Автореферат и диссертация по медицине (14.00.30) на тему:Молекулярно-генетические подходы к микробиологическому мониторингу в системе эпидемиологического надзора за риккетснозами группы клещевой пятнистой лихорадки и бартонеллёзами

На правах рукописи

Коломеец Анна Николаевна

003484094

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОМУ МОНИТОРИНГУ В СИСТЕМЕ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА

ЗА РИККЕТСИОЗАМИ ГРУППЫ КЛЕЩЕВОЙ ПЯТНИСТОЙ ЛИХОРАДКИ И БАРТОНЕЛЛЁЗАМИ

14.00.30 — «эпидемиология» 03.00.07 - «микробиология»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2.6 НОЯ 2009

Омск-2009

003484094

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Рудаков Николай Викторович доктор медицинских наук Шпынов Станислав Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Обухова Татьяна Михайловна (Омская государственная медицинская академия)

доктор медицинских наук, профессор Горовиц Эдуард Семёнович (Пермская государственная медицинская академия)

Ведущая организация:

Научный центр проблем здоровья и репродукции человека СО РАМН

Защита состоится «15» декабря 2009 года в 12 часов на заседании диссертационного совета (Д 208.065.03) при Омской государственной медицинской академии (644043, г.Омск, ул.Ленина, 12).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Омской государственной медицинской академии.

Автореферат разослан « » ноября 2009г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук, доцент

Р.Н. Готвальд

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Риккетсии и бартонеллы относятся к возбудителям «новых» и «возвращающихся» инфекций. Отмечается активизация природных очагов эндемических риккетсиозов в разных странах мира, причины которой требуют всестороннего изучения.

Клещевой риккетсиоз зарегистрирован на 18 административных территориях азиатской части РФ. В последние годы в очагах клещевого риккетсиоза и на территориях с отсутствием заболеваемости этой инфекцией выявлен ряд патогенных риккетсий и риккетсий с неустановленной патогенностью, что требует разработки новых подходов к эпидемиологическому надзору за природными очагами (Шпынов С.Н., Рудаков Н.В., 2004). Имеющиеся данные о гетерогенности антигенных и генетических свойств риккетсий привели к необходимости комплексного использования классических и современных молекулярно-генетических методов исследования (Балаева Н.М.,1991; Roux V, Fournier Р-Е, Raoult D,1996).

В связи с циркуляцией в природных очагах различных альфа-протеобактерий и схожестью клинических проявлений вызываемых ими заболеваний существенную актуальность имеет совершенствование методов и алгоритмов лабораторной диагностики заболеваний, вызываемых риккетсиями группы клещевой пятнистой лихорадки (КПЛ), бартонеллами и другими клещевыми альфа-протеобактериями. Одним из перспективных и недостаточно разработанных подходов является использование технологий, основанных на полимеразной цепной реакции (ПЦР) и рестрикционном анализе как более простой и доступной в практических лабораториях альтернативе технологиям ПЦР-секвенирования. Указанный подход может быть использован для повышения эффективности эпидемиологического надзора и лабораторной диагностики риккетсиозов группы КПЛ, дифференциации R.sibirica от других видов риккетсий группы КПЛ, прежде всего от наиболее распространенной в клещах рода Dermacentor Rickettsia raoultii sp. nov. Молекулярно-генетические исследования с использованием ПЦР-рестрикционного анализа для дифференциации циркулирующих на территории РФ патогенных и непатогенных риккетсий в иксодовых клещах и в материалах от больных ранее не проводились. Широкое применение молекулярно-генетических методов позволило выявить, что бартонеллы являются этиологическими агентами целого спектра инфекционных болезней. Однако эпидемиологическая значимость членистоногих переносчиков и млекопитающих в качестве резервуара бартонелл в РФ изучена недостаточно.

Цель работы

Цель - повышение эффективности эпидемиологического надзора и лабораторной диагностики риккетсиозов и других инфекций, вызываемых клещевыми альфа-протеобактериями, на основе подбора и совершенствования адекватных молекулярно-генетических подходов.

Задачи

1. Провести комплексный анализ структуры и уровней заболеваемости инфекций, передаваемых клещами, в территориальном и временном аспектах по федеральным округам РФ и административным территориям Сибирского федерального округа.

2. Отработать алгоритмы лабораторной дифференциации риккетсий группы КПЛ (R.sibirica, R.raoultii) с использованием ПЦР-рестрикционного анализа на музейных штаммах риккетсий.

3. Провести сравнительный анализ этиологической структуры и распространенности риккетсий в переносчиках и в материалах от пациентов на эндемичных по клещевому риккетсиозу территориях (Алтайский край) и территориях, свободных от этой инфекции (Омская область).

4. Провести скрининг заражённости бартонеллами диких мелких млекопитающих и клещей с использованием ПЦР.

5. Обосновать алгоритмы лабораторной диагностики риккетсиозов и детекции бартонелл и риккетсий с использованием технологий, основанных на ПЦР и рестрикционном анализе, в системе эпидемиологического надзора. Научная новизна

Впервые в территориальном и временном аспектах проанализирована структура заболеваемости клещевыми инфекциями в разрезе федеральных округов РФ и административных территорий Сибирского федерального округа. Увеличение в структуре заболеваемости клещевыми инфекциями ИКБ связано, в первую очередь, с уменьшением регистрируемой заболеваемости КЭ. Преобладание ИКБ в структуре заболеваемости отмечено в Центральном ФО, КЭ - в Уральском ФО, в Сибирском ФО регистрируются все три наиболее распространенные инфекции (КЭ, ИКБ, КР), КР преобладает в Дальневосточном ФО. На территориях, смежных с Омской областью, отмечается наиболее разнообразная структура заболеваемости клещевыми инфекциями.

С использованием комплекса лабораторных методов исследования установлена циркуляция на территории Омской области инфекционных агентов не только официально регистрируемых заболеваний (клещевого энцефалита и ик-содового клещевого боррелиоза), но также возбудителей новых инфекций -R.raoultii (потенциальный патоген человека, вызывающий заболевание, сходное с синдромом TIBOLA) и Bartonella зрр.(возбудители широкого спектра инфекций, объединяемых термином «бартонеллёзы»).

Осуществлена сравнительная оценка инфицированное™ риккетсиями переносчиков, собранных на эндемичных по клещевому риккетсиозу и свободных от этой инфекции территориях.

Впервые получены данные ПЦР-скрининга ДНК бартонелл в иксодовых клещах и мелких млекопитающих в Омской области, свидетельствующие об их широком распространении в Западной Сибири

Впервые разработаны и апробированы технологии молекулярно-биологических исследований, основанные на ПЦР-рестрикционном анализе,

для дифференциации основных видов риккетсий, выявляемых в природных очагах Западной Сибири.

Впервые обосновано применение ПЦР-рестрикционного анализа для дифференциации патогенных (R.sibirica) и условно-патогенных (генотипы Rraoultii) риккетсий в иксодовых клещах и в материалах от больных. Отработаны алгоритмы дифференциации риккетсий основных видов и лабораторной диагностики риккетсиозов у пациентов, основанные на ПЦР-рестрикционном анализе. Практическая значимость работы и внедрения

Обосновано введение в систему эпизоотолого-эпидемиологического надзора микробиологического мониторинга за риккетсиями группы КПЛ и барто-неллами.

В результате проведенных исследований отработана тактика применения ПЦР-рестрикционного анализа в комплексе методов, применяемых для молекуляр-но-биологической дифференциации альфа-протеобактерий в природных очагах.

Разработанные алгоритмы лабораторной диагностики на основе ПЦР-рестрикционного анализа использованы для совершенствования эпидемиологического надзора в природных очагах трансмиссивных инфекций.

По результатам проведенных исследований опубликованы статьи методического характера. Подготовлено учебное пособие «Молекулярно-генетические методы диагностики риккетсиозов группы КПЛ».

Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедре микробиологии, иммунологии и вирусологии ОмГМА и в научно-исследовательской деятельности Омского НИИПОИ. Основные положения, выносимые на защиту

1. Выявлены существенные отличия в структуре и уровнях заболеваемости инфекциями, передаваемыми клещами, в территориальном и временном аспектах по федеральным округам РФ и административным территориям Сибирского федерального округа, являющиеся отражением пространственной и функциональной структуры природных очагов.

2. Население Омской области подвержено риску заражения при присасывании клеща не только возбудителями регистрируемых инфекций (клещевой энцефалит и иксодовый клещевой боррелиоз), но и возбудителями «новых» инфекций, вызываемых R.raoultii и Bartonella spp., что требует совершенствования лабораторной диагностики и эпидемиологического надзора в сочетанных очагах.

3. ПЦР-рестрикционный анализ является эффективным методом для дифференциации R.sibirica и R.raoultii в комплексе методов, применяемых для молекулярно-биологической дифференциации альфа-протеобактерий в природных очагах.

4. Технологии, основанные на ПЦР-рестрикционном анализе, могут быть использованы для совершенствования лабораторной диагностики и эпизо-отолого-эпидемиологического надзора за клещевыми риккетсиозами. Апробация работы

Диссертационная работа апробирована на совместном заседании кафедр эпидемиологии, микробиологии, вирусологии и иммунологии Омской государ-

ственной медицинской академии, с участием научных сотрудников Омского НИИ природно-очаговых инфекций, 2009 г.

Основные положения диссертации доложены на следующих отечественных и международных конференциях: V межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы здоровья населения Сибири: гигиенические и эпидемиологические аспекты», г.Омск, 2004г.; научно-практической конференции, посвященной 75-летию кафедр инфекционных болезней взрослых и детей ОмГМА, г.Омск, 2005г.; конференции с международным участием «Актуальные вопросы региональной инфекционной патологии», посвященной 95-летию Института эпидемиологии и микробиологии НЦ МЭ ВСНЦ СО РАМН, г.Иркутск, 2007г.; VII межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения», г.Омск, 2007г.; VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, г.Москва, 2007г.; VIII межрегиональной конференции с международным участием «Актуальные проблемы сохранения здоровья населения Сибири», посвящённой 70-летию медико-профилактического факультета Омской государственной медицинской академии, г.Омск, 2008г.

Основные результаты опубликованы в 10 печатных работах.

Объём и структура диссертации

Работа изложена на 315 страницах машинописного текста, иллюстрирована 15 таблицами и 89 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, четырёх глав собственных исследований, заключения, выводов. Библиографический указатель содержит 217 источников, из которых 58 работ отечественных и 132 - зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Работа проводилась в соответствии с планом научно-исследовательской работы Омской государственной медицинской академии, номер государственной регистрации 01.20.06.01.310. В работе использован комплекс эпидемиологических, микробиологических, серологических, молекулярно-генетических и статистических методов.

По данным официальной регистрации из «Бюллетеня об инфекционной заболеваемости в Российской Федерации» и материалов Управления Роспотреб-надзора по Омской области проведен анализ уровней регистрируемой заболеваемости клещевым энцефалитом (КЭ), иксодовым клещевым боррелиозом (ИКБ) за 1997-2007гг. в Российской Федерации и Омской области и клещевым риккетсиозом (КР) в РФ, а также сравнительный анализ структуры заболеваемости КЭ, ИКБ и КР во всех регионах РФ за 2000 и 2007гг.

Лабораторные разделы исследования проводились в период с 2006г. по 2008г. на базе лаборатории клещевых боррелиозов и паразитозов ФГУН «Омский НИИ природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора.

Всего исследовано: 7 штаммов риккетсий из музея Омского НИИПОИ; клещи, снятые с людей в пригородной зоне г.Омска и собранные в Кормилов-ском и Омском районах Омской области в мае-июне 2007г.: 143 образца, из них I.persulcatus - 28 обр., D.reticulatus - 115 обр. (такое соотношение видов клещей обусловлено тем, что данные районы и г.Омск находятся в зоне южной лесостепи, где наблюдается низкая численность I.persulcatus); биоптаты больных, госпитализированных в эпидемический сезон 2006г. в г.Барнауле, и сыворотки крови этих же пациентов (45 обр.), взятые при поступлении в стационар на 2-10 день с момента заболевания; селезёнки мелких мышевидных грызунов, отловленных в различных районах Омской области в 2005-2008гг.(264 обр.); платяные вши (20 обр.), снятых с лиц БОМЖ в г.Новосибирск в 2005г.

Предварительно была проанализирована последовательность фрагмента гена отрА различных видов риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки, полученная из базы данных GenBank, определены сайты рестрикции используемых нами эндонуклеаз и рассчитан вес получаемых при рестрикции фрагментов. Для апробации разработанного варианта молекулярно-генетических методов - полимеразной цепной реакции и рестрикционного анализа, основанного на полиморфизме длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ анализа), использованы музейные штаммы риккетсий Омского НИИПОИ: R. sibirica subsp.BJ-90 («Приморье 32/84»), R.sibirica subsp.sibirica («Баево 107/87»), R.raoultii генотипа DnS14 («Шайман»), R.raoultii генотипа DnS28 («Бурятия-5/2000»), R.raoultii генотипа RpA4 («5/98-Караганда»),

На основании результатов ПЦР-ПДРФ анализа был разработан алгоритм детекции и идентификации риккетсий группы КПЛ в клиническом и полевом материале. С этой целью исследованы иксодовые клещи, собранные в природных стациях и снятые с людей; сыворотки и биоптаты от пациентов, госпитализированных с подозрением на клещевой риккетсиоз (KP), любезно предоставленные врачом-инфекционистом Арсеньевой И.В. (МУЗ ГБ №5 г.Барнаул).

Амплификацию фрагментов ДНК риккетсий осуществляли в однораундо-вой ПЦР с использованием стандартных праймеров и набора реактивов для ПЦР «АмплиСенс» (г.Москва). Все образцы ДНК, выделенных из 7 штаммов риккетсий, 126 экземпляров клещей, 45 биоптатов и сывороток, изначально исследовали в ПЦР на наличие фрагмента гена цитрат-синтазы, который является универсальным для всех риккетсий, следовательно его обнаружение даёт возможность сделать вывод о наличии ДНК риккетсии в пробе. Затем все пробы ДНК (223 обр.) исследовали в ПЦР с праймерами, специфичными для фрагмента гена, кодирующего поверхностный белок ЮтрА риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки. Этот ген имеется у большинства риккетсий данной группы, что позволяет дифференцировать их от группы сыпного тифа и предковой группы. В дальнейшем ПЦР-фрагменты, полученные при амплификации гена отрА (34 обр.), расщепляли рестрикционными эндонуклеазами Pstl и Rsal («SibEnzyme» г. Новосибирск).

В связи с актуальностью вопроса о «новых» инфекциях, вызываемых бар-тонеллами, нами также было проведено скрининговое исследование методом ПЦР селезёнок мелких мышевидных грызунов, отловленных в лесостепной зо-

не Омской области в 2005-2007гг. (264 обр.); платяных вшей, снятых с лиц БОМЖ в г.Новосибирске в 2005г. (20 обр.) и иксодовых клещей (17 обр.), снятых с людей, пребывавших в природных стациях в 2007г. Для амплификации ДНК бартонелл использовали однораундовую ПЦР с праймерами, специфичными для 16S-23S межгенной спейсерной области (ITS). Для приготовления реакционной смеси использовался набор реактивов для ПЦР «АмплиСенс» (г. Москва).

Все результаты ПЦР анализировали по флюоресценции интеркалирован-ного в ДНК бромистого этидия после электрофореза в 2% агарозном геле.

Кроме того, клещи, снятые с людей, исследовали методом иммунофер-ментного анализа (ИФА) на наличие антигена вируса комплекса клещевого энцефалита (НПО «Вектор-Бест» (г.Новосибирск) и методом ПЦР на наличие ДНК боррелий («АмплиСенс» (г.Москва).

Статистическая обработка данных осуществлена с помощью пакета прикладных программ Microsoft Excel 2003 с использованием параметрических критериев описательной статистики, которые включали в себя вычисление экстенсивных показателей, ошибки интенсивных и экстенсивных показателей, оценку достоверности различий сопоставляемых показателей и др., а также анализ динамических рядов, рекомендованные к использованию при изучении эпидемиологических явлений.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Эпидемиологическая характеристика инфекций, передающихся иксодовымн клещами

В Западной Сибири отмечена сочетанность природных очагов клещевого энцефалита, иксодового клещевого боррелиоза, клещевого риккетсиоза, Омской геморрагической лихорадки (Матущенко A.A. и др. 1998, Рудаков Н.В. и др., 2006; Ястребов В.К., 2007).

С широким внедрением в практику молекулярно-генетических методов детекции спектр возможных патогенов человека расширяется. Так, например, в клещах Ixodes persulcatus, собранных на территории Тюменской, Омской, Новосибирской области и Алтайского края была выявлена Ehrlichia mûris (Шпынов С.H. и др., 2002; Shpynov S.N. et.al, 2004), вероятный агент моноци-тарного эрлихиоза человека (МЭЧ). Анаплазмы геногруппы гранулоцитарного анаплазмоза человека (ГАЧ) были выявлены в клещах I.persulcatus на территориях Балтийского региона России (Дубинина Е.В., Алексеев А.Н., 1999), Алтайского, Приморского (Шпынов С.Н. и др., 2002), Хабаровского края (Ме-дянников О.Ю. и др., 2001), Пермской и Новосибирской области (Telford S.R.et.al., 2002; Morozova O.V.et.al., 2002). Можно предполагать дальнейшее расширение спектра выявляемых в клещах микроорганизмов, включая потенциальные патогены человека.

В Омской области имеются сочетанные природные очаги таких инфекций как клещевой энцефалит (КЭ), иксодовый клещевой боррелиоз (ИКБ), анаплазмозы, инфекционные агенты которых выявлены в клещах родов Ixodes и Der-

macentor. Из инфекций, передающихся клещами, официально регистрируются КЭ и ИКБ. Детекция в переносчиках патогенных и условно-патогенных риккет-сий и эрлихий даёт возможность предполагать наличие на территории Омской области инфекций, вызванных и этими возбудителями, однако их лабораторная диагностика невозможна без применения современных молекулярно-биологических методов.

Нами была проанализирована динамика и структура регистрируемой заболеваемости клещевым энцефалитом, иксодовым клещевым боррелиозом в РФ, Омской области, сельских районах Омской области и г.Омске, а также клещевым риккетсиозом в РФ. Анализ заболеваемости сопровождался расчётом темпа прироста (снижения) за период 1997-2007гг., с помощью которого определялось наличие/отсутствие тенденции прироста/снижения заболеваемости. Статистическую обработку проводили с использованием пакета прикладных программ Microsoft Excel 2003. Выполнен альтернативный и вариационный анализ (расчёт экстенсивных, интенсивных показателей, средних арифметических величин, а также средних квадратических отклонений), расчёт динамических рядов. Для оценки статистической значимости различий использовались параметрические критерии (t-критерий Стьюдента при р<0,05).

При анализе динамики заболеваемости КЭ по РФ была выявлена тенденция к снижению заболеваемости (Тсн=8,37%). Выраженная тенденция снижения регистрируемой заболеваемости КЭ наблюдается и в Омской области (Тс„=16,8%). Следовательно, тенденции заболеваемости КЭ в РФ и Омской области совпали. За анализируемый период уровень заболеваемости КЭ в РФ превысил показатели по Омской области в 1,5 раза (р<0,001).

При анализе динамики заболеваемости КЭ в сельских районах Омской области также выявлена выраженная тенденция к её снижению: Тс„=17,7%. Показатели заболеваемости КЭ в сельских районах Омской области и среднефеде-ральные показатели за анализируемый период не имеют статистически значимых различий (р>0,05).

При анализе динамики заболеваемости КЭ в г.Омске установлено наличие тенденции к снижению заболеваемости (Тсн=7,5%). За исследуемый период показатели заболеваемости КЭ в РФ превысили показатели в г.Омске в 5,4 раза (р<0,001).

В результате проведённого анализа можно сделать следующее заключение: динамика регистрируемой заболеваемости КЭ в г.Омске, сельских районах Омской области и по Омской области в целом свидетельствует о наличии выраженной тенденции к снижению. Эта тенденция совпала с общей тенденцией, наблюдаемой по РФ. Отмечался пик заболеваемости в 1999г., который совпал с максимумом по РФ, что, вероятно, является следствием факторов, оказавших влияние на заболеваемость КЭ в большинстве эндемичных регионов России. В Омской области границы ареала I.persulcatus сместились южнее (Рудакова С. А. и др., 2002), изменилось соотношение I.persulcatus и клещей рода Dermacentor в пользу I.persulcatus (Якименко В.В. и др., 2007). Схожие изменения происходят и в других регионах РФ, т.е. эти процессы носят общий характер (Якина Н.Х., 2008). Несмотря на снижение регистрируемой заболеваемости, численность

клещей [.регсика^ и О.геПсиЫиз в Омской области с 2005г. по 2008г. имеет тенденцию к увеличению (Емцова Т.Б. и др., 2008).

При изучении динамики заболеваемости ИКБ в РФ и в целом по Омской области выявлены следующие закономерности: существенных изменений в динамике заболеваемости ИКБ по РФ и Омской области не выявлено (Тсн=0,3% и Т11р=0,4% соответственно). При этом среднефедеральные показатели заболеваемости в 4,3 раза превысили таковые по области (р<0,001).

Динамика заболеваемости ИКБ в сельских районах Омской области имела умеренную тенденцию к снижению - (Тсн=3,8%), и показатели в 3,5 раза ниже по сравнению с среднефедеральными (р<0,001).

Динамика заболеваемости ИКБ в г.Омске демонстрировала наличие выраженной тенденции к росту за 1997-2007гг. (Тпр=8,9%). Показатели заболеваемости ИКБ в РФ в 7,4 раза превысили показатели заболеваемости в г.Омске (р<0,001).

Следовательно, тенденция снижения заболеваемости КЭ в Омской области совпадает с таковой по России, в отличие от ИКБ. Уровень заболеваемости ИКБ в РФ и Омской области оставался стабильным за период 1997-2007гг.

Третьей нозоформой, динамика заболеваемости которой нами исследовалась, является клещевой риккетсиоз (КР). Данное заболевание, также как КЭ и ИКБ, является облигатно-трансмиссивным, и имеет достаточно широкое распространение в Азиатской части России и за пределами РФ. В отличие от КЭ и ИКБ, КР не регистрируется на территории Омской области. В динамике заболеваемости КР в РФ за 1997-2007гг. имеется тенденция к снижению заболеваемости (Тсн=10,2%).

При анализе структуры заболеваемости инфекций, передаваемых клещами, в РФ в 2000г. и 2007г. было установлено, что в 2000г. КЭ составлял 36,0%, на долю ИКБ приходилось 48,0%, на долю КР - 16,0%. В 2007г. доля КЭ в структуре заболеваемости снизилась, составив 25,0%; доля ИКБ, напротив, возросла и составила 58,0%. Долевое участие КР практически не изменилось - 17,0%. Указанные изменения структуры заболеваемости определяются, вероятно, уменьшением регистрируемой заболеваемости КЭ.

Несмотря на снижение уровня заболеваемости в целом, современная ситуация по КЭ в РФ может быть оценена как напряжённая в ряде уральских и сибирских регионов (20,0-30,0 на 100 тыс. населения). Причём, долевое значение отдельных регионов России в заболеваемости КЭ отличается весьма значительно. Среднемноголетняя доля больных на Урале в 1999-2005гг. составляла 33,0%, в Восточной Сибири - 31,6%, в Западной Сибири - 24,5%, в Европейской части России - 7,2%, на Дальнем Востоке - 2,7% (Ястребов В.К., 2007).

Первое место в 2000г. в структуре территориального распределения заболеваемости КЭ принадлежало Сибирскому ФО (50,9%), на втором месте располагался Приволжский ФО (21,9%). Третье место по заболеваемости занимал Уральский ФО (16,5%). На Северо-Западный, Дальневосточный и Центральный ФО приходилось 6,1%, 3,4% и 1,1% соответственно.

В 2007г. в структуре территориального распределения заболеваемости КЭ также преобладал Сибирский ФО (52,6%), Уральский и Приволжский ФО обу-

словили 16,4% и 16,0% заболеваний соответственно. На Северо-Западный, Центральный и Дальневосточный ФО приходилось 11,0%, 2,2% и 1,8% соответственно. Общее число зарегистрированных случаев КЭ снизилось в 2007г. по сравнению с 2000г. в 1,8 раза (р<0,001).

Следовательно, на фоне снижения уровня регистрируемой заболеваемости КЭ отмечается некоторое изменение «вклада» очаговых регионов в суммарную заболеваемость этой инфекцией в РФ при сохранении ведущей роли Сибирского ФО.

Относительно высокий уровень заболеваемости связан с высокой численностью и зараженностью клещей ВКЭ, недостаточным объемом вакцинации и экстренной иммунопрофилактики (Г.Г. Онищенко, 2003), сокращением площадей противоклещевых обработок или использования для этих целей малоэффективных препаратов (Г.Г.Онищенко и др., 2007).

В структуре территориального распределения ИКБ в 2000г. первое место принадлежало Приволжскому ФО (28,7%). Вторым по доле вклада в общую заболеваемость ИКБ являлся Сибирский ФО (20,1%). Третье место принадлежало Северо-Западному ФО (18,9%). Четвёртое место в структуре заболеваемости ИКБ занимал Центральный ФО (16,2%). Пятое место принадлежало Уральскому ФО (11,6%). На шестом месте располагался Дальневосточный ФО (4,3%). Последнее место в территориальной структуре заболеваемости ИКБ занимал Южный ФО (0,23%). В условиях стабильного уровня заболеваемости ИКБ в РФ в 2000-2007гг. доли и ранг различных регионов в структуре заболеваемости практически не изменились.

Природные очаги КР охватывают 18 административных территорий южных регионов Сибири и Дальнего Востока (Рудаков Н.В. и.др., 2006). Основная часть заболеваний регистрируется в республике Алтай, Алтайском крае, Красноярском крае. Кроме этого, заболевания регистрируются в Тюменской, Курганской, Новосибирской, Кемеровской, Иркутской, Читинской, Амурской областях, республиках Тыве, Бурятии, Хабаровском и Приморском краях, Еврейской автономной области. До 80% случаев заболеваний КР в России обусловливают природные очаги Красноярского и Алтайского края (Рудаков Н.В. и др., 2006). Проведённый нами анализ показал, что на Западно-Сибирский регион приходится 58,0% всех заболевших в России, на Восточно-Сибирский - 24,0%; на Дальневосточный - 18,0%.

Первое место в территориальной структуре заболеваемости клещевым риккетсиозом в 2000г. принадлежало Сибирскому ФО (78,2%), второе -Дальневосточному ФО (21,4%), третье - Уральскому ФО (0,4%). В 2007г. первое место занимал СФО (79,3%); второе принадлежало Дальневосточному ФО (20,1%); третье - Уральскому ФО (0,6%). В других регионах РФ КР не регистрировался. Следовательно, за период 2000-2007гг. территориальная структура заболеваемости КР в РФ не претерпела существенных изменений, несмотря на снижение общего количества регистрируемых случаев КР в РФ.за данный период в 1,4 раза (р<0,001).

При анализе долевого участия отдельных нозологий (клещевого энцефалита, иксодового клещевого боррелиоза, клещевого риккетсиоза) в

структуре клещевых инфекций каждого региона были получены следующие результаты.

В Центральном ФО в 2000г. основная часть клещевых инфекций приходилась на ИКБ (95,0%), КЭ составлял небольшую часть (4,96%). В 2007г. структура клещевых инфекций в ЦФО не претерпела существенных изменений. Клещевой энцефалит составил 5,2%, иксодовый клещевой боррелиоз - 94,8%. В Северо-Западном ФО доля КЭ - 19,36%, хотя большую часть клещевых инфекций составлял ИКБ (80,6%). В 2007г. ситуация не претерпела существенных изменений. Доля КЭ составила 21,2%, а ИКБ - 78,8%. В Южном ФО в 2000г. клещевой энцефалит и клещевой риккетсиоз не регистрировали, все случаи заболеваний после укуса клещей были диагностированы как ИКБ. В 2007г. ситуация не изменилась. В Приволжском ФО в 2000г. на долю ИКБ приходилось 63,7% всех случаев регистрируемых клещевых инфекций, на КЭ -36,3%. В 2007г. доля КЭ в структуре клещевых инфекций в этом округе снизилась, составив 20,7%; доля ИКБ, напротив, возросла до 79,3%. В Уральском ФО в 2000г. доля ИКБ составляла 48,3 %; доля КЭ - 51,7%. В данном регионе в структуре клещевых инфекций уже появляется клещевой риккетсиоз, доля которого составила 0,6%. В 2007г. ситуация по данным нозоформам изменилась следующим образом: доля ИКБ возросла на 20%, составив 68,5%; доля КЭ, напротив, снизилась до 30,8%. Доля клещевого риккетсиоза осталась неизменённой - 0,6%. В Сибирском ФО в 2000г. доля ИКБ составила 23,8%; КЭ - 45,1%; КР - 31,1 %. В 2007г. доля ИКБ возросла до 26,1%; также увеличилась доля КР, составив 41,3%. Доля КЭ, напротив, снизилась до 32,6%. В Дальневосточном ФО в 2000г. на долю ИКБ приходилось 30,8 %; на долю КЭ -18,1 %; на долю КР - 51,1%. В 2007г. в данной структуре произошли изменения. Доля КЭ снизилась до 27,7%; доля ИКБ также уменьшилась до 6,4%. Доля клещевого риккетсиоза, напротив, возросла на 15%, составив 65,8%. Следовательно, в территориальной структуре этих трёх инфекций, передаваемых через укус клеща, имеются отличия в различных округах РФ.

Территориальный анализ заболеваемости клещевыми инфекциями по федеральным округам в 2007г. показал преобладание ИКБ в структуре заболеваемости в Центральном ФО (94,8%) с постепенным снижением доли ИКБ в структуре заболеваемости на восток до 26,1% в Сибирском ФО и 27,7% в Дальневосточном ФО. Одновременно отмечается возрастание доли КЭ с 5,2% в Центральном ФО до 68,5% в Уральском ФО, и снижением до 26,1% в Сибирском ФО и до 6,4% в Дальневосточном.

На территории Уральского ФО в структуре заболеваемости клещевыми инфекциями появляется клещевой риккетсиоз (0,6%), доля которого увеличивается на восток (в Сибирском - 41,3%, а в Дальневосточном - 65,8%), тогда как вклад КЭ и ИКБ в общую структуру клещевых инфекций снижается.

Наиболее пестрая структура заболеваемости клещевыми инфекциями отмечается на территориях Уральского и Сибирского ФО, смежных с Омской областью. В Курганской области в 2000г. в структуре заболеваемости клещевыми инфекциями КЭ составлял 63,4%; на долю ИКБ приходилось 34,9%; а КР - 1,6%. В 2007 г. в структуре клещевых инфекций произошли

некоторые изменения: так, возросла доля ИКБ (39,2%); доля КЭ, напротив, снизилась (58,9%), доля КР осталась практически не изменилась (1,7%). В Тюменской области в 2000 г. на долю КЭ приходилось более половины всех клещевых инфекций (56,8 %), на долю ИКБ - 39,6 %; доля КР составляла 3,6 %. В 2007г. в Тюменской области среди клещевых инфекций увеличилась доля ИКБ (46,6%), а также КР (6,1%), доля КЭ, напротив, снизилась, составив 47,4%. В Омской области клещевой риккетсиоз не регистрировался. На долю клещевого энцефалита в 2000г. приходилось 83,0%. Иксодовый клещевой боррелиоз составлял 17,0 %. В 2007г. долевое участие КЭ и ИКБ в структуре клещевых инфекций в Омской области приняло прямо противоположный характер. Доля КЭ составляла только 20,5%; тогда как доля ИКБ возросла, составив 79,5%. В Новосибирской области в 2000г. клещевой энцефалит составлял 56,8 %. На долю ИКБ приходилось 33,5%. Клещевой риккетсиоз составлял 9,6%. В 2007г. долевое участие КЭ снизилось, составив 37,1%, тогда как доли ИКБ и КР возросли (47,7% и 15,2%, соответственно). В Алтайском крае на долю КЭ приходилась небольшая часть заболеваний - 9,0%; на долю ИКБ - 1,7 %. Клещевой риккетсиоз составлял наибольшую долю в структуре заболеваемости клещевыми инфекциями - 89,2%. В 2007г. доля КР в Алтайском крае среди клещевых инфекций возросла, составив 92,7%. Также немного увеличилась доля ИКБ (3,2%); доля КЭ, напротив, уменьшилась (4,1%).

Следовательно, на территориях, находящихся в сходных с Омской областью климато-географических условиях, наряду в КЭ и ИКБ регистрируется и КР, что даёт основание предполагать возможность формирования очагов данной инфекции и на территории Омской области. В Омской области, характеризующейся отсутствием регистрируемых случаев заболеваемости КР, штаммы Rickettsia sibirica не выделены. В 2000г. в Омской области лабораторно был ретроспективно подтвержден первый случай КР. Но штамм риккетсий выделить не удалось, предположительно из-за раннего проведения антибиотикоте-рапии (Рудаков Н.В. и др, 2000). Использование молекулярно-биологических методов для мониторинга природных очагов КР на территории Омской области позволило выявить следующие виды риккетсий: R.helvetica, R.tarasevichiae и R.raoultii (Шпынов С.Н. и др., 2003), Следовательно, на территории Омской области циркулируют риккетсий, которые являются потенциальными патогенами человека. R.raoultii связывают с развитием синдрома «TIBOLA» (Ibarra V. et al., 2006), хотя окончательно роль этого вида в патологии человека не доказана.

На территории Омской области не осуществляется эпидемиологический надзор за КР, поскольку считается, что эта нозологическая форма здесь отсутствует. Роль вышеперечисленных видов риккетсий в качестве патогенов человека окончательно не доказана. Исходя из этого, крайне необходимым является внедрение в клинико-диагностическую практику точных, быстрых и относительно недорогих методов, каким является ПЦР. Метод ПЦР, дополненный ре-стрикционным анализом, является оптимальным для клинических лабораторий, благодаря простоте постановки, доступности реактивов и быстроте получения результата. Кроме того, он достаточно точен и легко может быть модифициро-

ван путём подбора оптимального набора рестрикгаз в зависимости от спектра риккетсий в конкретном регионе.

На регистрируемую заболеваемость передаваемых иксодовыми клещами инфекций оказывают влияние разнообразные природные и социальные факторы, что явилось предметом многочисленных специальных исследований. Такая многофакторность регистрируемой заболеваемости затрудняет проведение эпидемиологического анализа и прогнозирование заболеваемости, т.к. получаемые статистические данные как бы «размываются» множеством влияний.

Количество выявленных патогенов, которые могут передаваться человеку клещами, постоянно увеличивается. Наряду с возбудителями КЭ, ИКБ и КР к ним относятся также «новые» патогены - эрлихии, анаплазмы, бабезии, барто-неллы и др.

В РФ работа по детекции бартонелл в природных очагах и клиническом материале начата недавно и представлена немногочисленными исследованиями. Зараженность бартонеллами обнаружена у грызунов на Дальнем Востоке РФ (Mediannikov et al., 2005), в Московской области (Марков А.П. и др., 2006). ДНК бартонелл обнаруживалась также в иксодовых клещах, комарах и крови больных, госпитализированных с признаками инфекционных заболеваний в Новосибирской области (Морозова О.В. и др., 2006г.). Чистые культуры бартонелл впервые в России были выделены от пациентов с атипичной лихорадкой и подозрением на эндокардит в Московской области (Кириллов М.Ю. и др., 2007).

В Омской области в результате скрининга мелких диких млекопитающих с использованием ПЦР и секвенирования были выявлены бартонеллы известных видов: B.grahamii и B.taylorii, а также два генотипа, представляющие, вероятно, новые виды бартонелл (Самойленко И.Е. и др., 2008).

Так как в РФ бартонеллёзы не регистрируются, нет возможности на данном этапе оценить распространённость этой инфекции.

Постановка этиологического диагноза ввиду расширяющегося спектра инфекций, передаваемых клещами, а также некоторого сходства в их клинической картине, становится всё более затруднительной. В этом случае на помощь приходят клинико-лабораторные методы исследования, служащие подтверждающим тестом в сфере диагностики, а в некоторых случаях и отправной точкой в открытии нового инфекционного агента, выступающего в роли патогена человека.

Учитывая необходимость диагностики заболеваний, вызываемых широким спектром патогенов, особенно актуальным становится выбор методов, отличающихся относительной простотой постановки, доступностью, гибкостью и точностью (относительно высокая специфичность и чувствительность). Оптимальными методами для диагностики КР являются ПЦР и рестрикционный анализ.

Результаты молекулярно-генетических и серологических исследований полевого и клинического материала на инфекции, передаваемые клещами

Применение рестрикционного анализа с использованием эндонуклеаз (Rsal и PstI) позволило нам чётко дифференцировать два вида риккетсий:

1. R. sibirica, включающая подвиды R. sibirica subsp.sibirica и R. sibirica

subsp.BJ-90.

2. R.raoultii, включающая геноварианты R.sp.DnS14, R.sp.DnS28, R.sp. RpA4.

Картины рестрикции R.sibirica sensu stricto и R. sibirica subsp.BJ-90 сходны, поэтому при использовании данных эндонуклеаз картины рестрикции носят ви-доспецифический характер (R.sibirica). Картины рестрикции для трех генотипов вновь описанного вида R.raoultii также носят видоспецифический характер и подтверждают таксономическое положение этих генотипов в пределах одного вида риккетсий.

Этот подход позволяет четко осуществить дифференциацию R. sibirica (патогенной для человека) от геновариантов R.raoultii (R.sp.DnS14, R.sp.DnS28, R.sp. RpA4) с неизвестной патогенностью в переносчиках на эндемичных и неэндемичных по клещевому риккетсиозу территориях.

При исследовании клинического и полевого материала на наличие ДНК риккетсий получены следующие результаты: снятые иксодовые клещи в 18,7 % содержали фрагмент гена цитрат-синтазы, клещи относились к D.reticulatus (10 образцов) и I.persulcatus (2 образца) и в 23,4%- фрагмент гена поверхностного белка ошрА (все клещи относились к виду D.reticulatus). Фрагмент гена отрА в клещах I.persulcatus обнаружен не был.

Рестрикционный анализ показал вариант профилей, соответствующий виду R.raoultii.

Антиген вирусов комплекса КЭ выявлен в 7,8%, все клещи относились к виду D.reticulatus. Наличие фрагмента гена ospA боррелий выявлено в 1 случае (1,6%) у клеща D.reticulatus (табл.1). Микст-инфицирование (антиген вируса КЭ в ИФА и ген отрА риккетсий в ПЦР) было обнаружено в одном случае в клеще D.reticulatus.

Таблица 1

Результаты исследования клещей, снятых с людей__

Цель исследования Количество положительных проб всего Количество положительных проб среди D.reticulatus Количество положительных проб среди I.persulcatus

абс. % (от 64 образцов) абс. % (от 53 образцов) ±ш абс.

Антиген ВКЭ 5 7,8±3,4 5 9,4±4,0 0

Ген оэрА боррелий 1 1,6±1,5 1 1,9±1,9 0

Ген риккетсий 12 18,7±4,9 10 18,9±5,4 2

Ген отрА риккетсий 15 23,4±5,3 15 28,3±6,2 0

Количество проб, давших полож. рез-т на один или оба гена риккетсий 21 32,8±5,9 19 35,8±6,6 2

Оба гена риккетсий в одной пробе 6 9,4±3,6/28,6"±5,6 6 И,3±4,3/31,6'±6,4 0

*- % от числа проб с положительным результатом на один или оба фрагмента генов риккетсий.

При исследовании 62 образцов ДНК клещей О.геисиЬШв из природных стаций фрагмент гена йиА выявлен в 17,7%, гена отрА - в 21,0% (табл.2). При рестрикции получен вариант профилей, соответствующий 11.гаоиИп.

Таблица 2

Обнаружение ДНКриккетсий в клещах О.гейсиШт, собранных в Кормиловском и Омском районах Омской области (62 образца)

Цель исследования Количество положительных проб % положительных проб от 62 образцов ±ш

Ген gltA 11 17,7±4,8

Ген ошрА 13 21,0±5Д

Кол-во проб, давших полож. рез-т на один ген риккетсий из двух 10 16,1±4,7

Кол-во проб, давших полож. рез-т на оба гена риккетсий 7 11,3±4,0/41,2± 11,9

* - % от числа проб с положительным результатом на один или оба фрагмента генов риккетсий (17).

Наши исследования показали, что использование для детекции риккетсий в клещах только одного гена-мишени недостаточно. Большая часть положительных проб, содержащих ДНК риккетсий (19,8% от 126 проб - суммарное количество снятых и собранных в природных стациях клещей), была выявлена с использованием обеих пар праймеров.

Из 45 образцов ДНК биоптатов пациентов положительными в ПЦР на фрагмент гена цитрат-синтазы оказались 14 (31,1%). С праймерами на фрагмент гена ошрА положительный результат получен в 2,2% (1 проба). При рестрикции получен вариант профилей, соответствующий Я.гаои1Ш. Для идентификации риккетсий, положительных в ПЦР на фрагмент гена цитрат-синтазы, необходимо секвенирование полученных фрагментов. Образцы ДНК из сывороток крови «клещевых» больных в ПЦР дали отрицательный результат.

Следовательно, используя молекулярно-генетические методы, нам удалось получить результаты, свидетельствующие о наличии ДНК риккетсии Я.гаоиНи не только в клещах 0.ге(1си1аШз из природных стаций, но и в снятых с людей переносчиках и в биоптате от больного, что позволяет предположить этиологическую роль данного вида риккетсий в развитии инфекционного процесса.

При исследовании мелких диких млекопитающих, отловленных в Омской области, ДНК бартонелл была выявлена у следующих видов грызунов: М. §ге-§аИз - узкочерепной полёвки в 1,1%, М.оесопошив - полёвки экономки (1,5%), С1. гиШиБ - красной полёвки(4,5%), А.а§гагшз - полевой мыши (0,8%), А-вуГуа^сиз — лесной мыши(0,4%), Богах агапещ - обыкновенной бурозубки (0,4%).

Клещи [.регБи^аШэ, снятые с людей (17 обр.), содержали ДНК бартонелл в 35,0% (6 обр.), одна проба содержала антиген вируса КЭ, микст-инфицирования обнаружено не было. При исследовании платяных вшей было выявлено 15,0% положительных на наличие бартонелл проб.

Ранее в результате исследований в Омской в двух видах грызунов (СЛ.гоШив и С1^1агео1из) была обнаружена ДНК бартонелл В^гаЬати и ВЛау1оги (Самойленко И.Е. и др., 2008г.). В.цгаЬаши относится к патогенам человека, что подтверждает необходимость дальнейших исследований и скрининга потенциальных хозяев и переносчиков бартонелл.

Таким образом, снятых с людей и собранных в природных стациях переносчиков необходимо исследовать комплексом методов с обязательным использованием ПЦР на наличие ДНК риккетсий (с последующим рестрикцион-ным анализом для их видовой дифференциации) и бартонелл.

Изучение сочетанных очагов с использованием предложенного нами комплекса методов даёт возможность адекватно оценивать эпидемиолого-эпизоотологическую ситуацию по природно-очаговым инфекциям, прогнозировать ее, а также эффективно организовать противоэпидемические мероприятия.

Микробиологический мониторинг в системе эпизоотолого-эпидемнологического надзора

Диагностическая деятельность противоэпидемической службы реализуется в системе эпидемиологического надзора, который представляет собой унифицированную форму управления инфекционной заболеваемостью. Эпидемиологический надзор в системе управления инфекционной заболеваемостью выполняет диагностические функции: сбор информации, её анализ и формулировка эпидемиологического диагноза. В соответствии с данным диагнозом разрабатывается и реализуется регионально-ориентированная программа профилактики, которая входит в систему эпидемиологического контроля (по В.В.Далматову с соавт., 2003) - рис.1. По отношению к природноочаговым инфекциям, надзор становится эпизоотолого-эпидемиологическим, включая в себя дополнительные потоки информации о переносчиках, их прокормителях, факторах, потенцирующих активизацию природного очага.

Организация эпидемиологического надзора за клещевым риккетсиозом отражена в методических указаниях (МУ 3.1.1755-03 «Организация эпидемиологического надзора за клещевым риккетсиозом»). Она включает в себя три основных эколого-эпидемиологических раздела (жирным шрифтом и подчёркиванием нами выделены лабораторные методы, которыми мы предлагаем дополнить систему эпизоотолого-эпидемиологического надзора):

1. Оперативное слежение за эпидемическим процессом в текущем сезоне заболеваний:

Эпидемиологическое обследование очага с проведением серологических исследований крови пациента, а также исследование снятого клеща и/или биоптата с места его присасывания с использованием ПДР на заражённость бартонеллами, с использованием ПНР и рестрикционного анализа - на заражённость риккетсиями группы КПЛ.

Текущий эпидемиологический надзор

2. Долговременное наблюдение за природными очагами с целью прогноза степени их активности:

о, О со

и £ Е

о с; о

с

Г)

Я

о.

о

в

о.

■в" О

§ а

а Ь.

е!

и

о £

" 81 ь

К га

П. Аналитическая подсистема

Ретроспективный эпидемиологический анализ Оперативный эпидемиологический анализ

Эпидемиологический диагноз

1. Оценка эпидемиологической обстановки

2. Выявление ведущих проблем

3. Выявление территорий, групп, времени риска

4. Доказательство гипотез о факторах риска

5. Оценка эффективности и коррекция системы противоэпидемических мероприятий

6. Краткосрочный и долгосрочный прогноз заболеваемости и ей последствий

III. Организационно-исполнительская подсистема

1. Разработка адекватной, регионально-ориентированной программы профилактики

2. Расчёт затрат и выгод от профилактики

3. Материально-техническое и кадровое обеспечение. Работа с исполнителями

4. Реализация системы мероприятий. Контроль полноты и качества исполнения.

Рис.1. Система управления инфекционной заболеваемостью населения

Клещи (оценка видового состава имаго, их экологии, территориального распределения, внутригодовой и многолетней динамики численности, уровень заражённости риккетсиями - МФА, ПЦР; выявление инфекционного агента - биопробы, МФА, НЦР и рестрикционный анализ). Также исследование клещей на зараженность бартонелла-ми с использованием ПЦР.

• Прокормители клещей - мелкие и крупные млекопитающие (оценка видового состава прокормителей, их экологии, территориального распределения, внутригодовой и многолетней динамики численности, уровень заражённости риккетсиями - МФА, ПЦР; и бартонеллами - ПЦР, вы-

явление инфекционного агента - биопробы, МФА, ПЦР и рестрикци-онный анализ: определение наличия антител к риккетсиям. Типизация природных очагов и эпидемиологическое районирование их по числу видов клещей-переносчиков, абсолютно доминирующих в них.

3. Эпидемиологические наблюдения на эндемичных территориях:

• Ретроспективный анализ заболеваемости населения клещевым рик-кетсиозом с использованием годовых и среднемноголетних показателей в разрезе административных территорий, оценка внутригодовой динамики, а также заболеваемость КР в различных возрастных и профессиональных группах.

Создание картосхем районов административных территорий с нанесением на них мест нападения клещей.

• Оценка численности контингентов, подвергающихся профессиональному риску заболевания КР.

Данные эколого-эпидемиологические разделы обеспечивают содержание информационной подсистемы системы эпизоотолого-эпидемиологического надзора.

Целью оперативного слежения является контроль за эпидемической ситуацией для своевременного проведения противоэпидемических мероприятий в очагах. Каждый случай заболевания клещевым риккетсиозом расследуется врачом-эпидемиологом и энтомологом с проведением текущего эпидемиологического анализа КР с распределением случаев заболеваний по территориям, времени риска, группам риска. Обследование проводится по месту жительства, по месту работы заболевшего, в местах, эндемичных по КР. На основе этих данных составляется заключение и принимаются оперативные противоэпидемические меры: на участках с высокой плотностью клещей устанавливаются щиты с предупреждающими надписями: «Осторожно: клещи!»; проводятся противо-клещевые мероприятия; за лицами, отмечавшими присасывание клещей, устанавливается наблюдение с ежедневной термометрией в течение 7-10 дней.

Целью проведения долговременных наблюдений за природными очагами является выяснение их современного состояния и динамики изменений под влиянием биотических факторов или хозяйственной деятельности.

Эти данные получают с использованием зоолого-паразитологического обследования очагов, когда изучают видовой состав имаго клещей на конкретных территориях, их экологию, прокормителей, динамику численности клещей и прокормителей и характер их территориального распределения. Для определения уровня заражённости переносчиков риккетсиями группы КПЛ проводят исследование их при помощи метода флюоресцирующих антител (МФА). С использованием данного метода не определяются значимые различия между показателями инфицированности переносчиков в зонах с различным риском заражения населения, поэтому определение риккетсиофорности с использованием МФА не является адекватным критерием расчета риска заражения. Наличие или отсутствие вирулентных свойств выделенных инфекционных агентов изучают с использованием риккетсиологических моделей (биопробы на морских

свинках, куриных эмбрионах и др.). Участие диких млекопитающих в циркуляции Л^Ыпса устанавливают путем обнаружения антигена с использованием МФА или антител с применением РСК или РНИФ. Серологическое обследование сельскохозяйственных животных также может служить индикатором наличия природных очагов КР.

На основе полученных данных делают прогноз эпидемических проявлений на предстоящий сезон и намечают меры профилактических воздействий, направленных на ограничение эпидемического процесса. Таким образом, эпидемиологический надзор считается эффективным при проведении такого набора мер профилактики, которые приведут к отсутствию возникновения случаев заболеваний на эндемичной территории.

Мы предлагаем усовершенствовать информационную подсистему путём введения в неё схемы исследования переносчиков, прокормителей и клинического материала от пациентов с использованием ПЦР для детекции бартонелл и риккетсий группы КПЛ с последующим рестрикционным анализом для их дифференциации (рис.2):

Рис.2, Алгоритм исследования клинического и полевого материала на риккетсии и бартонеллы с использованием ПЦР

Таким образом, снятого с пациента клеща (популяция переносчиков) нужно исследовать в ПЦР на наличие бартонелл и риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки с последующим рестрикционным анализом с целью проведения их дифференциации (популяция возбудителей) для решения вопроса о необходимости профилактики. С расширением спектра выявляемых потенциальных патогенов человека, переносимых клещами, в данную схему необходимо ввести детекцию и других инфекционных агентов. Использование метода ПЦР является оптимальным для детекции, т.к. позволяет использовать одну и ту же пробу с нуклеиновыми кислотами для исследования на целый спектр инфекционных агентов, применяя различные праймеры. Оптимальным для целей

профилактики и эпизоотолого-эпидемиологического надзора является исследование снятого переносчика. Детекция инфекционных агентов методом ПЦР в сыворотке пациентов возможна, но из-за короткого периода нахождения возбудителей в крови не исключено получение ложноотрицательных результатов. Оптимальным является использование биолтата с места присасывания клеща.

Исследование диких мелких млекопитающих (популяция прокормителей переносчика) и их эктопаразитов также с использованием ПЦР даст возможность получить оперативную и точную информацию о распространённости инфекционного агента и возможной сочетанности природных очагов.

ВЫВОДЫ

1. Выявлена тенденция изменения уровня регистрируемой заболеваемости клещевым энцефалитом, иксодовым клещевым боррелиозом и клещевым риккетсиозом в РФ и Омской области за 1997-2007гг. Тенденция снижения заболеваемости КЭ в Омской области совпадает с таковой по России. Уровень регистрации ИКБ в РФ и Омской области не имеет тенденции к изменению за период 1997-2007гг.

2. Проведён сравнительный анализ структуры заболеваемости передаваемых клещами инфекций в РФ и регионах РФ за 2000г. и 2007г. В 2000г. структура заболеваемости клещевыми инфекциями в РФ была представлена следующим образом: КЭ составлял 36,0%; на долю ИКБ приходилось 48,0%; на долю КР - 16,0%. В 2007г. доля КЭ в структуре заболеваемости снизилась, составив 25,0%; доля ИКБ, напротив, возросла и составила 58,0%. Долевое участие КР практически не изменилось - 17,0%.

3. При продвижении с запада на восток РФ отмечалось постепенное снижение долевого участия в заболеваемости клещевыми инфекциями иксодового клещевого боррелиоза с 94,8% в Центральном ФО до 26,1% в Сибирском ФО и 27,7% в Дальневосточном ФО. Наряду с этим увеличивалась доля заболеваемости клещевым энцефалитом с 5,2% в Центральном ФО до 68,5% в Уральском ФО, 26,1% в Сибирском ФО и снова снижалась до 6,4% в Дальневосточном. Доля заболеваемости клещевым риккетсиозом в структуре исследуемых нами клещевых инфекций увеличивалась: в Уральском ФО она составляла 0,6%, в Сибирском - 41,3%, а в Дальневосточном - 65,8%.

4. Впервые отработан алгоритм детекции и дифференциации риккетсий Я. в^Ьшса и И-гаоиШ! с использованием ПЦР-рестрикционного анализа в полевом и клиническом материале, на основании которого обоснованы подходы эпидемиологического надзора на региональном уровне и алгоритмы лабораторной диагностики риккетсиозов.

5. Впервые в РФ в материале от пациентов с подозрением на клещевой рик-кетсиоз (биоптат) выявлена Я.гаоики, что позволяет предположить её этиологическую роль в инфекционной патологии человека.

6. Выявление ДНК бартонелл во внутренних органах диких мелких млекопитающих (грызуны), членистоногих переносчиках (иксодовые клещи, вши) свидетельствует о широком распространении бартонелл в Омской области.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Выявление протеобактерий (бартонелл и риккетсий) у иксодовых клещей, мелких млекопитающих, в биоптатах пациентов / А.Н.Коломеец, С.Н.Шпынов, Н.В.Рудаков, И.В.Арсеньева // Вестник Российской Военно-медицинской академии. - 2008. - №2 (22). - С. 635-636.

2. Выявление протеобактерий (бартонелл и риккетсий), спирохет (боррелий) и вируса клещевого энцефалита у иксодовых клещей, мелкий млекопитающих, в клиническом материале пациентов / А.Н.Коломеец и др. // Актуальные проблемы сохранения здоровья населения Сибири. - Омск, 2008. - С.228-231.

3. Дифференциация риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки с использованием комплекса молекулярно-генетических методов (ПЦР-ПДРФ) / А.Н.Коломеец, С.Н.Шпынов, Н.В.Рудаков, Л.В.Кумпан, И.Е.Самойленко, Т.А.Решетникова И Актуальные проблемы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения : матер.7 межрег. научно-npaicr. конф. с междунар. участием. - Омск, 2007. - Т.2. - С. 118-122.

4. Использование комплекса молекулярно-генетических методов (ПЦР-ПДРФ) для изучения риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки / А.Н. Коломеец, С.Н. Шпынов, Н.В. Рудаков, И.Е. Самойленко, Т.А. Решетникова, Л.В. Кумпан // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2007. - № 3 (55), прилож. - С. 117-120.

5. Коломеец А.Н. Методы выделения ДНК из различных биологических объектов / А.Н.Коломеец, С.А.Рудакова // Актуальные проблемы здоровья населения Сибири: гигиенические и эпидемиологические аспекты. - Омск, 2004. — Т.2. - С. 323.

6. Первые результаты изучения бартонеллезов в Омской области / Н.В.Рудаков, И.Е.Самойленко, Г.В.Березкина, А.Н.Коломеец, А.К.Танцев, С.Н.Шпынов, О.П.Мурзина, Л.В.Хорошавина, В.Н.Белов // Актуальные проблемы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения: матер.7 межрег. научно-практ. конф. с междунар. участием. -Омск, 2007. - Т.1.- С. 340-344.

7. Рудакова С.А. Актуальные аспекты эпидемиологии и профилактики трансмиссивных природноочаговых инфекций в Западной Сибири / С.А.Рудакова, А.Н.Коломеец, Н.В.Рудаков // Актуальные проблемы сохранения здоровья населения Сибири. - Омск, 2008. - С.368-372.

8. Экспресс-индикация трансмиссивных патогенов как основа дифференцированного подхода к профилактике инфекций, передающихся иксодовыми клещами / С.А.Рудакова, А.Н.Коломеец, И.Е.Самойленко, A.M. Кузьми-нов, Н.В.Рудаков // Бюллетень СО РАМН, 2007. - №4. - С. 116-119.

9. Эпидемиологическая оценка сочетанных очагов клещевого энцефалита, клещевого боррелиоза и гранулоцитарного анаплазмоза на юге Западной Сибири / С.А.Рудакова, А.А.Матущенко, Н.В.Рудаков, А.Н.Коломеец, О.В.Бутаков, А.А.Рыбин, Л.Д.Щучинова // Омский научный вестник : актуальные вопросы инфекционной патологии- 2005. - №4 (33), прилож. - С. 115-118.

10. Rudakova S.A. Genomic diagnostics of tick-borne borrelioses in West Siberia / S.A.Rudakova, E.V.Matuschenko, A.N.Kolomeetz // Proceedings of international scientific-practical interdisciplinary workshop.-Thailand, 2007. - P. 60-61.

На правах рукописи

Коломеец Анна Николаевна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОМУ МОНИТОРИНГУ В СИСТЕМЕ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА

ЗА РИККЕТСИОЗАМИ ГРУППЫ КЛЕЩЕВОЙ ПЯТНИСТОЙ ЛИХОРАДКИ И БАРТОНЕЛЛЁЗАМИ

14.00.30 - «эпидемиология» 03.00.07 - «микробиология»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Омск - 2009

Подписано в печать 12.11.2009 Формат 60x84/16 Бумага офсетная П.л. — 1,0 Способ печати — оперативный Тираж 100

Издательско-полиграфический центр ОмГМА 644043, г. Омск, ул. Ленина, 12; тел. 23-05-98

Актуальность темы

Риккетсии и бартонеллы относятся к возбудителям «новых» и «возвращающихся» инфекций. Отмечается активизация природных очагов эндемических риккетсиозов в разных странах мира, причины которой требуют всестороннего изучения.

Клещевой риккетсиоз зарегистрирован на 18 административных территориях азиатской части РФ. В последние годы в очагах клещевого риккетсиоза и на территориях с отсутствием заболеваемости этой инфекцией выявлен ряд патогенных риккетсий и риккетсий с неустановленной патогенностью, что требует разработки новых подходов к эпидемиологическому надзору за природными очагами (Шпынов С.Н., Рудаков Н.В., 2004). Имеющиеся данные о гетерогенности антигенных и генетических свойств риккетсий привели к необходимости комплексного использования классических и современных молекулярно-генетических методов исследования (Балаева Н.М.,1991; Roux V, Fournier Р-Е, Raoult D, 1996).

В связи с циркуляцией в природных очагах различных альфа-протеобактерий и схожестью клинических проявлений вызываемых ими заболеваний существенную актуальность имеет совершенствование методов и алгоритмов лабораторной диагностики заболеваний, вызываемых риккетсиями группы клещевой пятнистой лихорадки (КПЛ), бартонеллами и другими клещевыми альфа-протеобактериями. Одним из перспективных и недостаточно разработанных подходов является использование технологий, основанных на полимеразной цепной реакции (ПЦР) и рестрикционном анализе, как более простой и доступной в практических лабораториях альтернативе технологиям ПЦР-секвенирования. Указанный подход может быть использован для повышения эффективности эпидемиологического надзора и лабораторной диагностики риккетсиозов группы КПЛ, дифференциации R.sibirica от других видов риккетсий группы КПЛ, прежде всего от наиболее распространенной в клещах рода Dermacentor Rickettsia raoultii sp. nov. Молекулярно-генетические исследования с использованием ПЦР-рестрикционного анализа для дифференциации циркулирующих на территории РФ патогенных и непатогенных риккетсий в иксодовых клещах и в материалах от больных ранее не проводились. Широкое применение молекулярно-генетических методов позволило выявить, что бартонеллы являются этиологическими агентами целого спектра инфекционных болезней. Однако эпидемиологическая значимость членистоногих переносчиков и млекопитающих в качестве резервуара бартонелл в РФ изучена недостаточно.

Цель работы

Цель — повышение эффективности эпидемиологического надзора и лабораторной диагностики риккетсиозов и других инфекций, вызываемых клещевыми альфа-протеобактериями, на основе подбора и совершенствования адекватных молекулярно-генетических подходов.

Задачи

1. Провести комплексный анализ структуры и уровней заболеваемости инфекций, передаваемых клещами, в территориальном и временном аспектах по федеральным округам РФ и административным территориям Сибирского федерального округа.

2. Отработать алгоритмы лабораторной дифференциации риккетсий группы КПЛ (R.sibirica, R.raoultii) с использованием ПЦР-рестрикционного анализа на музейных штаммах риккетсий.

3. Провести сравнительный анализ этиологической структуры и распространенности риккетсий в переносчиках и в материалах от пациентов на эндемичных по клещевому риккетсиозу территориях (Алтайский край) и территориях, свободных от этой инфекции (Омская область).

4. Провести скрининг заражённости бартонеллами диких мелких млекопитающих и клещей с использованием ПЦР.

5. Обосновать алгоритмы лабораторной диагностики риккетсиозов и детекции бартонелл и риккетсий с использованием технологий, основанных на ПЦР и рестрикционном анализе, в системе эпидемиологического надзора.

Научная новизна

Впервые в территориальном и временном аспектах проанализирована структура заболеваемости клещевыми инфекциями в разрезе федеральных округов РФ и административных территорий Сибирского федерального округа. Увеличение в структуре заболеваемости клещевыми инфекциями ИКБ связано, в первую очередь, с уменьшением регистрируемой заболеваемости КЭ. Преобладание ИКБ в структуре заболеваемости отмечено в Центральном ФО, КЭ — в Уральском ФО, в Сибирском ФО регистрируются все три наиболее распространенные инфекции (КЭ, ИКБ, КР), КР преобладает в Дальневосточном ФО. На территориях, смежных с Омской областью, отмечается наиболее разнообразная структура заболеваемости клещевыми инфекциями.

С использованием комплекса лабораторных методов исследования установлена циркуляция на территории Омской области инфекционных агентов не только официально регистрируемых заболеваний (клещевого энцефалита и иксодового клещевого боррелиоза), но также возбудителей новых инфекций — R.raoultii (потенциальный патоген человека, вызывающий заболевание, сходное с синдромом TIBOLA) и Bartonella spp.(возбудители широкого спектра инфекций, объединяемых термином «бартонеллёзы»).

Осуществлена сравнительная оценка инфицированности риккетсиями переносчиков, собранных на эндемичных по клещевому риккетсиозу и свободных от этой инфекции территориях.

Впервые получены данные ПЦР-скрининга ДНК бартонелл в иксодовых клещах и мелких млекопитающих в Омской области, свидетельствующие об их широком распространении в Западной Сибири

Впервые разработаны и апробированы технологии молекулярно-биологических исследований, основанные на ПЦР-рестрикционном анализе, для дифференциации основных видов риккетсий, выявляемых в природных очагах Западной Сибири.

Впервые обосновано применение ПЦР-рестрикционного анализа для дифференциации патогенных (R.sibirica) и условно-патогенных (генотипы Rraoultii) риккетсий в иксодовых клещах и в материалах от больных. Отработаны алгоритмы дифференциации риккетсий основных видов и лабораторной диагностики риккетсиозов у пациентов, основанные на ПЦР-рестрикционном анализе.

Практическая значимость работы и внедрения

Обосновано введение в систему эпидемиолого-эпизоотологического надзора микробиологического мониторинга за риккетсиями группы КПЛ и бартонеллами.

В результате проведенных исследований отработана тактика применения ПЦР-рестрикционного анализа в комплексе методов, применяемых для молекулярно-биологической дифференциации альфа-протеобактерий в природных очагах.

Разработанные алгоритмы лабораторной диагностики на основе ПЦР-рестрикционного анализа использованы для совершенствования эпидемиологического надзора в природных очагах трансмиссивных инфекций.

По результатам проведенных исследований опубликованы статьи методического характера.

Подготовлено учебное пособие «Молекулярно-генетические методы диагностики риккетсиозов группы клещевой пятнистой лихорадки».

Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедре микробиологии, иммунологии и вирусологии ОмГМА и в научно-исследовательской деятельности Омского БИИПОИ.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Выявлены существенные отличия в структуре и уровнях заболеваемости инфекциями, передаваемых клещами, в территориальном и временном аспектах по федеральным округам РФ и административным территориям Сибирского федерального округа, являющиеся отражением пространственной и функциональной структуры природных очагов.

2. Население Омской области подвержено риску заражения при присасывании клеща не только возбудителями регистрируемых инфекций (клещевой энцефалит и иксодовый клещевой боррелиоз), но и возбудителями «новых» инфекций, вызываемых R.raoultii и Bartonella spp., что требует совершенствования лабораторной диагностики и эпидемиологического надзора в сочетанных очагах.

3. ПЦР-рестрикционный анализ является эффективным методом для дифференциации R.sibirica и R.raoultii в комплексе методов, применяемых для молекулярно-биологической дифференциации альфа-протеобактерий в природных очагах.

4. Технологии, основанные на ПЦР-рестрикционном анализе, могут быть использованы для совершенствования лабораторной диагностики и эпизоотолого-эпидемиологического надзора за клещевыми риккетсиозами.

Апробация работы

Диссертационная работа апробирована на совместном заседании кафедр эпидемиологии, микробиологии, вирусологии и иммунологии Омской государственной медицинской академии, с участием научных сотрудников Омского НИИ природно-очаговых инфекций, 2009 г.

Основные положения диссертации доложены на следующих отечественных и международных конференциях: V межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы здоровья населения Сибири: гигиенические и эпидемиологические аспекты», г.Омск, 2004г.; научно-практической конференции, посвященной 75-летию кафедр инфекционных болезней взрослых и детей ОмГМА, г.Омск, 2005г.; конференции с международным участием «Актуальные вопросы региональной инфекционной патологии», посвященной 95-летию Института эпидемиологии и микробиологии НЦ МЭ ВСНЦ СО РАМН, г.Иркутск, 2007г.; УП межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения», г.Омск, 2007г.; VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, г.Москва, 2007г.; VIII межрегиональной конференции с международным участием «Актуальные проблемы сохранения здоровья населения Сибири», посвященной 70-летию медико-профилактического факультета Омской государственной медицинской академии, г.Омск, 2008г.

Основные результаты опубликованы в 10 печатных работах.

Объём и структура диссертации

Работа изложена на 315 страницах машинописного текста, иллюстрирована 15 таблицами и 89 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, четырёх глав собственных исследований, заключения, выводов. Библиографический указатель содержит 217 источников, из которых 58 работ отечественных и 132 — зарубежных авторов.

ВЫВОДЫ:

1. Выявлена тенденция изменения уровня регистрируемой заболеваемости клещевым энцефалитом, иксодовым клещевым боррелиозом и клещевым риккетсиозом в РФ и Омской области за 1997-2007гг. Тенденция снижения заболеваемости КЭ в Омской области совпадает с таковой по России. Уровень регистрации ИКБ в РФ и Омской области не имеет тенденции к изменению за период 1997-2007гг.

2. Проведён сравнительный анализ структуры заболеваемости передаваемых клещами инфекций в РФ и регионах РФ за 2000г. и 2007г. В 2000г. структура заболеваемости клещевыми инфекциями в РФ была представлена следующим образом: КЭ составлял 36,0%; на долю ИКБ приходилось 48,0%; на долю КР — 16,0%. В 2007г. доля КЭ в структуре заболеваемости снизилась, составив 25,0%±0,01; доля ИКБ, напротив, возросла и составила 58,0%. Долевое участие КР практически не изменилось — 17,0%.

3. При продвижении с запада на восток РФ отмечалось постепенное снижение долевого участия в заболеваемости клещевыми инфекциями иксодового клещевого боррелиоза с 94,8% в Центральном ФО до 26,1% в Сибирском ФО и 27,7% в Дальневосточном ФО. Наряду с этим увеличивалась доля заболеваемости клещевым энцефалитом с 5,2% в Центральном ФО до 68,5% в Уральском ФО, 26,1% в Сибирском ФО и снова снижалась до 6,4% в Дальневосточном. Доля заболеваемости клещевым риккетсиозом в структуре исследуемых нами клещевых инфекций увеличивалась: в Уральском ФО она составляла 0,6%, в Сибирском — 41,3%, а в Дальневосточном — 65,8%.

4. Впервые отработан алгоритм детекции и дифференциации риккетсий R. sibirica и R.raoultii с использованием ПЦР-рестрикционного анализа в полевом и клиническом материале, на основании которого обоснованы подходы эпидемиологического надзора на региональном уровне и алгоритмы лабораторной диагностики риккетсиозов.

5. Впервые в РФ в материале от пациентов (биоптат) с подозрением на клещевой риккетсиоз выявлена R.raoultii, что позволяет предположить её этиологическую роль в инфекционной патологии человека.

6. Выявление ДНК бартонелл во внутренних органах диких мелких млекопитающих (грызуны), членистоногих переносчиках (иксодовые клещи, вши) свидетельствует о широком распространении бартонелл в Омской области.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Выявление протеобактерий (бартонелл и риккетсий) у иксодовых клещей, мелких млекопитающих, в биоптатах пациентов / А.Н.Коломеец, С.Н.Шпынов, Н.В.Рудаков, И.В.Арсеньева // Вестник Российской Военно-медицинской академии. — 2008. - №2 (22). — С. 635-636.

2. Выявление протеобактерий (бартонелл и риккетсий), спирохет (боррелий) и вируса клещевого энцефалита у иксодовых клещей, мелких млекопитающих, в клиническом материале пациентов / А.Н.Коломеец и др. // Актуальные проблемы сохранения здоровья населения Сибири. — Омск, 2008. - С.228-231.

3. Дифференциация риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки с использованием комплекса молекулярно-генетических методов (ПЦР-ПДРФ) / А.Н.Коломеец, С.Н.Шпынов, Н.В.Рудаков, Л.В.Кумпан, И.Е.Самойленко, Т.А.Решетникова // Актуальные проблемы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения : матер.7 межрег. научно-практ. конф. с междунар. участием. - Омск, 2007. - Т.2. -С. 118-122.

4. Использование комплекса молекулярно-генетических методов (ПЦР-ПДРФ) для изучения риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки / А.Н.Коломеец, С.Н.Шпынов, Н.В.Рудаков, И.Е.Самойленко, Т.А.Решетникова, Л.В.Кумпан // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2007. 3 (55), прилож. - С. 117-120.

5. Коломеец А.Н. Методы выделения ДНК из различных биологических объектов / А.Н.Коломеец, С.А.Рудакова // Актуальные проблемы здоровья населения Сибири: гигиенические и эпидемиологические аспекты. — Омск, 2004. — Т.2. — С. 323.

6. Первые результаты изучения бартонеллезов в Омской области / Н.В.Рудаков, И.Е.Самойленко, Г.В.Березкина, А.Н.Коломеец, А.К.Танцев, С.Н.Шпынов, О.П.Мурзина, Л.В.Хорошавина, В.Н.Белов // Актуальные проблемы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения: матер.7 межрег. научно-практ. конф. с междунар. участием. - Омск, 2007. - Т.1.- С. 340-344.

7. Рудакова С.А. Актуальные аспекты эпидемиологии и профилактики трансмиссивных природноочаговых инфекций в Западной Сибири / С.А.Рудакова, А.Н.Коломеец, Н.В.Рудаков // Актуальные проблемы сохранения здоровья населения Сибири. — Омск, 2008. — С.368-372.

8. Экспресс-индикация трансмиссивных патогенов как основа дифференцированного подхода к профилактике инфекций, передающихся иксодовыми клещами / С.А.Рудакова, А.Н.Коломеец, И.Е.Самойленко, A.M. Кузьминов, Н.В.Рудаков // Бюллетень СО РАМН, 2007. - №4. -С. 116-119.

9. Эпидемиологическая оценка сочетанных очагов клещевого энцефалита, клещевого боррелиоза и гранулоцитарного анаплазмоза на юге Западной

Сибири / С.А.Рудакова, А.А.Матущенко, Н.В.Рудаков, А.Н.Коломеец, О.В.Бутаков, А.А.Рыбин, Л.Д.Щучинова // Омский научный вестник : ак туальные вопросы инфекционной патологии — 2005. - №4 (33), прилож. -С. 115-118. lO.Rudakova S.A. Genomic diagnostics of tick-borne borrelioses in West Siberia / S.A.Rudakova, E.V.Matuschenko, A.N.Kolomeetz // Proceedings of international scientific-practical interdisciplinary workshop. — Thailand, 2007. -P. 60-61.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проблема заболеваний, переносчиками которых являются иксодовые клещи, в последнее десятилетие приобретает все большее значение для многих регионов России, в том числе и для Западной Сибири.

В Западной Сибири отмечена сочетанность природных очагов клещевого энцефалита, иксодового клещевого боррелиоза, клещевого риккетсиоза, Омской геморрагической лихорадки [40, 60, 70; 84].

В Омской области имеются сочетанные природные очаги таких инфекций, как клещевой энцефалит (КЭ), иксодовый клещевой боррелиоз (ИКБ), анаплазмозы, инфекционные агенты которых выявлены в клещах родов Ixodes и Dermacentor. Из инфекций, передающихся клещами, регистрируются КЭ и ИКБ. Всё большую актуальность приобретают «новые» и «возвращающиеся» инфекции, вызываемые риккетсиями и бартонеллами.

В связи с циркуляцией в природных очагах различных альфа-протеобактерий и схожестью клинических проявлений вызываемых ими заболеваний, существенную актуальность имеет совершенствование методов и алгоритмов лабораторной диагностики заболеваний, вызывающихся риккетсиями группы клещевой пятнистой лихорадки (КПЛ), бартонеллами и другими клещевыми альфа-протеобактериями. Одним из перспективных и недостаточно разработанных подходов является использование технологий, основанных на полимеразной цепной реакции (ПЦР) и рестрикционном анализе как более простой и доступной в практических лабораториях альтернативе технологиям ПЦР-секвенирования. Указанный подход может быть использован для эпидемиологического надзора и лабораторной диагностики риккетсиозов группы КПЛ, дифференциации R.sibirica от других видов риккетсий группы КПЛ, прежде всего от наиболее распространенной в клещах рода Dermacentor Rickettsia raoultii sp. nov. Молекулярно-генетические исследования с использованием ПЦР-рестрикционного анализа для дифференциации циркулирующих на территории РФ патогенных и непатогенных риккетсий в иксодовых клещах и в материалах от больных ранее не проводились. Поэтому нами было проведено исследование вышеуказанных видов материала для восполнения этого пробела. Эпидемиологическая значимость членистоногих переносчиков и млекопитающих в качестве резервуара бартонелл также изучена недостаточно, и наше исследование отчасти восполнило недостаток и этой информации.

Таким образом, основной целью нашего исследования являлось совершенствование адекватных молекулярно-генетических подходов, и на их основе - повышение эффективности эпидемиологического надзора и лабораторной диагностики риккетсиозов и других инфекций, вызываемых клещевыми протеобактериями.

Для достижения этой цели нами был проведён анализ основных тенденций эпидемического проявления природных очагов клещевого риккетсиоза, клещевого энцефалита и иксодового клещевого боррелиоза в РФ и Омской области за 1997-2007гг.; отработан алгоритм лабораторной дифференциации риккетсий группы КПЛ (R.sibirica, R.raoultii) с использованием ПЦР-рестрикционного анализа; проведён анализ этиологической структуры и распространенности риккетсий в переносчиках и в материалах от пациентов; проведён скрининг мелких млекопитающих (грызунов) и клещей на заражённость бартонеллами и обоснован алгоритм лабораторной диагностики риккетсиозов и детекции бартонелл и риккетсий с использованием технологий, основанных на ПЦР и рестрикционном анализе, в системе эпидемиологического надзора.

При анализе динамики заболеваемости КЭ по РФ была выявлена тенденция к снижению заболеваемости (Тсн=8,37%). Выраженная тенденция снижения регистрируемой заболеваемости КЭ наблюдается и в Омской области (Тсн=16,8%). Следовательно, тенденции заболеваемости КЭ в РФ и Омской области совпали. За анализируемый период уровень заболеваемости КЭ в РФ превысил показатели по Омской области в 1,5 раза (р<0,001).

При анализе динамики заболеваемости КЭ в сельских районах Омской области была выявлена выраженная тенденция к её снижению: Тсн=17,7%. За анализируемый период отмечается пик заболеваемости в 1999г. Увеличение уровня заболеваемости в 1999г. совпадает с подъёмом по РФ, что связано, возможно, с закономерностями, общими и для Омской области и для других регионов РФ. Показатели заболеваемости КЭ в сельских районах Омской области и среднефедеральные не имеют статистически значимых различий за анализируемый период (р>0,05).

При анализе динамики заболеваемости КЭ в г.Омске установлено наличие тенденции к снижению заболеваемости (Тсп=7,5%). За период 1997г. по 2007г. наибольший уровень регистрируемой заболеваемости 1,9 на 100 тыс. населения отмечался в 2000г. За исследуемый период показатели заболеваемости КЭ в РФ превысили показатели в г.Омске в 5,4 раза (р<0,001).

В результате проведённого анализа можно сделать следующее заключение: динамика регистрируемой заболеваемости КЭ в г.Омске, сельских районах Омской области и по Омской области в целом свидетельствует о наличии выраженной тенденции к снижению. Эта тенденция совпала с общей тенденцией, наблюдаемой по РФ. Отмечался пик заболеваемости в 1999г., который совпал с максимумом по РФ, что, вероятно, является следствием факторов, оказавших влияние на заболеваемость КЭ в большинстве эндемичных регионов России.

При изучении динамики заболеваемости ИКБ в РФ и в целом по Омской области нами были выявлены следующие закономерности: существенных изменений в динамике заболеваемости ИКБ по РФ и Омской области не выявлено (Тс„=0,3% и Тпр=0,4% соответственно). При этом показатели заболеваемости по РФ в 4,3 раза превысили таковые по области (р<0,001).

Динамика заболеваемости ИКБ в сельских районах Омской области имела умеренную тенденцию к снижению — (Тсн=3,8%), и показатели в 3,5 раза ниже по сравнению с среднефедеральными (р<0,001).

Динамика заболеваемости ИКБ в г.Омске демонстрировала наличие выраженной тенденции к росту 1997-2007гг. (Тпр=8,9%). Показатели заболеваемости ИКБ в РФ в 7,4 раза превысили показатели заболеваемости в г.Омске (р<0,001).

Таким образом, заболеваемость ИКБ по Омской области в целом ниже среднефедеральных показателей. Таким образом, тенденция снижения заболеваемости КЭ в Омской области совпадает с таковой по России, в отличие от ИКБ. Уровень заболеваемости ИКБ в РФ и Омской области оставался стабильным за период 1997-2007гг.

Несмотря на снижение регистрируемой заболеваемости, численность клещей I.persulcatus и D.reticulatus в Омской области с 2005г. по 2008г. имеет тенденцию к увеличению [21]. Также была выявлена прямая сильная корреляционная связь между количеством укусов клещей и уровнем заболеваемости КЭ (г=0,88) и слабая связь между количеством укусов и уровнем заболеваемости ИКБ (г^-0,07).

Третьей нозоформой, динамика заболеваемости которой нами исследовалась, является клещевой риккетсиоз (КР). Данное заболевание, также как КЭ и ИКБ, является облигатно-трансмиссивным, и имеет достаточно широкое распространение в Азиатской части России и за пределами РФ. В отличие от КЭ и ИКБ, КР не регистрируется на территории Омской области, хотя условия для циркуляции возбудителя данной инфекции имеются.

В динамике заболеваемости КР в РФ за 1997-2007гг. имеется тенденция к снижению заболеваемости (Тсн=10,2%).

Сопоставление территориального распределения заболеваемости КР за период с низким уровнем заболеваемости (60-е годы) и период резкого роста (1993-2002гг.) свидетельствует о его изменении за счёт увеличения доли заболеваемости в Западной Сибири (с 24,5 до 55,0%) и на Дальнем Востоке (с 7,5 до 23,0%). При этом доля заболеваемости в Восточной Сибири снизилась с 68,0 до 22,0%.

За период 2000-2007гг. территориальная структура заболеваемости КР в РФ не претерпела существенных изменений, несмотря на снижение общего количества регистрируемых случаев КР в РФ.

Использование молекулярно-биологических методов для мониторинга природных очагов КР на территории Омской области позволило выявить следующие виды риккетсий: R.helvetica, R.tarasevichiae и R.raoultii [48]. Следовательно, на территории Омской области циркулируют риккетсии, которые являются потенциальными патогенами человека. R.raoultii связывают с развитием синдрома «TIBOLA» [189], хотя окончательно роль этого вида в патологии человека не доказана.

На территории Омской области не осуществляется эпидемиологический надзор за КР, поскольку считается, что эта нозологическая форма здесь отсутствует. Роль вышеперечисленных видов риккетсий в качестве патогенов человека окончательно не доказана. Исходя из этого, крайне необходимым является внедрение в клинико-диагностическую практику точных, быстрых и относительно недорогих методов, каким является ПЦР. Метод ПЦР, дополненный рестрикционным анализом, является оптимальным для клинических лабораторий, благодаря простоте постановки, доступности реактивов и быстроте получения результата. Кроме того, он достаточно точен и легко может быть модифицирован путём подбора оптимального набора рестриктаз в зависимости от спектра риккетсий в конкретном регионе.

В 2000г. структура заболеваемости клещевыми инфекциями в РФ была представлена следующим образом: КЭ составлял 36,0%; на долю ИКБ приходилось 48,0%; на долю КР — 16,0%. В 2007г. доля КЭ в структуре заболеваемости снизилась, составив 25,0%; доля ИКБ, напротив, возросла и составила 58,0%. Долевое участие КР практически не изменилось — 17,0%. Общее количество зарегистрированных заболеваний КЭ за период 1997-2007гг. снизилось в 1,8 раза (р<0,001).

Первое место в 2000г. в структуре территориального распределения заболеваемости КЭ принадлежало Сибирскому ФО (50,9%), на втором месте располагался Приволжский ФО (21,9%). Третье место по заболеваемости занимал Уральский ФО (16,5%). Четвертое, пятое и шестое места принадлежали Северо-Западному (6,1%), Дальневосточному (3,4%) и Центральному ФО (1,1%), соответственно. Наибольшее число случаев КЭ в 2000г. зарегистрировано в Красноярском крае, Удмуртской республике, Пермской области, Свердловской и Томской области. Наибольшие показатели заболеваемости получены в Томской области, Удмуртской республике, Красноярском крае. В 2007г первое место в структуре территориального распределения заболеваемости КЭ также принадлежало Сибирскому ФО (52,6%), с третьего места на второе переместился Уральский ФО (16,4%). Доля Приволжского ФО в структуре заболеваемости снизилась (16,0%), и в 2007г. он занял третье место. Четвертое место принадлежало Северо-Западному ФО (11,0%), доля Центрального ФО возросла (2,2%) и он занял пятое место; доля Дальневосточного ФО по сравнению с 2000г., наоборот, снизилась (1,8%). Наибольшие показатели заболеваемости КЭ в 2007г. были получены в Томской области и республике Алтай, республике Удмуртия, Кировской и Курганской областях. Наибольшее число случаев заболеваний зарегистрировано в Красноярском крае, Пермском крае, Свердловской области.

Уровень заболеваемости КЭ в РФ снизился в 2007г. по сравнению с 2000г. в 1,8 раза (р<0,001).

В структуре территориального распределения ИКБ в 2000г. первое место принадлежало Приволжскому ФО (28,7%). Вторым по доле вклада в общую заболеваемость ИКБ являлся Сибирский ФО (20,1%). Третье место принадлежало Северо-Западному ФО (18,9%). Четвёртое место в структуре заболеваемости ИКБ занимал Центральный ФО (16,2%). Пятое место принадлежало Уральскому ФО (11,6%). На шестом месте располагался Дальневосточный ФО (4,3%). Последнее место в территориальной структуре заболеваемости ИКБ занимал Южный ФО (0,23%). Наибольшее число случаев

ИКБ зарегистрировано в Кировской и Пермской области, Удмуртской республике, г.Санкт-Петербурге, Томской, Свердловской и Ярославской областях. Наибольшие показатели заболеваемости ИКБ в 2000г. получены в УОБАО, Томской, Кировской, Костромской и Ярославской областях. Доли и ранг различных регионов в структуре заболеваемости ИКБ в 2007г. практически не изменились. Наибольшие показатели заболеваемости ИКБ в 2007г. были получены в Кировской области, Усть-Ордынском Бурятском АО и Вологодской области. Наибольшее число случаев ИКБ было зарегистрировано в Кировской области, Томской области, Вологодской области.

Уровень заболеваемости ИКБ в РФ не претерпел существенных изменений (р>0,05).

Первое место в территориальной структуре заболеваемости клещевым риккетсиозом в 2000г. принадлежало Сибирскому ФО (78,2%), второе -Дальневосточному ФО (21,4%), третье - Уральскому ФО (0,4%). В других округах РФ клещевой риккетсиоз зарегистрирован не был.

В 2007г. территориальная структура заболеваемости КР не претерпела существенных изменений. Первое место занимал СФО (79,3%); второе принадлежало Дальневосточному ФО (20,1%); третье — Уральскому ФО (0,6%). В других регионах РФ КР не регистрировался. Наибольшие уровни заболеваемости КР в 2000 и 2007гг. зарегистрированы в республике Алтай, УОБАО, Алтайском крае, Амурской и Тюменской области. Наибольшее число случаев заболеваний КРв 2000 и 2007гг. зарегистрировано в Алтайском крае, Приморском крае и Тюменской области.

Таким образом, территориальная структура заболеваемости КР в РФ не претерпела существенных изменений, несмотря на снижение уровня заболеваемости за 2000-2007гг. в 1,4 раза (р<0,001).

Таким образом, в территориальной структуре этих трёх инфекций, передаваемых через укус клеща, имеются отличия в различных округах РФ. За анализируемый временной период доля отдельных нозоформ в общей структуре также изменилась. При продвижении от западной границы РФ далее на восток в 2007г. происходит постепенное снижение доли ИКБ в структуре заболеваемости с 94,8% в Центральном ФО до 26,1% в Сибирском ФО и 27,7% в Дальневосточном ФО. с нарастанием доли КЭ с 5,2% в Центральном ФО до 68,5% в Уральском ФО, 26,1% в Сибирском ФО со снижением до 6,4% в Дальневосточном. На территории Уральского ФО в данной структуре появляется клещевой риккетсиоз (0,6%), доля которого увеличивается к восточной границе РФ (в Сибирском — 41,3%, а в Дальневосточном — 65,8%), тогда как вклад КЭ и ИКБ в общую структуру клещевых инфекций снижается.

При анализе структуры клещевых инфекций в округах РФ в 2007г. было установлено, что в Центральном ФО основная часть клещевых инфекций приходилась на ИКБ (94,8%), КЭ составлял небольшую часть (5,2%). В СевероЗападном ФО большую часть клещевых инфекций также составлял ИКБ (78,8%), тогда как на долю КЭ приходилось только 21,2%. В Южном ФО клещевой энцефалит и клещевой риккетсиоз не регистрировался, все случаи заболеваний после укуса клещей были диагностированы как ИКБ. В Приволжском ФО на ИКБ приходилось 79,3% всех случаев регистрируемых клещевых инфекций, на КЭ — 20,7%. В Уральском ФО доля ИКБ составляла 68,5%, доля КЭ - 30,8%, доля КР - 0,6 %. В Сибирском ФО доля ИКБ составляла 26,1%, КЭ - 32,5%; КР — 41,3%. В Дальневосточном ФО на долю ИКБ приходилось 27,7%; на долю КЭ - 6,4%, 15; КР - 65,8%.

Нами была проанализирована таюке заболеваемость КЭ, ИКБ и КР в отдельных областях РФ, относящихся к Уральскому (Курганская, Свердловская, Тюменская и Челябинская области) и Сибирскому федеральным округам в 2000г. и 2007г. В регионах Уральского ФО в 2007г. по сравнению с 2000г. отмечались сходные с СФО изменения, касающиеся увеличения доли ИКБ в структуре клещевых инфекций (с 48,3% в 2000г. до 68,5% в 2007г.) при снижении доли КЭ (с 51,7% в 2000г. до 30,8% в 2007г.). В СФО в 2007г. по сравнению с 2000г. отмечалось практически повсеместное снижение долевого участия в структуре клещевых инфекций клещевого энцефалита (с 45,1% в 2000г. до 32,6% в 2007г.), за исключением республики Алтай и Читинской области, где доля данной нозоформы, напротив, увеличилась. Во всех регионах СФО, за исключением УОБАО и Томской области, отмечалось увеличение доли ИКБ в 2007г.(26,1%) по сравнению с 2000г. (23,8%). В УОБАО доля ИКБ в 2007г. снизилась, а в Томской области осталась без изменений. Доля КР увеличилась практически во всех регионах СФО (с 31,1% в 2000г. до 41,3% в

2007г.), за исключением республики Алтай и Читинской области, где отмечалось её снижение.

Доля заболеваемости клещевым риккетсиозом в структуре исследуемых нами клещевых инфекций увеличивалась: в Уральском ФО она составляла 0,6%, в Сибирском - 41,3%, а в Дальневосточном — 65,8%.

В Челябинской области в 2000г. на долю КЭ приходилось 47,8%; на ИКБ — 52,2%.

В 2007г. в структуре произошли существенные изменения: доля КЭ снизилась до 28,1% ; доля ИКБ, напротив, возросла до 71,9%.

При анализе структуры клещевых инфекций в 2000г. в Свердловской области было установлено, что КЭ и ИКБ составляют примерно одинаковые доли в клещевых инфекциях (50,4 %и 49,6 %, соответственно).

В 2007г. в структуре клещевых инфекций Свердловской области произошли существенные изменения: доля ИКБ возросла до 75,5%; тогда как КЭ составил только 24,3%.

В Курганской области в 2000г. в структуре заболеваемости клещевыми инфекциями КЭ составлял 63,4%; на долю ИКБ приходилось 34,9 %; а КР — 1,6%.

В 2007г. в структуре клещевых инфекций произошли некоторые изменения: так, возросла доля ИКБ (39,2%); доля КЭ, напротив, снизилась (58,9%). Доля КР осталась практически не изменилась (1,7%).

В Тюменской области на долю КЭ приходилось более половины всех клещевых инфекций (56,8 %), на долю ИКБ — 39,6 %; доля КР составляла 3,6 %.

В 2007г. в Тюменской области среди клещевых инфекций увеличилась доля ИКБ (46,6% 1), а также КР (6,1%). Доля КЭ, напротив, снизилась, составив 47,4%.

В СФО нами была проанализирована заболеваемость клещевыми инфекциями в 2000г и 2007г. в республиках Алтай, Бурятии, Тыве, Хакасии; Алтайском, Красноярском краях; Иркутской, Кемеровской, Новосибирской, Омской, Томской, Читинской областях; УОБАО.

В Омской области клещевой риккетсиоз не регистрировался. На долю клещевого энцефалита в 2000г. приходилось 83,0%. Иксодовый клещевой боррелиоз составлял 17,0 %.

В 2007г. долевое участие КЭ и ИКБ в структуре клещевых инфекций в Омской области приняло прямо противоположный характер. Доля КЭ составляла только 20,5%; тогда как доля ИКБ возросла, составив 79,5%.

В Томской области клещевой риккетсиоз не регистрировался. Доли клещевого энцефалита и иксодового клещевого боррелиоза в 2000г. были примерно одинаковыми и составляли соответственно: 47,2% и 52,8%.

В 2007г. структура практически не изменилась. КЭ составлял 48,0%, а ИКБ - 52,0%.

В Новосибирской области клещевой энцефалит составлял 56,8 %. На долю ИКБ приходилось 33,5 %±0,06. Клещевой риккетсиоз составлял 9,6 %.

В 2007г. долевое участие КЭ снизилось, составив 37,1%, тогда как доли ИКБ и КР возросли (47,7% и 15,2%, соответственно).

В Алтайском крае на долю КЭ приходилась небольшая часть заболеваний — 9,0 %; на долю ИКБ — 1,7 %. Клещевой риккетсиоз составлял наибольшую долю в структуре заболеваемости клещевыми инфекциями - 89,2%.

В 2007г. доля КР в Алтайском крае среди клещевых инфекций возросла, составив 92,7%. Также немного увеличилась доля ИКБ (3,2%); доля КЭ, напротив, уменьшилась (4,1%).

В республике Алтай первое место в структуре заболеваемости клещевыми инфекциями занимал КР, составив 75,6 %; доля КЭ составляла 18,7 %; на долю ИКБ приходилось 5,6 %.

В 2007г. доли КЭ и ИКБ увеличились, составив 27,5% и 9,8%, соответственно. Доля КР, напротив, уменьшилась до 62,7%.

В Кемеровской области КЭ в структуре заболеваемости клещевыми инфекциями КЭ составлял 71,2%; ИКБ составлял 27,4 %. Клещевой риккетсиоз занимал незначительную долю и составлял 1,3 %.

В 2007г. в структуре изменилось соотношение долей КЭ и ИКБ. На долю КЭ приходилось лишь 52,3%, тогда как доля ИКБ возросла, составив 45,7%. Доля КР практически не изменилась (1,9%).

В республике Хакасия доля КЭ в структуре клещевых инфекций составила 47,2%; доля ИКБ - 18,4%. Клещевой риккетсиоз составил 34,4%.

В 2007г. доля КЭ снизилась до 27,6%. Доля ИКБ практически не изменилась, составив 17,3%. Доля КР, напротив, возросла, составив 55,1%.

В Красноярском крае в 2000г. на долю клещевого энцефалита приходилось 65,6 %; на долю ИКБ — 20,6 %. Клещевой риккетсиоз составлял 13,8 %.

В 2007г. доля КЭ снизилась, составив 55,0%. Доли ИКБ и КР, напротив, возросли, составив 28,0% и 17,0%, соответственно.

В республике Тыва на долю КЭ приходилось 50,3 %; примерно такую же долю составила заболеваемость КР — 46,8 %. На долю ИКБ приходилось только 2,8 %.

В 2007г. наблюдалось увеличение доли КР, которая составила 53,2%, а также увеличение доли ИКБ до 3,9%, наряду с уменьшением доли КЭ до 42,8%.

В Иркутской области клещевой энцефалит составлял 60,8% в структуре заболеваемости клещевыми инфекциями. ИКБ составлял 35,2 %. На долю клещевого риккетсиоза приходилось 4,1 %.

В 2007г. в данной структуре произошли существенные изменения : возросло долевое участие ИКБ (55,0%); также увеличилась доля КР (10,9%). Доля КЭ, напротив, снизилась, составив 34,1%.

В Усть-Ордынском Бурятском автономном округе в 2000г. большая часть клещевых инфекций приходилась на ИКБ, который составил 49,6%, тогда как на долю КЭ — 17,2 %. Клещевой риккетсиоз составлял 33,1 %.

В 2007г. доли КЭ и ИКБ в структуре заболеваемости клещевыми инфекциями снизились, составив 10,8% и 44,0%, соответственно. Доля КР, напротив, возросла до 45,2%.

В республике Бурятия первое место в структуре заболеваемости клещевыми инфекциями занимал клещевой энцефалит — 65,3%; примерно одинаковые доли занимали ИКБ и КР — 16,7 % и 17,9 % соответственно.

В 2007г. доля КЭ снизилась на 15%, составив 50,9%; тогда как доля ИКБ и JCP возросли (24,3% и 27,8%, соответственно).

В Читинской области в 2000г. на долю клещевого энцефалита приходилось 58,9%. Клещевой риккетсиоз составлял 34,2%, тогда как иксодовый клещевой боррелиоз составлял 6,8%.

В 2007г. додя КЭ в структуре заболеваемости возросла, составив 60,7%, также увеличилась доля ИКБ (16,9%). Доля КР, напротив, снизилась, составив 22,3%.

Таким образом, на территориях, находящихся в сходных климато-географических условия с Омской областью, наряду в КЭ и ИКБ регистрируется и КР, что даёт основание предполагать наличие очагов данной инфекции и на территории Омской области.

В республике Алтай наибольшая доля заболеваемости также принадлежала клещевому риккетсиозу, его доля в структуре заболеваемости клещевыми инфекциями составляла 62,7%; доля КЭ составляла 27,5%, а ИКБ — 9,8/%. В Томской области КЭ составлял 48,0%, ИКБ — 52,0%. В Кемеровской области 52,3% приходилось на клещевой энцефалит, 45,7% - ИКБ, 1,9% - КР. В Хакасии доля клещевого энцефалита составляла 27,6%, ИКБ — 17,3%, КР — 55,1%. В Красноярском крае 55,0% приходилось на КЭ, 28,0% - на ИКБ; 17,0% - на КР. В республике Тыва клещевой энцефалит и клещевой риккетсиоз составляли примерно одинаковые доли в структуре заболеваемости (53,2% и 42,8% соответственно), а на долю ИКБ приходилось 3,9%. В республике Бурятия на дол1р КЭ приходилось 50,9%, на долю ИКБ - 24,3%, на долю КР — 27,8%. В Иркутской области структура заболеваемости клещевыми цнфекциями была представлена следующим образом: КЭ — 34,1%; ИКБ — 55,0%, КР - 10,9%. В УОБАО на долю КЭ приходилось 10,8%, наибольшая доля заболеваемости клещевыми инфекциями принадлежала ИКБ, который составлял 44,0%, на долю КР приходилось 45,2%. В Читинской области КЭ составлял 60,7%, ИКБ - 16,9%, КР - 22,3%.

Причиной различных показателей заболеваемости в регионах РФ является широкий спектр факторов, влияющих на неё.

На регистрируемую заболеваемость оказывают влияние как природные, так ц социальные факторы. Заражённость клещей-переносчиков является, наверное, основным и самым важным фактором, оказывающим значительное влияние на показатели заболеваемости той или иной нозоформой. Немаловажное значение имеет и численность клещей на территории, которая в свою очередь зависит от комплекса биотических и абиотических факторов, экологии определённого вида клещей, а также вида и численности их прокормителей, качества проведения акарицидных обработок, характера климатических изменений в течение года, что создает, соответственно, более или менее благоприятные условия и для циркуляции инфекционного агента в природном очаге.

В формировании ареалов видов иксодовых клещей главными являются абиотические условия. Каждый вид в силу своих исторически выработавшихся биологических потребностей занимает то пространство, на котором обеспечен физическими условиями, необходимыми для полного завершения своего жизненного цикла Роль биотических условий проявляется, в основном, в количественном распределении клещей в пределах их ареалов по различным типам местообитаний. Для иксодовых клещей в целом характерна большая неравномерность в распределении на местности в пределах ареала, что связано с особенностями расселения их хозяев-прокормителей. Качественный и количественный состав населения клещей также находится в определённой связи с ландшафтными особенностями природных территориальных подразделений географической оболочки Земли и в значительной мере зависит от характера их хозяйственного использования. Следовательно, такие факторы как обеспеченность теплом и влагой, наличие прокормителей и характер распределения последних могут иметь индикационное значение при определении характера населения иксодовых клещей. (Вершинина Т.А., 1985) Из социальных факторов, влияющих на регистрируемую заболеваемость клещевыми инфекциями, главным является обращаемость населения в лечебно-диагностические учреждения по поводу присасывания клеща. Обращаемость населения складывается из различных компонентов, в том числе частоты контактов населения с очагами, сезонной активности клещей, уровнем информированности населения о риске заражения различными инфекциями при присасывании клеща, а также доступности медицинской помощи в территориальном и финансовом аспектах.

Такая мультифакториальность регистрируемой заболеваемости затрудняет проведение эпидемиологического анализа и прогнозирование заболеваемости, т.к. получаемые статистические данные как бы «размываются» таким множеством влияний.

Количество патогенов, которые могут передаваться человеку клещами, не ограничивается рассмотренными нами. К таким инфекционным агентам ртносятся также эрлихии, анаплазмы, бабезии, бартонеллы, и этот спектр, возможно, будет расширяться.

Нами впервые были разработаны и апробированы технологии молекулярно-биологических исследований, основанные на ПЦР-рестрикционном анализе, для дифференциации основных видов риккетсий, выявляемых в природных очагах Западной Сибири.

Применение рестрикционного анализа с использованием эндонуклеаз (Rsal и PstI) позволило нам чётко дифференцировать два вида риккетсий:

7. R. sibirica, включающая подвиды R. sibirica subsp.sibirica и R. sibirica subsp.BJ-90

8. R.raoultii, врючающая геноварианты R.sp.DnS14, R.sp.DnS28, R.sp. RpA4,.

При исследовании клинического и полевого материала на наличие ДНК риккетсий получены следующие результаты: снятые переносчики в 18,7 % содержали фрагмент гена цитрат-синтазы, клещи относились к виду D.reticulatus (10 образцов) и I.persulcatus (2 образца) и в 23,4%- фрагмент гена цоверхностного белка отрА (все клещи относились к виду D.reticulatus). Фрагмент гена отрА в клещах I.persulcatus обнаружен не был. Рестрикционный анализ показал вариант профилей, соответствующий виду R.raoultii.

Антиген вирусов комплекса клещевого энцефалита выявлен в 7,8% снятых клещей, все клещи относились к виду D.reticulatus. Наличие фрагмента гена ospA боррелий выявлено в 1 случае (1,6%) у клеща D.reticulatus.

Микст-инфицирование (антиген вируса клещевого энцефалита в ИФА и ген отрА риккетсий в ПЦР) было обнаружено в одном случае из клеща D.reticulatus.

При исследовании 62 образцов ДНК клещей из природных стаций фрагмент гена gltA выявлен в 17,7%, гена отрА - в 21,0%. При рестрикции получен вариант профилей, соответствующий R.raoulti.

Наши исследования показали, что использование для детекции риккетсий в клещах одного гена-мишени не выявляет все случаи инфицирования данными агентами, т.к. только небольшая часть проб (10,3% от 126 проб ДНК клещей) дала положительный результат на оба фрагмента гена риккетсий. Большая часть положительных проб (19,8% от 126 проб) была выявлена с праймерами на какой-то один ген-мишень из исследуемых двух (gltA и отрА). Используя оба праймера, мы можем выявить большее количество проб, содержащих ДНК риккетсий.

Из 45 образцов ДНК биоптатов положительными в ПЦР на фрагмент гена цитрат-синтазы оказались 14 (31,1%). С праймерами на фрагмент гена отрА положительный результат получен в 2,2% (1 проба). При рестрикции получен вариант профилей, соответствующий R.raoultii. Для подтверждения результатов исследований необходимо секвенирование полученных фрагментов.

Все образцы ДНК сывороток в ПЦР дали отрицательный результат, что вероятно, связано с поздним взятием крови у пациента для исследования.

Таким образом, используя молекулярно-генетические методы, нам удалось получить результаты, свидетельствующие о наличии ДНК риккетсии R.raoultii в полевом и клиническом материале, что позволяет предположить этиологическую роль данного вида риккетсий в развитии инфекционного процесса.

В Омской области в результате скрининга мелких диких млекопитающих с использованием ПЦР и секвенирования были выявлены бартонеллы известных видов: B.grahamii и B.taylorii, а также два генотипа, представляющие, вероятно, новые виды бартонелл [62].

Так как в РФ бартонеллёзы не регистрируются, нет возможности на данном этапе оценить распространённость этой инфекции.

Нами впервые получены данные ПЦР-скрининга переносчиков и мелких млекопитающих в Омской области, свидетельствующие о широком распространении в Западной Сибири бартонелл, этиологическая структура которых и роль в региональной инфекционной патологии требует дальнейшего изучения.

При исследовании мелких диких млекопитающих, отловленных в Омской области, ДНК бартонелл была выявлена у следующих видов грызунов: М. gregalis — узкочерепной полёвки в 1,1%, M.oeconomus — полёвки экономки (1,5%), CI. rutilus — красной полёвки(4,5%), A.agrarius — полевой мыши (0,8%), A.sylvaticus — лесной мыши(0,4%), Sorex araneus - обыкновенной бурозубки (0,4%).

Клещи I.persulcatus, снятые с людей, содержали ДНК бартонелл в 35,0%, одна проба содержала антиген вируса КЭ, микст-инфицирования обнаружено не было. При исследовании платяных вшей было выявлено 15,0% положительных проб.

Таким образрм, полученные данные свидетельствуют о заражённости бартонеллами диких мелких млекопитающих и иксодовых клещей в Омской области, однако для определения их видовой принадлежности необходимо секвенирование полученных фрагментов генов. Детекция бартонелл в органах диких млекопитающих и членистоногих переносчиках, снятых с людей доказывает возможность заражения человека при кровопитании переносчика.

Принимая во внимание полученные нами данные, необходимо ввести в информационную подсистему эпидемиологического надзора блок лабораторных исследований, направленных на детекцию и идентификацию в клещах и материале от пациентов риккетсий группы КПЛ, а также детекцию в клещах, диких мелких млекопитающих и материале от пациентов бартонелл с использованием ПЦР и рестрикционного анализа.