Автореферат и диссертация по медицине (14.00.09) на тему:Молекулярно-генетические механизмы формирования гемобластозов у детей

На правахрукописи

ЯКУПОВА ЭЛЬВИРА ВЕНЕРОВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ФОРМИРОВАНИЯ ГЕМОБЛАСТОЗОВ У ДЕТЕЙ

14.00.09 - педиатрия

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Уфа-2004

Работа выполнена в Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук

Научные руководители:

доктор медицинских наук Викторова Татьяна Викторовна доктор медицинских наук, профессор Малиевский Олег Артурович

Официальные оппоненты

доктор медицинских наук, профессор Муталов Айрат Гайнетдинович доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент Российской академии медицинских наук Баранов Владислав Сергеевич Ведущее учреждение Научный центр здоровья детей Российской академии

медицинских наук

Защита состоится 2 июля 2004 г. в часов на заседании диссертационного совета в Государственном общеобразовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации» по адресу: г. Уфа, ул. Ленина, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного общеобразовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации» по адресу: г. Уфа, ул. Ленина, 3.

Автореферат разослан « _/» июня 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, д.м.н., профессор

Г.Х Мирсаева

Актуальность темы. В последние годы во всем мире наблюдается рост заболеваемости злокачественными новообразованиями (ЗНО). За период с 1990 по 1999 гг. заболеваемость ЗНО в детском возрасте в Российской Федерации (РФ) возросла с 8,5 до 10,9 на 100 000 детского населения [Трапезников Н.Н. и др., 2001]. Абсолютное число детей в возрасте от 0 до 14 лет с впервые установленным диагнозом ЗНО, учтенных онкологическими учреждениями, в РФ составило 2902, среди них у 45% диагностируются злокачественные новообразования лимфатической и кроветворной тканей - гемобластозы (ГБ). В Республике Башкортостан (РБ) в 1999 году заболеваемость ЗНО в детском возрасте составила 12,3 на 100 000 детского населения, а заболеваемость ГБ - 5,0 на 100 000 детского населения [Трапезников Н.Н. и др., 2001]. Важно отметить тенденцию к снижению смертности от ГБ с 3,5 до 2,3 на 100 000 детского населения за последние 10 лет.

Снижение смертности от ЗНО в целом и от ГБ, в частности, связано с применением современных программ полихимиотерапии. Однако терапия ГБ остается серьезной проблемой педиатрии и гематологии. Повышение ее эффективности связывают с ранней диагностикой заболевания, назначением индивидуально подобранных максимально переносимых доз цитостатических препаратов, подавлением резистентности опухолевых клеток к химиотерапии и поиском новых путей противоопухолевой терапии. Решение этих проблем невозможно без детального изучения патогенеза ГБ.

Известно, что канцерогенез является результатом действия многих факторов, среди которых немаловажную роль играет генетическая предрасположенность [Регега F.P., 1996; Баранов B.C. и др., 2000; Новик АА и др., 2001]. Известно, что дети с врожденными хромосомными аномалиями относятся к группе лиц с повышенным риском развития ГБ, так, например, у детей с синдромом Дауна риск развития острого лейкоза повышен в 10-20 раз [Plowman P.N. et al., 1992]. Среди генов-кандидатов патогенеза ЗНО основными являются онкогены и гены-супрессоры опухолевого роста, тогда как другие генные системы, в том числе гены детоксикации и гены цитокинов, играют роль модификаторов функции главных генов [Баранов B.C. и др., 2000, Владимирская Е.Б., 2001, Назаров П.Г., 2001], В этой связи, наряду с изучением генов-кандидатов ЗНО, в последние годы все шире изучается влияние многокомпонентной системы детоксикации ксенобиотиков, генов цитокинов и супрессоров опухолевого роста на предрасположенность к развитию ГБ, тяжесть течения заболеваний и индивидуальную

РОС НАМмпыд пш>п < I

цитостатическим препаратам. Однако в литературе опубликованы единичные исследования по изучению полиморфных вариантов генов системы детоксикации ксенобиотиков, цитокинов, метилирования генов-супрессоров опухолевого роста при гемобластозах в детском, возрасте [Canalle R., 2004; Davies S.M., 2000; Krajinovic M., 1999;OkudaT., 1995].

Цель настоящего исследования: выявление клинико-генетических ассоциаций генов детоксикации ксенобиотиков, супрессоров опухолевого роста и цитокинов при гемобластозах у детей и определение их значимости в оценке риска разития и прогноза течения заболевания.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Оценить клинико-гематологические особенности и показатель выживаемости у детей с гемобластозами в Республике Башкортостан.

2. Определить частоту аллельных и генотипических вариантов генов системы детоксикации ксенобиотиков, цитокинов и частоту метилирования генов-супрессоров опухолевого роста при гемобластозах у детей.

3. Выявить генотипы, играющие протективную роль в развитии гемобластозов у детей, установить генотипы повышенного риска развития гемобластозов в детском возрасте, а также генотипы, ассоциированные с неблагоприятным- исходомЛ гемобластозов у детей.

4. Разработать подходы к оценке риска развития заболевания и прогноза течения гемобластозов у детей.

Научная новизна работы. Проведено изучение структуры заболеваемости гемобластозами с учетом линейной принадлежности опухолевых клеток. Дана оценка клинических и гематологических особенностей гемобластозов в детском возрасте. Проанализированы показатели выживаемости при различных вариантах гемобластозов у детей. Проведен комплексный молекулярно-генетический анализ полиморфных вариантов генов детоксикации ксенобиотиков, цитокинов и супрессоров опухолевого роста при ГБ у детей. Выявлено, что мутантный аллель Val гена первой фазы детоксикации ксенобиотиков CYP1A1 и медленный генотип *5*5*6 гена второй фазы детоксикации ксенобиотиков NAT2 ассоциированы с повышенным > риском развития гемобластозов в детском возрасте. Показано, что комбинация генотипов CYPlAl*IleVal/CYP2El*ClC2, определяющих повышение активности цитохромов Р-450, и активная форма микросомальной ЕРНХ1 ассоциированы с риском развития неходжкинских лимфом в детском возрасте. Установлено, что

генотип, определяющий повышение активности микросомальной ЕРНХ1, ассоциирован с риском развития острых лимфобластных лейкозов у детей. Показана роль подавления активности гена-супрессора опухолевого роста р16 путем гиперметилирования промотора в развитии острых лимфобластных лейкозов у детей. Выявлено, что функционально активный ген второй фазы детоксикации GSTT1 ассоциирован с риском развития острого миелобластного лейкоза у детей в РБ. Выявлены комбинации генотипов генов детоксикации ксенобиотиков, ассоциированные с повышенным риском развития ГБ. Охарактеризованы сочетания протективных. генотипов генов детоксикации ксенобиотиков. Установлено, что генотип TNF*GA гена фактора некроза опухолей а ассоциирован с риском развития В-клеточных гемобластозов у детей в РБ.

Практическая значимость. Выявление полиморфных вариантов гена системы детоксикации ксенобиотиков NAT2, гена CYP1A1 и его комбинации с генами ЕРНХ1, GSTT1, MDR1 позволяет проводить оценку предрасположенности детей к развитию гемобластозов. Тестирование промежуточного фенотипа гена первой фазы детоксикации ксенобиотиков, ЕРНХ1 может использоваться в качестве прогностического маркера неблагоприятного исхода терапии рецидива гемобластозов в детском возрасте.

Результаты работы могут быть использованы при разработке основ медико-генетического консультирования..

Внедрение в практику. Выявленные генетические маркеры используются для прогнозирования-, течения ГБ у детей в онкогематологическом центре Республиканской детской клинической больницы.

Материалы исследования внедрены в педагогический процесс на кафедре госпитальной педиатрии с курсом поликлинической педиатрии и кафедре биологии Башкирского государственного медицинского университета.

Апробация диссертации и публикации. Результаты исследования представлены на: научно-практической конференции, посвященной 70-летию БГМУ (Уфа, 2002); научно-практической конференции, посвященной 30-летию Республиканской детской клинической больницы (Уфа, 2002); научно-практическом симпозиуме «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении» (Москва, 2002); Международной научно-практической школе-конференции «Цитокины. Воспаление. Иммунитет.» (С-Петербург, 2002); III съезде биохимического общества (С-Петербург, 2002); II International meeting of the Global

Organization Against leukemia (Miami, USA, 2002); The 8th Annual International Human Genome Meeting HGM 2003 (Cancun, Mexico, 2003); European Human Genetic Conference ESHG 2003 (Birmingham, England, 2003); International Congress of Genetics (Melbourne, Australia, 2003); Всероссийской научно-практической конференции «Современные достижения клинической генетики» (Москва, 2003); The 9th Annual • International Human Genome Meeting (Berlin, Germany, 2004); Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Актуальные проблемы современной медицины 2004» (Минск, 2004); XV Коми Республиканской молодежной научной конференции (Сыктывкар, 2004); 69-й Республиканской-итоговой научно-практической конференции студентов и молодых ученых РБ с международным участием «Вопросы теоретической и практической медицины» (Уфа, 2004); European Human Genetic Conference ESHG 2004 (Munich, Germany, 2004).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 1S7 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 22 таблицами и 30 рисунками. Список литературы включает 221 источник, в том числе 35 публикаций отечественных и 186 иностранных авторов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. В структуре гемобластозов у детей преобладают острые лимфобластные лейкозы, реже встречаются острые миелобластные лейкозы и неходжкинские лимфомы. На долю В-клеточных гемобластозов приходится 71,43%, Т-линейный вариант заболевания диагностируется в 28,57% случаев. При остром лимфобластном лейкозе общая двухлетняя выживаемость составляет 78,84±4,71%, четырехлетняя -58,82±7,32%. При остром миелобластном лейкозе общая выживаемость за 12 месяцев составляет 37,50±14,07%, при неходжкинских лимфомах общая выживаемость за 15 месяцев наблюдения составляет 61,54±16,64%.

2. Повышенный риск развития гемобластозов у детей ассоциирован с мутантным аллелем гена первой фазы детоксикации ксенобиотиков CYP1A1 и его комбинациями с генотипами генов ЕРНХ1, GSTT1.

2. С неблагоприятным прогнозом рецидива гемобластозов ассоциирован промежуточный фенотипический вариант гена первой фазы детоксикации ксенобиотиков ЕРНХ1, это можно использовать в качестве критерия риска при проведении терапии заболевания.

3. Протективную роль при развитии гемобластозов в детском возрасте играют генотип ПеЛ1е гена CYP1A1, аллель Не гена CYP1A1, генотип NAT2*74 (BamHI) и аллель NAT2*7 гена N-ацетилтрансферазы 2, комбинации генотипов генов детоксикации ксенобиотиков CYPlAl*IleIle/EPHXl*SAeHoran/GSTTl*l, CYP1 Al *IleIle/GSTTl *O/MDR1 *СТ.

4. Повышенный риск развития острого лимфобластного лейкоза у детей связан с метилированием промоторной области гена р16. Ассоциации метилирования промоторной области гена р16 с тяжестью течения заболевания не выявлено.

5. Полученные результаты позволяют прогнозировать риск развития заболевания гемобластозами в группе детей, предрасположенных к развитию злокачественных новообразований, и оптимизировать проведение цитосгатической терапии.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

Проведено углубленное клиническое, лабораторно-инструментальное и молекулярно-генетическое обследование 120 детей с гемобластозами в возрасте от нескольких месяцев до 15 лет, находившихся на стационарном лечении в онкогематологическом центре Республиканской детской клинической больницы в период с 2001 по 2003 год. В качестве группы сравнения обследованы 226 практически здоровых доноров, проживающих на территории РБ.

Диагноз подтверждался морфологическим, цитохимическим исследованием костного мозга, гистологическим анализом трепанобиоптата крыла подвздошной кости, диагноз нейролейкоза устанавливался на основании морфологического исследования спинномозговой жидкости. Изучение линейной принадлежности (Т-, В-клеточный) при остром лимфобласшым лейкозе и неходжкинских лимфомах проводилось с использованием проточного цитофлуорометра фирмы «Becton Dickinson FACSCalibuz» с использованием стандартного набора «Acute Leukemia Phenotype Kit».

ДНК выделяли из лимфоцитов периферической венозной крови методом фенольно-хлороформной экстракции [Mathew C.C., 1984]. Молекулярно-генетический анализ полиморфизма генов детоксикации ксенобиотиков: CYP1A1, CYP2E1, ЕРНХ1, GSTM1, GSTT1, GSTP1, NAT2, MDR1; цитокинов: IL-6, TNF, LTA - проводили методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК. Для изучения однонуклеотидных полиморфизмов: A4889G гена CYP1A1, С-1020Т гена CYP2E1,

Т337С и A415G гена ЕРНХ1, A313G гена GSTP1, С481Т, G590A и G857A гена NAT2, С3435Т гена MDR1, G-174C гена IL-6, G-308A reHa.TNF, A252G гена LTA - был использован метод рестрикционного анализа. Метилирование CpG-островков генов р 15 и р 16 определяли с помощью метилчувствительной ПЦР*.

Амплифицированные фрагменты ДНК разделяли электрофоретически в 7%-ном полиакриламидном неденатурированном геле. После окончания электрофореза гель окрашивали раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе.

Статистическая обработка. полученных данных, проводилась с помощью биометрических методов анализа [Животовский Л.А., 1991, Swofford D.L. et al., 1997]. Достоверность различий в распределении • частот генотипов среди больных ГБ и контролем рассчитывали с использованием критерия X1 с поправкой Йетса на непрерывность с помощью программы RxC-statistica (Rows and Columns) [Roff D.F. et al., 1989]. Попарное сравнение изучаемых признаков (больные - контроль) проводилось с помощью точного критерия Фишера. Уровень значимости (р) определяли по х'-распределению с одной степенью свободы. Различия между признаками считались достоверными при р<0,05, % л3,84. Для оценки относительного риска заболевания по конкретному аллелю или генотипу использовали показатель отношения шансов (Odds Ratio, OR). Анализ вероятности наступления изучаемого исхода в определенный промежуток времени (выживания) проводился методом множительных оценок Каплана-Мейера [Ребров О.Ю., 2002]. Математические вычисления проводились на персональном компьютере с использованием стандартных программ «Microsoft Excel'97», «Microsoft Access'97» и пакетов статистических программ «Statistica for Windows», SAS (PC Version 6,04).

Результаты исследования •

1. Клинико-гематологическая характеристика больных гемобластозами

Среди обследованных больных у 96 (80,00%) детей был диагностирован острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ), у 13 детей - острый миелобластный-лейкоз (ОМЛ) (10,83%) у 11 детей - неходжкинские лимфомы (НХЛ) (9,17%) (рис.1).

•Автор благодарит заведующую онкогематологическим центром РДКБ, главного детского гематолога МЧ РБ Т.Н.Красавцеву и заведующего лабораторией эпигенетики ГУ Медико-генетического научного центра РАМН д.б.н., профессора Д.В.Залетаева за сотрудничество и помощь в проведении исследования.

10,Г

9,17

волл

□ ОМЛ !

□ нхл

Рис. 1. Распределение больных гемобластозами

Заболевания диагностированы у 66 мальчиков (55,00%) и у 54 девочек (45,00%). В возрастной группе от нескольких месяцев до двух лет заболевания диагностированы у 15 пациентов (12,50%), от 2 до 10 лет - у 71 пациента (59,17%), в возрастной группе старше 10 лет заболевания диагностированы у 34 детей (28,33%). Среди больных ГБ преобладали жители городов РБ, на долю которых приходилось 65,80% (79 больных), доля сельских жителей составила 34,20% (41 ребенок).

Анализ длительности заболевания до установления точного клинического диагноза показал, что у 71 ребенка (59,17%) диагноз был установлен в течение первого месяца от начала заболевания, у 49 детей (40,83%) с момента появления первых признаков заболевания до постановки диагноза прошло более одного месяца.

Анализ клинических проявлений развернутой стадии заболевания выявил, что 84 ребенка (70,00%) при поступлении жаловались на слабость, у 61 пациента (50,83%) выявлена бледность кожных покровов. Повышение температуры тела выше 38°С отмечалось у 94 детей (78,33%). Геморрагический синдром диагностирован у 71 больного (59,17%). Костно-сустаъной синдром (костные боли, деструкция позвонков, увеличение в объеме и болезненность суставов) наблюдался у 29 детей (24,17%). Увеличение лимфатических узлов зарегистрировано у 91 ребенка (75,84%), причем у 71 пациента (59,17%) лимфатические узлы мелкие, размерами от 1,0 до 2,0 см, выражены повсеместно, а у 20 детей (16,67%) определялись изолированные конгломераты в области шеи, средостения, подмышечной области и брюшной полости размерами от 2,0 до 7,0x15,0 см.

Увеличение печени и селезенки выявлено у 90 детей (75%). У 56 детей (46,67%) диагностирована незначительная гепатоспленомегалия (менее 3 см из-под крал реберной дуги), у 24 детей (20,00%) - умеренная гепатоспленомегалия (от 3 до 5 см из-под края реберной дуги). УЮ детей (8,33%) отмечалось выраженное увеличение

печени и селезенки (более 5 см ниже края реберной дуги). Специфическое поражение нервной системы встречалось у 23 детей (19,16%).

Анализы периферической крови показали, что у 91 больного (75,83%) в развернутой стадии заболевания наблюдается анемический синдром. Снижение количества тромбоцитов определено у 65 пациентов (54,17%).

Анализ количества лейкоцитов-периферической крови показал, что у 20 детей (17,86%) дебют заболевания характеризовался лейкопенией (лейкоцитов менее Зх10'/л), у 51 ребенка (45,54%) количество лейкоцитов было в пределах возрастной нормы. У 41 больного (36,6%) отмечался гиперлейкоцитоз, среди них у 12 детей (10,71%) количество лейкоцитов в период развернутой стадии заболевания превышало 100хЮ'/л. У 73 больных (66,97%) в развернутой стадии заболевания определялось наличие бластных клеток в периферической крови, у 36 детей (33,03%) диагностирован алейкемический вариант картины периферической крови.

Анализ клеточного состава костного мозга детей в развернутой - стадии заболевания показал преобладание бластных клеток с угнетением нормальных ростков кроветворения. В группе обследованных, больных в преобладающем большинстве случаев в миелограмме обнаружено более 80% бластных клеток - 104 человека (86,67%) и только у трех детей (2,50%) в пунктате костного мозга определено менее. 50% бластных клеток. Применение иммунофенотипических методов исследования бластных клеток позволило в группе детей с ОЛЛ и НХЛ выделить пациентов с Т-клсточными (СБ3, СБ5, СБ7) и В-клеточными вариантами заболевания (СБ 10, СБ 19, СБ20, СБ22). Согласно полученным результатам в обследованной группе у 16 больных (28,57%) установлен Т-линейный вариант заболевания, у 40 детей (71,43%) - В-клеточный.

Анализ результатов терапии ГБ показал, что стойкой клинико-гематологической ремиссии в результате терапии заболевания удалось добиться у 76 детей (63,30%). У 24 пациентов (20,00%) диагностирован рецидив заболевания, у 20 детей (16,70%), несмотря на проводимое лечение, диагностированы терминальная стадия и летальный исход заболевания. В группе детей с рецидивом заболевания проведена высокодозная противорецидивная терапия, в результате которой у 13 детей (54,20%) достигнута повторная клинико-гематологическая ремиссия, у 11 детей (45,80%) зарегистрирован летальный исход заболевания.

Анализ общей выживаемости, проведенный у 134 детей с использованием метода множительных оценок Каплана-Мейера, показал, что при ОЛЛ общая

двухлетняя выживаемость составляет 78,84±4,71%, четырехлетняя - 58,82±7,32% (рис. 2). У 25% больных ОЛЛ летальный исход заболевания наступает за 22 месяца.

8ипг1у*| Рипсиол о Сотр1в1в ♦ С«п«ог«а

О 10 20 30 40 60 60

Бипг|уа| Т1те

Рис. 2. График времен жизни и кумулятивной доли выживаемости при остром лимфобластном лейкозе у детей (здесь и в рис. 3-4 по оси абсцисс - выживаемость, в месяцах; по оси ординат - число выживших, в долях)

При ОМЛ общая выживаемость за 12 месяцев составляет 37,50± 14,07%, у 25% детей летальный исход наступает за 3,5 месяца, а медиана времени выживания (период времени, за который летальный исход наступает у 50% больных) при ОМЛ составляет 9,33 месяца (рис. 3).

Рис. 3. График времен жизни и кумулятивной доли выживаемости при остром миелобластном лейкозе у детей

При НХЛ общая выживаемость за 15 месяцев наблюдения составляет 61,54± 16,64%, у 25% детей летальный исход заболевания наступает за 8 месяцев (рис

4).

Рис. 4. График времен жизни и кумулятивной доли выживаемости при неходжкинских лимфомах у детей

2. Полиморфизм генов системы детоксикации ксенобиотиков

Учитывая то, что химические вещества играют большую роль в развитии ГБ у детей, нами изучены полиморфные варианты генов детоксикации ксенобиотиков как факторы риска развития заболеваний у детей При изучении полиморфизма A4889G гена CYP1A1 у больных ГБ и в контрольной группе установлено, что нормальный генотип Ile/Ile гена CYP1A1 в группе больных ГБ встречался значительно реже, в 87,50% случаев по сравнению с 94,71% в контроле (^=4,48; р=0,034; OR=0,39) (рис.5)

На долю аллеля Не гена CYP1A1 в группе больных ГБ пришлось 93,33% против 97,12% в контроле (х2=4>44; р=0,035; OR=0,41) На основании полученных данных можно сделать заключение о протективной роли генотипа Ile/Ile и аллеля Не при развитии ГБ в детском возрасте.

Частота мутантного генотипа Ile/Val гена CYP1A1 в группе больных ГБ оказалась существенно выше (11,67%) у больных по сравнению с контрольной группой (4,81%) (xi=4.32; р=0,037; OR=2,61). Анализ распределения генотипов и аллелей гена CYP1A1 у больных ГБ с учетом диагноза показал, что частота генотипа выше частоты указанного генотипа в контроле во всех группах больных, с максимальным значением, равным 12,50% в группе детей с ОЛЛ р=0,03;

СЖ=2,83). Мутантный аллель Уа) гена СУР1А1 достоверно чаще встречался в группе больных ГБ (6,67%) по сравнению с контролем (2, 88%) (х2=4,44; р=0,035; СЖ=2,40).

Рис.5. Распределение генотипов гена СУР1Л1 у больных гемобластозами •Здесь и далее наличие достоверных различий с контрольной группой

Ассоциация генотипа Ue/Val и аллеля Val гена CYP1A1, определяющих повышение энзиматической активности фермента с риском развития ГБ у детей, может указывать на влияние химических веществ - активных метаболитов фермента первой фазы детоксикации ксенобиотиков CYP1A1 - на развитие злокачественной трансформации клеток крови.

Анализ распределения генотипов и аллелей полиморфизма С-1020Т гена CYP2E1 в группе больных ГБ и контроле показал отсутствие статистически достоверных различий между изученными группами.

При комплексном анализе полиморфизма генов первой фазы детоксикации ксенобиотиков CYP1A1 и CYP2E1 с учетом клинического диагноза показано, что индивиды с сочетанием мутантных генотипов генов системы цитохрома

Р450 имеют высокий риск развития НХЛ (OR=51,51).

Анализ распределения генотипов и аллелей полиморфизма Т337С третьего экзона гена ЕРНХ1 показал отсутствие статистически значимых различий между изученными группами.

Анализ распределения генотипов полиморфизма A415G четвертого экзона гена ЕРНХ1 показал ассоциацию гетерозиготного генотипа, приводящего к повышению активности гена (FN-генотип) с риском развития ГБ у детей. В группе больных ГБ частота FN-генотипа гена ЕРНХ1 оказалась существенно выше частоты в контрольной группе (р=0,047). Анализ распределения генотипов четвертого экзона гена ЕРНХ1 с учетом диагноза показал, что статистически значимое повышение частоты генотипа FN сохраняется в группе больных с ОЛЛ (р=0,035). На основании генотипирования полиморфизмов Т337С третьего экзона и A415G четвертого экзона

гена ЕРНХ1 выделяют три фенотипические формы: быструю промежуточную (^ и медленную Анализ фенотипических форм гена ЕРНХ1 показал снижение

частоты медленного фенотипа в группе больных ГБ (р=О,ОЗ). Важно отметить, что в группе детей с НХЛ лиц с медленным фенотипом гена ЕРНХ1 выявлено не было (р=0,014). В группе детей, умерших в период рецидива заболевания, достоверно чаще встречался промежуточный фенотип гена ЕРНХ1

Изучение полиморфных вариантов генов первой фазы детоксикации показало, что генотипы, определяющие повышение активности ферментов, ассоциированы с риском развития гемобластозов в детском возрасте.

У больных ГБ проведен анализ генов 2-й фазы детоксикации ксенобиотиков: глутатион-8-трансфераз (GSTM1, GSTT1, GSTP1) и ^ацетилтрансферазы 2.

В группе больных ОМЛ выявлено повышение частоты делеции гена GSTM1 до 61,53% (р>0,05) (рис. 6) Анализ распределения генотипов гена GSTT1 показал снижение частоты делеции гена GSTT1 в группе больных ГБ до 14,17% по сравнению с контролем 23% (р=0,07)

озтмп езтмго взт*! огт-о

Рис. 6. Распределение генотипов генов глутатион-8-трансфераз (GSTM1, GSTT1) у больных гемобластозами

Низкая частота делеции сохраняется во всех группах больных, а в группе детей с ОМЛ генотип не встречался ни у одного пациента

OR=8,12). На основании полученных результатов можно сделать заключение, что у носителей функционального гена GSTT1 в гомо- или гетерозиготном состоянии риск развития ОМЛ повышен более чем в 8 раз.

Выявлено повышение частоты комбинации генотипов GSTM1*O/GSTT1*1 у детей с ОМЛ

Анализ частоты генотипов полиморфизма A313G гена GSTP1 у больных ГБ показал отсутствие ассоциации- генотипов- гена GSTP1 с риском развития заболевания.

При изучении полиморфизма гена NAT2 выявлено, что в группе больных ГБ генотип ЫАТ2*47 (BamHI) встречался в два раза реже по сравнению с контрольной группой (р=0,03). Достоверные различия в частотах сохранялись для группы больных с ОЛЛ (р=0,027). Аллель КАТ2*7 в группе больных ГБ также встречался достоверно реже по сравнению с контрольной группой (р=0,043). На основании полученных результатов можно сделать заключение, что генотип NAT2*47(Bamffl) и аллель NAT2*7 играют протективную роль при развитии ГБ у детей.

В группе больных ГБ лица, гомозиготные по нормальному аллелю (*4*4), встречались в три раза чаще, чем в контрольной группе (р=0,043) (рис. 7). Генотип *4*4 оказался выше во всех группах с максимальным значением в группе детей с НХЛ (16,67% против 3,13% в контроле). На основании полученных результатов можно предположить, что генотип *4*4 гена NAT2 ассоциирован с риском развития ГБ у детей (OR=3,4).

Анализ частоты генотипа NAT2*4*4 в группе больных ГБ с учетом тяжести течения заболевания показал, что в группе детей, достигших полной клинико-гематологической ремиссии, генотип NAT2*4*4 встречался в 13,64% случаев по сравнению с группой детей с рецидивом заболевания, в которой данный генотип не выявлен ни у одного ребенка (р=О,О58).

25

ОК=3.4

ОК=4.18

20

□ ГБ □ Контроль

- а

о

р

о

1В 1,11 ~ ^д,

Ч- Ч Ч Ч ч Ч Ч Ч> Чк \ Ч> Ч^ ^ Ч \ Ч

к

Рис. 7. Распределение генотипов гена N-ацетилтрансферазы 2 у больных гемобластозами

Маркерным для больных ГБ оказался генотип *5*5*б, который встречался с частотой 11,89% по сравнению с 3,13% в контрольной группе (OR=4,18).

Анализ распределения генотипов и аллелей полиморфизма С3435Т гена MDR1 показал отсутствие статистически значимых различий между изученными группами.

Анализ комбинаций генотипов генов системы детоксикации ксенобиотиков показал, что сочетание гетерозиготного генотипа гена CYPlAl*IleVal, определяющего повышение активности фермента с функционально активным геном GSTT1, повышает риск развития ГБ в детском возрасте (рис. 8).

При сочетании генотипов CYP1 Al*UeVal, функционально активного GSTT1 и гомозиготного по мутации гена MDR1*TT риск развития ГБ повышается в 14,28 раза Риск развития ГБ также повышен при сочетании генотипа CYP1 А1*11е11е, генотипа EPHX1*FN (полиморфизм A415G четвертого экзона, приводящий к повышению активности фермента) и функционально активного гена GSTT1 (р=0,049).

CYPlA1*IleVal/GSTTl*l/MDRl*TT

1 ' 114,28

-12 71 CYPlAl*»rfVal/GSTTl*l Рисковые

-—-1 *•>' I—I

I I—I генотипы

11.9 CYPtAl»IlelWEPHXl*FWGSrri*l

I ' Протективные

2 0,24' CYPIAlMIcIle/GSTTl'O/MDRI'CT I генотипы

I

tu 0,45 CYPlAtMlelle/EPHXI*S/CSTTI4

0 2 4 6 В 10 12 14 16

Рис. 8. Сочетания протективных и рисковых комбинаций генотипов генов системы детоксикации ксенобиотиков у больных гемобластозами, (по оси абсцисс -показатель отношения шансов)

Анализ комбинаций полиморфных вариантов генов системы детоксикации выявил сочетания протективных генотипов. К этой группе относится сочетание генотипа CYP1 AI »Helle с медленным фенотипическим вариантом гена ЕРНХ1 и функционально активного GSTT1 (р=0,028). К протективным комбинациям можно отнести также генотип CYPlAl*IleIle в сочетании с делецией гена GSTT1 в гомозиготном состоянии и генотипом

3. Частота метилирования генов-супрессоров опухолевого роста р15 ир1б

Высокая частота генетических повреждений генов-супрессоров опухолевого роста р16 и р15 при злокачественных новообразованиях системы кроветворения отражает вклад нарушения циклин-циклинзависимые киназы-ЯЬ-контроля регуляции клеточного цикла при развитии опухолевой трансформации [Ogawa S. et al. 1994; Okuda T. et al., 1995; Klangby U. et al., 1998]. Однако часто подавление экспрессии генов наблюдается и в случаях отсутствия делеции или рекомбинации гена, что предполагает наличие эпигенетических механизмов инактивации [Ogawa S. et al. 1994; Okuda T. et al, 1995; Klangby U. et al., 1998; Baur A. et al., 1999; Nosaka K. et al., 2000; Omura-Minamisawa M. et al., 2000].

Согласно литературным данным и результатам нашего исследования, в образцах ДНК индивидов контрольной группы метилирования CpG динуклеотидов промоторных областей генов р15 и р16 не обнаружено [Klangby U. et al., 1998; Kohno Т. et al., 1998; Cameron E. et al., 1999; Nosaka K. et al, 2000; Esteller M. et al, 2001].

Анализ метилирования CpG-островка промоторной области гена-супрессора опухолевого роста p15 показал отсутствие метилирования гена в группе больных ГБ. Ген р16 в группе больных ГБ оказался метилирован только в группе детей с ОЛЛ с частотой 9,67% (рис. 9). Среди больных ОМЛ и НХЛ метилирования промотора гена pi6 не выявлено.

Рис. 9. Метилирование гена р16 у больных острым лимфобластным лейкозом

Анализ степени метилирования CpG-динуклеотидов первого экзона гена р16 показал повышение частоты метилирования в группе больных с ОЛЛ (26,04%) и ОМЛ (38,46%) против 17,54% в контроле. Частота комплексного метилирования CpG-динуклеотидов промоторной области и первого экзона гена р16 в группе больных ОЛЛ составила 8,60% (OR=15,60). Анализ частоты метилирования гена р16 с учетом эффективности терапии и тяжести течения заболевания показал, что у 7 из 9 Детей с метилированием CpG-островка промоторной области гена р16 достигнута стойкая клинико-гематологическая ремиссия, у двух детей ремиссия достигнута в результате противорецидивной терапии первого костно-мозгового рецидива.

Повышение частоты метилирование гена р16 при ОЛЛ у детей свидетельствует о важной роли инактивации ингибиторов циклинзависимых киназ в патогенезе развития ОЛЛ в детском возрасте. Метилирование промоторной области гена р16 можно использовать в качестве благоприятного прогностического фактора при терапии ГБ.

4. Изучение полиморфных вариантов генов цитокинов IL-6, TNF, LTA у больных гемобластозами

Учитывая то, что цитокины через цепь внутриклеточных событий индуцируют гены раннего ответа (c-fos, c-myc, c-jun), являющиеся ключевыми регуляторами клеточной пролиферации и дифференцировки, нами проведен анализ ассоциации полиморфных вариантов генов цитокинов IL-6, TNF, LTA с предрасположенностью к развитию и тяжестью течения гемобластозов в детском возрасте.

Анализ распределения генотипов и аллелей генов цитокинов IL-6, TNF, LTA у больных ГБ и в контрольной группе достоверных различий между группами не выявил. Ассоциации генов с вариантами заболеваний и эффективностью терапии ГБ у детей также показано не было.

Анализ распределения генотипов гена TNF с учетом линии дифференцировки лимфобластов показал, что в группе В-клеточных ГБ частота генотипа TNF*GA повышена до 25% по сравнению с группой Т-клеточных ГБ, в которой генотип TNF*GA не встречался ни у одного больного (р=0,01) (рис. 10). На основании полученных результатов можно предположить, что TNF играет важную роль в пролиферации лимфоцитов В-клеточной линии дифференцировки.

Рис. 10. Распределение генотипов гена TNF в группе больных ГБ с учетов иммунологического фенотипа лимфобластов

Таким образом, при изучении полиморфных вариантов генов детоксикации ксенобиотиков выявлено, что полиморфные варианты гена CYP1A1 и его комбинации с генами ЕРНХ1, GSTT1, MDR1 ассоциированны с повышенным риском развития гемобластозов в детском возрасте. Промежуточный фенотипический вариант гена первой фазы детоксикации ксенобиотиков ЕРНХ1 ассоциирован с неблагоприятным прогнозом рецидива гемобластозов, что позволяет рекомендовать использование гена ЕРНХ1 в качестве критерия риска при проведении противорецидивной терапии. Выявлены аллели и генотипы, а также комбинации генотипов генов системы детоксикации ксенобиотиков, играющие протективную роль при развитии гемобластозов у детей. Выявлена роль метилирования регуляторной области гена супрессора опухолевого роста р16 при развитии острого лимфобластного лейкоза у детей, ассоциации метилирования с тяжестью течения заболевания не было. Показана ассоциация генотипа TNF*GA гена TNF с гемобластозами, бластные клетки которых экспрессируют CD-маркеры В-клеточной линии дифференцировки.

Выводы

1. В структуре гемобластозов у детей преобладают острые лимфобластные лейкозы (80,00%), реже встречаются острые миелобластные лейкозы (10,83%) и неходжкинские лимфомы (9,17%). На долю В-клеточных гемобластозов приходится 71,43%, Т-линейный вариант заболевания диагностируется в 28,57% случаев.

2. При остром лимфобластном лейкозе общая двухлетняя выживаемость составила 78,84±4,7Г/о, четырехлетняя выживаемость - 58,82±7,32%. При остром миелобластном лейкозе общая выживаемость за 12 месяцев составила 37,50±14,07%, при нсходжкинских лимфомах общая выживаемость за 15 месяцев наблюдения составила 61,54± 16,64%.

3. Повышенный риск развития гемобластозов в детском возрасте определяют: аллель Val гена первой фазы детоксикации CYP1A1 (OR=2,40), генотип

гена второй фазы детоксикации ксенобиотиков N-ацетилтрансферазы 2 (04=3,41), комбинации генотипов генов системы детоксикации ксенобиотиков

СУР 1А1 *IleVal/GSTT 1 * 1/MDR1 *ТТ (OR= 14,28);

CYPlAl*IleIle/EPHXl*FN/GSTTl*l (OR=1,90). Генотип TNF*GA гена фактора некроза опухолей ассоциирован с риском развития В-клеточных гемобластозов в детском возрасте (OR=11,36).

4. С повышенным риском развития острого лимфобластного лейкоза у детей ассоциированы: генотип гена первой фазы детоксикации CYP1A1(OR=2,83), генотип гена первой фазы детоксикации ксенобиотиков микросомальной эпоксигидролазы (OR=4,13), генотип NAT2*44 (ВатШ) (OR=3,06) и генотип *5*5*6 гена второй фазы детоксикации N-ацетилтрансферазы 2 (OR=1,84).

5. С повышенным риском развития острого лимфобластного лейкоза у детей ассоциировано гиперметилирование CpG-островка промоторной области гена супрессора опухолевого роста р 16 (OR=20,42). В группе больных острым лимфобластным лейкозом определено повышение частоты одновременного метилирования CpG-динуклеотидов промоторной области и первого экзона гена р16 (OR=15,60), причем у всех пациентов с метилированием промоторной области гена р16 достигнута клинико-гематологическая ремиссия.

6. Высокий риск летального исхода рецидива гемобластозов в детском возрасте ассоциирован с промежуточным фенотипом гена первой фазы детоксикации ксенобиотиков микросомальной эпоксигидролазы ЕРНХ1 (OR=10,12).

7. Протективную роль в развитии гемобластозов в детском возрасте играют:

генотип Ие/11е гена CYP1A1 ((Ж=0,39), аллель Не гена CYP1A1 (OR=<),41), генотип NAT2*74 (ВагаШ) (C)R=0,38) и аллель NAT2*7 (ORK),43) гена второй

фазы детоксикации ксенобиотиков N-ацетилтрансферазы 2, комбинации

генотипов генов детоксикации ксенобиотиков: CYP1 Al*llelle/EPHX1*S-фенотип/GSTTl * 1 (OR=0,45); CYPIAlMlelle/ GSTT1 »0/MDR1 »CT (OR=0,24).

Практические рекомендации

1. Для оценки риска развития гемобластозов у детей, предрасположенных к развитию заболевания (дети с синдромом Дауна, апластическими анемиями, миелодиспластическим синдромом и др.), целесообразно исследовать полиморфные варианты гена первой фазы детоксикации ксенобиотиков CYP1A1 и его комбинации с генами ЕРНХ1, GSTT1, MDR1.

2. Для оценки степени ри?ка неблагоприятного исхода терапии, рецидива гемобластозов у детей рекомендуется определение фенотипических вариантов гена первой фазы детоксикации ксенобиотиков ЕРНХ1.

3. Определение метилирования промоторной области гена-супрессора опухолевого роста р16 у детей, больных острым лимфобластным лейкозом можно использовать в качестве критерия благоприятного исхода заболевания.

4. Выявление - у детей с гемобластозами полиморфных вариантов генов, ассоциированных с неблагоприятным исходом заболевания, необходимо учитывать при проведении полихимиотерапии высокими дозами цитостатических препаратов.

Список публикаций

1. Якупова Э.В. Молекулярно-генетический анализ полиморфизма -174G/C в промоторной области гена интерлейкина 6 и полиморфизма -308G/A в промоторной области гена фактора некроза опухолей у больных острым лейкозом из Башкортостана / Э.В. Якупова, Т.Н. Красавцева, О.В.Гринчук, Т.В. Викторова // Научно-практический симпозиум «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении». - Москва, 2002. - С. 123.

2. Якупова Э.В. Молекулярно-генетический анализ полиморфизма -174G/C в промоторной области гена 1L-6 и полиморфизма - -308G/A в промоторной области гена TNF у больных острым лейкозом из Башкортостана / Э.В. Якупова, Т.Н.

Красавцева, СВ.Гринчук, Т.В. Викторова // III съезд биохимического общества: Тез. кон.- СПб.,2002.-С.321-322

3. Yakupova E.V. Polymorphism of -174G/C Interleukin 6 gene: molecular genetic study in the susceptibility to childhood acute leukemia / E.V. Yakupova, T.N. Krasavtccva, MA. Osipova et al. // The second international meeting of the Global Organization Against leukemia (GOAL). - Miami, FL, USA, 2002. - Poster № 2.2. P. 83.

4. Викторова ТЗ. Полиморфизм гена N-ацетилтрансферазы 2 в популяциях Волго-Уральского региона и у больных хроническими обструктивными болезнями легких / Т.В. Викторова, Г.Ф.Корытина, ДХЛнбаева, ОВ.Макарова, Э.В. Якупова // «Актуальные проблемы генетики», конференция посвященная-115-летию со дня рождения Н. И. Вавилова. - Москва, 2003 - С. 89-90.

5. Yakupova E.V. Polymorphisms of the IL-6, TNF and LTA genes associated with susceptibility to acute leukemia in children / E.V. Yakupova, T.N. Krasavtceva, OA. Malyevsky, T.V.Victorova // HGM 2003, Cancun, Mexico, 2003. - Poster № 292. - P. 126.

6. Yakupova E.V. Polymorphisms ofxenobiotic detoxification genes and susceptibility to blood cancer in children / E.V. Yakupova, T.N. Krasavtceva, O.V.Grinchuk, OA. Malyevsky et al. // Eur. J. Hum. Genet. European Human Genetic Conference. -Birmingham, England, 2003. - Poster № 003. - P. 61.

7. Yakupova E.V. Polymorphism of the IL-6, TNFa and TNFb genes associated with susceptibility to acute leukemia in children / E.V. Yakupova, O.A. Malyevsky, T.N. Krasavtceva, T.V.Victorova // Int. Congress of Genetics, Melbourne, Australia, 2003. - P. 122.

8. Бакиров БА. Молекулярно-генетический анализ полиморфизма генов интерлейкина 6, фактора некроза опухолей и глутатион-8-трансферазы Ml у больных хроническим лимфолейкозом / БА. Бакиров, Э.В. Якупова, Д-Х. Калимуллина и др. // Медицинская генетика. - 2003. - Т. 2. - № 12. -С. 537-540.

9. Якупова Э.В. Молекулярно-генетический анализ полиморфизма генов интерлейкина 6 и фактора некроза опухолей альфа у больных множественной миеломой / Э.В. Якупова, О.ВТринчук, Д.Х.Калимуллина и др. // Молекулярная биология. - 2003. - Т. 37. - № 3. - С. 420-424.

10. Викторова Т.В. Полиморфизм гена ариламин-К-ацетилтрансферазы 2 у народов Волго-Уральского региона / Т.В.Викторова, Г.Ф.Корытина, О.В.Макарова, Д.Г. Янбаева, Э.В. Якупова и др. // Молекулярная биология. - 2003. - Т. 37. - № 6. - С. 971974.

11. Макарова О.В. Полиморфизм генов метаболизма ксенобиотиков у рабочих нефтехимических производств / О.В.Макарова, Т.В.Викторова, Д.Г.Янбаева, Г.Ф.Корытина, Э.В. Якупова // Генетика. - Т. 39. - № 9. - С. 1268-1274.

12. Якупова Э.В. Роль полиморфизма генов цитокинов при гемобластозах у детей / Э.В. Якупова, Т.Н. Красавцева., ОА Малиевский., Т.В. Викторова // Всероссийская научно-практическая конференция «Современные достижения клинической генетики»: Тез.кон. - М., 2003. - Медицинская генетика. - Т. 2. - № 10. - С. 448.

13. Yakupova E.V. Tumor necrosis factor, lymphotoxin-alpha and interleukin 6 genetic polymorphisms and risk of development of hematological malignancies / / E.V. Yakupova, T.N. Krasavtceva, OA. Malyevsky, T.V.Victorova // Human Genome Meeting 2004. -Berlin, Germany, 2004. - Poster № 44. - P. 56.

14. Якупова Э.В. Эпигенетическая регуляция генов-супрессоров опухолевого роста при гемобластозах у детей / Э.В. Якупова, Т.Н. Красавцева, О.А. Малиевский,

ДБ. Залетаев, Т.В. Викторова // Международная научная конференция студентов и молодых ученых «Актуальные проблемы современной медицины 2004»: Тез.кон. -Минск, 2004. - С. 55.

15. Ахмадишина Л.З. Анализ метилирования генов супрессоров опухолевого роста при гемобластозах у детей / Л.3 .Ахмадишина, Э.В. Якуоова, Т.Н.Красавцева и др. // Республиканская итоговая научно-практическая конференция студентов и молодых ученых РБ с международным участием «Вопросы теоретической и практической медицины»: Тез.кон. - Уфа, 2004. - С. 195.

Якупова Эльвира Венеровна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ФОРМИРОВАНИЯ ГЕМОБЛАСТОЗОВ У ДЕТЕЙ

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Лицензия № 0177 от 10.06.96 г. Подписано к печати 28.05.2004 Бумага офсетная. Отпечатано на ризографе. Формат 60x84 '/\16 Усл.-печ. л. 1,5. Уч.-изд. 1,7. Тираж 100 экз. Заказ № 308.

450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3, Башкирский государственный медицинский университет

pi 29 7 3

Актуальность темы. В последние годы во всем мире наблюдается рост заболеваемости злокачественными новообразованиями, одной из причин которого является загрязнение окружающей среды. Результаты корреляционного анализ1", связи между количественными показателями внешнесредового загрязнения и распространенности онкозаболеваний, проведенного в 84 городах Российской Федерации (РФ), позволили установить, что увеличение загрязнения атмосферного воздуха на 100 мкг/м3 сопровождается увеличением заболеваемости злокачественными новообразованиями (ЗНО) почти на 20% [Гичев Ю.П., 2002]. В 1990 году заболеваемость ЗНО в детском возрасте в РФ составляла 8,5 на 100 000 населения, тогда как в 1999 заболеваемость возросла до 10,9 на 100 000 [Трапезников H.H. и др., 2001]. В детском возрасте к наиболее распространенным онкологическим заболеваниям относятся гемобластозы (ГБ) - группа злокачественных новообразований клеток системы кроветворения, на долю которых приходится до 45% всей онкопатологии в возрастной группе до 14 лет.

В Республике Башкортостан (РБ) в 1999 году заболеваемость ЗНО в детском возрасте составила 12,3 на 100 000, а заболеваемость ГБ - 5,0 на 100 000 детского населения [Трапезников H.H. и др., 2001].

В структуре детской смертности в РФ новообразования и болезни крови и кроветворных органов занимают 6 место после несчастных случаев, отдельных состояний перинатального периода, врожденных пороков развития, болезней органов дыхания и инфекционных заболеваний. Абсолютное число детей, умерших от злокачественных новообразований, в 1999 году в РФ составило 1451, среди которых на долю заболеваний лимфатической и кроветворной тканей пришлось 42% (610 детей). Важно отметить тенденцию к снижению смертности от ГБ с 3,5 до 2,3 на 100 000 за последние 10 лет.

Снижение смертности от ГБ связано с применением современных программ полихимиотерапии. В настоящее время при остром лимфобластном лейкозе (OJIJI) выздоравливает 70-75% детей, при остром миелобластном лейкозе (OMJI) - 40-50% детей, а при неходжкинских лимфомах (HXJI) выживаемость у детей составляет более 75% [Алексеев Н.А, 1998]. Однако, терапия ГБ остается серьезной проблемой педиатрии и гематологии. Повышение ее эффективности связывают с ранней диагностикой заболевания, назначением индивидуально подобранных максимально переносимых доз цитостатических препаратов, адекватной сопроводительной терапией, направленной на коррекцию токсического действия препаратов, подавлением первичной и вторичной резистентности опухолевых клеток к химиотерапии и поиском новых путей противоопухолевой терапии. Решение этих проблем невозможно без детального изучения патогенеза ГБ.

Наиболее эффективно организм функционирует при сопряженном, гармоничном действии ферментов системы детоксикации экзогенных и эндогенных ксенобиотиков, репарации повреждений ДНК, апоптоза, пролиферации и дифференцировки клеток [Perera F.P., 1996]. Отмена или ослабление механизмов негативного контроля пролиферации, активация и превалирование влияния факторов положительного контроля роста в сочетании с отменой апоптоза в ДНК поврежденных клеток приводит к иммортализации и усиленной пролиферации неотрансформированных клеток [Perera F.P., 1996; Баранов B.C. и др., 2000; Новик A.A. и др., 2001].

Известно, что канцерогенез является результатом действия многих факторов, среди которых немаловажную роль играет генетическая предрасположенность. Известно, что дети с врожденными хромосомными аномалиями относятся к группе лиц с повышенным риском развития ГБ, так, например, у детей с синдромом Дауна риск развития острого лейкоза повышен в 10-20 раз [Plowman P.N. et al., 1992]. Среди генов-кандидатов патогенеза ЗНО основное значение отводится онкогенам и генам-супрессорам опухолевого роста, тогда как другие генные системы, в том числе гены детоксикации и гены цитокинов, играют роль модификаторов функции главных генов [Баранов B.C. и др., 2000; Владимирская Е.Б., 2001; Назаров П.Г., 2001].

В этой связи, наряду с изучением генов-кандидатов ЗНО, в последние годы все шире изучается вклад многокомпонентной системы детоксикации ксенобиотиков, генов цитокинов и супрессоров опухолевого на предрасположенность к развитию, тяжесть течения и индивидуальную чувствительность к применяемым цитостатическим препаратам. Однако в литературе опубликованы единичные исследования по изучению полиморфных вариантов генов системы детоксикации ксенобиотиков, цитокинов и метилирования генов-супрессоров опухолевого роста и оценке их прогностической значимости при гемобластозах в детском возрасте, в связи с чем, актуальным является изучение ассоциации полиморфных вариантов генов указанных систем с предрасположенностью к развитию и тяжестью течения гемобластозов у детей [Canalle R., 2004; Davies S.M., 2000; Krajinovic М., 1999; Okuda Т., 1995].

Цель настоящего исследования: выявление клинико-генетических ассоциаций генов детоксикации ксенобиотиков, супрессоров опухолевого роста и цитокинов при гемобластозах у детей и определение их значимости в оценке риска развития и прогноза течения заболевания.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Оценить клинико-гематологические особенности и показатель выживаемости у детей с гемобластозами в Республике Башкортостан.

2. Определить частоту аллельных и генотипических вариантов генов системы детоксикации ксенобиотиков, цитокинов и частоту метилирования генов супрессоров опухолевого роста при гемобластозах у детей.

3. Выявить генотипы, играющие протективную роль в развитии гемобластозов у детей, установить генотипы повышенного риска развития гемобластозов в детском возрасте, а такя^е генотипы, ассоциированные с неблагоприятным исходом гемобластозов у детей.

4. Разработать подходы к оценке риска развития заболевания и прогноза течения гемобластозов у детей.

Научная новизна работы. Проведено изучение структуры заболеваемости гемобластозами с учетом линейной принадлежности опухолевых клеток. Дана оценка клинических и гематологических особенностей гемобластозов в детском возрасте. Проанализированы показатели выживаемости при различных вариантах гемобластозов у детей. Проведен комплексный молекулярно-генетический анализ полиморфных вариантов генов детоксикации ксенобиотиков, цитокинов и супрессоров опухолевого роста при ГБ у детей. Выявлено, что мутантный аллель Val гена первой фазы детоксикации ксенобиотиков CYP1A1 и медленный генотип *5*5*6 гена второй фазы детоксикации ксенобиотиков NAT2 ассоциированы с повышенным риском развития гемобластозов в детском возрасте. Показано, что комбинация генотипов CYP1 Al*IleVal/CYP2El*ClC2, определяющих повышение активности цитохромов Р-450 и активная форма микросомальной ЕРНХ1 ассоциированы с чиском развития неходжкинских лимфом в детском возрасте. Установлено, что генотип, определяющий повышение активности микросомальной ЕРНХ1, ассоциирован с риском развития острых лимфобластных лейкозов у детей. Показана роль подавления активности гена-супрессора опухолевого роста р16 путем гиперметилирования промотора в развитии острых лимфобластных лейкозов у детей. Выявлено, что функционально активный ген второй фазы детоксикации GSTT1 ассоциирован с риском развития острого миелобластного лейкоза у детей в РБ. Выявлены комбинации генотипов генов детоксикации ксенобиотиков повышенного риска развития гемобластозов, с характеризованы сочетания протективных генотипов генов детоксикации ксенобиотиков. Установлено, что генотип TNF*GA гена фактора некроза опухолей ассоциирован с риском развития В-клеточных гемобластозов у детей в РБ.

Практическая значимость. Выявление полиморфных вариантов гена системы детоксикации ксенобиотиков К!АТ2, гена СУР1А1 и его комбинации с генами ЕРНХ1, ОБТ'П МОЮ позволяет проводить оценку предрасположенности к развитию гемобластозов в детском возрасте. Тестирование промежуточного фенотипа гена первой фазы детоксикации ксенобиотиков ЕРНХ1 может использоваться в качестве прогностического маркера неблагоприятного исхода терапии рецидива гемобластозов в детском возрасте.

Результаты работы могут быть использованы при разработке основ и медико-генетического консультирования.

Внедрение в практику. Выявленные генетические маркеры используются для прогнозирования течения гемобластозов у детей в онкогематологическом центре Республиканской детской клинической больницы.

Материалы исследования внедрены в педагогический процесс на кафедре госпитальной педиатрии с курсом поликлинической педиатрии и кафедре биологии Башкирского государственного медицинского университета.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 157 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 22 таблицей и 30 рисунками. Список литературы включает 221 источника, в том числе 35 публикации отечественных и 186 иностранных авторов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Клинико-гематологическая характеристика больных гемобластозами

Проведен анализ клинико-гематологических показателей у 120 детей больных гемобластозами, проживающих на территории Республики Башкортостан. Клиническая характеристика больных ГБ представлена в табл. 4.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для оценки риска развития гемобластозов у детей, предрасположенных к развитию заболевания (дети с синдромом Дауна, апластическими анемиями, миелодиспластическим синдромом и др.), целесообразно исследовать полиморфные варианты гена первой фазы детоксикации ксенобиотиков СУР1А1 и его комбинации с генами ЕРНХ1, 08ТТ1, МБШ.

2. Для оценки степени риска неблагоприятного исхода терапии рецидива гемобластозов у детей рекомендуется определение фенотипических вариантов гена первой фазы детоксикации ксенобиотиков ЕРНХ1.

3. Определение метилирования промоторной области ген-супрессора опухолевого роста р16 у детей больных острым лимфобластным лейкозом можно использовать в качестве критерия благоприятного исхода заболевания.

4. Выявление у детей с гемобластозами полиморфных вариантов генов, ассоциированных с неблагоприятным исходом заболевания, необходимо учитывать при проведении полихимиотерапии высокими дозами цитостатических препаратов.