Автореферат и диссертация по медицине (14.00.30) на тему:Клинико-эпидемиологическая характеристика клещевого риккетсиоза, вызываемого Rickettsia heilongjiangensis на Дальнем Востоке России

На правах рукописи

МЕДЯННИКОВ ОЛЕГ ЮРЬЕВИЧ

КЛИНИКО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕЩЕВОГО РИККЕТСИОЗА, ВЫЗЫВАЕМОГО RICKETTSIA HEILONGJIANGENS1S, НА ДАЛЬНЕМ ВОСТОКЕ РОССИИ

14.00.30 - эпидемиология 14.00.10 - инфекционные болезни

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2004

Работа выполнена в Государственном Учреждении Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи Российской Академии медицинских наук, Дальневосточном Государственном медицинском университете и Медицинском Факультете Средиземноморского Университета (г. Марсель, Франция)

Научные руководители:

Ведущая организация:

ФГУ Санкт-петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пасте-ра МЗ РФ

Защита диссертации состоится « » ноября 2004 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 00 J .007.02 в ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН по адресу: 123098, Москва, ул. Гамалеи, 18

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН

Автореферат разослан «_Н__» октября 2004 г.

академик РАМН, д.б.н., профессор д.м.н., профессор

И.В. Тарасевич Ю.Н. Сидельников

Официальные оппоненты:

академик РАМН, д.м.н., профессор д.м.н., профессор

В, И. Злобин Н.М.Грачёва

Ученый секретарь диссертационного советата: Д.м.н., профессор

\

Е.В. Русакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Последние десятилетия XX века характеризуются активизацией эпидемического проявления природно-очаговых риккетсиозов, объединяемых в группу клещевой пятнистой лихорадки (КПЛ) в различных регионах мира (Тарасевич И.В. и др., 1980, Raoult D., et al., 1997, Rudakov N.V., et al., 2003). Риккетсиозы являются важной проблемой инфекционной патологии многих стран, в том числе и России (Тарасевич И.В., 1975, Raoult D., et al., 1997). За последние годы описано несколько заболеваний, вызываемых ранее неизвестными риккетсиями: астраханская пятнистая лихорадка, японская пятнистая лихорадка, клещевая пятнистая лихорадка острова Флиндерса (Австралия), риккетсиозы, вызываемые Rickettsia slovaca, Rickettsia aeschlimannii, Rickettsia parkeri. Они либо ранее не регистрировались, либо принимались за инфекции другой этиологии.

Методы, предлагаемые молекулярной биологией, прежде всего полимеразная цепная реакция и секвенирование нуклеиновых кислот, позволили не только с точностью характеризовать генетический материал микроорганизмов, но и в ряде случаев выявлять возбудителей новых инфекционных заболеваний (Chen S.M., et al., 1994, Nichol S.T., et al., 1993). Молекулярно-биологические методы стали особенно актуальными в риккетсиологии, поскольку микроорганизмы, относящиеся к порядку Rickettsiales, являются облигатными внутриклеточными паразитами, неспособными расти на искусственных питательных средах. Возбудитель ряда риккетсиозов был идентифицирован в результате амплификации (с последующим секвенированием полученных ампликонов) в ПЦР генов риккетсий в материалах от больных людей без выделения чистой культуры. Это заболевание, носящее аббревиатуру TIBOLA (tick-borne lymphadenopathy), вызываемое Rickettsia slovaca, и заболевание, вызываемое Rickettsia aeschlimannii (Preterms A.-M., et al., 2002, Raoult D., et al., 1997, 2002).

Применение «золотого стандарта» идентификации причины инфекционного заболевания (Koch R., 1891, Rivers T.M., 1937), а именно выделение чистой культуры возбудителя, в риккетсиологии является сложным и не всегда достижимым. Другие способы установления этиологического диагноза в риккетсиологии также не всегда достоверны. Серологический метод не является достаточно точным, поскольку для рик-кетсий характерны перекрестные серологические реакции, как между собой, так и с неродственными микроорганизмами, например Proteus spp. и Legionella spp. (La Scola В., et al., 1997, Raoult D., et al., 1995, Weil E., et al., 1916). Клинико-лабораторная кар-

вСф^^^да^ кри-

тина заболевания зачастую вариабельна и не

териев для каждого конкретного риккетсиоза (La Scola В., et al., 1997). Таким образом, амплификация генов риккетсий в материалах из различных тканей и сред организма человека с последующим секвенированием ампликонов для видовой идентификации оказалась ценным методом установления диагноза в риккетсиологии.

Одним из первых описанных в СССР риккетсиозов человека, передаваемых иксо-довыми клещами, является клещевой сыпной тиф Северной Азии (клещевой риккетси-оз, клещевой сыпной тиф), активные эндемические очаги которого распространены в азиатской части Российской Федерации. С 1979 по 1997 гг. в Российской Федерации выявлено 23980 случаев этой инфекции с ростом заболеваемости более чем в 8 раз (Шпынов С.Н., 1999). Показатели заболеваемости также увеличиваются и в 2001 году составили 2,38 на 100 тыс. населения. Это может быть объяснено как ростом активности очагов клещевого сыпного тифа, так и интенсификацией природопользования и контактов человека с природными очагами и улучшением диагностики. Выделение возбудителя, Rickettsia sibirica, произошло в Восточной Сибири в 1937-1939 гг. После этого все острые инфекционные заболевания, клинически, эпидемиологически и серологически (в РСК с растворимым антигеном R sibirica) соответствующие клещевому сыпному тифу в Сибири и на Дальнем Востоке России, относили к этому заболеванию. Немногочисленные штаммы риккетсий из дальневосточного региона, также отнесенные к R. sibirica, были утрачены.

Еще с середины прошлого века исследователи отмечали отличия клинико-эпидемиологических показателей заболевания, считавшегося клещевым сыпным тифом Северной Азии на Дальнем Востоке России, от заболевания в классических очагах клещевого риккетсиоза Северной Азии в Центральной Сибири (Маевский М.М., 1947, Томилка Г.С., 1987). Пик заболеваемости в Хабаровском крае возникал в июне-июле, что на два месяца позднее, чем, например, в Алтайском крае, среди заболевших отмечалось большое количество лиц пожилого возраста, яркость сыпи выражена меньше (Томилка Г.С., 1987). Были выявлены также и отличия в микробиологических свойствах возбудителя, выделенного на Дальнем Востоке (Сомов Г.П., 1966, Шапиро М.И., 1959). Тем не менее, выделенные в Приморском крае штаммы также были отнесены к R. sibirica. Нужно отметить, что методы исследования, применявшиеся в то время, не позволяли провести четкую видовую дифференциацию риккетсий. Соответственно этому, для серологической диагностики заболевания у человека на Дальнем Востоке РФ использовали растворимый (группоспецифический) антиген, приготовленный из штамма «Нецветаев» R sibirica Подтверждение клинического диагноза клещевого сыпного тифа Северной Азии на Дальнем Востоке с помощью серологических методов

при исследовании с антигенами R sibirica колебалось в различных исследованиях от

53 до 95% (Киреева Р.Я., 1974).

Указанные особенности и различия клинико-эпидемиологических признаков клещевого риккетсиоза на Дальнем Востоке Российской Федерации по сравнению с регионами Сибири послужили поводом для подробного изучения этиологии клещевого риккетсиоза в этом регионе.

В прилежащих районах Китая в последние годы было выделено несколько новых штаммов риккетсий (Fan M.Y., et al., 1999, Wang J.W., et al., 1987, Yu X., et al., 1993). Большинство штаммов оказалось идентичными Rickettsia sibirica, однако некоторые были идентифицированы как новые виды. Одним из таких штаммов является штамм

054 или Rickettsia heilongjiangensis, выделенный из клещей Dermacentorsylvarum в северной провинции Хэйлунцзян КНР, непосредственно граничащей с Хабаровским краем. Связывание антител в сыворотках переболевших людей в Китае с антигеном этой риккетсии предполагает патогенность ее для человека (Lou D., et al., 1989).

Цель работы: идентифицировать возбудителя клещевого риккетсиоза на Дальнем Востоке России с помощью молекулярно-биологических методов и дать клинико-эпидемиологическую характеристику этого заболевания.

В соответствии с целью поставлены следующие задачи исследования:

1. Провести оценку эпидемиологической ситуации по клещевому риккетсиозу в Хабаровском крае РФ и выявить ее особенности по сравнению с регионами выделения классических штаммов R sibirica.

2. Обследовать стандартными методами больных острыми инфекционными заболеваниями, связанными с присасыванием иксодовых клещей, и дать им эпидемиологическую и клиническую характеристику.

3. Провести исследование сывороток больных на наличие антител к антигенам риккетсий группы пятнистой лихорадки (Rickettsia sibirica; Rickettsia heilongjiangensis; Rickettsia Conorii) в РНИФ с корпускулярным антигеном.

4. Разработать тест-систему на основе ПЦР для определения ДНК риккетсий в материалах с потенциально низким ее содержанием. Полученные ампликоны при последующем секвенировании должны позволять точно идентифицировать вид риккетсии.

5. Исследовать разработанным методом материалы от больных (ДНК, выделенную из крови и биоптата первичного аффекта), идентифицировать полученные при ПЦР

результаты при помощи секвенирования ампликонов для определения этиологии рик-кетсиальной инфекции в Хабаровском крае.

6. Дать характеристику выявленным бактериальным агентам методом построения филогенетического дерева.

7. Провести эпидемиологическое обследование природных очагов клещевого рик-кетсиоза, исследовать собранных в очагах и с больных иксодовых клещей молекуляр-но-биологическими методами для выяснения их инфицированности и определения вида риккетсий.

Научная новизна. Проведенное исследование позволило выявить этиологический агент клещевого риккетсиоза на Дальнем Востоке Российской Федерации. Молекуляр-но-биологическими методами у больных клинически диагностированным клещевым риккетсиозом выявлены гены Rickettsia heilongjiangensis, что доказывает его этиологическую роль. Среди широкой выборки с помощью молекулярно-биологических методов выявлено 18 больных клещевым риккетсиозом, а серологическими методами - 52 больных. Описана клиническая картина этого заболевания, ему предложено название: «дальневосточный клещевой риккетсиоз».

Вследствие клинического сходства с другими риккетсиозами группы КПЛ и серологических перекрестных реакций это заболевание ранее принималось за клещевой сыпной тиф Северной Азии, распространенный в Сибири и на Алтае.

Установлено, что основным переносчиком дальневосточного клещевого риккетсио-за являются иксодовые клещи Haemaphysalis concinna, инфицированность которых в изучаемых биотопах составила 28,13%. Клещи Haemaphysalisjaponica douglasi также могут являться переносчиками дальневосточного клещевого риккетсиоза, инфициро-ванность достигает 4,48%.

Изучены эпидемиологические особенности как в группе официально регистрируемого клещевого риккетсиоза, так и в группе больных с диагнозом риккетсиоза, подтвержденным молекулярно-биологическими методами. Выявленные особенности совпадали в обеих группах и оказались следующими: преобладание среди заболевших лиц старших возрастных групп, пик заболеваемости в конце июня-июле.

Впервые проведено сравнение взаимодействия сывороток больных дальневосточным клещевым риккетсиозом с антигенами различных риккетсий, в том числе этиологического агента {Rickettsia heilongjiangensis) и антигена возбудителя клещевого сыпного тифа Северной Азии {Rickettsia sibirica) Исследованные сыворотки реагировали

не только с антигеном R. heilongjiangensis, но также и с антигенами других риккетсий, в т.ч. R. sibirica и R. сопогИ, однако, как правило, в меньшем разведении.

Разработана модификация ГЩР с использованием «гнездовых» праймеров на основе гена цитрат-синтазы (gltA) риккетсий. Она позволяет обнаруживать генетический материал любых риккетсий в клиническом материале и клещах.

Впервые секвенированы и помещены в базу генетических данных GenBank гены отрВтиповых штаммов Rickettsia heilongjiangensis и Rickettsia hulinensis. Выявлены и по согласованию с авторами (J.Z. Zhang и др.) исправлены неточности в опубликованных в GenBank нуклеотидных последовательностях генов gltA и отрА Rickettsia heilongjiangensis.

В клещах Haemaphysalisjaponica douglasi впервые была обнаружена ДНК Candida-tus Rickettsia tarasevichiae.

Впервые выявлена ДНК новой риккетсии, генетически значительно отличающейся от всех известных. Ей дано предварительное название Candidatus Rickettsia principis.

Научно-практическая ценность и реализация результатов работы

Полученные данные свидетельствуют о том, что заболевание, традиционно считавшееся на Дальнем Востоке Российской Федерации клещевым сыпным тифом Северной Азии, вызывается не Rickettsia sibirica, а недавно описанной Rickettsia heilongjiangensis. Поскольку возбудитель клещевого риккетсиоза на Дальнем Востоке отличается от микроорганизма, традиционно считавшегося этиологическим агентом этого давно известного заболевания, предлагается ввести новую нозологическую единицу: «дальневосточный клещевой риккетсиоз», относящийся к группе КПЛ и вызываемый Rickettsiaheilongjiangensis.

Организациям практического здравоохранения рекомендуется включить обследование на дальневосточный клещевой риккетсиоз в комплекс лабораторных обследований заболевших после присасывания клеща.

Идентификация возбудителя дальневосточного клещевого риккетсиоза предоставляет возможность проводить специфическую диагностику. Корпускулярный антиген этиологического агента болезни {Rickettsia heilongjiangensis) позволяет проводить принципиально более точную диагностику, поэтому именно его следует применять для проведения серологических исследований в эндемичных очагах.

Разработана чувствительная и специфичная модификация ПЦР на ген цитрат-синтазы риккетсий с использованием «гнездовых» праймеров. Она может применяться как в клинической диагностике, так и в научно-исследовательской работе.

Исследование биоптатов первичных аффектов на наличие ДНК риккетсий является значительно более успешным, чем исследование фибриновых сгустков. Это позволяет рекомендовать для клинических реакций использовать материалы биоптатов первичного аффекта.

Материалы диссертации представлены на:

• Конференции общества инфекционистов Хабаровского края, г. Хабаровск, 2001 г.

• Краевом конкурсе молодых ученых, г. Хабаровск, 2001 г.

• Конференции отдела эпидемиологии ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН, г. Москва, 2002 г.

• Научных конференциях справочного центра ВОЗ, лаборатории риккетсиозов Средиземноморского университета, г. Марсель, 2003, 2004 гг.

• 14-м ЕССМШ, Прага, 2004 г.

По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, в базу генетических данных ОепБапк внесено 6 отдельных позиций.

Апробация диссертации состоялась на совместной конференции отдела природно-очаговых болезней и отдела эпидемиологии ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН 21 апреля 2004 года.

Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста, включает 10 таблиц и 21 рисунок. Состоит из введения, обзора литературы, 6 глав, заключения, выводов и списка литературы. Библиография включает 37 работ, опубликованных на русском языке и 106 работ на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Для решения поставленных задач использовали эпидемиологические, статистические, клинико-лабораторные, зоолого-паразитологические, серологические и молеку-лярно-биологические (генетические) методы исследования.

Материалами для исследований явились данные отчетной документации Федерального центра государственного санитарно-эпидемиологического надзора Министерства Здравоохранения Российской Федерации, Фонда обязательного медицинского страхования Хабаровского края, истории болезни больных, сыворотки, собранные в динамике заболевания, ДНК, извлеченная из фибринового сгустка (лейкоцитарной взвеси) и

кожного биоптата первичного аффекта, развившегося на месте присасывания клеща, иксодовые клещи, собранные в природных очагах риккетсиоза в Хабаровском крае.

Больные. Исследование проводилось в течение мая-августа 2002-2003 годов. В исследуемую группу были включены все больные, госпитализированные в инфекционное отделение городской больницы №10 г. Хабаровска и соответствующие хотя бы одному из следующих критериев: установленный в приемном отделении диагноз «клещевой сыпной тиф Северной Азии»; наличие в анамнезе контакта с иксодовыми клещами (присасывание, снятие ползающих клещей с себя, раздавливание руками клещей, снятых с себя или домашних животных и т.п.); острое лихорадочное заболевание, развившееся после пребывания в природных очагах риккетсиозов при отсутствии клинических, эпидемиологических, серологических или иных лабораторных признаков других заболеваний.

Указанным характеристикам отвечали 65 больных, наблюдаемых в 2002 году и 42 больных, наблюдаемых в 2003 году.

При наличии очага некроза и воспаления на коже в месте присасывания клеща (первичный аффект) брали биоптат этого участка. Истории болезни были проанализированы стандартными статистическими методами.

Сбор и исследование сывороток от больных людей. Сыворотки были собраны и заморожены при -20°С. В исследование были взяты только парные сыворотки, первая из которых была собрана в лихорадочный период до начала лечения, а вторая спустя 4-18 дней после первой. Было протестировано 47 парных сывороток от больных 2002 года и 28 сывороток от больных 2003 года. Для проведения исследований сыворотки были высушены на стандартной бумаге для иммуноблоттинга при комнатной температуре для транспортировки до места проведения серологических реакций (84, 85). Исследование проводилось методом непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ). Использовали антигены следующих штаммов микроорганизмов: Rickettsia heilongjiangensis (штамм 054, АТСС VR-1524), Rickettsia sibirica (штамм 246, АТСС VR-151),Rickettsia сопотп (штамм Moroccan АТСС VR-141),Coxiella burnetii (штамм Nine Mile, АТСС VR-6l5),Orientia tsutsiigaimishi (смесь штаммов Gilliam, Karp, Kato и Ка-wazaki),Ehrlichia.chaffeensis (штамм Arkansas)Anaplasma phagocytophilum (штамм Webster), Bartonella henselae (штамм Houston-1, ATCC-49882)Bartonella quintana (штамм Oklahoma).

Цельные антигены из указанных микроорганизмов для исследования в РНИФ готовили в лаборатории риккетсиологии Средиземноморского Университета (г. Марсель).

ДНК, выделенная из фибринового сгустка и кожных биоптатов. Забор крови для выделения ДНК проводили непосредственно после поступления больного в стационар на высоте лихорадки и до начала лечения антибиотиками. Выделение ДНК проводили с помощью коммерческих наборов колонок, содержащих сорбенты (Quiagen, Japan).

Штаммы микроорганизмов. Для получения последовательностей генов отрА, отрВ и gltA Rickettsia heilongjiangensis и Rickettsia hulinensis использовали типовые штаммы этих микроорганизмов (штамм HL-93 Rickettsia hulinensis и штамм 054 Rickettsia heilongjiangensis), хранящиеся в коллекции лаборатории риккетсиологии медицинского факультета Средиземноморского университета, г. Марсель, Франция.

Сбор, идентификация и хранение иксодовых клещей. Сбор иксодовых клещей проводили на территории Хабаровского края в местах предположительного контакта больных с клещами. Сбор имаго клещей проводился методом сбора на себя. За период 2002-2003 годов было собрано 67 имаго H.japonica douglasi (37 самок и 30 самцов); 32 Н. concinna (21 самка и 11 самцов); 1 самка Dermacentor sylvarum, и 256 клещей Ixodes persulcatus (133 самок и 123 самца). Сбор клещей проводили 1 по 25 июня, что предшествует многолетним пикам заболеваемости клещевым риккетсиозом на юге Хабаровского края. Два насосавшихся клеща рода Haemaphysalis были сохранены больными, у которых через некоторое время после присасывания клещей развилось заболевание. Вид клещей был определен согласно определительным таблицам по Б.И. Померанцеву и верифицирован сотрудниками зоологического отдела Хабаровской Противочумной станции МЗ РФ.

Выделение ДНК из иксодовых клещей. ДНК из иксодовых клещей извлекали помощью коммерческих наборов колонок, содержащих сорбенты аналогично выделению из кожных биоптатов.

Олигонуклеотидные праймеры. Все праймеры, использованные в данном исследовании были произведены Eurogentec (Seraing, Belgium).

Полимеразная цепная реакция, секвенирование ампликонов и филогенетические исследования. В качестве скрининговой методики для идентификации ДНК рик-кетсий в материалах от больных и клещей мы использовали методику гнездовой (nested) ПЦР с модифицированными нами праймерами. Для амплификации полного гена использоали праймер CSendR, комплементарный крайнему 3'-участку гена gltA. Таким образом, комбинация праймеров CS2d и CSendR должна амплифицировать целиком ген цитрат-синтазы риккетсий группы КПЛ.

Для более подробной идентификации риккетсий использовали ген отрА, кодирующий основной поверхностный антиген риккетсий группы КПЛ, 190-кДа белок, и ген отрВ, кодирующий 120-кДа поверхностный антиген всех риккетсий. Гены были порционно амплифицированы и секвенированы.

Амплификация ДНК проводилась стандартными методами в амплификаторах с нагревающимися крышками производства фирм «Biometra», «Eppendorf» и «Applied Biosystems». Для проведения реакций использовали смесь Taq и Pfu под коммерческим названием «Elongase» производства GibcoBRL. Использовали соответствующие положительные и отрицательные контроли.

Продукты ПЦР перед проведением прямого секвенирования очищали с использованием специального набора QIAquick PCR purification kit (производства Qiagen, Франция). Реакция секвенирования проводилась дидеокси-методом (метод Sanger) при помощи коммерческого набора реактивов D-rhodamine terminator cycle DNA sequencing kit (Applied Biosystems, Foster City, Calif.) согласно инструкциям производителя. Продукты реакции подвергались электрофорезу на автоматическом секвенсере ABI Prism 377 sequencer (Applied Biostems). Полученные результаты обрабатывали и сопоставляли с использованием программного обеспечения AutoAssembler и Genetix-Win 5.I.

Последовательности генов, используемые для сравнения, были получены из базы данных GenBank, выровнены с помощью программного обеспечения (alignment), а затем проверены вручную для сохранения совпадения кодонов при выравнивании. Сомнительно выровненные участки и крайние З'-и 5'- участки, не имеющие гомологии во всех генах, были удалены из дальнейшего анализа. Филогенетические деревья были построены методами neighbour-joining, UPGMA и minimum evolution, используя программное обеспечение MEGA2 Version 2.1. При построении филогенетических деревьев для проверки достоверности использовали показатель bootstrap с повторением 100.

Эпидемиологическая характеристика клещевого риккетсиоза.

Клещевой риккетсиоз Северной Азии характеризуется природной очаговостью и трансмиссивным механизмом передачи. Источниками и переносчиками инфекции являются строго определенные виды иксодовых клещей, очаги клещевого риккетсиоза привязаны к их ареалу. Заболеваемость в регионах обитания клещей колеблется в пределах 7-40 на 100 тысяч населения. Ежегодно в России регистрируется 2500-3500 случаев клещевого риккетсиоза. В последние десятилетия заболеваемость имеет четко выраженную тенденцию к росту. С 1995 по 2001 год прирост заболеваемости составил 54% для общей и 55% для детской заболеваемости. Это может быть объяснено увели-

чением частоты контактов человека с переносчиками в природных очагах инфекции; увеличением прослойки населения с различными иммунодефицитами, демографическим сдвигом в сторону старения населения, что, в свою очередь ведет к повышению восприимчивости населения к инфекционным заболеваниям; улучшением диагностических возможностей современной медицины. Кроме того, многолетние наблюдения за клещевым риккетсиозом, равно как и за другими природно-очаговыми заболеваниями, позволяют сделать вывод о периодических спадах и подъемах заболеваемости, которые непосредственно связывают с циклическими изменениями численности животных-резервуаров и переносчиков инфекционных заболеваний.

Выявленные тенденции указывают на то, что клещевой риккетсиоз продолжает оставаться актуальной проблемой для российского здравоохранения. Для уточнения значимости этого заболевания для здравоохранения Хабаровского края нами проведен анализ заболеваемости клещевым риккетсиозом в крае по официально регистрируемым данным.

Клещевой риккетсиоз регистрируется в южных административных районах Хабаровского края: Амурском, Бикинском, Вяземском, районе имени Лазо, Нанайском, Ульчском, Комсомольском и Хабаровском сельском районах. По оценке на начало 2004 года в этих районах и городах Хабаровске и Комсомольске-на-Амуре проживает 1203,3 тысяч человек, что составляет 84,4% от общей численности населения Хабаровского края. Поскольку общая численность населения края заведомо больше численности населения, проживающего в южных районах, нами были отдельно вычислены показатели заболеваемости в южных районах Хабаровского края в совокупности и в каждом районе отдельно. В некоторых районах Хабаровского края, где основная масса населения проживает в небольших населенных пунктах, находящихся в природных очагах, заболеваемость оказалась очень высокой. Например, в 2003 году заболеваемость населения в Нанайском районе 102,56 на 100 тысяч населения, а в Вяземском районе в 2001 году - 120,63 на 100 тысяч населения.

Заболевание обладает выраженной сезонностью и основная масса регистрируемых пациентов поступает в амбулатории и стационары в течение трех летних месяцев. Поэтому в летний период такие больные составляют значительную или основную массу поступающих в инфекционные стационары Хабаровского края.

Восточная Сибирь и Забайкалье являются классическими очагами клещевого рик-кетсиоза Северной Азии. В Красноярском и Алтайском краях, Новосибирской области были выделены многочисленные штаммы. При сравнении литературных данных с

данными, полученными нами при анализе заболеваемости клещевым риккетсиозом в Хабаровском крае, были выявлены следующие основные отличия:

1. В Хабаровском крае на протяжении многолетних наблюдений отмечается очень небольшая детская заболеваемость. В отличие от регионов Сибири, где дети до 14 лет составляют до трех четвертей заболевших, в Хабаровском крае количество их не превышает 10% (рисунок 1).

2. Значительно отличается сезонность заболевания (рисунок 2). В регионах Сибири, в частности Красноярском крае, основной пик заболеваемости приходится на май, когда регистрируется до 75% от всех заболевших. Остальные заболевают в апреле, июне и июле. Такая сезонность совпадает с активностью классических переносчиков клещевого сыпного тифа Северной Азии, клещей рода БегтасеМог, В августе и сентябре наблюдаются единичные больные. В Хабаровском крае пик приходится напротив, на июль. Основная масса (90%) заболевших регистрируется в июне-августе. Следует отметить, что такой пик заболеваемости совпадает с пиками активности клещей Haemaphysalis сопстпа, которые считаются основными переносчиками клещевого риккетсиоза в Хабаровском крае.

Рисунок 1. Удельный вес детей в возрастной структуре больных клещевым риккет-сиозом в Хабаровском и Красноярском краях

Рисунок 2. Сезонность клещевого риккетсиоза Северной Азии в Хабаровском и Красноярском краях

Была выделена группа из 18 больных, у которых молекулярно-биологическими методами была обнаружена Rickettsia heilongjiangensis. Анализ эпидемиологических данных этой группы больных показывает, что заболевание в целом сходно с другими клещевыми риккетсиозами группы клещевой пятнистой лихорадки. Эпидемиологические отличия от клещевого риккетсиоза, вызываемого Rickettsia sibirica и распространенного в регионах Сибири, совпадают с особенностями, выявленными при сравнении официально регистрируемых данных.

Результаты обследования эпидемических очагов.

При выборе мест сбора иксодовых клещей руководствовались эпидемиологическими данными, полученными при опросе больных.

Вид I.persulcatus оказался безусловно доминирующим в обследуемых районах. Он составил от 65 до 90% среди всех собранных клещей.

Клещи Н. concinna и H.japonica douglasi составляли вторую по частоте встречаемости группу иксодовых клещей. Они, как правило, обитали в одних и тех же биотопах и не отличались друг от друга при макроскопическом исследовании. Вид Н. concinna встречался чаще среди группы собранных клещей рода Haemaphysalis и составлял от 70 до 80%.

За время исследования была собрана только одна самка D sylvarum. Вероятно, этот вид не имеет большого значения в передаче инфекций на юге Хабаровского края.

Результаты молекулярно-биологического обследования иксодовых клещей.

При исследовании в «гнездовой» ПЦР единственной самки клеща D.sylvarum не было выявлено ДНК риккетсий.

При исследовании случайной выборки из 35 клещей I.persulcatus было выявлено, что 34 из 35 клещей содержат ДНК риккетсий. Все ампликоны были секвенированы. Они оказались полностью идентичными друг другу, при сравнении полученной из клещей последовательности было обнаружено, что они на 100% идентичны Candidatus R.tarasevichiae. Других видов риккетсий в клещах обнаружено не было.

При исследовании собранных клещей H.concinna было выявлено, что 28,13% клещей этого вида содержат ДНК риккетсий. Результаты секвенирования показали, что вся амплифицированная ДНК принадлежит R.heilongjiangensis. Высокая инфициро-ванность клещей этой риккетсией свидетельствует о том, что клещи этого вида могут играть важную роль в передаче инфекции человеку и поддержании очага.

При исследовании клещей //. japonica douglasi выявлено, что 8,96% клещей содержат ДНК риккетсий. Результаты секвенирования показали, что половина (4,48%) из них содержат ДНК R.heilongjiangensis. Инфицированность этого вида достоверно ниже, чем H.concinna, тем не менее, этот вид клещей также может быть переносчиком дальневосточного клещевого риккетсиоза.

«г Rickettsia Astrakhan spotted fever U5972

iL(

r»

L-/

Rickettsia Israeli tick typhus US9727 Rickettsia /rone/AF018074 Rickettsia conorii U59730 Rickettsia sp. DaE1 OOR AF201330 Rickettsia hckettsii R U59729

- Rickettsia afncae ESF 5 U59733 Rickettsia sibirica 246 U59734

'"Rickettsia sp COOPERIAY362704 Rickettsia slovaca U59725

— Rickettsia hulinensis AF172943 Rickettsia heilonaiianqensis AY28Q709

7sL- Rickettsia japonica YM U59724

— Rickettsia ambiyommii AY375163

- Rickettsia sp DnS28 AF120027 R/Citefts/aspRpA4AF120029 r- Rickettsia massiliae Mtu 1 U59719

iL Rickettsia rhipicephali U59721

r Candidates Rickettsia principis Hid54 'roL Candidates Rickettsia principis Hid61 Rickettsia montanensis U74756 I— Rickettsia helvetica C9P9 U59723 Rickettsia sp 101 AF394901 r— Rickettsia sp AT1 AF394896 Rickettsia sp IRS3 AF140706

-Rickettsia sp California 2 AF210692

-Rickettsia akari MK Kaplan U59717

- Rickettsia austraiis Phillips U59718

-Rickettsia prowazekii Brein! U59715

- Rickettsia typhi Wilmington U59714

С

loo L

- Candidates Rickettsia tarasevichiae AF503167

- Rickettsia canadensis U59713

r Male killing Rickettsia from Adalia decempunctata

о!—

Male killing Rickettsia from Adalia bipunctata U59712 -Rickettsia bellii Ac25 AY362703

Рисунок 3. Положение Candidatus Rickettsia principis и R.heilongjiangensis по отношению к другим риккетсиям на основании анализа гена gltA. Шифр обозначает код доступа (accession number) гена в базе данных GenBank.

Остальные клещи содержали ДНК других риккетсий. Один клещ содержал ДНК Candidates R.tarasevichiae. Секвенирование ампликонов гена gltA из двух других клещей показало, что они содержат ДНК другой риккетсии. Поиск в базе данных GenBank показал, что ген gltA значительно отличается от генов всех известных риккетсий. Степень отличия соответствует генетическим критериям нового вида в риккетсиологии. Генетические последовательности гена gltA зарегистрированы под названием статусом Candidatus Rickettsia principis. Гены и размещены в GenBank под номерами AY578114 и AY578115 для двух ампликонов соответственно. На рисунке 3 филогенетическое дерево показывает положение Candidatus Rickettsia principis среди остальных риккртсисследовании в обоих клещах, снятых с заболевших риккетсиозом людей, была обнаружена ДНК (гены gltA и отрА) R.heilongjiangensis.

Результаты серологического обследования больных.

Результаты исследования парных сывороток подтвердили данные, полученные при молекулярно-биологическом исследовании материалов от больных. 34 из 47 парных сывороток 2002 года и 18 из 28 парных (трех в динамике) сывороток 2003 года выявили признаки острой риккетсиальной инфекции у больных. Сыворотки двоих больных с положительными результатами ПЦР не реагировали с антигенами риккетсий, что, возможно, объясняется ранним началом антибиотикотерапии и/или ранним забором второй сыворотки. Сыворотки исследовали с антигенами трех риккетсий -R.heilongjiangensis, R.eonorii и R.sibirica.

У всех больных были выявлены иммуноглобулины классов G и М, последние свидетельствуют об острой инфекции. В динамике у 40 больных наблюдалась серокон-версия, у остальных было выраженное нарастание титра антител в 2-8 раз.

Установлено, что антиген, приготовленный из R.sibirica, реагировал с сыворотками больных слабее всего. Среди 52 сывороток, положительных при исследовании с антигенами R.heilongjiangensis и Rxonorii, 15 не реагировали с антигеном R.sibirica. Сыворотки лишь пяти больных реагировали с одинаковой интенсивностью с антигенами R.heilongjiangensis и R.sibirica.

Сыворотки больных реагировали также и с антигеном Rxonorii. 24 из 52 сывороток были положительными в одинаковых разведениях с антигенами R.heilongjiangensis и R.eonorii, 19 сывороток имели хотя бы один из показателей (уровень IgG и/или IgM хотя бы в одной из исследуемых сывороток) выше для R.heilongjiangensis, а в сыворотках 9 больных хотя бы один показатель даже оказался выше при исследовании с антигеном Rxonorii.

Из проведенных исследований следует, что применение антигена Я^Шпса для диагностического исследования сывороток больных Дальневосточным клещевым рик-кетсиозом является нецелесообразным из-за нерезко выраженной сывороточной перекрестной реакции между Я.яЫпса и R.heilongjiangensis, что не позволяет эффективно использовать применяемый ныне антиген R.sibirica для диагностики дальневосточного клещевого риккетсиоза.

Молекулярно-биологические методы в изучении этиологии клещевого риккет-сиоза в Хабаровском крае.

Изучение материалов от больных проводилось до исследования штаммов риккетсий и клещей с целью исключить вероятность их контаминации ампликонами.

При тестировании 95 образцов ДНК, извлеченной из крови больных в «гнездовой» ПЦР на ген риккетсиальной цитрат-синтазы были получены положительные результаты в 11 образцах. Оценка положительного результата проводилась при сравнении ам-пликона, полученного из материалов от больных, с положительным контролем. Оценка проводилась при помощи электрофореза в 1 % агарозовом геле.

В следующей реакции исследовались 26 образцов ДНК, извлеченной из биоптатов первичного аффекта. Было получено 8 положительных результатов.

Размер ампликонов (382 пары нуклеотидов) полностью совпадал с размером ам-пликона, полученного из положительного контроля.

В итоге положительные результаты были получены от 18 больных (16 больных в 2002 и 2 больных в 2003 году). У одной больной ДНК риккетсии была обнаружена и в крови и в биоптате первичного аффекта.

Процент положительных результатов при исследовании ДНК, выделенной из крови больных (12%) и биоптатов первичного аффекта (31%) достоверно (р<0,01) отличались друг от друга. Таким образом, исследование ДНК, выделенной из первичных аффектов, на наличие ДНК риккетсий является более успешным, чем исследование ДНК, выделенной из фибриновых сгустков.

С помощью разработанной методики был амплифицирован и секвенирован целый ген цитрат-синтазы (1251 пара нуклеотидов) риккетсий из материалов от всех больных. Последовательности были идентичными у всех больных. При поиске в базе данных оказалось, что полученная последовательность отличалась от всех последовательностей, помещенных в GenBank, однако ближе всего была к R. heilongjiangensis.

При проведенном позднее аналогичном секвенировании гена цитрат-синтазы типового штамма R. heilongjiangensis были обнаружены незначительные неточности в по-

следовательности гена, помещенной в ОепБапк, которые были исправлены. Оказалось, что ген типового штамма R. heUongjiangensis и ген цитрат-синтазы, полученный из материалов от всех больных полностью идентичны.

Таким образом, у 18 больных молекулярно-биологическими методами было доказано наличие гена цитрат-синтазы R. heUongjiangensis в крови и биоптате первичного аффекта.

Полученные данные подтвердили при амплификации других риккетсиальных генов в тех же самых образцах. Ген отрА кодирует поверхностный антиген риккетсий группы КПЛ. Из-за ограниченного количества образцов две порции этого гена были ам-плифицированы в 4 образцах ДНК из крови больных и в 4 образцах биоптата первичного аффекта. Были получены последовательности размером 590 и 3182 пар нуклеоти-дов соответственно для 5'- и 3'- участков гена. Сравнение последовательностей этого гена типового штамма R. heUongjiangensis и результатов, полученных от больных, показало 100% их соответствие.

Для дополнительного подтверждения была проведена ПЦР с геном, который еще никогда не был амплифицирован в лабораторных условиях у типового штамма R. heUongjiangensis. Вследствие этого возможность контаминации образца полученными в лаборатории ампликонами практически исключается.

Ген отрВ кодирует 120-кДа поверхностный антиген риккетсий. Его последовательность известна для многих риккетсий, однако до нашего исследования он никогда не был амплифицирован и секвенирован у R heUongjiangensis. Из тех же восьми образцов были получены последовательности гена размером 4852 пар нуклеотидов. Полученная последовательность была идентична у всех больных и не имела 100% совпадения ни с одной последовательностью, помещенной в базу генетических данных ОепБапк.

После проведения амплификации и секвенирования материалов от больных была получена последовательность гена отрВ типового штамма R. heilongjiangensis. При сравнении полученных результатов было обнаружено 100% совпадение последовательностей, полученных от больных и из типового штамма.

Параллельно проводимому исследованию провели также секвенирование гена отрВ типового штамма R.hulinensis. Результаты использовались для проведения анализа и помещены в ОепБапк.

Таким образом, наличие в крови и(или) первичных аффектах больных клинически диагностированным риккетсиозом ДНК (четырех участков трех генов) R. heUongjian-gensis свидетельствует, что именно этот микроорганизм вызывает данное заболевание.

Было проведено исследование для уточнения филогенетической позиции этого микроорганизма по отношению к другим риккетсиям. Филогенетические деревья, построенные тремя разными методами, оказались топологически одинаковыми. Все они показали, что три микроорганизма, R. heilongjiangensis, Rickettsia hulinensis и Rickettsia japonica образуют отдельную хорошо выраженную (bootstrap-показатель равен 100) сестринскую ветвь внутри группы КПЛ. Обе ветви является равно удаленными от непатогенных видов группы КПЛ, таких как Rickettsia rhipicephali и Rickettsia montanen-sis. Это может говорить об обособленном пути филогенетического развития этой группы. Одно из полученных филогенетических деревьев, построенное методом neighbor-joining (NJ) на основании анализа обеих соединенных порций гена отрА и показывающее положение R. heilongjiangensis по отношению к другим риккетсиям группы КПЛ, показано на Рисунке 4.

Нуклеотидные последовательности генов, полученных в данной работе, помещены в базу данных GenBank под следующими номерами: AY26045I для гена отрВ R. heilongjiangensis, AY260452 для гена отрВ R. hulinensis, AY2807I2 для гена отрВ, ам-плифицированного от больных, AY280711 для 5'- и AY280710 для 3'- участка гена отрА и AY280709 для гена gltA R. heilongjiangensis, амплифицированных из материалов от больных.

Рисунок 4. Положение R heilongjiangensis по отношению к другим риккетсиям группы КПЛ на основании анализа обеих порций гена отрА.

Клинико-эпидемиологическая характеристика больных.

У 52 больных по результатам серологического обследования и 18 больных по результатам молекулярно-биологического обследования был подтвержден диагноз рик-

001

кетсиоза. Поскольку серологически установленный диагноз не является достаточно точным для определения видового статуса возбудителя заболевания, было решено проанализировать и представить клинико-эпидемиологические данные только той группы больных, у которых молекулярно-биологическими методами была доказана инфекция К.кеНопдгащетк. Полные данные были собраны у 16 из 18 больных с мо-лекулярно-биологическим подтверждением диагноза. 14 пациентов переболели Дальневосточным клещевым риккетсиозом в 2002 году и 2 больных в 2003 году.

В материалах от обоих больных 2003 года, сохранивших присосавшихся к ним до развития заболевания клещей, также обнаружена ДНК риккетсий - у одного пациента в крови, у другого в биоптате первичного аффекта. Данные по исследованию этих клещей приведены в следующих главах.

Эпидемиологические, клинические и лабораторные данные больных Дальневосточным клещевым риккетсиозом представлены в Таблице 1.

Характерен пожилой возраст заболевших, 75% составляли лица старше 50 лет, половину больных составили пенсионеры. Первый больной заболел 29 мая, последний 25 июля. Основная масса (75%) заболели в последнюю декаду июня и первую декаду июля. На амбулаторном этапе больным, как правило, выставлялся диагноз острого респираторного заболевания, так как самый яркий признак заболевания - пятнистая или ро-зеолезно-папулезная сыпь появлялась у большинства больных на 4-ый - 5-ый день заболевания (в среднем 3,5± 1,8). Половина больных точно указали дату единственного присасывания клеща, что позволило точно вычислить продолжительность инкубационного периода, который составил в среднем 4,5± 1,7 дня (2-7). Каждый четвертый больной отрицал факт присасывания клеща, однако у всех отрицавших при осмотре кожных покровов был обнаружен очаг некротического воспаления визуально неотличимый от первичного аффекта или удален присосавшийся клещ. Более половины (56%) больных подверглись нападению клещей во время нахождения на приусадебном участке, а 37% находились в лесу с целью сбора ягод, грибов, пищевых или лекарственных дикорастущих растений. Пятеро постоянно проживали в сельской местности, остальные проживали в городе Хабаровске, лишь временно выезжая за город.

Все пациенты заболели остро. Заболевание начиналось с лихорадки до 40°С, у всех больных сопровождалось выраженным интоксикационным синдромом с ознобами, слабостью, головной болью. Многие (75%) отмечали головокружение. Боли в мышцах и крупных суставах беспокоили также большинство больных (87,5%). У некоторых больных наблюдались признаки поражения желудочно-кишечного тракта -тошнота (у двоих), жидкий стул 1 -2 раза в день (у одного больного). Характерным признаком за-

болевания явилась сыпь, появлявшаяся в среднем на 3,5±1,8 день заболевания (от 1-го до 7-го) у 87,5% больных. Сыпь у всех больных была неяркая, негустая, крупнопятнистая и/или пятнисто-папулезная. В среднем сыпь держалась 5,6±1,2 дней, достаточно быстро угасая на фоне антибиотикотерапии. Пигментации или иных остаточных явлений после угасания сыпи нами замечено не было. У 87,5% больных на месте предполагаемого или точно указанного места присасывания клеща возникло поражение кожи в виде первичного аффекта. У большинства больных аффект представлял собой очаг воспаления, в центре которого находился участок некроза (покрывающийся позднее коркой) размером 0,5-2,0 см. Воспалительный инфильтрат, окружающий очаг некроза, достигал размером 4,0 см, его окружала область гиперемии кожи, достигавшая 5,5 см. В трех случаях от первичного аффекта по направлению к регионарным лимфатическим узлам шла четко выраженная дорожка подкожного лимфангоита. В одном случае (при легком течении заболевания) первичный аффект представлял собой слегка инфильтрированный гиперемированный участок кожи. Еще в одном случае сформировался инфильтрат, окруженный гиперемией, без очага некроза. Первичный аффект располагался на поясничной области (трое больных), передней поверхности грудной клетки (двое), голени (двое), в ягодичной складке, подмышечной области, на шее, спине, животе, плече и бедре (по одному больному).

Признаки вовлечения сердечно-сосудистой системы были типичны для острого инфекционного заболевания: глухость сердечных тонов (44%), тахикардия (75%), гипотония (37,5%). У 37,5% больных наблюдалось увеличение печени, определяемое пер-куторно и пальпаторно, а у 18,8% - селезенки. Оно сопровождалось повышением активности сывороточных трансфераз в полтора и более (до 4) раз: АлАт (у 56% больных) и АсАТ (у 18,8% больных), при этом серологические маркеры вирусных гепатитов В и С были отрицательными. У двоих больных отмечалось увеличение содержания уровня билирубина (до 24 и 33,6 мкмоль/л), быстро пришедшее к норме.

В общем анализе крови при поступлении в стационар выявили лейкоцитоз у 5 человек и лейкопению у двоих. У всех наблюдался выраженный сдвиг лейкоцитарной формулы влево, количество палочкоядерных нейтрофилов достигало 46%. У 45,5% больных наблюдалось снижение количества тромбоцитов ниже 170.000/мм3, уровень которых нормализовался у всех больных уже через 1-2 дня после начала лечения антибиотиками. У 81,3% больных при поступлении была увеличена СОЭ (до 54 мм/ч). В периоде реконвалесценции перед выпиской (в среднем через 10±1,4 дня после начала болезни) общий анализ крови приходил к норме примерно у половины больных, однако, у 56,3% больных сохранялось увеличенное количество палочкоядерных лейкоци-

тов и у 31,3% увеличенная СОЭ при объективно удовлетворительном состоянии и самочувствии. У всех заболевших при амбулаторном долечивании показатели общего анализа крови приходили к норме.

Таблица 1. Эпидемиологические, клинические и лабораторные данные 16 больных Дальневосточным клещевым риккетсиозом

Показатель Значение

Пол, муж/жен 11/5

Средний возраст (колебания) 54,3±13,5* (18-73)

Средний койко-день 5,5±1,5'

Средний инкубационный период 4,5±1,7'

Вакцинация противклещевого энцефалита 25%

Озноб 100%

Слабость 100%

Головная боль 100%

Головокружение 75%

Миалгии, артралгии 87,5%

Тошнота 12,5%

Анорексия 100%

Сыпь 87,5%

День появления сыпи от начат заболевания 3,5±1.8'

Продолжительность высыпаний 5,6±1,2*

Наличие первичного аффекта 87,5%

Регионарная лимфаденопатия 56,3%

Лимфангоит, ведущий к регионарным лимфатическим узлам 18,8%

Глухость тон» сердца 43,8%

Тахикардия 75%

Гипотония 37,5%

Увеличение печени 37,5%

Увеличение селезенки 18,8%

Нарушения сна (бессонница и/или сонливого) 56,3%

Лейкоцитоз при поступлении встационар(>9.000/мм3) 31,3%

Лейкопения при поступлении в стационар (<4,000/ММ3) 12,5%

Повышенная СОЭ (>15 мм/ч) 81,3%

Тромбоцитопения (<150,000/мм3) 45,5%

Повышенная активность сывороточной АлАТ,>1,5 раз 56,3%

Повышенная активность сывороточной АсАТ,>1,5 раз 18,8%

'-Шп

При сравнении клинико-эпидемиологических признаков Дальневосточного клещевого риккетсиоза с картиной клещевого сыпного тифа Северной Азии, описанной для районов, где были выделены многочисленные штаммы R.sibirica от больных людей, были выявлены некоторые особенности:

• менее выраженная, зачастую неяркая и редкая сыпь,

• наличие сыпи не у всех, а лишь у 87,5% больных,

• частое по сравнению с инфекцией, вызываемой R.siЫrica, возникновение подкожного лимфангита, ведущего от первичного аффекта к регионарным лимфатическим узлам.

Выводы:

1. В результате ревизии этиологии клещевого риккетсиоза молекулярно-биологическими методами выявлено, что клещевой риккетсиоз в Хабаровском крае вызывается Rickettsia heilongjiangensis. Полученные последовательности генов, амплифицированных у 18 больных, помещены в GenBank.

2. Возбудитель клещевого риккетсиоза в Хабаровском крае, R. heilong/iangensis, является представителем подгруппы Rickettsia japonica группы КПЛ, что подтверждено филогенетическим исследованием на основании анализа впервые се-квенированного гена отрВ.

3. Показано, что клещевой риккетсиоз в Хабаровском крае (дальневосточный клещевой риккетсиоз) является эндемичным заболеванием, распространенным только в южных административных районах. Его особенностями являются пик заболеваемости в июле и преимущественная подверженность заболеванию лиц старших возрастных групп, что объясняется особенностями биологии переносчика и хозяйственной деятельности человека.

4. Переносчиками клещевого риккетсиоза, вызываемого Rickettsia heilongjiangensis (дальневосточного клещевого риккетсиоза), являются часто встречающиеся в Хабаровском крае клещи видов Haemaphysalis concinna (основной, инфицирован-ность 28,13%) и Haemaphysalis japonica douglasi (второстепенный, инфицирован-ность 4,48%), в отличие от малораспространенного клеща Dermacentor sylvarum, переносчика клещевого риккетсиоза Северной Азии,.

5. Rickettsia sibirica (возбудитель клещевого сыпного тифа Северной Азии) не был выявлен ни в пробах от больных, ни в иксодовых клещах на юге Дальнего Востока.

6. Разработана высокочувствительная и специфичная тест-система на основе ПЦР для индикации наличия патогенных риккетсий в средах и тканях человека. Она позволяет целиком секвенировать ген цитрат-синтазы, что было использовано для идентификации риккетсий и для филогенетического анализа

7. Выявлены клинические особенности инфекции, вызванной Rickettsia heilongjian-gensis, при анализе случаев, этиология которых доказана методами молекулярной биологии: наличие неяркой сыпи только у 87,5% больных, склонность к образованию подкожных лимфангоитов.

8. В клещах вида Haemaphysalis japonica douglasi обнаружена ДНК риккетсий нескольких видов, в том числе R.heilongjiangensis (4,48%), Candidatus Rickettsia ta-rasevichiae (1,49%) и новой риккетсии, предварительно названной Candidatus Rickettsia principis (2,99%).

9. Растворимый антиген R.sibirica, применяющийся в практике с целью диагностики дальневосточного клещевого риккетсиоза (возбудитель Rheilongjiangensis) группоспецифичен и дает перекрестные реакции. Его применение для лабораторной диагностики дальневосточного клещевого риккетсиоза нецелесообразно, так как он менее специфичен, чем антиген возбудителя, R. heilongjiangensis

Основные положения отражены в следующих публикациях:

1. Медянников О.Ю., Мартыненко А.Ю. Клинико-лабораторная характеристика клещевого риккетсиоза Северной Азии на юге Хабаровского края // Материалы 55-й научной студенческой конференции. - Хабаровск, 1998. - С. 60.

2. Медянников О.Ю. Особенности течения клещевого риккетсиоза Северной Азии у пожилых людей // Здоровье пожилых людей: проблемы, пути решения. Материалы первой Хабаровской краевой геронтологической конференции. - Хабаровск, 2000. - С.97.

3. Медянников О.Ю. Особенности эпидемиологии клещевого риккетсиоза Северной Азии на юге Дальнего Востока // Вестник РГМУ: Материалы Пироговской межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых. - 2000. -№2(12).-С. 27.

4. Медянников О.Ю., Сидельников Ю.Н., Иванов Л.И., Здановская Н.И. Грануло-цитарный ,эрлихиоз человека: предпосылки и доказательства существования новых трансмиссивных инфекций на юге Дальнего Востока. // Актуальные аспекты природноочаговых болезней. Материалы межрегиональной научно-практической конференции 16-17 октября 2001 г., посвященной 80-летию Омского НИИПИ. -Омск, 2001. С. 196-197.

5. Медянников О.Ю., Сидельников Ю.Н. Развитие хронического Лайм-боррелиоза после излечения клещевого риккетсиоза при одновременном инфицировании // Клиническая медицина. - №6. - 2002. С.64-66.

6. O.Mediannikov, Y.Sidelnikov, L.Ivanov, E.Mokretsova, P.-E.Fournier, I.Tarasevich and D.Raoult. Acute tick-bome rickettsiosis caused by Rickettsia heilongjiangensis in Russian Far East. Emerg. Infect. Dis. 10(5):810-817.

7. O.Mediannikov, Y.Sidelnikov, L.Ivanov, E.Mokretsova, P.-E.Fournier, I.Tarasevich, and D.Raoult. New acute tick-borne rickettsiosis caused by Rickettsia heilongjiangensis in the Russian Far East. In: Clinical Microbiology an Infection. The official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 14th European Congress of Clinical Microbiology an Infectious Diseases, Prague, Czech Republic, 1-4 May 2004. P.37.

Считаю приятным долгом выразить благодарность своим научным руководителям: академику РАМН, доктору биологических наук, профессору Ирине Владимировне Та-расевич и доктору медицинских наук, профессору Юрию Николаевичу Сидельникову за пробуждение интереса ко всем областям естествознания и культуры, всестороннюю помощь и постоянное внимание.

Искренне благодарен сотрудникам лаборатории риккетсиологии Медицинского факультета Средиземноморского Университета (г. Марсель, Франция) во главе с профессором Didier Raoult за бескорыстную помощь в проведении исследований.

Выражаю свою признательность за всестороннее содействие и восхищение искренней любовью к науке сотрудникам Хабаровской противочумной станции МЗ РФ во главе с Леонидом Ивановичем Ивановым; огромную благодарность сотрудникам кафедры инфекционных болезней ДВГМУ и инфекционного отделения 10 городской больницы г. Хабаровска, руководимыми профессором, доктором медицинских наук Геннадием Степановичем Томилкой, за всестороннее содействие в проведении исследований.

Выражаю глубокую признательность ученому секретарю НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи, доктору медицинских наук профессору Екатерине Владимировне Русаковой.

иго 1zi

521

Последние десятилетия XX века характеризуются активизацией эпидемического проявления природно-очаговых риккетсиозов, объединяемых в группу клещевой пятнистой лихорадки (КПЛ) в различных регионах мира (27, 108, 117). Риккетсиозы являются важной проблемой инфекционной патологии многих стран, в том числе и России (23, 26, 108). За последние годы описано несколько заболеваний, вызываемых ранее неизвестными риккетсиями. Яркими примерами являются астраханская пятнистая лихорадка, японская пятнистая лихорадка, клещевая пятнистая лихорадка островов Флиндерса, а также риккетсиозы, вызываемые Rickettsia slovaca, Rickettsia aeschlimannii, Rickettsia parkeri. Эти заболевания либо ранее не регистрировались, либо принимались за инфекции другой этиологии.

Методы, предлагаемые молекулярной биологией, прежде всего полимеразная цепная реакция и секвенирование нуклеиновых кислот, позволили не только с высокой чувствительностью и точностью характеризовать генетический материал микроорганизмов, но и в ряде случаев выявлять возбудителей новых инфекционных заболеваний (53, 87). Значительно облегчилась задача определения инфекционной причины заболеваний с ранее неизвестной этиологией (51, 111), достигнут значительный прогресс в решении генеральных вопросов эволюции живых организмов, например происхождения эукариотической клетки (58, 72, 138, 140). Молекулярно-биологические методы стали особенно актуальными в отношении риккетсий, поскольку микроорганизмы, относящиеся к порядку Rickettsials, являются облигатными внутриклеточными паразитами, неспособными расти на искусственных питательных средах. Заболевание, носящее аббревиатуру TIBOLA (tick-borne lymphadenopathy), и встречающееся в Венгрии, Испании, Словакии и Франции, вызывается Rickettsia slovaca. Это было неоднократно доказано при амплификации ДНК этого микроорганизма, ранее выделенного в чистой культуре из клещей, из материалов от больных людей (аспираты лимфоузлов, кровь, кожный биоптат) (102, 107). Чистой культуры возбудителя от человека, однако, получено до сих пор не было, а диагноз устанавливается серологически и при обнаружении в ПЦР генов этой риккетсии в материалах от больных людей. Аналогично этому в Южной Африке было описано заболевание, вызываемое Rickettsia aeschlimannii (99, 106). Оно было доказано у нескольких больных в результате амплификации (с последующим секвенированием полученных ампликонов) в ПЦР генов этой риккетсии в материалах от больных людей.

Применение «золотого стандарта» идентификации причины инфекционного заболевания (77, 113), а именно выделение чистой культуры возбудителя, в риккетсиологии является сложным и не всегда достижимым. Другие способы установления этиологического диагноза в риккетсиологии также не всегда достоверны. Серологический метод не является достаточно точным, поскольку для риккетсий характерны множественные и выраженные перекрестные серологические реакции, как между собой, так и с совершенно неродственными микроорганизмами, например Proteus spp. и Legionella spp. (78, 105, 137). Клинико-лабораторная картина заболевания зачастую вариабельна и не имеет выраженных опознавательных критериев для каждого конкретного риккетсиоза (78). Таким образом, амплификация генов риккетсий в материалах из различных тканей и сред организма человека с последующим секвенированием ампликонов для видовой идентификации оказалась ценным методом установления диагноза в риккетсиологии.

Одним из первых описанных в СССР риккетсиозов человека, передаваемых иксодовыми клещами, является клещевой сыпной тиф Северной Азии (клещевой риккетсиоз, клещевой сыпной тиф), активные эндемические очаги которого распространены в азиатской части Российской Федерации. Начиная с 30-х годов прошлого века отмечали периоды роста и снижения заболеваемости, однако за период с 1979 по 1997 гг. в Российской Федерации выявлено 23980 случаев этой инфекции с ростом заболеваемости более чем в 8 раз (34). Показатели заболеваемости также увеличиваются и в 2001 году составили 2,38 на 100 тыс. населения. Это может быть объяснено как ростом активности очагов клещевого сыпного тифа, так и интенсификацией природопользования и контактов человека с природными очагами и улучшением диагностики.

Выделение возбудителя клещевого сыпного тифа Северной Азии, Rickettsia sibirica, произошло в Восточной Сибири в 1937-1939 гг. После этого все острые инфекционные заболевания, клинически, эпидемиологически и серологически (в РСК с растворимым антигеном Rsibirica) соответствующие клещевому сыпному тифу в Сибири и на Дальнем Востоке России, традиционно относили к этому заболеванию. Немногочисленные штаммы риккетсий из дальневосточного региона, также отнесенные к R. sibirica, были утрачены.

Еще с середины прошлого века исследователи отмечали отличия клинико-эпидемиологических показателей заболевания, считавшегося клещевым сыпным тифом Северной Азии на Дальнем Востоке России, от заболевания в классических очагах клещевого риккетсиоза Северной Азии в Центральной Сибири (15, 29). Пик заболеваемости в Хабаровском крае возникал в июне-июле, что на два месяца позднее, чем, например, в Алтайском крае, среди заболевших отмечалось большое количество лиц пожилого возраста, яркость сыпи выражена меньше (29). Были выявлены также и отличия в микробиологических свойствах возбудителя, выделенного на Дальнем Востоке, такие как меньшая вирулентность для лабораторных животных, размножение риккетсий в ядрах 50-60% пораженных клеток, низкие титры антител к антигену ОХ-19 при заражении кроликов, неполная нейтрализация токсического вещества риккетсий в перекрестной реакции между приморскими и эталонными штаммами (22, 32). Тем не менее, выделенные в Приморском крае штаммы также были отнесены к R. sibirica. Нужно отметить, что методы исследования, применявшиеся в то время, не позволяли провести четкую видовую дифференциацию риккетсий.

Соответственно этому, применявшиеся методы диагностики, прежде всего серологической, клещевого сыпного тифа на Дальнем Востоке основывались на принятом мнении об этиологии заболевания. Для диагностики заболевания у человека использовали растворимый (группоспецифический) антиген, приготовленный из штамма «Нецветаев» R. sibirica. Подтверждение клинического диагноза клещевого сыпного тифа Северной Азии на Дальнем Востоке с помощью серологических методов при исследовании с антигенами R. sibirica колебалось в различных исследованиях от 53 до 95% (11).

Указанные особенности и различия клинико-эпидемиологических признаков клещевого риккетсиоза на Дальнем Востоке Российской Федерации по сравнению с регионами Сибири послужили поводом для подробного изучения этиологии клещевого риккетсиоза в этом регионе. В прилежащих районах Китая в последние годы было выделено несколько новых штаммов риккетсий (59, 135, 142). Большинство штаммов оказалось идентичными Rickettsia sibirica, однако некоторые штаммы были идентифицированы как новые виды. Одним из таких штаммов является штамм 054 или Rickettsia heilongjiangensis, выделенный из клещей Dermacentor silvarum в северной провинции Хэйлунцзян КНР, непосредственно граничащей с Хабаровским краем. Наличие антител в сыворотках переболевших людей в Китае предполагает патогенность этого штамма для человека (79).

Цель работы: дать клинико-эпидемиологическую характеристику и изучить этиологию клещевого риккетсиоза на Дальнем Востоке Российской Федерации.

В соответствии с целью поставлены следующие задачи исследования:

1. Провести оценку эпидемиологической ситуации по клещевому риккетсиозу в Хабаровском крае РФ и выявить ее особенности по сравнению с регионами выделения классических штаммов R.sibirica',

2. Обследовать стандартными методами больных острыми инфекционными заболеваниями, связанными с присасыванием иксодовых клещей, и дать им эпидемиологическую и клиническую характеристику;

- 103. Провести исследование сывороток больных на наличие антител к антигенам риккетсий группы пятнистой лихорадки {Rickettsia sibirica; Rickettsia heilongjiangensis; Rickettsia conorii) в РНИФ с корпускулярным антигеном.

4. Разработать тест-систему на основе ПНР для определения ДНК риккетсий в материалах с потенциально низким ее содержанием. Полученные ампликоны при последующем секвенировании должны позволять точно идентифицировать вид риккетсии;

5. Исследовать разработанным методом материалы от больных (ДНК, выделенную из крови и биоптата первичного аффекта), идентифицировать полученные при ПЦР результаты при помощи секвенирования ампликонов для определения этиологии риккетсиальной инфекции в Хабаровском крае.

6. Дать характеристику выявленным бактериальным агентам методом построения филогенетического дерева.

7. Провести эпидемиологическое обследование природных очагов клещевого риккетсиоза, исследовать собранных в очагах и с больных иксодовых клещей молекулярно-биологическими методами для выяснения их инфицированности и определения вида риккетсий.

Научная новизна

Проведенное исследование позволило выявить этиологический агент клещевого риккетсиоза на Дальнем Востоке Российской Федерации. Молекулярно-биологическими методами у больных клинически диагностированным клещевым риккетсиозом выявлены гены Rickettsia heilongjiangensis, что является доказательством того, что именно этот микроорганизм является возбудителем клещевого риккетсиоза. Этот микроорганизм был выделен в 90-х годах 20-го века из клещей Dermacentor silvarum в прилежащей к Хабаровскому краю провинции Китая. Патогенность этого штамма для человека оставалась недостаточно доказанной. Среди широкой выборки с помощью молекулярно-биологических методов выявлено 18 больных клещевым риккетсиозом, а серологическими методами - 52 больных. Описана клиническая картина этого заболевания. Предложено название для этого риккетсиоза группы клещевой пятнистой лихорадки: «дальневосточный клещевой риккетсиоз».

Вследствие клинического сходства с другими риккетсиозами группы КПЛ и серологических перекрестных реакций это заболевание ранее принималось за, клещевой сыпной тиф Северной Азии, распространенный в Сибири и на Алтае.

Установлено, что основным переносчиком дальневосточного клещевого риккетсиоза являются иксодовые клещи Haemaphysalis concinna,. инфицированность которых в изучаемых биотопах составила 28,13%. Клещи вида Haemaphysalis japonica douglasi также могут являться переносчиками дальневосточного клещевого риккетсиоза, инфицированность достигает 4,48%.

Изучены эпидемиологические особенности как в группе официально регистрируемого клещевого риккетсиоза, так и в группе больных с диагнозом риккетсиоза, подтвержденным молекулярно-биологическими методами. Выявленные особенности совпадали в обеих группах и оказались следующими: преобладание среди заболевших лиц старших возрастных групп, пик заболеваемости в конце июня-июле.

Впервые было проведено сравнение взаимодействия сывороток больных дальневосточным клещевым риккетсиозом с антигенами различных риккетсий, в том числе его этиологического агента {Rickettsia heilongjiangensis) и антигена возбудителя клещевого сыпного тифа Северной Азии {Rickettsia sibirica). Поскольку для риккетсий группы КПЛ характерны выраженные перекрестные серологические реакции, исследованные сыворотки реагировали не только с антигеном R. heilongjiangensis, но также и с антигенами других риккетсий, в т.ч. R. sibirica и R. conorii, однако, как правило, в меньшем разведении. Растворимый антиген Rickettsia sibirica в настоящее время применяется в практическом здравоохранении для диагностического исследования сывороток больных клещевым риккетсиозом в Хабаровском крае, что, возможно, объясняет невысокую частоту положительных серологических реакций при исследовании сывороток больных дальневосточным клещевым риккетсиозом.

Разработана модификация ПЦР с использованием «гнездовых» праймеров на основе гена цитрат-синтазы (gltA) риккетсий. Она позволяет обнаруживать генетический материал любых риккетсий в клиническом материале и клещах.

Впервые секвенированы и помещены в базу генетических данных GenBank гены отрВ типовых штаммов Rickettsia heilongjiangensis и Rickettsia hulinensis. Были выявлены и при согласовании с авторами (J.Z. Zhang и др.) исправлены неточности в опубликованных в GenBank нуклеотидных последовательностях генов gltA и отрА Rickettsia heilongjiangensis.

В клещах Haemaphysalis japonica douglasi впервые была обнаружена ДНК Candidatus Rickettsia tarasevichiae.

Впервые выявлена ДНК новой риккетсии, генетически значительно отличающейся от всех известных видов. Она была обнаружена в клещах Haemaphysalis japonica douglasi. Риккетсии дано предварительное название Candidatus Rickettsia principis.

Научно-практическая ценность и реализация результатов работы

Полученные данные свидетельствуют о том, что заболевание, традиционно считавшееся на Дальнем Востоке Российской Федерации клещевым сыпным тифом Северной Азии, вызывается не Rickettsia sibirica, а недавно описанной Rickettsia heilongjiangensis. Поскольку было обнаружено, что возбудитель клещевого риккетсиоза на Дальнем Востоке отличается от микроорганизма, традиционно считавшегося этиологическим агентом этого давно известного заболевания, предлагается ввести новую нозологическую единицу: «дальневосточный клещевой риккетсиоз», относящийся к группе КПЛ и вызываемый Rickettsia heilongjiangensis.

Организациям практического здравоохранения рекомендуется включить обследование на дальневосточный клещевой риккетсиоз в комплекс лабораторных обследований заболевших после присасывания клеща.

Идентификация возбудителя дальневосточного клещевого риккетсиоза предоставляет возможность проводить специфическую диагностику. Антиген

Rickettsia sibirica, который используется в диагностике заболевания до настоящего времени, является группоспецифичным. Корпускулярный антиген этиологического агента болезни {Rickettsia heilongjiangensis) позволяет проводить принципиально более точную диагностику, поэтому именно его следует применять для проведения серологических исследований в эндемичных очагах.

Разработана чувствительная и специфичная модификация ПЦР на ген цитрат-синтазы риккетсий с использованием «гнездовых» праймеров. Она может применяться как в клинической диагностике, так и в научно-исследовательской работе.

Исследование биоптатов первичных аффектов на наличие ДНК риккетсий является значительно более успешным, чем исследование фибриновых сгустков. Это позволяет рекомендовать для клинических реакций использовать материалы биоптатов первичного аффекта.

Апробация работы.

Материалы диссертации представлены на:

• Конференции общества инфекционистов Хабаровского края, г. Хабаровск, 2001 г.

• Краевом конкурсе молодых ученых, секции работ по медицине, г. Хабаровск, 2001 г.

• Конференции отдела эпидемиологии ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН, г. Москва, 2002 г.

• Научных конференциях справочного центра ВОЗ, лаборатории риккетсиозов Средиземноморского университета, г. Марсель, 2003, 2004 гг.

• 14-м ECCMID, Прага, 2004 г.

По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, в базу генетических данных GenBank внесено 6 отдельных позиций.

Диссертация апробирована на совместной научной конференции отделов эпидемиологии и природно-очаговых болезней ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН 21 апреля 2004 года.

- 15

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКАЯ И КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РИККЕТСИОЗОВ ГРУППЫ КЛЕЩЕВОЙ ПЯТНИСТОЙ ЛИХОРАДКИ.

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ИДЕНТИФИКАЦИИ, КЛАССИФИКАЦИИ И ФИЛОГЕНЕТИКЕ РИККЕТСИЙ

Характеристика риккетсиозов группы клещевой пятнистой лихорадки

Риккетсиозами называются заболевания, вызываемые облигатными внутриклеточными бактериями из семейства Rickettsiaceae порядка Rickettsials группы альфа-протеобактерий (23, 24, 95, 108). За исключением эпидемического сыпного тифа, крысиного сыпного тифа, осповидного риккетсиоза, лихорадки цуцугамуши и заболевания, вызываемого Rickettsia felis, переносчиками и во многих случаях доказанными резервуарами и переносчиками этих инфекционных заболеваний являются иксодовые клещи. Первым риккетсиозом человека, трансмиссивный механизм передачи которого был расшифрован, является пятнистая лихорадка Скалистых гор. В 1909 г. Н. Ricketts, в честь которого позднее будет назван и род, и вид возбудителя этой болезни, опубликовал данные о роли клеща Dermacentor andersonii в передаче пятнистой лихорадки Скалистых гор (112).

До середины 70-х годов XX века было известно только четыре клещевых трансмиссивных заболевания, вызываемых риккетсиями: пятнистая лихорадка Скалистых гор (R.rickettsii), марсельская (средиземноморская) лихорадка {R.conorii), клещевой сыпной тиф Северной Азии (R.sibirica) и квинслендский клещевой тиф {R.australis), (Табл.1). Однако за последнюю четверть века были описаны трансмиссивные заболевания, вызываемые следующими риккетсиями: Rickettsia "mogolotimonae", Rickettsia honei, Rickettsia conorii subsp. israelii и subsp. caspiensis, Rickettsia africae, Rickettsia slovaca, Rickettsia helvetica, Rickettsia japonica, Rickettsia aeschlimannii, Rickettsia parkeri (88, 102, 108).

Доказательство этиологической причины риккетсиозов всегда вызывало значительные трудности, прежде всего из-за сложностей в выделении чистой культуры возбудителя и перекрестных серологических реакций. В последние десятилетия развитие новых методов выделения микроорганизмов, таких как «shell-vial technique», а также молекулярно-биологических методов, привело к. описанию многих новых заболеваний, вызываемых риккетсиями. В таблице .1 сгруппированы данные обо всех известных на настоящий момент риккетсиозах человека.

Одним из наиболее ярких примеров таких заболеваний является Астраханская пятнистая лихорадка. На территории России с начала 80-х годов в Астраханской области стали отмечать ранее неизвестную лихорадку с пятнистой сыпью. И.В. Тарасевич было высказано предположение о риккетсиозной природе этого заболевания, которое позднее было подтверждено в лаборатории экологии риккетсий НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи (25, 131). Выделенные от больных штаммы (80) были идентифицированы как риккетсии группы пятнистой лихорадки. Позднее при комплексном исследовании выделенного микроорганизма, прежде всего на основании эволюционно-филогенетических исследований, было высказано предположение о близости выделенной риккетсии к возбудителю марсельской лихорадки R.conorii (56). Недавно было сделано предложение об объединении на основании генетических критериев возбудителей марсельской лихорадки, Астраханской пятнистой лихорадки и пятнистой лихорадки Израиля в комплекс R.conorii с соответствующим выделением нескольких подвидов, в том числе и Rickettsia conorii subsp. caspiensis, возбудителя Астраханской пятнистой лихорадки (63).

Японская пятнистая лихорадка была впервые описана у двух пациентов в 1984 году (81). Заболевание по клинической картине напоминало клещевые риккетсиозы, а вскоре выделенный от больных штамм был охарактеризован как новая риккетсия - Rickettsia japonica (132).

Новый риккетсиоз был выявлен также на небольшом острове Флиндерса, который находится близ северной оконечности Тасмании. Единственный врач на этом острове, доктор Стюарт, описал 26 случаев острого инфекционного заболевания за 12 лет (127). Заболевание было сезонным и протекало с лихорадкой, сыпью и тромбоцитопенией. Особенности клинико-лабораторной картины свидетельствовали о том, что это заболевание отличалось от известного на тот период в Австралии клещевого тифа Северного Квинсленда. Позднее было доказано, что выделенные от больных штаммы риккетсий принадлежат к новому виду, названному Rickettsia honei (43, 44).

Африканская клещевая лихорадка была открыта дважды. Вначале в 30-х годах прошлого века в Южной Африке A. Pijper описал легко протекающее заболевание, возникающее вследствие присасывания клещей (97). Он же выделил на морских свинках этиологический агент этой болезни и доказал его отличие от возбудителя марсельской лихорадки (98). Его последователь, однако, выделил из клещей рода Rhipicephalus возбудителя марсельской лихорадки, R.conorii, и связал это с описанным заболеванием. В связи с этим до 90 годов прошлого века считалось, что в Африке распространен вариант марсельской лихорадки. Лишь в 1990 году из клещей рода АтЫуотта была выделена новая риккетсия, R.africae. На основании совокупности факторов (большая инфицированность клещей риккетсиями, принципиально более частое нападение этих клещей на человека по сравнению с Rhipicephalus, серологические данные, полученные от больных людей) была доказана роль этой риккетсии как основной причины клещевых риккетсиозов на юге Африки.

Выделенная из кошачьих блох Ctenocephalides felis в Калифорнии новая риккетсия, позднее названая Rickettsia felis (74), вначале не считалась патогенной для человека (100). Однако после того как ДНК данного микроорганизма была амплифицирована из материалов от человека, больного сходным с крысиным сыпным тифом заболеванием (122), этот микроорганизм был признан возбудителем заболевания человека.

Совершенно недавно еще две риккетсии группы КПЛ присоединили к кругу патогенных. Это Rickettsia aeschlimannii, выделенная от африканских клещей более 6 лет назад, и Rickettsia parkeri, клещевой изолят которой известен с 1939 года. Оба этих микроорганизма были идентифицированы в качестве этиологических агентов заболеваний, клинически сходных с риккетсиозами группы КПЛ. В последнем случае был также получен изолят от человека (94, 101). Инфекция, вызванная Rickettsia aeschlimannii, была идентифицирована на основании данных клинико-эпидемиолгических, серологических и молекулярно-биологических исследований (99, 106)

Открытие Rickettsia sp. «mongolotimonae» {Rickettsia sibirica, штамм «mongolotimonae») связано с необычной историей. Возбудитель, описанный сначала как «Rickettsia mongolotimonae», был выделен из двух совершенно разных источников - клещей Hyalomma asiaticum (142), собранных во Внутренней Монголии (КНР) и от больного клинически нетяжелым заболеванием в Марселе (Франция) (104). Было предположено, что больной подвергся нападению клеща, принесенного во Францию из Китая перелетными птицами, в то время, когда он собирал компост в саду, где отдыхали птицы. В Китае заболевание человека, вызванное этим микроорганизмом, до сих пор не было доказано.

Rickettsia slovaca была впервые выделена в Чехословакии в 1968 г. (48) из клещей Dermacentor marginatus, а позднее - во Франции, Армении, Португалии, Швейцарии, России. Документировано уже несколько десятков случаев этой инфекции, вызываемой данным микроорганизмом. Он вызывает острое трансмиссивное лихорадочное заболевание, протекающее, как правило, без сыпи и с выраженной лимфаденопатией (102, 107). Это заболевание было названо «клещевая лимфаденопатия» (tick-borne lymphadenopathy, TIBOLA). Примечательно, что заболевание было доказано без выделения от человека чистой культуры возбудителя. Доказательство было построено на основании серологических и молекулярно-биологических методов. Из организма человека (кровь, пунктат лимфоузла, биоптат первичного аффекта) были амплифицированы фрагменты ДНК возбудителя, что и послужило доказательством этиологической роли Rickettsia slovaca в этом заболевании. Амплификация ДНК была успешной только у 25% в целом, причем, при исследовании кожных биоптатов и пунктатов лимфатических узлов частота получения положительных результатов была выше (102, 107).

Rickettsia helvetica была впервые выделена из клещей Ixodes ricinus в Швейцарии в 1979 году (49). Она считалась непатогенной для человека до 1999 года, когда в Швеции были описаны два клинических случая смертельного перимиокардита у молодых пациентов. В обоих случаях при помощи ПЦР с последующим секвенированием материалов от больных, электронной микроскопии и серологических исследований было доказано, что именно этот микроорганизм вызвал летальные заболевания (88). Позднее описано еще несколько клинических случаев этой инфекции, протекающей в виде лихорадочного заболевания без специфических симптомов (62).

В исследованном нами регионе, Хабаровском крае, традиционно единственным риккетсиозом группы КПЛ считается клещевой сыпной тиф Северной Азии, вызываемый R.sibirica.

В 1936 году Е.И. Милль опубликовал данные о наблюдаемых им с 1932 года в Приморье случаях острого заболевания, эпидемиологически связанного с присасыванием клещей и клинически сходного с другими риккетсиозами группы КПЛ (17). В 1936-1937 гг. Н.И. Антонов и А.Г. Найштат регистрировали подобное заболевание у людей, проживающих в верхнем и среднем течении р. Амур и пойме р. Уссури (1). В 1939 году М.Д.Шматиков и М.А.Велик описали 13 случаев заболевания клещевой лихорадкой в Красноярском крае (33). После этого, несмотря на приоритет описания заболевания, проведение основных исследований сместилось в районы центральной Сибири, видимо, вследствие более высокой плотности населения и заболеваемости, а также географической близости к центральным исследовательским институтам. В 1938-1945 гг. в Сибири клещевые лихорадки детально изучались комплексными экспедициями под руководством Е.Н. Павловского, М.К. Кронтовской, П.А. Петрищевой. Большая работа по изучению эпидемиологии, этиологии риккетсиозов, микробиологических, генетических, иммунологических свойств патогенных и непатогенных риккетсий продолжает вестись в Омском НИИ природно-очаговых инфекций (21,31, 34, 37, 45, 117, 124, 125). Первые штаммы риккетсий от больных и клещей, позднее описанные как Rickettsia sibirica, были получены из Красноярского края (12) и Дальнего Востока (13). В 1943 г. Е.П. Савицкая пришла к выводу об идентичности изучаемых ей штаммов риккетсий, выделенных близ Биробиджана, возбудителю клещевого сыпного тифа Центральной Сибири (20). К сожалению, указанные штаммы не сохранились. В 1949-1956 гг. П.Ф. Здродовский и Е.М. Голиневич детально изучали, возбудителей и пришли к выводу об идентичности возбудителей риккетсиозов группы клещевой пятнистой лихорадки на территории Сибири и Дальнего Востока (8). Тем не менее, в 1947г. М.М. Маевский обратил внимание на отличие друг от друга в различных регионах клещевых пятнистых лихорадок по некоторым особенностям клинической картины и серологических реакций (15).

Интересно, что еще в 1946 г. отмечалось совпадение сезонности клещевого сыпного тифа в Приморье и Сибири, а также других эпидемиологических факторов (19), однако в Хабаровском крае в 1974 г. наблюдали четкий сдвиг максимума заболеваемости на летние месяцы, максимум заболеваемости отмечается в июле, в отличие от апреля-мая в Сибири (11, 29, 46). Четкое отличие в сезонности наблюдалось между Хабаровским и Приморским краями, в последнем максимум заболеваемости также наблюдается в мае (37). Более того, наблюдается значительное преобладание среди заболевших в Хабаровском крае лиц пожилого возраста по сравнению с регионами Сибири, где преобладали дети (29, 46). Так, например, в 1991 г. на долю детей до 14 лет в Красноярском крае приходилось 67% от всех заболевших, тогда как в Хабаровском крае - только 10% (46). Таким образом, эпидемиологические данные свидетельствуют о некоторых особенностях клещевого риккетсиоза в Хабаровском крае от клещевого сыпного тифа Северной Азии в других регионах Сибири и Дальнего Востока. Обычно это объяснялось превалирующим значением в Хабаровском крае и экологическими особенностями такого переносчика, как H.concinnae, в отличие от клещей рода Dermacentor в других регионах (29, 37, 46).

Как известно, морфологически риккетсии практически не отличаются друг от друга, а исследование человеческих сывороток с растворимым антигеном имеют выраженный перекрест (8, 78). Поэтому исследование сывороток больных клещевым риккетсиозом людей с антигеном любой риккетсии группы КПД потенциально способно дать положительный результат. Следовательно, серологические реакции являются группоспецифическими, с их помощью очень сложно провести идентификацию до вида риккетсии, вызвавшей заболевание.

Проводимые в дальнейшем исследования клещевого риккетсиоза в Приморском крае (22) также не выявили выраженных отличий выделенных от людей, клещей и животных штаммов и неотипом R.sibirica, штаммом «Нецветаев», хотя некоторые серологические отличия были отмечены (14). Молекулярно-генетическими методами эти штаммы не исследованы. Три штамма, выделенных от клещей D. silvarum в 1983-1984 гг. в Приморском крае Т.А. Решетниковой, были молекулярно-генетическими методами (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) идентифицированы как типичная R.sibirica (45).

Клинико-лабораторные и эпидемиологические исследования риккетсиоза, проведенные в Хабаровском крае в прошлые годы (11, 29), показали, что заболевание сходно с другими риккетсиозами группы КПЛ, такими как пятнистая лихорадка Скалистых гор, марсельская лихорадка. Это острое природно-очаговое трансмиссивное инфекционное заболевание, протекающее с выраженной интоксикацией, морфологическими изменениями в мелких кровеносных сосудах в виде пролиферативно-деструктивного тромбоваскулита, а также функциональными и метаболическими нарушениями. Тем не менее, отличительными эпидемиологическими особенностями являлось значительно меньшая численность детей до 15 лет среди всех возрастных групп заболевших

11), а также то, что значительную группу больных составляли лица старше 50 лет.

Очаги клещевого риккетсиоза располагаются в южных и центральных районах Хабаровского края, где имеющиеся биогеоценотические факторы способствуют циркуляции возбудителя. В качестве переносчиков предполагались клещи родов Dermacentor и Haemaphysalis; Первые являются классическими.переносчиками клещевого сыпного тифа Северной Азии в регионах Центральной и Восточной Сибири. Из этих клещей были выделены типовые штаммы, неотипы и множество топотипов R.sibirica. Тем не менее, пик активности этих клещей (с марта по май) не совпадает с многолетними пиками заболеваемости клещевым сыпным тифом в Хабаровском крае (июнь-июль).

В 1982 году из клещей D. silvarum, собранных близ г. Суйфеньхэ провинции Хэйлунцзян был выделен изолят риккетсий, названный HLJ-054 (59). Провинция Хэйлунцзян - самая северная провинция КНР, непосредственно прилегающая к Хабаровскому краю РФ. В 1993 году из клещей Н. concinnae, собранных в той же провинции близ г. Хулин была выделена другая риккетсия, штамм HL-93. По основным характеристикам эти штаммы оказались представителями группы клещевой пятнистой лихорадки. Проведенные позднее генетические исследования показали, что эти риккетсии действительно принадлежат к этой группе, однако, образуют наиболее генетически удаленную ветвь на филогенетическом дереве, образуя стабильный (по результатам сравнения нескольких генов) кластер с возбудителем японской пятнистой лихорадки Rickettsia japonica (143). В 2004 году изоляту HLJ-054 был придан статус вида Rickettsia heilongjiangensis (61). Четких данных о патологии этих риккетсий для человека не существовало, однако сыворотки лихорадящих больных из этого региона реагировали с антигеном, приготовленным из штамма HLJ-054 (79). Кроме этого, наличие в этом северном регионе Китая больных с проявлениями сходными с клиникой клещевых пятнистых лихорадок, а также присутствие этой риккетсии в иксодовых клещах. Активно нападающих на человека, привело к предположению и патогенности Rickettsia heilongjiangensis.

В мае 2004 года были опубликованы данные С.Н. Шпынова об обнаружении этой риккетсии в клещах Haemaphysalis concinna, собранных на территории Российской Федерации в Красноярском крае (125).

Немногочисленны исследования непатогенных риккетсий, встречающихся в Сибири и на Дальнем Востоке. В 2003 году были опубликованы данные о наличии в клещах Ixodes persulcatus, собранных в Сибири и на юге Урала, нового вида риккетсии (124). Поскольку штамм риккетсии выделен не был, а риккетсия была обнаружена и характеризована молекулярно-биологическими методами, а также вследствие недостаточной характеристики обнаруженной риккетсии, она получила статус Candidatus (85, 86). Микроорганизм Candidatus Rickettsia tarasevichiae получил свое имя в честь И.В.Тарасевич, вложившей значительный вклад в мировую риккетсиологию. Оказалось, что эта риккетсия имеет очень интересное филогенетическое положение и наиболее близка к непатогенной Rickettsia canadensis. Этот факт, а также то, что процент инфицированности клещей достигал значительных цифр (до 20,5% на юге Урала), позволили предположить, что найденная риккетсия непатогенна для человека и, скорее всего, является эндосимбионтом. В упомянутой выше (125) работе также описывается обнаружение молекулярно-биологическими методами в клещах еще двух риккетсий: риккетсии, генетически близкой к Rickettsia aeschlimannii и Rickettsia sp. RpA4. Последняя, наряду с Rickettsia sp. DnS14 и Rickettsia sp. DnS28 были выделены на лабораторных линиях клещей в Омском НИИ природно-очаговых инфекций и подробно генетически охарактеризованы в 1999 г. (118). Rickettsia sp. RpA4 и Rickettsia sp. DnS14, a также Rickettsia slovaca также молекулярно-биологическими методами были обнаружены клещах рода Dermacentor, собранных в различных регионах юга Сибири и Европейской части России, а также Казахстане (123). Недавно также опубликованы данные о еще одной риккетсии, обнаруженной Dermacentor silvarum в районе озера Байкал (3).

Риккетсиозы группы клещевой пятнистой лихорадки являются классическими примерами так называемых вновь появляющихся (emerging) инфекций, что вызывает пристальное внимание, как свидетельствуют многочисленные публикации (4, 40, 88, 96, 102, 104, 107, 108, 109, 114, 117, 124, 143).

Иксодовые клещи как переносчики заболеваний человека

Клещи семейства Ixodidae служат специфическими переносчиками таких возбудителей болезней человека и животных как риккетсии, анаплазмы, эрлихии, некоторые другие альфа- и гамма-протеобактерии, спирохеты, тейлерии, пироплазмиды, вирусы, микрофилярии. Не исключено участие их в передаче некоторых видов грибов, токсоплазм и жгутиконосцев (4). Они являются кровососущими паразитами наземных позвоночных, в основном млекопитающих. Семейство насчитывает в своем составе около 15 родов и не менее 700 видов, распространенных на всех материках земного шара. Два подсемейства включают в себя роды Ixodes и Ceratixodes (подсемейство Ixodinae)\ Haemaphysalis, Boophilus, Rhipicentor, Dermacentor, Amblyomma, Aponomma, Anomalohimalaya, Cosmiosomma, Nosomma, Margaropus, Rhipicentor, Rhipicephalus и Hyalomma (подсемейство Amblyomminae) (30). На территории бывшего СССР встречается около 70 видов (2, 18, 30).

Тесные и многообразные связи кровососущих клещей с различными микроорганизмами обычно объясняют древностью их паразитизма и разнообразием биоценотических связей с хозяевами - наземными позвоночными (4). Некоторые анатомические, физиологические и биохимические особенности позволяют этим членистоногим быть идеальными переносчиками различных инфекционных агентов. Это смена хозяев в зависимости от стадии развития, способность длительное время обходиться без питания, впадать в анабиоз, длительное время кровососания, значительное разрушение тканей хозяина и выделение туда слюны и цементирующего вещества при прикреплении, способность быть инфицированными несколькими патогенными микроорганизмами (2). Длительность жизни самого клеща при этом может не сокращаться (2, 90, 91). С помощью современных методов было доказано существование в клещах не только патогенных для человека микроорганизмов, но и микроорганизмов с неизвестной патогенностью или вообще считающихся эндосимбионтами (46, 70, 89, 96). Отличить их от патогенных и/или идентифицировать можно зачастую лишь на основании, специфических молекулярных методов исследования (70).

Основное значение клещей для человека - это способность являться источником и переносчиками различных инфекционных заболеваний. В патологии человека наиболее значимыми трансмиссивными заболеваниями, передающимися иксодовыми клещами, являются риккетсиозы группы клещевой пятнистой лихорадки (КПЛ), эрлихиозы и анаплазмозы, болезнь Лайма, вирусные клещевые заболевания (клещевой энцефалит, лихорадка Крым-Конго и другие арбовирусные инфекции), бабезиоз.

Молекулярно-биологический подход к идентификации микроорганизмов, диагностике инфекционных заболеваний и изучению эпидемиологии трансмиссивных инфекций

С 80-х годов XIX века, когда Роберт Кох разработал свои принципы определения роли микроорганизма как возбудителя заболевания, позднее ставшие известными как постулаты Коха, многое изменилось. Фундаментальность постулатов не так очевидна, когда речь идет об облигатных паразитах, в частности вирусах, которые не могут быть выделены и размножены в «чистой» (то есть неживой, бесклеточной) культуре. Это было подчеркнуто еще в 1936 году в выступлении Thomas Rivers перед Американским обществом микробиологов (65, 113). Дальнейшие открытия и внедрение новых методик еще более расширили представление о критериях диагностики инфекционных заболеваний: выяснение роли вируса Эпштейна-Барра в генезе разнообразных заболеваний, персистенция вирусов в организме человека и животных; открытие прионных заболеваний, возбудитель которых не является живым организмом в общепринятом смысле слова; выяснение роли микроорганизмов в канцерогенезе; индукция аутоиммунных заболеваний и др. Все эти открытия встали в разрез с традиционными постулатами и стимулировали постепенный их пересмотр и модификацию.

Термин «полифазная таксономия» употребляется для обозначения таксономии финального уровня, использующей все имеющиеся данные, как фенотипические, так и генетические, для определения позиции определенной группы организмов. Поскольку в микробиологии фенотипические данные зачастую труднодоступны для описания или вообще немногочисленны, генетическая концепция определения вида, основанная на филогенетическом анализе, чрезвычайно важна. Роль полифазной таксономии в описании вида подчеркнута в последней издании определителя Bergey (69). Там же подчеркнуто, что секвенирование некоторых универсальных генов (кодирующих рибосомальную РНК, например) имеет самую высокую разрешающую способность среди всех остальных фенотипических и генотипических методов в идентификации позиций «штамм-вид-род-семейство». Хотя сравнение последовательностей генов рибосомальных ДНК представляет собой филогенетическую основу классификации микроорганизмов на современном этапе развития науки (69), в некоторых случаях, например, у риккетсий, этот ген не содержит достаточное количество информации для определения внутриродовых и внутривидовых отличий. Вследствие этого исследователям приходится дополнительно проводить филогенетические исследования на основании других, менее консервативных генов, например, гена цитрат-синтазы (116).

Развитие методик молекулярной биологии позволило не только с высочайшей чувствительностью и точностью идентифицировать генетический материал микроорганизмов, но и в ряде случаев выявлять возбудителей новых инфекционных заболеваний и определять инфекционную причину заболеваний ранее неизвестной этиологии. Первый случай гранулоцитарного анаплазмоза человека был диагностирован на основании амплификации генов микроорганизма, ныне называемого Anaplasma phagocytophilum в материалах от больных людей (53) и лишь позднее многочисленные штаммы этой анаплазмы были выделены от человека. Примером успешного применения методов молекулярной биологии в идентификации инфекционного генеза давно известных заболеваний с неизвестной этиологией является болезнь Уиппла или кишечная липодистрофия. Благодаря амплификации ДНК специфического микроорганизма из подслизистой оболочки кишечника больных людей была доказана инфекционная причина этого заболевания (40). Лишь спустя почти 10 лет после идентификации инфекционной причины заболевания удалось выделить эту чрезвычайно прихотливую бактерию в чистой культуре (103). Идентификация новых, ранее неизвестных болезней человека также возможна с помощью молекулярно-биологических методов. Причина хантавирусного легочного синдрома, унесшего десятки жизней во время вспышки в США в 1993 году (52) также была идентифицирована этими методами (87). Аналогичным образом доказана инфекционная причина саркомы Капоши (51). Идентификация вируса гепатита С, как причины одного из парентеральных вирусных гепатитов человека также основывалась на молекулярно-биологических принципах (54).

Появление новых технологий, позволяющих получить непосредственный доступ к последовательности нуклеиновых кислот и концептуальные достижения, дающие возможность делать выводы об эволюционном, филогенетическом взаимоотношении на основании сравнения отдельных секвенсов (последовательностей нуклеиновых кислот) принесло практически неограниченные возможности выявления и идентификации ранее неизвестных микроорганизмов. Революционные технологии амплификации ДНК (57, 119, 120), гибридизации нуклеиновых кислот (57) и секвенирования ДНК (82, 121) дополняют традиционные методы микробиологических исследований. С их помощью было выявлено огромное количество ранее неизвестных и некультивируемых микроорганизмов в окружающей среде, а также находящихся в ассоциации с организмом человека (110, 136). Специально разработаны методики, позволяющие получать участки генома как известных, так и новых микроорганизмов из-за того, что разные гены микроорганизмов обладают широчайшим спектром специфичности - от универсальных, встречающихся практически у всех (гены рибосомальных РНК, белков теплового шока, синтетаз нуклеиновых кислот), до родо- и видоспецифичных., Более того, сильно варьирует и специфичность различных участков генов на их протяжении - последовательность может быть специфичной для определенного штамма или для всей группы протеобактерий.

Современные методы позволяют быстро обнаружить ДНК практически в любом материале, а наличие ДНК некультивируемых или ранее неизвестных микроорганизмов в совокупности с классическими микробиологическими подходами может служить способом выявления возбудителей новых инфекционных заболеваний.

В настоящее время разработаны специфические методы идентификации для большого количества микроорганизмов, а описание ни одного нового вида не обходится без молекулярно-биологической характеристики (47, 66).

Обнаружение и идентификация бактерий в клещах: молекулярно-биологические подходы. На современном этапе развития науки методы детекции различных микроорганизмов, предлагаемые молекулярной биологией, играют ведущую роль. Максимально специфичные и чувствительные, значительно менее трудоемкие по сравнению с другими методами, ПЦР и родственные методы заняли ведущую позицию не только в научных исследованиях, но также и в практике, например, диагностике инфекционных заболеваний.

Особое значение данные методы могут иметь при выявлении микроорганизмов из таких сред, определенные характеристики которых затрудняют применение стандартных методов детекции и/или выделение чистой культуры микроорганизма. Исследование микрофлоры, населяющей внутреннюю среду клещей - типичный пример. Наличие огромного количества различных микроорганизмов во внутренней среде этих членистоногих, небольшие размеры каждого клеща и невысокая концентрация микроорганизмов в них, неизученность многих микроорганизмов, ведущая к затруднениям при культивировании: все это ведет к тому, что молекулярно-биологические методы начинают играть ведущую роль в этих исследованиях (126). Кроме того, многие практически неразличимые фенотипически микроорганизмы могут иметь принципиально различную патогенность для млекопитающих. Патогенные и непатогенные виды можно легко дифференцировать с помощью генетического анализа. И, наконец, именно молекулярно-биологические методы наконец-то дали возможность выявить инфицирование одного клеща несколькими патогенными микроорганизмами одновременно, что приводит к возникновению смешанных инфекций, требующих зачастую дифференцированного лечения у людей и у животных (71,84).

Первым этапом молекулярно-биологического исследования является извлечение из внутренних органов клещей комплекса нуклеиновых кислот. Впоследствии растворенные в воде или нейтральном буфере кислоты используются для дальнейших исследований. Методика полимеразной цепной реакции подразумевает многократную амплификацию (умножение) одной или нескольких копий ДНК in vitro специальным ферментом (ДНК-полимеразой) при определенных условиях. Специфичность и чувствительность реакции определяется в первую очередь подбором праймеров («затравок»), необходимых для инициации амплификации. Они должны быть комплементарны искомым участкам ДНК. Соответственно этому, выбрав в качестве праймеров участки ДНК, максимально специфичные искомому организму, можно амплифицировать ДНК строго определенного микроорганизма. Наоборот, праймеры, разработанные на основе участков ДНК, одинаковых у многих микроорганизмов, то есть обладающих широкой специфичностью, можно получить ампликон не только видов, на основании которых были разработаны праймеры, но и других, потенциально новых, неизвестных микроорганизмов.

Возможна разработка различных вариантов ПЦР с потенциально любой специфичностью на основании правильно разработанных праймеров. Этими широчайшими возможностями и пользуются исследователи не только для детекции определенных, известных, но и для поиска новых микроорганизмов. Некоторые гены присутствуют в геноме всех протеобактерий, например, ген, кодирующий 16S рибосомальную РНК. Разработаны праймеры, амплифицирующие практически полный ген потенциально всех протеобактерий (138, 139), то есть обладающие максимально широкой специфичностью. Подобной широкой специфичностью обладает также ген, кодирующий 23 S рибосомальную РНК. Другие гены, например, гены кодирующие РНК-полимеразу (гроВ) или белки теплового шока (оперон groESL) обладают более узкой специфичностью, то есть праймеры, разработанные на их основе могут амплифицировать определенную группу микроорганизмов (115,130).

Каждая методика ПЦР может обладать различной специфичностью. Во многих случаях для разработки реакции используются мало вариабельные гены, которые могут присутствовать у многих микроорганизмов. В таких случаях для полной идентификации полученного ампликона прибегают к определению его нуклеотидной последовательности путем его секвенирования. Как правило, пользуются либо прямым секвенированием полученного ампликона, либо его клонированием в другом микроорганизме с помощью вектора (75). После получения последовательности амплифицированного в ПЦР гена или его участка проводят поиск в базе данных. Как правило, используют доступные в Интернете поисковые системы в основных базах генетических данных, коими являются GenBank, DDBJ (DNA Database of Japan) и EMBL. В основном, данные в этих базах повторяют друг друга. При получении результата сравнения возможно несколько вариантов. Это либо полное совпадение запрашиваемого результата с имеющимся в базе данных, что свидетельствует об идентичности генов амплифицированного микроорганизма и находящегося в базе генетических данных, то есть об идентичности микроорганизмов. При отсутствии полного совпадения можно говорить о гомологии полученного гена с каким-либо (какими-либо) имеющимися в базе данных либо о ее отсутствии. То есть амплифицированный ген либо принадлежит некому микроорганизму, который еще не известен, либо известен, но этот ген у него еще не секвенирован. При существовании гомологии проводится филогенетический анализ. Его результаты определяют систематическое положение и таксономию микроорганизма (73, 86, 126, 138, 139).

Следует отметить, что вследствие сложности выделения чистой культуры возбудителя в риккетсиологии часто используются косвенные методы выявления риккетсий. Например, в клинических диагностических исследованиях преимущественно используются серологические методы диагностики, несмотря на то, что сыворотки больных риккетсиозами группы КПЛ дают выраженные перекрестные серологические реакции с антигенами других микроорганизмов {Proteus spp., Legionella spp.) и антигенами других риккетсий этой же группы (105).

Высокую эффективность показал метод лабораторной диагностики пятнистой лихорадки Скалистых гор путем иммунофлюоресцентного мечения риккетсий в первичном аффекте (133). Было показано также клиническая эффективность и оправданность использования биоптатов первичных аффектов для выявления риккетсиальной этиологии заболевания у человека, поскольку именно здесь наблюдаются большие скопления риккетсий (134).

Вследствие относительной легкости исследования материалов от больных молекулярно-биологические методы нашли широкое применение в риккетсиологии. Амплификация ДНК риккетсий и последующее секвенирование ампликонов для подтверждения специфичности реакции стали основным критерием клинической диагностики риккетсиозов во многих лабораториях мира (88, 94, 106, 107).

Для идентификации ДНК риккетсий в клещах и клинических материалов от больных людей используются различные наборы праймеров, некоторые наиболее часто используемые варианты рассмотрены далее.

В связи с тем, что основная масса генов риккетсий отличается друг от друга в небольшой степени, для видовой идентификации как правило используется комбинация ПЦР с последующим анализом амплифицированного продукта либо при помощи анализа длин рестрикционных фрагментов (RFLP), либо, что в последнее время практически вытеснило все остальные методы, при помощи полного секвенирования полученного продукта.

На настоящий момент чаще всего для идентификации и характеристики риккетсий используются в основном 5 генов. Это ген 16S рибосомальной РНК, ген цитрат-синтазы {gitА), ген 190-кДа поверхностного антигена (отрА), 120-кДа поверхностного антигена (<отрВ) и 17-кДа белка. Огромными преимуществами этих генов являются их изученность, изменчивость, присутствие у всех риккетсий (за исключением отрА, наличие которого является признаком риккетсий группы КПЛ), а также наличие большой базы данных секвенированных генов, что позволяет с легкостью идентифицировать полученные ампликоны или характеризовать ранее неизвестные риккетсии.

На основании гена 16S рибосомальной РНК разработаны праймеры для амплификации ДНК риккетсий, однако специфичность их зачастую бывает низкой (114, 128, 129). Ген gltA кодирует цитрат-синтазу риккетсий, и праймеры, разработанные на его основе способны амплифицировать ДНК риккетсий всех групп (109, 116). Одним из первых известных генов, специфичных для риккетсий группы пятнистой лихорадки, является ген отрА, кодирующий 190-кДа поверхностный антиген (40). На его основе разработан ряд праймеров, амплифицирующих ДНК риккетсий группы пятнистой лихорадки (64, 109). Праймеры на основе 17-кДа антигена также могут обладать родоспецифичностью (41). Ген отрВ, кодирующий 120-кДа поверхностный антиген практически всех риккетсий, был впервые клонирован

-33в 1989 г. (50). На основе его также были разработаны праймеры для амплификации риккетсиальной ДНК (115).

Как правило, при исследовании клинических образцов используют амплификацию нескольких генов риккетсий для снижения вероятности контаминации и облегчения определения видовой принадлежности риккетсии (78).

Генетические подходы к филогенетическим исследованиям, эволюции микроорганизмов В настоящее время описание любого микроорганизма, как выявленного вновь, так и известного давно, не может обойтись без его генетической характеристики. На основании сравнения гомологичных генов различных микроорганизмов разными методами делаются выводы о степени отличия микроорганизмов друг от друга, о близости тех или иных групп, даже о приблизительном времени эволюционного происхождения того или иного микроорганизма (92). Исследования генома археобактерий, проведенные Carl Woese и Gary Olsen в конце 70-х годов прошлого века привели к революционным сдвигам в понимании эволюции жизни на Земле и позволили разработать современные подходы к систематике, филогенетическим и эволюционным исследованиям (93, 140, 141). Классическая схема пяти царств сменилась трехдоменной системой, разработанной на основании сравнения гена, кодирующего рРНК малой субъединицы рибосомы. Этот ген универсален, он присутствует практически во всех клеточных организмах.

ПЦР-диагностика, как правило, всегда сопряжена с таксономической и филогенетической характеристикой, поскольку амплифицированный ген после секвенирования должен быть сравнен с имеющимися в базе данных ортологами и гомологами (83). При полном совпадении делается вывод об идентичности выявленного микроорганизма с занесенным в банк, при выявлении отличий необходимо провести филогенетический анализ. Отличия, как правило, заключаются в точечных заменах (мутациях) нуклеотидов. Считается, что такие замены происходят с определенной скоростью и их количество и качество характеризуют удаленность двух конкретных микроорганизмов друг от друга. Кроме этого, математический анализ качества и количества замен нуклеотидов в ортологичных генах нескольких микроорганизмов способен дать цельную картину филогенетического соотношения исследуемых микроорганизмов. На основании этого также строится современная таксономия.

Анализ такого типа, как правило, проводится с помощью компьютерных филогенетических программ, таких как Genetix-Win, MEGA-2, CLASTAL и др.

Благодаря возможностям, которые открыла молекулярная биология, в риккетсиологии произошла большая перемена: полная реорганизация порядка Rickettsiales (67). Он составляет 2-ой порядок альфапротеобактерий, включает в себя два семейства: Rickettsiaceae и Anaplasmataceae, а также группу риккетсиеподобных микроорганизмов, предварительно сгруппированных в нетаксономическое семейство «Holosporaceae». Бартонеллы, считающиеся ранее близкими к риккетсиям, отнесены к 6-му порядку альфапротеобактерий, а коксиеллы относятся к принципиально другой группе микроорганизмов -гаммапротеобактериям.

Филогенетические исследования применялись для характеристики различных представителей порядка Rickettsiales. Представители рода Rickettsia, например, были подробно охарактеризованы при сравнении и анализе генов 16S рРНК, git А, отрА, отрВ (40, 114, 115, 116). При обнаружении новой риккетсии «золотым стандартом» является не только классическое описание микробиологических характеристик, но также и секвенирование этих генов и филогенетический анализ на их основе (143).

Таким образом, исследования эволюции микроорганизмов, долгое время базировавшиеся либо на сомнительных археологических данных, либо на сравнении фенотипических характеристик (физиология и морфология) микроорганизмов, в настоящее время основываются на точных математических критериях, выведенных из генетических данных. Это является кардинальным изменением в науке об эволюции, уже приведшим к множеству открытий.

Таблица 1.

Список представителей рода Rickettsia, патогенных для человека

Группа Вид Заболевание Переносчик Распространение

Группа клещевой пятнистой лихорадки Rickettsia rickettsii Пятнистая лихорадка Скалистых Гор Dermacentor variabilis, Dermacentor andersoni, Rhipicephalus sanguineus, Amblyomma cajennense Северная и Южная Америка

Rickettsia conorii комплекс, ssp. caspiensis Астраханская пятнистая лихорадка Rhipicephalus pumilio Астраханская область, Россия

Rickettsia conorii комплекс, ssp. israeli Пятнистая лихорадка Израиля Rhipicephalus sanguineus Израиль

Rickettsia sibirica Клещевой сыпной тиф Северной Азии Dermacentor nuttalli, Dermacentor marginatus, Haemaphysal is concinna Россия (Центральная и Восточная Сибирь), Монголия, Северный Китай, Пакистан

Rickettsia sibirica, штамм «mongolotimonae» Клещевая пятнистая лихорадка Hyalomma asiaticum Китай (Внутренняя Монголия), Франция

Rickettsia akari Везикулезный (осповидный) риккетсиоз Allodermanyssus sanguineus США, Украина, Хорватия, Корея

Rickettsia africae Африканская лихорадка укуса клеща (African tick bite fever) Amblyomma hebraeum Юг Африки

Rickettsia australis Клещевой тиф Северного Квинсленда Ixodes holocyclus Австралия (Квинсленд)

Rickettsia japonica Японская пятнистая лихорадка Haemaphysal is longicornis, Dermacentor taiwanensis Япония (юго-западные районы)

Таблица 1 (продолжение). Список представителей рода Rickettsia, патогенных для человека

Группа Вид Заболевание Переносчик Распространение

Группа клещевой пятнистой лихорадки Rickettsia slovaca Клещевая пятнистая лихорадка, TIBOLA Dermacentor marginatus Словакия, Армения, Россия (Урал), Франция, Швейцария, Португалия

Rickettsia honei Клещевая пятнистая лихорадка острова Флиндерса Аропотта hydrosauri Остров Флиндерса (Тасмания, Австралия)

Rickettsia aeschlimannii Риккетсиоз группы КПЛ Rhipicephalus appendiculatus, Hyalomma marginatum Южная и Северная Африка

Rickettsia parkeri Риккетсиоз группы КПЛ Amblyomma maculatum, Amblyomma americanum США

Группа сыпного тифа Rickettsia prowazekii Эпидемический сыпной тиф, болезнь Брилля Pediculus humanus (Pediculus vestimenti) Убиквитарно

Rickettsia typhi Крысиный сыпной тиф Xenopsylla cheopsis Убиквитарно

Rickettsia felis Калифорнийский блошиный риккетсиоз Ctenocephalides felis США (Калифорния, Техас, Оклахома)

Rickettsia helvetica Лихорадочные заболевания без сыпи, перимиокардиты (?) Ixodes ricinus Европа

123 Выводы:

1. В результате ревизии этиологии клещевого риккетсиоза молекулярно-биологическими методами выявлено, что клещевой риккетсиоз в Хабаровском крае вызывается Rickettsia heilongjiangensis. Полученные последовательности генов, амплифицированных у 18 больных, помещены в GenBank.

2. Возбудитель клещевого риккетсиоза в Хабаровском крае,

R. heilongjiangensis, является представителем подгруппы Rickettsia japonica группы КПЛ, что подтверждено филогенетическим исследованием на основании анализа впервые секвенированного гена отрВ.

3. Показано, что клещевой риккетсиоз в Хабаровском крае (дальневосточный клещевой риккетсиоз) является эндемичным заболеванием, распространенным только в южных административных районах. Его особенностями являются пик заболеваемости в июле и преимущественная подверженность заболеванию лиц старших возрастных групп, что объясняется особенностями биологии переносчика и хозяйственной деятельности человека.

4. Переносчиками клещевого риккетсиоза, вызываемого Rickettsia heilongjiangensis (дальневосточного клещевого риккетсиоза), являются часто встречающиеся в Хабаровском крае клещи видов Haemaphysalis concinna (основной, инфицированность 28,13%) и Haemaphysalis japonica douglasi (второстепенный, инфицированность 4,48%), в отличие от малораспространенного клеща Dermacentor silvarum, переносчика клещевого риккетсиоза Северной Азии,.

5. Rickettsia sibirica (возбудитель клещевого сыпного тифа Северной Азии) не был выявлен ни в пробах от больных, ни в иксодовых клещах на юге Дальнего Востока;

6. Разработана высокочувствительная и специфичная тест-система на основе ПЦР для индикации наличия патогенных риккетсий в средах и тканях человека. Она позволяет целиком секвенировать ген цитрат-синтазы, что было использовано для идентификации риккетсий и для филогенетического анализа.

7. Выявлены клинические особенности инфекции, вызванной Rickettsia heilongjiangensis, при анализе случаев, этиология которых доказана методами молекулярной биологии: наличие неяркой сыпи только у 87,5% больных, склонность к образованию подкожных лимфангоитов.

8. В клещах вида Haemaphysalis japonica douglasi обнаружена ДНК риккетсий нескольких видов, в том числе R.heilongjiangensis (4,48%), Candidatus Rickettsia tarasevichiae (1,49%) и новой риккетсии, предварительно названной Candidatus Rickettsia principis (2,99%).

9. Растворимый антиген R.sibirica, применяющийся в практике с целью диагностики дальневосточного клещевого риккетсиоза (возбудитель R.heilongjiangensis) группоспецифичен и дает перекрестные реакции. Его применение для лабораторной диагностики дальневосточного клещевого риккетсиоза нецелесообразно, так как он менее специфичен, чем антиген возбудителя, R. heilongjiangensis.

125