Автореферат и диссертация по медицине (14.01.25) на тему:Молекулярно-генетические аспекты терапевтической резистентности у больных бронхиальной астмой

На правах рукописи

МИРОНОВА Жанна Александровна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ У БОЛЬНЫХ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ

14.01.25. - Пульмонология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Санкт-Петербург 2012

1 О 1.1М.; 2012

005017276

005017276

Работа выполнена на кафедре госпитальной терапии имени академика М.В.Черноруцкого Государственного Бюджетного Образовательного Учреждения Высшего Профессионального Образования «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П.Павлова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор Василий Иванович Трофимов член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор Михаил Владимирович Дубина

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Гембицкая Татьяна Евгеньевна

руководитель отдела терапевтической пульмонологии НИИП СПбГМУ им.И.П.Павлова

академик РАМН, доктор медицинских наук Мазуров Вадим Иванович

зав. кафедрой терапии и ревматологии им.Э.Э.Эйхвальда СЗПГМУ им.И.И.Мечникова

доктор медицинских наук, профессор Шавловский Михаил Михайлович

руководитель лаборатории молекулярной генетики человека отдела молекулярной генетики

ФГБУ НИИ экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН Ведущая организация:

ФГОУ ВПО «Военно-медицинская академия им.С.М.Кирова МО РФ»

Защита диссертации состоится «29» мая 2012г. в 13.10. часов на заседании диссертационного Совета Д.208.090.02 при Санкт-Петербургском Государственном медицинском университете имени академика И.П.Павлова в Научно-исследовательском институте пульмонологии (197022, Санкт-Петербург, ул. Рентгена 12, зал заседаний Ученого Совета).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И.П.Павлова по адресу: 197022, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого 6-8.

Автореферат разослан « 23 уапрелА2012г.

Ученый секретарь диссертационного Совета

доктор медицинских наук, профессор Александров Альберт Леонидович

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Бронхиальная астма (БА) относится к числу наиболее распространенных хронических воспалительных заболеваний бронхолегочной системы. В связи с урбанизацией населения к 2025 году ожидается увеличение количества больных БА до 400 миллионов человек (Gibeon D.S. et al„ 2010). Рост заболеваемости, увеличение количества тяжелых форм БА, резистентных к лечению и сохраняющиеся на прежнем уровне, несмотря на достижения терапии, показатели смертности приводят к тому, что БА остается серьезной медицинской и социальной проблемой (Чучалин А.Г., 2005; Федосеев Г.Б., Трофимов В.И. и соавт., 2011).

По результатам анализа эффективности терапии БА в США и в Европе, у 70% пациентов с БА симптомы заболевания не контролируются (AJRCEE, 2000; ENFUMOSA, 2003; TENOR, 2006). Несмотря на успехи фармакотерапии и выявление многих механизмов данной патологии, тяжелая форма БА остается наименее изученной.

В России до 80% пациентов не достигают адекватного уровня лечебного контроля над БА (Чучалин А.Г., 2005; ЛещенкоИ.В. и соавт., 2009); у 10-20% больных диагностируется тяжелое течение заболевания с признаками терапевтической резистентности (Петровский В.Ф. и соавт., 2008). У больных БА резистентность к глюкокортикостероидам (ГКС) достигает 20%, к р2-агонистам адренергических рецепторов - 15%, к ингибиторам лейкотриеновых рецепторов -40% (Чучалин А.Г., 2001). Около 10% пациентов с БА тяжелого течения (ТБА) не отвечают на традиционные режимы лечения, включая высокие дозы ингаляционных ГКС (ИГКС), а 1% пациентов нуждается в постоянной терапии пероральными ГКС (ТГКС) (Barnes Р., 2010).

В последнее время обсуждается понятие терапевтически резистентной бронхиальной астмы (ТРБА); выделяют её фенотипы: фатальная астма, «хрупкая» («brittle») астма, гормонозависимая БА (ГЗБА) - стероидозависимая и стероидорезистентная (Barnes P.J. et al., 1998; Огородова Jl.M. и соавт., 2001; WenzelS., 2005; Chung K.F., 2011). Однако до сих пор нет четкого определения фенотипа ТРБА, и эта терминология пока не применяется повсеместно. Сложившаяся ситуация требует создания единых критериев для постановки диагноза ТРБА с учетом гетерогенности заболевания.

Наиболее перспективными в понимании патогенетических механизмов развития ТРБА, а также в поиске новых диагностических тестов, обладающих высокой степенью чувствительности и специфичности, являются генетические исследования. Вклад генетических факторов в этиопатогенез БА составляет от 36 до 94% (Anderson G., 2008). Генетическая детерминированность может быть

ответственна за 60-80% вариации ответа на ряд противоастматических препаратов (Пузырев В.П., Огородова Л.М., 2010).

В связи с этим особую актуальность приобретает изучение генов лекарственных мишеней. Мутации, ассоциированные с ответом на р2-агонисты, обнаружены в гене р2-адренорецептора (ADRB2), а также в гене глюкокортикоидного рецептора (NR3C1), кодирующего ответ на ГКС. У лиц с определенным генотипом при назначении ГКС, вероятно, может развиваться не только стероидозависимость, но и стероидорезистентность, а при назначении р2-агонистов не исключено отсутствие бронходилатирующего эффекта. Однако результаты исследований очень противоречивы (Hawkins G.A. et al., 2004; Contopoulos-Ioannidis D.G. et al., 2005; Hall I.P. et al., 2007) и требуют уточнения, a y пациентов с ТРБА подобный анализ вообще не проводился.

Актуальным является изучение механизма генетического контроля транспорта ГКС из клетки и связанных с ним различий в стероидочувствительности. Ген множественной лекарственной устойчивости (MDR1) кодирует транспортный белок Р-гликопротеин-170 (Pgp-170), который участвует в эффлюксе липофильных соединений, в том числе ГКС (Farrell. R.O. et al., 2003). Исследований по изучению гена MDR1 при БА в доступной нам литературе мы не нашли.

Одним из молекулярных механизмов развития стероидорезистентности является дисбаланс изоформ глюкокортикоидного рецептора (ГР), который может определять чувствительность тканей-мишеней к ГКС. Данные литературы, касающиеся этого механизма при БА, единичны и противоречивы (Gagliardo R. et al., 2000; Whorwood C.B. et al., 2001; Goleva E. et al., 2006), a в аспекте фенотипов ТРБА, степени тяжести БА и терапии ГКС, особенно при динамическом наблюдении, вообще отсутствуют как в зарубежной, так и в отечественной литературе.

Для решения проблемы терапевтической резистентности необходимо также изучение вклада аллельных вариантов генов цитокинов Th2: интерлейкина 4 (IL4) и интерлейкина 13 (IL13), ассоциированных с иммунным ответом. Исследования в этом направлении пока ограничиваются анализом аллельных вариантов гена IL4 преимущественно при аллергической БА (Фрейдин М.Б. и соавт., 2002; Келембет Н.А., Гембицкая Т.Е. и соавт, 2008), а комплексная оценка полиморфных вариантов генов IL4 и IL 13 при ТРБА еще не проводилась.

Таким образом, представляется актуальным изучение генетической природы терапевтической резистентности, в частности, к глюкокортикостероидам и р2-агонистам, у больных БА. Это позволит выявить генетические маркеры для прогнозирования чувствительности и резистентности к лекарственным средствам и разработать диагностический алгоритм с использованием фармакогенетического подхода у больных БА.

Цель исследования

Оценить значение фармакогенетических факторов в терапии

глюкокортикостероидами и бета2-агонистами у больных терапевтически

резистентной бронхиальной астмой и разработать критерии прогнозирования

терапевтической резистентности с учетом генетических маркеров.

Задачи исследования

1. Определить частоты аллелей, обусловленных мутациями С3435Т гена МБШ; ау16Агё и ап2701и гена АОЯВ2; Ие559А8П, Уа172911е, 11е747Ме1, АзпЗбЗБег, Агё23Ьуз гена ШЗС1; С-589Т гена 1Ь4 и Агё13(Ю1п гена 11ЛЗ, у больных БА различной степени тяжести, а также в зависимости от терапевтической резистентности.

2. Определить частоты аллелей, обусловленных вышеперечисленными мутациями, в контрольной группе, а также аллелей, обусловленных мутациями С3435Т гена ШЖ1, С-589Т гена 1Ь4 и Агё13(Ю1п гена 11ЛЗ, у больных идиопатическим фиброзирующим альвеолитом (ИФА).

3. Определить уровень экспрессии изоформ ГРа и ГР(3, кодируемых геном N11301, у пациентов с ГЗБА, а также у больных БА среднетяжелого и легкого течения заболевания до и после терапии ГКС.

4. Выявить вклад вышеперечисленных генетических детерминант в формирование патогенетических и клинических фенотипов БА, а также их ассоциацию с ответом на терапию ГКС.

5. Разработать алгоритм диагностики, в том числе молекулярно-генетического исследования, для выявления маркерного профиля терапевтической резистентности у больных БА.

Научная новизна исследования

1. Впервые определен маркерный профиль терапевтически резистентной Б А у больных славянской популяции на основании комплексной оценки распределения аллелей, обусловленных мутациями С3435Т гена МОЮ; С1у16Аг§ и 01п27С1и гена АВЯВ2; Ие559Азп, Уа172911е, 11е747Ме1, АзпЗбЗБег, Аг§23Ьуз гена N11301; С-589Т гена 1Ь4 и А^13(Ю1п гена 11ЛЗ.

2 Впервые установлен генетический профиль, включающий аллели, обусловленные мутациями С3435Т гена МЖ1; 01у16Агё и С1п2701и гена АВКВ2-, Ие559А5п, Уа172911е, 11е747Ме1, АзпЗбЗйег, Агё23Ьуз гена NRЗC1; С-589Т гена 1Ь4 и Агё130С1п гена 1Ь13, у больных БА в зависимости от степени тяжести заболевания, позволяющий диагностировать и дифференцировать фенотипы БА.

3. Впервые выявлены ассоциации аллельных вариантов вышеперечисленных генов с

фенотипами ТРБА, а также с проводимой терапией. У больных БА различной степени тяжести показана роль изоформы ГРа как маркера эффективности терапии глюкокортикостероидами.

4. Впервые выявлены генетические предикторы терапевтической резистентности, включая стероидорезистентность, у пациентов с ИФА.

5. Впервые на основании выявленного генетического маркерного профиля с учетом патогенетических и клинических фенотипов БА определены предикторы формирования терапевтической резистентности, что позволило разработать единые критерии постановки диагноза ТРБА.

Практическая ценность работы

1. Разработан метод диагностики терапевтически резистентной БА, основанный на молекулярно-генетических исследованиях, включая фармакогенетический подход, позволивший создать маркерные профили тяжелого и легкого течения БА. Это позволяет прогнозировать эффективность ГКС и р2-агонистов, своевременно назначать альтернативные лекарственные препараты, тем самым предотвращать развитие ятрогенных осложнений и обеспечивать индивидуальный подход, то есть персонифицированную терапию, а также способствовать усовершенствованию принципов индивидуальной противовоспалительной терапии с оптимальным соотношением «эффективность-безопасность».

2. Показана необходимость использования фармакогенетических маркеров с учетом патогенетических и клинических фенотипов, наряду с критериями терапевтически резистентной БА (ATS, 2000), для формирования группы труднокурабельной БА.

3. Разработанное с позиции фармакогенетики комплексное молекулярно-генетическое исследование маркеров ТРБА может быть рекомендовано для широкого практического применения, включая амбулаторный этап. Прогнозирование эффективности терапии у больных БА на основе комплекса фармакогенетических исследований позволяет персонализировать терапию и снизить фармакоэкономические затраты.

4. Выявленные молекулярные механизмы и генетические маркеры, ассоциированные с режимом лекарственной терапии, объемом лечения, ответом на проводимую терапию, открывают возможности использования новых мишеней для воздействия «таргетной» терапии, внедрения новых препаратов, основанных на регулировании экспрессии генов лекарственных мишеней, генов воспаления, генов, ответственных за детоксикацию ксенобиотиков и транспорт лекарственных препаратов.

Положения, выносимые на защиту

1. Терапевтически резистентная Б А является мультифакгорным заболеванием, генетические черты которого имеют популяционные особенности. В развитии БА тяжелого течения с признаками терапевтической резистентности каждый из генетических факторов предрасполагает к развитию заболевания, а их комбинации, «генетические ансамбли», обладают аддитивным эффектом, приводят к высокому риску развития БА, когда для дебюта болезни достаточно минимального влияния факторов внешней среды.

2. Развитие терапевтической резистентности у больных БА обусловлено нарушением функции (32-адренорецептора (02-АР) и ГР вследствие их детерминированности определенными аллелями генов лекарственных мишеней ADRB2 и NR3C1, генов провоспалительных цитокинов IL4 и IL13, генов детоксикации, а также дисбалансом экспрессии изоформ ГР.

3. Терапевтически резистентные и терапевтически чувствительные больные БА представляют собой две различные группы пациентов, отличающиеся друг от друга генетическими маркерами, характером воспаления, механизмами развития стероидочувствительности, функциональными особенностями ГР, р2-АР и, соответственно, ответом на терапию ГКС и (32-агонистами.

4. Терапевтически резистентная БА - это гетерогенное заболевание, которое включает гормонозависимый вариант заболевания, нередко в сочетании с нервно-психическим вариантом БА; характеризуется поздним началом манифестации, зрелым возрастом пациентов преимущественно женского пола, с повышенным индексом массы тела, наличием коморбидной патологии, преобладанием системного нейтрофильного воспаления, выраженной и частично обратимой бронхообструкцией, а также плохим контролем заболевания и склонностью к развитию осложнений.

5. При БА глюкокортикостероиды модулируют экспрессию изоформ ГР, и это особенно выражено при терапии системными ГКС.

Апробация работы

По материалам диссертации опубликовано 34 печатные работы, в том числе 14 статей, из них 11 в журналах, рекомендуемых ВАК; в зарубежной литературе 9 публикаций.

Материалы диссертации докладывались на научной сессии общего собрания Северо-Западного отделения РАМН «Генетика в профилактике, диагностике и лечении заболеваний человека» (Санкт-Петербург, 2005); на XVI, XVII, XIX, XX Национальных конгрессах по болезням органов дыхания (Санкт-Петербург, 2006, Казань, 2007, Москва, 2009, 2010); на 4-м конгрессе Евро-Азиатского респираторного общества, 5 международном конгрессе пульмонологов Центральной Азии (Ташкент,

7

2008); на 4 Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Каракол, 2009); на научно-практических конференциях «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2007, 2009); на научно-практической конференции «Бронхиальная астма: вчера, сегодня, завтра» (Санкт-Петербург, 2007); на Российском конгрессе с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины - возможное и реальное», посвященном памяти Е.И.Шварца (Санкт-Петербург, 2010); на конференции «От научных исследований к практической пульмонологии» в рамках научной сессии НИИ Пульмонологии (Санкт-Петербург, 2010); на XIV научно-практической конференции «Булатовские чтения: актуальные вопросы пульмонологии и клинической аллергологии - врачам общей практики» (Санкт-Петербург, 2010); на Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы внутренней медицины», посвященной 170-летию кафедры госпитальной терапии BMA им. С.М.Кирова (Санкт-Петербург, 2010); на научно-практической конференции, посвященной 110-летию кафедры госпитальной терапии им. акад. М.В.Черноруцкого СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова (Санкт-Петербург, 2011); на Европейской конференции «Генетика человека» (Nice, 2007); на XVI, XVIII, XX, XXI конгрессах Европейского респираторного общества (Munich, 2006; Berlin, 2008; Barcelona, 2010; Amsterdam, 2011).

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты исследования внедрены в лечебную практику клиники госпитальной терапии, а также межклинического аллергологического отделения и консультативно-диагностического центра ГБОУ ВПО СПбГМУ им. И.П. Павлова Минздравсоцразвития РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 251 странице машинописного текста, содержит 47 таблиц, иллюстрирована 37 рисунками и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования и обсуждение, выводы, практические рекомендации и список литературы, включающий 236 научных источников 47 - на русском языке и 189 - на иностранном.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследование (дизайн «случай-контроль») были включены жители СевероЗападного региона России, европеоиды, не связанные узами родства и подписавшие информированное согласие на участие. Для решения поставленных задач мы обследовали 263 человека.

За период 2006-2011 гг. в клинике госпитальной терапии ГБОУ ВПО СПбГМУ им. И.П.Павлова было обследовано 122 больных Б А. Группу контроля составили 103 человека: 66 женщин (64%) и 37 мужчин (36%) в возрасте от 20 до 75 лет, без хронической бронхолегочной, аллергической, аутоиммунной и онкологической патологии, с неотягощенной наследственностью по аллергическим заболеваниям, все некурящие. В сравнительную группу вошли 38 больных ИФА, из них 26 женщин (68,4%) и 12 мужчин (31,6%), средний возраст 61,29±13,15 года (использован банк ДНК, предоставленный к.м.н. Ю.М. Илькович - сотрудником кафедры пульмонологии факультета последипломного образования с клиникой СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова).

Диагноз БА устанавливали в соответствии с классификацией и критериями международного консенсуса по вопросам диагностики и лечения БА (GINA, 2008) и Российского руководства по диагностике, лечению и профилактике БА (Трофимов В.И., 2005). Тяжелое течение БА (ТБА) было выявлено у 55 больных (45,08%), среднетяжелое (СБА) - у 52 пациентов (42,62%) и легкое течение (ЛБА) - у

15 человек (12,30%).

ТРБА была диагностирована согласно критериям рабочей группы Американского Торакального общества (ATS, 2000) (таблица 1). Для постановки диагноза достаточно одного большого и двух малых критериев.

Таблица 1

Диагностические критерии ТРБА (ATS, 2000)

Большие критерии

Малые критерии

1. Потребность в применении ТГКС на протяжении >50% длительности БА

2. Необходимость использования высоких доз ИГКС (беклометазон >1260 мкг/сутки, будесонид>1200 мкг/сутки, триамсинолон и флунизолид >2000 мкг/сутки, флутиказон пропионат >880 мкг/сутки 1. Ежедневная потребность в длительнодействующих р2-агонистах (ДДБА), теофиллине, антилейкотриеновых препаратах__

2. Ежедневные симптомы БА, требующие применения короткодействующих [32-агонистов (КДБА)

3. Сохраняющаяся бронхообструкция (ОФВ,<80%, дневная вариабельность ПСВ>20%)

4. >1 вызова бригады неотложной помощи за последний год

5. >3 курсов ТГКС за последний год

6. Обострение БА при уменьшении на <25% дозы ИГКС и ТГКС

7. Жизнеугрожающие события, связанные с БА в прошлом

Все пациенты с БА были стратифицированы в соответствии с критериями терапевтической резистентности: 46 больных ТРБА и 76 пациентов с терапевтически чувствительной БА (ТЧБА), (таблица 2).

Таблица 2

Распределение больных ТРБА и ТЧБА с учетом степени тяжести и клинико-патогенетических вариантов БА

Признак ТРБА ТЧБА Р

Число/доля больных 46/0,38 76/0,62

Пол женщины 32/0,70 53/0,70 р>0,050

мужчины 14/0,30 23/0,30

Возраст, годы 53,15± 12,89 45,72±16,16 р=0,016

Длительность заболевания, годы 18,74±8,99 10,62±8,52 р<0,001

Степень тяжести БА: -тяжелая 38/0,83 17/0,22 р<0,001

-средняя 8/0,17 44/0,58

-легкая 0/0 J 15/0,20

Клинико-патогенетический вариант БА -аллергическая о/о 9/0,12 р>0,050

-неаллергическая 8/0,17 8/0,10

-смешанная 38/0,83 59/0,78

-инфекционно-зависимый вариант 39/0,85 65/0,86 р>0,050

-нервно-психический вариант 29/0,63 45/0,59 р>0,050

-аспириновая БА 2/0,04 10/0,13 р>0,050

-гормонозависимый вариант 36/0,78 17/0,22 р<0,001

У больных ТРБА превалировал гормонозависимый вариант заболевания.

Пациентам с БА проводили стандартное комплексное клинико-лабораторное и инструментальное обследование, включавшее общеклинические методы, цитологическое исследование мокроты, исследование иммунологического статуса, исследование функции внешнего дыхания (ФВД), а также, по показаниям, фибробронхоскопию, аллергологическое и гормональное исследования.

Основные показатели крови, мокроты и ФВД у больных ТРБА и ТЧБА представлены в таблице 3.

Для больных ТРБА было характерно нейтрофильное воспаление в периферической крови, а для больных ТЧБА - эозинофилия в крови и в мокроте.

Обструктивные и рестриктивные изменения были в большей степени выражены у пациентов с ТРБА, по сравнению с больными ТЧБА.

Сравнительная характеристика клинико-лабораторных признаков

Признак ТРБА ТЧБА Р

Лейкоциты в периферической крови, 109/л 10,3 (7,6; 13,5) 8,2 (6,6; 10,0) р=0,007

Эозинофилы в периферической крови, 109/л 0,06 (0,01; 0,16) 0,14 (0,04; 0,30) р=0,037

Нейтрофилы в периферической крови, 109/л 6,9(4,6; 9,4) 4,9 (3,8; 6,5) р=0,007

Кортизол в плазме крови, нмоль/л 72 (35; 183) 242 (61; 413) р=0,008

Эозинофилы в мокроте, % 14,0(10,0; 19,0) 17,0(13,0; 28,0) р=0,018

Нейтрофилы в мокроте, % 42,0 (31,0; 54,0) 38,0 (30,0; 50,0) р>0,050

ОФВ1, % должного 53,97±20,80 75,87 ± 19,89 р<0,001

Прирост ОФВ1,% (после бронхолитика) 19,0(11,7; 36,0) 13,8(6,9; 23,5) р=0,025

фЖЕЛ, % должного 79,48± 19,71 95,33 ± 15,77 р<0,001

Индекс Тиффно (ОФВ,/фЖЕЛ) 65,01±15,47 78,16 ± 15,09 р<0,001

МОС5о, % должной величины 18,9 (13,3; 31,0) 45,0(27,8; 55,7) р<0,001

МОС75, % должной величины 14,0(11,0; 27,0) 29,0 (17,3; 41,0) р<0,001

Эваху, см вод.ст.-'с-1 0,06±0,06 0,08±0,03 р<0,001

Количество больных с резкими обструктивными изменениями 24/0,57 10/0,13 р<0,001

Количество больных с рестриктивными изменениями 11/0,28 7/0,09 р=0,012

Сравнительная характеристика анамнестических данных представлена в таблице 4.

Коморбидная патология, профессиональные вредности в анамнезе, а также осложнения глюкокортикостероидной терапии (ГКТ) существенно чаще встречались у пациентов с ТРБА.

Комплекс лечебных мероприятий у больных Б А представлен в таблице 5.

Длительность глюкокортикоидной терапии, дозы системных и ингаляционных ГКС, неконтролируемость заболевания были в большей степени представлены у больных ТРБА.

Сравнительная характеристика анамнестических данных

Анамнестический признак ТРБА ТЧБА Р

Ишемическая болезнь сердца (ИБС) 27/0,59 28/0,37 р=0,015

Гипертоническая болезнь (ГБ) 32/0,70 43/0,57 р>0,050

Варикозная болезнь нижних конечностей 11/0,24 8/0,11 р=0,044

Ожирение 17/0,46 21/0,32 р>0,050

Гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь (ГЭРБ) 12/0,26 8/0,11 р=0,024

Профессиональные вредности 24/0,53 27/0,36 р=0,048

Курение 19/0,41 23/0,30 р>0,050

Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) 14/0,30 13/0,17 р>0,050

Пневмония 23/0,62 25/0,39 р=0,018

ГКС-ассоциированные осложнения 30/0,65 16/0,21 р<0,001

Синдром Иценко- Кушинга 16/0,35 7/0,09 р<0,001

Остеопороз 25/0,54 12/0,16 р<0,001

Стероидный диабет 7/0,15 3/0,04 р=0,039

Трофические изменения кожи 16/0,35 6/0,08 р<0,001

Миопатия 3/0,06 0/0 р>0,050

Таблица 5

Характер терапии у больных ТРБА и ТЧБА

Показатель ТРБА ТЧБА Р

Длительность терапии ТГКС, годы 9,03±9,34 1,95±4,81 р<0,001

Максимальное количество ТГКС за период болезни,таблетки 4,38±3,04 1,29±2,11 р<0,001

Суточная доза ТГКС, таблетки 3,0 (1,0; 4,0) 1,0(1,0; 2,0) р=0,023

Суточная доза ИГКС в пересчете на беклометазон, мкг 2000 (1500; 2000) 1000 (1000; 1000) р<0,001

Количество больных, получающих ИГКС > 1200 мкг/сутки в пересчете на беклометазон 39/0,85 6/0,08 р<0,001

Суточная доза в/в ГКС в пересчете на преднизолон, мг 47,0 (38,0; 63,0) 37,6 (27,0; 45,0) р<0,001

Максимальное количество КДБА, ингаляц /сут 7 (4; 10) 4 (2; 9) р=0,040

Количество больных с комбинированной ингаляционной терапией (ГКС + ДДБА) 34/0,74 30/0,40 р<0,001

Суточная доза верапамила, мг 160 (120; 240) 120 (100; 120) р=0,003

Лечение ятрогенных осложнений ГКС 11/0,24 3/0,04 р=0,040

Количество вызовов скорой помощи в год 3 (2; 10) 2(1; 3) р=0,007

Вызовы неотложной помощи >1 раза за год 31/0,69 24/0,33 р<0,001

Молекулярно-генетическое исследование

Молекулярно-генетическое исследование было проведено в Отделе молекулярно-генетических и нанобиологических технологий ГБОУ ВПО СПбГМУ им. И.П.Павлова (руководитель отдела чл.-корр. РАН, профессор Дубина М.В) при непосредственном методическом содействии научных сотрудников к.м.н. Янчиной Е.Д. и K.M.Ii Улитиной A.C.

Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови стандартным фенольно-хлороформным методом (Маниатис Т. и соавт., 1984). Однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) идентифицировали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим рестрикционным анализом.

Был выполнен анализ 10 SNP в 5 генах: MDR1 (OMIM 171050); IL4 (OMIM 147780); IL13 (OMIM 147683); ADRB2 (OMIM 109690); NR3C1 (OMIM 138040) (таблицы 6, 7).

Таблица 6

Условия ПЦР: структура и температура отжига праймеров

Ген SNP Прямой (F) и обратный (R) праймеры* T°,C

MDR1 С3435Т F- 5-TGT ATGTTGGCCТССTTTGCTG-3' R: 5'-AGC ATT GCT GAG AAC ATT GCC TA-3' 57

IL-4 С-589Т F: 5'-ACT AGG CCT CAC CTG ATA CG-3' R: 5'-GTT GTA ATG CAG ТСС ТСС T-3' 51

IL-13 Argl30Gly F: 5'-CCA GTT TGT AAA GGA CCT GCT-3' R: 5 ' -GCT TTC GAA GTT TCA GTT GAG C-3' 53

ADRB2 GlylóArg Gln27Glu F: 5-GCC TTC TTG CTG GCA CCC CAT-3' R: 5'- CAG ACG CTC GAA С TT GGC CAT-3' 60

NR3C1 Asn363Ser F: 5'-TTC TCA АСА GCA GGA TCA GAA GC-3' R: 5-TGT TCG ACC AGG GAA GTT CAG AG-3' 65

Arg23Lys F: 5-AGG ATTGAT ATT CAC TGA TG-3' R: 5'-TTA GGG TTT TAT AGA AGT-3' 47

Ile559Asn F: 5'-CAG GCC CAN АСА GGA GTC TCA CAA-3' R: 5-TGC CGC CCT CCT AAC ATG TT-3' 57

Val729Ile Ile747Met F: S'-CAT TAC CAT АТС TTC ТСС TG-3' R: 5'-TTC TTA TTA AGG CAG TCA CT-31 55

Параметры рестрикционного анализа

Ген SNP Рестрик-таза Ампликон, п.н. Генотипы и длины рестрикционых фрагментов, п.н.

MDR1 С3435Т Mbol 89 С С: 60, 29; CT: 89, 60,29; TT: 89

IL-4 С-589Т BsmFI 254 СС: 209, 45; CT: 254, 209, 45; TT: 254

IL-13 Argl30Gln AIuI 76 ArgArg: 76; ArgGln: 76, 55, 21; GlnGln: 55,21

ADRB2 Glyl6Arg Ncol 168 ArgArg: 128, 18,22; ArgGly: 146, 128, 18,22; GlyGly: 146, 22

Gln27Glu BseXI GlnGln: 168; GlnGlu: 168, 105, 63; GluGlu: 105,63

Asn363Ser TasI 139 AsnAsn: 94,45; AsnSer: 94, 75, 19,45; SerSer: 75,19,45

Arg23Lys Mnll 117 ArgArg: 117; ArgLys: 117,76,41; LysLys: 76,41

NR3C1 Ile559Asn Mbol 206 Helle: 170, 36; IleAsn: 206, 170, 36; AsnAsn: 206

Val729Ile BseLI 192 Val Val: 168, 24; Vaille: 192, 168, 24; Helle: 192

Ile747Met Rsel Helle: 192; IleMet: 192, 113, 79; MetMet: 113,79

Работа по определению уровня экспрессии мРНК включала в себя следующие этапы: забор венозной крови в стандартную пробирку с ЭДТА; стабилизация профиля экспрессии РНК реагентом «Среда-РНК» (ФГУН «ЦНИИЭ Роспотребнадзора», Россия); выделение общей РНК набором реагентов «РИБО-золь-В» (ФГУН «ЦНИИЭ Роспотребнадзора», Россия); реакция обратной транскрипции с помощью набора реагентов «PEBEPTA-L» (ФГУН «ЦНИИЭ Роспотребнадзора», Россия); ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) в амплификаторе ABI 7000 («Applied Biosystems», США), используя «Комплект реагентов для проведения ПЦР-РВ с Taq ДНК-полимеразой и ингибирующими активность фермента антителами в присутствии референсного красителя ROX» («Синтол», Россия).

Детекцию продуктов ПЦР проводили методом линейных разрушаемых проб с флуорофором и гасителем флуоресценции (TaqMan-зонды); в качестве эндогенного внутреннего контроля использовали G-белок, продукт гена GNB2L1 (ОМ1М 176981) (таблица 8). Для повышения точности результатов все образцы исследовались в трех повторах (трипликатах).

Таблица 8

Параметры ПЦР в реальном времени: структура и температура отжига праймеров и ТацМап-зондов

Фрагмент ДНК Прямой (F) и обратный (R) праймеры; TaqMan-зонд T,°C

ГРа F: 5'-СТС СТТ ААС TAT TGC TTC CAA АСА ТТТ-3' R: 5'-TGA TTG GTG ATG ATT ТСА GCT ААС А-3' 5'-(FAM)-TGG ATA AGA CCA TGA GTA TTG AAT TCC CCG A-3'-(TAMRA) 60

TPß F: 5'-TTA АТС TGA TTT TCA TCC CAA CAA TC-3' R: 5'-TTG ACA ACG AAG TGC АСА TAA TCT T-3 5'-(FAM)-TGG CGC TCA AAA AAT AGA ACT CAA TGA GAA AA-3'-(TAMRA) 60

GNB2L1 F: 5'- GAA TAC CCT GGG TGT GTG CAA-3' R: 5'- GGA CAC AAG АСА CCC ACT CTG-A-3' 5'- (R6G)-TAC ACT GTC CAG GAT GAG-A-(BHQ-3)' 60

Результаты исследования обрабатывали с помощью компьютерной программы Statistica 6.0 (StatSoft Inc., США). Критической величиной уровня значимости (р) считали 0,050. Переменные, удовлетворяющие критерию нормального распределения (критерий Шапиро-Уилка), сравнивали с помощью t-критерия Стьюдента и дисперсионного анализа ANOVA, и переменные представляли в виде «М ± ш», где М - среднее арифметическое (Mean), ш - среднеквадратичное отклонение (SD). В остальных случаях для сравнения выборок использовали непараметрические методы: критерий Манна-Уитни и критерий Крускапа-Уоллиса, и переменные представляли в виде «Me (Q25; Q75)», где Me - медиана, Q25 - нижний квартиль, Q75 - верхний квартиль. Для сравнения частот генотипов и аллелей использовали критерий у? и точный критерий Фишера. Корреляции оценивали по методу Спирмана. Для оценки влияния нескольких независимых переменных на переменную отклика использовали метод множественной линейной регрессии. Относительный риск (odds ratio, OR) рассчитывали с 95% доверительным интервалом (CI) по формуле OR=a/b х d/c, где а и b - количество больных, имеющих и не имеющих мутантный аллель, соответственно; cud- количество лиц контрольной группы, имеющих и не имеющих мутантный аллель, соответственно.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При популяционном анализе распределения полиморфных вариантов гена MDR1 частота генотипа 3435СС в контрольной выборке (8,7%) резко отличалась от результатов в популяциях восточных африканцев (83%), афроамериканцев (61%), европейцев (38%) и японцев (26%) (FarrellR.O. et al., 2003). Наиболее близкие к нашим, результаты по данному локусу были получены в португальской популяции (3435СС 12%, 3435СТ 47%, 3435ТТ 41%) и в русской популяции из Новосибирской области (3435СС 13%, 3435СТ 43%, 3435ТТ 44%) (Pechandova Н„ 2006; ГореваО.Б., 2007).

Частота аллеля 16Arg гена ADRB2 (0,422) в контрольной группе соответствовала данным по европейской популяции (0,420). Частота генотипа 16ArgArg (19,8%) была сопоставима с данными (15%), полученными в исследовании WechlerM.E. и соавт. (2006). Частота аллеля 27Gln была несколько выше частоты аллеля 27Glu (0,547 и 0,453, соответственно) и сопоставима со средними значениями по Европе (0,560) (Thakkinstian A. et al., 2005).

Мы не обнаружили мутаций в пятом (IIe559Asn) и девятом (Val729Ile, Ile747Met) экзонах гена NR3C1 в группе контроля. Выявлен единственный случай гомозиготного носительства аллеля 23R гена NR3C1 в группе контроля; частота гетерозиготного носительства 23RK, ассоциированного со стероидорезистентностью 2 типа, составила 2,9% и была меньше значений, полученных в других популяциях (более 6%) (Rossum Е. et al., 2002, Panek М. et al., 2011). При анализе аллельных вариантов N363S гена NR3C1, ассоциированных с повышенной чувствительностью к ГКС (Huizenga N.A. et al., 1998; Dobson M.G. et al., 2001; RosmondR., 2003) было выявлено, что в контрольной группе 10 человек (10%) были гетерозиготами (363SN), то есть они были генетически детерминированы в плане гиперчувствительности к ГКС. Наши данные оказались близки к результатам в других популяциях, в которых врожденную гиперчувствительность к ГКС имели 6-16% лиц (Corrigan С.S., et al., 2007; Panek М. etal., 2011).

Частота генотипа -589ТТ гена IL4 в нашей выборке (10,5%) оказалась близкой к таковой в русской выборке (9,4%) (Фрейдин М.Б. и соавт., 2002) и несколько выше, чем в группе здоровых жителей Северо-Западного региона РФ (4,3%) (Келембет Н.А. и соавт., 2008). Распределение аллельных вариантов гена 1L4 в нашей контрольной группе отличалось от результатов по другим этническим группам: среди таджиков частота генотипа -589ТТ составила 3%; среди бурят - 36,7% (Фрейдин М.Б. и соавт., 2002); среди американцев - 2,5%; среди афроамериканцев - 42% (Donfack J. et al., 2005).

Выявленные нами частоты генотипов гена IL13 (130ArgArg - 57,3%, 130ArgGln - 38,8%, 130GlnGln - 3,9%) мало отличались от выборки американцев (130ArgArg -62%, 130ArgGln - 35%, 130GlnGln - 2,5%) и более существенно отличались от группы

афроамериканцев (68%, 29% и 2,4%, соответственно) (ЭопГаск .1. е! а1., 2005).

Полученные нами данные согласуются с представлением о том, что в процессе этногенеза частоты аллелей приобретают свою специфику у разных народов, что создает предпосылки для дифференцированной предрасположенности к мультифакторным заболеваниям.

Мы провели анализ распределения полиморфных вариантов исследуемых генов у больных БА в зависимости от степени тяжести заболевания.

Нами впервые была выявлена ассоциация аллельных вариантов, обусловленных мутацией С3435Т гена N©111, с наличием БА, а также со степенью тяжести заболевания (рис. 1).

р<0.001

В 3435СС Ц 3435СТ № 3435ТТ

ТБА

СБА

ЛБА

Контроль

Рисунок 1. Распределение генотипов и аллелей С3435Т гена М1Ж1 у больных БА различной степени тяжести по сравнению с группой контроля

Носительство генотипа 3435СС повышало риск развития БА почти в 4 раза [(Ж (3435СС против 3435СТ+3435ТТ)=3,92 (95%С1 1,74-8,79)]. Различия в частотах генотипов С3435Т сохранялись при стратификации больных БА по степени тяжести заболевания (х2=б,57; <1£=2; р=0,037), в сравнении их с группой контроля; причем, чем тяжелее БА, тем весомее была связь с аллелем 3435С. Носительство генотипа 3435СС повышало риск развития ТБА в 5,22 раза [(Ж (3435СС против 3435СТ+3435ТТ) = 5,22 (95%С1 2,11-12,92)].

Также существенным фактом, с практической точки зрения, было обнаружение в группе больных ГЗБА (это пациенты с тяжелым течением заболевания), что

носительство генотипа 3435СС гена MDR1 увеличивало риск развития потребности в ГКС (более 4 таблеток) в 8,4 раза [OR (3435СС против 3435СТ+3435ТТ)=8,40 (95%С1 1,73 - 40,71)]. Это свидетельствует о неодинаковом влиянии аллельных вариантов гена MDR1 на метаболизм ГКС в клетках, что в итоге определяет дозу ТГКС, риск развития ятрогенных осложнений и приводит к развитию БА тяжелого течения.

Механизм этого феномена заключается, вероятно, в том, что аллель 3435С гена MDR1 ассоциирован с повышенным уровнем активности Pgp-170, который приводит к ускоренному эффлюксу ГКС и недостаточному противовоспалительному эффекту ГКТ, как это было показано ранее, у больных ревматоидным артритом (Pawlik А. et al„ 2005).

При обсуждении роли воспаления в патогенезе БА, был рассмотрен вопрос о характере воспалительного процесса, играющим, по современным представлениям, решающее значение в формировании тяжелого течения БА (Федосеев Г.Б., Трофимов В.И. и соавт., 2011; Newton R. et al„ 2010). У больных БА была выявлена корреляция между содержанием нейтрофилов и эозинофилов в периферической крови со степенью тяжести БА: по мере прогрессирования заболевания содержание нейтрофилов повышалось (Spearman R=0,324; р<0,001; п=120), что иллюстрировало несомненный вклад нейтрофильного воспаления в развитие ТБА, а содержание эозинофилов снижалось (Spearman R=4),264; р=0,004; п=120). Наряду с этим, по мере увеличения степени тяжести БА показатель ОФВ, уменьшался (Spearman R—0,466; р<0,001; п=118), что свидетельствовало о прогрессировании бронхообструкции.

Также нами была обнаружена корреляция, свидетельствующая о том, что у больных БА по мере увеличения вклада аллеля 3435Т гена MDR1 (в ряду генотипов 3435СС - 3435СТ - 3435ТТ) содержание эозинофилов в мокроте увеличивалось (Spearman R=0,234, р=0,025; п=92). Данный факт подтверждает гипотезу о том, что аллель 3435Т гена MDR1 ассоциирован с аллергическим воспалением и, как правило, с легким, контролируемым течением БА. В то же время, у больных ЛБА носителей генотипа 3435ТТ гена MDR1 было отмечено наименьшее содержание нейтрофилов в мокроте [34,0 (29,0; 39,0) %] по сравнению с генотипами 3435СТ [48,0 (45,0; 52,0) %]

и 3435СС [52,0 (50,0; 54,0) %] (р=0,047).

Отметим, что выявление указанного выше феномена крайне важно, поскольку нейтрофильное воспаление, ассоциированное с генотипом 3435СС гена MDR1, является агрессивным фактором, способствующим развитию БА тяжелого течения и плохому контролю заболевания. Это подтверждает и выявленная нами отрицательная корреляционная связь между вкладом аллеля 3435Т и числом астматических статусов у больных БА: по мере увеличения вклада аллеля 3435Т (в ряду генотипов 3435СС -3435СТ - 3435ТТ) число астматических статусов уменьшалось (Spearman R=-0,433; р=0,035; п=24). Следовательно, генотип 3435СС гена MDR1 может рассматриваться в качестве маркера, ассоциированным с нейтрофильным воспалением и с развитием

фатальных состояний, проявляющихся астматическим статусом.

У больных БА частота генотипа 16GlyGly гена ADRB2 составила 35,7% и была сопоставима с группой контроля (35,4%). Частоты генотипов (16ArgArg - 13,9%, 16ArgGly - 50,4%) были ближе к результатам в группе больных БА славянского происхождения, где частота генотипа 16ArgArg составила 16,9%, 16ArgGly - 51,8% и 16GlyGly - 31,3% (Пузырев В.П. и соавт., 2010) и также были сопоставимы с данными, полученными в испанской популяции: 16ArgArg - 18%, 16ArgGly - 46% и 16GlyGly - 37% (Rebordosa С. et al., 2011). Мы не выявили различий в распределении аллельных вариантов Glyl6Arg гена ADRB2 у больных в зависимости от степени тяжести БА и при сравнении с группой контроля, поэтому нет оснований рассматривать данный генетический вариант как предрасполагающий к БА. Подобной точки зрения придерживаются и другие авторы (Куренкеева А.К. и соавт., 2006).

Важно отметить, что отсутствие в анализируемых группах ярких различий в частотах аллельных вариантов Glyl6Arg гена ADRB2 не должно снижать интерес к данному полиморфизму. Мы обнаружили ассоциации аллельных вариантов Glyl6Arg гена ADRB2 с патогенетическими и клиническими фенотипами БА. При оценке количества эозинофилов в периферической крови, как косвенного показателя активности аллергического воспаления, было выявлено, что носительство генотипа 16GlyGly гена ADRB2 повышало риск эозинофилии в периферической крови в 6,26 раза [OR (16GlyGly против 16GlyArg+16ArgArg) =6,26 (95%CI 1,16 - 33,80)]. В свою очередь, у больных ЛБА по мере увеличения вклада аллеля 16Arg содержание эозинофилов в крови уменьшалось (Spearman R=-0,720, р=0,004; п=14). Вероятно, функциональные особенности р2-АР, кодируемые аллельным вариантом 16GlyGly гена ADRB2, ассоциированы с эозинофильным воспалением и создают предпосылки для развития аллергической БА. Необходимо также отметить, что носительство аллеля 16Gly гена ADRB2 повышало риск развития гипоксемической дыхательной недостаточности (ДН) II степени в 17,31 раза [OR (16GlyGly+16GlyArg против 16ArgArg) =17,31 (95%CI 2,01 - 149,28)]. При этом генотип 16ArgArg гена ADRB2 можно рассматривать как протективный фактор в отношении прогрессирования ДН [OR (16ArgArg против 16GlyGly+16GlyArg) = 0,06 (95%CI 0,01 - 0,50)]. Таким образом, аллель 16GIy гена ADRB2 через нарушение проведения регуляторного сигнала в адренореактивной системе может влиять на развитие осложнений БА в виде гипоксемической ДН.

У больных ТБА частота генотипа 27GInGlu (37%) была в 1,5 раза меньше по сравнению с больными СБА (57,4%) (р=0,032) и ЛБА (50,0%), а также с объединенной выборкой пациентов (СБА + ЛБА) (р=0,034). Генотип 27GluGlu гена ADRB2 не был выявлен ни у одного пациента с ЛБА, в то время как он встречался у 20,8% обследуемых лиц в группе контроля и у 22,2% больных ТБА (р=0,047). У

пациентов с ЛБА чаще встречался аллель 27Gln (0,750) по сравнению с группой контроля (0,547) (р=0,049). Полученные данные согласуются с результатами исследования в европейской популяции, где была выявлена ассоциация полиморфных вариантов Gln27Glu гена ADRB2 со степенью тяжести БА (Kim S.H. et.al., 2002). Вероятно, у больных БА носительство аллельных вариантов Gln27Glu гена ADRB2, ассоциированное с различной степенью недостаточности функции Р2-адренергической системы, может приводить к разному течению БА и, соответственно, определять длительность терапии и дозу р2-агонистов и ГКС. Это было подтверждено обнаружением положительной корреляции между вкладом аллеля 27Glu гена ADRB2 и длительностью внутривенной терапии у больных ТБА: по мере увеличения вклада аллеля 27Glu (в ряду генотипов 27GlnGln - 27GlnGlu -27GluGlu) длительность внутривенной терапии увеличивалась (Spearman R=0,448; р=0,002; п=45).

У пациентов с БА мы не выявили мутаций в пятом (Т1808А) и девятом (G2317A, T2373G) экзонах гена NR3C1. Это позволило исключить стероидорезистентность 2-го типа (первичную, семейную), которая встречается очень редко (1:10 000 больных БА), наследуется по аутосомно-доминантному типу и является крайним вариантом снижения чувствительности к ГКС (Barnes Р. et al., 2009).

Мы выявили единственного пациента с ТБА с носительством генотипа 23RK гена NR3C1, у которого было осложнение ГКТ в виде системного остеопороза. В данном случае, вероятно, «вес» мутантного аллеля 23R не был достаточен для фенотипических проявлений врожденной стероидорезистентности. Наши данные по частоте гетерозигот (0,08) незначительно отличались от польских пациентов с БА (0,06). Все пациенты с СБА были гомозиготами по аллелю 23К, в отличие от больных СБА - поляков, среди которых частота генотипа 23К.К составила 0,96 (Panek М. et al., 2011). Таким образом, носительство генотипа 23RK гена NR3C1 является редким событием и ассоциировано с тяжелым течением БА.

Среди пациентов с БА мы обнаружили пять носителей генотипа 363SN (4,1%), то есть они встречались в 2,4 раза реже, чем в группе контроля (10%). Все эти пациенты были стероидочувствительными. В европейской популяции частота варианта 363SN у больных БА составила 6% (Huizenga N.A. et al., 1998; Dobson M.G. et al., 2001), а у больных ИФА - 8,8% (Илькович Ю.М., 2006). Таким образом, гиперчувствительность, ассоциированная с носительством генотипа 363SN гена NR3C1, у пациентов с БА встречается реже, чем у лиц без бронхолегочной патологии.

Анализ полиморфных вариантов С-589Т гена IL4 показал, что только больные ЛБА (преимущественно с аллергическим вариантом заболевания) отличались от контрольной группы. Аллель -589Т гена IL4 преобладал у пациентов с ЛБА (0,464) по сравнению с больными СБА (0,356) и группой контроля (0,326) (р<0,050). Не

исключено, что носительство аллеля -589Т у больных ЛБА в последующем может привести к прогрессированию и более тяжелому течению заболевания. Наши результаты согласуются с данными литературы, где мутация С-589Т гена IL4 рассматривается как имеющая прогностическое значение для степени тяжести атопической БА (Freidin M.V. et al„ 2003). Следует отметить, что аллель -589Т гена IL4 выявлен у 38% афроамериканцев, страдающих Б А, по сравнению с пациентами белой расы (12%) и, афроамериканцы почти в 3 раза чаще подвержены снижению стероидочувствительности, вплоть до развития стероидорезистентности (Ito К. et al., 2006).

Вероятно, носительство аллеля 589Т гена IL4, ассоциированное со снижением стероидочувствительности и с недостаточным контролем заболевания, требует назначения высоких доз ГКС. Данная гипотеза была подтверждена выявленной нами положительной корреляцией, согласно которой, по мере увеличения вклада аллеля

-589Т (в ряду генотипов -589СС--589СТ - -589ТТ) увеличивалась доза ГКС,

вводимых внутривенно для купирования обострения у больных ТБА (Spearman R=0,319; р=0,033; п=45). Это подтверждает концепцию, согласно которой, одной из причин повышенной потребности в ГКС, вводимых внутривенно, у носителей аллеля -589Т гена 1L4 является снижение чувствительности к ГКС, обусловленное цитокиновым дисбалансом (Barnes P.J. et al., 2009) и, таким образом, есть основания полагать, что аллель -589Т гена IL 4 является «агрессивным» у больных БА.

Мы выявили ассоциацию аллельных вариантов Argl30Gln гена IL13 с Б А, что согласуется с результатами по японской и европейской популяциям, где была выявлена связь данного локуса с атопической БА (Graves Р.Е., 2000). У больных БА частота «агрессивного» генотипа 130GlnGln гена IL13 составила 9,8%, что сопоставимо с данными по нидерландской (7%), финской (12%), немецкой (6%) и британской (12%) популяции (Koppelman G.H. et al., 2008). Частота «агрессивного» аллеля 130Gln гена IL13, ассоциированного с повышенной продукцией IL13 (Кетлинский С.А. и соавт., 2008) была выше у пациентов с СБА, чем в группе контроля (0,394 и 0,233; р=0,004). Носительство аллеля 130Gln гена IL13 повышало риск развития СБА в 2,8 раза [OR (130GlnGln+130ArgGln против 130ArgArg) =2,76 (95%CI 1,35-5,63)]. При исследовании показателей гормонального гомеостаза было выявлено, что у больных ТБА по мере увеличения вклада аллеля 130Gln гена IL13 (в ряду генотипов 130ArgArg - 130ArgGln - 130GlnGln) содержание кортизола в плазме крови уменьшалось (Spearman R=-0,363; р=0,014; п=45), что отражает участие IL13 в персистенции хронического воспаления и, соответственно, в развитии тяжелого течения БА. Это, в свою очередь, вызывает развитие вторичной стероидорезистентности и определяет назначение больших доз ГКС, в том числе и системных.

Резюмируя полученные данные, мы можем отнести генетический вариант 3435СС гена ШЖ1 к факторам риска развития БА тяжелого течения. В то же время, генотип 3435ТТ и аллель 3435Т обладают протективным эффектом и снижают риск развития ТБА: [(Ж(3435ТТ против 3435СС+3435СТ) = 0,19 (95%С1 0,08-А,45)] и [СЖ (3435СТ+3435ТТ против 3435СС) = 0,19 (95%С1 0,08-0,47)]. Аналогичная

закономерность сохранялась и при сопоставлении группы больных ТБА с группой (ЛБА+СБА). Носительство аллеля 3435С гена МЖ1 повышало риск развития ТБА по сравнению с группой СБА+ЛБА в 3 раза: [СЖ (3435СС+3435СТ против 3435ТТ) = 3 01 (95%С1 1 19-7 56)]. При этом протективным эффектом обладал генотип 3435ТТ гена ШЖ1, который снижал риск развития ТБА [ОЯ(3435ТТ против 3435СС+

3435СТ) = 0,33 (95%С10,13-0,84)].

Риск развития СБА и ЛБА по сравнению с группой контроля повышался с

носительством генотипа 130С1пАгВ в 2 раза [СЖ (130С1пАгё против 13001пС1п + 130АгеАгй)= 2,06 (95%С1 1,09-3,91)], причем в большей степени с аллелем 130С1п: [СЖ (13001пАгё + 13001п01п против 130Аг8Лг8) = 2,57 (95%С1 1,34-4,92)]. В свою очередь, носительство гомозиготного варианта 130АгёАг§ 1ЫЗ снижало риск развития СБА и ЛБА [ОК(130АгёАг§ против 130С1пАг§ + 1300Ш01п) = 0,39 (95%С1

0'20_°Анмогичная ситуация сложилась с геном ПА Так, генотип -589СТ гена ПА повышал риск развития СБА и ЛБА почти в 2 раза [(ОК (5 89СТ против 589СС+589ТТ) = 1,94 (95%С1 1,01-3,72)]. Следует отметить, что нами была выявлена ассоциация количества обострений БА с полиморфизмом С-589Т гена ПА (Х -13,05; й{=2. р=о,002). У пациентов с частыми обострениями БА чаще встречались генотипы

-589СТ и -589ТТ, по сравнению с вариантом -589СС (р=0,006).

В дополнении к вышеизложенному необходимо добавить, что сочетание аллеля 3435С гена МЖ1 и генотипа 27С1иС1и гена АО!1В2 повышало риск развития ТБА по сравнению с больными (ЛБА+СБА) в 3,5 раза [ОЯ=3,50 (95%С1 1,01-12,17)]. Генотип 27С1пС1и сам по себе не оказывал значимого протекгивного действия, однако усиливал протективный эффект генотипа 3435ТТ гена МОЯ1 [ОЯ (27С1п01и+3435ТТ против 2701пС1п+2701и01и+ 3435СС+3435СТ) = 7,00 (95%С1 1,47-33,34)].

В отношении ТРБА нами было впервые выявлено, что носительство аллеля 3435С гена МЖ1 повышало риск развития ТРБА в 2,9 раза по сравнению с группой контроля [ОЯ (3435СС+3435СТ против 3435ТТ) = 2,89 (95%С1 1,30-6,40)], а генотип 3435СС - в 6 раз [СЖ (3435СС против 3435СТ+3435ТТ) = 6,12 (95%С1 2,42-15,48)], (рис.2).

р=0.015

ТРБА ТЧБА

ГЗБА>4 ПЗБА<4 Контроль таб таб

р=0.Ш

1*0.001

ТРБА

ПЗБА< 4 Контроль таб

Рисунок 2. Распределение аллельных вариантов С3435Т гена MDR1 у больных ТРБА и ТЧБА

Одной из причин развития терапевтической резистентности у больных БА было системное нейтрофильное воспаление, по данным гемограммы (табл.5), которое может вносить вклад в развитие обструкции дыхательных путей (Федосеев Г.Б. и соавт., 2011), являться прогностическим фактором плохого клинического ответа на ГКТ (Newton R. et ai., 2010) и быть ассоциированным с одним из патогенетических механизмов терапевтической резистентности - стероидозависимостью (Chung K.F. et al., 2011). Очень важным, с практической точки зрения, было обнаружение того факта, что у больных ТРБА носительство генотипа 3435СС гена MDR1 повышало риск развития потребности в ТГКС в дозе, превышающей среднетерапевтическую (>4 таблеток) [OR=20,89 (95%С1 5,10-85,53)]. При ТРБА длительное использование высоких доз ТГКС может приводить к ятрогенным осложнениям ГКТ. В частности, нами была найдена ассоциация полиморфных вариантов С3435Т гена MDR1 с ГКС-ассоциированной миопатией (р=0,039). Ни у одного больного ТРБА с миопатией не было выявлено аллеля 3435Т, все они являлись носителями аллеля 3435С гена MDR1.

Одним из признаков терапевтической резистентности у больных БА был плохой контроль заболевания. Высокая потребность в КДБА (более 8 раз в сутки в период обострения) была выявлена у больных ТРБА с генотипами 3435СС и 3435СТ, в отличие от носителей 3435ТТ гена MDR1 (р=0,040). В этой связи представляется важным наличие корреляции между вкладом аллеля 343 5Т с количеством

астматических статусов в анамнезе, а также с содержанием IgE в сыворотке крови в подгруппе ТРБА: по мере увеличения вклада аллеля Т (в ряду генотипов 3435СС -3435СТ - 3435ТТ) число астматических статусов уменьшалось (Spearman R—0,513; р=0,035; п=17), также снижалось содержание IgE в сыворотке крови (Spearman R~ 0,408; р=0,028; п=29).

Таким образом, при анализе исследуемых параметров нами было впервые выявлено, что генотип 3435СС гена MDR1 является прогностическим маркером, ассоциированным не только с тяжелым течением БА (связь с системным нейтрофильным воспалением, а также с уровнем IgE, свидетельствующим в данном случае о фенотипе аллергической БА неконтролируемого течения), но и с терапевтической резистентностью вплоть до развития фатальных осложнений и, что немаловажно, определяет стратегию назначения высоких доз ТГКС с учетом возможных ятрогенных осложнений.

Превалирование аллеля 3435С в группе больных ТРБА, вероятно, обеспечивает ускоренный эффлюкс ГКС и, в связи с этим, снижение их противовоспалительного эффекта, влечет за собой более тяжелое течение заболевания, необходимость назначения больших доз системных ГКС. Кроме того, гипоксемия, нередко встречающаяся у больных ТРБА, может вызывать индукцию экспрессии MDR1 и, следовательно, приводить к увеличению количества Pgp-170 на поверхности клеток (Comerford К.М. et al. 2002). И, наконец, Pgp-170 может инактивировать внутри клетки липофильные соединения путем защелачивания среды, а также на разном уровне ингибировать апоптоз, как это было показано у больных гематологического профиля (Zarickii A.U. et al., 1998; Зубова С.Г. и соавт., 2000).

В свою очередь, генотип 3435ТТ гена MDR1 является маркером, определяющим чувствительность и хороший ответ на малые дозы ГКС, а также предрасположенность к контролируемому течению БА. Носительство аллеля 3435Т и генотипа 3435ТТ гена MDR1 снижало риск развития ТРБА: [OR (3435ТТ против 3435СТ+3435СС) = 0,35 (95%С1 0,16-0,77)] и [OR (3435ТТ+3435СТ против 3435СС) = 0,16 (95%С1 0,06-0,41)].

Нами было впервые выявлено, что носительство генотипа 16GlyArg гена ADRB2 само по себе не оказывало значимого влияния на риск развития ТРБА, однако в сочетании с генотипом 343 5СС гена MDR1 усугубляло неблагоприятный эффект последнего [OR (3435CC+16GlyArg против 3435CT+3435TT+16ArgArg+16GlyGly) = 7,78 (95%CI 2,27-26,67)]. Таким образом, генотип 16GlyArg является одним из факторов риска развития терапевтической резистентности и обладает потенцирующим действием в отношении генотипа 3435СС гена MDR1.

У больных ТРБА была выявлена ассоциация низких значений ОФВ] с генотипами 16GlyGly и 27GluGlu и 27GlnGlu гена ADRB2 (рис. 3).

р<0.001

р=0,004

р~0.020

16GlyGly 1 GGIyArg 16ArgArg

27GlnGln

27GlnGlu

27GluGlu

¡ТРБА

1ТЧБА

Рисунок 3. Ассоциация аллельных вариантов GIyl6Arg и Gln27Glu гена ADRB2 с ОФВ! у больных ТРБА и ТЧБА

Важно отметить, что у больных ТРБА мужчин была выявлена корреляция между аллелем 16Arg гена ADRB2 с ОФВ]: по мере увеличения вклада аллеля 16Arg (в ряду генотипов 16GlyGly - 16GlyArg - 16ArgArg) значение ОФВ, увеличивалось (Spearman R=0,657; р=0,015; п=13). Кроме того, в подгруппе ТРБА величина удельной проводимости бронхов (Sgaw) у гетерозигот в 16 позиции (0,04±0,02) и 27 позиции (0,03±0,01) гена ADRB2 была меньше, чем в подгруппе ТЧБА (0,07±0,02 и 0,08±0,03, соответственно) (р<0,050). Эти данные свидетельствовали о генетической детерминированности бронхообструкции у больных ТРБА.

Генотип 27GluGlu гена ADRB2 чаще встречался у пациентов с ТРБА (26,2%) по сравнению с ТЧБА (9,6%), (р=0,020); носительство генотипа 27GluGlu повышало риск развития ТРБА по сравнению с ТЧБА [OR (27GluGlu против 27GlnGln+27GlnGlu) = 3,35 (95%CI 1,16-9,66)]. Следует отметить, что носительство аллеля 27Glu гена ADRB2 повышало риск развития БА в 7,2 раза [OR(27GluGlu+27GlnGlu против 27GlnGln)=7,20 (95%CI 1,19-^3,48)]. Это еще больше укрепило позицию аллеля 27Glu гена ADRB2 как маркера, ассоциированного не только с тяжелым течением заболевания, но и с терапевтической резистентностью, вероятно, обусловленной нарушением функции (52-АР. В связи с этим, вполне закономерным, было обнаружение корреляции между длительностью терапии внутривенными ГКС с аллелем 27Glu гена ADRB2: по мере увеличения вклада аллеля 27Glu (в ряду генотипов 27GlnGln - 27GlnGlu - 27GluGlu) длительность внутривенной ГКТ увеличивалась (Spearman R=0,452; р=0,006; п=36). Это указывает на увеличение потребности в системных ГКС при утяжелении заболевания

вследствие терапевтической резистентности за счет снижения чувствительности к ГКС и развития вторичной эндогенной стероидной недостаточности.

Носительство аллельных вариантов Asp363Ser гена NR3C1 у наших пациентов не снижало риск развития ТРБА; у больных ТЧБА генотип 363SS преобладал лишь на уровне тенденции. Полученные нами результаты согласуются с данными по выборке больных ИФА, где аллель 363S встречался только среди пациентов со стероидочувствительным вариантом заболевания (Илькович Ю.М, 2006).

Единственный пациент с ТБА, у которого был выявлен генотип 23RK гена NR3C1, соответствовал критериям ТРБА, но без признаков стероидорезистентности. Данный случай можно рассматривать скорее как исключение: возможно, что для фенотипической реализации генетической компоненты необходимо определенное сочетание нескольких генотипов и факторов внешней среды; тем более, что и в контрольной группе мы выявили 4 носителя генотипа 23RK.

Мы не обнаружили мутаций в пятом (Т1808А) и девятом (G2317A, T2373G) экзонах гена NR3C1; соответственно, данные локусы не влияли на развитие терапевтической резистентности и первичной генетически детерминированной стероидорезистентности.

Мы не установили статистически значимой ассоциации аллельных вариантов С-589Т гена IL4 с ТРБА и ТЧБА.

Носительство аллеля 130Gln гена IL13 повышало риск развития ТРБА по сравнению с группой контроля в 2 раза [OR (130GlnGln+130GlnArg против 130ArgArg) = 2,09 (95%CI 1,01-4,30)]. Аллель 130Gln гена IL13, ассоциированный с гиперпродукцией IL13 (Кетлинский С.А. и соавт., 2008) играет важную роль в персистенции воспаления и ассоциирован с гиперреактивностью бронхов и ремоделированием легких (Wills-Karp М. et al., 2003). Вероятно, у больных БА вариабельность цитокинового профиля вносит свой вклад в развитие терапевтической резистентности, определяет стратегию назначения высоких доз ГКС, в том числе в пероральной форме и, как следствие, индуцирует развитие эндогенной стероидной недостаточности. У пациентов с ТРБА уровень кортизола в плазме крови был ассоциирован с полиморфизмом Argl30Gln гена IL13 (р=0,003), причем наименьшее содержание кортизола в плазме крови наблюдалось у носителей генотипов 130ArgGln и 130GlnGln гена IL13 (р=0,004). Мы обнаружили отрицательную корреляционную связь между аллелем 130Gln гена IL13 и содержанием кортизола в плазме крови у больных ТРБА: по мере увеличения вклада аллеля 130Gln (в ряду генотипов 130ArgArg - 130ArgGln -130GlnGln) содержание кортизола уменьшалось (Spearman R=4),441; р=0,006; п=37). Кроме того, у больных ТРБА была выявлена ассоциация генотипов 130ArgGln и 130GlnGln гена IL13 с нейтрофилезом в периферической крови (р=0,039). Возможно, белок, кодируемый аллелем 130Gln гена IL13, активирует синтез нейтрофилами матриксных металлопротеиназ, которые активно участвуют в

регуляции местной воспалительной реакции, перестройке тканей (Кетлинский С.А. и соавт., 2008) и ремоделировании легких и, таким образом, развитию трудно-контролируемого течения БА.

С учетом того, что «генетические ансамбли», то есть сочетания аллельных вариантов, могут потенциировать или, наоборот, обладать протективным действием в плане развития БА, в том числе и ТРБА, очень важно учитывать «наборы» аллельных вариантов генов, которые генетически детерминируют гетерогенность клинических проявлений, определяют степень тяжести заболевания и могут быть использованы в качестве инструмента для прогнозирования терапевтической резистентности и контроля заболевания.

В связи с этим особый интерес представляет впервые выявленный нами факт, что по сравнению с группой контроля носительство генотипа 16GlyArg гена ADRB2 само по себе не оказывало значимого влияния на риск развития ТРБА, однако в сочетании с носительством аллеля 3435С гена MDR1 усугубляло неблагоприятный эффект последнего [OR (3435CC+3435CT+16GlyArg против 3435TT+16ArgArg+ 16GlyGly) = 3,00 (95%CI 1,39-6,49)]. При этом сочетание генотипа 16GlyArg гена ADRB2 и генотипа 3435СС гена MDR1 еще в большей степени усугубляло неблагоприятный эффект «агрессивного» генотипа 3435СС [OR (3435CC+16GlyArg против 3435CT+3435TT+16ArgArg+16GlyGly) = 7,78 (95%CI 2,27-26,67)].

Весомым фактом также было то, что сочетанное носительство генотипов 3435ТТ гена MDR1 и 130ArgArg гена IL13 обладало протективным эффектом в плане развития ТРБА [OR (3435TT+130ArgArg против 3435CC+3435CT+130ArgGly+ 130GlyGly) = 4,52 (95%CI 1,46-14,01)]. Кроме того, аналогичный протективный эффект наблюдался и при сочетании аллеля 27Gln гена ADRB2 с аллелем 3435Т гена MDR1: данная комбинация в 3,37 раза снижала риск развитие ТРБА по сравнению с ТЧБА [OR (27GlnGln+27GlnGlu+3435TT+3435CT против 27GluGlu+3435CC) = 3,37 (95%CI 1,54-7,35)].

Таким образом, полученные данные позволили нам определить маркерные профили, ассоциированные с ТРБА и ТЧБА. Выявление генетических маркеров ТРБА и ТЧБА способствует разработке принципов индивидуального подбора терапии и прогнозированию ответа на действие лекарственных препаратов у больных трудноконтролируемой БА, что является основой персонализированной терапии.

ГКС являются базисными лекарственными средствами для лечения не только БА, но и ИФА, и данная терапия пока не имеет альтернативы, особенно на ранних стадиях заболевания. При ИФА ответ на ГКТ варьирует в широких пределах: от быстрой положительной клинико-рентгенологической и функциональной динамики до стероидорезистентности и фатального прогрессирования заболевания (Gross T.J. et al., 2001).

Среди пациентов с ИФА было 18 стероидорезистентных больных (СР-ИФА)

(47%) и 20 больных со стероидочувствительным вариантом ИФА (СЧ-ИФА) (53%). Все больные получали базисную терапию ТГКС, преимущественно триамсинолонового ряда, по альтернирующей схеме. Суточные дозы ТГКС в пересчете на преднизолон составили в группе пациентов со СЧ-ИФА 11,5 мг или [2,3 (2,0; 3,0)] таблетки, а в группе больных СР-ИФА - 20 мг или [4,0 (3,0; 5,0)] таблетки (р=0,004).

У пациентов с ИФА «агрессивный» генотип 3435СС гена МИЮ встречался чаще, чем в группе контроля (15,8% и 8,7%, р<0,001), а генотип 3435ТТ реже по сравнению с группой контроля (10,5% и 47,6%, р<0,001). В группе ИФА превалировал аллель 3435С, в отличие от группы контроля (0,526 и 0,306, р<0,001). Носительство аллеля 3435С повышало риск развития ИФА [СЖ (3435СС+3435СТ против 3435ТТ = 7,71 (95%С1 2,50-23,83)]. При этом генотип 3435ТТ проявил себя как протекгивный фактор [СЖ. (3435ТТ против 3435СС+3435СТ) = 0,13 (95%С10,04-0,40)].

У больных СР-ИФА генотип 3435ТТ встречался реже, чем в контрольной группе (11,1% и 47,6%, р=0,003). «Агрессивный» аллель 3435С существенно чаще встречался в подгруппе СР-ИФА по сравнению с контрольной выборкой (0,556 и 0,306, р=0,003). Для больных СР-ИФА с генотипом 3435СС суточная доза ТГКС в пересчете на преднизолон составила 35 мг или [7 (6,0; 8,0)] таблеток; с генотипом 3435СТ - 20 мг или [4,0 (3,0; 4,0)] таблетки; с генотипом 3435ТТ - 17,5 мг или [3,5 (3,0; 4,0)] таблетки (р=0,036).

Превалирование аллеля 3435С гена МБШ в подгруппе больных СР-ИФА, ассоциировано с развитием стероидорезистентности, что влечет за собой тяжелое течение заболевания, необходимость назначения больших доз системных ГКС и, в ряде случаев, цитостатиков.

Мы не выявили различий в распределении аллельных вариантов С-589Т гена 1Ь4 и А^13001п гена 1Ь13 у больных ИФА.

Таким образом, нами впервые показано, что аллельные варианты, обусловленные мутацией С3435Т в гене МОШ, могут быть использованы для формирования группы повышенного риска развития ИФА, прогнозирования вариантов клинического течения ИФА на ранних стадиях заболевания, определения персонифицированной тактики лечения и стратегии длительного назначения высоких доз системных ГКС.

Одним из важных молекулярных механизмов развития стероидорезистентности является дисбаланс изоформ ГРа и ГРр, которые образуются в результате альтернативного сплайсинга (ВагпеБ РЛ. й а1., 2009). Для выяснения факторов, определяющих экспрессию изоформ ГР, нами был выполнен анализ уровня экспрессии мРНК ГРа и мРНК ГРр у 37 больных БА: 9 пациентов с ГЗБА, 14 больных ЛБА, 7 больных СБА и 7 практически здоровых лиц (группа контроля). У 5 больных

ЛБА, которым впервые была назначена терапия ингаляционными и внутривенными ГКС в период обострения, а также у 5 пациентов с СБА, которым к базовой терапии ИГКС были назначены внутривенные ГКС, образцы крови брали до начала и через 2 недели лечения, пациентам с ГЗБА - однократно на фоне длительной терапии ИГСК и ТГКС. Все пациенты получали терапию р2-агонистами.

У больных ГЗБА экспрессия ГРа была выше, чем у больных СБА до лечения внутривенными ГКС: [34,2 (15,0; 101,3)] единиц (ед.) и [1,3 (0,3; 14,1)] ед, соответственно (р=0,023). У больных СБА уровень экспрессии ГРа коррелировал с длительностью терапии ИГКС (Spearman R=0,899; р=0,00б; п=7) и с длительностью лечения системными ГКС (Spearman R=0,894; р=0,041; п=5). В то же время, в группе больных СБА после лечения ГКС, вводимыми внутривенно, экспрессия ГРР была ниже, чем в группе контроля: [1,5 (1,3; 3,1)] ед. и [24,6 (6,2; 68,1)] ед., соответственно (р=0,042). У больных СБА выявленная корреляция между уровнем экспрессии ГРР и содержанием нейтрофилов в периферической крови после лечения показала, что ГКС действуют на экспрессию ГРР, подавляя ее, но не действуют на нейтрофильное воспаление (Spearman R=-0,900; р=0,037; п=5). Следует подчеркнуть, что у больных ГЗБА на фоне терапии системными ГКС уровень экспрессии ГРа был выше, чем у пациентов с СБА (до лечения внутривенными ГКС). У пациентов с СБА длительная терапия ИГКС, в сочетании с высокими дозами внутривенных ГКС способствовала повышению уровня ГРа. Наши результаты не согласуются с исследованием, согласно которому стероидозависимость при ГЗБА не ассоциирована с ир-регуляцией ГР(3, и экспрессия изоформ ГР не коррелирует с симптомами БА и дозой ГКС (Jakiela В. et al., 2010).

Нами впервые обнаружено, что в группе больных ЛБА до лечения ГКС носители различных генотипов, обусловленных мутацией С3435Т гена MDR1, продемонстрировали неодинаковый уровень экспрессии ГРр (х2=6,50; df=2; р=0,039). Так, у носителей генотипа 3435СС (п=2) уровень экспрессии ГРР составил [576,9 (40,0; 1113,7)] единиц (ед.), 3435СТ (п=8) - [42,1 (5,0; 407,8)] ед., 3435ТТ (п=4) - [8,2 (2,0; 20,0)] ед. Полученные данные, даже на таком небольшом количестве пациентов, показали, что у больных ЛБА исходно, то есть до лечения ИГКС, носительство генотипа 343 5СС гена MDR1 ассоциировано с повышенным уровнем экспрессии ГРр и, в итоге, со сниженной чувствительностью к терапии ГКС. При этом нами отмечена отрицательная корреляция между уровнем экспрессии CRP и аллелем 3435Т: по мере увеличения вклада аллеля 3435Т (в ряду генотипов 3435СС -3435СТ - 3435ТТ) уровень экспрессии ГРР снижался (Spearman R—0,558; р=0,038; п=14).

Таким образом, выявленные нами закономерности вносят вклад в понимание молекулярных механизмов развития стероидорезистентности у больных БА. Нами впервые показано, что экспрессия мРНК изоформ ГР различается у больных БА в

зависимости от степени тяжести заболевания. Кроме того, соотношение изоформ ГРа и ГРр зависит от длительности и дозы терапии ГКС, и этот параметр можно рассматривать в качестве маркера стероидочувствительности и эффективности глюкокортикоидной терапии.

Обобщая полученные результаты, можно заключить, что терапевтически резистентная БА является гетерогенным заболеванием. Пациенты с ТРБА - это лица преимущественно женского пола, с поздней манифестацией заболевания, с избыточной массой тела, с коморбидной патологией (ГЭРБ, ИБС), с перенесенной инфекцией нижних дыхательных путей (пневмонией) в анамнезе. Патофизиологические изменения (системное нейтрофильное воспаление в сочетании с частично обратимой бронхообструкцией и рестриктивными изменениями) обуславливают развитие терапевтической резистентности и, в итоге, определяют плохой контроль над заболеванием.

Генетические детерминанты вносят значимый вклад в развитие БА; выявленные нами генетические маркеры позволяют, с одной стороны, идентифицировать патогенетические и клинические фенотипы, прогнозировать «группу высокого риска» развития тяжелого течения заболевания и осложнений; с другой стороны - позволяют подобрать терапию индивидуально, для конкретного больного. Полиморфные варианты ряда генов, каждый с относительно малым изолированным эффектом, в определенной комбинации («генетический ансамбль») способны существенно увеличивать свое влияние на фенотип, детерминировать степень тяжести заболевания и определять эффективность проводимой терапии.

Результаты исследований подтверждают наш тезис о необходимости проведения комплексного обследования пациентов. Мы сформулировали алгоритм диагностики, включающий в себя молекулярно-генетическое исследование, для оценки терапевтической резистентности у больных ТРБА (рис. 4).

При совокупной оценке данных клинического и молекулярно-генетического обследования мы выявили, что, наряду с факторами внешней среды, носительство комбинаций полиморфных вариантов генов лекарственных мишеней (изоформ ГР a/ß, образующихся в результате альтернативного сплайсинга и кодируемых геном NR3C1; гена ADRB2; гена детоксикации - MDR1; генов Th2 - IL4 и IL13) детерминирует развитие терапевтической резистентности у больных БА. Выявленные нами генетические маркеры позволяют прогнозировать развитие БА, а также индивидуализировать фармакотерапию у пациентов с БА.

Рисунок 4. Алгоритм диагностики ТРБА

ВЫВОДЫ

1. Протективными маркерами контролируемого течения БА являются аллельные варианты 3435ТТ гена МБШ, 2701пС1и гена АГЖВ2, 130Аг§Аг§ гена 1ЫЗ. К маркерам повышенного риска развития терапевтически резистентной БА относятся аллельные варианты 3435СС гена ЖЖ1, 16С1уА^ и 27С1и01и гена А1ЖВ2, 13(Ю1п гена 1ЫЗ, -589Т гена 1Ь4, которые могут быть использованы для усовершенствования профилактической медицины, то есть для формирования групп повышенного риска развития БА на донозологическом этапе, а также для прогнозирования вариантов клинического течения БА на ранних стадиях заболевания.

2. Развитие терапевтической резистентности у больных БА обусловлено снижением стероидочувствительности и формированием стероидорезистентности вследствие генетической детерминированности за счет вклада аллельных вариантов 3435С гена МОШ, 2701а гена АОЯВ2, -589Т гена 1Ь4, 13001п гена 11ЛЗ и повышенной экспрессии мРНК изоформы ГРР, что определяет стратегию длительного назначения высоких доз ингаляционных и системных ГКС и ассоциировано с ГКС-индуцированными осложнениями, плохим контролем заболевания (повышенной потребностью в КДБА, развитием астматического статуса). При этом у данной категории пациентов отсутствует первичная (семейная) стероидорезистентность, ассоциированная с мутациями 11е559Азп, Уа1729Ме1, 11е747Ме1 в гене N11301.

3. У больных Б А легкого и ереднетяжелого течения повышенная экспрессия изоформы ГРР является маркером сниженной стероидочувствительности, возможно, обусловленной у некоторых больных активным воспалительным процессом. У стероидочувствительных пациентов на фоне ГКТ снижение экспрессии изоформы ГРР и повышение экспрессии изоформы ГРа являются маркерами чувствительности к терапии системными ГКС. У больных БА легкого течения генотип 343 5СС гена МЖ1 ассоциирован с повышенной экспрессией изоформы ГРР, что является предиктором сниженной чувствительности к ГКС и имеет прогностическое значение при гормональной терапии.

4. Аллель 3435С и генотип 3435СС гена МОЮ являются предикторами повышенного риска развития ИФА, в том числе стероидорезистентного варианта заболевания, и маркерами для назначения высоких доз таблетированных ГКС. Генотип 343 5ТТ является протективным фактором и может рассматриваться в качестве маркера благоприятного течения ИФА.

5. Патогенетические фенотипы (эндогенная глюкокортикоидная недостаточность, системное нейтрофильное воспаление, частично обратимая бронхообструкция с рестриктивными изменениями) и сопутствующая патология обладают аддитивным эффектом, потенцирующим развитие терапевтической резистентности у больных БА.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для выявления риска развития терапевтической резистентности, прогнозирования на ранних стадиях БА тяжелого течения заболевания, а также подбора персонализированной терапии целесообразно проведение комплексного молекулярно-генетического исследования (ПЦР с последующим рестрикционным анализом, ПЦР в реальном времени). Сформированный маркерный профиль больных ТРБА позволяет определить индивидуальную чувствительность к глюкокортикостероидам и р2-агонистам и осуществить патогенетически обоснованную терапию с позиций персонализированной медицины.

2. Для определения маркерного профиля ТРБА целесообразно выявление генотипов, обусловленных мутациями 3435СС гена МОШ, участвующего в транспорте ГКС; 1601уАг§ и 2701и01и гена АБЯВ2, являющегося «лекарственной мишенью» для Р2-агонистов; аллелями 13<Ю1п гена 1ЫЗ и -589Т гена 1Ь4, ассоциированных с развитием и персистенцией хронического воспаления.

3. Для определения индивидуальной стероидочувствительности, а также эффективности терапии ГКС у больных БА целесообразно оценивать уровень экспрессии мРНК изоформ ГРа и ГРр, кодируемых геном N11301.

4. Для диагностики ТРБА, помимо критериев терапевтической резистентности (ATS, 2000), целесообразно учитывать генетические маркеры труднокурабельной БА, а также оценивать патогенетический и клинический интегральный фенотип: зрелый возраст больных, женский пол, повышенный индекс массы тела, поздняя манифестация заболевания, коморбидная патология (ХОБЛ, ГЭРБ, ИБС), вредные привычки (курение), патофизиологические изменения (преобладание системного нейтрофилыгого воспаления в сочетании с частично обратимой бронхообструкцией и рестриктивными изменениями) и плохой контроль заболевания.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Трофимов В.И., Шапорова Н.Л., Дудина О.В., Дунаева Л.Л., Лебедев А.Э., Миронова Ж.А. Гормонозависимая бронхиальная астма; особенности патогенеза, клиники и лечения // Ученые записки СПб государственного медицинского университета им. акад. И.П.Павлова. -2001. -T.VIII. - №1. -С.52-55.

2. Трофимов В.И., Миронова Ж.А. Молекулярно-генетические и фармакогенетические аспекты стероидной резистентности при бронхиальной астме // Медицинский Академический журнал. - 2006. -Т.6. - №1. -С.150-162.

3. Миронова. Ж.А., Трофимов В.И., Дубина М. В., Янчина Е.Д., Шапорова Н.Л., Симакова М.А. Фармакогенетические аспекты стероидорезистентности у больных тяжелой астмой // Сборник трудов XVI Национального конгресса по болезням органов дыхания. -2006. - №83. - С.23.

4. Миронова Ж.А., Трофимов В.И., Янчина Е.Д., Дубина М.В. Фармакогенетические аспекты стероидорезистентности у больных бронхиальной астмой // Клинико-лабораторный консилиум. -2006. -№13. -С.60-64.

5. Миронова Ж.А., Трофимов В.И., Янчина Е.Д., Дубина М.В., Симакова М.А. Генетический контроль механизма транспорта глюкокортикоидов и регуляции IL 4 у больных тяжелой астмой //Сборник трудов XVII Национального конгресса по болезням органов дыхания. - 2007. - № 37. - С. 18.

6. Симакова М.А., Миронова Ж.А., Трофимов В.И, Дубина М.В., Янчина Е.Д. Генетические аспекты гормонозависимости у больных бронхиальной астмой // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины СПб.- 2007.-С. 96-97.

7. Трофимов В.И., Миронова Ж.А., Янчина Е.Д., Илькович Ю.М., Дубина М.В., Симакова М.А. Полиморфизм С3435Т гена MDR1 у больных бронхиальной астмой и пациентов с идиопатическим фиброзирующим альвеолитом // Сборник

трудов 5 международного конгресса пульмонологов Центральной Азии. - 2008. -N82.-C.27.

8. Трофимов В.И., Миронова Ж.А., Янчина Е.Д., Дубина М.В. Фармакогенетические аспекты тяжелой астмы // Пульмонология. - 2008. - №2. - С.111-116.

9. Трофимов В.И., Миронова Ж.А., Янчина Е.Д., Симакова М.А., Дубина М.В. Полиморфизм гена глюкокортикоидного рецептора NR3C1 у больных бронхиальной астмой // Центрально - Азиатский медицинский журнал. - 2009. - Т. XV. - Приложение 1. - С.25.

10. Трофимов В.И., Миронова Ж.А., Янчина Е.Д., Дубина М.В. Ассоциация вариантов генов IL4 -589С\Т и IL 13 Argl30Gln с терапевтически- резистентной бронхиальной астмой // Российский аллергологический журнал «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» посвященного 100-летию со дня рождения академика АМН А.Д.Адо. - 2009. - №3. - выпуск 1. -С.307.

П.Миронова Ж.А., Трофимов В.И., Янчина Е.Д., Дубина М.В. Ассоциация вариантов гена бета2-адренорецептора (ADRB2) и бронхиальной астмы // Проблемы клинической медицины. -2009. -№1 (19). - С.58-61.

12.Миронова Ж.А., Трофимов В.И., Янчина Е.Д., Дубина М. В., Симакова М.А. Генетический контроль механизма транспорта глюкокортикоидов и регуляции IL 4 у больных тяжелой астмой // Сборник трудов XIX Национального конгресса по болезням органов дыхания. - 2009. - № 45. - С.42.

13. Симакова М.А., Миронова Ж.А., Трофимов В.И., Янчина Е.Д., Дубина М.В. Терапевтическая резистентность у больных тяжелой БА // Пульмонология. -2010.-№2.-С. 108-112.

14. Миронова Ж.А., Трофимов В.И., Дубина М.В., Янчина Е.Д. Аллельные варианты С3435Т гена множественной лекарственной резистентности (MDR1), R130Q гена шггерлейкина 13 (IL 13), 590С/Т гена IL4- маркеры риска развития бронхиальной астмы (БА) // Клинико - лабораторный консилиум. -2010. - №2-3 (33-34). - С. 162.

15. Симакова М.А., Трофимов В.И., Миронова Ж.А., Янчина Е.Д., Дубина М.В. Ассоциация полиморфизма С3435Т гена MDR1 со степенью тяжести бронхиальной астмы // Ученые записки Петрозаводского Государственного университета. - 2010. - №6 (III). - С.34-37.

16. Миронова Ж.А., Трофимов В.И., Симакова М.А., Янчина Е.Д., Дубина М.В. Ген множественной лекарственной устойчивости (MDR1) - маркер терапевтической резистентности и степени тяжести заболеваний // Российский Аллергологический журнал. -2010. -№3. -С.9-13.

17.Миронова Ж.А., Трофимов В.И., Симакова М.А., Белаш В.А., Янчина Е.Д., Дубина М.В. Фармакогенетика гормонозависимой астмы // Сборник трудов XX

Национального Конгресса по болезням органов дыхания. - 2010. - № 104. -С.76.

18.Миронова Ж.А, Трофимов В.И., Белаш В.А., Янчина Е.Д., Улитина А.С., Дубина М.В. Особенности экспрессии изоформ глюкокортикоидного рецептора (ГР) у пациентов с бронхиальной астмой (БА) // Сборник трудов XXI Национального конгресса по болезням органов дыхания. - 2011. -№ 69. - С.56-57.

19. Миронова Ж.А. Молекулярные механизмы развития стероидорезистентности при бронхиальной астме: роль интерлейкинов 4 и 13 // Казанский медицинский журнал. -2011. - Т.92. -№6. -С.880-882.

20.Миронова Ж.А. Аллельные варианты R130Q гена интерлейкина 13, С590Т гена интерлейкина 4, С3435Т гена множественной лекарственной устойчивости -маркеры развития риска и степени тяжести бронхиальной астмы // Ученые записки Петрозаводского Государственного университета. - 2011. -№ 6 (119). -С.54-57.

21. Трофимов В.И., Миронова Ж.А. Терапевтически-резистентная бронхиальная астма // Врач. - 2012. -№3. -С.2-4.

22. Миронова Ж.А., Трофимов В.И., Янчина Е.Д., Улитина А.С., Дубина М.В. Мутация С3435Т в гене множественной лекарственной устойчивости MDR1 -фармакогенетический маркер тяжелого течения бронхиальной астмы // Российский Аллергологический журнал. -2012. -№2. -С. 9-12

23. Миронова Ж.А., Трофимов В.И., Янчина Е.Д., Дубина М.В., Улитина А.С. Ассоциация аллельных вариантов Gln27Glu гена бета2-адренорецептора ADRB2 с бронхиальной астмой в зависимости от степени тяжести заболевания // Ученые записки Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П.Павлова. -2012. -T.XIX. - №1. -С.128-129.

24. Миронова Ж.А., Трофимов В.И., Илькович Ю.М., Новикова JI.H., Улитина А.С., Янчина Е.Д., Дубина М.В. Мугация С3435Т в гене MDR1 - предиктор и маркер неблагоприятного течения идиопатического фиброзирующего альвеолита // Врач. - 2012. -№3. -С.91-93.

25.Mironova Z.A., Troflmov V.I., Dubina M.V., Shaporova N.L., Iantchina E.D., Simakova M.A., Shmorgun T.A., Balashova D.A. The pharmacogenetic aspects of corticosteroid metabolism in patients with severe asthma // Eur. Respir. J.- 2006. -Vol.28, Suppl.50.-№ P3013,P. 523s

26. Simakova M.A, Mironova Z.A., Trofimov V.I., Iantchina E.D., Dubina M.V., Ilkovich Y.M. The MDR1 polymorphism C3435T in bronchial asthma (BA) and steroid- resistant idiopathic fibrosing alveolitis (IFA) patients // Eur. J. of HUMAN GENETICS. - 2007. -Vol.15, Suppl.l.-№. P0026, P.41s.

27.Mironova Z., Trofimov V., Iantchina E., Ilkovich J., Dubina M., Surkova E., Simakova M. Polymorphism of multidrug resistance gene (MDR1), interleukin 4 (1L4), IL13 genes in asthmatics patients and patients with idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) // Eur.

Respir. J.- 2008. -Vol.32, -Suppl.52. -№ P3558, - P.621s

28. Mironova Z., Trofimov V., Iantchina E., Simakova M., Dubina M. The associations of polymorphism 3435 multidrug resistance gene (MDR1) and regimen of inhaled glucocorticosteroid therapy in bronchial asthma (BA) patients // Eur. Respir. J.- 2008. -Vol.32, -Suppl.52. -№ P.3618, P.633s.

29. Mironova Z.A., Trofimov V.l., Iantchina E.D., Simakova M., Dubina M.V. Association of variants T2373G, T1808A glucocorticosteroids gene (NR3C1) and C3435T multidrug resistance gene (MDR1) with severity of bronchial asthma (BA) // Eur. J. of HUMAN GENETICS -2009. - Vol.17, Suppl. 2, № P.02.010, P.56s.

30. Simakova M., Mironova Z., Trofimov V., Iantchina E„ Dubina M., Belash V. Associations of C3435T polymorphism of MDR1 gene and T1808A polymorphism of NR3C1 gene with bronchial obstruction in severe asthmatics and COPD patients // Eur. Respir. J. - 2010. - Vol.36, -Suppl.54. -№ P4293, P. 779s.

31. Mironova Z., Trofimov V., Simakova M., Belash V., Iantchina E., Dubina M. Pharmacogenetic markers of steroid dependent bronchial asthma control // Eur. Respir. J.- 2010. -Vol.36, -Suppl.54. -№ E5485, P. 1003s.

32. Mironova Z., Trofimov V., Simakova M., Belash V., Iantchina E„ Dubina. M. Allele variants of C3435T multidrug resistance gene (MDR1), R130Q interleukin 13 (IL13) gene, 590C/T IL4- markers of steroid dependent bronchial asthma (BA) risk // Eur. Respir. J.- 2010. -Vol.36, -Suppl.54. -№ P1583, P. 291-292s.

33. Simakova M.A., Mironova Z.A., Trofimov V.l., Belash V.A., Iantchina E.D., Dubina M.V. Pharmacogenetic control of bronchial obstruction in hormone depend asthma // Eur.Respir. J.- 2011. -Vol.38, -Suppl.55. -№ P.439, P. 56s.

34. Mironova Z., Trofimov V., Belash V., Iantchina E„ Ulitina A., Dubina M. Glucocorticosteroid receptor gene isoforms expression in bronchial Asthma patients // Eur. Respir. J.- 2011. -Vol.38. -Suppl.55. -№ P.526, P.74-75s.

Формат бумаги 60*90 1/16. Бумага офсетная. Печать ризографическая. Тираж 100 экз. Отпечатано в ПК «Объединение Вента» с оригинал-макета заказчика. 197198, Санкт-Петербург, Большой пр. П.С., д. 29а, тел.718-4636.

Актуальность темы

Бронхиальная астма (БА) относится к числу наиболее распространенных хронических воспалительных заболеваний бронхолегочной системы. В связи с урбанизацией населения к 2025 году ожидается увеличение количества больных БА до 400 миллионов человек (Gibeon D.S., Campbell D.A., Menzies G., 2010). Рост заболеваемости, увеличение количества тяжелых форм БА, резистентных к лечению и сохраняющиеся на прежнем уровне, несмотря на достижения терапии, показатели смертности приводят к тому, что БА остается серьезной медицинской и социальной проблемой (Чучалин А.Г., Огородова Л.М., Петровский Ф.И., 2005; Федосеев Г.Б., Трофимов В.И., Петрова М.А., 2011).

По результатам анализа эффективности терапии БА в США и в Европе, у 70% пациентов с БА симптомы заболевания не контролируются (AJRCEE, 2000; ENFUMOSA, 2003; TENOR, 2006). Несмотря на успехи фармакотерапии и выявление многих механизмов данной патологии, БА тяжелого течения (ТБА) остается наименее изученной.

В России до 80% пациентов не достигают адекватного уровня лечебного контроля над БА (Чучалин А.Г., Огородова Л.М., Петровский Ф.И., 2005; Лещенко И.В., ЛежнинаМ.Б., 2009); у 10-20% больных диагностируется тяжелое течение заболевания с признаками терапевтической резистентности (Петровский В.Ф., Огородова Л.М., 2008). У больных БА резистентность к глюкокортикостероидам (ГКС) достигает 20%, к р2-агонистам - 15%, к ингибиторам лейкотриеновых рецепторов - 40% (Чучалин А.Г., 2001). Около 10% пациентов с Б А тяжелого течения не отвечают на традиционные режимы лечения, включая высокие дозы ингаляционных ГКС (ИГКС), а 1% пациентов нуждается в постоянной терапии пероральными ГКС (ТГКС) (Barnes Р., 2010).

В последнее время обсуждается понятие терапевтически резистентной бронхиальной астмы (ТРБА), выделяют ее фенотипы: фатальная астма, «хрупкая» («brittle») астма, гормонозависимая БА (ГЗБА) - стероидозависимая и стероидорезистентная БА (СРБА) (Огородова JI.M., Петровский Ф.И., Петровская Ю.А., 2001; Barnes P.J., Marsh D.G., 1998; Wenzel S., 2005; Chung K.F., Bel E.H., Wenzel S.E., 2011). Однако до сих пор нет четкого определения фенотипа ТРБА, и этот термин пока не применяется повсеместно. Сложившаяся ситуация требует создания единых критериев для постановки диагноза ТРБА с учетом гетерогенности заболевания.

Наиболее перспективными в понимании патогенетических механизмов развития ТРБА, а также в поиске новых диагностических тестов, обладающих высокой степенью чувствительности и специфичности, являются генетические исследования. Вклад генетических факторов в этиопатогенез БА составляет от 36 до 94% (Anderson G., 2008). Генетическая детерминированность может быть ответственна за 60-80% вариации ответа на ряд противоастматических препаратов (Пузырев В.П., Огородова JI.M., 2010).

В связи с этим особую актуальность приобретает изучение генов лекарственных мишеней. Мутации, ассоциированные с ответом на ß2-агонисты, обнаружены в гене р2-адренорецептора (ADRB2), а также в гене глюкокортикоидного рецептора (NR3C1), кодирующего ответ на ГКС. У лиц с определенным генотипом на назначение ГКС, вероятно, может развиваться не только стероидозависимость, но и стероидорезистентность, а при назначении Р2-агонистов не исключено отсутствие бронходилатирующего эффекта. Однако результаты исследований очень противоречивы (Hawkins G.A., AmelungPJ., Richard S., 2004; Contopoulos-Ioannidis D.G., Manoli E.N., Ioannidis J.P. et al., 2005; Hall I.P., Sayers I., 2007) и требуют уточнения, a y пациентов с ТРБА подобный анализ вообще не проводился.

Актуальным является изучение механизма генетического контроля транспорта ГКС из клетки и связанных с ним различий в стероидочувствительности. Ген множественной лекарственной устойчивости

MDR1) кодирует транспортный белок Р-гликопротеин-170 (Pgp-170), который участвует в эффлюксе липофильных соединений, в том числе и ГКС (Farrell R.O., Kelleher D., 2003). Исследований по изучению гена MDR1 при БА в доступной нам литературе мы не нашли.

Одним из молекулярных механизмов развития стероидорезистентности является дисбаланс изоформ глюкокортикоидного рецептора (ГР), который может определять чувствительность тканей-мишеней к ГКС. Данные литературы, касающиеся этого механизма при БА, единичны и противоречивы (Gagliardo R., Chañes P., Vignola A.N., 2000; Whorwood C.B., Donovan S.J., Wood P.J. et al., 2001; GolevaE., LiL., Eves P., 2006), а в аспекте фенотипов ТРБА, степени тяжести БА и терапии ГКС, особенно при динамическом наблюдении, вообще отсутствуют, как в зарубежной, так и в отечественной литературе.

Для решения проблемы терапевтической резистентности необходимо также изучение вклада аллельных вариантов генов цитокинов Th2: интерлейкина 4 (IL4) и интерлейкина 13 (IL 13), ассоциированных с иммунным ответом. Исследования в этом направлении пока ограничиваются анализом аллельных вариантов гена IL4 преимущественно при аллергической БА (Фрейдин М.Б., ПузыревВ.П., Огородова JI.M. и соавт., 2002; Келембет H.A., Гембицкая Т.Е., Иващенко Т.Э. и соавт., 2008), а комплексная оценка полиморфных вариантов генов IL4 и IL 13 при ТРБА еще не проводилась.

Таким образом, представляется актуальным изучение генетической природы терапевтической резистентности, в частности, к глюкокортикостероидам и Р2-агонистам, у больных БА. Это позволит выявить генетические маркеры для прогнозирования чувствительности и резистентности к лекарственным средствам и разработать диагностический алгоритм с использованием фармакогенетического подхода у больных БА.

Цель исследования

Оценить значение фармакогенетических факторов в терапии глюкокортикостероидами и бета2-агонистами у больных терапевтически резистентной бронхиальной астмой и разработать критерии прогнозирования терапевтической резистентности с учетом генетических маркеров.

Задачи исследования

1. Определить частоты аллелей, обусловленных мутациями С3435Т гена МЕШ; ау16А^ и 01п27С1и гена АВШ2; 11е559АБП, Уа172911е, 11е747Ме1, Азп3638ег, А^23ЬуБ гена ИЮС1; С-589Т гена 1Ь4 и Аг§13(Ю1п гена 1ЫЗ, у больных БА различной степени тяжести, а также в зависимости от терапевтической резистентности.

2. Определить частоты аллелей, обусловленных вышеперечисленными мутациями, в контрольной группе, а также аллелей, обусловленных мутациями С3435Т гена МЖ1, С-589Т гена 1Ь4 и А^13001п гена 1Ь13, у больных идиопатическим фиброзирующим альвеолитом (ИФА).

3. Определить уровень экспрессии изоформ ГРа и ГРр, кодируемых геном N11301, у пациентов с гормонозависимой Б А, а также у больных Б А среднетяжелого и легкого течения заболевания до и после терапии ГКС.

4. Выявить вклад вышеперечисленных генетических детерминант в формирование патогенетических и клинических фенотипов БА, а также их ассоциацию с ответом на терапию ГКС.

5. Разработать алгоритм диагностики, в том числе молекулярногенетического исследования, для выявления маркерного профиля терапевтической резистентности у больных БА. Научная новизна работы

1. Впервые определен маркерный профиль терапевтически резистентной Б А у больных славянской популяции на основании комплексной оценки распределения аллелей, обусловленных мутациями С3435Т гена МБЮ; 01у16Аг£ и 01п27С1и гена АББШ2; Ие559Азп, Уа172911е, 11е747Ме1, АзпЗбЗБег, А^23Ьу8 гена >ШС1; С-589Т гена 1Ь4 и А^13(Ю1п гена 11ЛЗ.

2. Впервые установлен генетический профиль, включающий аллели, обусловленные мутациями С3435Т гена М1Ж1; С1у16А^ и 01п27С1и гена А1ЖВ2; Ие559А8П, Уа172911е, Ие747Ме1, АэпЗбЗЗег, Аг&ЗЪуБ гена ЫЮС1; С-589Т гена 1Ь4 и Ащ13СЮ1п гена 1Ь13, у больных Б А в зависимости от степени тяжести заболевания, позволяющий диагностировать и дифференцировать фенотипы БА.

3. Впервые выявлены ассоциации аллельных вариантов вышеперечисленных генов с фенотипами терапевтически резистентной БА, а также с проводимой терапией. У больных БА различной степени тяжести показана роль изоформы ГРа, как маркера эффективности терапии глюкокортикостероидами.

4. Впервые выявлены генетические предикторы терапевтической резистентности, включая стероидорезистентность, у пациентов с ИФА.

5. Впервые на основании выявленного генетического маркерного профиля с учетом патогенетических и клинических фенотипов БА определены предикторы формирования терапевтической резистентности, что позволилс разработать единые критерии постановки диагноза терапевтически резистентной БА.

Практическая ценность работы

1. Разработан метод диагностики ТРБА, основанный на молекулярно-генетических исследованиях, включая фармакогенетический подход, позволивший создать маркерные профили тяжелого и легкого течения БА. Это позволяет прогнозировать эффективность ГКС и |32-агонистов, своевременно назначать альтернативные лекарственные препараты, тем самым предотвращать развитие ятрогенных осложнений, и обеспечивать индивидуальный подход, то есть персонифицированную терапию, а также способствовать усовершенствованию принципов индивидуальной противовоспалительной терапии с оптимальным соотношением «эффективность-безопасность».

2. Показана необходимость использования фармакогенетических маркеров с учетом патогенетических и клинических фенотипов, наряду с критериями терапевтически резистентной БА (ATS, 2000), для формирования группы труднокурабельной БА.

3. Разработанное с позиции фармакогенетики комплексное молекулярно-генетическое исследование маркеров ТРБА может быть рекомендовано для широкого практического применения, включая амбулаторный этап. Прогнозирование эффективности терапии у больных БА на основе комплекса фармакогенетических исследований позволяет персонализировать терапию и снизить фармакоэкономические затраты.

4. Выявленные молекулярные механизмы и генетические маркеры, ассоциированные с режимом лекарственной терапии, объемом лечения, ответом на проводимую терапию, открывают возможности использования новых мишеней для воздействия «таргетной» терапии, внедрения новых препаратов, основанных на регулировании экспрессии генов лекарственных мишеней, генов воспаления, генов, ответственных за детоксикацию ксенобиотиков и транспорт лекарственных препаратов.

Положения, выносимые на защиту

1. Терапевтически резистентная БА является мультифакторным заболеванием

МФЗ), генетические черты которого имеют популяционные особенности. В развитии БА тяжелого течения с признаками терапевтической резистентности каждый из генетических факторов предрасполагает к развитию заболевания, а их комбинации, «генетические ансамбли», обладают аддитивным эффектом, приводят к высокому риску развития БА, когда для дебюта болезни достаточно минимального влияния факторов внешней среды.

Развитие терапевтической резистентности у больных БА обусловлено нарушением функции |32-адренорецептора и глюкокортикоидного рецептора вследствие их детерминированности определенными аллелями генов лекарственных мишеней АЕЖВ2 и N113(1! 1, генов цитокинов 1Ь4 и 1ЫЗ, генов детоксикации, а также дисбалансом экспрессии изоформ ГР. Терапевтически резистентные и терапевтически чувствительные больные БА представляют собой две различные группы пациентов, отличающиеся друг от друга генетическими маркерами, характером воспаления, механизмами развития стероидочувствительности, функциональными особенностями ГР, 02-АР и, соответственно, ответом на терапию ГКС и р2-агонистами.

Терапевтически резистентная БА - это гетерогенное заболевание, которое включает гормонозависимый вариант заболевания, нередко в сочетании с нервно-психическим вариантом БА; характеризуется поздним началом манифестации, зрелым возрастом пациентов преимущественно женского пола, с повышенным индексом массы тела, наличием коморбидной патологии, преобладанием системного нейтрофильного воспаления, выраженной и частично обратимой бронхообструкцией, а также плохим контролем над заболеванием и склонностью к развитию осложнений. При БА глюкокортикостероиды модулируют экспрессию изоформ ГР, и это особенно выражено при терапии системными ГКС.

Апробация работы

Результаты исследования внедрены в лечебную практику клиники госпитальной терапии, а также межклинического аллергологического отделения и консультативно-диагностического центра ГБОУВПО СПбГМУ им. И.П. Павлова Минздравсоцразвития РФ.

Материалы диссертации докладывались на научной сессии общего собрания Северо-Западного отделения РАМН «Генетика в профилактике, диагностике и лечении заболеваний человека» (Санкт-Петербург, 2005); на XVI, XVII, XIX, XX Национальных конгрессах по болезням органов дыхания (Санкт-Петербург, 2006, Казань 2007, Москва, 2009, 2010); на 4-м конгрессе Евро-Азиатского респираторного общества, 5 международном конгрессе пульмонологов Центральной Азии (Ташкент, 2008); на 4 Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Каракол, 2009); на научно-практических конференциях «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2007, 2009); на научно-практической конференции «Бронхиальная астма: вчера, сегодня, завтра» (Санкт-Петербург, 2007); на Российском конгрессе с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины - возможное и реальное», посвященном памяти Е.И.Шварца (Санкт-Петербург, 2010); на конференции «От научных исследований к практической пульмонологии» в рамках научной сессии НИИ Пульмонологии (Санкт-Петербург, 2010); на XIV научно-практической конференции «Булатовские чтения: актуальные вопросы пульмонологии и клинической аллергологии - врачам общей практики» (Санкт-Петербург, 2010); на Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы внутренней медицины», посвященной 170-летию кафедры госпитальной терапии BMA им. С.М.Кирова (Санкт-Петербург, 2010); на научно-практической конференции, посвященной 110-летию кафедры госпитальной терапии им.акад. М.В.Черноруцкого СПбГМУ им.акад.

И.П.Павлова (Санкт-Петербург, 2011), на Европейской конференции «Генетика человека» (Nice, 2007), на XVI, XVIII, XX, XXI конгрессах Европейского респираторного общества (Munich, 2006; Berlin, 2008; Barcelona, 2010; Amsterdam, 2011).

По материалам диссертации опубликовано 34 печатные работы, в том числе 14 статей, из них 11 в журналах, рекомендуемых ВАК; в зарубежной литературе 9 публикаций.

ВЫВОДЫ

1. Протективными маркерами контролируемого течения БА являются аллельные варианты 3435ТТ гена MDR1, 27GlnGlu гена ADRB2, 130ArgArg гена IL 13. К маркерам повышенного риска развития терапевтически резистентной БА относятся аллельные варианты 3435СС гена MDR1, 16GlyArg и 27GluGlu гена ADRB2, 130Gln гена IL13, -589Т гена IL4, которые могут быть использованы для усовершенствования профилактической медицины, то есть для формирования групп повышенного риска развития БА на донозологическом этапе, а также для прогнозирования вариантов клинического течения БА на ранних стадиях заболевания.

2. Развитие терапевтической резистентности у больных БА обусловлено снижением стероидочувствительности и формированием стероидорезистентности вследствие генетической детерминированности за счет вклада аллельных вариантов 3435С гена MDR1, 27Glu гена ADRB2, -589Т гена IL4, 130Gln гена IL 13 и повышенной экспрессии мРНК изоформы ITß, что определяет стратегию длительного назначения высоких доз ингаляционных и системных ГКС и ассоциировано с ГКС-индуцированными осложнениями, плохим контролем заболевания (повышенной потребностью в КДБА, развитием астматического статуса). При этом у данной категории пациентов отсутствует первичная (семейная) стероидорезистентность, ассоциированная с мутациями Ile559Asn, Val729Met, Ile747Met гена NR3C1.

3. У больных Б А легкого и среднетяжелого течения повышенная экспрессия изоформы TPß является маркером сниженной стероидочувствительности, возможно, обусловленная у некоторых больных активным воспалительным процессом. У стероидочувствительных пациентов на фоне терапии глюкокортикостероидами снижение экспрессии изоформы TPß и повышение изоформы ГРа являются маркерами чувствительности к терапии системными ГКС. У больных Б А легкого течения генотип 3435СС гена ШЖ1 ассоциирован с повышенной экспрессией изоформы ГРр, что является предиктором сниженной чувствительности к ГКС и имеет прогностическое значение при гормональной терапии.

4. Аллель 3435С и генотип 3435СС гена ШЖ1 являются предикторами повышенного риска развития идиопатического фиброзирующего альвеолита, в том числе стероидорезистентного варианта заболевания и маркерами для назначения высоких доз таблетированных ГКС. Генотип 3435ТТ является протективным фактором и может рассматриваться в качестве маркера благоприятного течения ИФА.

5. Патогенетические фенотипы (эндогенная глюкокортикоидная недостаточность, системное нейтрофильное воспаление, частично обратимая бронхообструкция с рестриктивными изменениями) и сопутствующая патология обладают аддитивным эффектом, потенцирующим развитие терапевтической резистентности у больных БА.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для выявления риска развития терапевтической резистентности, прогнозирования на ранних стадиях БА тяжелого течения заболевания, а также подбора персонализированной терапии, целесообразно проведение комплексного молекулярно-генетического исследования (ПЦР с последующим рестрикционным анализом, ПЦР в реальном времени). Сформированный маркерный профиль больных терапевтически резистентной БА позволяет определить индивидуальную чувствительность к глюкокортикостероидам и бета2-агонистам, и осуществить патогенетически обоснованную терапию с позиций персонализированной медицины.

2. Для определения маркерного профиля ТРБА целесообразно выявление генотипов, обусловленных мутациями 3435СС гена МОЯ!, участвующего в транспорте ГКС; 16GlyArg и Gln27Glu гена ADRB2, являющегося «лекарственной мишенью» для бета2-агонистов; аллелями 130Gln гена IL13 и -589Т гена IL4, ассоциированных с развитием и персистенцией хронического воспаления.

3. Для определения индивидуальной стероидочувствительности, а также эффективности терапии глюкокортикостероидами у больных БА целесообразно оценивать уровень экспрессии мРНК изоформ ГРа и ГР(3, кодируемых геном NR3C1.

4. Для диагностики терапевтически резистентной Б А, помимо критериев терапевтической резистентности (ATS, 2000), целесообразно учитывать генетические маркеры труднокурабельной БА, а также оценивать патогенетический и клинический интегральный фенотип: зрелый возраст больных, женский пол, повышенный индекс массы тела, поздняя манифестация заболевания, коморбидная патология (ХОБЛ, ГЭРБ, ИБС), вредные привычки (курение), патофизиологические изменения (преобладание системного нейтрофильного воспаления в сочетании с частично обратимой бронхообструкцией и рестриктивными изменениями) и плохой контроль заболевания.