Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Молекулярно-генетические изменения при раке предстательной железы

На правах рукописи

КЕКЕЕВА Татьяна Владимировна

Молекулярно-генетические изменения при раке предстательной железы

14.00.14 - онкология 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ииа448095

Москва - 2008 г.

003448095

Работа выполнена в ГУ Медико-генетический научный центр РАМН

Научный руководитель: доктор биологических наук, ведущий

научный сотрудник ГУ МГНЦ РАМН Немцова Марина Вячеславовна

член-корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор, зав. патологоанатомическим отделением ФГУ МНИОИ им. П.А. Герцена Франк Георгий Авраамович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор ГОУ

ВПО МГМСУ Петрин Александр Николаевич;

доктор медицинских наук, старший научный сотрудник ФГУ МНИОИ им. П.А. Герцена Теплов Александр Александрович

Ведущая организация: НИИ канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН.

Защитадкссертации состоится "¿Ц" ОШГ¡^^/ЭсРЮОЯ г. в/У час, на заседании диссертационного совета Д 208.047.01 по адресу: Москва, 125284, 2-й Боткинский пр., дом 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ Московского научно-исследовательского онкологического института имени П.А.Герцена Росмедтехнологий

Автореферат разослан "/¿" в^игЛХрЛ 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор медицинских наук

профессор С.А. Седых

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Рак предстательной железы (РПЖ) является одним из наиболее часто встречающихся злокачественных новообразований у мужчин, которому с каждым годом уделяется все больше внимания. Это обусловлено тем, что быстрыми темпами увеличивается заболеваемость, особенно у мужчин пожилого возраста. В структуре онкологических заболеваний в ряде стран рак предстательной железы выходит на 2-3 место после рака легких и желудка, а в США - на первое место. Вместе с тем смертность от РПЖ среди прочих онкологических заболеваний занимает третье место у мужчин после рака легкого и толстой кишки.

В настоящий момент основным диагностическим критерием РПЖ является патологоанатомическое исследование. В противоположность, молекулярно-генетические маркеры в клинической практике применяются в исключительных случаях или находятся в стадии научных разработок. Учитывая, что молекулярные изменения являются наиболее ранними в канцерогенезе, применение подобных маркеров в клинике могло бы расширить возможности ранней диагностики и увеличить ее прогностический потенциал. Таким образом, приоритетным направлением в диагностике РПЖ является поиск и характеристика новых молекулярно-генетических маркеров с достаточной чувствительностью и специфичностью для применения в клинической практике.

К настоящему времени, важность взаимодействия между стромальными и эпителиальными клетками хорошо известна не только для эмбрионального развития, но и для канцерогенеза. Опухолевое микроокружение играет существенную роль в процессах развития и прогрессии опухолей. Многочисленные свидетельства генетических перестроек в строме опухоли говорят, о том, что это не только заболевание трасформированного эпителия, но также и всего микроокружения, включая клетки стромы. Показано, что строма подвергается значительной модификации: изменению профиля экспрессии\--

белков и различным генетическим перестройкам, которые имеют свой особенный профиль и не повторяют генетическую патологию опухолевого эпителия. Подобные генетические изменения фибробластов приводят к аномальной экспрессии белков и последующей дисинтеграции сигнальных реакций, в результате чего происходит разрушение нормальных взаимодействий между стромой и опухолью. Молекулярные изменения в строме являются значимыми прогностическими маркерами наравне с молекулярными маркерами опухолевого эпителия РПЖ. Однако сведения об эпигенетических и генетических нарушениях в строме, ассоциированной с опухолевым эпителием, появились совсем недавно и требуют более детального изучения для

идентификации новых маркеров, терапевтических мишеней и понимания механизмов возникновения опухоли в целом.

Цель и задачи исследования. Целью работы является изучение генетических и эпигенетических нарушений в опухоли и ее микроокружении и оценка значимости этих нарушений в диагностике РПЖ.

Задачами исследования являются:

1. Определение частоты химерных онкогенов ТМР1^82/ЕРС/4, ТМРШ2/ЕТУ1 и ТМРШ2/ЕТУ4 в ткани РПЖ и оценка их диагностической значимости.

2. Оценка частоты потери гетерозиготности (ПГ) и микросателлитной нестабильности (МН) локусов 8р22, 13я14 и 16ц23 в опухолевом эпителии и смежной строме РПЖ, а также при предраковых состояниях простатической интраэпителиальной неоплазии (ПИН).

3. Оценка частоты метилирования генов Р16, Н1С1, N33 и ОБТР1 в опухолевом эпителии и его стромальном микроокружении. Сравнение частот метилирования изученных генов в микродиссекционных и биопсийных образцах предстательной железы.

4. Сравнительный анализ генетических и эпигенетических изменений в опухолевом эпителии и строме.

5. Выявление возможных ассоциаций между изученными генетическими и эпигенетическими изменениями и клиническими параметрами РПЖ.

Научная новизна. В результате проведенного исследования с применением метода лазерной микродиссекции изучены генетические и эпигенетические изменения РПЖ на материале опухолевых, неопластических и гиперпластических желез. Впервые охарактеризованы молекулярно-генетические изменения стромального опухолевого микроокружения. Определено, что частоты молекулярных повреждений в строме РПЖ не уступают таковым в опухолевом эпителии. Впервые для РПЖ показано, что спектр и частота молекулярных повреждений, выявленных в железах аденокарциномы и стромальном компоненте РПЖ, не идентичны. Частота ПГ/МН на ранних этапах канцерогенеза в строме намного превышает таковую в эпителии.

Впервые на российской выборке охарактеризована частота химерных перестроек ТМРШ2/ЕРС4, ТМРШ2/ЕТУ1 и ТМРКББ2/ЕТУ4 и показана специфичность этих нарушений для РПЖ.

Практическая значимость. Показано, что образование химерного гена ТМРЕБ82/Е[{04 является частым, опухоль-специфическим событием при РПЖ. Достоверное различие по частотам образования химерного транскрипта ТМРКББ!/ЕРС4 обнаружено также в группах пациентов РПЖ с поражением одной и обеих долей ПЖ, т.е. между стадиями Т2а и Т2Ь, а также в группах

пациентов, проходивших гормональное лечение и не проходивших. Экспрессия данного транскрипта коррелирует с более агрессивными стадиями заболевания и может служить молекулярным маркером РПЖ и маркером оценки ответа опухолевых клеток на гормональную терапию и андрогенчувствительности опухолевых клеток. Преимуществом данного метода является возможность работать с образцами опухоли без выполнения микродиссекции, несмотря на выраженную гетерогенность РПЖ.

В результате исследования обнаружены статистически достоверные корреляции аллельных потерь локуса 16ц23 в опухолевом эпителии со степенью дифференцировки опухоли, стадией злокачественного процесса и наличием метастазов в регионарные лимфоузлы. При исследовании ПГ/МН локуса 13я14 обнаружены достоверные корреляции с более поздними стадиями РПЖ. Для метилирования гена СБТР! обнаружено статистически достоверное отличие между группами пациентов с ПИН и пациентов с опухолевым процессом. Метилирование гена N33 не было обнаружено в предраковых состояниях, тогда как частота метилирования этого гена в аденокарциноме составила 22%. Обнаруженные молекулярные изменения могут использоваться как молекулярные маркеры РПЖ в дополнение к применяемым диагностическим методам - гистологическому и биохимическому.

Положения, выносимые на защиту.

1.Экспрессия ТМРЯББ2/ЕКС4 является частым, специфическим для РПЖ событием и может быть использована для диагностики РПЖ, а также как маркер оценки ответа опухоли на гормональную терапию.

2.Высокая частота ПГ/МН по исследуемым локусам и метилирования изученных генов характерна как для эпителия РПЖ, так и для смежной с ним стромы. На ранних этапах канцерогенеза аллельные нарушения в строме преобладают над таковыми в эпителии.

3.Спектр и частота молекулярных повреждений, выявленных в железах аденокарциномы и стромальном компоненте РПЖ, не идентичны.

4.Выявленные молекулярные повреждения: потеря гетерозиготности локуса 16ц23 и метилирование генов ОБТР1 и N33 ассоциированы с прогресией РПЖ и могут использоваться в качестве диагностических маркеров.

Апробация работы.

Материалы исследования докладывались на ежегодных конференциях Европейского общества генетики человека в 2005-2008 г.г., на конференции Российского общества медицинских генетиков в 2005 г., на конференции «Биомедицина и биобезопасность» в 2006-2007 г., на I и II онкоурологических конгрессах в 2006-2007 г.

Работа удостоена золотой медали Российской академии медицинских наук на V Конференции молодых ученых России с международным участием в 2008 году. Работа заняла 1 место в конкурсе на лучший научный и инновационный проект студентов и молодых ученых российских и зарубежных вузов (в рамках Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова) в номинации «медицинская наука».

Внедрение результатов в клиническую практику.

Результаты исследования применяют для диагностики рака предстательной железы в межклинической лаборатории молекулярных методов диагностики ММА им. И.М. Сеченова. Полученные результаты использованы для разработки следующих медицинских технологий:

1. «Молекулярно-генетическая методика определения маркера TMPRSS2/ERG4 для диагностики и проведения эффективной гормональной терапии у пациентов с раком предстательной железы». ФС№2008/153 от 23.07.2008.

2. «Молекулярно-генетическая методика определения потери гетерозиготности и микросателлитной нестабильности хромосомных районов 13ql4 и 16q23 у пациентов с подозрением на рак предстательной железы». ФС№2008/151 от 23.07.2008.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 8 статей, 7 тезисов и 2 медицинских технологии.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 98 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (результаты и методы), описания результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 152 ссылки. Диссертация иллюстрирована 21 таблицой и 22 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Материал для исследования был любезно предоставлен отделением онкоурологии Московского научно-исследовательского онкологического института им. П. А. Герцена. Все случаи РПЖ классифицированы по TNM согласно требованиям Международного противоракового союза (UICC, версия 1989 г.). Гистологическую идентификацию тканей проводили в патологоанатомическом отделении Московского научно-исследовательского онкологического института им. П. А. Герцена.

Микродиссекцию выполняли на 5 цш срезах, фиксированных формалином и окрашенных гематоксилином-эозином, с помощью системы лазерной микродиссекции ASLMD (Leica microsystems, Германия). Геномную ДНК из лимфоцитов периферической крови и замороженных и микродиссекционных тканей выделяли стандартным методом (Sambrook et al., 1989). Выделение

РНК проводили методом кислофенольной экстракции с использованием набора "РИБО-золь-А" (фирма АмплиСенс, Россия)

Рестрикцию ДНК и электрофорез проводили стандартными методами (Sambrook et al., 1989). В работе использовалась рестриктаза Hpall.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили по стандартной схеме (Saiki, 1989) при помощи программируемого многоканального амплификатора ДНК «Терцик» фирмы ДНК-Технология с использованием термофильной ДНК-полимеразы Taq фирмы «ИнтерЛабсервис» г. Москва. В работе была использована метилчувствительная (МЧ-ПЦР), метилспецифическая ПЦР (МС-ПЦР), микросателлитный анализ. Условия реакций и последовательности праймеров приведены в работах (Кекеева и др., 2007; Кекеева и др., 2008)

Реакцию автоматического прямого секвенирования проводили на приборе ABI Prism 310, с использованием Genetic Analyzer Kits "Applied Biosystems" по протоколам производителя. Результаты секвенирования обрабатывали с использованием программы Chromas 3.01. Очистку продукта ПЦР для МС-секвенирования проводили согласно протоколу Quantum Prep Freeze 'N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns (B10-RAD).

Реакцию обратной транскрипции РНК проводили методом случайного праймирования с использованием High-Capacity cDNA Archive kit (Applied Biosystems, США) по протоколу фирмы-производителя в термоциклере GeneAmp2700.

Анализ экспрессии химерных генов проводили методом ОТ-ПЦР. В качестве эндогенного контроля использован ген В2М.

Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей проводили с использованием программ Blast и Fasta, Genebank Pustell, Genepro, Oligo 4.0, Executor и Chromas.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Анализ химерных генов TMPRSS2/ERG4, TMPRSS2/ETV1 и TMPRSS2/ETV4.

Особенностью канцерогенеза РПЖ являются образование химерных онкогенов, приводящих к активации факторов транскрипции семейства ETS. Исследования последних двух лет привели к открытию химерных генов при РПЖ, образованных слиянием 5'-нетраслируемой. области гена TMPRSS2 и генов семейства транскрипционных факторов ETS, таких как ERG4 (21q22.1), £7У7(7р21.2) и ETV4 (17q21). Конечным результатом всех перестроек ETS является аномальная гиперэкспрессия измененных вариантов транскрипционных факторов. Наиболее частым вариантом, до 78%, является слияние TMPRSS2 с расположенным рядом геном ERG 4 (Mosquera et al, 2007; Winnes et al., 2007). Простатспецифические промоторные элементы химерных

генов ТМРЯ882/ЕТ8 обеспечивают высокую стойкую экспрессию онкогенов, запуская процессы пролиферации и трансформации клеток в предстательной железе. Так, у трансгенных мышей с химерным геном АЯК2РЬ/ЕТУ1, экспрессирующимся только в предстательной железе под контролем андрогенов, уже на 12 неделе развития обнаруживаются предраковые изменения (ТотНпБ й а1., 2007а).

В данной работе проведен анализ химерных транскриптов ТМРШ2ЖС4, ТМР№82/ЕТУ1 и ТМРР£52/ЕТУ4 в образцах РПЖ, а также в ткани пациентов с доброкачественной гиперплазией ПЖ.

Рис.1. Анализ экспрессии ТМР№Я2/£КС4 в образцах РПЖ. М - маркер молекулярного веса, К - отрицательный контроль, дорожки 2, 3 - наличие химерного транскрипта, 1, 2, 3 - наличие транскрипта В2М.

Щ /Ш/(148 п.н.)

ТМРЯ882/ЕЯ04 (121 п.н.)

ШЙ. I с. I ' .

М К 1 2 3

Частота перестройки ТМРЯ882/ЕЯС4 в образцах РПЖ составила 50% (33/66) (рис.1). Подлинность химерного гена ТМРК882/ЕРС4 подтверждена секвенированием исследуемого фрагмента кДНК (рис.2).

Рис. 2. Результаты секвенирования химерного гена ТМР№82/ЕЮ4.

По данным литературы частота встречаемости данной перестройки при РПЖ составляет 36-59% по результатам ОТ-ПЦР (Mosquera et al., 2007; Perner et al., 2006; Soller et al., 2006) и 36-59% по результатам ОТ-ПЦР (Tomlins et al., 2005; Wang et al., 2006). В целом, частота химерного гена увеличивается с

прогрессированием РПЖ: частота TMPRSS2/ERG4 на стадии II составила 38% (14/37), на стадии III - составила 59% (13/22) и на стадии IV - 71% (5/7).

Учитывая, что экспрессия TMPRSS2 является андрогензависимой, можно предположить, что экспрессия химерного транскрипта играет важную роль именно в гормонзависимом РПЖ (Stanbrough et al., 2006). Лечение путем гормональной депривации приводит к блокированию андрогеновой регуляции гормонзависимых опухолевых клеток и прекращению их пролиферации. Мы предположили, что при делении пациентов на группы, проходящих гормональное лечение и не проходящих, после лечения в ткани РПЖ не должно быть гормончувствительных опухолевых клеток, экспрессирующих TMPRSS2/ERG4. Действительно, частота перестройки у пациентов без гормонального лечения составила 56% (25/45), а после него - 17% (2/12), что статистически достоверно различается (р=0.023).

Достоверное различие по частотам химерного транскрипта TMPRSS2/ERG4 обнаружено также в группах пациентов РПЖ с поражением одной и обеих долей ПЖ, т.е. между стадиями Т2а и Т2Ь. В группе пациентов с локализацией РПЖ в одной доле химерных перестроек не обнаружено - 0/10, у пациентов с поражением обеих долей - 48% (14/27), /?=0,005. По литературным данным химерный транскрипт TMPRSS2/ERG4 ассоциирован с инвазией в семенные пузырьки, ранним рецидивом, агрессивным течением (Wang et al., 2006), поздними стадиями заболевания и метастазированием (Регпег et al., 2006) и с летальным исходом вследствие РПЖ (Demichelis et al., 2007).

Мы не обнаружили других химерных генов TMPRSS2/ETV1 и TMPRSS2/ETV4 в образцах РПЖ. По данным литературы частота TMPRSS2/ETV1 и TMPRSS2/ETV4 не превышает 2% (Tomlins et al., 2006; Iljin et al., 2006). Вероятно, размер нашей выборки не позволил выявить данные минорные перестройки, которые, однако, хотя и не являются частым событием при РПЖ, объясняют механизмы гиперэкспрессии других транскрипционных факторов ETS. Мы не обнаружили химерных генов TMPRSS2/ERG4, TMPRSS2/ETV1 и TMPRSS2/ETV4 в образцах ткани предстательной железы пациентов с гиперплазией ПЖ (0/10). Наши данные согласуются с результатами работы, в которой при анализе 20 нормальных и 8 гиперпластических образцов ткани ПЖ химерных транскриптов не выявлено (Wang et al., 2006), что свидетельствует о специфичности данных химерных генов для опухолевой ткани. Более того, принимая во внимание простатспецифичную экспрессию гена TMPRSS2, можно предположить, что перестройки TMPRSS2/ERG4, TMPRSS2/ETV1 и TMPRSS2/ETV4 характерны только для РПЖ. Так, исследования Yoo с соавт. (2007) не обнаружили существования химерных вариантов ETS в других эпителиальных опухолях - раке желудка и колоректальном раке.

В нашей работе показано, что образование химерного гена TMPRSS2/ERG4 является частым, опухоль-специфическим событием при РПЖ. Экспрессия

данного транскрипта коррелирует с более агрессивными стадиями заболевания и может служить молекулярным маркером РПЖ и маркером оценки ответа I опухолевых клеток на гормональную терапию и андрогенчувствительности опухолевых клеток. Преимуществом данного маркера является возможность работать с образцами опухоли без выполнения микродиссекции, несмотря на выраженную гетерогенность РПЖ. Поиск других способов активации онкогенов и выявление возможных перестроек на стадии гормонрезистентного РПЖ позволит объяснить механизмы ухода опухолевых клеток от гормональной терапии и выработать новые стратегии лечения поздних стадий РПЖ.

Анализ потери гетерозиготности и микросателлитной нестабильности.

Гомозиготные и гетерозиготные делеции, являются одними их самых частых генетических патологий эпителиальных опухолей, и для их детекции широко применяется микросателлитный анализ потери гетерозиготности (ПГ) и микросателлитной нестабильности (МН). Для оценки частоты генетических нарушений в опухолевом эпителии и смежной строме и их сравнения были выбраны хромосомные районы 8р22, 13ql4 и 16q23, как наиболее часто ' повреждаемые при РПЖ (Knobloch et al., 2004; Matsuyama et al., 2001; Paris et al., 2000). Принято считать, что делеции 8р22 и 13ql4 характерны для ранних стадий РПЖ, а потери хромосомного района 16q23 чаще встречаются на более поздних стадиях.

Анализ потери гетерозиготности и микросателлитной нестабильности в микродиссекционных образцах РПЖ.

С применением технологии лазерной микродиссекции мы разделили эпителиальный и стромальный компоненты РПЖ. На этом этапе была выполнена процедура микродиссекции ткани предстательной железы с выделением отдельно на гистологическом срезе малигнизированных железистых структур, участков ПИН, гиперплазии, а также соединительнотканной стромы вокруг каждого типа железистых структур (рис. 3).

Рис. 3. Гиперплазия ПЖ. А - увеличение 4x10, В -увеличение 10x10, стрелкой указаны области микродиссекции: гиперплазированный ацинус (ж) и смежная строма (стр). Обработка срезов для лазерной микродиссекции, окраска гематоксилин-эозином.

Исследование микросателлитных маркеров выполнено на 51 микродиссекционном образце ткани ПЖ, полученных от больных с аденокарциномой ПЖ. Изучены частоты ПГ/МН в опухолевом эпителии (51 образец) и смежной строме (39 образцов). Пример электрофореграммы с потерей гетерозиготности и микросателлитной нестабильностью показан на рис. 4. 46 образцов опухолевого эпителия (91%) имели ПГ/МН, по крайней мере, по одному из маркеров. Частоты аллельных нарушений в эпителии составили 49% для локуса 8р22, 51% для маркера 0168534, 57% для 0168422 (72% для локуса 16ц23 по совокупности двух маркеров) и 37% для локуса 13ц14. В строме найдена незначительно более высокая частота ПГ/МН в исследуемых локусах (табл. 1).

Рис. 4. Анализ потери гетерозиготности и микросателлитной нестабильности на примере маркера Э163534. к- кровь, а - аденокарцинома, с - строма. А - потеря гетерозиготности (дорожки 1 а, 1 с, 2с). Б - микросателлитная нестабильность (дорожки 2с, 4а).

1к 1а 2а 2с Зк За 4а 4с Таблица 1. Частота аллельных нарушений у пациентов с аденокарциномой и пациентов с ПИН в неопластическом эпителии и соответствующей смежной строме.

Частота ПГ/МН

Л о кус Маркер аденокарцинома строма НИН строма

8р22 £>«.9/75/ 25/51 (49%) 22/39 (56%) 4/25 (16%) 1/19 (6%)

\6q23 016X534 26/51 (51%) 21/39 (54%) 7/25 (28%) 2/19 (11%)

16ц24 0165422 29/51 (57%) 20/39 (51%) 6/25 (24%) 2/20 (10%)

Щ14 КБ 1.20 19/51 (37%) 23/39 (59%) 7/25 (28%) 4/19(21%)

Анализ ПГ и МН в микродиссекционных образцах ПИН.

Мы выполнили микродиссекцию биопсийных образцов пациентов с ПИН, но без РПЖ. Микросателлитный анализ был проведен на 25 образцах ткани ПЖ от пациентов с ПИН. Для исследования брали эпителий ПИН (25 образцов) и

строму микроокружения неопластических ацинусов (20 образцов) Был обнаружен небольшой процент молекулярных перестроек как в эпителиальном (от 16 до 28%), так и в стромальном компоненте ПИН (от 6 до 21 %) (табл. 1).

Максимальная частота аллельных потерь совместно по эпителию и строме найдена для маркера RB20int. Предполагают, что простатическая интраэпителиальная неоплазия служит прямым предшественником инвазивной карциномы ПЖ. Показано, что повреждения при ПИН имеют мультифокальную природу, причем молекулярно-генетические изменения соответствуют таковым при раннем инвазивном раке, хотя менее выражены (Joshua et al., 2007; Ai-Maghrabi et al., 2002). Частоты аллельных перестроек ПИН достоверно ниже таковых при РПЖ как в эпителии, так и в строме (р<0.05), кроме локуса 13ql4. В строме ПИН частота ПГ/МН незначительно ниже, чем в эпителии ПИН.

Для анализа частот ПГ/МН изученных локусов с прогрессией РПЖ, были выбраны следующие клинические критерии: степень дифференцировки опухоли по классификации Глисона, стадия процесса и наличие метастазов в регионарных лимфоузлах. Достоверные корреляции со всеми выбранными клиническими параметрами найдены для маркера D16S534 в опухолевом эпителии. Положительные корреляции со стадией заболевания показаны также для микросателлитных маркеров RB20int и D16S422 (табл. 2). Наши результаты совпадают с данными других исследователей (Harkonen et al., 2005; Knobloch et al., 2004). По данным литературы, ПГ по 8р22 коррелирует с такими клиническими параметрами как стадия опухолевого процесса, степень дифференцировки и метастазирование (Matsuyama et al., 2001; Knobloch et al., 2004). Мы не обнаружили статистически значимых корреляций ПГ/МН для этого локуса с данными параметрами, возможно вследствие того, что нами были использованы другие маркеры.

Таблица 2. Ассоциации аллельных нарушений в опухолевом эпителии с клиническими параметрами степенью дифференцировки по классификации Глисона, стадией РПЖ и метастазированием при сравнении точным критерием Фишера, р - вероятность, НД - недостоверное различие (р>0,05)

Маркер Корреляции

степень дифференцировки,/? метастазирование, р стадия,/;

D8S1731 НД НД НД

D16S534 0.01 0.04 0.02

D16S422 НД НД 0.04

RB1.20 НД НД 0.02

Мы не обнаружили статистически достоверных корреляций по частотам аллельных нарушений изученных маркеров с прогрессией РПЖ в стромальном компоненте опухоли. В ряде работ описаны положительные ассоциации прогрессии опухоли с нарушениями в строме (Frank et al., 2007; Fukino et al., 2004), но в нашем исследовании такой закономерности не найдено. В результате проведенного исследования показано, что использование системы прогностических маркеров ПГ/МН как дополнительного метода к гистологическому исследованию может помочь в диагностике и прогнозе РПЖ.

Анализ аномального метилирования.

Проведен анализ метилирования генов Р16, HIC1, N33 и GSTP1, вовлеченных в канцерогенез предстательной железы, в образцах ткани пациентов с опухолевыми новообразованиями предстательной железы. Исследование включало 2 стадии. На первом этапе была выполнена процедура микродиссекции ткани предстательной железы с выделением отдельно на гистологическом срезе малигнизированных ацинусов, участков ПИН, гиперплазии, а также соединительнотканной стромы вокруг каждого типа железистых структур. После оценки уровня метилирования в микродиссекционных образцах, был проведен анализ метилирования в образцах ткани предстательной железы, полученных в результате простатэктомий и биопсийных процедур.

Метилирование генов в микродиссекционных образцах.

Микродиссекция выполнена на 30-ти гистологически гетерогенных срезах операционных материалов больных с диагнозом аденокарцинома. Всего получено 30 образцов железистых структур аденокарцином, 15 образцов ПИН разной степени, 8 гиперплазий, а также 43 смежных соединительнотканных образца, 37 из которых были расположены рядом с фокусами аденокарциномы или ПИН высокой степени, а 6 остальных - рядом с ацинусами доброкачественной гиперплазии.

В нашем исследовании в аутопсийном материале нормальной простаты (2 образца) и у пациентов с доброкачественной гиперплазией ПЖ (5 образцов) метилирование исследуемых генов не было обнаружено ни в строме, ни в опухоли. У пациентов с РПЖ мы обнаружили высокий процент метилирования как для малигнизированного эпителия, так и для близлежащей соединительнотканной стромы (табл. 3). Пример определения аномального метилирования методом мультилокусной ПЦР представлен на рис. 5. Для подтверждения метилирования проведено метилспецифическое секвенирование промоторных районов генов pió, GSTP1 и N33. Показано наличие метилированных цитозинов в составе проанализированных последовательностей ДНК (рис. 6).

Высокие частоты метилирования были найдены для аденокарциномы: Н1С1

- 77%; р16 - 50%, GSTP1 - 93%, N33 - 27%. В близлежащей строме было показано наличие метилирования со следующими частотами: HIC1 - 56%; р16-36%; GSTP1 - 56%; N33 - 8%.

Рис. 5, Метилчувствительная ПЦР генов N33, GSTPI с внутренним контролем XL. Дорожки 1,4 -отсутствие метилирования, 5 - метилирование гена GSTP1, 2,3 - метилирование генов N33, GSTP1, К

- положительный контроль, М - маркер молекулярной массы.

N33

GSTPI

XL

М 1 2 3 4 К 5

В железах ПИН высокой степени у пациентов с РПЖ частоты метилирования изученных генов близки к таковым в железах аденокарциномы: HIC1 - 60%; pió - 53%; GSTP1 - 73%; N33 - 27%. Молекулярно-генетические изменения при ПИН соответствуют таковым при раннем инвазивном раке, хотя менее выражены.

Рис. 6. Результаты метилспецифического секвенирования промоторной области гена р16. Стрелкой помечены метилированные цитозины.

В близлежащей к ПИН строме показано наличие метилирования для всех генов, кроме гена N33: ШС1 - 66%; р16 - 58%; GSTP1 - 33%. Ряд работ по изучению ПИН высокой степени выявил молекулярные изменения и в смежной строме. Так, в работе Joshua и соавт. (2007) показан достоверный риск развития аденокарциномы при обнаружении коротких теломер в строме, смежной с ПИН высокой степени. В гиперпластически измененных железистых структурах пациентов с РПЖ, расположенных рядом с фокусами аденокарциномы, и в близлежащей строме метилирование исследуемых генов не было обнаружено, за исключением двух случаев. В образцах ткани, полученных от пациентов с начальной стадией метастазирования, в очагах гиперплазии и смежной строме найдено метилирование генов Р16, Н1С1 и GSTP1 (табл. 3). Сравнение статуса

метилирования гистологически различных железистых структур на одном срезе у различных пациентов представлено в табл. 4.

Табл. 3. Частоты метилирования генов Н1С1, р16, N33 и й5ТР! в микродиссекционных образцах предстательной железы

Я/С/ р16 GSTP1 N33

норма 0/2 0/2 0/2 0/2

смежная строма 0/2 0/2 0/2 0/2

гиперплазия (от пациентов с ДГПЖ) 0/5 0/5 0/5 0/5

смежная строма 0/5 0/5 0/5 0/5

гиперплазия (от пациентов с АК) 2/8 (25%) 2/8 (25%) 1/8 (13%) 0/8

смежная строма 1/6 0/6 1/6 1/6

ПИН (от пациентов с АК) 9/15 (60%) 8/15(53%) И/15 (73%) 5/15(33%)

смежная строма 8/12 (66%) 7/12(58%) 4/12 (33%) 0/12

аденокарцинома 23/30 (77%) 15/30 (50%) 28/30 (93%) 8/30 (27%)

смежная строма 14/25 (56%) 9/25 (36%) 14/25(56%) 2/25 (8%)

Анализ метилирования генов в биопсийных и операционных образцах.

Учитывая присутствие аномального метилирования не только в опухолевых клетках, но и опухолевом окружении, и распространенность этого процесса, мы решили оценить изменения, характерные для опухоли, в образцах ткани предстательной железы без мккродиссекции. Был проведен анализ метилирования генов pió, HIC1, N33 и GSTP1 в биоптатах пациентов с различными заболеваниями предстательной железы (гиперплазия, ПИН и аденокарцинома) (106 образцов) и в операционном материале ткани пациентов с аденокарциномой предстательной железы (28 образцов). Образцы ткани ПЖ были условно поделены по наличию у данного пациента определенной гистологической картины. Так пациенты, имеющие хотя бы в одном из 12 фрагментов биопсии аденокарциному, относились к группе РПЖ. Пациенты, имеющие один или более участков ПИН в любом из 12 биопсийных фрагментов были в группе ПИН, аналогичный принцип применяли для пациентов с ДГПЖ.

Метилирование гена HIC1 на стадии гиперплазии составило 33%, в то же время для неоплазии и аденокарциномы частоты метилирования достоверно выше (66% и 65% соответственно) (р=0.03) (табл. 5). Гиперметилирование промоторного района гена р16 обнаружено в 18% случаев гиперплазии, 48% ПИН и 42% аденокарциномы. Схожая частота метилирования гена GSTP1 найдена для аденокарциномы (41%). Однако, если частота метилирования гена

pió для ПИН также высока, как и для аденокарциномы, то между ПИН и аденокарциномой для GSTPJ найдено достоверное различие (р=0.007). В предраковых состояниях метилирование гена N33 не обнаружено, тогда как частота метилирования этого гена в аденокарциноме составила 22% (р=0.05). Таблица 4. Сравнение статуса метилирования гистологически различных железистых структур на одном срезе у различных пациентов. Темный сектор - наличие метилирования, серый - его отсутствие. Образцы 98, 94, 86, 149, 58 и 77 пациентов с диагнозом аденокарцинома, образцы 55,137 - пациентов с диагнозом ДГПЖ.

GSTP1

Ткань

пациента

аденокарцином а

ПИН высокой ст.

строма

аденокарцинома

ПИН высокой ст.

строма

ПИН высокой ст.

строма

ПИН высокой ст.

гиперплазия

ПИН низкой ст.

строма

гиперплазия

строма

гиперплазия

строма

гиперплазия

строма

Таблица 5 Частоты метилирования гаювр16, Н1С1, N33 и GSTPJ в биолсийных и операционных образцах предстательной железы

ШС1 р16 G5777 N33

Биопташ пацдаггов с ДГПЖ 8/24 (33%) 2/11(18%) 3/24(13%) (У12

Биятгагь! ram китов с ПИН 19/29(66%)' 14/29(48%) 4/29(13%) 0/29

Биолиты пащкшов с АК 32/50(65%) 19/45(42%) 22/53(41%)* 9/47(19%)*

Адаюкарщп юш операцштсрш 20/28(71%) 628(22%) 9/28(32%) 3/16(20%)

* - достоверное различие (р<0,05, критерий Фишера)

Анализ метилирования генов Р16, HIC1, N33 и GSTP1 был проведен также в 28 образцах РПЖ, полученных в результате простатэктомии. Для данных образцов частоты метилирования исследуемых генов статистически не отличались от частот метилирования при аденокарциноме в биопсийных образцах, что и следовало ожидать (табл. 5).

Частоты метилирования всех генов в операционных образцах ткани РПЖ без микродиссекции были значительно ниже, чем в аналогичных микродиссекционных образцах аденокарциномы (Я/С/, 71% versus 77%; pi6, 22% versus 50%; GST PI, 32% versus 93%; N33, 20% versus 27%). Полученные результаты можно объяснить примесью неопухолевых клеток в образце вследствие высокой гетерогенности РПЖ. Данное сравнение подтверждает необходимость микродиссекционного исследования при молекулярном анализе данного типа опухоли. Несмотря на то, что аномальное метилирование распространяется достаточно далеко от очага малигнизации, как показано в данной работе и в других исследованиях, недооценивание гетерогенности РПЖ может приводить при анализе к появлению ложноотрицательных результатов.

Пациентов делили на группы по гистологическому критерию (рак, ПИН и ДГПЖ) и сравнивали в этих группах частоты метилирования по каждому гену с помощью критерия х2- Для генов N33 и GSTP1 было найдено статистически достоверное отличие между группами пациентов с ПИН - 0/30 (0%) и 4/31 (13%), соответственно, и пациентов с опухолевым процессом - 9/47 (19%) и 22/53 (41%) (табл. 5). Таким образом, в нашем исследовании частоты метилирования генов N33 и GSTP1 достоверно отличаются в группах ПИН и РПЖ. Использование системы прогностических маркеров метилирования, в частности генов N33 и GSTP1, как дополнительного метода к гистологическому исследованию, может помочь в диагностике и прогнозе РПЖ.

Анализ частоты генетических и эпигенетических нарушений в строме

РПЖ. Теории канцерогенеза.

Микроокружение РПЖ играет одну из основных ролей в канцерогенезе, выступая как активный индуктор опухолевого роста (Barclay et al., 2005). Ставшее уже классическим исследование Олуми и соавт. (1999) показало, что неопухолевые эпителиальные клетки ПЖ становятся злокачественными, если их культивировать вместе с фибробластами, полученными из микроокружения РПЖ, в то время как нормальные фибробласты не инициируют злокачественного перерождения. Строма молочной железы, подвергшаяся воздействию радиации, индуцирует трансформацию эпителиальных клеток, тогда как нормальная строма не вызывает такого эффекта (Barcellos-Hoff et al., 2000). Таким образом, показано, что микроокружение способно стимулировать опухолевый рост эпителия, но и сама строма подвергается значительной модификации: изменению экспрессии белков, различным генетическим перестройкам. Подобные изменения обнаружены для РПЖ, РМЖ, рака мочевого пузыря, опухоли головы и шеи (Frank et al., 2007; Fukino et al., 2004; Paterson et al., 2003; Rodríguez-Canales et al., 2007; Grover et al., 2006; Moinfar et al., 2000). В нашей работе проведен анализ эпигенетических и генетических изменений в опухолевом микроокружении РПЖ.

Для анализа эпигенетических изменений РПЖ мы изучили метилирование CpG-островков промоторных областей генов Р16, GSTP и N33 в микродиссекционных образцах пациентов с аденокарциномой и обнаружили высокий процент метилирования как для малигнизированного эпителия, так и для близлежащей соединительнотканной стромы (табл. 3). Наши данные о наличии аномального метилирования с высокой частотой в опухолевой строме согласуются с результатами недавней работы по изучению опухолевого микроокружения предстательной железы (Hanson et al., 2006). Эпигенетические изменения в строме, вероятно, являются частью процесса взаимодействия опухоли и стромального микроокружения. Один из возможных механизмов появления метилирования в опухолевом микроокружении — воздействие измененного паттерна экспрессии цитокинов и ростовых факторов в опухолевом эпителии на близлежащую ткань и последующая дисрегуляция процессов, контролирующих метилирование в клетке. Появление метилирования, характерного для опухоли, в близлежащих клетках различных зародышевых листков свидетельствует об универсальном механизме индукции процессов метилирования в клетках.

Для анализа структурных изменений микроокружения РПЖ определена частота ПГ/МН хромосомных районов 8р22, 13ql4 и 16q23. Мы обнаружили высокий процент ПГ/МН в микроокружении РПЖ по всем исследуемым локусам (табл. 1). В некоторых образцах ПГ/МН исследуемых локусов

присутствовали только в эпителии или только в стромальных клетках, в некоторых - молекулярные нарушения были в обоих типах клеток, но по различным аллелям, т.е. профили делеций в эпителии и строме не совпадали. Такие генетические различия между опухолью и стромой наблюдали и в других типах опухолях (Moinfar et al., 2000; Ни et al., 2005; Kurose et al., 2002). В нашем исследовании наибольшая частота аллельных потерь в эпителии РПЖ обнаружена в районе 16q23 (72%), а в строме РПЖ - в районе 13ql4 (58%). При разделении пациентов на группы по стадии заболевания обнаружено, что в эпителиальном компоненте частота аллельных перестроек нарастала с прогрессированием РПЖ, в строме же частота нарушений практически не менялась или по мере прогресии уменьшалась (табл. 6). При анализе ранних стадий опухоли пищевода исследователи нашли изначально высокую частоту ПГ/МН в строме, с прогрессированием процесса генетические перестройки в эпителии постепенно нарастали, а в микроокружении оставались на прежнем высоком уровне (Shiraishi et al., 2006). Предполагая, что генетические нарушения в строме появляются раньше, чем в эпителии, мы провели анализ ПГ/МН в предраковых состояниях ПИН и обнаружили низкую частоту аллельных делеций как в строме, так и в неопластическом эпителии (табл. 1). Значительного преобладания генетических нарушений в одном из компонентов ПИН мы не обнаружили. Для понимания, где генетические нарушения появляются первыми, необходимы работы по детальному ретроспективному изучению на больших выборках последней стадии ПИН - карциномы in situ и ее микроокружения.

Таблица 6. Частота аллельных потерь исследуемых локусов в эпителии и строме при различных стадиях РПЖ

Стадия D8S1731 D16S422 D16S534 RB1.20

Эпителий, Сгрома,% Эпителии, Строма,% Эпителий, Строма,% Эпителий, Строи а,%

I-II 33 57 30 50 27 70 9 64

III-IV 58 55 78 50 68 50 56 57

Таким образом, в нашей работе показано, что эпигенетические и генетические изменения генома стромальных клеток - частое событие, которое присутствует на всех стадиях патогенеза РПЖ (рис. 7). По частоте нарушения в строме не уступают нарушениям в опухолевом эпителии.

Так как эпигенетические и генетические нарушения в канцерогенезе имеют место и в эпителии, и в строме, то можно предположить, что изменения, найденные в строме, могут быть последствием первоначального мутационного процесса в эпителии, а также наоборот. Теория соматических мутаций

предполагает, что патологическая пролиферация является следствием накопления порогового уровня мутаций в одной из эпителиальных клеток железы. Этиологические агенты, вызывающие канцерогенез, вероятнее влияют на весь орган в целом, чем только на эпителиальный компонент. Таким образом, ответ на вопрос, какие клетки наиболее подвержены митотическому сбою, может прояснить начальные этапы возникновения онкопатологии. Исследования Май!ш и соавт. (2004) на молочной железе показали, что мишенью мутагенного фактора является строма,

Рис. 7. Сравнение молекулярно-генетических нарушений в опухолевом эпителии и строме. Метилирование Потеря гетерозиготное™

В нашей работе показано, что аномальное метилирование присутствует не только в опухолевом эпителии и смежной строме РПЖ, но и в нормальном эпителии на удалении от РПЖ. У пациентов с аденокарциномой в двух случаях из восьми было показано метилирование генов HIC1, GSTP1 и N33 в очагах гиперплазии и в близлежащей соединительной ткани, расположенных на расстоянии от очага аденокарциномы (табл. 3). Подобные результаты можно объяснить теорией поля канцеризации, которая в наши дни получила множество подтверждений (Braakhuis et al., 2003). Молекулярные свидетельства о наличии полей канцеризации показаны для различных типов опухолей (Dakubo et al., 2007). В клинической практике морфологическое исследование не может дать правильный прогноз в случаях гистологически нормальной ткани, при этом обладающей всеми признаками молекулярной патологии. Несомненно, что молекулярно-генетические методы должны использоваться в дополнение золотому стандарту диагностики — патологоанатомическому исследованию.

В нашей работе определено, что молекулярные повреждения стромального и эпителиального компонентов опухоли - частое событие, которое присутствует на всех стадиях патогенеза РПЖ, что может приводить к нарушению стромально-эпителиальных взаимодействий. Теория полей тканевой организации (Tissue organization field theory) предполагает, что действие канцерогенов заключается в изменении стромально-эпителиальных

взаимодействий и пролиферация эпителия есть результат неправильного взаимоотношения обоих типов клеток (Soto et al., 2005). Наше исследование, а также последние работы в области изучения опухолевого микроокружения подтверждают эту гипотезу более, чем выдвинутую ранее теорию соматических мутаций, по крайней мере, для эпителиальных опухолей. Эти результаты свидетельствуют о необходимости детального изучения различных составляющих микроокружения - фибробластов, эндотелиоцитов, адипоцитов и компонентов экстрацеллюлярного матрикса. Дальнейшее изучение молекулярных основ стромально-эпителиальных взаимодействий, возможно, откроет в опухолевом микроокружении терапевтические мишени этиологического лечения РПЖ.

ВЫВОДЫ.

1. Определена частота химерных транскриптов ТМРК582/ЕЯ04, ТМРШ2/ЕТУ1 и ТМР№82/ЕТУ4 в образцах РПЖ. Частота перестройки ТМРЯ$32/Е1Ю4 составила 50%, химерных генов ТМРШ2/ЕТУ1 и ТМРК5Б2/ЕТУ4 в нашей выборке пациентов с РПЖ не обнаружено.

2. Определена частота ПГ/МН хромосомных районов 8р22, 13ц14 и 16я23 на 51 микродиссекционном образце ткани РПЖ, а также на 25 микродиссекционных образцах ПИН в опухолевом эпителии и смежной строме. Обнаружена высокая частота ПГ/МН в опухолевых и стромальных клетках. В образцах ПИН частота молекулярных повреждений в опухоли и строме была достоверно ниже, чем в образцах РПЖ, кроме локуса 13ц14.

3. Определена высокая частота метилирования генов Р16, Н1С1, N33 и СБТР1 в 96 микродиссекционных образцах РПЖ малигнизированного эпителия и близлежащей стромы. В железах с высокой степенью ПИН частоты метилирования изученных генов близки к таковым в аденокарциноме. Сравнительный анализ метилирования в микродиссекционных и биопсийных образцах свидетельствует о необходимости микродиссекционного исследования при молекулярном анализе данного типа опухоли.

4. Определено, что частоты генетических и эпигенетических повреждений в строме РПЖ не уступают таковым в опухолевом эпителии. Спектр и частота повреждений, выявленных в опухолевых и стромальных клетках РПЖ, не идентичны. Частота ПГ/МН на ранних этапах канцерогенеза в строме достоверно превышает таковую в эпителии.

5. Обнаружены достоверные корреляции аллельных потерь локуса \6q23 в эпителии со степенью дифференцировки опухоли, стадией злокачественного процесса и наличием метастазов в регионарные лимфоузлы. Для локуса 13ц14

определены достоверные корреляции со стадией РПЖ. Частоты метилирования генов ОЗТР! и N33 достоверно отличаются в группах пациентов с ПИН и пациентов с РПЖ. Наличие химерного гена ТМРР5Б2/ЕНС4 ассоциировано с прогрессией РПЖ и является значимым критерием оценки ответа опухоли на гормональную терапию. Выявленные молекулярные изменения можно использовать в диагностике РПЖ в дополнение к применяемым диагностическим методам - гистологическому и биохимическому.

Практические рекомендации.

1. Определение экспрессии ТМРКБ82/ЕКС4 рекомендовано для диагностики РПЖ, а также как маркер оценки ответа опухоли на гормональную терапию среди пациентов с различными заболеваниями предстательной железы и лиц с РПЖ в операционном материале ПЖ или материале биопсии ПЖ на

2. Выявленные молекулярные повреждения: потеря гетерозиготности локуса \6q23 и метилирование генов ОБТР! и N33 могут быть использованы в качестве диагностических маркеров в биопсийных образцах больных с заболеваниями предстательной железы с целью выявления пациентов с начальными стадиями РПЖ, а также для прогноза подтвержденного РПЖ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Кекеева Т. В., Жевлова А.И., Подистов Ю.И., Соловьева Ю.В., Залетаев Д.В., Немцова М.В. // Аномальное метилирование генов-супрессоров опухолевого роста как маркер предраковых состояний шейки матки. // Клиническая лабораторная диагностика. 2006, Т. 3, стр. 46-49.

2. Kekeeva T.V., Alekseev B.Y., Shegai P.V., Nemtsova M.V.// Methylation profile of N33, HIC, GSTP1 and CDKN2 at different stages of prostate carcinogenesis. // Eur. J. Hum. Genet. 2005, V. 13, p. 201.

3. Кекеева T.B., Немцова M.B., Г.А. Франк, Быстров C.B., Русаков И.Г., Алексеев Б.Я. // Профиль метилирования генов Pió, HICI, N33 и GSTP1 при раке предстательной железы. // V съезд российского общества медицинских генетиков, Уфа, Россия, «Медицинская генетика». 2005, №5, с. 200.

4. Kekeeva T.V., Alekseev B.Y., Shegai P.V., Nemtsova M.V., Zaletaev D.V. // RNA alterations in plasma of prostate cancer patients. // Eur. J. Hum. Genet. 2006, V. 14, p. 228.

5. Кекеева Т. В., Попова О. П., Шегай П. В., Алексеев Б.Я., Залетаев Д. В., Немцова М. В. // Аномальное метилирование генов PI6, HIC1, N33 И GSTP1 в

эпителии и опухолевом микроокружении рака предстательной железы. // Материалы И конгресса Российского общества онкоурологов. 2006, стр. 3738.

6. Kekeeva T.V., Popova O.P., Andreeva Y.Y., Zavalishina L.E., Zaletaev D.V., Nemtsova M.V. // Molecular genetic alterations in tumor epithelium and tumor-associated stromal cells of prostate cancer. // Eur. J. Hum. Genet. 2007, V. 15, p. 169.

7. Кекеева T.B., Попова О.П., Шегай П.В., Алексеев Б.Я. , Андреева Ю.Ю., Залетаев Д.В., Немцова М. В. // Аномальное метилирование генов PI6, HIC1, N33 И GSTPI в эпителии и стромальных клетках рака предстательной железы. // Молекулярная биология. 2007. Т. 41, стр. 1-7.

8. Кекеева Т.В., Немцова М.В., Стрельников В.В., Кузнецова Е.Б., Бабенко О.В., Иванов М.А., Попова О.П., Шегай П.В., Алексеев Б.Я., Андреева Ю.Ю., Завалишина Л.Э., Русаков И.Г., Франк Г.А., Залетаев Д.В. // Анализ молекулярно-генетических изменений при раке предстательной железы. // Вестник молекулярной медицины. 2007, Т. 7, стр. 23-41.

9. Кекеева Т. В., Шегай П. В., Андреева Ю. Ю., Алексеев Б.Я., Залетаев Д. В., Немцова М. В. // Экспрессия химерного транскрипта TMPRSS2/ERG4 при раке предстательной железы.// Материалы II конгресса Российского общества онкоурологов. 2007, стр. 36-37.

10. Кекеева Т. В., Попова О. П., Шегай П. В., Завалишина J1. Э., Андреева Ю. Ю., Залетаев Д. В. , Немцова М. В. // Высокая частота химерного транскрипта TMPRSS2/ERG4 при раке предстательной железы. // Материалы II конгресса «РМФ-2007». 2007, стр.134.

11. Немцова М.В., Михайленко Д.С., Кекеева Т.В., Кузнецова O.A., Башкатов C.B., Курынин P.D., Попов A.M., Попова О.П., Шегай П.В., Андреева Ю.Ю., Алексеев Б.Я., Еникеев М.Э., Аляев Ю.Г., Карякин О.Б., Русаков И.Г., Франк Г.А., Залетаев Д.В. // Молекулярно-генетические маркеры в онкоурологии. // Молекулярная медицина. 2007, Т. 3, стр. 43-54.

12. Kuznetsova Е.В., Kekeeva T.V., Larin S.S., Zemlyakova V.V., Khomyakova A.V., Babenko O.V., Nemtsova M.V., Zaletaev D.V. and Strelnikov V.V. // Methylation of the BIN1 gene promoter CpG island associated with breast and prostate cancer. // J. Carcinogenesis. 2007.4, p. 6-9.

13. Кекеева T.B., Попова О.П., Завалишина Н.Э., Шегай П.В., Алексеев Б.Я., Андреева Ю.Ю., Залетаев Д.В. , Немцова М. В. // Потеря гетерозиготности и микросателлитная нестабильность в стромальных и эпителиальных клетках рака предстательной железы. // Молекулярная биология. 2008, Т. 42, стр. 96109.

14. Кекеева Т.В., Андреева Ю.Ю., Франк Г.А., Залетаев Д.В., М. В. Немцова //Экспрессия химерных онкогенов ETS при раке предстательной железы. // Российский Онкологический Журнал. 2008, Т.З, стр. 33-38

15. Кекеева Т.В., Андреева Ю.Ю., Франк Г.А., Попова О П., Пальцева Е. М., Д.В. Залетаев, М. В. Немцова // Экспрессия химерного гена ТМРР582/ЕРС4 при раке предстательной железы // Молекулярная медицина. 2008, Т. 5, стр. 29-34

16. Кекеева Т.В., Немцова М.В., Залетаев Д.В. «Молекулярно-генетическая методика определения маркера ТМРЯ552/Е1Ю4 для диагностики и проведения эффективной гормональной терапии у пациентов с раком предстательной железы». Медицинская технология. ФС№2008/153 от 23.07.2008.

17. Кекеева Т.В., Немцова М.В., Залетаев Д.В. «Молекулярно-генетическая методика определения потери гетерозиготности и микросателлитной нестабильности хромосомных районов 13я14 и ^23 у пациентов с подозрением на рак предстательной железы». Медицинская технология. ФС№2008/151 от 23.07.2008.

Подписано в печать 12 09.2008 г

Печать трафаретная

Заказ № 727 Тираж" 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Рак предстательной железы (РПЖ) является одним из наиболее часто встречающихся злокачественных новообразований у мужчин. Смертность от РПЖ среди прочих онкологических заболеваний занимает третье место у мужчин после рака легкого и толстой кишки. Хотя пренеопластические изменения (простатические интраэпителиальные неоплазии, ПИН) могут быть обнаружены даже у 20-летних мужчин, а для 50-летних они обычны, клинически выявляемый РПЖ редко диагностируется раньше 60-70 летнего возраста.

В настоящий момент основным диагностическим критерием РПЖ является патологоанатомическое исследование. Молекулярно-генетические же маркеры в клинической практике применяются в исключительных случаях или находятся в стадии научных разработок. В опухолевых тканях обнаруживается большое количество структурных перестроек, прежде всего транслокаций и делеций, количество которых заметно нарастает по мере прогрессирования злокачественного роста. Среди таких нарушений наибольшего внимания заслуживают хромосомные перестройки, приводящие к образованию химерных генов TMPRSS2/ERG4, TMPRSS2/ETV1 и TMPRSS2/ETV4 с последующей гиперэкспрессией химерных онкогенов. Гомозиготные и гетерозиготные делеции, являются одними их самых частых генетических патологий РПЖ. Также одним из наиболее значимых механизмов канцерогенеза РПЖ является аномальное метилирование CpG-островков генов-супрессоров опухолевого роста. Учитывая, что молекулярные изменения являются наиболее ранними в канцерогенезе, применение подобных маркеров в клинике могло бы расширить возможности ранней диагностики и увеличить ее прогностический потенциал. Таким образом, приоритетным направлением в диагностике РПЖ является поиск и характеристика новых молекулярно-генетических маркеров с достаточной чувствительностью и специфичностью для применения в клинической практике.

За последнее десятилетие интенсивного изучения опухолевого микроокружения получено большое число убедительных данных, свидетельствующих о критической роли стромы в канцерогенезе. Опухолевая прогрессия зависит не только от молекулярных изменений эпителиальных клеток, но и от многочисленных изменений смежной стромы, обеспечивающей необходимое окружение для пролиферации, миграции, инвазии опухолевого эпителия в процессе неопластического роста. Изменения, происходящие в строме, включают изменения в профиле экспрессии ростовых факторов, цитокинов, преобразования в цитоскелете фибробластов и экстрацеллюлярном матриксе. Показано, что микроокружение способно стимулировать опухолевый рост эпителия, но и сама строма подвергается значительной модификации: изменению профиля экспрессии белков и различным генетическим перестройкам. Молекулярные повреждения генома стромальных клеток, такие как гиперметилирование генов-супрессоров, изменение длины теломер, потеря гетерозиготности (ПГ) и микросателлитная нестабильность (МЫ) на различных хромосомах, мутации, имеют свой особенный профиль и не повторяют генетическую патологию опухолевого эпителия. Однако сведения об эпигенетических и генетических нарушениях в строме, ассоциированной с опухолевым эпителием, появились совсем недавно и требуют более детального изучения для идентификации новых маркеров, терапевтических мишеней и понимания механизмов возникновения опухоли в целом.

Настоящее исследование посвящено изучению генетических и эпигенетических нарушений в опухоли и ее микроокружении, а также оценке диагностической значимости этих нарушений как потенциальных маркеров РПЖ.

Цель работы — изучение молекулярно-генетических изменений, происходящих на разных этапах канцерогенеза РПЖ в ткани опухоли, в опухолевом эпителии и смежной с ним строме.

Задачи исследования.

1. Определить частоту химерных онкогенов TMPRSS2/ERG4, TMPRSS2/ETV1 и TMPRSS2/ETV4 в ткани РПЖ и оценить их диагностическую значимость.

2. Оценить частоту ПГ/МН локусов 8р22, 13ql4 и 16q23 в опухолевом эпителии и смежной строме РПЖ, а также при предраковых состояниях ПИН.

3. Охарактеризовать частоту метилирования генов Р16, HIC1, N33 и GSTP1 в опухолевом эпителии и его стромальном микроокружении. Провести сравнение частот метилирования изученных генов в микродиссекционных и биопсийных образцах предстательной железы.

4. Провести сравнительный анализ генетических и эпигенетических изменений в опухолевом эпителии и строме.

5. Выявить возможные ассоциации между изученными генетическими и эпигенетическими изменениями и клиническими параметрами РПЖ.

Научная новизна.

В результате проведенного исследования изучены генетические и эпигенетические изменения РПЖ на материале опухолевых, неопластических и гиперпластических желез с применением метода лазерной микродиссекции. Впервые охарактеризованы молекулярно-генетические изменения стромального опухолевого микроокруження. Определено, что в строме РПЖ частоты молекулярных повреждений не уступают таковым в опухолевом эпителии. Спектр и частота молекулярных повреждений, выявленных в железах аденокарциномы и стромальном компоненте РПЖ, не идентичны. Частота ПГ/МН на ранних этапах канцерогенеза в строме намного превышает таковую в эпителии.

Впервые на российской выборке охарактеризована частота химерных перестроек TMPRSS2/ERG4, TMPRSS2/ETV1 и TMPRSS2/ETV4 и показана специфичность этих нарушений для РПЖ.

Практическая значимость.

Одной из наиболее важных практических задач ДНК-диагностики в онкологии является создание эффективных и экономичных диагностических протоколов, основанных на молекулярно-биологических технологиях, внедрение которых позволит повысить результативность лечения РПЖ. В работе показано, что образование химерного гена TMPRSS2/ERG4 является частым, опухоль-ассоциированным событием при РПЖ. Достоверное различие по частотам образования химерного транскрипта TMPRSS2/ERG4 обнаружено также в группах пациентов РПЖ с поражением одной и обеих долей ПЖ, т.е. между стадиями Т2а и Т2Ь, а также в группах пациентов, проходивших гормональное лечение и не проходивших. Экспрессия данного транскрипта коррелирует с более агрессивными стадиями заболевания и может служить молекулярным маркером РПЖ и маркером оценки ответа опухолевых клеток на гормональную терапию и андрогенчувствительности опухолевых клеток. Преимуществом данного метода является возможность работать с образцами опухоли без выполнения микродиссекции, несмотря на выраженную гетерогенность РПЖ.

В результате исследования обнаружены статистически достоверные ассоциации аллельных потерь в эпителии локуса 16q23 со степенью дифференцировки опухоли, стадией злокачественного процесса и наличием метастазов в регионарных лимфоузлах. Для локуса 13ql4 обнаружены достоверные корреляции со стадией процесса. Для гена GSTP1 обнаружено статистически достоверное отличие между группами пациентов с ПИН и пациентов с опухолевым процессом. Метилирование гена N33 не было обнаружено в предраковых состояниях, тогда как частота метилирования этого гена в аденокарциноме составила 22%. Обнаруженные молекулярные изменения могут использоваться как молекулярные маркеры РПЖ в дополнение к применяемым диагностическим методам - гистологическому и биохимическому.

Полученные результаты могут служить для разработки диагностического протокола, основанного на анализе молекулярно-генетических нарушений, что позволит проводить скрининг и бороться с онкопатологией на самых ранних этапах ее возникновения, проводить мониторинг заболевания в периоды ремиссий, определять риск метастазирования в период лечения и определять тактику терапии в случае инактивации определенных генов-рецепторов.

Апробация работы.

Материалы исследования докладывались на ежегодных конференциях Европейского общества генетики человека в 2005-2008 г.г., на конференции Российского общества медицинских генетиков в 2005 г., на конференции «Биомедицина и биобезопасность» в 2006-2007 г., на I и II онкоурологических конгрессах в 2006-2007 г.

Работа удостоена золотой медали Российской академии медицинских наук на V Конференции молодых ученых России с международным участием в 2008 году. Работа заняла 1 место в конкурсе на лучший научный и инновационный проект студентов и молодых ученых российских и зарубежных вузов (в рамках Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова) в номинации «медицинская наука» в 2007 г.

По теме диссертации опубликовано 8 статей, 7 тезисов и 2 медицинских технологии.

Положения, выносимые на защиту.

1. Экспрессия TMPRSS2/ERG4 является частым, специфическим для РПЖ, событием и может быть использована как маркер РПЖ, а также маркер оценки ответа опухоли на гормональную терапию.

2. Высокая частота ПГ/МН по исследуемым локусам и метилирования изученных генов характерна как для эпителия РПЖ, так и для смежной с ним стромы. На ранних этапах канцерогенеза аллельные нарушения в строме преобладают над таковыми в эпителии.

3. Спектр и частота молекулярных повреждений, выявленных в железах аденокарциномы и стромальном компоненте РПЖ, не идентичны.

4. Выявленные молекулярные повреждения: потеря гетерозиготности локуса 16q23 и метилирование генов GSTP1 и N33 ассоциированы с прогресией РПЖ и могут использоваться в качестве диагностических маркеров.

выводы.

1. Проведен анализ экспрессии химерных транскриптов TMPRSS2/ERG4, TMPRSS2/ETVI и TMPRSS2/ETV4 в образцах РПЖ. Частота перестройки TMPRSS2/ERG4 составила 50%, химерных генов TMPRSS2/ETV1 и TMPRSS2/ETV4 в нашей выборке пациентов с РПЖ не обнаружено.

2. Проведен анализ потери гетерозиготности и микросателлитной нестабильности хромосомных районов 8р22, 13ql4 и 16q23 па 51 микродиссекционном образце ткани РПЖ, а также па 25 микродиссекционных образцах ПИН в опухолевом эпителии и смежной строме. Обнаружена высокая частота ПГ/МН по исследуемым локусам в эпителии аденокарциномы и смежной с ним строме. В образцах ПИН частота молекулярных повреждений в опухоли и строме была достоверно ниже, чем в образцах РПЖ, кроме локуса 13ql4.

3. Проведен анализ метилирования генов Р16, HIC1, N33 и GSTP1 в микродиссекционных образцах ткани РПЖ, определена высокая частота метилирования изученных генов как для малигнизированного эпителия, так и для близлежащей соединительнотканной стромы. В железах с ПИН высокой- степени частоты метилирования изученных генов близки к таковым в железах аденокарциномы. Сравнительный анализ метилирования в микродиссекционных и биопсийных образцах свидетельствует о необходимости микродиссекционного исследования при молекулярном анализе данного типа опухоли.

4. Проведен сравнительный анализ генетических и эпигенетических изменений в опухолевом эпителии и строме. Определено, что в строме РПЖ частоты молекулярных повреждений не уступают таковым в опухолевом эпителии. Спектр и частота молекулярных повреждений, выявленных в железах аденокарциномы и стромальном компоненте РПЖ, не идентичны. Частота ПГ/МН на ранних этапах канцерогенеза в строме достоверно превышает таковую в эпителии.

5. Наличие химерного гена TMPRSS2/ERG4 ассоциировано с прогрессией РПЖ. Обнаружены статистически достоверные ассоциации аллельных потерь в эпителии локуса 16q23 со степенью дифференцировки опухоли, стадией злокачественного процесса и наличием метастазов в регионарных лимфоузлах. Определены достоверные корреляции со стадией РПЖ для локуса 13ql4. Для метилирования генов GSTP1 и N33 было найдено статистически достоверное отличие между группами пациентов с ПИН и пациентов с опухолевым процессом. Выявленные молекулярные изменения могут использоваться как молекулярные маркеры РПЖ в дополнение к применяемым диагностическим методам - гистологическому и биохимическому.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В данной работе изучено метилирование CpG-островков промоторных областей гена GSTP, р1б, HIC1 и N33 на материале опухолевых, неопластических и гиперпластических желез, а также их стромального микроокружения при раке предстательной железы. Обнаружен высокий процент метилирования как для опухолевых желез, так и для близлежащей соединительнотканной стромы. Эпигенетические изменения в етроме, вероятно, являются частью процесса взаимодействия опухоли и стромального микроокружения и являются еще одним свидетельством важной роли опухолевого микроокружения в процессах развития и прогрессии опухолей. Изменение метилирования генов, найденное в близлежащей ткани, показывает, что взаимодействие опухоли и ее окружения происходит на различных функциональных уровнях, в том числе и на эпигенетическом. Наше исследование подтверждает необходимость микродиссекционпого исследования при молекулярном анализе РПЖ, недооценка гетерогенности рака предстательной железы может приводить при анализе к появлению ложноотрицательных результатов. Проведен микросателлитный анализ хромосомных районов 8р22, 13ql4 и 16q23 в неопластических и стромальных клетках при раке предстательной железы и предраковых изменениях.

Результаты нашей работы свидетельствуют, что в строме РПЖ происходят многочисленные мутационные события, которые по частоте не уступают таковым в опухолевом эпителии. Изучение процессов взаимовлияния между опухолевыми и стромальными клетками является одним из направлений, необходимых для понимания механизмов канцерогенеза. Несомненно, что дальнейшее изучение этой проблемы откроет новые возможности в подходах к молекулярной диагностике и лечению рака предстательной железы.

Поиск и характеристика молекулярных маркеров ранней диагностики и прогноза развития опухолевого процесса на сегодняшний день являются наиболее актуальными проблемами онкологии. Определенные молекулярные маркеры или их сочетание позволяют определить прогноз развития заболевания, подобрать оптимальную тактику лечения и разработать новые терапевтические средства. Одной из наиболее важных практических задач ДНК-диагностики в онкологии является создание эффективных и экономичных диагностических протоколов, основанных на молекулярно-биологических технологиях, внедрение которых позволит повысить результативность лечения рака. В нашей работе показано, что образование химерного гена TMPRSS2/ERG4 является частым, опухоль-ассоциированным событием при РПЖ. Достоверные ассоциации наличия химерной перестройки найдены в группах больных с поражением одной доли и двух долей ПЖ, а также в группах пациентов, проходивших гормональное лечение и не проходивших. Экспрессия данного транскрипта коррелирует с более агрессивными стадиями заболевания и может служить молекулярным маркером РПЖ и маркером оценки ответа опухолевых клеток на гормональную терапию и андрогенчувствительности опухолевых клеток. Преимуществом данного метода является возможность работать с образцами опухоли без выполнения микродиссекции, несмотря на выраженную гетерогенность РПЖ.

Результаты нашей работы свидетельствуют о невысокой частоте метилирования генов-супрессоров в плазме крови пациентов с РПЖ, что, к сожалению, не позволяет нам рекомендовать использовать их как маркеры РПЖ.

В результате данного исследования мы обнаружили статистически достоверные ассоциации аллельных потерь в эпителии локуса 16q23 со степенью дифференцировки опухоли, стадией злокачественного процесса и наличием метастазов в регионарных лимфоузлах. Для локуса 13ql4 также найдены достоверные корреляции со стадией процесса. Для гена GSTP1 было найдено статистически достоверное отличие между группами пациентов с ПИН и пациентов с опухолевым процессом. Метилирование гена N33 не было обнаружено в предраковых состояниях, тогда как частота метилирования этого гена в аденокарциноме составила 22%. Найденные молекулярные изменения могут использоваться как молекулярные маркеры РПЖ в дополнение к применяемым диагностическим методам — гистологическому и биохимическому.

Приведенные данные позволяют начать разработку диагностического протокола, основанного на анализе молекулярно-генетических нарушений. Аиализ метилирования генов GSTP1 и N33 в биоптатах пациентов с предраковыми состояниями позволяет выявить группу риска возникновения РПЖ. Микросателлитный анализ локусов 16q23 и 13q 14 может сориентировать в прогнозе уже развившегося РПЖ, определяет пациентов с высоким риском метастазирования. Экспрессия химерной перестройки TMPRSS2/ERG4 может служить маркером оценки ответа опухолевых клеток на гормональную терапию. В перспективе дальнейшая разработка стандартного набора ДНК-маркеров позволит эффективно проводить скрининг и бороться с онкопатологией на самых ранних этапах ее возникновения, проводить мониторинг заболевания в периоды ремиссий, определять микрометастазы в период лечения и определять тактику терапии в случае инактивации определенных генов-рецепторов.

В заключение подчеркнем, что активно развивающиеся сейчас молекулярно-генетические исследования в онкологии в ближайшем будущем позволят существенно изменить и расширить область применения генодиагностики при РПЖ.