Автореферат и диссертация по медицине (14.00.30) на тему:Эколого-эпидемиологические и молекулярно-генетические аспекты изучения природных очагов риккетсиозов и эрлихиозов в России

На правах рукописи

Шпынов Станислав Николаевич

Эколого-эпидемиологические и молекулярно-генетические аспекты

изучения природных очагов риккетсиозов и эрлихиозов в России

14.00.30 - эпидемиология 03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Омск - 2004

Работа выполнена в Государственном учреждении «Омский научно-исследовательский институт природноочаговых инфекций Минздрава России»

Научный консультант:

доктор медицинских наук Рудаков Николай Викторович Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Горовиц Эдуард Семенович доктор медицинских наук Боровский Игорь Владимирович доктор медицинских наук, профессор Обухова Татьяна Михайловна

Ведущая организация: Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера

Защита диссертации состоится « 5 » октября 2004 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д. 208.065.03. при Омской государственной медицинской академии (644099, г. Омск, ул. Ленина, 12).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Омской государственной медицинской академии.

Автореферат разослан « / »

2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук, доцент

Р.Н. Готвальд

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В Российской Федерации регистрируют заболевания двумя риккетсиозами, передающимися человеку иксодовыми клещами: клещевым риккетсиозом, вызываемым R. sibirica, и астраханской пятнистой лихорадкой с этиологическим агентом, относящимся к «генокомплексу R. conorii» (Лысковцев М.М., 1963; Rudakov N.V., 1996, Tarasevich I.V. et al., 1991). Астраханская пятнистая лихорадка является ярким примером «новой» инфекции (Тарасевич И.В., 2002). Rickettsia sp. DnS14 и Rickettsia sp. DnS28 недавно открыты в клещах Dermacentor nuttalli, собранных на территории республики Алтай в природных очагах клещевого риккетсиоза, и Rickettsia sp. RpA4 - в клещах Rhipicephalus pumilio из очагов астраханской пятнистой лихорадки в Астраханской области (Rydkina E. et al., 1999).

Внедрение молекулярно-генетических методов (ПЦР+установление нуклеотидных последовательностей) позволило открыть ряд новых, преимущественно апатогенных представителей семейства Rickettsiaceae в членистоногих. Эти методы позволили установить этиологическую роль ранее считавшихся апатогенными для человека риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки (КПЛ): Rickettsia slovaca, R. helvetica, R. mongolotimonae и «R. aeschlimannii» (Raoult D. et al., 1996, 1997, 2000, 2002; Fournier P.- E. et al., 2000).

В России в последние десятилетия отмечается непрекращающийся рост передаваемых клещами инфекций, в том числе и риккетсиозов. В ряде регионов описаны случаи заболеваний моноцитарным и гранулоцитарным эрлихиозами человека. Большой научный интерес и практическую ценность представляет изучение этиологической структуры риккетсиозов и эрлихиозов, передающихся человеку через присасывание клещей, и установление роли определенных видов иксодид в их распространении. Для эффективного решения задачи обеспечения эпидемиологического благополучия населения необходима четкая организация эпидемиологического надзора за этими инфекциями с использованием комплекса современных эпидемиологических, клинических, экологических и лабораторных методов и подходов, включая многоплановый мониторинг возбудителя и других сочленов паразитарных систем очаговых территорий.

Цель исследования

Изучить эколого-элидемиологические закономерности распространения риккетсий и эрлихий в России и Казахстане и обосновать применение молекулярно-генетических подходов для их мониторинга в природных очагах.

Задачи исследования-

1. Изучить современные эпидемиологические закономерности распространения клещевых риккетсиозов и эрлихиозов в России.

2. Изучить геновидовой состав и географическое распространение риккетсий и эрлихий и их связи с различными-видамн ттгупп in.территории России и Казахстана.

РОС национальная j библиотека

3. Изучить генетические характеристики штаммов Rickettsia sibirica, выделенных из различных источников в разных частях нозоареала клещевого риккетсиоза за длительный период изучения очагов.

4. Установить эпидемиологическую значимость различных видов иксодовых клещей и связанных с ними риккетсий в формировании нозоареала клещевого риккетсиоза.

5. Осуществить типологическую характеристику распространения патогенных для человека риккетсий группы КПЛ на территории России в зависимости от типа населения основных хозяев - иксодовых клещей.

6. Разработать новые подходы к мониторингу возбудителей «новых» клещевых бактериальных инфекций и эпидемиологического надзора за очагами клещевого риккетсиоза с использованием методов генетического анализа.

Научная новизна.

Охарактеризованы современные эпидемиологические закономерности клещевого риккетсиоза в период беспрецедентного роста заболеваемости этой инфекцией в Российской Федерации при ведущем значении Западной Сибири (Алтайский край).

Впервые выявлена выраженная генетическая гетерогенность а-протеобактерий порядка Rickettsiales (16 видов) на территориях России и Казахстана и их экологические связи с различными видами иксодовых клещей. Наибольшее разнообразие представителей порядка Rickettsiales связано с клещами Ixodes persulcatus, в которых генотипированы «Candidatus Rickettsia tarasevichiae», R. sibirica, R. helvetica, риккетсия, близкая к Rickettsia sp. AT-1, Anaplasma phagocytophila, Ehrlichia muris, «Ehrlichia-like» 'Schotti variant' и бактерия 'Montezuma'.

Установлены сопряженные очаги клещевого риккетсиоза и гранулоцитарного эрлихиоза человека в Западной Сибири (Алтайский край). В очагах клещевого риккетсиоза в роли переносчика R. sibirica выступают иксодовые клещи из рода Dermacentor, в очагах гранулоцитарного эрлихиоза человека этиологический агент A. phagocytophila передается клещами /. persulcatus, кроме этого в клещах Haemaphysalis concinna генотипирована «R. heilongjiangensis», признанная «новым» патогеном человека.

При молекулярно-генетических исследованиях штаммов риккетсий группы КПЛ доказано наличие R. sibirica в пределах всего нозоареала клещевого риккетсиоза в России, где по результатам генотипирования выявлено выраженное преобладание R. sibirica над другими видами риккетсий с доказанной патогенностью (из 25 изученных штаммов - 23 штамма R. sibirica, 1- Rickettsia sp. BJ-90, являющийся геновариантом R. sibirica, и 1- R. slovaca). Сравнение нуклеотидных последовательностей двух генов (ртрА и gitА) 23 изученных штаммов показало их полную гомологию, что демонстрирует генетическую консервативность R. sibirica.

Выявлены различия в генотипическом составе риккетсий в очагах клещевого риккетсиоза и на неэндемичных по этому заболеванию территориях. На территориях с отсутствием заболеваемости клещевым риккетсиозом не выявлены штаммы патогенных риккетсий, кроме R. slovaca. В очагах

клещевого риккетсиоза наряду с Rickettsia sibirica, выявлены и другие представители группы КПЛ с доказанной патогенностью- «R. heilongjiangensis» и R. slovaca.

Описан новый генотип риккетсий, получивший название «Candidates Rickettsia tarasevichiae», в честь академика РАМН, руководителя лаборатории экологии риккетсий НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН И.В.Тарасевич. Установлена филогенетическая позиция, экологическая связь с клещами /. persulcatus и географическое распространение этого нового представителя рода Rickettsia.

Впервые на основании полученных мол екулярно-генетических исследований дана типологическая характеристика распространения патогенных для человека риккетсий группы КПЛ в зависимости от типа населения основных хозяев- иксодовых клещей. Выделены два основных географических региона: Восточно-Европейский с циркуляцией возбудителя астраханской пятнистой лихорадки и R. slovaca (дермаценторио-рипицефалисный) и Азиатский с циркуляцией R. sibirica, «R. heilongjiangensis» и R: slovaca (дермаценторно-гемафизалисный). В пределах Азиатского региона выделены четыре области: дермаценторная (маргинатусно-ретикулятусная) с циркуляцией R. sibirica и R. slovaca; дермаценторно-гемафизалисная сибирская с циркуляцией R. sibirica и «R. heilongjiangensis»; дермаценторная (нутталлиево-сильварумная) с циркуляцией R. sibirica; и дермаценторно-гемафизалисная дальневосточная с циркуляцией R. sibirica и «R. heilongjiangensis».

Практическая ценность и реализация результатов исследования

В результате проведенных исследований установлены основные закономерности распространения очагов клещевых риккетсиозов, гранулоцитарного эрлихиоза человека на территории России. Установлено географическое распространение представителей порядка Rickettsiales и их экологические связи с иксодовыми клещами на территориях России и Казахстана. Разработан комплекс мероприятий по эпидемиологическому надзору за очагами клещевых риккетсиозов и эрлихиозов и профилактике этих инфекций на территориях Южного Урала, Западной и Восточной Сибири и Дальнего Востока. Усовершенствованы методы индикации и идентификации представителей порядка Rickettsiales в иксодовых клещах и обоснована тактика мониторинга очагов этих инфекций. Отработана тактика применения комплекса биологических, серологических и молекулярно - генетических методов, как на эндемичных территориях с высоким уровнем заболеваемости клещевым риккетсиозом и выявлением вирулентных штаммов R. sibirica, так и на территориях с отсутствием заболеваемости и циркуляцией авирулентных штаммов риккетсий.

Разработаны Методические указания. 3.1.1755-03. Организация эпидемиологического надзора за клещевым риккетсиозом: Утверждены МЗ РФ

'Выражаем глубокую признательность академику РАМН И.В.Тарасевич за научно-консультационную помощь при выполнении работы

28.09.03. Авторы: В.КЛстребов, Н.В.Рудаков, И.Е.Самойленко, Т.А.Решетникпйя, С.Н.Шпыноз, И.В.Тарасевич.

Получено решение о выдаче патента на изобретение по заявке № 2001127459/13 (029242) «Апатогенный штамм риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки, используемый для дифференциации патогенных и апатогенных риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки» авторов Самойленко И.Е., Шпынова С.Н. и Рудакова Н.В. от 24 февраля 2004 г. Дата приоритета 09.10.2001 г.

Впервые определены и депонированы в Международный компьютерный банк данных GenBank нуклеотидные последовательности гена gltA (AF503167) и гена 16S рРНК (AF503168) «Candidatus Rickettsia tarasevichiae», гена отрА (AY259083) и гена gltA (AY259084) Rickettsia aeschlimannii штамм «Казахстан».

Депонированы штаммы новых генотипов риккетсий во Всероссийский музей риккетсиозных культур НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН:

1. Самойленко И.Е., Шпынов С.Н. Штамм группы клещевой пятнистой лихорадки «5/98-Караганда» Rickettsia species novus генотипа RpA4 (сокращенно R.sp.nov.RpA4). Справка о депонировании штамма от 23.12.02 г. (Омский НИИПИ).

2. Самойленко И.Е., Шпынов С.Н. Штамм группы клещевой пятнистой лихорадки «Шайман» Rickettsia species novus генотипа DnS14 (сокращенно R.sp.nov.DnS14). Справка о депонировании штамма от 23.12.02 г. (Омский НИИПИ).

Положения, выносимые на защиту

1. На территориях России и Казахстана в иксодовых клещах имеют распространение: «классический» патоген человека - R. sibirica; возбудитель астраханской пятнистой лихорадки, R. slovaca, «R. heilongjiangensis», R. aeschlimannii и R. helvetica, отнесенные к «новым» патогенам человека, и риккетсий с неизученной патогенностыо для человека, к которым относятся: Rickettsia sp. RpA4, Rickettsia sp. DnS14 и Rickettsia sp. DnS28, «Candidatus Rickettsia tarasevichiae» и риккетсия близкая Rickettsia sp. AT-1. Филогенетические позиции большинства выявленных видов риккетсий существенно отличаются и представляют все основные геногруппы риккетсий, экология которых связана с иксодовыми клещами.

2. Нозоареал клещевого риккетсиоза соответствует ареалу R. sibirica и имеет распространение от Зауралья (Курганская область) до Дальнего Востока России (Приморский край). Наряду с R. sibirica в нозоареале клещевого риккетсиоза выявлены другие патогенные и с неустановленной патогеностью риккетсий, распространение которых связано с населением основных эпидемически значимых переносчиков.

3. На территориях юга Западной Сибири (Алтайский и Красноярский края) и Дальнего Востока (Приморский край) в клещах К concinna выявлен «новый» патоген человека «R. heilongjiangensis», в Алтайском и Приморском краях в очагах клещевого риккетсиоза в клещах /. persulcatus генотипирована A. phagocytophila- возбудитель гранулоцитарного эрлихиоза человека.

4. Выделены три экологические группы риккетсий, выявленных на территориях России и Казахстана, по отношению к их преимущественным хозяевам - представителям различных родов иксодовых клещей (Dermacentor и Rhipicephalus; Haemaphysalis Ixodes). Выделены два основных географических региона по распространению иксодовых клещей и экологически связанных с ними патогенных риккетсий группы КПЛ: Восточно-Европейский с циркуляцией возбудителя астраханской пятнистой лихорадки и R. slovaca (дермаценторно-рипицефалисный) и Азиатский с циркуляцией R. sibirica, «R. heilongjiangensis» и R. slovaca (дермаценторно-гемафизалисный).

5. Комплексное применение биологических, серологических и молекулярно - генетических методов, является целесообразным как на эндемичных территориях с высоким уровнем заболеваемости клещевым риккетсиозом и выявлением вирулентных штаммов R. sibirica, так и на территориях с отсутствием заболеваемости и циркуляцией авирулентных штаммов риккетсий.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на:

• Международной конференции: «Rickettsiae and Rickettsial Diseases in the Tum ofthe Third Millenium», Marselle, France, 1999;

• Республиканской конференции посвященной 80- летаю Омского НИИПИ «Природноочаговые болезни человека», Омск, 2001;

• Второй и третьей региональных и четвертой межрегиональной научно — практических конференциях «Актуальные проблемы обеспечения санитарно -эпидемиологического благополучия населения», Омск, 2001,2002,2003;

• 8 Всероссийском съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 2002;

• Второй научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера», Новосибирск, 2002;

• International conference on rickettsiae and rickettsial diseases, Ljubljana, 2002;

• «7 international Potsdam symposium on tick - borne diseases» poster sessions, Berlin, 2003;

• Научно - практической конференции «Современное состояние Российской биотехнологии», Москва, 2003

Публикации

Основные материалы диссертации отражены в 43 печатных работах. Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов, списка литературы (287 отечественных и зарубежных источника). Объем работы составляет 204 страницы машинописного текста, в том числе 16 таблиц и 22 рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и МЕ ТОДЫ исследования

Осуществлен анализ данных официальной регистрации заболеваемости клещевым риккетсиозом в Российской Федерации за весь период регистрации (1936-2002 гг.). Изучено территориальное распределение заболеваемости клещевым риккетсиозом в Азиатской части России (Западная и Восточная Сибирь, Дальний Восток) в периоды с низким уровнем заболеваемости (60-е годы) и резкого роста заболеваемости (1993-2002 гг.). Изучены тенденции изменения показателей заболеваемости клещевым риккетсиозом на 100 тыс. населения в регионах Российской Федерации (Западная и Восточная Сибирь, Дальний Восток) за последние 10 лет (периоды: 1993-1997 тт. и 1998-2002 гг.). Изучена динамика заболеваемости клещевым риккетсиозом в России, Алтайском крае и республике Алтай (1942-2002 гг.), в Новосибирской области (1944 - 2002 гт). Изучена территориальная структура заболеваемости клещевым риккетсиозом в Новосибирской области в период с 1990 по 2001 гг. Осуществлена дифференциация территории России на основании географического распространения иксодовых клещей-хозяев и экологически связанных с ними патогенных для человека видов риккетсий. Разработаны новые подходы к мониторингу возбудителей «новых» клещевых бактериальных инфекций и эпидемиологического надзора за очагами клещевого риккетсиоза с использованием комплекса молекулярно-генетических, серологических и биологических методов. Раздел молекулярно-генетических исследований был выполнен на базе лаборатории «Unite des Rlckettsies» (г. Марсель, Франция) в соответствии с договором о международном сотрудничестве. Осуществлено молекулярно-генетическое исследование 25 штаммов риккетсий группы КПЛ из коллекции Омского НИИПИ, выделенных в очагах клещевого риккетсиоза от больных и иксодовых клещей шести видов на различных территориях в период с 1954 по 2001гг. С применением комплекса молекулярно-генетических методов (ПЦР+установление нуклеотидных последовательностей) осуществлено исследование на наличие риккетсий, эрлихий и анаплазм 900 экземпляров имаго иксодовых клещей четырех родов (Dermacentor, Haemaphysalis, Ixodes и Hyalommd), собранных в Воронежской, Оренбургской, Челябинской, Тюменской, Омской и Новосибирской областях, Ставропольском, Алтайском, Красноярском и Приморском краях, республике Бурятия (Российская Федерация), а также в Карагандинской, Алма-Атинской и Восточно-Казахстанской областях Казахстана. Определение видовой принадлежности клещей было осуществлено научным сотрудником НИИПИ А.К. Танцевым при консультационной помощи д.б.н., профессора Омского педагогического университета И.И. Богданова. С помощью гемоцитового теста, методом флюоресцирующих антител с поликлональными антителами к риккетсиям группы КПЛ, осуществлено выявление риккетсий группы КПЛ в 640 экземплярах переносчиков (D. marginatus, D. reticulatus, I. ricinus) в лесостепной зоне Европейской части России (Ставропольский край, Воронежская область) и на южном Урале (Оренбургская и Челябинская области), проведена оценка их вирулентности в биопробах на морских свинках.

В ИФА, в сопоставлении с другими методами (МФЛ, РИГА) выявления риккетсий группы КПП, в пулах и индивидуально исследовано потомство четырех экспериментальных линий иксодовых клещей двух видов (D. nuttalli, D. marginatus), в том числе: 3200 яиц, 1507 личинок 193 нимфы, 35 имаго. Методом биопроб на морских свинках исследовано 400 (10 пулов по 40 особей) экземпляров имаго иксодовых клещей рода Dermacentor (120 экз. - D. marginatus и 280 экз. - D. reticulatus), собранных в новом очаге клещевого риккетсиоза в Татарском районе Новосибирской области.

В работе применен ряд классических методов эпидемиологии (статистический анализ заболеваемости и сравнительно-исторический метод), молекулярно-генетические методы (полимеразная цепная реакция, установление нуклеотидных последовательностей-секвенирование), филогенетический метод для построения филогенетических деревьев. Были применены стандартные риккетсиологические (биопроба на морских свинках -самцах, куриных эмбрионах) и серологические методы: метод флюоресцирующих антител (МФА), реакция связывания комплимента (РСК), реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) и иммуноферментный анализ (ИФА).

Сбор имаго иксодовых клещей проводили в весенне-летний период с 1999 по 2002 гг. с растительности на стандартную волокушу (флаг) по общепринятым методикам. Идентификация клещей была осуществлена по морфологическим признакам (Померанцев Б.И., 1950; Филиппова Н.А. 1977). Иксодовые клеши с территории Оренбургской области получены от Шерстневой М.Б. и Турышева А.Г. (ФГУ ЦГСЭН по Оренбургской области), Новосибирской области от Федорова Е.Г. и Федянина А.П. (ФГУ ЦГСЭН по Новосибирской области), Ставропольского края от Тохова О.М. (ФГУ ЦГСЭН по Ставропольскому краю), Алтайского края от Прейдер В.П. (ФГУ ЦГСЭН по Алтайскому краю), Красноярского края от к.б.н. Хазовой Т.Г. (ФГУ ЦГСЭН по Красноярскому краю), Приморского края от д.м.н. Леоновой Г.Н. (НИИЭМ СО РАМН, г. Владивосток), а также от Егоровой Н.В. и Борисовой О.Н. (ФГУ ЦГСЭН по Приморскому краю). Иксодовые клещи из Воронежской области получены при содействии главного государственного врача ФГУ ЦГСЭН по Воронежской области д.м.н. Чубирко М.И., из Челябинской области при содействии главного государственного врача ФГУ ЦГСЭН по Челябинской области Гаврил ова А. П. Иксодовые клещи с территории Казахстана (Карагандинская, Алма-Атинская и Восточно-Казахстанская области) получены от к.м.н. Танкибаева М.А. (Карагандинская медицинская академия).

Материалы исследования подвергались статистической обработке с использованием математических приемов, адекватных цели и задачам исследования. Обработка данных и оформление результатов осуществлялась на персональном компьютере при помощи пакета MS Office, MS Excel -2000.

Суммарную ДНК экстрагировали из каждого клеща индивидуально, применяя QIAamp Tissue Kit (QIAGEN, Hilden, Germany). Однораундовую ПЦР выполняли в терхмоциклере Peltier модель РТС-200 (Mj Research, Inc, Watertown, MA). Для амплификации ДНК риккетсий применяли праймеры Rrl90.70p (5-

ATGGCGAATATTTCTCCAAAA -3) и Rrl90.701n (5- GTTC CGTTAATGGCAGCATCT -3), которые амплифицируют фрагмент 629- 632 nap оснований (п.о.) гена кодирующего белок наружной мембраны 190-кД {ртрА), а также RpCS.877p (5-GGGGACCTGCTCACGGCGG-3) и RpCS.1258 (5-TTGCAAAAAGTACAGTGAACA-3), которые амплифици-руют 396 п.о. фрагмент гена цитрат синтетазы (gltA) риккетсий. ДНК эрлихий и анаплазм была амплифицирована в ПЦР, применяя прямой праймер 16SEHRD (5' GGTACCYACAGAAGAAGTCC 3') и обратный праймер 16SEHRR (5' TAGCACTCATCGTTTACAGC 3'), которые амплифициругат 345 п.о. фрагмент 16S рибосомальной РНК всех известных эрлихий и анаплазм. Каждая постановка ПЦР включала отрицательный контроль (дистиллированная вода) и положительный контроль (ДНК Rickettsia montanensis или Erhlichia canis в зависимости от направленности скрининга). Визуализацию амплифицированных ПЦР-продуктов проводили в 1 % агарозном геле с добавлением бромида этидия после электрофоретической миграции. Установление нуклеотидных последовательностей всех полученных ПЦР-продуктов было осуществлено на ABI 3100 PRISM (Applied Biosystems, Warrington, United Kingdom) автоматическом секвенаторе. Последовательности ДНК, полученные при секвенировании, были идентифицированы с депонентами, находящимися в GenBank в режиме прямого доступа. Выравнивание нуклеотидных последовательностей осуществляли с помощью программы CLUSTAL в оболочке BISANCE (Dessen P. et al., 1990). Процент гомологии иуклеотидных последовательностей определяли, применяя DNADIST software package (Hitachi Software Engineering America, Brisbane, CA) метод Kimura (Kimura M., 1980). Филогенетический анализ выполняли применяя neighbour-joining метод и программу DNAPARS в версии PHYLIP с методом максимальной вероятности (maximum-likelihood). Построение филогенетических деревьев выполняли с применением программы ClustalW в версии 1.8 (доступной через DNA Data Bank of Japan, Vishima, Japan [http:www.ddbj.nig.ac.jp/htmls/E-mail/clustalw-e.html]). Визуализацию

дендрограмм осуществляли с помощью программы Tree View, версия 1.61.

Автор выражает глубокую благодарность администрации и сотрудникам ГУ Омский НИИ природноочаговых инфекций МЗ РФ, специалистам центров санитарно-эпидемиологического надзора за поддержку при выполнении исследований. Автор признателен профессору Средиземноморского университета Dider Raoult за возможность, осуществить молекулярно-генетические исследования на базе лаборатории «Unite des Rickettsies» (г. Марсель, Франция).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Современное состояние очагов клещевого риккетсиоза

С начала официальной регистрации клещевого риккетсиоза с 1936 по 2003 гг. в России зарегистрировано более 61 тыс. случаев этого заболевания (рис. 1).

Проведенный анализ позволил выделить три многолетних периода.

Рис. 1. Заболеваемость клещевым риккетсиозом в России с 1936 по 2003 гг.

Число случаев заболеваний КР в год — Линия тренда (Полином 6 степени)

Первый период, характеризующийся подъемом уровня заболеваемости клещевым риккетсиозом в стране, наблюдался с 1943 по 1967 гг. с регистрацией наибольшего количества случаев заболеваний в 1945, 1954 и 1967 гг. преимущественно за счет региона Восточной Сибири. Во второй период (с 1968 по 1978 гг.) наблюдалось значительное снижение регистрации заболеваемости клещевым риккетсиозом. Однако, с 1979 г. по настоящее время (третий период) наблюдается непрекращающийся рост заболеваемости с ростом показателей в 10 раз, преимущественно за счет Западной Сибири.

Сопоставление территориального распределения заболеваемости клещевым риккетсиозом за период с низким уровнем заболеваемости (60-е годы) и период резкого роста (1993-2002 гг.) свидетельствует о его изменениях за счет увеличения доли заболеваемости в Западной Сибири (с 24,5 до 55,0 %) и на Дальнем Востоке (с 7,5 до 23 %). При этом доля заболеваемости в Восточной Сибири снизилась с 68,0 до 22 % (рис. 2).

За последнее десятилетие с 1993 г. по 2002 г. в Российской Федерации зарегистрировано 25020 случаев заболевания клещевым риккетсиозом, в среднем 2502 случая в год. При анализе заболеваемости по регионам доля случаев в Западно-Сибирском регионе составляет 55% по России, в ВосточноСибирском регионе - 22% и в Дальневосточном — 23%. В 2001 гг. было зарегистрировано наибольшее количество случаев клещевого риккетсиоза (3460), из них на Западную Сибирь приходится 64,7%, на Восточную Сибирь -21,8%, на Дальний Восток - 13,5%.

Рис. 2. Структура заболеваемости клещевым риккетсиозом в 60-е годы 20 века и за последнее десятилетие

Западная Сибирь Ш Восточная Сибирь Ш Дальний Восток Ш

Показатели заболеваемости на 100 тыс. населения составляли, в Западно-

Сибирском регионе - 9,0 (с колебаниями в различные годы от 4,8 до 15), в Дальневосточном - 7,6 (от 5,9 до 10,2), в Восточно-Сибирском - 6,1 (от 4,3 до 8,9), соответственно. В Западно-Сибирском регионе наиболее высокие показатели заболеваемости отмечались в республике Алтай и Алтайском крае (более 50,0 на 100 тыс. населения).

В Восточно-Сибирском регионе показатели заболеваемости от 21,0 до 55,0 отмечались в республиках Хакасия, Тыва и Усть-Ордынском Бурятском АО. В Дальневосточном регионе максимальные показатели заболеваемости на 100 тыс. населения отмечались в Хабаровском, Приморском краях и Амурской области (более 10,0).

Приведенные данные свидетельствуют, что наиболее высокие показатели заболеваемости в период 1993-2002 гг. регистрировались в Западно-Сибирском регионе (15,0 в 2001 г.).

Анализ заболеваемости клещевым риккетсиозом по регионам за последние 5 лет (1998-2002) показал, что в Западно-Сибирском регионе среднегодовой показатель на 100 тыс. населения составлял 11,3, в Восточно-Сибирском - 6,8, в Дальневосточном - 7,3. Сравнение с аналогичными показателями заболеваемости клещевым риккетсиозом за период 1991-1995 гг. свидетельствовало об увеличении показателей в 1998-2002 гг. в основном в Западно-Сибирском (с 6,7 до 12,4), Восточно-Сибирском (с 5,4 до 6,8 на 100 тыс. населения) регионах, при тенденции снижения показателей в Дальневосточном регионе (с 7,9 до 7,3). В 2002 произошло снижение показателя заболеваемости на 100 тыс. населения в Западно-Сибирском регионе и рост этого показателя в Восточно-Сибирском регионе, в результате чего произошло их выравнивание на значении 8,9 (рис. 3).

16

Рис. 3. Динамика заболеваемости клещевым риккетсиозом по регионам России с 1993 по 2002 гг. Западно-Сибирский -»-Восточно-Сибирский -♦-Дальневосточный

По заболеваемости населения клещевым риккетсиозом Алтайский край и республика Алтай стабильно характеризуются наиболее высокими показателями в Российской Федерации (республика Алтай - 54,2-90,9 на 100 тыс. населения и Алтайский край - 24,3-65,3). По данным официальной регистрации за 2001 гг. 59% случаев клещевого риккетсиоза в стране было зарегистрировано в Алтайском крае (54%) и республике Алтай (5%). За 61 год изучения (1942-2002 гг.) на этих территориях зарегистрирован 25151 случай этой инфекции, из них 12970 (51,6%) случаев за последнее десятилетие (1993-2002 гг.). Наиболее эпидемически активны очаги в горно-степных ландшафтах республики Алтай, где стабильно высокие показатели заболеваемости на 100 тыс. населения связаны с низкой численностью населения при высоком количестве случаев клещевого риккетсиоза. В последнее десятилетие более значительную роль приобретают очаги в районах северной лесостепи, характеризующиеся наибольшим разнообразием видового состава переносчиков, среди которых возросло значение клещей Н. ^тЫт.

В настоящее время отмечается расширение нозоареала клещевого риккетсиоза, что проявляется в появлении новых эпидемически активных очагов в Новосибирской, Тюменской и Курганской областях. Анализ многолетней динамики заболеваемости клещевым риккетсиозом в Новосибирской области позволяет выделить три периода с различными особенностями распространения и эпидемического проявления природных очагов клещевого риккетсиоза на этой территории. Первый период (1944 - 1986 гг.) - заболеваемость регистрируется в одном восточном районе (Тогучинском) и характеризуется постепенным снижением эпидемического потенциала очага с переносчиком D. silvarum. Второй период (1987 - 1992 гг.) - появление нового эпидемически активного очага в восточной части Новосибирской области (Сузунский район) с переносчиком D. silvarum. Третий период (с 1993 г. - по настоящее время) — резкий рост заболеваемости клещевым риккетсиозом в западной части области с переносчиками D. marginatus и D. С 1991 г.

заболевания клещевым риккетсиозом стали выявлять в Карасукском районе, с 1993 г.- в Татарском, с 1995 г.- в Здвинском и с 1999 г.- в Краснозерском районах. Таким образом, в 90-е годы в юго-западной части Новосибирской области сформировались новые эпидемически активные очаги клещевого риккетсиоза. Всего за период 1990-2001 гг. в Новосибирской области зарегистрировано 407 случаев клещевого риккетсиоза в городах Новосибирске и Татарске, Сузунском, Карасукском, Татарском, Здвинском и Краснозерском районах. В восточной части Новосибирской области клещевой риккетсиоз регистрируют только в Сузунском районе (наиболее эпидемически активные очаги с переносчиком D. silvarum). В западной части области заболевания отмечают в четырех районах, наиболее эпидемически активные очаги выявлены в Здвинском и Татарском районах. Изучение территориальной структуры заболеваемости клещевым риккетсиозом в Новосибирской области за два периода с 1990 по 1995 гг. и с 1996 по 2001 гг. свидетельствует о существенном повышении доли западных районов за последнее пятилетие.

Полученные материалы свидетельствуют об устойчивой тенденции формирования новых эпидемически активных очагов на западных границах нозоареала клещевого риккетсиоза. По типу населения основного переносчика вновь выявленные очаги относятся к дермаценторным лесостепным (D. marginatus и D. reticulatus) и характеризуются полным отсутствием D. silvarum. В Татарском районе при углубленном изучении очагов клещевого риккетсиоза из клещей D. reticulatus выделен штамм R. sibirica «Киевка/01», что показывает эпидемическую значимость этого вида клещей. Продвижение нозоареала клещевого риккетсиоза на запад связано с повышением эпидемической значимости D. reticulatus. На территории Татарского района в клещах этого вида была генотипирована Rickettsia RpA4, патогенность, которой не установлена.

Таким образом, в последние годы отмечается рост заболеваемости клещевым риккетсиозом в западных и юго-западных районах Новосибирской области, где за последние 15-20 лет сформировались активные очаги клещевого риккетсиоза. С момента регистрации клещевого риккетсиоза в Тогучинском, а позднее Сузунском (восточных) районах Новосибирской области идет распространение очагов этой инфекции в западном направлении.

Генотипированис штаммов риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки, выделенных в очагах клещевого риккетсиоза

Результаты генотипирования показали, что 23 из изученных штаммов риккетсий группы КПЛ представлены видом R. sibirica. Штамм «Приморье 32/84», изолированный от клещей D. silvarum из Приморского края в 1984 г., был идентифицирован как Rickettsia sp. BJ-90. Эта риккетсия была впервые описана в 1990 г. в клещах D. sinicus в КНР (Yu X.J. et al., 1991), филогенетически близка к R. sibirica и «R. mongolotimonae», однако более тесно связана с R. sibirica и признана генетическим вариантом этого вида риккетсий (Zhang J.Z. et al., 2000). Это первый случай выделения «китайского» геноварианта R. sibirica за пределами КНР. Штамм «Карпунино 19/69» показал 100 % гомологии с R. slovaca. Этот вид риккетсий из группы КПЛ был впервые изолирован J. Rehacek в 1968 г. из клещей D. marginatus в Чехословакии. Штамм «Карпунино 19/69» был изолирован Шайманом М.С. в 1969 г. от клещей D. marginatus в Курганской области и спустя 34 года идентифицирован как R. slovaca. Этот вид риккетсий был выявлен в клещах D. marginatus во Франции, Швейцарии, Словакии, Украине, Югославии, Армении и Португалии (Sekeyova Z. et al., 1998). В настоящее время инфекция, вызываемая R. slovaca, подтверждена с применением методов генетического анализа у 17 из 67 пациентов с синдромом «Tibola» (Raoult D. et al., 2002). Полученные результаты расширяют представления об ареале R. slovaca в России.

Вид R. sibirica абсолютно преобладал (92 %) среди 25 исследованных патогенных для морских свинок штаммов риккетсий группы КПЛ (таблица 1). Этот вид риккетсий был генотипирован из различных источников (больные клещевым риккетсиозом, иксодовые клещи) на всех эндемичных по клещевому риккетсиозу территориях, где были выделены штаммы риккетсий. На всех территориях, где были выделены штаммы R. sibirica, регистрируется заболеваемость клещевым риккетсиозом. Большинство территорий

Таблица 1

Результаты секвенирования штаммов риккетсий фуипы клещевой пятнистой лихорадки по двум генам (отрА и 2НА)

№ Штамм Источник Исследователь, год Вид

1 Карпунино 19/69 D. marginatus Шайман М.С., 1969 R. slovaca

2 Комсомольское 21/69 D. marginatus Шайман М.С., 1969 R. sibirica

3 Бердюжье 20/64 D. reticulatus Шайман М.С., 1964 R.sibirica

4 Сидро человек Шайман М.С., 1954 R. sibirica ■

5 Тогучин 104 I .persulcatus Шайман М.С., 1964 R. sibirica

6 Сузун 11/89 D. silvarum Рудаков Н.В., 1989 R. sibirica

7 Киевка/01 D. reticulatus Шпынов С.Н., Рудаков Н.В., 2001 R. sibirica

8 55/65 I. persulcatus Шайман М.С., 1965 R. sibirica

9 44/65 D. reticulatus Шайман М.С., 1965 R. sibirica

10 84/Казанцева человек Ястребов В.К., 1966 R. sibirica

11 87/Паршукова человек Ястребов В.К., 1966 R. sibirica

12 148/66 D. reticulatus Ястребов В.К., 1966 R. sibirica

13 Алтай 24/86 H. concinna Рудаков Н.В., 1986 R. sibirica

14 Баево 105/87 D. marginatus Рудаков Н.В., 1987 R. sibirica

15 Баево 107/87 D. marginatus Рудаков Н.В., 1987 R. sibirica

16 Горный 54/88 D. nuttalli Рудаков Н.В., Шпынов С.Н., 1988 R. sibirica

17 Алтай 81/88 D. silvarum Рудаков Н.В., Самойленко И.Е., 1988 R. sibirica

18 Горный 37/89 D. nuttalli Шпынов С.Н., R. sibirica

Рудаков Н.В., 1989

19 Завьялово 43/89 D. marginatus Рудаков Н.В., Самойленко И.Е, 1989 R. sibirica

20 Глубокое 45/89 D. marginatus Рудаков Н.В., Самойленко И.Е., 1989 R. sibirica

21 Красноярск 10/91 D. nuttalli Самойленко И.Е., 1991 R. sibirica

22 Красноярск 15/91 D. nuttalli Самойленко И.Е., 1991 R. sibirica

23 Бурятия 91/85 D. nuttalli Решетникова Т.А., 1985 R. sibirica

24 Приморье 20/84 H. concinna Решетникова Т.А., 1984 R. sibirica

25 Приморье 32/84 D. silvarum Решетникова Т.А., 1984 R. BJ-90

характеризуется стабильно высоким уровнем заболеваемости этой инфекцией (Алтайский, Красноярский и Приморский края, республики Алтай и Бурятия, Новосибирская область). На территории Алтайского края и республики Алтай -гиперэндемичных по клещевому риккетсиозу было выделено наибольшее количество (52%) штаммов R. sibirica. На других территориях, таких как Курганская и Тюменская области, единичные случаи заболеваний клещевым риккетсиозом регистрируют лишь в отдельные годы многолетних наблюдений. Все 23 штамма R. sibirica, выделенные за 48 лет из различных источников, имели 100 % гомологию по 2 изученным генам (отрА и gltA).

Два штамма, выделенные из клещей /. persulcatus, были генотипированы как R. sibirica. Этот факт может указывать на потенциальную роль клещей этого вида в качестве переносчика и резервуара R. sibirica.

На территории Курганской области из клещей D. marginatus было выделено 2 штамма риккетсий: 1 штамм Л slovaca «Карпунино 19/69» и 1 штамм R. sibirica «Комсомольское 21/69». Нами впервые установлено и подтверждено с помощью молекулярно-генетических методов, что выделенные в очаге клещевого риккетсиоза штаммы представлены R. sibirica и R. slovaca. Идентификация R. sibirica «Комсомольское 21/69» в переносчике - клещах D. marginatus подтверждает соответствие западной границы нозоареала распространению возбудителя инфекции. Однако, по некоторым данным штаммы риккетсий, выделенные из клещей D. pictus (D. reticulatus) на территории Тульской области в 60ыс годы прошлого века, были отнесены к R. sibirica (Коршунова О.С. и др., 1966).

Другим важным аспектом распространения риккетсий группы КПЛ на этой территории является идентификация штамма R. slovaca «Карпунино 19/69», выделенного из клещей D. marginatus на территории Курганской области. С момента описания R. slovaca долгое время рассматривалась, как апатогенный серовариант, представляющий западную часть ареала R. sibirica (Makarova V.A. et al., 1978). Самыми восточными территориями, на которых до настоящего времени была выявлена R. slovaca, являлись Армения и Украина (Крым). В период с 1968 по 1978 гг. 116 штаммов R. slovaca было выделено из различных видов иксодовых клещей на морских свинках и куриных эмбрионах на территории Европы и в Армении (Rehacek J, Tarasevich I.V., 1988). Большинство штаммов было выделено из клещей D. marginatus, несколько - из других видов клещей, в том числе 3 штамма - из D. reticulatus. Это указывает на потенциальную роль клещей D. reticulatus как резервуара и вектора R. slovaca.

К настоящему времени штамм «Карпунино 19/69» является самой восточной находкой R. slovaca в клещах на территории Евразии. Таким образом, на территории Курганской области установлена западная граница ареала R. sibirica и восточная граница ареала R. slovaca, которые связаны с распространением клещей D. marginatus. При проведении дальнейших исследований иксодовых клещей (D. marginatus) возможно выявление R. slovaca восточнее этих находок, что расширит представление об ареале этого вида риккетсий.

Наибольшее количество изученных штаммов риккетсий группы КПЛ (18 изолятов) было выделено на территории Западной Сибири. Несмотря на наибольшее разнообразие источников (человек, шесть видов иксодовых клешей трех родов) все идентифицированные штаммы были представлены одним видом риккетсий - R. sibirica. На территории Тюменской области, граничащей на западе с Курганской областью и характеризующейся так же стабильно низким уровнем заболеваемости клещевым риккетсиозом, из клещей D. reticulatus был выделен штамм R. sibirica «Бердюжье 20/64». Это са.мая западная точка выделения R. sibirica из клещей D. reticulatus.

Четыре из генотипированных штаммов риккетсий были выделены на территории Новосибирской области в разные периоды (три периода) изучения проблемы клещевого риккетсиоза на этой административной территории.

Наибольшее количество штаммов R. sibirica было выделено на территориях Алтайского края и республики Алтай. Эти территории юга Западной Сибири характеризуются наибольшим видовым многообразием клещей рода Dermacentor, достигающим максимума в предгорьях Алтая (D. marginatus, D. reticulatus, D. nuttalli, D. silvarum). На ряде территорий имеют распространение виды клещей, представляющие другие рода иксодовой фауны (/. persulcatus, H. concinna). Ареалы различных видов иксодовых клещей перекрываются, однако каждый вид клещей занимает свойственный его среде обитания биотоп. На территориях Алтайского края и республики Алтай в период с 1965 по 1989 гг. штаммы R. sibirica были выделены из клещей D. marginatus («Баево 105/87», «Баево 107/87», «Завьялове 43/89», «Глубокое 45/89»), D. reticulatus («44/65», «148/66»), D. nuttalli («Горный 54/88», «Горный 37/89»), D. silvarum («Алтай 81/88»), Н. concinna («Алтай 24/86») и /.persulcatus («55/65»). Два штамма («84/Казанцева» и «87/Паршукова») были выделены В.К. Ястребовым от пациентов в 1966 г. На западе нозоареала клещевого риккетсиоза штаммы R. sibirica были выделены из клещей D. marginatus и D. reticulatus (Курганская и Тюменская области), а на востоке нозоареала из клещей D. nuttalli и D. silvarum (Красноярский край, республика Бурятия, Приморский край).

Территории Алтайского края и республики Алтай можно отнести к центральной части нозоареала клещевого риккетсиоза, с наивысшими показателями заболеваемости этой инфекцией на 100 тыс. населения (24,3-65,3 и 54,2-90,9 соответственно), где штаммы R. sibirica были выделены из всех видов исследованных клещей родов Dermacentor, Haemaphysalis, Ixodes и два штамма от пациентов.

На территории Восточной Сибири все исследованные штаммы были выделены из клещей D. nuttalli («Бурятия 91/85», «Красноярск 10/91», «Красноярск 15/91»).

На территории Дальнего Востока (Приморский край) было генотипировано два штамма риккетсий группы КПЛ. Только установление нуклеотидных последовательностей позволило провести окончательную идентификацию этих штаммов. Штамм «Приморье 20/84», выделенный из Н. concinna, оказался R.

sibirica, другой штамм «Приморье 32/84», выделенный из D. silvarum-геновариантом R. sibirica - Rickettsia sp. BJ-90.

Применение методов генетического анализа (ПЦР+установление нуклеотидных последовательностей) позволило установить, что все штаммы риккетсии группы КПП, выделенные от пациентов, были представлены одним видом - R. sibirica.

Таким образом, по результатам генотипирования R. sibirica была доминирующим видом риккетсии, выделенных от людей и шести видов иксодовых клещей (D. nuttalli, D. marginatus, D. silvarum, D. reticulatus, H. concinna и /. persulcatus) в лесостепной зоне РФ от Курганской области до Приморского края в период с 1954 по 2001 год.

Штаммы риккетсии, выделенные из иксодовых клещей на территории РФ за этот период были представлены тремя видами: R. sibirica, Rickettsia sp. BJ-90 и R. slovaca. Эти результаты показывают, что на территории России кроме, R. sibirica и возбудителя астраханской пятнистой лихорадки, распространена и другая патогенная для человека риккетсия группы КПЛ - R. slovaca, а также впервые показывают наличие в Приморском крае геноварианта R. sibirica -Rickettsia sp. BJ-90, что необходимо учитывать при эпидемиологическом надзоре и диагностике заболеваний.

Генотипирование патогенных риккетсии в иксодовых клещах в России и Казахстане

Проведенный скрининг позволил выявить в иксодовых клещах несколько видов патогенных для человека риккетсии, среди них «классический» патоген -R. sibirica и риккетсии, отнесенные к «новым» патогенам: «R. heilongjiangensis», R. slovaca, R. helvetica и R. aeschlimannii.

ДНК R. sibirica была выявлена у 4 из 33 (12,1 %) экземпляров клещей D. nuttalli, собранных на территории Красноярского края (сбор D. nuttalli был осуществлен только на этой административной территории) в очагах клещевого риккетсиоза. «R. heilongjiangensis» была выявлена у 7 из 91 (7,7 %) экземпляров клещей Н. concinna, собранных на территориях Алтайского (4/20/20 %), Красноярского (2/56/3,57 %) и Приморского (2/15/13,3 %) краев, а также в 1 из 33 экземплярах клещей D. nuttalli, собранных на территории Красноярского края. Это первое выявление «Rickettsia heilongjiangensis» в клещах Н. concinna на территории России. «/?. heilongjiangensis» относится к «новым» патогенам человека и впервые была изолирована из клещей D. silvarum в провинции Heilorigjiang (КНР) в 1982 г. (Lou D,, et al., 1985). В КНР описано 12 случаев заболеваний, вызванных этой риккетсией, с клиникой, типичной для большинства клещевых пятнистых лихорадок, с четырехкратным нарастанием титров комплементсвязывающих антител в сыворотках крови пациентов (Lou D., et al., 1989). В Хабаровском крае в 2002 г. у 13 пациентов с клинической картиной, напоминающей клещевой риккетсиоз, в образцах крови и биоптатах с места первичного аффекта была генотипирована «R. heilongjiangensis» (Mediannikov O.Y. et al., 2004). Таким образом, выявление «R. heilongjiangensis» на территории Алтайского, Красноярского и Приморского краев в клещах Н. concinna на весьма отдаленных расстояниях от места первичного обнаружения

(провинция Heilongjiang, КНР) свидетельствует о стабильной экологической связи данного представителя группы КПЛ с клещами Н. concinna. He исключено, что ареал «R. heilongjiangensis» может быть более широким, связанным с распространением клещей Н. concinna, имеющим разорванный, реликтовый ареал в Евразии. Требует дальнейшего изучения роль «R. heilongjiangensis» в возникновении заболеваний риккетсиозной этиологии на территориях, где имеет распространение Н. concinna.

В результате проведенных исследований ДНК R. slovaca выявлена в двух пробах клещей D. marginatus, собранных в Европейской части РФ на территориях Ставропольского края и Воронежской области.

При исследовании 122 экземпляров клещей /. persulcatus, собранных на территории Омской области, в 1 (0,82 %) пробе была генотипирована риккетсия, имеющая 99,7 % соответствия по reiry gltA с R. helvetica. Это первая находка геноварианта риккетсии R. helvetica на территории России.

При исследовании 36 экземпляров клещей Н. punctata, собранных на территории Алма-Атинской области Казахстана, в 2 (5,5 %) была генотипирована риккетсия, близкородственная R. aeschlimannii. Этот геновариант был заявлен в GenBank, как R. aeschlimannii штамм «Казахстан», степень гомологии полученных нуклеотидных последовательностей составила 98,5 % по гену отрА и 99,6 % гомологии по гену gltA (GenBank номера AY259083 и AY259084).

R. aeschlimannii штамм «Казахстан», выявленная в клещах Н. punctata на территории Казахстана, является первой находкой данного вида риккетсии на территории Евразии. Этот вид риккетсии был описан в клещах Hyalomma marginatum в Марокко в 1997 году (Beati L. et al., 1997) и позднее выявлен в клещах этого вида в Зимбабве, Мали и Нигере (Parola P. et al., 2001). Описано два случая инфекции, вызываемой R. aeschlimannii, первый- у пациента вернувшегося во Францию из путешествия по Марокко в 2000 г. (Raoult D. et al., 2002), второй- у жителя ЮАР (Pretorius, A. M. and Birtles R. J., 2002).

Генотипирование в иксодовых клещах риккетсии с неизученной патоген ностью

В результате проведенного скрининга риккетсии в иксодовых клещах на территории России и Казахстана удалось установить географическое распространение Rickettsia sp. RpA4, Rickettsia sp. DnS14 и Rickettsia sp. DnS28 и их членистоногих хозяев. Rickettsia sp. RpA4 была впервые выявлена в клещах R. pumilio в Астраханской области (Rydkina E. et al., 1999). ДНК Rickettsia sp. RpA4 была выявлена в клещах D. reticulatus на территории Воронежской и Челябинской областей, в клещах D. marginatus и D. reticulatus на территориях Оренбургской, Омской и Новосибирской областей. На территории Алтайского края Rickettsia sp. RpA4 была генотипирована в клещах D. reticulatus, D. marginatus, H. concinna и /. persulcatus. В Приморском крае в одном из экземпляров клещей /. persulcatus также был выявлен этот вид риккетсии. На территории Казахстана Rickettsia sp. RpA4 была генотипирована в D. niveus, собранных в Карагандинской области, и D. marginatus из Восточно-Казахстанской области.

ДНК Rickettsia sp. DnS14 была выявлена в клещах D. marginatus, собранных на территории Оренбургской области и Алтайского края, Б клещах D. nuttalli на территории Красноярского, Приморского краев и республики Бурятии, в клещах D. silvarum на территории Приморского края и республики Бурятии, а также в клещах D. nixeus, собранных в Карагандинской области Казахстана. Находки ДНК Rickettsia sp. DnS28 были ограничены территориями Красноярского края и республики Бурятия, где эта риккетсия была обнаружена в клещах D. nuttalli и D. silvarum.

Ареалы D. reticulatus и D. marginatus представляют западную часть ареалов клещей рода Dermacentor в Евразии, a D. nuttalli и D. silvarum -восточную. Rickettsia sp. RpA4, впервые генотипированная в R. pumilio, в пределах ареала клещей рода Dermacentor связана с видами D. reticulatus, D. marginatus и D. niveus, но по-видимому, не с D. nuttalli и D. silvarum. Единичные находки Rickettsia sp. RpA4 связаны с Н. concinna и 1. persulcatus. Впервые генотипированные в клещах D. nuttalli виды риккетсий Rickettsia sp. DnS14 и Rickettsia sp. DnS28 (Rydkina E. et al., 1999) экологически связаны с клещами этого вида и D. silvarum. Однако, Rickettsia sp. DnS14 была генотипирован нами также в клещах D. marginatus и D. niveus. Таким образом, Rickettsia sp. RpA4, Rickettsia sp. DnS14 и Rickettsia sp. DnS28 из геногруппы R. massiliae имеют широкое распространение в Евразии от европейской части России до Дальнего Востока. Их ареалы перекрываются, а распространение связано преимущественно с клещами рода Dermacentor.

Открытие и изучение генетических характеристик нового- вида риккетсий «Candidatus Rickettsia tarasevichiae» в клещах persulcatus, собранных на различных территориях России

При исследовании клещей. persulcatus, собранных в Тюкалинском районе Омской области, с помощью гемоцитового теста и МФА с иммуноглобулинами диагностическими для выявления риккетсий группы КПЛ люминесцирующими, а также с иммуноглобулинами люминесцирующими для выявления риккетсий группы сыпного тифа, были выявлены риккетсий. Как показали исследования, проведенные с помощью этих двух диагностических наборов, 23±4,2 % клещей содержали риккетсий (Шпынов С.Н., Рудаков Н.В, 2002).

При дальнейших исследованиях с применением методов молекулярно-генетического анализа в клещах. persulcatus, собранных в России, нами описан новый вид риккетсий (Shpynov S.N.'et al., 2003). Новый вид риккетсий имел 98 % соответствия по гену 16S рибосомальной РНК и 96 % гомологии по гену gltA (номера GenBank AF503168 и AF503167, соответственно) с R. canadensis. Эта риккетсия была генотипирована при исследовании клещей /. persulcatus, собранных на территории Челябинской, Тюменской, Омской и Новосибирской областей, Алтайского, Красноярского и Приморского краев.

Полученные нами последовательности нуклеотидов составили 1322 п.о. для гена 16S рибосомальной ДНК и 1196 п. о. для гена 'gltA. При сравнении установленных нами нуклеотидных последовательностей с имеющимися в GenBank они показали свою уникальность и имели наибольший процент

гомологии с R. canadensis. Для гена git А было установлено 38 различий в нуклеотидах с R. canadensis, что составило 96 % гомологии. Для гена 16S рДНК было выявлено 19 различий, что составило 98 % соответствия.

«Candidatus Rickettsia tarasevichiae» имеет широкое распространение на территории России в зоне тайги и лесостепи. Этот риккетсиальный агент был обнаружен у 81 из 317 исследованных клещей /. persulcatus, от 1 из 26 в Новосибирской области (Западная Сибирь) до 56,8±7,5 % в Приморском крае (Дальний Восток).

Таким образом, нами впервые с помощью молекулярно-генетических методов доказано присутствие риккетсий в клещах рода Ixodes в России. Мы обнаружили «Candidatus Rickettsia tarasevichiae» в 25,5±2,4 % имаго /. persulcatus, собранных на различных территориях от Южного Урала до Дальнего Востока.

Возможно, географическое распространение этого вида риккетсий совпадает с ареалом /. persulcatus, который населяет биотопы южной тайги и смешанных лесов в Евразии от западной границы России до Дальнего Востока (рис. 4). Эту гипотезу подтверждают находки «Candidatus Rickettsia tarasevichiae» в клещах /. persulcatus, собранных в Вологодской области (Eremeeva М. et al., 2003).

Рис. 4. Распространение «Candidatus Rickettsia tarasevichiae» в клещах /. persulcatus на территории России

Места выявления «Candidatus Rickettsia tarasevichiae» \ Омская область

Ареал /. persulcatus на территории России по Филипповой Н.А (в модификации)

Проведенный филогенетический анализ генов 16S рДНК и цитрат синтетазы всех известных видов риккетсий покачал, что «Candidatus Rickettsia tarasevichiae» вместе с R. canadensis и новыми риккетсиями насекомых (Adalia Bipunctata Bacterium, Adalia decempunctata Bacterium, Pea Aphid rickettsia) образовала отдельный кластер в пределах рода Rickettsia (рис. 5). Представители этого кластера по ряду характеристик не принадлежат ни к группе сыпного тифа, ни к группе КПЛ и имеют обособленное филогенетическое положение, граничат с группой сыпного тифа и далее с группой R. australis и наиболее отдалены от группы КПЛ и геногруппы R. massiliae. При исследовании клещей, содержащих эти риккетсий, положительные результаты в МФА были получены как с иммуноглобулинами для выявления риккетсий группы КПЛ, так и с иммуноглобулинами для выявления группы сыпного тифа. Учитывая гипотезу о более ранней дивергенции R. canadensis от общего предшественника, до разделения риккетсий на группы сыпного тифа и КПЛ (Stochard D.R., Fuerst P.A. , 1995), полученные данные подтверждают близость этих двух видов клещевых риккетсий.

R. canadensis (штахмм 2678) была изолирована из клещей Haemaphysalis leporispolustris в Канаде (Онтарио) в 1963 (McKiel Y. A. et al., 1967). Позднее антитела к R. canadensis были выявлены у четырех пациентов с клиникой пятнистой лихорадки Скалистых гор в США: в Техасе и Калифорнии (Bozeman F. M. et al., 1970). Эта риккетсия также является ответственной за случаи острого церебрального васкулита в странах Северной Америки (Wenzel R. P. et al., 1986; Linnemann С. С. et al., 1989; Hechemy К. Е. et al., 1991). В связи с этим можно предположить, что «Candidatus Rickettsia tarasevichiae» может оказаться патогеном и быть ответственной за ряд случаев инфекций с клинической картиной, нетипичной для известных клещевых инфекций, которые регистрируют в ареале /. persulcatus.

Новый генотип риккетсий, имеющий 86 % соответствия по гену отрА с Rickettsia sp. AT-1, был выявлен в клещах этого вида, собранных на территориях Алтайского и Красноярского краев. Риккетсия, аналогичная или близкая по генотипу этой бактерии, была генотипирована в клешах /. persulcatus, собранных на территории Хабаровского края (Манзенюк О. Ю. и др., 2002). Rickettsia sp. AT-1 с неизученной патогенностью была изолирована из клещей Amblyomma testudinarium в Японии в 1993 (Fournier P.-E., at el., 2002) и занимает филогенетически близкую позицию к двум генотипам Rickettsia sp. IRS3 и IRS4, выявленным в клещах /. ricinus в Словакии (Sekeyova Z. et al., 2000).

ДНК R. sp. RpA4 была генотипирована в клещах D. niveus, собранных на территории Карагандинской области, и клещах D. marginatus из Восточно-Казахстанской области Казахстана. Rickettsia sp. DnS\4 была выявлена в клещах D. niveus на территории Карагандинской области. При исследовании 47 экземпляров клещей Hyalomma asiaticum, собранных на территории Алма-Атинской области Казахстана, были получены отрицательные результаты.

Рис. 5. Филогенетическое древо Rickettsia. Построено при сравнении нуклеотидных последовательностей гена gltA риккетсий с помощью neighbour-joining метода. Степень различия между последовательностями выражена в длине горизонтальных линий, соединяющих отдельные виды риккетсий. Масштабная тикала (1 %)

Представленные данные показывают, что R. sibirica - этиологический агент клешевого риккетсиоза, был выявлен в клещах D. nuttalli, собранных на территории Красноярского края. Ранее R. sibirica была генотипирована в 12 % клещей этого вида, собранных в республике Алтай (Rydkina E. et al., 1999). Эти две территории южной Сибири характеризуются наиболее напряженными очагами клещевого риккетсиоза, где регистрируется подавляющее количество случаев этой инфекции.

«R. heilongjiangensis» была генотипирована в клещах Я concinna, собранных на территориях Алтайского, Красноярского и Приморского краев, а также в D. nuttalli на территории Красноярского края. «Л. heilongjiangensis» относится к «новым» патогенам человека.

Проведенные исследования показали, что риккетсии группы КПЛ имеют повсеместное распространение на территориях России и Казахстана и связаны с ареалами иксодовых клещей. Прослеживается связь выявленных видов риккетсии к определенным видам и родам иксодовых клещей, которые являются их основными хозяевами.

В настоящее время в России установлено распространение природных очагов клещевого риккетсиоза и астраханской пятнистой лихорадки. Помимо риккетсии - этиологических агентов этих двух клещевых риккетсиозов, нами генотипировано 9 видов риккетсии в иксодовых клещах 10 видов, собранных на территориях России и Казахстана. В целом, на территории этих двух стран доказано распространение 11 видов риккетсии, связанных с иксодовыми клещами. R. sibirica, возбудитель астраханской пятнистой лихорадки, «R. heilong/iangensis» и R. slovaca относятся к геногруппе R. rickettsii; Rickettsia sp. RpA4, Rickettsia sp. DnSl4, Rickettsia sp. DnS28и R. aeschlimannii из геногруппы R. massiliae; R. helvetica из одноименной геногруппы; «Candidatus R. tarasevichiae» из геногруппы R. canadensis. Филогенетические позиции выявленных в России и Казахстане риккетсии существенно отличаются и представляют все основные кластеры экологически связанных с иксодовыми клещами. Один из них является «классическим» патогеном, пять относятся к «новым» патогенам человека, патогенность для человека пяти других видов риккетсии к настоящему времени не установлена.

Анализ полученных результатов позволил выделить три экологических группы риккетсии клещевого биотипа, выявленных на территориях России и Казахстана, по отношению к их преимущественным хозяевам - представителям различных родов иксодовых клещей (таблица 2). Экология первой группы связана преимущественно с клещами родов Dermacentor и Rhipicephalus из подсемейства Rhipicephalinae. К этой группе можно отнести R. sibirica, возбудителя астраханской пятнистой лихорадки, R. slovaca, а также Rickettsia sp. RpA4, Rickettsia sp. DnS14 и Rickettsia sp. DnS28. Необходимо отметить, что возбудители наиболее значимых инфекций из группы КПЛ, таких как пятнистая лихорадка Скалистых гор, средиземноморская пятнистая лихорадка и клещевой риккетсиоз, связаны преимущественно с клещами из подсемейства Rhipicephalinae, а именно из родов Dermacentor и Rhipicephalus. «R. heilongjiangensis» и R. aeschlimannii штамм «Казахстан» связаны с двумя

Таблица 2

Классификация риккетсий по отношению к преимущественным хозяевам

Группы риккетсий Вид риккетсий Вид клещей

Риккетсии, экологически связанные с иксодовыми клещами из подсемейства КЫркерЪаНпае Возбудитель астраханской пятнистой лихорадки Rickettsia sp. RpA4 R. pumilio

R. sibirica R. slovaca Rickettsia sp. RpA4 Rickettsia sp. DnSU D.marginatus

R. sibirica Rickettsia sp. RpA4 D. reticulums

R. sibirica Rickettsia sp. DnS\4 Rickettsia sp. DnS2S «R. heilongjiangensis» D. nuttalli

R. sibirica Rickettsia sp. DnS\4 Rickettsia sp. DnS2Z D. silvarum

Rickettsia sp. RpAA Rickettsia sp. DnS\4 D. niveus

Риккетсии, экологически связанные с иксодовыми клешами из подсемейства НаетаркухаИпае R. sibirica «R. heilongjiangensis» H. concinna

Ä aeschlimannii H. punctata

Риккетсии, экологически связанные с иксодовыми клещами из подсемейства 1хо(Ипае «Candidatus R. tarasevichiae» R. sibirica R. helvetica Rickettsia sp. RpA4 Rickettsia sp. AT-1 86 % гомологии I. persulcatus

представителями рода Haemaphysalis (H. concinna и И. punctata). «R. heilongjiangensis» выявлена в очагах клещевого риккетсиоза в клещах Я. concinna и D. nuttalli, что сближает эту риккетсию в экологическом плане с R. sibirica. «Candidatus Rickettsia tarasevichiae», R. helvetica и Rickettsia sp. AT-1 связаны только с клещами рода Ixodes (/. persulcatus).

Таким образом, на территориях России и Казахстана в иксодовых клещах имеют распространение R. sibirica, являющаяся «классическим» патогеном человека, возбудитель астраханской пятнистой лихорадки, R. slovaca, «R. heilongjiangensis», R. aeschlimannii и R. helvetica, отнесенные к «новым» патогенам человека, и риккетсий с неизученной патогенностью для человека, к которым относятся: Rickettsia sp. RpA4, Rickettsia sp. DnS14 и Rickettsia sp. DnS28, «Candidatus Rickettsia tarasevichiae» и Rickettsia sp. AT-1 (86 %

гомологии). Ареалы различных видов иксодовых клещей- хозяев риккетсий перекрываются, что влияет на видовое многообразие риккетсий на территориях.

Выявление эрлихнй и анаплазм в иксодовых клещах в России и Казахстане

В результате провенных исследований ДНК эрлихий и анаплазм была выявлена и идентифицирована у 17 из 900 (1,9 %) исследованных иксодовых клещей. ДНК Е. muris была выявлена у 10 из 317 (3,1 %) исследованных клещей /. persulcatus, собранных на территориях Тюменской (1/19/5,3%), Омской (4/122/3,3%) и Новосибирской (1/26/3,8%) областей и Алтайского края (4/47/8,5 %). На территории Омской области в 2 (1,6 %) из 122 проб клещей /. persulcatus была выявлена ДНК «Ehrlichia-like» Schotti variant. ДНК A. phagocytophila была выявлена и идентифицирована в клещах /. persulcatus, собранных на территориях Алтайского и Приморского краев, инфицированность составила 2,1 % (1 из 47) и 4,5 % (2 из 44) соответственно. ДНК A. bovis была генотипирована в 2 из 15 (13,3 %) экземпляров клещей Н. concinna, собранных на территории Приморского края. При исследовании клещей /. persulcatus, собранных на территориях Омской и Новосибирской областей, Алтайского и Приморского краев, была выявлена некультивируемая бактерия «\fontezuma».

Не выявлены представители родов Anaplasma и Ehrlichia при исследовании 364 экземпляров клещей рода Dermacentor (D. marginatus, D. reticulatus, D. silvarum и D. nuttalli), собранных в России в зоне лесостепи от Ставропольского края на западе до Приморского края на востоке, а также при исследовании 106 экземпляров клещей родов Dermacentor, Haemaphysalis и Hyalomma, собранных в степной зоне Казахстана.

Проведенные исследования позволили установить, что на территории России в иксодовых клещах имеют распространение четыре представителя семейства Anaplasmataceae, два из них относятся к роду Anaplasma - A. phagocytophila и A. bovis, два к роду Ehrlichia - Е. muris и «Ehrlichia-like» 'Schotti variant1. В клещах /. persulcatus были выявлены A. phagocytophila (Алтайский и Приморский края), Е. muris (Тюменская, Омская, Новосибирская области и Алтайский край) и «Ehrlichia-like» 'Schotti variant (Омская область), а A. bovis (Приморский край) была генотипирована в клещах Н. concinna. Три из четырех вышеперечисленных видов бактерий являются признанными патогенами теплокровных, передающимися клещами. Четвертый - «Ehrlichia -like» 'Schotti variant' был описан при исследовании клещей /. ricinus, собранных в природных очагах гра1гулоцитарного эрлихиоза в Нидерландах, и данные о его патогенности для теплокровных отсутствуют (Schouls L. et al., 1999).

Имеются клинико - эпидемиологические и серологические данные о связи Е. muris с заболеваниями моноцитарным эрлихиозом человека в Пермской области (Ravyn M.D. et al., 1999). До настоящего времени Е. muris не изолирована и не генотипирована от больных моноцитарным эрлихиозом человека, что требует дополнительного изучения. В результате проведенных нами исследований Е. muris впервые выявлена в клещах / persulcatus на ряде территорий азиатской части России.

Некультивируемая бактерия «Montezuma» из порядка Rickettsiales, описанная в клещах /.persulcatus в Хабаровском крае (Медянников О.Ю. и др., 2004) была выявлена в клещах /. persulcatus, собранных на территориях Омской и Новосибирской областей, Алтайского и Приморского краев. Возможно, ее распространение, как и «Candidatus R. tarasevichiae» связано с ареалом клещей /. persulcatus.

Таким образом, впервые в азиатской части России в клещах /. persulcatus выявлена Е. muris. A. phagocytophila была генотипирована в клещах /. persulcatus, собранных на территории Алтайского и Приморского краев. К настоящему времени гранулоцитарные эрлихии выявлены в Новосибирской области (Morozova O.V. et al., 2002). В 2002 г. при расшифровке вспышки заболеваний неясной этиологии в Усть-Таркском районе Новосибирской области нами выявлены у тяжелых лихорадящих больных серопозитивные результаты с нарастанием титров антител в динамике до 1:100 - 1:400 в РНИФ (реакция непрямой иммуннофлюоресценции) с антигеном возбудителя гранулоцитарного эрлихиоза человека (Шпынов С.Н. и др., 2002). Случаи гранулоцитарного эрлихиоза у людей были выявлены ретроспективно в Алтайском крае в 1999 г. (Рудаков Н.В. и др., 2001).

Выявление ДНК A. phagocytophila в клещах /. persulcatus на территории Алтайского края (Шпынов С.Н. и др., 2003) и серологическая верификация случаев гранулоцитарного эрлихиоза человека среди пациентов с «серонегативпым клещевым риккетсиозом» на фоне резкого роста заболеваемости клещевым риккетсиозом на этой территории в последние годы (Рудаков Н.В. и др., 2001) позволяет сделать заключение о существовании природных очагов этой инфекции на территории Западной Сибири. Можно считать достаточно вероятным распространение возбудителя гранулоцитарного эрлихиоза человека в России в пределах всего ареала клещей /. persulcatus, с возможными эпидемическими проявлениями очагов этой инфекции. Несомненна необходимость дифференциации случаев гранулоцитарного эрлихиоза человека от других распространенных клещевых инфекций - прежде всего клещевого энцефалита, иксодовых клещевых боррелиозов и клещевого риккетсиоза.

Типологическая характеристика распространения патогенных для человека риккетсий группы КПЛ в России

В результате проведенной работы установлена генетическая гетерогенность риккетсий в иксодовых клещах на территориях России и Казахстана. Осуществлена молекулярно-генетическая идентификация штаммов риккетсий группы КПЛ, выделенных в очагах клещевого риккетсиоза от больных этой инфекцией и из клещей.

Эти исследования позволили установить экологические связи эпидемически значимых риккетсий с различными видами иксодовых клещей -их хозяев.

Накопленные к настоящему времени данные свидетельствуют о разнообразии типов природных очагов клещевого риккетсиоза. Типизации очагов по ландшафтному признаку посвящен ряд работ (Кулагин СМ., 1969;

Сомов ГЛ., 1969; Кереев Н.И., 1969; Ястребов В.К., 1971; Тарасевич И.В. и др., 1977 и др.). Осуществлено выделение эпидемиологических зон клещевого риккетсиоза, основанное на группировке однородных эпидемиологических участков, и районирование нозоареала этой инфекции по степени риска заражения населения (Ястребов В.К., 1993).

Рудаковым Н.В. и Богдановым И.И. (1994) был предложен подход, при котором предлагается именовать тип очага клещевого риккетсиоза по принадлежности основных переносчиков к определенному роду (родам) иксодид, а вид очага - по принадлежности к тому или иному виду (видам). Этот подход позволил выделить шесть основных типов природных очагов; дермаценторные степные и лесостепные, гемафизалисные лесостепные, гиаломмные полупустынные и пустынные, дермаценторно-гемафизалисные, дермаценторно-рипицефалисные полупустынные, гиаломмно-рипицефалисные пустынные и долинные.

Применение этого подхода при анализе полученных нами данных по распространению риккетсий в иксодовых клещах на территориях России и Казахстана, картографирование ареалов иксодовых клещей (родов Dermacentor и Haemaphisalis) на территории этих двух стран, изучение экологических связей риккетсий по отношению к преимущественным хозяевам (иксодовым клещам) позволило разработать типологическую характеристику распространения патогенных для человека риккетсий группы КПП в зависимости от типа населения основных хозяев - иксодовых клещей.

К настоящему времени установлено, что распространение патогенных для человека риккетсий группы КПЛ на территории России связано с клещами, входящими в состав двух подсемейств- Rhipicephalinae и Haemaphysalinae (рода Rhipicephalus, Dermacentorи Haemaphisalis).

На территории Европейской части России и Урала с иксодовыми клещами из подсемейства Rhipicephalinae связаны возбудитель астраханской пятнистой лихорадки (R. pumilio) и R. slovaca (Б. marginatus). На Урале с клещами подсемейства Rhipicephalinae, а точнее рода Dermacentor связаны возбудитель клещевого риккетсиоза - R. sibirica и «новый» патоген R. slovaca. В Азиатской части России с клещами рода Dermacentor связаны возбудитель клещевого риккетсиоза - R. и «новый» патоген - «Л heilongfiangensis»,

распространение которого преимущественно связано с клещами Я. concinna из подсемейства Haemaphysalinae. На некоторых территориях юга Сибири и Дальнего Востока в очагах клещевого риккетсиоза на ареалы клещей рода Dermacentor (D. nuttalli, D.marginatus и D. silvarum)- основных эпидемически значимых переносчиков R. sibirica, налагаются пятна ареала Я. concinna. На этих территориях клещи D. nuttaШ и Я. concinna проявляют себя в роли переносчиков Я. и «Я. heilongjiangensis».

В результате проведенного анализа на территории России выделено 2 основных географических региона по распространению иксодовых клещей -хозяев патогенных риккетсий группы КПЛ (рис. 6).

1) Восточно-Европейский с циркуляцией возбудителя астраханской пятнистой лихорадки и Я. slovaca (дермаценторно-рипицефалисный);

2) Азиатский с циркуляцией R. slovaca, R. и «R. heilongjiangensis»

(дермаценторно-гемафизалисный), в котором можно выделить четыре области:

а) дермаценториую (маргинатусно-ретикулятусную) с циркуляцией Я. sibirica и Я. slovaca. Эта область простирается от Зауралья (Курганская и Тюменская области), где регистрируется спорадическая заболеваемость клещевым риккетсиозом, через Омскую и Томскую области, с отсутствием регистрации этой инфекцией, и до восточной части Новосибирской области, где в последнее время наблюдается рост заболеваемости клещевым риккетсиозом;

б) дермаценторно-гемафизалисную сибирскую (сибирское пятно ареала Я. тпЫппф с циркуляцией Я. sibirica и «Я. heilongjiangensis». Эта область имеет распространение на территориях Алтайского края, республики Алтай, где иксодофауна представлена клещами рода Dermacentor с максимумом разнообразия (Ю. ти^т^т, D. ^киШт, D. пШШШ, D. з^игит и Н. т^^пи) в предгорьях Алтая. Эти две территории Западной Сибири характеризуются самыми высокими показателями заболеваемости клещевым риккетсиозом: республика Алтай - 54,2-90,9 и Алтайский край- 24,3-65,3 на 100 тыс. населения. Переход к территориям Восточной Сибири характеризуется наличием только двух представителей рода Dermacentor (Ю. nuttaШ и Б. silvarum) и Н. concinna. Показатели заболеваемости клещевым риккетсиозом на 100 тыс. населения в республиках Хакасия, Тыва и Красноярском крае регистрируются от 21,0 до 55,0;

в) дермаценторную (нутталлиево-сильварумную) с циркуляцией Я.

и возможно «Я. heilongjiangensis». Эта область имеет распространение на территориях Иркутской и Читинской областей, республик Бурятии, Агинского Бурятского и Усть-Ордынского Бурятского автономных округов. Показатель заболеваемости на различных территориях варьирует от 10 до 55,0 (Усть-Ордынский Бурятский АО).

Сильварумные лесостепные очаги менее эпидемически активны, чем нутталлиевые, и расположены в восточной части ареала Я. (юг Дальнего

Востока, отдельные территории юга Западной и Восточной Сибири);

г) дермаценторно-гемафизалисную дальневосточную (пятно ареала Я. concinna на Дальнем Востоке) с циркуляцией Я. и «Я.heilongjiangensis». Эта территория представлена Амурской областью, Хабаровским и Приморским краями, где клещи рода Dermacentor представлены одним видом - Б. silvarum, который как и Я. concinna является вектором «классического» патогена Я. sibirica и «нового» патогена — «Л. heilongjiangensis». Эти территории характеризуются низким уровнем заболеваемости клещевым риккетсиозом. Чисто гемафизалисные очаги встречаются только на юге Приморского края (Я. concinna-H.japonica ^щШз^ - (Сомов ГЛ., 1969).

В Восточно-Европейском регионе, в Астраханской области, регистрируется заболеваемость астраханской пятнистой лихорадкой с наибольшими показателями заболеваемости 23,8 на 100 тыс. населения (Тарасевич И.В., 2002 г). К настоящему времени ни одного случая синдрома «ТШОЬА» на территории Российской Федерации не зарегистрировано.

Рис. 6. Географические регионы по распространению иксодовых клещей- хозяев патогенных риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки:

1 - Восточно-Европейский (дермаценторно-рипицефалисный); 2- Азиатский (дермаценторно-гемафизалисный)

В Азиатском регионе (дермаценторно-гемафизалисные очаги) регистрируют заболеваемость только клещевым риккетсиозом, в то же время здесь имеют распространение «новые» патогены: R. slovaca в западной части региона (Курганская область) и «R. heilongjiangensis» в восточной части региона (Алтайский, Красноярский и Приморский края). В этом регионе наиболее высокой эпидемической активностью (показатели заболеваемости в ряде районов превышают 50-200 на сто тыс. населения) и стойкостью характеризуются нутталлиевые горностепные и лесостепные очаги клещевого риккетсиоза в республике Алтай, Алтайском и Красноярском (лесостепные котловины) краях, Туве, Пред- и Забайкалье (Рудаков Н.В., Богданов И.И.,1994).

Выявление генетической гетерогенности риккетсий группы КПП в популяциях клещей в очагах клещевого риккетсиоза, астраханской пятнистой лихорадки и на неэндемичных по риккетсиозам группы КПЛ территориях, индикация «новых» патогенов из группы КПЛ в клещах в различных географических регионах России позволило осуществить дифференциацию территории страны на основании географического распространения иксодовых клещей-хозяев и экологически связанных с ними патогенных для человека риккетсий.

Мониторинг риккетсий группы КПЛ в иксодовых клещах на эндемичных по клещевому риккетсиозу территориях и территориях с отсутствием заболеваемости этой инфекцией

Для совершенствования методов мониторинга риккетсий группы КПЛ нами была разработана тест-система ИФА (Шпынов С.Н., Рудаков Н.В., 1991, 1999). Тест-система ИФА группоспецифична, позволяет выявлять антигены риккетсий группы КПЛ - «классические» риккетсиальные патогены ^. sibirica и R. сопогИ). Она позволяет эффективно осуществлять скрининг переносчиков для последующего выделения штаммов R. sibirica. Из пяти положительных по ИФА и РИГА пулов клещей D. nШtaШ (республика Алтай) в четырех случаях изолированы штаммы риккетсий. Два штамма («Горный 54/88» и «Горный 37/89») депонированы в Российском музее риккетсиозных культур НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи. Дальнейшие молекулярно-генетические исследования показали их 100 % гомологию с R. sibirica (Шпынов С.Н. и др., 2003).

В сравнении с РИГА и МФА в пулах и индивидуально исследовано потомство четырех экспериментальных линий иксодовых клещей двух видов ф. пиШШ, D. та^таШ), в том числе: 3200 яиц, 1507 личинок 193 нимфы, 35 имаго, содержащих по данным МФА с моноклональными антителами риккетсий группы КПЛ. Индивидуальная инфицированность имаго клещей составила по данным ИФА- 38,9 %, в МФА -58,3 %, в РИГА получены отрицательные результаты. При исследовании яиц зараженность проб составила в ИФА и МФА 100 %. Инфицированность личинок составила в ИФА-60 %, МФА- 20 %, в РНГА получены отрицательные результаты.

В последующем с применением молекулярно-генетических методов проведена идентификация исследованных с помощью ИФА тест-системы, МФА и РНГА риккетсий в четырех экспериментальных линиях иксодовых клещей: D.n.23, D.n.29 (Д nuttalli, республика Алтай) и D.m.5/6, D.m. 7/9 (D. marginatus, Казахстан) на различных стадиях метаморфоза. Положительные в ИФА пробы были идентифицированы, как новые генотипы Rickettsia sp. DnS28 (экспериментальные линии D.n.23 и D.n.29) и Rickettsia sp. RpA4 (экспериментальные линии D.m.5/6 и D.m. 7/9). При исследовании этих проб в МФА также были получены положительные результаты, параллельное исследование в РНГА на наличие риккетсий дало отрицательные результаты.

Таким образом, разработанная нами тест-система ИФА для выявления риккетсий группы КПЛ, позволяет выявить в иксодовых клещах как «классический патоген» - R. sibirica, так и риккетсий новых генотипов -Rickettsia sp. RpA4 и Rickettsia sp. DnS28.

Проведено сравнительное изучение антигенной структуры риккетсий группы КПЛ на контрастных по эпидемиологическим параметрам территориях с использованием методов, позволяющих выявлять различные антигенные компоненты риккетсий- корпускулярные антигены (МФА с поликлональными антителами), растворимые антигены (ИФА), гемагглютинин (РНГА). Исследована индивидуальная риккетсиофорность иксодовых клещей, собранных с эндемичной по клещевому риккетсиозу (горная степь республики Алтай) и неэндемичной (лесостепь Омской области) территорий. Для территории с высоким показателем заболеваемости клещевым риккетсиозом (республика Алтай) была отмечена значительная инфицированность по результатам всех трех методов (от 60,4±7,1 % в РНГА до 86,2±4,5 % в ИФА). На территории с отсутствием регистрации клещевого риккетсиоза при достаточно высоких показателях в ИФА и МФА результаты РНГА были крайне низкими.

Молекулярно-генетический скрининг клещей на наличие риккетсий на эндемичной по клещевому риккетсиозу территории республики Алтай показал, что клещи D. nuttalli содержат как патоген - R. sibirica, так и Rickettsia sp. DnS14 и Rickettsia sp. DnS28 (Rydkina E, et al., 1999). В тоже время на территории Омской области, характеризующейся отсутствием заболеваемости клещевым риккетсиозом, в клещах D. marginatus и D. reticulatus содержались только риккетсий генотипа Rickettsia sp. RpA4 (Shpynov S.N. et al., 2001; Шпынов С.Н. и др., 2003).

Проведенное изучение спектра риккетсий в иксодовых клещах на территориях России и Казахстана, а также генетическая идентификация штаммов риккетсий группы КПЛ, выделенных из очагов клещевого риккетсиоза на территории России, показало необходимость интегрирования методов генетического анализа с комплексом традиционно применяемых биологических и серологических методов. Показана эффективность комплекса экспресс-методов индикации антигенов для выявления риккетсий группы К1Ш при исследовании переносчиков как наэнде\ ичййх^^^^^х с Циркуляцией вирулентных штаммов R. sibirica, так и на те^щ^эдх с отсутствием

О» 3» ем J

заболеваемости клещевым риккетсиозом и циркуляцией авирулентных геновариантов риккетсий. При этом показатели индивидуальной инфицированности переносчиков, полученные при помощи ИФА и МФА, позволяют судить о суммарной инфицированности переносчиков риккетсиями группы КПЛ, а показатели индивидуальной инфицированности переносчиков по данным метода биопроб и в РНГА о вирулентной части популяций риккетсий.

Для идентификации риккетсий в иксодовых клещах и выделенных из клещей и от пациентов штаммов необходимо применение молекулярно-генетических методов. На первом этапе генетических исследований проводится; индикация риккетсий. в ГЩР. При полученном положительном результате определяется нуклеотидная последовательность полученного ГЩР-продукта и идентифицируется в режиме прямого доступа с последовательностями,, депонированными в GenBank.

Показана целесообразность комплексного применения молекулярно-генетических методов и метода биопроб (морские свинки). Это было продемонстрировано нами при изучении нового очага клещевого риккетсиоза в Татарском районе Новосибирской области. Методом биопроб было исследовано 400 (в 10 пулах по 40 особей) экземпляров имаго иксодовых. клещей рода Dermacentor (120 экз. - D. marginatus и 280 экз. - D. reticulatus). В одной из биопроб, из клещей D. reticulatus, собранных у с. Киевка был выделен штамм риккетсий группы КПЛ - «Киевка/01», генотипированный как R. sibirica (Шпынов С.Н. и др., 2003). 176 экземпляров иксодовых клещей (126 экз. - D. marginatus и 50 экз. - D. reticulatus) были исследованы при помощи * гемоцитового теста методом флюоресцирующих антител. По данным этого метода не идентифицированные до вида риккетсий группы КПЛ содержались в 20,8 % клещей D. marginatus. и в 20 % D. reticulatus. Из них пять положительных в МФА клещей D. reticulatus были исследованы в ПЦР с праймерами, специфическими для риккетсий. В одной из проб была выявлена риккетсиальная ДНК, нуклеотидная последовательность которой была секвеиирована и идентифицирована как Rickettsia sp. RpA4.

Отработан алгоритм изучения клещевых риккетсий, предусматривающий два подхода для эпидемиологической разведки территорий и углубленного изучения очагов клещевого риккетсиоза с применением комплекса биологических, серологических и молекулярно-генетических методов. Их применение зависит в первую очередь от материально-технической базы и оснащенности лабораторий. При первом подходе осуществляется индикация и предварительная идентификация патогенных и апатогенных риккетсий в клещах (рис.7), при втором проводится полная идентификация риккетсий (рис.8).

Первый подход основан на применении комплекса биологических и серологических методов и позволяет дифференцировать R. sibirica от апатогенных риккетсий группы КПЛ (Rickettsia sp. RpA4 или Rickettsia sp. DnS28) без осуществления идентификации (рис. 7). Положительный результат исследований в МФА (ИФА) и РНГА указывает на присутствие в исследуемой

Pnc.7. HHfli iKaLpiH puKKercHH (R. sibirica - Rickettsia sp. RpA4, Rickettsia sp. DnS28)

пробе R. sibirica. Отрицательный результат исследований в РНГА при положительном в МФА (Р1ФА) свидетельствует о присутствии в пробе апатогенных риккетсий группы КПП (Rickettsia sp. RpA4 или Rickettsia sp. DnS28). Отрицательные результаты, полученные в РНГА и МФА (ИФА), позволяют сделать вывод об отсутствии риккетсий группы КПЛ (как патогенных, так и апатогенных) в исследуемой пробе.

При этом подходе возможно применение ПЦР без дальнейшего установления нуклеотидных последовательностей (секвенирования). Положительный результат ПЦР показывает наличие риккетсиальной ДНК в исследуемой пробе, применение указанных выше праймеров (Материалы и методы исследования) обуславливает группоспецифичность реакции, не имеет существенного преимущества перед МФА и ИФА и может только заменить их.

Рис.8. Применение комплекса биологических, серологических и молекулярно - генетических методов при эпидемиологической разведке и углубленном изучении очагов клещевого риккетсиоза

Второй подход, основанный на применении комплекса молекулярно-генетических и биологических методов, является наиболее адекватным и полным для эпидемиологической разведки территорий и углубленном изучении очагов клещевого риккетсиоза. Его применение позволяет с помощью биологического метода выделить и изучить штаммы возбудителя, и провести полную идентификацию риккетсий с использованием молекулярно-генетических методов. При этом с помощью биопробы осуществляется индикация только патогенных видов риккетсий, а молекулярно-генетические методы позволят выявить и идентифицировать как патогенные, так и апатогенные виды риккетсий.

Таким образом, отработана тактика применения комплекса биологических, серологических и молекулярно-генетических методов, как на эндемичных территориях с высоким уровнем заболеваемости клещевым риккетсиозом и выявлением вирулентных штаммов R. sibirica, так и на территориях с отсутствием заболеваемости и циркуляцией авирулентных штаммов риккетсий. Применение генетических методов в комплексе с другими лабораторными методами в системе эпидемиологического надзора за клещевым риккетсиозом будет способствовать более эффективному мониторингу очагов этой инфекции и совершенствованию профилактических мероприятий.

ВЫВОДЫ

1. При анализе многолетней динамики (более 65 лет) выделено три периода с различными уровнями заболеваемости клещевым риккетсиозом в России. Первый период, характеризующийся подъемом уровня заболеваемости клещевым рикетсиозом в стране, наблюдался с 1943 по 1968 гг., с регистрацией наибольшего количества случаев заболевания в 1945, 1954 и 1967 гг., преимущественно за счет Восточной Сибири. Во второй период (с 1968 по 1978 гг.) наблюдалось значительное снижение регистрации заболеваемости клещевым риккетсиозом. Третий период - с 1979 г. по настоящее время, характеризуется непрекращающимся ростом заболеваемости с увеличением показателей в 10 раз, преимущественно за счет Западной Сибири.

2. При использовании комплекса генетических методов показана высокая генетическая однородность штаммов R. sibirica, выделенных в очагах клещевого риккетсиоза с 1954 по 2001 гг. от человека и иксодовых клещей 6 видов на территории от Урала до Дальнего Востока, из 24 штаммов только один оказался геновариантом R. sibirica - Rickettsia sp. BJ-90.

3. В очагах клещевого риккетсиоза на территории России в иксодовых клещах выявлено генетическое разнообразие недавно описанных риккетсий, эрлихий и анаплазм, как признанных патогенов человека, так и с не доказанной к настоящему времени патогенностыо. В клещах рода Dermacentor-эпидемически значимых переносчиках R. sibirica, с помощью молекулярно-генетических методов показано преобладание риккетсий из групппы КПЛ с неизученной патогенностью, относящихся к геногруппе R. massiliae.

4. «Candidates Rickettsia tarasevichiae», генотипированная в клещах /. persulcatus и образовавшая кластер вместе с R. canadensis и новыми видами риккетсий, найденными в насекомых, занимает промежуточное филогенетическое положение между представителями групп сыпного тифа и КПЛ. «Candidates Rickettsia tarasevichiae» экологически связана с клещами /. persulcatus и имеет распространение во всем ареале этого вида иксодид от Европейской части России до Дальнего Востока.

5. Установлены три экологических группы риккетсий на территориях России и Казахстана, по отношению к их преимущественным хозяевам -представителям различных родов иксодовых клещей (1 -Dermacentor и Rhipicephalus; 2 - Haemaphysalis3 - Ixodes).

6. В клещах /. persulcatus выявлено наибольшее количество ctl-протеобактерий: A. pkagocytopb.Ha, E. muris, R. sibirica, «Candidatus R. tarasevichiae», бактерия «Montezuma» и риккетсия, близкая Rickettsia sp. AT-1, что указывает на их значимость в циркуляции ряда клещевых а-протеобактерий.

7. Впервые выявлен возбудитель гранулоцитарного эрлихиоза человека - A. phagocytophila в клещах /. persulcatus на территории Западной Сибири (Алтайской край), и установлено существование природных очагов этой инфекции. Впервые на территории Приморского края в клещах /. persulcatus генотипирована A. phagocytophila.

8. Дана типологическая характеристика распространения патогенных для человека риккетсий группы КПЛ в зависимости от типа населения основных хозяев- иксодовых клещей. Выделены два основных географических очаговых региона: Восточно-Европейский с циркуляцией возбудителя астраханской пятнистой лихорадки и R. slovaca (дермаценторно-рипицефалисный) и Азиатский с циркуляцией R. slovaca, R. sibirica и «R. heilongjiangensis» (дермаценторно-гемафизалисный).

9. Отработан алгоритм изучения клещевых риккетсий, предусматривающий два подхода- для эпидемиологической разведки территорий и углубленного изучения очагов клещевого риккетсиоза с применением комплекса биологических, серологических и молекулярно-генетических методов. Применение этих подходов в системе эпидемиологического надзора за клещевым риккетсиозом способствует более эффективному мониторингу очагов этой инфекции.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Rudakov N.V. The re- emergence of Siberian tick, typhus: field and experimental observations / N.V. Rudakov, I.E. Samoilenko, V.V. Yakimenko et al. // Rickettsiae and Rickettsial Diseases in the Turn of the Third Millenium: Elsever.-Marselle, 1999.- P. 269-273.

2. Рудаков H.B. Клещевой риккетсиоз в Новосибирской области / Н.В. Рудаков, В.Н. Михеев, Е.В. Тофанюк и др. // Актуальные проблемы обеспечения санитарно — эпидемиологического благополучия населения Омской области: Материалы областной науч.- практ. конф. - Омск, 2000. -С. 192-194.

3. Рудаков Н.В. Выявление инфицированности иксодовых клещей риккетсиями группы клещевой пятнистой лихорадки на территориях с различной эпидемической активностью очагов клещевого риккетсиоза / Н.В. Рудаков, И.Е. Самойленко, Т.А. Решетникова и др. // Актуальные проблемы обеспечения санитарно - эпидемиологического благополучия населения Омской области: Материалы областной науч. - практ. конф. - Омск, 2000. -С. 194-196.

4. Шпынов С.Н. Выявление риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки на территориях с отсутствием заболеваемости клещевым

риккетсиозом в Европейской части России и на южном Урале / С.Н. Шпынов, И.Е. Самойленко, H.R. Рудаков и др. // Актуальные проблемы обеспечения санитарно - эпидемиологического благополучия населения Омской области: Материалы областной науч.- практ. конф. - Омск, 2000.- С.215-217.

5. Рудаков Н.В. Новые данные об очагах клещевого риккетсиоза в Азиатской части России и Казахстане / Н.В. Рудаков, И.Е. Самойленко, М.А. Танкибаев и др. // Профилактика инфекционных заболеваний на рубеже 21 века. Раздел 2. Природноочаговые инфекции и инвазии. - Хабаровск, 2001. -С.139-151.

6. Шпынов С.Н. Новые данные о циркуляции риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки на неэндемичных по клещевому риккетсиозу территориях / С.Н. Шпынов, В.В. Якименко, Н.В. Рудаков и др. // Актуальные вопросы микробиологии и иммунологии: Сб. науч. тр. - Иркутск, 2000. - С.69-70.

7. Шпынов С.Н. Распространение риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки на территории России и Казахстана и их экологические связи с клещами рода Dermacentor / С.Н. Шпынов, P. Parola, Н.В. Рудаков и др. // Природноочаговые болезни человека: Респ. сб. науч. работ, посвящ. 80- летию Омского НИИПИ.- Омск, 2001.- С.69-75.

8. Шпынов С.Н. Новые аспекты изучения клещевого риккетсиоза в Новосибирской области / С.Н. Шпынов, Н.В. Рудаков, В.Н. Михеев и др. // Природноочаговые болезни человека: Респ. сб. науч. работ, посвящ. 80- летию Омского НИИПИ. - Омск, 2001.- С.75-80.

9. Шпынов С.Н. Новые данные о распространении Rickettsia slovaca в Евразии / С.Н. Шпынов, Н.В. Рудаков, И.В. Тарасевич и др. // Природноочаговые болезни человека: Респ. сб. науч. работ, посвящ. 80- летию Омского НИИПИ. - Омск, 2001. - С.80-83.

10. Рудаков Н.В. Некоторые итоги изучения риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки в России и Казахстане / Н.В. Рудаков, И.Е. Самойленко, С.Н. Шпынов и др. // Природноочаговые болезни человека: Респ. сб. науч. работ, посвященный 80- летию Омского НИИПИ.- Омск, 2001. - С.83-89.

11. Самойленко И.Е. Экспериментальное изучение биологических свойств риккетсий трех новых генотипов из группы клещевой пятнистой лихорадки / И.Е. Самойленко, Н.В. Рудаков, С.Н. Шпынов и др. // Природноочаговые болезни человека: Респ. сб. науч. работ, посвящ. 80- летию Омского НИИПИ.- Омск, 2001. - С.89-95.

12. Рудаков Н.В. Новые и возвращающиеся природноочаговые инфекции: теоретические и прикладные аспекты проблемы / Рудаков Н.В., Шпынов С.Н. // Актуальные аспекты природноочаговых болезней: Материалы межрегион, науч.-практ. конф. - Омск, 2001.- С.5-8.

13. Рудаков Н.В. Новые данные о риккетсиях группы КПЛ в России и Казахстане / Н.В. Рудаков, И.Е. Самойленко, С.Н. Шпынов и др. // Журнал инфекционной патологии.- 2001.- N2-3.- С.75-80.

14. Рудаков Н.В. Новые и возвращающиеся природноочаговые инфекции: концепция и некоторые результаты изучения / Н.В. Рудаков, А.А.

Матущенко, С.Н. Шпынов и др. // Актуальные проблемы обеспечения сакитарно - эпидемиологического благополучия населения: Материалы 2 региональной науч.-практ. конф., посвященной 80-летию ОГМА - Омск, 2001. -

C.265 - 269.

15. Шпынов С.Н. Генотипирование риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки в клещах рода Dermacentor на территориях Омской и Новосибирской областей / С.Н. Шпынов, Н.В. Рудаков, В.А. Тарасов и др. // Актуальные проблемы обеспечения санитарно - эпидемиологического благополучия населения : Материалы 2 регион, науч. - практ. конф., посвящ. 80-летию ОГМА - Омск, 2001. - С.290 - 294.

16. Shpynov S. Detection and Identification of Spotted Fever Group Rickettsiae in Dermacentor ticks from Russia and Central Kazahstan / S. Shpynov, P. Parola, N. Rudakov et al. //EurJ.Clin.Microbiol.Inf.Dis.- 2001.-20(12).-p.903-905.

17. Рудаков Н.В. Новые и возвращающиеся природноочаговые инфекции / Н.В. Рудаков, А.А. Матущенко, С.Н. Шпынов, С.А Рудакова // Материалы 8 Всероссийского съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. (В 4 т.). Т.1.- М., 2002.- С.385-386.

18. Рудаков Н.В. Новые данные о риккетсиях группы клещевой пятнистой лихорадки в Евразии / Н.В. Рудаков, С.Н. Шпынов, И.Е. Самойленко и др. // Материалы 8 Всероссийского съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. В 4 т. Т.1.- М., 2002.- С.387-388.

19. Шпынов С.Н. Генотипирование риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки в России и Казахстане / С.Н. Шпынов, P. Parola, Н.В. Рудаков и др. // Материалы 8 Всероссийского съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. В 4 т. Т.З.- М., 2002.- С.375-376.

20. Рудаков Н.В. Новые и возвращающиеся природноочаговые инфекции: теоретические и прикладные аспекты проблемы / Н.В. Рудаков, А.А. Матущенко, С.Н. Шпынов, С.А Рудакова // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН.-2002.-Т.2, N4.-C 16-19.

21. Шпынов С.Н. Новые данные о распространении риккетсий RpA4 и R.aeschlimannii в Северной Азии / С.Н. Шпынов, Н.В. Рудаков, М.А. Танкибаев // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН.- 2002.- Т.2, N4.- С.136-138.

22. Шпынов С.Н. Выявление эрлихий в клещах Ixodes persulcatus на Урале и в Азиатской части России / С.Н. Шпынов, Н.В. Рудаков, Р.-Е. Fournier,

D. Raoult // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН.- 2002.- Т.2, N4.- С. 139-141.

23. Кумпан Л.В. Изучение новых генотипов риккетсий с использованием культур клеток / Л.В. Кумпан, И.Е. Самойленко, С.Н. Шпынов, Н.В. Рудаков // Актуальные проблемы обеспечения санитарно -эпидемиологического благополучия населения: Материалы 3 регион, науч.-практ. конф., посвящ. 80-летию образования гос. сан.-эпид. службы Российской Федерации.- Омск, 2002.- С. 199-201.

24. Шпынов С.Н. "Rickettsia tarasevichiae"- новый вид риккетсий из клещей Ixodes persulcatus, собранных на различных территориях России / СП. Шпынов, Н.В. Рудаков // Актуальные проблемы обеспечения санитарно -эпидемиологического благополучия населения: Материалы 3 регион, науч.

практ. конф., посвящ. 80-летию образования гос. сан.-эпид. службы Российской Федерации.- Омск, 2002.- С.258-262.

25. Шпынов С.Н. Генотипирование риккетсий в иксодовых клещах в России / С.Н. Шпынов, Н.В. Рудаков // Актуальные проблемы обеспечения санитарно - эпидемиологического благополучия населения: Материалы 3 регион, науч.-практ. конф., посвящ. 80-летию образования гос. сан.- эпид. службы Российской Федерации.- Омск, 2002.- С.262-266.

26. Шпынов С.Н. Выявление эрлихий в клещах Ixodes persulcatus на Урале и в Азиатской части России / С.Н. Шпынов, Н.В. Рудаков, Р.-Е. Fournicr, D. Raoult // Актуальные проблемы обеспечения санитарно эпидемиологического благополучия населения: Материалы 3 регион, науч.-практ. конф., посвящ. 80-летию образования гос. сан.- эпид. службы Российской Федерации.- Омск, 2002.- С.266-269.

27. Rudakov N.V. Ecology and epidemiology of spotted fever group rickettsiae and new data from their study in Russia and Kazakhstan / N.V. Rudakov, S.N. Shpynov, I.E. Samoilenko and M.A. Tankibaev // Ann. NY Acad. Sci. Rickettsiology: present and future directions.-2003, June.- Vol.990.- P. 12-24.

28. Shpynov S. "Candidatus Rickettsia tarasevichiae" in Ixodes persulcatus ticks collected in Russia / S. Shpynov, P.-E. Fournier, N. Rudakov and D. Raoult // Ann. NY Acad. Sci. Rickettsiology: present and future directions.-2003, june.-Vol.990.-P.162-172.

29. Samoilenko I.E. Study of biological characteristics of spotted fever group rickettsial genotypes RpA4, DnS14 and.DnS28 / I.E. Samoilenko, N.V. Rudakov, S.N. Shpynov et al. // Ann. NY Acad. Sci. Rickettsiology: present and future directions.-2003, June.- Vol.990.- P.612-616.

30. Шпынов С.Н. Генотипирование риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки в клещах рода Dermacentor в России и Казахстане / С.Н. Шпынов, P. Parola, Н.В. Рудаков и др. // Мед. паразитология и паразитарные болезни.- 2003.- №3.-С.20-24.

31. Ястребов В.К. Организация эпидемиологического надзора за клещевым риккетсиозом / В.К.Ястребов, Н.В.Рудаков, И.Е.Самойленко и др. // Методические указания 3.1.1755-03.-Москва, 2003.-19 с.

32. Шпынов С.Н., Рудаков Н.В. Молекулярно-биологические подходы при изучении протеобактерий / С.Н. Шпынов, Н.В. Рудаков // Современное состояние Российской биотехнологии: Материалы науч.-практ. конф.- М., 2003. - С. 36-37.

33. Рудаков Н.В. Классификация и основные характеристики риккетсий / Н.В. Рудаков, С.Н. Шпынов, И.Е. Самойленко // Актуальные проблемы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения: Материалы 4 межрегион, науч.-практ. конф.- Омск, 2003.- Т. 1.- С. 152-161.

34. Шпынов С.Н. Молекулярно-биологическое изучение штаммов риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки, изолированных в очагах клещевого риккетсиоза / С.Н. Шпынов Н.В. Рудаков, И.Е. Самойленко и др. // Актуальные проблемы обеспечения санитарно-эпидемиологического

благополучия населения: Материалы 4 межрегион, науч.-практ. конф.-Омск, 2003. - Т. 1.-С. 168-173.

35. Шпынов С.Н. Некоторые итоги молекулярно-биологического изучения риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки в иксодовых клещах в России и Казахстане / С.Н. Шпынов, Н.В. Рудаков, В.К. Ястребов и др. // Актуальные проблемы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения: Материалы 4 межрегион, науч.-практ. конф.-Омск, 2003.-Т.1.-С.174-180.

36. Шпынов С.Н. Генотипирование эрлихий и анаплазм в иксодовых клещах в России и Казахстане / С.Н. Шпынов, Н.В. Рудаков, В.К. Ястребов и др. // Актуальные проблемы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения: Материалы 4 межрегион, науч.-практ. конф.-Омск, 2003.-Т.1.-СЛ80-185.

37. Шпынов С.Н. Выявление антител классов IgG и IgM к риккетсиям группы клещевой пятнистой лихорадки в сыворотках крови больных клещевыми инфекциями на территориях Новосибирской области и Алтайского края / С.Н. Шпынов, Н.В. Рудаков, А.С. Оберт и др. // Актуальные проблемы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения: Материалы 4 межрегиональной науч.-практ. конф.-Омск, 2003. - Т. 1-С 185-189.

38. Кумпан Л.В. Применение культур клеток для изучения клещевых патогенов / Л.В. Кумпан, М.А Вайтович, Т.Г. Чепурко и др. // Актуальные проблемы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения: Материалы 4 межрегион, науч.-практ. конф.- Омск, 2003. - Т.2-С.203-205.

39. Шпынов С.Н. Методологические подходы применения молекулярно-геиетических методов в изучении риккетсий и других протеобактерий / С.Н. Шпынов, Н.В. Рудаков, В.К. Ястребов // Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней: Материалы 4-й Межгосударственной науч.-практ. конф. государств-участников СНГ.-Саратов, 2003.- С.202-205.

40. Шпынов С.Н. Первое выявление Rickettsia heilongjiangensis в клещах Haemaphysalis concinna на территории России / С.Н. Шпынов, Н.В. Рудаков, В.К. Ястребов и др. // Здоровье населения и среда обитания. - 2003. -N 12.-С. 16-20.

41. Шпынов С.Н. Обнаружение Rickettsia hulinii в клещах Haemaphysalis concinna на территории России. / С.Н. Шпынов, Н.В. Рудаков, В.К. Ястребов и др. // ЖМЭИ.- 2004.-№2.-С.26-29.

42. Шпынов С.Н. Новые данные о выявлении эрлихий и анаплазм в иксодовых клещах в России и Казахстане. / С.Н.Шпынов, Н.В.Рудаков, В.К. Ястребов и др. // Мед. паразитол. и паразитарн. болезни. - 2004. - №3. -С. 10-14.

43. Шпынов С.Н. Современное состояние очагов клещевого риккстсиоза в Российской Федерации. / С.Н.Шпынов, Н.В.Рудаков.// Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов. Материалы Всероссийской науч. коиф.- Томск, 2004.- С.239-242.

На правахрукописи

Шпынов Станислав Николаевич

Эколого-эпидемиологические и молекулярно-генетические аспекты

изучения природных очагов риккетсиозов и эрлихиозов в России

14.00.30 - эпидемиология 03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Омск - 2004

»15652

Подписано в печать 03.08.2004 г. Формат 60x84/16. Печ.л. 2,0 Тираж 100 экз. Способ печати-оперативный. Заказ № 241 Отпечатано в типографии ФГУ ЦГСЭН в Омской области

г.0мск-001, ул. 10 лет Октября, 98, тел. 56-69-28

Актуальность темы

В Российской Федерации регистрируют заболевания двумя риккетсиозами, передающимися человеку иксодовыми клещами: клещевым риккетсиозом (КР), вызываемым R. sibirica, и астраханской пятнистой лихорадкой (АПЛ) с этиологическим агентом, относящимся к «генокомплексу R. conorii» (Лысковцев М.М., 1963; Rudakov N.V., 1996, Tarasevich I.V. et al., 1991). АПЛ является ярким примером «новой» инфекции (Тарасевич И.В., 2002). Rickettsia sp. DnS14 и Rickettsia sp. DnS28 недавно открыты в клещах Dermacentor nuttalli, собранных на территории республики Алтай в природных очагах КР, и Rickettsia sp. RpA4 - в клещах Rhipicephalus pumilio из очагов астраханской пятнистой лихорадки в Астраханской области (Rydkina Е. et al., 1999).

Внедрение молекулярно-генетических методов (полимеразная цепная реакция (ПЦР) + установление нуклеотидных последовательностей) позволило открыть ряд новых, преимущественно апатогенных представителей семейства Rickettsiaceae в членистоногих. Эти методы позволили установить этиологическую роль ранее считавшихся апатогенными для человека риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки (КПЛ): Rickettsia slovaca, R. helvetica, R. mongolotimonae и «R. aeschlimannii» (Raoult D. et al., 1996, 1997, 2000, 2002; Fournier P.- E. et al., 2000).

В России в последние десятилетия отмечается непрекращающийся рост передаваемых клещами инфекций, в том числе и риккетсиозов. В ряде регионов описаны случаи заболеваний моноцитарным (МЭЧ) и гранулоцитарным эрлихиозами человека (ГЭЧ). Большой научный интерес и практическую ценность представляет изучение этиологической структуры риккетсиозов и эрлихиозов, передающихся человеку через присасывание клещей, и установление роли определенных видов иксодид в их распространении. Для эффективного решения задачи обеспечения эпидемиологического благополучия населения необходима четкая организация эпидемиологического надзора за этими инфекциями с использованием комплекса современных эпидемиологических, клинических, экологических и лабораторных методов и подходов, включая многоплановый мониторинг возбудителя и других сочленов паразитарных систем очаговых территорий.

Цель исследования

Изучить эколого-эпидемиологические закономерности распространения риккетсий и эрлихий в России и Казахстане и обосновать применение молекулярно-генетических подходов для их мониторинга в природных очагах.

Задачи исследования

1. Изучить современные эпидемиологические закономерности распространения клещевых риккетсиозов и эрлихиозов в России.

2. Изучить геновидовой состав и географическое распространение риккетсий и эрлихий и их связи с различными видами иксодид на территории России и Казахстана.

3. Изучить генетические характеристики штаммов Rickettsia sibirica, выделенных из различных источников в разных частях нозоареала клещевого риккетсиоза за длительный период изучения очагов.

4. Установить эпидемиологическую значимость различных видов иксодовых клещей и связанных с ними риккетсий в формировании нозоареала клещевого риккетсиоза.

5. Осуществить типологическую характеристику распространения патогенных для человека риккетсий группы КПЛ на территории России в зависимости от типа населения основных хозяев - иксодовых клещей.

6. Разработать новые подходы к мониторингу возбудителей «новых» клещевых бактериальных инфекций и эпидемиологического надзора за очагами клещевого риккетсиоза с использованием методов генетического анализа.

Научная новизна

Охарактеризованы современные эпидемиологические закономерности клещевого риккетсиоза в период беспрецедентного роста заболеваемости этой инфекцией в Российской Федерации при ведущем значении Западной Сибири (Алтайский край).

Впервые выявлена выраженная генетическая гетерогенность а-протеобактерий порядка Rickettsials (16 видов) на территориях России и Казахстана и их экологические связи с различными видами иксодовых клещей. Наибольшее разнообразие представителей порядка Rickettsiales связано с клещами Ixodes persulcatus, в которых генотипированы «Candidatus Rickettsia tarasevichiae», R. sibirica, R. helvetica, риккетсия, близкая к Rickettsia sp. AT-1, Anaplasma phagocytophila, Ehrlichia muris, «Ehrlichia-Yike» 'Schotti variant' и бактерия 'Montezuma'.

Установлены сопряженные очаги клещевого риккетсиоза и гранулоцитарного эрлихиоза человека в Западной Сибири (Алтайский край). В очагах клещевого риккетсиоза в роли переносчика R. sibirica выступают иксодовые клещи из рода Dermacentor, в очагах гранулоцитарного эрлихиоза человека этиологический агент- A. phagocytophila передается клещами I. persulcatus, кроме этого в клещах Haemaphysalis concinna генотипирована «R. heilongjiangensis», признанная «новым» патогеном человека.

При молекулярно-генетических исследованиях штаммов риккетсий группы КПЛ доказано наличие R. sibirica в пределах всего нозоареала клещевого риккетсиоза в России, где по результатам генотипирования выявлено выраженное преобладание R. sibirica над другими видами риккетсий с доказанной патогенностью (из 25 изученных штаммов - 23 штамма R. sibirica, 1- Rickettsia sp. BJ-90, являющийся геновариантом R. sibirica, и 1- R. slovaca). Сравнение нуклеотидных последовательностей двух генов (отрА и gltA) 23 изученных штаммов показало их полную гомологию, что демонстрирует генетическую консервативность R. sibirica.

Выявлены различия в генотипическом составе риккетсий в очагах клещевого риккетсиоза и на неэндемичных по этому заболеванию территориях. На территориях с отсутствием заболеваемости клещевым риккетсиозом не выявлены штаммы патогенных риккетсий, кроме R. slovaca. В очагах клещевого риккетсиоза наряду с Rickettsia sibirica, выявлены и другие представители группы КПЛ с доказанной патогенностью- «R. heilongjiangensis» и R. slovaca.

Описан новый генотип риккетсий, получивший название «Candidatus Rickettsia tarasevichiae», в честь академика РАМН, руководителя лаборатории экологии риккетсий НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН И.В.Тарасевич*. Установлена филогенетическая позиция, экологическая связь с клещами I. persulcatus и географическое распространение этого нового представителя рода Rickettsia.

Впервые на основании полученных молекулярно-генетических исследований дана типологическая характеристика распространения патогенных для человека риккетсий группы КПЛ в зависимости от типа населения основных хозяев- иксодовых клещей. Выделены два основных географических региона: Восточно-Европейский с циркуляцией возбудителя

Выражаем глубокую признательность академику РАМН И.В.Тарасевич за научно-консультационную помощь при выполнении работы

АПЛ и R. slovaca (дермаценторно-рипицефалисный) и Азиатский с циркуляцией R. sibirica, «R. heilongjiangensis» и R. slovaca (дермаценторно-гемафизалисный). В пределах Азиатского региона выделены четыре области: дермаценторная (маргинатусно-ретикулятусная) с циркуляцией R. sibirica и R. slovaca; дермаценторно-гемафизалисная сибирская с циркуляцией R. sibirica и «R. heilongjiangensis»; дермаценторная (нутталлиево-сильварумная) с циркуляцией R. sibirica; и дермаценторно-гемафизалисная дальневосточная с циркуляцией R. sibirica и «R. heilongjiangensis».

Практическая ценность и реализация результатов исследования

В результате проведенных исследований установлены основные закономерности распространения очагов клещевых риккетсиозов, гранулоцитарного эрлихиоза человека на территории России. Установлено географическое распространение представителей порядка Rickettsiales и их экологические связи с иксодовыми клещами на территориях России и Казахстана. Разработан комплекс мероприятий по эпидемиологическому надзору за очагами клещевых риккетсиозов и эрлихиозов и профилактике этих инфекций на территориях Южного Урала, Западной и Восточной Сибири и Дальнего Востока. Усовершенствованы методы индикации и идентификации представителей порядка Rickettsiales в иксодовых клещах и обоснована тактика мониторинга очагов этих инфекций. Отработана тактика применения комплекса биологических, серологических и молекулярно -генетических методов, как на эндемичных территориях с высоким уровнем заболеваемости КР и выявлением вирулентных штаммов R. sibirica, так и на территориях с отсутствием заболеваемости и циркуляцией авирулентных штаммов риккетсий.

Разработаны Методические указания. 3.1.1755-03. Организация эпидемиологического надзора за клещевым риккетсиозом: Утверждены МЗ

РФ 28.09.03. Авторы: В.К.Ястребов, Н.В.Рудаков, И.Е.Самойленко, Т.А.Решетникова, С.Н.Шпынов, И.В.Тарасевич.

Получено решение о выдаче патента на изобретение по заявке №2001127459/13 (029242) «Апатогенный штамм риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки, используемый для дифференциации патогенных и апатогенных риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки» авторов Самойленко И.Е., Шпынова С.Н. и Рудакова Н.В. от 24 февраля 2004 г. Дата приоритета 09.10.2001 г.

Впервые определены и депонированы в Международный компьютерный банк данных GenBank нуклеотидные последовательности гена цитрат синтетазы {gitA) (AF503167) и гена 16S рибосомальной РНК (16S рРНК) (AF503168) «Candidates Rickettsia tarasevichiae», гена кодирующего белок наружной мембраны 190-кД (отрА) (AY259083) и гена gltA (AY259084) Rickettsia aeschlimannii штамм «Казахстан».

Депонированы штаммы новых генотипов риккетсий во Всероссийский музей риккетсиозных культур НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН:

1. Самойленко И.Е., Шпынов С.Н. Штамм группы клещевой пятнистой лихорадки «5/98-Караганда» Rickettsia species novus генотипа RpA4 (сокращенно R.sp.nov.RpA4). Справка о депонировании штамма от 23.12.02 г. (Омский НИИПИ).

2. Самойленко И.Е., Шпынов С.Н. Штамм группы клещевой пятнистой лихорадки «Шайман» Rickettsia species novus генотипа DnS14 (сокращенно R.sp.nov.DnSH). Справка о депонировании штамма от 23.12.02 г. (Омский НИИПИ).

Положения, выносимые на защиту

1. На территориях России и Казахстана в иксодовых клещах имеют распространение: «классический» патоген человека - R. sibirica; возбудитель астраханской пятнистой лихорадки, R. slovaca, «R. heilongjiangensis», R. aeschlimannii и R. helvetica, отнесенные к «новым» патогенам человека, и риккетсии с неизученной патогенностью для человека, к которым относятся: Rickettsia sp. RpA4, Rickettsia sp. DnS14 и Rickettsia sp. DnS28, «Candidates Rickettsia tarasevichiae» и риккетсия близкая Rickettsia sp. AT-1. Филогенетические позиции большинства выявленных видов риккетсий существенно отличаются и представляют все основные геногруппы риккетсий, экология которых связана с иксодовыми клещами.

2. Нозоареал КР соответствует ареалу R. sibirica и имеет распространение от Зауралья (Курганская область) до Дальнего Востока России (Приморский край). Наряду с R. sibirica в нозоареале КР выявлены другие патогенные и с неустановленной патогеностью риккетсии, распространение которых связано с населением основных эпидемически значимых переносчиков.

3. На территориях юга Западной Сибири (Алтайский и Красноярский края) и Дальнего Востока (Приморский край) в клещах Н. сопс'тпа выявлен «новый» патоген человека «R. heilongjiangensis», в Алтайском и Приморском краях в очагах КР в клещах I. persulcatus генотипирована A. phagocytophila- возбудитель ГЭЧ.

4. Выделены три экологические группы риккетсий, выявленных на территориях России и Казахстана, по отношению к их преимущественным хозяевам - представителям различных родов иксодовых клещей (Dermacentor и Rhipicephalus; Haemaphysalis; Ixodes). Выделены два основных географических региона по распространению иксодовых клещей и экологически связанных с ними патогенных риккетсий группы КПЛ: Восточно-Европейский с циркуляцией возбудителя АПЛ и R. slovaca (дермаценторно-рипицефалисный) и Азиатский с циркуляцией R. sibirica, «R. heilongjiangensis» и R. slovaca (дермаценторно-гемафизалисный).

5. Комплексное применение биологических, серологических и молекулярно - генетических методов, является целесообразным как на эндемичных территориях с высоким уровнем заболеваемости КР и выявлением вирулентных штаммов R. sibirica, так и на территориях с отсутствием заболеваемости и циркуляцией авирулентных штаммов риккетсий.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на:

• Международной конференции: «Rickettsiae and Rickettsial Diseases in the Turn of the Third Millenium», Marselle, France, 1999;

• Республиканской конференции посвященной 80- летию Омского НИИПИ «Природноочаговые болезни человека», Омск, 2001;

• Второй и третьей региональных и четвертой межрегиональной научно -практических конференциях «Актуальные проблемы обеспечения санитарно - эпидемиологического благополучия населения», Омск, 2001, 2002, 2003;

• 8 Всероссийском съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 2002;

• Второй научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера», Новосибирск, 2002;

• International conference on rickettsiae and rickettsial diseases, Ljubljana, 2002;

• «7 international Potsdam symposium on tick - borne diseases» poster sessions, Berlin, 2003;

• Научно - практической конференции «Современное состояние Российской биотехнологии», Москва, 2003

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 43 научных работы в журналах (в том числе в периодических научных изданиях, рекомендуемых

ВАК для публикации основных результатов диссертаций на соискание ученой степени доктора наук, и за рубежом), сборниках, материалах конференций, одни методические указания.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов, списка литературы (287 отечественных и зарубежных источника). Объем работы составляет 204 страницы машинописного текста, в том числе 16 таблиц и 22 рисунка.

ВЫВОДЫ

1. При анализе многолетней динамики (более 65 лет) выделено три периода с различными уровнями заболеваемости клещевым риккетсиозом в России. Первый период, характеризующийся подъемом уровня заболеваемости клещевым рикетсиозом в стране, наблюдался с 1943 по 1968 гг., с регистрацией наибольшего количества случаев заболевания в 1945, 1954 и 1967 гг., преимущественно за счет Восточной Сибири. Во второй период (с 1968 по 1978 гг.) наблюдалось значительное снижение регистрации заболеваемости клещевым риккетсиозом. Третий период - с 1979 г. по настоящее время, характеризуется непрекращающимся ростом заболеваемости с увеличением показателей в 10 раз, преимущественно за счет Западной Сибири.

2. При использовании комплекса генетических методов показана высокая генетическая однородность штаммов R. sibirica, выделенных в очагах клещевого риккетсиоза с 1954 по 2001 гг. от человека и иксодовых клещей 6 видов на территории от Урала до Дальнего Востока, из 24 штаммов только один оказался геновариантом R. sibirica - Rickettsia sp. BJ-90.

3. В очагах клещевого риккетсиоза на территории России в иксодовых клещах выявлено генетическое разнообразие недавно описанных риккетсий, эрлихий и анаплазм, как признанных патогенов человека, так и с не доказанной к настоящему времени патогенностью. В клещах рода Dermacentor- эпидемически значимых переносчиках R. sibirica, с помощью молекулярно-генетических методов показано преобладание риккетсий из групппы КПЛ с неизученной патогенностью, относящихся к геногруппе R. massiliae.

4. «Candidatus Rickettsia tarasevichiae», генотипированная в клещах I. persulcatus и образовавшая кластер вместе с R. canadensis и новыми видами риккетсий, найденными в насекомых, занимает промежуточное филогенетическое положение между представителями групп сыпного тифа и КПЛ. «Candidatus Rickettsia tarasevichiae» экологически связана с клещами I. persulcatus и имеет распространение во всем ареале этого вида иксодид от Европейской части России до Дальнего Востока.

5. Установлены три экологических группы риккетсий на территориях России и Казахстана, по отношению к их преимущественным хозяевам - представителям различных родов иксодовых клещей (1 -Dermacentor и Rhipicephalus; 2 - Haemaphysalis', 3 - Ixodes).

6. В клещах I. persulcatus выявлено наибольшее количество al-протеобактерий: A. phagocytophila, Е. muris, R. sibirica, «Candidatus R. tarasevichiae», бактерия «Montezuma» и риккетсия, близкая Rickettsia sp. AT-1, что указывает на их значимость в циркуляции ряда клещевых а-протеобактерий.

7. Впервые выявлен возбудитель гранулоцитарного эрлихиоза человека - A. phagocytophila в клещах I. persulcatus на территории Западной Сибири (Алтайской край), и установлено существование природных очагов этой инфекции. Впервые на территории Приморского края в клещах I. persulcatus генотипирована A. phagocytophila.

8. Дана типологическая характеристика распространения патогенных для человека риккетсий группы КПЛ в зависимости от типа населения основных хозяев- иксодовых клещей. Выделены два основных географических очаговых региона: Восточно-Европейский с циркуляцией возбудителя астраханской пятнистой лихорадки и R. slovaca (дермаценторно-рипицефалисный) и Азиатский с циркуляцией R. slovaca, R. sibirica и «R. heilongjiangensis» (дермаценторно-гемафизалисный).

9. Отработан алгоритм изучения клещевых риккетсий, предусматривающий два подхода- для эпидемиологической разведки территорий и углубленного изучения очагов клещевого риккетсиоза с применением комплекса биологических, серологических и молекулярно-генетических методов. Применение этих подходов в системе эпидемиологического надзора за клещевым риккетсиозом способствует более эффективному мониторингу очагов этой инфекции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С начала официальной регистрации КР с 1936 по 2003 гг. на 18 административных территориях юга Сибири и Дальнего Востока России зарегистрировано более 61 тыс. случаев этого заболевания.

За более чем 65-летнюю историю изучения КР в России выделено три многолетних периода. Первый период, характеризующийся подъемом уровня заболеваемости КР в стране, наблюдался с 1943 по 1968 гг., с регистрацией наибольшего количества случаев заболевания в 1945, 1954 и 1967 гг. преимущественно за счет региона Восточной Сибири. Во второй период (с 1968 по 1978 гг.) наблюдается значительное снижение регистрации заболеваемости КР. Однако, с 1979 г. по настоящее время (третий период) наблюдается непрекращающийся рост заболеваемости с ростом показателей в 10 раз, преимущественно за счет Западной Сибири.

Сопоставление территориального распределения заболеваемости клещевым риккетсиозом за период с низким уровнем заболеваемости-(60-е годы) и период резкого роста (1993-2002 гг.) свидетельствует о его изменениях за счет увеличения доли заболеваемости в Западной Сибири (с 24,5 до 55,0 %) и на Дальнем Востоке (с 7,5 до 23 %). При этом доля заболеваемости в Восточной Сибири снизилась с 68,0 до 22 %.

За последние десятилетие с 1993 г. по 2002 г. в Российской Федерации зарегистрировано 25020 случаев заболевания КР, в среднем 2502 случая в год. При анализе заболеваемости по регионам число случаев в Западно-Сибирском регионе составляет 55% от всех случаев по России, в Восточно-Сибирском регионе - 22% и в Дальневосточном - 23%. Наиболее высокие показатели заболеваемости в период 1993

2002 гг. регистрировались в Западно-Сибирском регионе (15,0 в 2001 г.).

На территориях Алтайского края и республики Алтай (Западная Сибирь), характеризующихся самыми высокими показателями заболеваемости КР, по данным официальной регистрации за 2001 гг. зарегистрировано 59% случаев этой инфекции. За 60 лет изучения (1942-2002 гг.) здесь зарегистрирован 25151 случай этой инфекции, из них 12970 (51,6%) случаев за последнее десятилетие (1993-2002 гг.).

Отмечается расширение нозоареала КР, что проявляется в появлении новых эпидемически активных очагов в Новосибирской, Тюменской, Курганской областях.

В Новосибирской области на основании анализа многолетней динамики заболеваемости выделено три периода с различными особенностями распространения и эпидемического проявления природных очагов КР.

В последние годы отмечается рост заболеваемости КР в западных и юго-западных районах Новосибирской области, где за последние 15-20 лет сформировались активные очаги клещевого риккетсиоза. С момента регистрации КР в Тогучинском, а позднее Сузунском - (восточных) районах Новосибирской области идет распространение очагов этой инфекции в западном направлении. Индикация этого процесса косвенно подтверждается хронологией выделения из переносчиков штаммов R. sibirica.

Картографированы ареалы клещей рода Dermacentor, с учетом их частичного совпадения. D. marginatus и D. reticulatus населяют западную часть Евразии, a D. nuttalli и D. silvarum- восточную. Ареалы D. marginatus и D. reticulatus распространены в зоне лесостепи до юга Красноярского края на востоке. Однако северная граница распространения D. reticulatus находится выше, чем D. marginatus. Северная граница D. silvarum находится севернее,чем D. nuttalli. Юг Западной Сибири характеризуется наибольшей видовой насыщенностью ареала рода Dermacentor, достигая в предгорьях Алтая максимума разнообразия (D. marginatus, D. reticulatus, D. nuttalli, D. silvarum).

Применение методов генетического анализа (ПЦР - секвенирование) позволило установить, штаммы риккетсий группы КПЛ, выделенные из иксодовых клещей на территории РФ с 1954 по 2001 гг. (25 штаммов), представлены тремя видами: R. sibirica, Rickettsia sp. BJ-90 и R. slovaca. На территории Алтайского края и республики Алтай - гиперэндемичных по КР было выделено наибольшее количество (52 %) штаммов R. sibirica. Все 23 из исследованных штаммов R. sibirica, выделенные за 48 лет из различных источников, имели 100 % гомологию по 2 изученным генам.

Генотипирование штаммов риккетсий, изолированных из клещей Ixodes persulcatus как R. sibirica, может указывать на потенциальную роль клещей этого вида в качестве переносчика и резервуара.

На территории Курганской области, расположенной в самой западной части нозоареала КР из клещей D. marginatus было выделено 2 штамма риккетсий: 1 штамм,/?, slovaca «Карпунино 19/69» и 1 штамм R. sibirica «Комсомольское 21/69». Впервые установлено и подтверждено с помощью молекулярнро-биологических методов, что выделенные в очаге КР штаммы представлены R. sibirica и R. slovaca.

Территории Алтайского края и республики Алтай можно отнести к центральной части нозоареала КР, с наивысшими показателями заболеваемости этой инфекцией на 100 тыс. населения (24,3-65,3 и 54,290,9, соответственно), где штаммы R. sibirica были выделены из всех видов исследованных клещей (род Dermacentor, Haemaphysalis, Ixodes) и два штамма от пациентов.

По результатам генотипирования R. sibirica был доминирующим видом среди штаммов риккетсий группы КПЛ, выделенных от людей и шести видов иксодовых клещей (D. nuttalli, D. marginatus, D. silvarum, D. reticulatus, H. concinna и I. persulcatus) в лесостепной зоне РФ от Курганской области до Приморского края в период с 1954 по 2001 год.

В иксодовых клещах генотипировано несколько видов патогенных для человека риккетсий, среди них «классический» патоген - R. sibirica и риккетсии, отнесенные к «новым» патогенам: «R. heilongjiangensis», R. slovaca, R. helvetica и R. aeschlimannii.

ДНК R. sibirica была выявлена у 4 из 33 (12,1 %) экземпляров клещей D. nuttalli, собранных на территории Красноярского края (сбор D. nuttalli был осуществлен только на этой административной территории) в очагах КР. «R. heilongjiangensis» была выявлена у 7 из 91 (7,7 %) экземпляров клещей Н. concinna собранных на территориях Алтайского (4/20/20 %), Красноярского (2/56/3,57 %) и Приморских (2/15/13,3 %) краев. Этот вид риккетсий также обнаружен в 1 из 33 (3 %) экземпляров клещей D. nuttalli, собранных на территории Красноярского края. ДНК R. slovaca выявлена в двух пробах клещей D. marginatus, собранных в Европейской части РФ на территориях Ставропольского края и Воронежской области.

Риккетсия, имеющая 99,7 % соответствия по гену gltA с R. helvetica генотипирована в клещах I. persulcatus, собранных на территории Омской области.

При исследовании 36 экземпляров клещей Н. punctata, собранных на территории Алма-Атинской области Казахстана в 2 (5,5 %) была генотипирована риккетсия, близкородственная R. aeschlimannii. Этот геновариант был заявлен в GenBank, как R. aeschlimannii штамм «Казахстан», степень гомологии полученных нуклеотидных последовательностей составила 98,5 % по гену отрА и 99,6 % гомологии по гену gltA (GenBank номера AY259083 и AY259084).

R. aeschlimannii штамм «Казахстан», выявленна в клещах Н. punctata, собранных на территории Алма-Атинской области Казахстана. Rickettsia sp. RpA4 выявлена в клещах D. reticulatus на территории Воронежской и Челябинской областей, в клещах D. marginatus и D. reticulatus на территориях Оренбургской, Омской и Новосибирской областей. На территории Алтайского края этот вид риккетсий был генотипирован в клещах D. reticulatus, D. marginatus, Н. concinna и /. persulcatus. В Приморском крае в одном из экземпляров клещей I. persulcatus также был выявлен этот вид риккетсий. На территории Казахстана Rickettsia sp. RpA4 была генотипирована в D. niveus, собранных в Карагандинской области и D. marginatus из Восточно-Казахстанской области.

Rickettsia sp. DnS14 генотипирована в клещах D. marginatus, собранных на территории Оренбургской области и Алтайского края, в клещах D. nuttalli на территории Красноярского, Приморского краев и республики Бурятии, в клещах D. silvarum на территории Приморского края и республики Бурятии, а также в клещах D. niveus, собранных Карагандинской области Казахстана. Находки ДНК Rickettsia sp. DnS28 были ограничены территориями Красноярского края и республики Бурятии где эта риккетсия была обнаружена в клещах D. nuttalli и D. silvarum, соответственно.Эти три вида риккетсий из геногруппы R. massiliae имеют широкое распространение в Евразии от европейской части России до Дальнего Востока. Их ареалы перекрываются, а экология связана преимущественно с клещами рода Dermacentor.

В клещах I. persulcatus, собранных на территориях Челябинской, Тюменской, Омской и Новосибирской областей, Алтайского, Красноярского и Приморского краев генотипирован новый вид риккетсий, являющийся наиболее близким к R. canadensis (98 % гомологии по гену 16S рибосомальной РНК и 96% гомологии по гену gltA, соответственно). Этот новый вид риккетсий получил название «Candidatus Rickettsia tarasevichiae» в честь академика РАМН, руководителя лаборатории экологии риккетсий НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН И. В. Тарасевич.

Это первое выявление риккетсий в клещах рода Ixodes в России. Мы обнаружили «Candidatus Rickettsia tarasevichiae» в 25,5 % клещей /. persulcatus, собранных на различных территориях от Южного Урала до Дальнего Востока.

Новый генотип риккетсий имеющий 86 % соответствия по гену отрА с Rickettsia sp. АТ-1 был выявлен в клещах этого вида собранных на территории Алтайского и Красноярского краев.

ДНК R. sp. RpAA была генотипирована в клещах D. niveus, собранных на территории Карагандинской области и клещах D. marginatus из Восточно-Казахстанской области Казахстана. Rickettsia sp. DnSXA была выявлена в клещах D. niveus на территории Карагандинской области.

В целом, на территориях России и Казахстана доказано распространение 11 видов риккетсий, экология которых связана с иксодовыми клещами. Филогенетические позиции этих видов риккетсий существенно отличаются и представляют все основные кластеры, экология которых связана с иксодовыми клещами. Один из них является «классическим» патогеном, пять относятся к «новым» патогенам человека, патогенность для человека пяти других видов риккетсий к настоящему времени не установлена.

Анализ полученных результатов позволил выделить три экологических группы риккетсий клещевого биотипа, выявленных на территориях России и Казахстана, по отношению к их преимущественным хозяевам - представителям различных родов иксодовых клещей. Экология первой группы связана преимущественно с клещами родов Dermacentor и Rhipicephalus из подсемейства Rhipicephalinae. К этой группе можно отнести R. sibirica, возбудителя АПЛ, R. slovaca, а также Rickettsia sp. RpA4, Rickettsia sp. DnS14 и Rickettsia sp. DnS28.

Риккетсии второй группы, к которым относятся «R. heilongjiangensis» и R. aeschlimannii штамм «Казахстан», экология которых связана с двумя представителями рода Haemaphysalis (Н. concinna и Н. punctata). «R. heilongjiangensis» выявлена в очагах КР в клещах Н. concinna и D. nuttalli, что сближает эту риккетсию в экологическом плане с R. sibirica. Экология третьей группы риккетсий включающей «Candidatus Rickettsia tarasevichiae», R. helvetica и Rickettsia sp. AT-1 связана только с клещами рода Ixodes (I. persulcatus).

Таким образом, на территориях России и Казахстана в иксодовых клещах имеют распространение R. sibirica, являющаяся «классическим» патогеном человека, возбудитель АПЛ, R. slovaca, «R. heilongjiangensis», R. aeschlimannii и R. helvetica отнесенные к "новым" патогенам человека, и риккетсии с неизученной патогенностью для человека к которым относятся: Rickettsia sp. RpA4, Rickettsia sp. DnS14 и Rickettsia sp. DnS28, «Candidatus Rickettsia tarasevichiae» и Rickettsia sp. AT-1 (86 % гомологии). Ареалы различных видов иксодовых клещей хозяев риккетсий перекрываются, что влияет на видовое многообразие риккетсий на территориях.

В результате провенных исследований ДНК эрлихий и анаплазм была выявлена и идентифицирована в 17 из 900 (1,9 %) исследованных иксодовых клещей. ДНК Е. muris была выявлена у 10 из 317 (3,1 %) исследованных клещей I. persulcatus, собранных на территориях Тюменской (5,3 %), Омской (3,3 %) и Новосибирской (3,8 %) областей и Алтайского края (8,5 %). На территории Омской области в 2 из 122 проб клещей I. persulcatus была выявлена ДНК «Ehrlichia-like» 'Schotti variant'. ДНК A. phagocytophila была выявлена и идентифицирована в клещах I. persulcatus, собранных на территориях Алтайского и Приморского краев, инфицированность составила 2,1 % и 4,5 % соответственно. ДНК A. bovis была генотипирована в 2 из 15 (13,3 %) экземпляров клещей Н. concinna, собранных на территории Приморского края. При исследовании клещей I. persulcatus, собранных на территориях Омской и Новосибирской областей, Алтайского и Приморского краев, была выявлена некультивируемая бактерия 'Montezuma'.

Не выявлены представители родов Anaplasma и Ehrlichia при исследовании 364 экземпляров клещей рода Dermacentor {D. marginatus, D. reticulatus, D. silvarum и D. nuttalii), собранных в России в зоне лесостепи от Ставропольского края на западе до Приморского края на востоке, а также при исследовании 106 экземпляров клещей родов Dermacentor, Haemaphysalis и Hyalomma, собранных в степной зоне Казахстана.

Проведенные исследования позволили установить, что на территории России в иксодовых клещах имеют распространение четыре представителя трибы Ehrlichiaea, два из них относятся к роду Anaplasma

- A. phagocytophila и A. bovis, два к роду Ehrlichia - Е. muris и «Ehrlichia-YikQ» 'Schotti variant'. В клещах I. persulcatus были выявлены A. phagocytophila (Алтайский и Приморский края), Е. muris (Тюменская, Омская, Новосибирская области и Алтайский край) и «Ehrlichia-like» 'Schotti variant' (Омская область), a A. bovis (Приморский край) была генотипирована в клещах Н. concinna. Три из четырех вышеперечисленных видов бактерий являются признанными патогенами теплокровных, передающимися клещами. Четвертый -«Ehrlichia-like» 'Schotti variant' был описан при исследовании клещей /. ricinus, собранных в природных очагах гранулоцитарного эрлихиоза в Голландии, и к настоящему времени был генотипирован только в иксодовых клещах, данные о его патогенности для теплокровных отсутствуют.

Выявление ДНК A. phagocytophila в клещах I. persulcatus на территориях Алтайского и Приморского краев, где ранее осуществлена серологическая верификация случаев ГЭЧ среди пациентов с клещевыми инфекциями, позволяет сделать вывод о существовании природных очагов этого заболевания на территориях Западной Сибири и Дальнего Востока России.

В результате проведенного анализа на территории России выделено 2 основных географических региона по распространению иксодовых клещей - хозяев патогенных риккетсий группы КПЛ.

1) Восточно-Европейский с циркуляцией возбудителя АПЛ и R. slovaca (дермаценторно-рипицефалисный);

2) Азиатский с циркуляцией R. slovaca, R. sibirica и R. heilongjiangensis (дермаценторно-гемафизалисный), в котором можно выделить четыре области: дермаценторную (маргинатусно-ретикулятусную) с циркуляцией R. sibirica и R. slovaca', дермаценторногемафизалисную сибирскую (сибирское пятно ареала Н. concinna) с циркуляцией R. sibirica и R. heilongjiangensis-, дермаценторную (нутталливо-сильварумную) с циркуляцией R. sibirica и возможно R. heilongjiangensis', дермаценторно-гемафизалисную дальневосточную (дальневосточное пятно ареала Н. concinna) с циркуляцией R. sibirica и R. heilongjiangensis.

В Восточно-Европейский регионе в Астраханской области регистрируется заболеваемость АПЛ, наибольшее значение интенсивного показателя 23,8 на 100 тыс. населения зафиксировано в 1999 г. В настоящее время ни одного случая клинического синдрома «TIBOLA» - инфекции, вызываемой R. slovaca на территории Российской Федерации не зарегистрировано.

В Азиатском регионе (дермаценторно-гемафизалисный) в настоящее время регистрируется заболеваемость только КР, в то же время здесь имеют распространение «новые» патогенны R. slovaca в западной части региона (Курганская область) и R. heilongjiangensis в восточной части ареала.

Отработан алгоритм изучения клещевых риккетсий, предусматривающий два подхода- для эпидемиологической разведки территорий и углубленного изучения очагов КР с применением комплекса биологических, серологических и молекулярно-генетических методов. Их применение зависит в первую очередь от материально-технической базы и оснащенности лабораторий. При первом подходе осуществляется индикация и предварительная идентификация патогенных и апатогенных риккетсий в клещах, при втором проводится полная идентификация риккетсий.

Первый подход основан на применении комплекса биологических и серологических методов и позволяет дифференцировать R. sibirica от апатогенных риккетсий группы КПЛ (Rickettsia sp. RpA4 или Rickettsia sp. DnS28) без осуществления идентификации. Положительный результат исследований в МФА (ИФА) и РНГА указывает на присутствие в исследуемой пробе R. sibirica. Отрицательный результат исследований в РНГА при положительном в МФА (ИФА) свидетельствует о присутствии в пробе апатогенных риккетсий группы КПЛ {Rickettsia sp. RpA4 или Rickettsia sp. DnS28). Отрицательные результаты, полученные в РНГА и МФА (ИФА), позволяют сделать вывод об отсутствии риккетсий группы КПЛ (как патогенных, так и апатогенных) в исследуемой пробе.

Второй подход, основанный на применении комплекса молекулярно-генетических и биологических методов, является наиболее адекватным и полным для эпидемиологической разведки территорий и углубленном изучении очагов клещевого риккетсиоза. Его применение позволяет с помощью биологического метода выделить и изучить штаммы возбудителя, и провести полную идентификацию риккетсий с использованием молекулярно-генетических методов. При этом с помощью биопробы осуществляется индикация только патогенных видов риккетсий, а молекулярно-генетические методы позволят выявить и идентифицировать как патогенные, так и апатогенные виды риккетсий.

Таким образом, отработана тактика применения комплекса биологических, серологических и молекулярно-генетических методов, как на эндемичных территориях с высоким уровнем заболеваемости КР и выявлением вирулентных штаммов R. sibirica, так и на территориях с отсутствием заболеваемости и циркуляцией авирулентных штаммов риккетсий. Применение генетических методов в комплексе с другими лабораторными методами в системе эпидемиологического надзора за КР будет способствовать более эффективному мониторингу очагов этой инфекции и совершенствованию профилактических мероприятий.