ выявлен не был. Однако у коренного и пришлого населения частота встречаемости возможных генотипов имеет существенные различия.

Роль аллельных вариантов гена IL-8 в патогенезе НР-ассоциированной ЯБ не является однозначной [Kamali-Sarvestani Е., 2006]. Аллель А -251 IL-8 связан с прогрессией атрофических изменений в слизистой оболочке желудка у пациентов с НР и увеличивает риск развития ЯБ в японской популяции [Ohyauchi М, 2005; Taguchi А., 2005]. Z. Gyulai et al. показали взаимосвязь между носи-тельством генотипа ТТ -251 IL-8 и риском развития дуоденальной язвы. B.D. Ye et al. (2009) показали, что аллель А полиморфизма Т-251 А гена IL-8 ассоциирован с высокой продукцией IL-8, тяжелой степенью воспаления, атрофией слизистой, по сравнению с генотипом ТТ -251IL-8.

В нашем исследовании среди европеоидов частота встречаемости генотипа АА -251 IL-8 не различалась у больных с ХГ и ЯБ. У хакасов при ЯБ была высокой частота встречаемости высокопродуцирующего генотипа АА -251 IL-8, доля ТА значительно снижалась относительно контроля. При ХГ такой закономерности не отмечалось.

Данный факт имеет подтверждение и в работах других исследователей. Генотип АА -251 IL-8 ассоциирован с риском развития ЯБ двенадцатиперстной кишки [Hofner Р., 2007]. J.M. Kang et al. (2009) также показали, что, хотя при ЯБ преобладающим генотипом был ТА и ТТ -257 IL-8, риск развития заболевания связан с генотипом АА -257 IL-8. Исследования, проведенные Е. Garza-Gonzalez et al. (2007), Р. Cañedo et al. (2008), продемонстрировали преобладание гетерозиготного генотипа ТА -257 IL-8 при ХГ.

Для дополнительного анализа мы рассчитывали значения критерия отношения шансов, на основании чего сделали вывод о положительной ассоциации генотипов и риске развития НР-ассоциированных ЯБ и ХГ. У европеоидов генотип GT -330 IL-2 (OR=2,35) положительно ассоциирован с риском развития ХГ. Риск развития ЯБ ассоциирован с генотипом СС +3953 IL-ip (OR=2,63), R2R3 IL-lRa (OR=8,08), СС -174 C>C IL-6 (OR=2,25). С учетом значений пока-

зателей критерия отношения шансов можно заключить, что полиморфный вариант ТТ -330 ЕЬ-2 ((Ж=0,28) является протективным в отношении риска развития ХГ у европеоидов. Генотипами, снижающими риск развития ЯБ, у европеоидов являются СТ и ТТ +3953 ГЬ-1р гена 1Ь-1Р (ОЯ=0,51 и СЖ=0,44, соответственно), Я4К4 [Ь-1Яа и ЯЗИ4 1Ь-1Иа (0я=0,51 и ОК=0,30, соответственно) (рис. 6).

У хакасов возможное влияние на риск развития ХГ связано с наличием генотипа СТ +3953 1ИР (СЖ=1,97), протективный эффект у хакасов оказывает генотип ТТ -330 1Ь-2 ((Ж=0,42). Фактором, ассоциированным с риском развития ЯБ, является йй -330 Л-2 (СЖ=1,91) и АА -251 1Ь-8 (ОК=3,15). Протективный эффект в отношении развития ЯБ в данной популяции был ассоциирован с ТА -251 1Ь-8 (011=0,40) (рис. 7).

Резистентность Предр асположенность

С+3953Т IL-lß

IL-lRa VNTR — 4ji ---------- R2R3

ТТ 0,28 -330 T/GIL-2 2,35 GT

-174 ОС IL-6 -251 T>A IL-8

0,5 1 2 3 5 8

•

Резистентность Предрасположенность

ТТ 0,44 : C+3953T IL-lp 2/3 cc

R4R4 0,51 IL-lRa VNTR ','v .L-.rl 8,08 R2R34

-330 T/O IL-2

-174 ОС IL-6 " 2,25 cc

-251 T>A IL-8

0,5 1 2 3 5 8

1'ис. 6. Показатели критериев отношения шансов (OR) риска развития Helicobacter ру1оп-ассоциированных хронического гастрита (а) и язвенной болезни (б) у европеоидов

Для определения взаимосвязи различных полиморфных вариантов гена с развитием ХГ или ЯБ нужно обратить внимание на системы межгенного взаимодействия. Известно, что полиморфный вариант Я2ЯЗ гена 1Ь-1Яа ассоциирован с высоким уровнем продукции цитокина. Его физиологическое действие направлено на конкурентное связывание рецептора для 1Ь-1р, тем самым при-

водя к подавлению эффектов цитокина. Однако гиперпродукция антагониста рецептора ГЬ-Ша оказывает парадоксальный эффект: по принципу обратной связи происходит усиление синтеза 1Ир. В результате воспалительная реакция приобретает затяжной характер.

На основании выявленной нами ассоциации риска развития ЯБ у европеоидов и комбинации генотипов СС +3953 1Ь-1(1 и Я2Ю гена 1Ь-1Яа можно предположить, что именно этот эффект имеет место в патогенезе ЯБ у европеоидов. В то же время у хакасов наиболее распространенными вариантами были СС +3953 1Ир и Я4Я4 1Ь-111а. Данные генотипы не характеризуются высоким уровнем экспрессии гена. Вероятно, эта особенность обеспечивает мягкий про-воспалительный эффект, следовательно, и низкую, по сравнению с европеоидами, заболеваемость ЯБ.

Резистентность Предрасположенность

С+3953Т IL-lp 1,97 CT

IL-IRa VNTR

ТТ <М2 -330 T/GIL-2

-174 ОС IL-6 -251 T>AIL-8

0,5 1 2 3 5 8

Л

Резистентность Предрасположенность

C+3953T IL-ip

IL-IRa VNTR

-330 T/G IL-2 Ifil GG

-174 ОС IL-6

ТА 0,40 -251 T>AIL-8 ':r'•'."•'• ' ' : : 3,15 AA

0,5

1

Fue. 7. Показатели критериев отношения шансов (UR) риска развития Helicobacíer pylori-ассоциированных хронического гастрита (а) и язвенной болезни (б) у хакасов

Необходимо отметить, что инфицирование CagA+ штаммами HP также может влиять на изменение концентрации IL-8 [Audibert С., 2000; Fischer W., 2001; Riedcr G., 2001; Kim N., 2010]. Важную роль в запуске и стимуляции продукции IL-8 играет липополисахарид клеточной стенки HP, причем, разные

штаммы HP оказывают разное стимулирующее влияние. Считается, что CagA+ штаммы увеличивают продукцию цитокина. В результате анализа внутриклеточных сигнальных механизмов было показано, что HP индуцирует транскрипцию гена IL-8 через активацию NF-кВ р65 [Ritter В., 2011]. В то же время L.I. Shu-Ping et al. (2010) показали, что при CagA HP-зависимой активации PI3K/Aktl сигнального пути происходит супрессия синтеза IL-8 эпителиоцита-ми.

Таким образом, можно сделать вывод, что у хакасов фактическим риском развития ЯБ является наличие генотипа АА -251 IL-8. Другим фактором является установленная нами взаимосвязь между генетическими особенностями инфекта (cagA+ HP) и носительством генотипа ТА -251IL-8 у хакасов, больных ЯБ. Анализ содержания IL-8 в сыворотке крови, в зависимости от генотипа, показал, что уровень IL-8 у носителей АА -251 продукции был наибольшим, по сравнению с уровнем интерлейкина у носителей генотипов ТА и TT -251 1L-8. Следовательно, сочетание CagA и ТА -251 IL-8 сопряжено с более выраженным воспалением в слизистой оболочке желудка и двенадцатиперстной кишки. Однако штаммы HP, не экспрессирующие CagA, не являются комменсалами, так как обнаруживаются и у больных язвенной болезнью, и у больных раком желудка, хотя значительно реже. Это связано с тем, что подверженность к ЯБ, ХГ является полигенной.

Заключение

Исследование иммунопатогенеза—НР-ассоциированной гастродуоденаль-ной патологии, проведенное у двух популяций - хакасов и европеоидов, проживающих на одной территории - в Республике Хакасия, позволило выявить ряд клинико-патогенетических особенностей ХГ и Ж (рис. 8).

У европеоидов чаще регистрировался более тяжелый характер течения ЯБ (степень тяжести, частота обострений, наличие осложнений), что может быть связано с присутствием гена vacA sls2 (OR=3,3). У хакасов более легкое течение ЯБ ассоциировано с наличием гена cagA HP (OR=32,3).

Изменения характеристик локального и системного иммунитета у пациентов с HP-ассоциированной патологией коррелировали со степенью выраженности инфекционного процесса и популяционными особенностями обследованных. HP является длительно протекающей инфекцией, в результате которой возникает гиперактивация локальной иммунной системы с последующей декомпенсацией по количественным и качественным признакам, соответственно, а также снижение эффективности иммунного ответа.

Свидетельством этого является факт выявления нарушения баланса цито-кинов в сыворотке крови (IL-4, IL-10, TNFa) у хакасов и европеоидов, страдающих Helicobacter pylori-ассоциированными хроническим гастритом и яз-

венной болезнью, а также особенности спонтанной и ФГА-индуцированной продукции интерлейкинов мононуклеарными лейкоцитами крови. Важное значение имеет иммунофенотипический состав лимфоцитов крови. У хакасов при хроническом гастрите и язвенной болезни наблюдалось снижение числа СЭЗ+-, С04+- и С08+-лимфоцитов крови, у европеоидов — увеличение численности субпопуляций СБ4+- и С08+-лимфоцитов крови.

Рис. 8. Молекулярно-клеточные механизмы нарушения локального и системного иммунитета при инфекции Helicobacter pylori СОЖ - слизистая оболочка желудка, ПК - периферическая кровь, по данным результатам собственных исследований (выделено цветом)

Обнаруженные изменения закономерностей реализации апоптотической гибели иммунных клеток являются важным звеном нарушения иммунореактив-

ности макроорганизма в патогенезе HP-ассоциированных заболеваний, так как уменьшение количества клеток иммунной системы сопряжено с изменениями соотношения субпопуляций лимфоцитов и является одним из проявлений им-мунореактивности.

Очевидно, что выявленные изменения, с одной стороны, являются следствием нарушения иммунологического равновесия, обеспечивающего адекватное реагирование макроорганизма на HP-инфекцию. С другой стороны, являются результатом молекулярно-генетической детерминации функционирования иммунной системы.

Выводы

1. Различные клинические фенотипы язвенной болезни, ассоциированной с Helicobacter pylori, у коренного и пришлого населения Республики Хакасия сопровождаются доминированием в различных этнических популяциях разных, по генетическим характеристикам, патогенов. У хакасов язвенная болезнь ассоциирована с cagA штаммами Helicobacter pylori (93,2 %), у европеоидов - sls2 vacA штаммами Helicobacter pylori (55,6 %). Helicobacter pylori-ассоциированный хронический гастрит также характеризуется молекулярно-генетической дифференцированностью возбудителя: у хакасов хронический гастрит ассоциирован с ш2 vacA штаммами (62,9 %), у европеоидов - с ml vacA штаммами Helicobacter pylori (62,1 %).

2. Изменения субпопуляционного состава клеточного инфильтрата в слизистой оболочке желудка у хакасов и европеоидов с Helicobacter pylori-ассоциированной гастродуоденальной патологией характеризуются активацией гуморального (увеличение числа С020+-лимфоцитов) и клеточного звеньев иммунитета (возрастание количества CD4+- и СБ8+-лимфоцитов).

3. Дисбаланс между апоптозом (СРР-32 и Вс1-2) и пролиферацией (Ki-67) лимфоцитов слизистой оболочки желудка у хакасов и европеоидов с хроническим гастритом и язвенной болезнью, ассоциированных с Helicobacter pylori, имеет одинаковую направленность, но разную интенсивность: активность апоптоза лимфоцитов (отношение показателей СРР-32 и Bcl-2) выше при хроническом гастрите, чем при язвенной болезни; у хакасов более выражено, по сравнению с европеоидами.

4. Изменения численности субпопуляций лимфоцитов крови при гастродуоденальной патологии, ассоциированной с инфекцией Helicobacter pylori, у коренного и пришлого населения Республики Хакасия, характеризуются снижением числа CD3+-, CD4+- и СЭ8+-лимфоцитов у хакасов как при хроническом гастрите, так и при язвенной болезни, и увеличением количества CD4+- и С08+-лимфоцитов у европеоидов, больных хроническим гастритом

и язвенной болезнью, по сравнению с аналогичными показателями у здоровых доноров.

5. Течение Helicobacter pylori-ассоциированной гастродуоденальнон патологии у больных, относящихся к разным этническим группам и проживающих на территории Республики Хакасия, сопровождается изменением числа лимфоцитов крови, вступивших в апоптоз, наиболее выраженным у хакасов, по сравнению с европеоидами.

6. Чувствительность лимфоцитов, полученных у пациентов с гастродуоде-нальной патологией, ассоциированной с инфекцией Helicobacter pylori, к действию неспецифического модулятора апоптоза (0,01 % раствора перекиси водорода) in vitro снижена, по сравнению с лимфоцитарными клетками крови у здоровых доноров; выраженность указанных изменений наиболее значима у европеоидов, чем у хакасов. При язвенной болезни апоптотиче-ский индекс снижен, что свидетельствует о снижении функционального потенциала иммунных клеток при длительной инфекции Helicobacter pylori.

7. Дисбаланс интерлейкинов сыворотки крови у хакасов и европеоидов, страдающих Helicobacter pylori-ассоциированной гастродуоденальнон патологией, характеризуется увеличением концентрации TNFa, IL-4 и IL-I0. Особенности спонтанной и ФГА-индуцированной продукции интерлейкинов моно-нуклеарными лейкоцитами крови у пациентов с Helicobacter pylori-сопряженными хроническим гастритом и язвенной болезнью характеризуются снижением базальной и резервной продукции IL-2 у хакасов н увеличением продукции IL-4, IL-10 - у европеоидов.

8. Распространенность полиморфизмов генов цитокинов С+3953Т IL-ip, IL1-Ra VNTR, -330 T/G IL-2, -174 G/C IL-6, -251 T/A IL-8 у хакасов и европеоидов имеет выраженные межпопуляционные различия и является определяющим в иммунопатогенезе Helicobacter pylori-сопряженных хронического гастрита и язвенной болезни у хакасов и европеоидов.

9. Иммуногенетическими предикторами Helicobacter pylori-ассоциированной язвенной болезни у хакасов являются генотип АА промоторного региона -251 Т>А гена IL-8 (OR=3,15), генотип GG промоторного региона -330 T/G IL-2 (OR=l,91); у европеоидов - генотип СС промоторного региона С+3953Т гена IL-lp (OR=2,63), генотип R2R3 гена IL-IRa (OR=8,08), генотип СС промоторного региона -174 G>C гена IL-6 (OR=2,25). У хакасов риск развития хронического гастрита при инфицировании Helicobacter pylori ассоциирован с генотипом СТ полиморфизма С+3953Т гена IL-ip (OR=l,97); у европеоидов - с генотипом R2R3 гена IL-IRa (OR=4,41) и генотипом GT промоторного региона -330 T/G гена IL-2 (OR=2,35).

10. Фактором, снижающим риск развития язвенной болезни, ассоциированной с Helicobacter pylori, у хакасов является генотип ТА промоторного региона -251 Т>А гена IL-8 (OR=0,40); у европеоидов - генотипы СТ и ТТ промоторного региона С+3953Т гена IL-ip (OR=0,51 и OR=0,44, соответственно), генотипы R3R4 и R4R4 гена IL-IRa (OR=0,30 и OR=0,51, соответственно). Риск развития хронического гастрита, ассоциированного с Helicobacter pylori, снижен у хакасов и европеоидов - носителей генотипа ТТ промоторного региона -330 T/G IL-2 (OR=0,42 и OR=Of28, соответственно).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Агеева, Е.С. Особенности хеликобактер-ассоциированной язвы желудка у населения Республики Хакасия / Е.С. Агеева, О.В. Штыгашева, II.В. Рязанцева II Сибирский вестник гепатологии и гастроэнтерологии. - 2007. - № 21. - С. 48-49.

2. Штыгашева, О.В. Фенотипический состав лимфоцитов собственной пластинки желудка при язвенной болезни желудка у жителей Республики Хакасия / О.В. Штыгашева, Е.С. Агеева // Сибирский вестник гепатологии и гастроэнтерологии. -

2007,-№21.-С. 146-147.

3. Агеева, Е.С. Этно-биологические аспекты хеликобактер-ассоциированной патологии желудка / Е.С. Агеева, О.В. Штыгашева, Н.В. Рязанцева // Этносы развивающейся России: проблемы и перспективы: материалы II межрегиональной научно-практической конференции 27-28 сентября 2007 г., г. Абакан / под. ред. Т.А. Фоте-ковой - Абакан: Издательство Хакасского Государственного Университета им. Н.Ф. Катанова, 2007. - С. 175-176.

4. Агеева, Е.С. Патогенетические аспекты в формировании хеликобактер-ассоциированной патологии / Е.С. Areeea^XLB- Штыгашева, Н.В. Рязанцева // Генетика человека и патология: Сборник научных трудов / Под ред. В.П. Пузырева. Вып. 8. - Томск: Изд-во «Печатная мануфактура», 2007. - С. 42-44.

5. Штыгашева, О.В. Иммунобиологическая толерантность к хронической персистен-ции Helicobacter pylori / О.В. Штыгашева, Е.С. Агеева, Н.В. Рязанцева II Клинико-эпндемиологические и этно-экологические проблемы заболеваний органов пищеварения: материалы восьмой Восточно-Сибирской гастроэнтерологической конференции с международным участием и красноярской краевой гастроэнтерологической конференции / под ред. проф. В.В. Цуканова, проф. А.Б. Салминой - Красноярск, 2008.-С. 100-111.

6. Штыгашева, О.В. О роли персистенции микроорганизмов в генезе неинфекциом-ных заболеваний / О.В. Штыгашева, Е.С. Агеева II Вестник Российской Военно-медицинской академии. - 2008. - 2 (22). - Ч. II. - С. 648-649.

7. Агеева, Е.С. Молекулярно-генетические особенности распространенности персистенции Helicobacter pylori в Республике Хакасия / Е.С. Агеева, О.В. Штыгашева // Вестник Российской Военно-медицинской академии. - 2008. - 2 (22). - Ч. II. - С. 651-652.

8. Агеева, Е.С. Роль апоптоза в патогенезе мультифакториальных заболеваний / Е.С. Aieeea, О.В. Штыгашева // Актуальные проблемы медицины: материалы межрегиональной научно-практической конференции, 16-17 мая 2008 г., г. Абакан / под ред. О.В. Штыгашевой - Абакан: Издательство ООО «ДиалогСибирь-Абакан».

2008.-С. 82-86.

9. Особенности апоптоза лимфоцитов периферической крови при язвенной болезни у коренных жителей Республики Хакасия / Е.С. Агеева, О.В. Штыгашева, H.H. Буто-рин и др. // Актуальные проблемы медицины: материалы межрегиональной научно-практической конференции, 16-17 мая 2008 г., г. Абакан / под ред. О.В. Штыгаше-вой - Абакан: Издательство ООО «ДиалогСибирь-Абакан», 2008. - С. 89-90.

10. Агеева, Е.С. Методы дифференциального окрашивания апоггготических клеток / Е,С. Агеева, O.A. Берсенева // Актуальные проблемы медицины: материалы межрегиональной научно-практической конференции 16-17 мая 2008 г., г. Абакан / под ред. О.В. Штыгашевой - Абакан: Издательство ООО «ДиалогСибирь-Абакан», 2008. - С. 234-236.

11. Штыгашева, О.В. Роль Helicobacter pylori в патогенезе актуальных социально-значимых заболеваний / О.В. Штыгашева, Е.С. Агеева // «Вопросы сохранения и развития здоровья населения Республики Тыва»: материалы конференции в рамках ежегодной итоговой научно-практической конференции ГУ НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН «Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири» / под. ред. В.Т. Манчука и C.B. Смирновой. - Кызыл: Тувинское книжное издательство, 2008. - Вып. 7. - С. 156-159.

12. The Features of Interactions between M. pylori and Human Organism in Caucasian and Mongol Populations / O.V. Shtygasheva, E.S. Ageeva, N.N. Butorin, N.V. Ryazantseva // Helicobacter. - 2008. - Vol. 13, № 5. - P.432-433.

13. Иммунологические показатели крови при язвенной болезни у коренного населения Хакасии / Е.С. Агеева, О.В. Штыгашева, H.H. Буторин и др. // Российский журнал Гастроэнтерологии, Гепатологии, Колопроктологии. Приложение № 32. Материалы Четырнадцатой Российской Гастроэнтерологической Недели, 6-8 октября 2008 г., г. Москва, 2008. - T. XVIII, № 5. - С. 143.

14. Анализ вклада гена -251 Т>А ИЛ-8 в генетическую предрасположенность язвенной болезни у хакасов / Е.С. Агеева, О.В. Штыгашева, В.М. Иптышев, A.A. Смор-гова П Вопросы патогенеза типовых патологических процессов: труды Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. - Новосибирск: Снбмедиздат НГМУ, 2009. - С. 24-27.

15. Агеева. Е.С. Анализ уровня интерлейкина-lß у больных гастродуоденальной НР-ассоциированной патологией коренного населения Республики Хакасия / Е.С. Агеева, A.A. Сморгова // «Студент и научно-технический прогресс»: Медицина: материалы XLVII Международной научной студенческой конференции / Новосиб. гос. ун-т. Новосибирск, 2009. - С. 3.

16. Ассоциации полиморфизма генов интерлейкина 1 с гастродуоденальной патологией у хакасов / Е.С. Агеева, О.В. Штыгашева, В.М Иптышев и др. II Клинико-эпидемиологические проблемы и этно-экологические проблемы органов пищеварения: материалы девятой Восточно-Сибирской гастроэнтерологической конференции с международным участием, 6-7 мая 2009 г. / под. ред. проф. В.В. Цуканова, проф. А.Б. Салминой. - Красноярск, 2009. - С. 133-134.

17. Иммунологические особенности течения гастродуоденальной патологии у жителей Хакасии / Е.С. Агеева, О.В. Штыгашева В В. Цуканов, Н.В. Рязанцева // Иммунология. - 2009. - Т. 30, № 3. - С. 162-165.

18. Polymorphisms in Genes Interleukins Associated with Ulcer Disease in a High-Risk Khakas Population / O.V. Shtygasheva, E.S. Ageeva, N.N. Butorin, N.V. Ryazantseva // Helicobacter.-2009.-Vol 14, №4.-P 359.

19. Агеева, Б.С. Изучение ассоциаций полиморфизмов генов интерлейкинов с язвенной болезнью у хакасов / Е.С. Агеева, О. В. Штыгашева // Российский журнал Гастроэнтерологии, Гепатологии, Колопроктологии. Приложение № 34. Материалы Пятнадцатой Российской Гастроэнтерологической Недели, 12-14 октября 2009 г., Москва, 2009. - Т. XIX, № 5. -С. 131.

20. Механизмы формирования иммунного ответа при Helicobacter pylori персистенции у коренного населения Хакасии / Е.С. Агеева, О.В. Штыгашева, Н.В. Рязанцева, Е.В. Кудряшова // Четвертая Всероссийская научно-практическая конференция / под ред. акад. РАМН проф. В.А. Шкурупия. - Новосибирск, 2009. - С. 5-6.

21. Характеристика морфологических изменений слизистой оболочки желудка у хакасов при персистенции инфекции Н. pylori / О.А. Берсенева, Е.А. Осипова, Е.С. Агеева, А.С. Пуликов // Наука и общество: взгляд молодых исследователей: материалы третьей научной конференции школьников и студентов с международным участием, Абакан / под. ред. С.В. Пебыковой. - Абакан: ООО «ДиалогСибирь-Абакан», 2009. - С. 43-46.

22. Агеева, Е.С. Особенности патогенеза Helicobacter pylori-инфекции у представителей хакасской популяции / Е.С. Агеева, О.В. Штыгашева, Н.В. Рязанцева // Бюллетень Сибирской медицины. - 2009. - № 4. - С. 5-9.

23. Некоторые показатели морфомстрии слизистой оболочки желудка при персистенции Helicobacter pylori у коренных жителей Республики Хакасия / О.А. Берсенева, Е.А. Осипова, Е.С. Агеева, А.С. Пуликов II Экология Южной Сибири и сопредельных территорий. Выпуск 13: в 2 т. Т. II / отв. ред. В.В. Анюшин. - Абакан: Издательство Хакасского государственного университета им. Н.Ф. Катанова, 2009. - С. 113-115.

24. Система цитокинов у больных с хронической персистенцией Helicobacter pylori у коренного населения Хакасии / Е.С. Агеева, О.В. Штыгашева, В.М. Иптышев, Н.В. Рязанцева И Дни иммунологии в Сибири: материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным" участием / под ред. В.А. Козлова, С.В. Смирновой, ВТ. Манчука. - Красноярск: Издательство КрасГМУ, 2010. - С. 91-93.

25. Молекулярные механизмы изменений слизистой оболочки желудка у хакасов при персистенции Helicobacter pylori / О.А. Берсенева, Е.С. Агеева, О.В. Штыгашева и др. // Дни иммунологии в Сибири: материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием / Под ред. В.А. Козлова, С.В. Смирновой, В.Т. Манчука. - Красноярск: Издательство КрасГМУ, 2010. - С. 96-98.

26. Иммунопато генетические особенности развития Helicobacter pylori-ассоциированных заболеваний / Е.С. Агеева, З.К. Хаитова, О.В. Штыгашева и др. // Вопросы патогенеза типовых патологических процессов: труды II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. - Новосибирск: Сибмедиздат НГМУ, 2010. - С 7-10.

27. Агеева, Е.С. Модуляция программируемой гибели клеток при хронической персистенции Helicobacter pylori / Е.С. Агеева // Актуальные проблемы медицины: материалы 13-ой межрегиональной научно-практической конференции с международным участием; г. Абакан, 4-5 мая 2010 г. / отв. ред. О.В. Штыгашева. - Абакан: Издательство ГОУ ВПО «Хакасский государственный университет им. Н.Ф. Катанова». 2010.-С. 232-238.

28. Агеева, Е.С. Особенности распределения генов цитокинов (IL-I и 11.-8) у больных язвенной болезнью / Е.С. Агеева, О.В. Штыгашева, Н.В. Рязанцева II Актуальные

проблемы медицины: материалы 13-ой межрегиональной научно-практической конференции с международным участием; г. Абакан, 4-5 мая 2010 г. / отв. ред. О.В. Штыгашева. - Абакан: Издательство ГОУ ВПО «Хакасский государственный университет им. Н.Ф. Катанова», 2010. - С. 238-243.

29. Фенотип лимфоцитов периферической крови при Helicobacter pylori-ассоциированной гастродуоденальной патологии / Е.С. Агеева, О.В. Штыгашева, З.К. Хаитова и др. // Актуальные проблемы медицины: материалы 13-ой межрегиональной научно-практической конференции с международным участием; г. Абакан, 4-5 мая 2010 г. / отв. ред. О.В. Штыгашева. - Абакан: Издательство ГОУ ВПО «Хакасский государственный университет им. Н.Ф. Катанова», 2010. - С. 243-246.

30. Гены и болезни хакасов / О.В. Штыгашева, Е.С. Агеева, В.Н. Харьков, В.А. Степанов // Красноярск: Поликор, 2010. - 296 с.

31. Фенотип лимфоцитов крови больных с Helicobacter pylori-ассоциированным раком желудка / Е.С. Агеева, О.В. Штыгашева, МО. Максимов, Г.Н. Стрижаков // Актуальные вопросы охраны здоровья населения регионов Сибири: материалы научно-практической конференции молодых ученых. Вып. 8. / под ред. В.Т. Манчука, С.В. Смирновой. - Красноярск, 2010. - С. 3-4.

32. Роль TNFA в патогенезе Helicobacter pylori-ассоциированной гастродуоденальной патологии / Е.С. Агеева, В.М. Иптышев, О.В. Штыгашева, Н.В. Рязанцева П Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири: материалы итоговой научно-практической конференции НИИМПС СО РАМН / под ред. В.Т. Манчука, С.В. Смирновой. - Красноярск, 2010. - Вып. 9. - С. 135-136.

33. Агеева, Е.С. Популяционные особенности распространенности инфекции Helicobacter pylori в Хакасии / Е.С. Агеева, О.В. Штыгашева И Инфекция Helicobacter pylori в России: сборник научных статей / под. ред. Е.А. Корниенко и др. - СПб., 2010.-С. 5-12.

34. Агеева, Е.С. Ассоциация полиморфизмов генов G-174C ИЛ6 и Т-251А ИЛ8 с язвенной болезнью у хакасов / Е. С. Агеева, О.В. Штыгашева, Н.В. Рязанцева И Иммунология. - 2010. 3, Т. 31.-С. 131-133.

35. Молекулярно-генетические факторы, влияющие на исход инфицирования Helicobacter pylori у жителей Республики Хакасия I Е.С. Агеева, О.В. Штыгашева, Н.В. Рязанцева, В.В. Цуканов // Российский журнал Гастроэнтерологии, Гепатоло-гни, Колопроктологии. - 2010. - № 4. - С. 13-18.

36. Роль апоптоза в диерегуляции локального и системного иммунитета при Helicobacter pylori-инфекции / Е.С. Агеева, О.В. Штыгашева, В.М. Иптышев и др. // Бюллетень Сибирской медицины. - 2010. - Ks 5. - С. 13-18.

37. The external features of polymorphism in genes IL-1В in patients with atrophic gastritis / E.S. Ageeva, O.V. Shtygasheva, N.N. Butorin, N.V. Ryazantseva // Helicobacter. -2010.-Vol. 15, N.4. -P.357.

38. The phenotype lymphocytes of patient with H. pylori-associated the gastric cancer / O.V. Shtygasheva, E.S. Ageeva, M O. Maksimov, G.N. Strizhakov // Helicobacter. -2010- Vol 15, №4.-P. 384.

39. Анализ эрадикационкой терапии хеликобактериоэа в России и возможности использования фитопрепаратов / Е.В. Смирнова, Е.О. Шалгинова, Ю.В. Саранчина, Е.С. Агеева и др. // Наука и общество: взгляд молодых исследователей: материалы четвертой научной конференции школьников и студентов с международным участием, 12-13 ноября 2010 г., г. Абакан / под. ред. О.В. Комаровой. - Абакан: ООО «ДиалогСибирь-Абакан», 2010. - С. 86-87.

40. Изучение фагоцитарной активности нейтрофилов и цитокин-продуцирующей способности лимфоцитов у больных с персистенцией Helicobacter pylori / Ю.В. Саран-чина, Е.С. Агеева, C.B. Водолаэова и др. Н Наука и общество: взгляд молодых исследователей: материалы четвертой научной конференции школьников и студентов с международным участием, 12-13 ноября 2010 г., г. Абакан / под. ред. О.В. Комаровой. - Абакан: ООО «ДиалогСибирь-Абакан», 2010. - С. 85-86.

41. Особенности цитокин-продуцирующей способности лимфоцитов больных хроническим гастритом и язвой желудка, ассоциированными с Helicobacter pylori у жителей Хакасии / Ю.В. Саранчина, Е.С. Агеева, О.В. Штыгашева, C.B. Водолазова // Экология Южной Сибири и сопредельных территорий. Выпуск 14: в 2 т. T. II / отв. ред. В.В. Анюшин. - Абакан: Издательство ГОУ ВПО «Хакасского государственного университета им. Н. Ф. Катанова», 2010. - С. 133-115.

42. Аспекты прогнозирования перехода Helicobacter pylori-ассоциированного хронического гастрита в рак желудка / Е.С. Агеева, О.В. Штыгашева, О.М. Максимов и др. // Актуальные вопросы долголетия: материалы Всероссийского научно-практической конференции, г. Красноярск, 8-10 декабря 2010 г. / под ред. В Т. Манчука, C.B. Смирновой. - Красноярск: Изд-во КрасГМУ, 2010. - С. 3-5.

43. Агеева, Е.С. Роль аллельных вариантов гена IL-1B в формировании II. pylori-вссоциированной гастродуоденальной патологии / Е.С. Агеева, О.В. Штыгашева, Н.В. Рязанцева// Медицинский Академический Журнал, 2010. - Т. 10, №5. - С.114.

44. Оценка иммунного статуса больных с персистенцией Helicobacter pylori / Ю.В. Саранчина, Е.С. Агеева, C.B. Водолазова и др. // Достижения науки и практики в обеспечении санитарно-эпидемиологического благополучия Вооруженных сил Российской Федерации: труды Третьего съезда военных врачей медико-профилактического профиля Вооруженных сил Российской Федерации (Санкт-Петербург, 8-10 декабря 2010 г.). - СПб., 2010. -С. 179.

45. Штыгашева, О.В. Роль иммунорегуляториызшитокинов в патогенезе хронического гастрита и язвенной болезни, поиск предикторов заболеваний / О.В. Штыгашева, Е.С. Агеева, В.М. Иптышев // Сибирский медицинский журнал. - 2011. - № I. -С. 88-90.

46. Агеева, Е.С. Популяционные особенности ассоциации полиморфизма генов ик-терлейкинов с патологией желудка и двенадцатиперстной кишки у хакасов / Е.С. Агеева, О.В. Штыгашева, Н.В. Рязанцева // Терапевтический архив. - 2011. - Т. 83, №2.-С. 16-19.

47. Агеева, Е.С. Роль полиморфизма гена -330 T/G IL-2 в патогенезе Helicobacter ру-lori-ассоциированных хронического гастрита и язвенной болезни / Е.С. Агеева, О.В. Штыгашева // Дни иммунологии в Сибири: материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием / под. ред. В.А. Козлова, C.B. Смирновой, В.Т. Манчука. - Абакан. Издательство ГОУ ВПО «Хакасский государственный университет им. Н.Ф. Катанова», 2011. - С. 116-118.

48. Саранчина, Ю.В. Влияние полиморфизма гена С+3953Т IL-Iß на продукцию ин-терлейкина при хроническом гастрите, ассоциированном с Helicobacter pylori инфекцией / Ю.В. Саранчина, Е.С. Агеева, О.В. Штыгашева // Дни иммунологии в

, Сибири: материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием / под. ред. В.А. Козлова, C.B. Смирновой, В Т. Манчука. - Абакан: Издательство ГОУ ВПО «Хакасский государственный университет им. Н.Ф. Катанова», 2011. - С. 163-167.

49. Штыгашева, О.В. Формирование научной школы: молекулярно-генетические предикторы и факторы риска социально-значимых заболеваний у коренного и пришлого населения Хакасии / О.В. Штыгашева, Е.С. Агеева // Актуальные проблемы медицины: материалы 14-й межрегиональной научно-практической конференции с международным участием; г. Абакан, 27-28 апреля 2011 г. / под. ред. О.В. Штыга-шевой. - Абакан: Издательство ГОУ ВПО «Хакасский государственный университет им. Н.Ф. Катанова», 2011. - С. 6-9.

50. Особенности иммунного статуса при семейной трансмиссии хеликобактериоза у населения Хакасии / Е.С. Агеева, О.В. Штыгашева, Ю.В. Саранчина, С.В. Водола-зова // Актуальные проблемы медицины: материалы 14-й межрегиональной научно-практической конференции с международным участием; г. Абакан, 27-28 апреля 2011 г. / под. ред. О.В. Штыгашевой. - Абакан: Издательство ГОУ ВПО «Хакасский государственный университет им. Н. Ф. Катанова», 20II. - С. 209-219.

51. Агеева, Е.С. Ассоциация полиморфных маркеров 251 Т>А гена IL-8 с язвенной болезнью у хакасов / Е.С. Агеева, О.В. Штыгашева, Н.В. Рязанцева // Молекулярная медицина. - 2011. - №2. - С. 17-22.

52. Аллсльный полиморфизм генов IL-IQ и IL-8 при персистенции Helicobacter pylori в случаях семейной трансмиссии у жителей Хакасии / Ю.В. Саранчина, Е.С. Агеева, С.В. Водолазова, О.В. Штыгашева II Клинико-эпидемиологические и этно-экологические проблемы заболеваний органов пищеварения: материалы одиннадцатой Восточно-Сибирской гастроэнтерологической конференции с международным участием; г. Иркутск, 24-25 мая 2011 г. и Забайкальской конференции «Актуальные проблемы гастроэнтерологии», г. Чита, 27-28 мая 2011 г. / под ред. В.В. Цуканова. - Красноярск, 2011.-С. 55-56.

53. Семейный анамнез в определении предрасположенности к заболеваниям / Е.С. Агеева, Ю.В. Саранчина, С.В. Водолазова, О.В. Штыгашева II Клинико-эпидемиологические и этно-экологические проблемы заболеваний органов пищеварения: материалы одиннадцатой Восточно-Сибирской гастроэнтерологической конференции с международным участием; г. Иркутск, 24-2S мая 2011 г. и Забайкальской конференции «Актуальные проблемы гастроэнтерологии», г. Чита, 27-28 мая 2011 г. / под ред. В.В. Цуканова. - Красноярск, 2011. - С. 63-66.

54. Эгно-популяционные особенности распределения полиморфизма гена lL-ф при Helicobacter pylori-ассоциированной гастродуоденальной патологии / Е.С. Агеева, О.В. Штыгашева, Н.В. Рязанцева и др. // Бюллетень Сибирской медицины.-20П. - № 3. - С. 14-18.

55. Роль IL-ip и IL-8 в патоморфозе слизистой оболочки желудка при Helicobacter ру-bri-ассоциированном гастрите/ Е.С. Агеева, О.В. Штыгашева, А.С. Пуликов, Н.Н. Буторин // Бюллетень ВСПЦСО PAMII. -2011. - №1(77), ч. I.-C. 16-20.

56. Ageeva, E.S. The polymorphism in genes and pathomorphosis of the mucous membrane of the stomach at Helicobacter pylori-associated gastritis / E.S. Ageeva, O.V. Shty-gasheva, N.V. Ryazantseva //Helicobacter. -2011. -Vol. 16 (S.l). - P. 124.

57. Агеева, Е.С. Поиск молекулярно-генетических факторов риска Helicobacter pylori-ассоциированных заболеваний желудка / Е.С. Агеева, О.В. Штыгашева // Этносы развивающейся России: проблемы и перспективы: материалы четвертой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, 20-21 октября 2011 г., г. Абакан / под. ред. Т.А. Фотековой. - Абакан: Издательство ФГБОУ ВПО «Хакасский государственный университет им. Н.Ф. Катанова», 2011. - С. 176-178.

58. Изменение показателей иммунного ответа при хронической персистенции Helicobacter pylori-инфекции у населения Хакасии / Ю.В. Саранчина, С.В. Водолазова, Е.С. Агеева, О.В. Штыгашева // Этносы развивающейся России: проблемы и перспективы: материалы четвертой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, 20-21 октября 2011, Абакан / под. ред. Т.А. Фотеко-вой. - Абакан: Издательство ФГБОУ ВПО «Хакасский государственный университет им. Н.Ф. Катанова», 2011. -С. 185-186.

59. Ageeva, E.S. Features of immune response in pathogenesis of ulcer disease at the native and stranger inhabitants of Khakassia / E.S. Ageeva, O.V. Shtygasheva // Abstracts of XII International Euroasian Congress of Surgery and Gastroenterology. Baku, October 20!I.-P. 36-37.

60. Продукция провоспалительных цитокинов IL-Iß и IL-8 при инфекции Helicobacter pylori / Ю.В. Саранчина, C.B. Водолазова, Е.С. Агеева, O.B. Штыгашева // Экология Южной Сибири и сопредельных территорий. Выпуск 15. В 2 т. Т. II / отв. ред. В,В. Анюшин. - Абакан: Издательство ФГБОУ ВПО «Хакасский государственный университет им. Н.Ф. Катанова», 2011.-С. 141-142.

61. Особенности иммунного ответа при хронической инфекции Helicobacter pylori-инфекции / Ю.В. Саранчина, С.В. Водолазова, Е.С. Агеева, О.В. Штыгашева // Актуальные вопросы бактериологии: материалы научно-практической конференции. -2011.-С. 63-65.

62. Генетические детерминанты прогноза инфицирования Helicobacter pylori / Е.С. Агеева, О.В. Штыгашева, Н.В. Рязанцева и др. // Бюллетень СО РАМН. — 20II.— Т. 31, №6.-С. 5-9.

63. Роль нарушений системы цитокинов в патогенезе Helicobacter pylori-ассоциированной патологии / Е.С. Агеева, О.В. Штыгашева, В.М. Иптышев, Н.В. Рязанцева // Бюллетень Сибирской медицины. - 2011. - № 6. - С. 5-8.

64. Агеева, Е.С. Показатели спонтанного и индуцированного апоптоза при Helicobacter pylori-инфекции / Е.С. Агеева // Сибирский медицинский журнал. - 2012. -№ I .-C. 37-39.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕННА

АИ - аполтотический индекс

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИФА - иммуноферментный анализ

ОП - оптическая плотность

ПЦР - полимераэная цепная реакция

РХВ - равновесие Харди-Вайнберга

ФГА - фктогемагггаотанин

ХГ - хронический гастрит

ЭФГДС - ззофагогастродуоленоскопия

ЯБ - язаенная болезнь

CagA (cytotoxín associated gene A) - шгготоксин-ассоцииро ванный антиген CD (cluster differentiation) - кластер дифференци-ровки

CI (Confidents Intervals) - доверительный интервал HP - Helicobacter pylon IFNy - интерферон у lg - иммуноглобулин IL - интерлейкин

IL-IRa - антагонист рецептора интерлейкина OR (Odds Ratio) - отношение шансов Th - Т-хелперный лимфоцит

TNF (tumor necrosis factor) - фактор некроза опухоли

VacA (vacuolating-associated cylotoxin А) - вакуолизируюший

цитотоксин

VNTR (variable nucleotide trend repeat) - вариабельность длины та наемных повторов

Подписано в печать 27.03.2012. Формат 60x84 1/16. Гарнитура Times New Roman. Печать - ризограф. Бумага офсетная. Физ.печ.л. 2,75. Усл.печ.л. 2,6. Уч.-изд.л. 2,3. Тираж 100 экз. Заказ № 57.

Отпечатано в типографии ФГБОУ ВПО «Хакасский государственный университет им. Н. Ф. Катанова» 655017, г. Абакан, пр. Ленина, 90а, тел. 22-51-13; e-mail: izdat@khsu.ru

12-

1 69 Л

2011355610

2011355610

Актуальность. Helicobacter pylori является ведущим этиологическим фактором язвенной болезни и хронического гастрита [118, 257]. Результаты широкомасштабных исследований показали, что на долю язвенной болезни, ассоциированной с инфекцией Helicobacter pylori, приходится 70-80 % случаев выявления дуоденальных язв и 50-60 % язв желудка [327]. Появляется все больше доказательств той роли, которую играет инфекция Helicobacter pylori в возникновении и развитии рака желудка [301, 355]. Исследователи связывают с инфицированием Helicobacter pylori 100 % случаев выявления проксимального рака желудка у японцев [163].

Ключевым звеном в развитии гастродуоденальной патологии является не только длительная инфекция Helicobacter pylori в макроорганизме, но и непосредственное участие в этом процессе клеток иммунной системы. Механизмы дизрегуляции иммунного ответа макроорганизма при хронической инфекции Helicobacter pylori связаны с прямым цитопатическим действием микроорганизма, приводящим к поляризации иммунного ответа по Thl-пути и выработке соответствующего спектра цитокинов (IFNy, TNFa, IL-1, IL-2, IL-8, IL-10). Детерминация иммунного ответа по Thl-клеточному типу оказывает решающую роль в иммунопатогенезе заболеваний, связанных с Helicobacter pylori-инфекцией [52, 269]. Действие цитокинов, с одной стороны, вызывает неадекватную активацию иммунной системы: усиление апоп-тоза иммунных клеток с их последующей элиминацией [143, 324], а, с другой, - дисбаланс между процессами программированной гибели желудочных эпителиоцитов и их пролиферацией [15, 84]. Усиление гибели эпителиоци-тов приводит к усугублению язвенных дефектов слизистой оболочки желудка. И, наоборот, преобладание пролиферативных процессов при хроническом воспалении эпителия слизистой оболочки желудка увеличивает риск развития рака [50].

Характер взаимодействия Helicobacter pylori и организма хозяина имеет популяционные отличия. В литературе описаны феномены «африканская загадка», «азиатская загадка», «северная загадка», сущность которых заключается в «консервации» макроорганизмом патогенных штаммов Helicobacter pylori при хронической инфекции [61, 208, 279, 293]. Подобные результаты были выявлены при эпидемиологическом исследовании распространенности язвенной болезни у населения Республики Хакасия [92, 93, 95]. Было установлено, что распределение цитотоксических штаммов Helicobacter pylori и ассоциация бактерии с язвенной болезнью имеет выраженные этнические особенности. При равной частоте инфицированности Helicobacter pylori у хакасов и европеоидов заболеваемость язвенной болезнью у них существенно различается. Кроме того, у хакасов и европеоидов были установлены различия в соотношении процессов пролиферативной и апоптотической активности эпителия слизистой оболочки желудка, а также в дифференциации локального иммунного ответа по ТЬ1/ТЬ2-пути [92]. Данный факт предполагает существование генетически-детерминированных особенностей иммунного ответа и является основой разнообразия Helicobacter pylori-ассоциированных заболеваний.

Приоритетным является изучение ассоциированности заболеваний с рядом аллельных вариантов генов цитокинов и их рецепторов. Накоплено и обобщено значительное число данных о вовлеченности различных полиморфных генов в формирование предрасположенности ко многим социально-значимым заболеваниям, в том числе - инфекциям и связанными с длительной персистенцией патогена осложнениями [57, 67, 212]. Отдельные ал-лельные варианты приводят к изменению уровней продукции соответствующих цитокинов и их рецепторов, что также оказывает влияние на характер течения заболевания и возникновение определенных осложнений, формирует популяционные различия в структуре заболеваемости у европеоидов и монголоидов. Вместе с тем фактические данные о роли конкретных полиморфизмов генов цитокинов и их рецепторов в развитии Helicobacter pyloriассоциированных язвенной болезни и хронического гастрита носят противоречивый характер, в пределах, даже, одной популяции [104]. Выявление генетических особенностей течения Helicobacter pylori-ассоциированных заболеваний необходимо для разработки персонализированных технологий профилактики, диагностики и лечения гастродуоденальной патологии и сопряженных с вызванной персистенцией патогена осложнений.

Таким образом, представляется актуальным и перспективным изучение популяционных различий молекулярных механизмов дизрегуляции иммунного ответа, вызванных инфицированием Helicobacter pylori, у хакасов и европеоидов.

Цель исследования

Установить молекулярно-генетические и клеточные основы иммунопа-тогенеза Helicobacter pylori-ассоциированных заболеваний (язвенная болезнь, хронический гастрит) у населения Республики Хакасия (хакасы, европеоиды).

Задачи исследования:

1. Установить распространенность субтипов VacA и CagA Helicobacter pylori у хакасов и европеоидов с хроническим гастритом и язвенной болезнью, ассоциированными с инфекцией Helicobacter pylori; оценить взаимосвязь между генетическими особенностями Helicobacter pylori и клиническим течением сопряженной с инфекцией гастродуоденальной патологии.

2. Выявить общие закономерности и особенности нарушений локального и системного иммунитета у хакасов и европеоидов с гастродуоденальной патологией, ассоциированной с Helicobacter pylori-инфекцией (хронический гастрит, язвенная болезнь).

3. Оценить роль нарушений системы цитокинов (IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, TNF а) в иммунопатогенезе Helicobacter pylori-ассоциированных заболеваний гастродуоденальной зоны у хакасов и европеоидов.

4. Установить распространенность полиморфизмов генов цитокинов С+3953Т IL-lß, ILl-Ra VNTR, -330 T/G IL-2, -174 G/C IL-6, -251 T/A IL-8 у европеоидов и хакасов, страдающих ассоциированной с Helicobacter pylori гастродуоденальной патологией.

5. Выявить критические иммуногенетические факторы предрасположенности и резистентности у коренного и пришлого населения Республики Хакасия к развитию сопряженных с Helicobacter pylori хронического гастрита и язвенной болезни.

Научная новизна

Впервые представлены знания фундаментального характера о роли ге-нетически-детерминированных механизмов развития Helicobacter pylori-ассоциированной гастродуоденальной патологии (хронического гастрита и язвенной болезни), имеющих популяционно-зависимые закономерности.

Установлена причина взаимосвязи между генетическими особенностями инфекта у хакасов и европеоидов с Helicobacter pylori-ассоциированной гастродуоденальной патологией и клиническими проявлениями заболеваний. У европеоидов при язвенной болезни частым является субтип sls2 vacA Helicobacter pylori, у больных хроническим гастритом - ml vac A Helicobacter pylori. У хакасов sls2 vacA штаммы Helicobacter pylori чаще встречаются при язвенной болезни, ш2 vacA Helicobacter pylori - при хроническом гастрите. CagA штаммы Helicobacter pylori у европеоидов и хакасов чаще встречаются при язвенной болезни, чем при хроническом гастрите.

Установлены общие закономерности и особенности нарушений локального иммунитета у хакасов и европеоидов при Helicobacter pylori-ассоциированной гастродуоденальной патологии. Показана роль нарушения баланса цитокинов в сыворотке крови (IL-4, IL-10, TNFa) в иммунопатогене-зе Helicobacter pylori-ассоциированных заболеваний гастродуоденальной зоны у хакасов и европеоидов. Выявлены особенности спонтанной и ФГА-индуцированной продукции интерлейкинов мононуклеарными лейкоцитами крови у пациентов с Helicobacter pylori-сопряженными хроническим гастритом и язвенной болезнью, характеризующиеся снижением базальной и резервной продукции IL-2 у хакасов и увеличением продукции IL-4, IL-10 - у европеоидов. Выявлены нарушения реализации спонтанного и индуцированного перекисью водорода in vitro апоптоза лимфоцитов крови, полученных у хакасов и европеоидов, больных Helicobacter pylori-ассоциированными хроническим гастритом и язвенной болезнью. Показано, что иммунофенотипический состав лимфоцитов крови характеризуется снижением числа CD3+-, CD4+- и СБ8+-лимфоцитов у хакасов как при хроническом гастрите, так и при язвенной болезни. У европеоидов изменения суб-популяционного состава лимфоцитов характеризуются увеличением количества CD4+- и СВ8+-лимфоцитов крови у пациентов с хроническим гастритом и язвенной болезнью.

Впервые проведено исследование распределения частоты полиморфизма генов цитокинов (С+3953Т IL-lß, IL-lRa VNTR, -330 T/G IL-2, -174 G>C IL-6, -251 T>A IL-8) у коренных и пришлых жителей Республики Хакасия. Установлена связь между предрасположенностью к Helicobacter pylori-ассоциированным язвенной болезни и хроническому гастриту и носительст-вом полиморфизмов генов С+3953Т IL-lß, IL-lRa VNTR, -330 T/G IL-2, -174 G>C IL-6, -251 T>A IL-8 у хакасов и европеоидов. Впервые выявлены ассоциации между носительством полиморфизма генов интерлейкинов и инфицированием этиологически-значимыми для развития язвенной болезни генотипами возбудителя (cagA Helicobacter pylori - у хакасов и vacA sls2 Helicobacter pylori - у европеоидов).

Теоретическая и практическая значимость

Результаты проведенного исследования позволили выявить взаимосвязь между генетическими особенностями патогена и ДНК-маркеров вовлеченности полиморфных вариантов генов цитокинов, их роль в иммунопатогене-зе Helicobacter pylori-ассоциированных хронического гастрита и язвенной болезни с учетом этно-популяционных различий коренного и пришлого населения Республики Хакасия.

Полученные фундаментальные знания об иммуногенетических факторах, обладающих протективным эффектом и определяющих риск прогресси-рования и хронизации язвенной болезни и хронического гастрита представляют основу для разработки новых подходов к прогнозированию клинического течения Helicobacter pylori-ассоциированных заболеваний, у хакасов и европеоидов, а также технологий персонализированной терапии иммунных нарушений. Идентификация полиморфизмов генов позволит в дальнейшем обоснованно определить показания для назначения эрадикационной терапии, что является достаточно важным фактором в условиях возрастающей резистентности к антибиотикам.

Положения, выносимые на защиту:

1. Различия гастродуоденальной патологии (хронический гастрит, язвенная болезнь) у европеоидов и хакасов обусловлены генетическими особенностями Helicobacter pylori. У хакасов при язвенной болезни превалируют cagA, при хроническом гастрите - m2 vac А штаммы Helicobacter pylori. У европеоидов при язвенной болезни чаще встречаются s 1 s2 vacA, при хроническом гастрите - ml vacA штаммы Helicobacter pylori.

2. Нарушения функциональных свойств компонентов локального (на уровне органа-мишени) и системного иммунитета у пациентов с хроническим гастритом и язвенной болезнью, ассоциированными с Helicobacter pylori, носят однонаправленный характер и различаются у представителей разных этнических групп (хакасы, европеоиды).

3. Распространенность полиморфизмов генов цитокинов у коренного и пришлого населения Республики Хакасия различается. У хакасов риск развития язвенной болезни ассоциирован с полиморфизмами -330 T/G IL-2 (генотип GG) и -251 Т>А IL-8 (генотип АА); у европеоидов - с С+3953Т IL-lß (генотип СС), IL-lRa VNTR (генотип R2R3) и -174 G>C IL-6 (генотип СС).

Предикторами хронического гастрита у хакасов являются полиморфизм гена - С+3953Т IL-ip (генотип СТ); у европеоидов - IL-IRa VNTR (генотип R2R3) и -330 T/G IL-2 (генотип GT).

Апробация и реализация работы

Результаты проведенных исследований докладывались и обсуждались на II и IV межрегиональных научно-практических конференциях «Этносы развивающейся России: проблемы и перспективы» (Абакан, 2008; 2011), научной конференции с международным участием, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Е. Ф. Ларина «Нейрогуморальные механизмы регуляции органов пищеварительной системы в норме и патологии» (Томск, 2007), международной конференции «Генетика человека и патология» (Томск, 2007), VIII, IX, X, XI Восточно-Сибирских гастроэнтерологических конференциях с международным участием «Клинико-эпидемиологические и этно-экологические проблемы заболеваний органов пищеварения» (Красноярск, 2008; Иркутск, 2009; Абакан, 2010; Иркутск, Чита, 2011), Всероссийской научной конференции «Современные эпидемиологические и профилактические аспекты профилактики инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» (Санкт-Петербург, 2008), XI, XII, XIII, XIV научно-практических конференциях «Актуальные проблемы медицины» (Абакан, 2008; 2009; 2010; 2011), итоговой научно-практической конференции ГУ НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН «Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири» (Кызыл, 2008; Абакан, 2009; Красноярск 2010), XXIth, XXIIth, XXIIIth, XXIVth International Workshop on Helicobacter and related bacteria in chronic digestive inflammation and gastric cancer (Рига, 2008; Порто, 2009; Роттердам, 2010; Дублин, 2011), XIV и XV Российских Гастроэнтерологических Неделях (Москва, 2008; 2009), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2009; 2010), Всероссийской конференции «Компенсаторноприспособительные процессы: фундаментальные экологические и клинические аспекты» (Новосибирск, 2009), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири» (Красноярск, 2010; Абакан, 2011), Третьем съезде военных врачей медико-профилактического профиля Вооруженных сил Российской Федерации (Санкт-Петербург, 2010), Международной конференции «3-е тысячелетие: Взгляд молодых ученых» (Санкт-Петербург, 2010), XII International Eu-roasian Congress of Surgery and Gastroenterology (Баку, 2011).

Исследование выполнено в рамках проекта ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (проект «Разработка технологической платформы молекулярной диагностики и лечения социально значимых заболеваний и подготовка на ее основе научно-исследовательских кадров для молекулярной медицины», ГК № 02.740.11.0311; гранта РФФИ № 09-04-98011 рсибирьа - Региональный конкурс Сибирь «Исследование роли патогенных факторов Helicobacter pylori для превенции язвенной болезни и рака желудка у коренного и пришлого населения Хакасии» (2009-2010).

Основные положения и выводы диссертационной работы используются в учебном процессе кафедры фундаментальной медицины и гигиены в курсе «Патофизиология», в курсе «Микробиология, иммунология и вирусология», кафедры внутренних болезней для студентов, обучающихся по специальности «Лечебное дело» Медико-психолого-социального института ФГБОУ ВПО «ХГУ им. Н. Ф. Катанова»; внедрены в учебный процесс кафедры фундаментальных основ клинической медицины ГБОУ ВПО СибГМУ Мин-здравсоцразвития России в разделах «Современные проблемы медико-биологической науки» и «Молекулярные основы патологии».

Публикации

По теме диссертации опубликовано 64 работы, из них 15 статей в ведущих рецензируемых журналах и изданиях, определенных ВАК РФ, монография «Гены и болезни хакасов», 45 статей и тезисов в материалах конференций, конгрессов и съездов.

Личный вклад автора

Автором были выполнены следующие этапы работ: анализ данных отечественной и зарубежной литературы по теме диссертации, выделение и культивирование лимфоцитов крови, оценка содержания TNFa, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 в сыворотке крови и в супернатантах клеточных культур методом иммуноферментного анализа, оценка апоптотической гибели лимфоцитов крови (спонтанного и индуцированного перекисью водорода), выделение ДНК и проведение рестрикционного анализа полиморфизма генов интерлейкинов С+3953Т IL-lß, ILl-Ra VNTR, -330 T/G IL-2, -174 G/C IL-6, -251 T/A IL-8, выделение ДНК из биоптатов слизистой оболочки желудка и определение субтипов cagA, sls2 и mlm2 vac A Helicobacter pylori методом полимеразной цепной реакции, статистический анализ результатов, написание диссертации.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 256 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов и библиографического списка. Работа содержит 63 рисунка и 51 таблицу. Библиографический указатель включает 363 источника (98 - отечественных и 265 - иностранных).

Выводы

1. Различные клинические фенотипы язвенной болезни, ассоциированной с Helicobacter pylori, у коренного и пришлого населения Республики Хакасия сопровождаются доминированием в различных этнических популяциях разных, по генетическим характеристикам, патогенов. У хакасов язвенная болезнь ассоциирована с cagA штаммами Helicobacter pylori (95,2 %), у европеоидов - sls2 vac А штаммами Helicobacter pylori (55,6 %). Helicobacter pylori-ассоциированный хронический гастрит также характеризуется молеку-лярно-генетической дифференцированностью возбудителя: у хакасов хронический гастрит ассоциирован с m2 vacA штаммами (62,9 %), у европеоидов -с ml vacA штаммами Helicobacter pylori (62,1 %).

2. Изменения субпопуляционного состава клеточного инфильтрата в слизистой оболочке желудка у хакасов и европеоидов с Helicobacter pylori-ассоциированной гастродуоденальной патологией характеризуются активацией гуморального (увеличение числа CD20+-лимфоцитов) и клеточного звеньев иммунитета (возрастание количества CD4+- и С08+-лимфоцитов).

3. Дисбаланс между апоптозом (СРР-32 и Вс1-2) и пролиферацией (Ki-67) лимфоцитов слизистой оболочки желудка у хакасов и европеоидов с хроническим гастритом и язвенной болезнью, ассоциированных с Helicobacter pylori, имеет одинаковую направленность, но разную интенсивность: активность апоптоза лимфоцитов (отношение показателей СРР-32 и Вс1-2) выше при хроническом гастрите, чем при язвенной болезни; у хакасов более выражено, по сравнению с европеоидами.

4. Изменения численности субпопуляций лимфоцитов крови при гастродуоденальной патологии, ассоциированной с инфекцией Helicobacter pylori, у коренного и пришлого населения Республики Хакасия, характеризуются снижением числа CD3+-, CD4+- и С08+-лимфоцитов у хакасов как при хроническом гастрите, так и при язвенной болезни, и увеличением количества

CD4+- и CD8+-лимфоцитов у европеоидов, больных хроническим гастритом и язвенной болезнью, по сравнению с аналогичными показателями у здоровых доноров.

5. Течение Helicobacter pylori-ассоциированной гастродуоденальной патологии у больных, относящихся к разным этническим группам и проживающих на территории Республики Хакасия, сопровождается изменением числа лимфоцитов крови, вступивших в апоптоз, наиболее выраженным у хакасов, по сравнению с европеоидами.

6. Чувствительность лимфоцитов, полученных у пациентов с гастродуо-денальной патологией, ассоциированной с инфекцией Helicobacter pylori, к действию неспецифического модулятора апоптоза (0,01 % раствора перекиси водорода) in vitro снижена, по сравнению с лимфоцитарными клетками крови у здоровых доноров; выраженность указанных изменений наиболее значима у европеоидов, чем у хакасов. При язвенной болезни апоптотический индекс снижен, что свидетельствует о снижении функционального потенциала иммунных клеток при длительной инфекции Helicobacter pylori.

7. Дисбаланс интерлейкинов сыворотки крови у хакасов и европеоидов, страдающих Helicobacter pylori-ассоциированной гастродуоденальной патологией, характеризуется увеличением концентрации TNFa, IL-4 и IL-10. Особенности спонтанной и ФГА-индуцированной продукции интерлейкинов мо-нонуклеарными лейкоцитами крови у пациентов с Helicobacter pylori-сопряженными хроническим гастритом и язвенной болезнью характеризуются снижением базальной и резервной продукции IL-2 у хакасов и увеличением продукции IL-4, IL-10 - у европеоидов.

8. Распространенность полиморфизмов генов цитокинов С+3953Т IL-lß, ILl-Ra VNTR, -330 T/G IL-2, -174 G/C IL-6, -251 T/A IL-8 у хакасов и европеоидов имеет выраженные межпопуляционные различия и является определяющим в иммунопатогенезе Helicobacter pylori-сопряженных хронического гастрита и язвенной болезни у хакасов и европеоидов.

9. Иммуногенетическими предикторами Helicobacter pylori-ассоциированиой язвенной болезни у хакасов являются генотип АА промо-торного региона -251 Т>А гена IL-8 (OR=3,15), генотип GG промоторного региона -330 T/G IL-2 (OR=l,91); у европеоидов - генотип СС промоторного региона С+3953Т гена IL-1(3 (OR=2,63), генотип R2R3 гена IL-IRa (C>R=8,08), генотип СС промоторного региона -174 G>C гена IL-6 (OR=2,25). У хакасов риск развития хронического гастрита при инфицировании Helicobacter pylori ассоциирован с генотипом СТ полиморфизма С+3953Т гена IL-1J3 (OR=l,97); у европеоидов - с генотипом R2R3 гена IL-IRa (OR=4,41) и генотипом GT промоторного региона -330 T/G гена IL-2 (OR=2,35).

10. Фактором, снижающим риск развития язвенной болезни, ассоциированной с Helicobacter pylori, у хакасов является генотип ТА промоторного региона -251 Т>А гена IL-8 (OR=0,40); у европеоидов - генотипы СТ и ТТ промоторного региона С+3953Т гена IL-1(3 (OR=0,51 и (Ж=0,44, соответственно), генотипы R3R4 и R4R4 гена IL-IRa (OR=0,30 и C)R=0,51, соответственно). Риск развития хронического гастрита, ассоциированного с Helicobacter pylori, снижен у хакасов и европеоидов - носителей генотипа ТТ промоторного региона -330 T/G IL-2 (C)R=0,42 и QR=0,28, соответственно).

Заключение

Исследование иммунопатогенеза НР-ассоциированной гастродуоде-нальной патологии, проведенное у двух популяций, проживающих на одной территории - Республики Хакасия, позволило выявить ряд клинических особенностей течения хронического гастрита и язвенной болезни. Различия касались частоты ведущего синдрома функциональной диспепсии: у хакасов преобладали синдромы дискинетической и неспецифической диспепсии, у европеоидов - синдром язвенно-подобной диспепсии встречался чаще, чем у хакасов. В целом, течение болезни у хакасов характеризуется как более легкое (степень тяжести, частота обострений, наличие осложнений), по сравнению с европеоидами.

Известно, что развитие и ход инфекционного процесса предопределяется результатом взаимодействия макро- и микроорганизма и зависит как от вирулентности возбудителя, определяемой совокупным действием его факторов патогенности, так и от антиинфекционного потенциала макроорганизма, зависящего, в том числе, от функциональных возможностей клеток иммунной системы. Результаты, полученные в ходе настоящего исследования, о молекулярно-генетических особенностях макроорганизма, распространенности определенных видов НР и их ассоциации с заболеванием среди коренных (с Са§А+-штаммами) и пришлых (с УасА+-штаммами) жителей Республики Хакасия свидетельствуют о том, что гипотеза о консервации определенных штаммов НР в разных этнических группах имеет подтверждение и в данной популяции.

По результатам проведенного нами исследования, изменения характеристик локального и системного иммунитета у пациентов с НР-ассоциированной патологией (рис. 63) коррелировали со степенью выраженности инфекционного процесса и с популяционными особенностями обследованных. НР вызывает длительно протекающую инфекцию, в результате которой возникает гиперактивация локальной иммунной системы с последующей декомпенсацией по количественным и качественным признакам и снижением эффективности иммунного ответа.

Обнаруженные закономерности реализации апоптотической гибели иммунных клеток являются ключевым звеном нарушения иммунореактивности макроорганизма в патогенезе НР-ассоциированных заболеваний, так как уменьшение количества клеток иммунной системы сопряжено с изменениями соотношения субпопуляций лимфоцитов и является проявлением патологической иммунореактивности.

Очевидно, что выявленные изменения, с одной стороны, являются следствием нарушения иммунологического равновесия, обеспечивающего адекватное реагирование макроорганизма на НР-инфекцию. С другой стороны, являются проявлением генетической детерминации функционирования иммунной системы.

Персистенция HP

Попадание цитокинов в кровь, миграция клеток в органы дифференцировки и пролиферации

Модуляция апоптоза

Цитокиновый дисбаланс

Опосредованное цитопатическое действие HP

Нарушение активации Т-лимфоцитов

Антигенный дрейф, бактериальная мимикрия

Дисбаланс локального Thl/Th2 иммунного ответа

Полиморфизм генов цитокинов

Нарушение активации факторов транскрипции

Изменение белкового продукта

Нарушение антиген-презентации сож

Снижение активационного сигнала

Изменение содержания основных иммунорегуляторных цитокинов в сыворотке крови

ПК

Цитокиновый дисбаланс

Деструкция слизистой оболочки желудка Активация клеточного иммунного ответа

Нарушение соотношения CD-лимфоцитов клеточного и гуморального звена

Дисбаланс системного Thl/Th2 иммунного ответа

Изменения в апоптоз-регулирующих системах

Хроническая персистенция HP

Угнетение гуморального иммунного ответа

Миграция иммунных клеток в слизистую оболочку желудка

Рис. 63. Молекулярно-клеточные механизмы нарушения локального и системного иммунитета при инфекции Helicobacter pylori. СОЖ - слизистая оболочка желудка, ПК - периферическая кровь, по данным результатам собственных исследований (выделено цветом)