Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Молекулярно-генетические аспекты патогенеза венозного тромбоэмболизма

На правах рукописи УДК 616 155 2 616-005 7 616-092 612 114

КАПУСТИН СЕРГЕЙ ИГОРЕВИЧ

МОЛЕКУЛЯРНО-Г ЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПАТОГЕНЕЗА ВЕНОЗНОГО ТРОМБОЭМБОЛИЗМА

14 00 29 - гематология и переливание крови 03 00 04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург - 2007

003058658

Работа выполнена в ФГУ "Российский ордена Трудового Красного Знамени, ордена Дружбы народов научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию"

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор Михаил Николаевич Блинов доктор медицинских наук, профессор Людмила Петровна Папаян

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАМН, заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор Владислав Сергеевич Баранов

доктор биологических наук Наталья Николаевна Зыбина

доктор медицинских наук, профессор Александр Давидович Макацария

Ведущая организация - Санкт-Петербургский Государственный медицинский университет им акад ИП Павлова

Защита состоится " " г- 2007 г п часов

на заседании диссертационного совета Д 208 074 01 при Российском НИИ гематологии и трансфузиологии Росздрава по адресу 191024, г Санкт-Петербург, ул 2-я Советская, д 16

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского НИИ гематологии и трансфузиологии

Автореферат разослан аА/^ЬМ- 2007 г

Ученый секретарь специализированного совета

доктор медицинских наук Т В Глазанова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Несмотря на значительные успехи современной медицины, тромбоэмболические заболевания (ТЭЗ) по-прежнему представляют глобальную медико-социальную проблему, являясь основной причиной смертности и инвалидизации в индустриально развитых странах (Балуда В П и соавт, 1999, Бокарев ИН, 2000) Частота возникновения венозного тромбоэмболизма (ВТ) в общей популяции составляет 1-2 случая на тысячу населения ежегодно, при этом более 90% тромбозов локализуется в системе нижней полой вены (Silverstem MD. et al, 1998, Heit JA et al, 2001) Тромбозы глубоких вен нижних конечностей (ТГВНК) являются основной причиной развития различных форм тромбоэмболии легочной артерии (ТЭЛА) - от асимпгоматических до фатальных (Савельев В С , Матюшенко А А, 1999) Особую проблему представляют рецидивирующие формы ВТ. В то же время, более половины тромботических эпизодов в венозном русле протекают бессимптомно и обнаруживаются впоследствии при развитии таких осложнений, как ТЭЛА, хроническая венозная недостаточность и, к сожалению, достаточно часто на аутопсии (Planes А et al, 1988, Gathof В S et al, 2004) Фатальная ТЭЛА нередко является первым и единственным проявлением ВТ и занимает третье место в общей структуре причин внезапной смерти (Кириенко А И и соавт, 2003, Heit JA et al, 2001)

Ключевое место в современной концепции патогенеза ВТ занимает понятие "фактор риска" (ФР), обозначающее любое состояние, между наличием которого и повышенной встречаемостью заболевания существует либо предполагается причинно-следственная связь (Rosendaal FR, 1999) Установлен целый ряд ставших уже классическими факторов риска ВТ (Rosendaal F R, 1999; Samaraa М М. et al, 2003) Наряду с ними, важное место в его патогенезе отводится феномену тромбофилии, или повышенной склонности индивида к тромбозу (Баркаган 3 С, 1996) Исследования последних лет существенно расширили наши представления о молекулярных механизмах формирования тромбофилических состояний (Патрушев ЛИ, 1999, Макацария АД., Бицадзе ВО, 2001, De Stefano V et al, 2002) Во многом это объясняется успехами в изучении такой фундаментальной составляющей эндогенного риска, как генетическая предрасположенность

Интерес к изучению наследственной тромбофилии (НТ) возрос в связи с открытием около 10 лет назад мутаций в генах факторов П и V свертывания крови, которые считаются наиболее частыми причинами генетической предрасположенности к ВТ (Bertma RM et al, 1994, Poort SR et al, 1996) Однако, несмотря па общепризнанное мнение о протромботической роли указанных аномалий, по-прежнему существует множество вопросов относительно их участия в патогенезе различных клинических проявлений ВТ и целесообразности диагностики этих мутаций в практических целях Сложившаяся ситуация во многом объясняется многофакторной природой

ВТ и сложным характером взаимодействия генетических и экзогенных ФР, лежащих в основе или провоцирующих развитие патологических сдвигов в системе гемостаза (Samama ММ et al, 2003) Эпидемиологические исследования указывают также на возможность неодинакового вклада тех или иных факторов (в том числе, генетических) в патогенез ВТ у представителей различных популяционных групп (Rosendaal F R, 1999)

Необходимость использования принципиально новых подходов при изучении основ генетической предрасположенности к тромбозу диктуется существующей на сегодняшний день концепцией о полигенном характере НТ, которая постулирует наличие в подавляющем большинстве случаев ТЭЗ не одного, а нескольких генетических вариантов, независимо или синергично модифицирующих риск развития заболевания (Zoller В et al, 1999) В этой связи, особый интерес уделяется явлению аллельного полиморфизма, которое присуще большинству генов человека (Баранов В С и соавт, 2000), в том числе, тем, продукты которых вовлечены в регуляцию физиологического тока крови К настоящему времени выявлено несколько десятков генетических вариантов, носительство которых ассоциировано с развитием протромботических сдвигов в системе гемостаза и/или риском ВТ (Lane D.A, Grant Р J, 2000, Sykes Т С F et al, 2000, Franco R F, Reitsma P H, 2001) Большинство из них кодирует компоненты плазменного и тромбоцитарного звеньев гемостаза, либо предрасполагает к развитию состояний, вовлеченных в патогенез эндотелиальной дисфункции (артериальная гипертензия, дислипидемия, гипергомоцистеннемия и др )

Несмотря на интенсивный поиск новых генетических детерминант НТ, данные о роли большей части полиморфизмов ДНК в формировании индивидуальной предрасположенности к тем или иным тромботическим проявлениям остаются весьма противоречивыми Практически отсутствуют работы, посвященные изучению распространенности уже известных и потенциальных факторов риска ВТ в зависимости от пола пациентов, возраста, в котором произошла клиническая манифестация заболевания, наличия классических ФР и тд К сожалению, весьма редкими остаются публикации, в которых проводится анализ "ген-генных взаимодействий" полиморфных генетических вариантов, способных влиять на риск развития ВТ Наконец, существует целый ряд нерешенных вопросов относительно целесообразности диагностики определенных полиморфизмов ДНК в клинической практике, что в значительной мере объясняется недостаточным количеством исследований, направленных на установление коррелятивных связей между особенностями клинического течения тромботического процесса и наличием определенных маркеров в генотипе пациента

Это обусловило интерес к изучению роли некоторых генетических вариантов, способных оказывать влияние на функциональную активность системы гемостаза, в патогенезе ВТ у жителей Северо-Западного региона России и позволило сформулировать цель и задачи исследования

Цель исследования

Установить роль аллельного полиморфизма некоторых генов, вовлеченных в регуляцию функциональной активности гемостаза, в патогенезе наиболее распространенных клинических форм венозного тромбоэмболизма для совершенствования критериев при формировании групп повышенного риска и прогнозировании течения данной патологии

Задачи исследования

1 Изучить характер распределения генетических полиморфизмов, ассоциированных с дисфункцией плазменного и тромбоцитарного звеньев гемостаза, а также сосудистой стенки, у больных с ВТ

2 Провести анализ "ген-генных взаимодействий" в группе больных с ВТ и выявить генотипические сочетания, ассоциированные с риском развития данной патологии

3 Исследовать распределение генетических полиморфизмов и характер "ген-генных взаимодействий" в зависимости от пола пациентов и возраста, в котором произошел дебют ВТ

4 Выявить аллельные варианты и их сочетания, характерные для пациентов с рецидивирующим течением ТГВНК

5 Выявить аллельные варианты и их сочетания, характерные для пациентов с ТГВНК, осложненным ТЭЛА

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1 Аллельный полиморфизм генов, вовлеченных в регуляцию функциональной активности гемостаза, составляет основу генетической предрасположенности к ВТ и является одним из важнейших факторов, определяющих характер его клинических проявлений

2. Наиболее значимыми генетическими факторами риска ВТ у жителей Северо-Западного региона России являются мутации "169Ш/А" в гене фактора V и "2021ОС/А" в гене фактора П, что согласуется с данными для других популяционных групп европеоидной расы Неодинаковый характер "ген-генных взаимодействий" с аллельными вариантами, вовлеченными в регуляцию функциональной активности гемостаза, свидетельствует о различии патогенетических механизмов возникновения ВТ и особенностей его клинического проявления у носителей мутаций в генах факторов П и V

3 Основу полигенной предрасположенности к ВТ составляют комбинации аллельных вариантов генов, ассоциированных с дисфункцией сосудистой стенки и развитием протромботических сдвигов в системе гемостаза Увеличение спектра анализируемых ДНК-полиморфизмов и анализ их "ген-генных взаимодействий" позволяет установить причину тромбофилического статуса более чем у половины больных с ВТ

4 Комплексный молекулярно-генетический анализ полиморфизмов, ассоциированных с дисфункцией гемостаза, может быть использован для прогнозирования рецидивирующего течения ТГВНК и оценки риска возникновения ТЭЛА Генетически обусловленная склонность к повышенной

активации тромбоцитарного звена гемостаза является фактором риска развития ТЭЛА у пациентов с ТГВНК"

Научная новизна

Впервые на большом клиническом материале проведен комплексный молекулярно-генетический анализ ДНК-полиморфизмов, ассоциированных с дисфункцией плазменного и тромбоцитарного звеньев гемостаза, а также сосудистой стенки, у жителей Северо-Западного региона России, перенесших эпизод(ы) наиболее распространенных проявлений венозного тромбоза -ТГВНК или/и ТЭЛА Получены доказательства полигенной природы предрасположенности к ВТ, позволяющие обосновать необходимость расширения спектра анализируемых ДНК-полиморфизмов при установлении причин наследственных тромбофилических состояний.

Показана существенная роль полиморфизмов, ассоциированных с дисфункцией тромбоцитарного звена гемостаза, а также сосудистой стенки, в возникновении ВТ и некоторых особенностях его течения, в том числе, и у носителей мутаций в генах факторов II и V

Впервые установлена роль полиморфизма гена аполипопротеина Е (АроЕ) в патогенезе ВТ. Показано, что частота встречаемости (ЧВ) генотипа "АроЕ Е2/ЕЗ" у больных с ВТ существенно ниже, чем в группе здоровых лиц, что позволяет рассматривать данный генетический вариант в качестве протекгивного фактора Среди пациентов с мутацией в гене фактора П или/и V увеличена доля лиц, не содержащих в генотипе аллеля "АроЕ ЕЗ", а сочетание аллеля "АроЕ Е4" с мутацией в гене протромбина является существенным фактором риска развития ТЭЛА как осложнения ТГВНК

Анализ распределения генетических полиморфизмов у больных с ВТ в зависимости от пола пациентов и возраста, в котором произошел дебют заболевания, выявил значительное увеличение доли носителей аллеля "677Т" гена метилентетрагидрофолат редукгазы (MTHFR) в группе женщин, впервые перенесших ВТ в возрасте 45 лет и старше Показано, что генотип "1565СС" гликопротеина (Gp) Ша является самостоятельным фактором риска ВТ у женщин, особенно, в молодом возрасте. Выявлено преобладание носителей мутации FV Leiden в группе пациентов с дебютом ВТ в возрасте 45 лет и старше, для лиц, перенесших эпизод(ы) ВТ в молодом возрасте, характерно увеличение доли носителей аллеля "1166С" гена рецептора ангиотегоина II первого типа (ATGR1), особенно, в гомозиготной форме

Впервые проанализирован характер "ген-генных взаимодействий" между изученными полиморфизмами, как в общей группе больных с ВТ, так и в зависимости от пола и возраста пациентов; выявлены генотипические сочетания, представляющие собой неизвестные ранее факторы риска данной патологии

На основании анализа распределения изученных полиморфизмов ДНК, а также характера "ген-генных взаимодействий" между ними, у больных с различными проявлениями ВТ получены данные, свидетельствующие о целесообразности использования результатов генетического тестирования

компонентов, вовлеченных в регуляцию гемостаза, в клинической практике для прогнозирования характера течения ТГВНК

Практическая значимость

Использование молскулярно-генетического анализа изученных в работе ДНК-полиморфизмов в комплексе с существующими алгоритмами функциональной диагностики тромбофилических состояний позволит значительно повысить эффективность выявления факторов риска заболеваний, обусловленных патологией гемостаза

Данные о распределении генотипов 1б-ти компонентов, вовлеченных в регуляцию гемостаза, в популяции Северо-Западного региона России могут быть использованы в качестве референтных при изучении молекулярных основ генетической предрасположенности к ТЭЗ

Полученные в результате исследования данные о встречаемости аллельных вариантов и их сочетаний у пациентов с различными проявлениями ВТ могут быть использованы при формировании трупп повышенного риска с целью принятия своевременных профилактических мер, направленных на снижение частоты ТЭЗ в популяции

Комплексная оценка аллельного полиморфизма генов, вовлеченных в регуляцию гемостаза, у пациентов с ТГВНК позволит прогнозировать рецидивирующее течение заболевания и риск возникновения ТЭЛА, что будет способствовать снижению уровня смертности и инвалидизации этих больных

Апробация материалов диссертации

Основные положения диссертационной работы были представлены на Съездах Международного Общества по тромбозу и гемостазу 15-ом (1998, Анталня, Турция), 18-ом (2001, Париж, Франция), 19-ом (2003, Бирмингем, Великобритания), на Съездах Европейской Ассоциации гематологов 4-ом (1999, Барселона, Испания), 5-ом (2000, Бирмингем, Великобритания), на 17-ом Международном Конгрессе по тромбозу (2002, Болонья, Италия), на 3-ей Международной конференции по шпергомоцистеинемии (2003, Саарбрюкен, Германия), на 5-ой Всероссийской конференции "Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром Проблемы лечения" (2000, Москва), на научно-практических конференциях "Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии" (2000, 2004 гг, Санкт-Петербург), на 6-ой Всероссийской конференции "Атеротромбоз и артериальная пшертензия" (2001, Москва), на научной конференции "Молекулярные механизмы типовых патологических процессов" (2003, Санкт-Петербург), на П Съезде реаниматологов и анестезиологов Северо-Запада России (2003, Архангельск)

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты диссертационной работы используются при оказании стационарной и амбулаторной помощи в Российском НИИ гематологии и трансфузиологии (РосНИИГТ), на неврологическом отделении ЦМСЧ-122 г Санкт-Петербурга, на отделении анестезиологии, реанимации и интенсивной терапии МУЗ "Первая городская клиническая больница" г Архангельска, а также в научной и педагогической работе в РосНИИГТ, на кафедре нейрохирургии и неврологии медицинского факультета Санкт-Петербургского государственного университета и на кафедре анестезиологии и реаниматологии лечебного факультета Северного государственного медицинского университета (г Архангельск)

По результатам исследований написаны и утверждены

1 Пособие для врачей "Методы диагностики АПС-резистентности, обусловленной мутацией гена фактора V", 2001 г

2 Пособие для врачей "Методы диагностики тромбофилий, обусловленных мутацией генов протромбина и метилентетрагидрофолат редукгазы", 2001г

3 Пособие для врачей "Особенности профилактики и лечения тромбозов при наследственных тромбофилиях", 2003 г

4 Методические рекомендации "Алгоритм исследования системы гемостаза у больных с наследственными тромбофилиями", 2003 г

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 37 научных работ Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 294 страницах машинописного текста и состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы Работа иллюстрирована 33 таблицами и 40 рисунками Библиография включает 314 источников, из них 41 -отечественных и 273 - зарубежных

Личный вклад автора

Автором лично выполнены исследования, направленные на изучение аллельного полиморфизма генов у пациентов с ВТ и в контрольной группе, включая выделение ДНК, постановку полимеразной цепной реакции (ГИДР), обработку амплификатов ферментами рестрикции, разделение продуктов в агарозном и полиакриламидном геле, учет результатов генетического анализа Проведена регистрация, статистическая обработка, анализ полученных данных и обобщение результатов исследований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика обследованных больных. Объектом исследования послужила группа из 593 больных с венозным тромбозом (291 мужчина и 302 женщины) в возрасте от 5 до 79 лет (средний возраст 42,9 ± 14,2 года), находившихся в 1997 - 2006 гг на стационарном или амбулаторном лечении в клиническом отделении "Хирургия" Российского НИИ гематологии и трансфузиологии, в отделении анестезиологии, реанимации и интенсивной терапии МУЗ "Первая городская клиническая больница" г Архангельска, а также направленных для диагностических исследований нарушений гемостаза в лабораторию свертывания крови РосНИИГТ специалистами ведущих НИИ и ЛПУ г Санкт-Петербурга Критериями отбора больных в исследуемую группу являлись наличие в анамнезе объективно доказанного эпизода ВТ и отсутствие в анамнезе эпизодов артериального тромбоза, иных проявлении артериальной патологии (ишемическая болезнь сердца, цереброваскулярные заболевания, облитерирующий атеросклероз сосудов нижних конечностей), онкологических и гематологических заболеваний Для подтверждения диагноза тромбоза глубоких вен нижних конечностей использовалось ультразвуковое допплерографическое аягиосканирование, у пациентов с тромбоэмболией легочной артерии проводились обзорная рентгенография органов грудной клетки, электрокардиографическое исследование, по показаниям — перфузионная сцинтиграфия или/и ангиография легких ТГВНК был диагностирован у 420 больных, при этом в 303 случаях клинико-инструментальное обследование не выявило признаков ТЭЛА (подгруппа "изолированный ТГВНК"), тогда как у 117 пациентов ТГВНК осложнился развитием ТЭЛА (подгруппа "ТГВНК+ТЭЛА") У 86 индивидов с ТЭЛА установлено наличие в анамнезе тромбофлебита поверхностных вен, у 87 больных, перенесших ТЭЛА, клинико-инструментальное обследование не выявило признаков венозной патологии нижних конечностей

Комплексная оценка показателей гемостаза у пациентов с ВТ была выполнена в лаборатории свертывания крови РосНИИГТ Исследование плазменного звена гемостаза проводилось на полуавтоматических коагулометрах COAG-A-MATE ХМ ("Organon Teknika", Голландия) и ACL-200 ("Instrumentation Laboratory", США) и включало определение активированного парциального тромбопластииового времени, протромбинового и тромбинового времени, концентрации фибриногена, ристоцетин-кофакторной активности и уровня фактора Вшшебранда, активности фактора VIII и естественных антикоагулянтов (антитромбина, протеинов С и S) Оценка внутрисосудистой активации тромбоцитов проводилась морфофункциональным методом (Шитикова А.С, 1991)

Контрольную группу составили 228 индивидов, соответствующих по полу и возрасту исследуемому контингенту больных, не имевших в анамнезе тромботических эпизодов и проживающих в Северо-Западном регионе России Среди них - 198 кадровых доноров крови и 30 сотрудников РосНИИГТ

В качестве материала исследования использована периферическая кровь больных с ВТ и лиц контрольной группы, полученная путем пункции локтевой вены и стабилизированная 2,5% раствором ЭДТА в соотношении 10 1 Образцы геномной ДНК выделяли из лейкоцитарной фракции согласно Miller S A. et al (1988)

В работе исследован аллельпый полиморфизм 16-ти различных генов, которые условно можно разбить на 3 группы

1) гены, кодирующие компоненты плазменного звена гемостаза (факторы I, П, V, XII свертывания крови, тканевой активатор плазминогена -TP А, ингибитор активатора плазминогена типа I — PAI-1),

2) гены, кодирующие компоненты тромбоцитарных рецепторов, опосредующих процессы адгезии и агрегации кровяных пластинок (гликопротеины Ia, Iba, ПГа, тромбоцитарный рецептор АДФ - P2Y12),

3) гены компонентов, ассоциированных с эндотелиальной дисфункцией (метилентетрагидрофолат редуктазы - MTHFR, аполипопротеина Е - АроЕ, эндотелиальной синтазы оксида азота - cNOS, ангиотензиногена - AGT, ангиотензин превращающего фермента - АСЕ, рецептора ангиотензина II первого типа - ATGR1)

Характеристика и использованные методы идентификации изученных ДНК-полиморфизмов, с указанием оригинального источника, представлены в таблице 1

Амплификацию участков геномной ДНК, содержащих указанные полиморфизмы, осуществляли на основе технологии полимеразной цепной реакции (ПЦР) Для инсерционно-делеционных (I/D) полиморфизмов в генах TP А и АСЕ после проведения 35 циклов ПЦР в соответствующих режимах алшсвоту (10-12 мкл) образовавшегося продукта анализировали путем электрофореза в 2% агарозном геле Идентификацию аллельных вариантов, обусловленных точечными нуклеотидными заменами, осуществляли путем анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ПЦР-продукта (метод ПЦР-ПДРФ) После проведения 35 циклов ПЦР, образовавшийся амплификат инкубировали с 10 ед специфической эндонуклеазы рестрикции в условиях, рекомендуемых поставщиком (ООО "Сибэнзим", Россия, или MBI "Fermentas", Литва) Продукты рестрикции анализировали с помощью электрофореза в 6% (для полиморфизма в гене АроЕ - в 10%) полиакриламидном геле Фрагменты ДНК визуализировали в проходящем ультрафиолетовом свете после окрашивания геля бромистым этидием в концентрации 1 мкг/мл (Маниатис Т и соавт, 1984)

ТАБЛИЦА 1

Исследованные ДНК-полиморфизмы и методы их идентификации

Ген (сокращение) Локализация Полиморфизм Метод Источник

Фактор I, р-субъединлца (Р1) 4q28 -455 G/A ПЦР-ПДРФ Thomas A et al, 1991

Фактор II (ЕЛ) IIpll-ql2 20210 G/A ПЦР-ПДРФ Poort S R et al, 1996

Фактор V (ТУ) lq23 1691 G/A ПЦР-ПДРФ Gandnlle S et al, 1995

Фактор ХП (КХП) 5q33-qter 46C/T ПЦР-ПДРФ Kohler H P et al, 1999

Ингибитор активатора плазминогена типа I (РА1-1) 7q21 3-q22 -675 4G/5G ПЦР-ПДРФ Margaghone M et al, 1997

Тканевой активатор плазминогена (ТРА) 8pl2 311 bpI/D ПЦР HooperWC et al, 2001

Гликопротеин 1а (Ор1а) 5q23-q31 807 C/T ПЦР-ПДРФ Corral J et al, 1999

Гликопротеин 1Ь, а-субъединица (Ор1Ьа) 17pter-pl2 434 ОТ ПЦР-ПДРФ BrayPF et al, 1994

Гликопротеин ГПа (СгрШа) 17q21 32 1565 T/C ПЦР-ПДРФ BrayPF et al, 1994

Рецептор АДФ (Р2Е.У12) 3q24-q25 H1/H2 ПЦР-ПДРФ Fontand P et al, 2003

Мегалентетрагидро-фолат редуктаза (МТШТ1) lp36 3 677 ОТ ПЦР-ПДРФ Arruda V R. et al, 1997

Эндотелиальная синтаза оксида азота (еМК) 7q35-q36 -786 T/C ПЦР-ПДРФ Colombo M G et al, 2003

Аполипопротеин Е (АроЕ) 19ql32 E2/E3/E4 ПЦР-ПДРФ Hixson J E et al, 1990

Ангиотензиногев (АСТ) Iq42-q43 704 T/C ПЦР-ПДРФ Jeunemaitre X et al, 1992

Ангиотензин-превращающий фермент (АСЕ) 17q233 287 bp I/D ПЦР RigatB et al, 1992

Рецептор ангиотензина П 1-го типа (АТОК1) 3q22 1166 A/C ПЦР-ПДРФ Bonnardeaux A. et al, 1994

Статистическая обработка результатов проводилась на персональном компьютере Частоты встречаемости аллелей и генотипов определяли прямым подсчетом Оценка отклонения распределений генотипов изученных полиморфизмов ДНК от канонического распределения Харди-Вайнберга проводилась с помощью компьютерной программы для анализа генетических данных "GenePop" ("Genetics of Population"), доступной в Интернете (http //wbiomed curtin edu au/genepop) При проведении анализа "ген-генных взаимодействий" оценка статистической значимости "неравновесия по сцеплению" между изученными ДНК-полиморфизмами осуществлялась с помощью программ "GenePop" и "GDA" ("Genetic Data Analysis", доступна в Интернете http //hydrodictyon eeb исопп edu/people/plewis/softnare php)

Анализ ассоциативных связей внутри генотипических сочетаний, а также оценку степени различий в частоте встречаемости аллелей, генотипов и межгенных комбинаций между исследуемыми группами проводили с помощью точного критерия Фишера Для расчета коэффициента "отношения шансов" (OR - odds ratio) с 95% доверительным интервалом (CI - confidence interval) и /»-значения использовался статистический пакет GraphPad Prism, версия 2 (GraphPad Software Inc, San Diego, USA)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Распределение полиморфизмов ДНК у пациентов с венозным тромбозом

В таблице 2 представлены результаты анализа распределения аллелей и генотипов изученных полиморфизмов ДНК у пациентов с ВТ, а также в контрольной группе (КГ) Наиболее значимые различия между группой больных и контролем были выявлены при анализе полиморфизмов в генах факторов II и V Гетерозиготное носительство варианта "2021 OA" гена протромбина наблюдалось в 4 раза чаще среди больных, по сравнению с группой контроля (8 8% против 2 2%, соответственно, OR=4 3, 95% СГ 1 710 9, р<0 001), тогда как гомозигот по данному аллелю среди обследованных индивидов не было обнаружено Носителями варианта "1691А" гена фактора V (мутации FV Leiden) в гетеро- либо -гомозиготном состоянии являлись 93/593 (15 7%) пациентов и 10/228 (4 4%) лиц КГ, что также соответствовало более чем 4-кратному увеличению риска развития ВТ (OR=4 1, 95% CI 2 17 9, р<0 0001) У 5/593 (0 8%) больных мутация FV Leiden была обнаружена б гомозиготной форме, в контроле таких индивидов не наблюдалось Расчетная ЧВ генотипа "FV 1691АА" в здоровой популяции составила около 4 8/10000 жителей, что соответствовало 17-кратному увеличению риска ВТ у его носителей (OR=17 0, 95% CI 2 0-145 9, р=0 002) Одновременное наличие мутаций в генах факторов П и V в гетерозиготном состоянии было выявлено у 10/593 (1 7%) пациентов и не обнаруживалось среди лиц КГ В здоровой популяции ожидаемая доля таких "двойных гетерозигот" составила 9 68 на 10000 жителей, что соответствовало более чем 17-кратному увеличению риска ВТ (OR-17 1, 95% CI 2 2-134 3, р=0 0004)

ТАБЛИЦА 2

Распределение полиморфизмов ДНК у пациентов с ВТ и в контрольной группе (КГ)

Полиморфизм Аллель ЧВ аллеля ВТ КГ Р< Генотип * ЧВ генотипа, % ВТ КГ

Фактор I -455 С/А -455 G -455 А 0 762 0 238 0 739 0 261 -455 (G/G) -455 (G/A) -455 (А/А) 56 5 39 5 4.0 55 7 36 4 7.9 003

Фактор И 20210 С/А 20210 G 20210 А 0 956 0 044 0 989 ООН 0.001 20210 (G/G) 20210 (G/A) 20210 (А/А) 912 S 8 00 97 8 22 00 0.001

Фактор V 1691С1к 169) G 1691 А 0 917 0.083 0 978 0.022 0.001 1691 (G/G) 1691 (G/A) 1691 (А/А) 84 3 14.9 08 95 6 4.4 00 0 001

Фактор XII 46 С/Т 46 С 46 Т 0 686 0314 0 696 0 304 46 (С/С) 46 (СЯ) 46 (Т/Т) 47 5 42 3 102 45 8 47 7 65 02

РАМ -675 4С/5С -675 4G -675 5G 0 589 0411 0 590 0 410 ^675 4G/4G -675 4G/5G -675 5G/5G 36 1 45 5 184 35 5 46 9 17 6

ТРА 311 п.н. Ш) INS DEL 0 547 0 453 0 529 0 471 1Л 1/0 D/D 32 4 44 5 23 1 29 2 47 4 23 4

Ср1а 807 С/Т 807 С 807 Т 0 586 0 414 0614 0 386 807 (С/С) 807 (С/Т) 807 (Т/Т) 34 8 47 7 17 5 39 9 43 0 17 1 02

Ср1Ьа 434 С/Т 434 С 434 Т 0 900 0 100 0 916 0 084 434 (С/С) 434 (С/Т) 434 (Т/Т) 812 17 6 12 83 6 160 04

ТАБЛИЦА 2 (продолжение)

GpIIIa 1565 Т 0 833 0 831 1565 (Т/Т) 68 8 67 1

1565 Т/С 1565 С 0 167 0 169 1565 (Т/С) 29 0 32 0

1565 (С/С) 22 09

P2Y12 Н1 0 861 0 846 Н1/Н1 73 8 72 6

Н1/Н2 Н2 0 139 0 154 Н1/Н2 24 7 24 0

Н2/Н2 1 5 34 02

MTHFR 677 С 0 686 0 702 677 (С/С) 46 5 50 4

677 С/Т 677 Т 0 314 0 298 677 (С/Т) 442 39 5

677 (Т/Т) 93 10 1

eNOS -786 Т 0 651 0 621 -786 (Т/Г) 43 7 38 6

-786 Т/С -786 С 0 349 0 379 -786 (Г/С) 42 9 47 0

-786 (С/С) 13 4 14 4

AGT 704 Т 0 520 0 507 704 (ТЛГ) 26 9 27 6

704 Т/С 704 С 0 480 0 493 704 (Т/С) 50 1 46 1

704 (С/С) 23 0 26 3

АСЕ INS 0 481 0 493 1Л 22 3 25 0

287 п н I/D DEI, 0519 0 507 I/D 51 7 48 7

D/D 26 0 26 3

ATGR1 1166 А 0 744 0 746 1166 (А/А) 55 8 56 1

1166 А/С 1166 С 0 256 0 254 1166 (А/С) 37 1 36 9

1166 (С/С) 7 1 70

Е2/Е2 10 04

АроЕ Е2 0 079 0 099 02 Е2/ЕЗ 12.5 18 0 005

Е2/ЕЗ/Ё4 ЕЗ 0 796 0 787 ЕЗ/ЕЗ 63 5 61 0

Е4 0 125 0 114 Е2/Е4 12 09

ЕЗ/Е4 19 8 17 5

Е4/Е4 20 22

Примечание * Жирным шрифтом выделены генотипы, являющиеся потенциальными факторами риска тромбоза.

Суммарная доля носителей аллелей "FII 20210А" и "FV 1691А" в обследованной группе больных с ВТ составила 135/593 (22 8%), тогда как в контроле эта цифра была почти в 3 5 раза ниже - 15/228 (6 6%) Таким образом, как и для большинства популяциошшх групп европеоидной расы, показана высокая значимость мутаций в генах факторов II и V в развитии ВТ В общей группе пациентов с ВТ наблюдалось статистически значимое, по сравнению с контролем, снижение ЧВ генотипа "FI -455АА" (4 0% против 7 9%, соответственно, (Ж=0 5, 95% CI 0 3-0 9, р=0 025) При этом доля гетерозиготных носителей аллеля "-455А" фактора I, ассоциированного с повышенным уровнем фибриногена в плазме, была несколько выше среди больных (39 5% против 36 4% в КГ, OR=l 1, 95% CI 0 8-16, р-0 42) В результате, в группе пациентов было обнаружено статистически значимое (р=0 032) отклонение распределения генотипов фактора I от канонического распределения Харди-Вайнберга

Снижение доли гомозиготных носителей аллеля "FI -455А", по сравнению со здоровой популяцией, было впервые описано нами у больных, перенесших эпизод(ы) ТЭЛА (Kapustin SI et al, 2002) и подтверждено в дальнейшем при анализе более многочисленной группы пациентов с ВТ (Капустин С И и соавт, 2004) Большинство зарубежных авторов считают, что полиморфизм "FI -455G/A" не играет значительной роли в развитии ВТ (Camillen R S , Cohen Н, 2005, Bozic М. et al 2003) В то же время, согласно данным Лейденской группы по изучению тромбофилии, повышенный уровень фибриногена в плазме (более 5 г/л) ассоциирован с 4-кратным увеличением риска ВТ (Koster Т et al, 1994) Таким образом, выявленное нами снижение доли лиц с генотипом "—455АА" фактора I среди пациентов, перенесших эпизод(ы) ВТ, вряд ли может свидетельствовать о протективной роли указанного генетического варианта, ввиду его положительной ассоциации с уровнем фибриногена, являющегося предшественником фибрина - основного компонента тромба в венозном русле Наиболее вероятной причиной наблюдаемого феномена является "неполная репрезентативность" исследуемой группы больных, связанная с отсутствием в ней лиц с фатальной ТЭЛА, которая, по разным оценкам, составляет 1020% всех случаев ВТ (Кириенко А.И и соавт, 2003, Heit JA et al, 2001) В то же время, именно в случаях "массивной" ТЭЛА, являющейся одной из главных причин внезапной смерти (Савельев В С и соавт, 1990), можно предполагать увеличение доли лиц, склонных к развитию гиперфибриногенемии, обусловленной, в том числе, гомозиготным состоянием по аллелю "—455А" гена фактора I Таким образом, снижение ЧВ варианта "FI -455АА" в группе пациентов, перенесших эпизод(ы) ВТ, может быть связано с неблагоприятным прогнозом течения заболевания у лиц с данным генотипом Такое предположение должно быть подтверждено на основании анализа соответствующих клинических случаев

В группе пациентов с ВТ было обнаружено статистически значимое, по сравнению с КГ, снижение ЧВ генотипа "АроЕ Е2/ЕЗ" (12 5% против 18 0%,

соответственно, OR=0 7, 95% CI 0 4-1 0, р=0 043) Полиморфизм в гене АроЕ рассматривается в настоящее время как один из важнейших генетических факторов, определяющих особенности лихшдного спектра у индивида и влияющих на риск развития атеросклероза, тромбоза и иных осложнений (Eichner JE et al, 2002) Считается, что вариант "Е2" гена АроЕ играет протективную роль в развитии артериальной патологии (Davignon J et al, 1988, Kessler С et al., 1997), хотя результаты проведенного Wilson Р W et al мета-анализа противоречат этому положению (Wilson PW et al, 1996) Несмотря на повышенный интерес к изучению роли полиморфизма АроЕ в патогенезе артерио- и атеросклероза, практически отсутствуют работы, посвященные анализу встречаемости аллельных вариантов этого гена у пациентов с ВТ Выявленное нами снижение ЧВ варианта "АроЕ Е2/ЕЗ" в группе больных позволяет говорить о возможной "устойчивости" лиц с этим генотипом к развитию ВТ

Помимо рассмотренных статистически значимых отличий от группы здоровых лиц, в распределении некоторых полиморфизмов ДНК у пациентов с ВТ наблюдались тенденции в сторону увеличения или снижения ЧВ определенных аллелей или/и генотипов (табл 2) В частности, в группе больных была существенно выше доля лиц с генотипом "FXI1 46ТТ" (10 2% против 6 5% в контроле, OR=l 6, 95% CI 0 8-3 3, р=0 21) Несколько чаще среди пациентов встречались носители аллеля "GpTa 807Т" (65 2% против 60 1% в КГ, OR=l 2, 95% CI 0 9-1 7, р=0 17) Напротив, у больных было обнаружено более чем двукратное снижение ЧВ генотипа "P2Y12 Н2/Н2" тромбоцитарного рецептора АДФ, по сравнению с группой здоровых лиц (1 5% против 3 4%, соответственно, OR=0 4, 95% CI 0 1-1 3, р=0 17) Кроме того, в группе пациентов наблюдалось статистически значимое отклонение распределения генотипов ТРА от канонического распределения Харди-Вайнберга (р=0 016) Подобная картина была также обнаружена при анализе полиморфизма "1565Т/С" гена СЗрШа в контрольной группе (р~0 034)

Учитывая многофакторный и гетерогенный патогенез ВТ, анализ распределения генотипов изученных полиморфизмов ДНК был проведен не только в общей группе больных, но и в зависимости от пола пациентов, а также возраста, в котором произошла манифестация заболевания В группе женщин с ВТ значительно чаще встречались гомозиготы по аллелю "1565С" гена GpLJa (3 6% против 0 7% у мужчин, OR=5 5, 95% CI 1 2-24 9, р=0 02) Сравнение с КГ обнаружило существенное увеличение риска ВТ у женщин с данным генотипом (OR=4 3,95% CI 0 9-19 5, р=0 048), наиболее выраженное для пациенток молодого (до 45 лет) возраста (рис 1) В этой подгруппе ЧВ генотипа "GpIIIa 1565СС" в 5 раз превышала таковую в здоровой популяции (4 5% против 0 9%, соответственно, OR=5 3,95% CI 1 1-24 8, р=0 028)

Среди больных мужского пола чаще, по сравнению с пациентками, выявлялись гетерозиготные носители аллеля "GpIIIa 1565С" В результате, в группе мужчин с ВТ наблюдалось статистически значимое отклонение распределения генотипов полиморфизма GpIIIa от распределения Харди-Вайнберга (р=0 016), наиболее выраженное у лиц с дебютом ВТ после 45 лет

%

20

4,5

щ

25,4

2,3

28,4

Женщины <45 лет

Женщины >45 лет

0,9

КГ

1,1

32,0

¡¡111 27,7

Мужчины <45 лет

0,0

ШШ

Ш

Мужчины >45 лет

□ Генотип 1565ТС

I Генотип1565СС

Рис. I, Доля носителей аллеля Юрта 1565С™ среди больных с ранним (<45 лет) и поздним (>45 лет) дебютом ВТ.

Среди женщин с ВТ чаще, чем в КГ, обнаруживались носители аллеля "МТНРК 677Т" (58.6% протии 49.6%, соответственно, ОК=1.4, 95% С1: 1.02.0; р=0.043). При зтом наиболее отчетливое различие между пациентками и группой здоровых лиц было обнаружено в ЧВ гетерозигот "МТНКК 677СТ" (48.0% против 39.5%, соответственно, 011=1.4, 95% С1: 1.0-2.0; р=0.053). В то же время, у больных мужского пола характер распределения полиморфизма гена МТНРК. практически не отличался от такового в контроле. Интересно, что в группе мужчин носителями аллеля "МТИРЯ 677Т" чаще являлись лица моложе 45 лет, тогда как для женщин наблюдалась обратная зависимость (рис. 2). В результате, максимальные различия в ЧВ этого генетического варианта у больных разного пола были зафиксированы в группе пациентов с поздним дебютом ВТ (61.4% женщин и 43.5% мужчин в указанной группе являлись носителями аллеля "МТШК 677Т", СЖ=2.1, 95% СГ: 1.2-3.7; р=0.015).

В группе пациенток с ВТ, по сравнению с контролем, наблюдалось статистически зна'пшое снижение ЧВ генотипа "Р2У12 Н2/Н2" (0,7% против 3.4%, соответственно, ОБ!=0,2, 95% С1: 0.1-1.0; р-0.041). Несмотря на довольно высокую ЧВ аллеля "Р2У12 Н2" у женщин, перенесших эпизод(ы) ВТ в молодом возрасте, среди них не было обнаружено ни одной гомозиготы по данному варианту (рис. 3). В результате, распределение генотипов Р2У12 в этой подгруппе характеризовалось статистически значимым отклонением

1Я

%

10,0

40 ;

46,2

11,4

llii; IÊ|1 ïSl

Женщины Женщины <45 лепт >45 лет

□ Генотип 677СТ б

10,1

9,0

SP

m

6,5

37,0

КГ Мужчины Мужчины

<45 лет 245 лет

[Генотип 677ТТ

Рис. 2. Доля носителей аллеля "МГНЕИ 677Т" Среди больных с рашшм (<45 лет) и поздним (>45 лет) дебютом ВТ.

30

%

15

0,0

Ш

2,3

■щШ 17.2

Женщины Женщины <45 лет 245 лет

3,4

1,9

шяш,

wk i ш1 i»§

fpil | ||p H Épi

X ' ■

24,0 24,0 26,2

m ■ ■ "7:

КГ Мужчины Мужчины

<45 лет 245 лет

□ Генотип Н1/Н2 и Генотип Н2/Н2

Рис. 3. Доля носителей аллеля "Р2У12 Н2" среди и поздним (>45 лет) дебютом ВТ.

больных с

ранним (<45

лет)

от распределения Харди-Вайнберга {р=0.029)_ Напротив, в группе женщин с поздним дебютом ВТ была существенно снижена доля гетерозигот по алледю 'T2Y12 Н2". Как видно из рис. 3, у больных мужского пола распределение генотипов P2Y12 практически не отличалось от такового в норме, независимо от возраста, в котором впервые произошла манифестация ВТ.

Весьма неожиданным оказалось увеличение доли гетерозиготных носителей мутации FV Leiden среди больных, впервые перенесших ВТ в возрасте 45 лет и старше (19.4% против 13.0% у пациентов с ранним дебютом заболевания, OR=l.<>, 95% CI: 1.0-2.6; р=0.049). Сравнение с КГ обнаружило, что риск развития ВТ у индивидов с данным генотипом с возрастом существенно увеличивается (OR=5.2, 95% CI: 2.5-10,8; р<0.0001 в группе лиц 45 дет и старше, по сравнению с OR=3.2, 95% CI: 1.6-6.5 j р<0.001 »молодом возрасте). При этом у 4 из 5 больных, являющихся гомозиготными носителями мутации FV Leiden, первый эпизод ВТ был диагностирован в возрасте до 45 лет (36, 37, 38 и 42 года, соответственно). Тенденция к увеличению доли носителей мутации FV Leiden среди больных с поздним дебютом ВТ наблюдалась независимо от пола {рис. 4).

Полученный результат согласуется с мнением о целесообразности поиска генетических причин повышенной склонности к тромбозу независимо от возраста обследуемого больного (Ridker P.M. et aL, 1997; Bauer К., 2001; De Stefano V. et al., 2002).

22,2%

13,4%

17,0%

4,4%

14,7%

Женщины Женщины <45 лет >45 лет

КГ

Мужчины Мужчины <45 лет £45 лет

Рис. 4. Доля носителей мутации FV Leiden среди больных с ранним (<45 лет) и поздним (>45 лет) дебютом ВТ.

В группе лиц с ранним дебютом ВТ чаще, чем у пациентов, впервые перенесших ВТ в возрасте 45 лет и старше, обнаруживалось носительство аллеи "ATGR1 1166С" (47 1% против 37 8%, соответственно, OR=l 5, 95% CI 1 0-2 1, р=0 034), особенно, в гомозиготном состоянии (8 2% против 3 6%, соответственно, OR=2 4, 95% CI 1 0-5 6, р=0 035) Снижение ЧВ аллеля "ATGR1 1166С" в группе больных с поздним дебютом ВТ наблюдалось независимо от пола

Таким образом, анализ распределения изученных полиморфизмов ДНК в общей группе больных, а также с учетом пола пациентов и возраста, в котором произошел дебют ВТ, выявил ряд особенностей, присущих всей исследуемой группе, либо определенной ее части Однако лишь небольшое число генетических вариантов характеризовалось статистически значимым отклонением ЧВ в той или иной когорте пациентов от соответствующей величины в контроле, или, иными словами, обладало так называемым "основным эффектом" ("main effect") в отношении риска развитая ВТ В большинстве случаев распределение генотипов изученных полиморфизмов ДНК либо соответствовало таковому в здоровой популяции, либо имело лишь незначительную тенденцию к отклонению от нормы

Между тем, некоторые из полученных результатов свидетельствовали в пользу гипотезы о полигенном характере предрасположенности к ВТ и продиктовали необходимость дальнейшего поиска генетических факторов, задействованных в молекулярных механизмах его патогенеза В частности, для ряда полиморфизмов ДНК наблюдалось отклонение распределения генотипов в общей группе больных или/и в определенных подгруппах от распределения Харди-Вайнберга Кроме того, выявленные различия в ЧВ некоторых генетических вариантов между выделенными для детального анализа подгруппами пациентов также могли быть обусловлены, в том числе, и влиянием "ген-генных взаимодействий" на формирование индивидуальной предрасположенности к ВТ и, возможно, особенности манифестации тромботического процесса

Анализ "ген-генных взаимодействий" у пациентов с венозным тромбозом

Для поиска генотипических сочетаний, или "межгенных комбинаций", ассоциированных с риском развития ВТ, в работе был проведен анализ так называемых "ген-генных взаимодействий" в общей когорте больных или ее подгруппах, сформированных по полу пациентов и возрасту, в котором произошел дебют ВТ Целью этого анализа явилось изучение ассоциативных связей между аллельными вариантами различных генов и обнаружение неслучайных генотипических сочетаний, ЧВ которых в исследуемой группе имеют отклонения от произведения ЧВ входящих в их состав генетических вариантов (как это было бы для случайного события) С помощью программ анализа генетических данных "GenePop" и "GDA" были выявлены пары изученных полиморфизмов с максимально значимым (р<0 2) коэффициентом неравновесного сцепления в исследуемой группе Затем, с помощью точного

критерия Фишера, для каждой из этих пар полиморфизмов были определены сочетания генотипов с высоким уровнем статистической значимости (р<0.05) ассоциативной связи между входящими в их состав генотипами. При отсутствии в составе межгенной комбинации генетического варианта с "основным эффектом" (ЧВ которого в исследуемой группе пациентов имела статистически значимое отклонение от таковой в контроле), для оценки роли этого генотипического сочетания в развитии ВТ было использовано сравнение его ЧВ у больных и в КГ. В противном случае, для установления ассоциативных связей, возможно, имеющих патогенетическую значимость, проводился анализ распределения генотипов "нейтрального" полиморфизма в исследуемой группе пациентов в зависимости от наличия либо отсутствия генетического варианта, обладающего "основным эффектом".

В результате, выявлены два сочетания, ЧВ которых у пациентов с ВТ статистически значимо превышали таковые в здоровой популяции.

Одновременное носительство аллеля "MTHFR 677Т" я аллеля "Gpla 807Т" наблюдалось более чем у трети больных (36.9% против 27.6% в контроле; OR=I.5, 95% CS: 1,1-2.1; р=0.014), причем к увеличению риска ВТ приводила даже комбинация гетерозиготных генотипов MTHFR и Gpla (24.1% против 16.2%, соответственно; OR4.6, 95% CI: 1.1-2.4; р=0.014). Анализ встречаемости сочетания "MTHFR 677СТ I Gpla 807СТ" у патентов в зависимости от наличия мутаций FV Leiden и "РП 20210G/A" показал его самостоятельную роль как фактора риска ВТ (рис. 5). Увеличение ЧВ данной комбинации у больных с нормальными генотипами факторов И и V характеризовалось достаточно высоким уровнем статистической значимости.

28,9% (р<0,02)

16,2%

23,8% (р<0,03)

ш.

30,0% (р=0,4)

16,7%

кг

FV(-yFII(~) FV(+VFII(-) FV(-VFII(+) FV{+)/FII(+)

Рис. 5. Частота встречаемости комбинации "МТНРК 677СТ / СтрГа 807СТ" у больных с ВТ в зависимости от наличия мутаций в генах факторов Пи V.

Среди пациентов с мутацией FV Leiden "двойные гетерозиготы" по MTHFR и Gpla встречались почти в 2 раза чаще, чем в контроле В то же время, среди больных с мутацией в гене протромбина доля лиц с указанным сочетанием практически не отличалась от таковой в здоровой популяции

Результаты анализа "ген-генных взаимодействий" полиморфизмов MTHFR и Gpla в различных подгруппах больных свидетельствовали о самостоятельной роли одновременного носительства аллелей "MTHFR 677Т" и "Gpla 807Т" как фактора риска ВТ в молодом возрасте, причем независимо от пола индивида Патогенетическая значимость обнаруженной комбинации становится весьма очевидной при рассмотрении функциональных свойств указанных полиморфизмов ДНК Нуклеотидная замена "677С/Т" в гене MTHFR является важнейшей предпосылкой развития гипергомоцистеинемии (ГГЦ) и обусловленного этим состоянием поражения сосудистого эндотелия Полиморфизм "807С/Т" в гене Gpla ассоциирован с увеличением количества экспрессированных на мембране тромбоцитов молекул рецептора Gpla/Üa, основным лигандом которого является коллаген - главный компонент субэндотелиалыюго матрикса Таким образом, сочетание в генотипе индивида аллелей "MTHFR 677Т" и "Gpla 807Т" может предрасполагать к формированию "первичного звена" патофизиологических реакций гемостаза, лежащих в основе тромбоза, - адгезии тромбоцитов к поврежденной сосудистой стенке (Петрищев Н Н, Власов Т Д, 2003)

Ввиду невысокой величины риска возникновения ВТ, обнаруженной для одновременного носительства аллелей "MTHFR 677Т" и "Gpla 807Т", представилось интересным провести анализ, направленный на установление дополнительных генетических вариантов, кооперативно с указанной межгенной комбинацией влияющих на формирование предрасположенности к данной патологии Были обнаружены "тройные" генотипические сочетания, ассоциированные с риском развития ВТ в молодом возрасте У мужчин с ранним дебютом ВТ наблюдалось более чем двукратное увеличение ЧВ комбинации гетерозиготных генотипов "MTHFR 677СТ", "Gpla 807СТ" и "FI —455GA" (11 3% против 5 3% в контроле, OR=2 3, 95% CI 1 1-4 8, р=0 04) В группе женщин, перенесших эпизод(ьт) ВТ в возрасте до 45 лет, высоким уровнем статистической значимости характеризовалось увеличение доли пациенток, являющихся носительницами аллеля "MTHFR 677Т", а также генотипов "Gpla 807СТ" и "ATGR1 1166АС" (14 9% против 5 7% в группе здоровых лиц, OR=2 9,95% CI 1 5-5 7, р=0 003)

Выявленные у пациенток с ВТ положительные ассоциации варианта "MTHFR 677Г' с посительством мутации FV Leiden и аллелем "Gpla 807Т" поставили под сомнение его независимую роль как фактора риска ВТ у женщин (несмотря на увеличение ЧВ носителей аллеля "MTHFR 677Т" в этой подгруппе) Подтверждением этому явился тот факт, что у пациенток с нормальными генотипами фактора V и Gpla вариант "MTHFR 677Т" встречался практически с такой же частотой, что и у соответствующих лиц контрольной группы (рис 6)

65,1% (р<0,07)

49,6%

52,5%

1 *

шш

ня : : : V- . %

Г--.-:;-.:.«-.

61,3% {р<0,02)

В ВН»

КГ РУ 1-ек1еп(-) РУ 1.е1с1еп(+) Ср1а 807Т(+)

вр!а 807С С

^ Женщины с ВТ

Рис. 6, Доля носителей аллеля "МТН№ 677Т" в подгруппах пациенток с различными генотипами фактора V и Ср1а.

Таким образом, геяотипирование полиморфизмов "МТИРИ 677С/Т"' и "Ор1а 807С/Т" с целью выявления случаев одновременного носительства "протромбогенных" аллелей указанных генов является целесообразным для установления молекулярных основ НТ у больных с ВТ и формирования групп повышенного риска данной патологии, особенно, при учете иных генетических вариантов и внешних факторов, синергично с отмеченным генотипа ческим сочетанием вовлеченных в патогенезе заболевания. Функциональная значимость аллеля "МТН№ 677Т", предрасполагающего к развитию гипергомоцистеинемии, позволяет предположить, что носительство варианта "Ор!а 807Т" увеличивает риск развития ВТ у лиц с ГГЦ независимо от обусловивших ее причин.

Вторая межгенная комбинация, которая встречалась у пациентов значительно чаще, чем в контроле (8.9% против 3.9%, соответственно; 08=2.4, 95% С1: 1.2-4-9; р=0.018), была образована генотипом "ТРА ЕГ, ассоциированным с повышенной продукцией этого фактора, и аллелем "Е4" гена АроН. Анализ встречаемости сочетания "ГРА II / АроЕ Е4(+)" в общей группе больных показал его самостоятельную роль как фактора риска ВТ (рис. 7), Увеличение ЧВ дайной комбинации у пациентов с нормальными генотипами факторов II и V характеризовалось достаточно высоким уровнем статистической значимости (8.7% против 3.9% в КГ; ОК=2.3, 95% С1: 1.14.9; р-0.027).

10,8% (p<0,04)

КГ FU(-VFV(-) FV {+) Ftl (+)

Рис. 1. Частота встречаемости комбинации 'TPА П / АроЕ Е4(+)" у больных с ВТ в зависимости от наличия мутаций в генах факторов Н и V.

"Среди больных с мутацией FV Leiden доля носителей этого генотипического сочетания также существенно превышала такоьую в контроле. Напротив, у пациентов с мутацией в гене протромбина ЧВ указанной комбинации практически не отличалась от таковой в здоровой популяции.

Как и в случае одно врем енного носительства аллелей "MTHFR 677Т" и "Gpla 807Т", патогенетическая значимость сочетания "ТРА П I АроЕ Е4(+)", наиболее вероятно, связана со специфическими механизмами повреждения сосудистой стенки.

Таким образом, сочетание аллелей "MTHFR 677Т" и "Gpla 807Т", а также комбинация генотипа "ТРА IP с носительством аллеля "АроЕ Е4" являются самостоятельными факторами риска развития ВТ в популяции Северо-Западного региона России, в том числе, у лиц молодого возраста. Обнаружение указанных генотипических сочетаний, с учетом мутаций в генах факторов Ц и V, позволило охарактеризовать молекулярную причину НТ более чем у половины больных с ВТ.

При анализе "ген-генных взаимодействий" в общей группе больных с ВТ, у носителей мутаций в генах факторов II и V был выявлен неодинаковый характер ассоциативных связей с генетическими вариантами компонентов, вовлеченных в регуляцяю функциональной активности гемостаза (рис. 8 и 9).

9,7 (Р<0,01)

24,9 (р<0,01)

АрсЕ"ЕЗИ" АроЕ "414" АСТ"ТС" АвТХС" 01М 1_ек1еп(-) и РУ 1_е1(1еп{+}

Рис. 8. Частота встречаемости некоторых генетических вариантов у носителей мутации РУ в общей группе пациентов с ВТ.

70 ЧВ,%

60,0 (р=0,05)

т Н1 20210А(~) @ РМ 20210А(+)

Рис. 9. Частота встречаемости некоторых генетических вариантов у носителей мутации "РП 202 Юв/А" в общей группе пациентов с ВТ.

60 чв,%

38,5 (р<0,05)

46,0 (р<0,01)

37,3 (р<0,05)

26,9 (Р<0,02)

АроЕ "Е2{+)" АСЕ "СЮ"

АТа«1 Р2У12

"АС+СС" "Н1/Н2"

Среди носителей мутации FV Leiden была увеличена доля лиц, не содержащих в генотипе аллеля "АроЕ ЕЗ" [вариант "АроЕ Е3(~)"| Так, генотип "АроЕ Е4/Е4" наблюдался почти в 4 раза чаще у пациентов с дефектом в гене фактора V, чем при его отсутствии Данная ассоциация была наиболее характерна для группы больных с поздним дебютом ВТ

Другой отличительной чертой пациентов с мутацией FV Leiden явилось необычное распределение генотипов ангиотензиногена, со значительным снижением доли гомозигот по аллелю "AGT 704С", ассоциированному с повышенным уровнем в плазме этого первичного компонента ренин-ангиотегоиновой системы (РАС)

Среди пациентов с мутацией в гене протромбина чаще встречались носители аллеля "АроЕ Е2", а также лица с генотипами "ACE DD" или/и "P2YI2 HI/H2", ассоциированными, соответственно, с повышением уровня в плазме ангиотензин-превращающего фермента и АДФ-зависимой активацией тромбоцитов Напротив, в этой группе больных была снижена ЧВ аллеля "ATGR1 1166С" гена рецептора ангиотензина П 1-го типа

В группе больных с ранним дебютом ВТ, являющихся носителями мутации в гене протромбина, доля гетерозигот по аллелю "P2Y12 Н2" почти в 2 раза превышала таковую у лиц с нормальным генотипом фактора П (42 9% против 24 2%, соответственно, OR=2 3, 95% CI 1 1-5 2, р=0 041), причем положительная ассоциация между указанными вариантами оказалась наиболее характерной для пациентов мужского пола Кроме того, в группе мужчин, перенесших ВТ в возрасте до 45 лет, наблюдалось неслучайное сочетание генотипа "P2Y12 Н1/Н2" с мутацией FV Leiden (OR=3 2, 95% CI 13-8 2, р=0 016) В результате, у мужчин с ранней манифестацией ВТ наличие мутации в гене фактора П или/и V почти в половине случаев (47.1%) сопровождалось гетерозиготным носительством аллеля "P2Y12 Н2", тогда как при отсутствии указанных дефектов ЧВ генотипа "P2Y12 Н1/Н2" в этой подгруппе составила всего лишь 18 4% (OR=3 9,95% CI 1 8-8 7, р=0 001)

Среди мужчин с мутацией в гене протромбина, перенесших ВТ в молодом возрасте, была существенно выше доля лиц, не содержащих аллеля "АроЕ ЕЗ" (20 0% против 1 2% у пациентов этой подгруппы с нормальным генотипом фактора П, OR=20 1,95% CI 2 5-161 9, р=0 017)

Неодинаковый характер "ген-генных взаимодействий" с некоторыми аллельными вариантами компонентов, вовлеченных в регуляцию активности гемостаза, отражает специфические особенности молекулярного патогенеза ВТ у носителей мутаций в генах факторов II и V Кроме того, полученные результаты могут свидетельствовать о важной патогенетической значимости сочетаний генетических дефектов свертывающей системы (в данном случае, мутации FV Leiden или "FII 20210G/A") и вариантов, предрасполагающих к гиперактивации тромбоцитарного звена гемостаза или/и эндотелиальной дисфункции, в развитии ВТ При этом характер влияния соответствующих межгенных комбинаций на риск возникновения и особенности манифестации тромботического процесса, по всей видимости, зависит не только от роли затрагиваемых компонентов в (патофизиологии гемостатнческих реакций,

но и от целого ряда дополнительных факторов (пола и возраста индивида, состояния иных генетических полиморфизмов, экзогенных ФР и т д )

Аллельныи полиморфизм генов, вовлеченных в регуляцию гемостаза, и некоторые клинические особенности течения ВТ

Учитывая гетерогенный характер клинических проявлений ВТ, с целью совершенствования прогностических критериев его течения в работе был проведен анализ распределения изученных ДНК-полиморфизмов, а также "ген-генных взаимодействий" между ними, у пациентов с рецидивирующим течением "изолированного" ТГВНК, а также в группе больных с ТГВНК, осложненным ТЭЛА (подгруппа "ТГВНК+ТЭЛА").

При анализе когорты из 108 человек (49 мужчин и 59 женщин, средний возраст - 44 4±14.2 года), имевших в анамнезе более одного эпизода ТГВНК, не осложненного ТЭЛА, группу сравнения составили 119 пациентов (62 мужчины и 57 женщин, средний возраст - 41 0±16 9 года), перенесших на момент обследования единственный эпизод "изолированного" ТГВНК Выявлен ряд генетических вариантов, частоты встречаемости которых в указанных подгруппах имели существенные различия (табл 3)

Единственным статистически значимым различием, обнаруженным при изучении распределения генотипов, оказалось увеличение среди больных с рецидивирующим течением ТГВНК доли лиц с вариантом "PAI-1 5G/5G", ассоциированным с наименьшим уровнем этого ингибитора фибринолиза в плазме (28 7% против 15 1% в группе сравнения, OR=2 3, 95% CI 1 2-4 3, р=0 015) Поскольку увеличение риска возникновения повторных эпизодов тромбоза в условиях "нормальной" фибринолитической активности является маловероятным, данный результат, по всей видимости, объясняется тем, что носительство аллеля "PAI-1 4G" сопряжено с риском развития ТЭЛА или иных тромботических осложнений у пациентов с ТГВНК Таким образом, когорта больных с рецидивирующим течением "изолированного" ТГВНК в определенном смысле представляет группу лиц с благоприятным течением ВТ, поскольку в данных случаях даже при наличии повторных эпизодов тромбоза не происходит эмболизации ветвей легочных артерий

Как видно из табл 3, среди больных с рецидивирующим ТГВНК доля носителей мутации FV Leiden лишь незначительно превышала таковую в группе сравнения (21 3% против 16 8%, соответственно, OR=l 3, 95% CI 0 72 6, р=0 4), а гетерозиготы по аллелю "FII20210А" обнаруживались почта в 2 раза реже (5 6% против 10 1%, соответственно, OR=0 5, 95% CI 0 2-1 5, р=0 23) Кроме того, в группе пациентов, церенесших более одного эпизода ТГВНК, не осложненного ТЭЛА, было выявлено заметное преобладание гомозиготных носителей аллеля "MTHFR 677Т" (12 0% против 6 7% у лиц с единственным эпизодом "изолированного" ТГВНК в анамнезе, OR=l 9, 95% CI 0 8-4 8,р=0 18)

ТАБЛИЦА 3

Генетические варианты у пациентов с рецидивирующим течением ТГВНК, не осложненного ТЭЛА

Генетический вариант Частота встречаемости, %

Рецидивирующий ТГВНК t ТГВНК без рецидивов Контрольная группа

Генотипы:

Фактор V"1691A(+)" 21 3 16 8 44

Фактор II "20210GA" 5 6 10 1 22

PAI-1 "5G/5G" 28 7* 15 1 176

Комбинации из 2-х генотипов:

Фактор V "1691 А(+)" 1 АроЕ "ЕЗ(-)" 46* 00 04

MTHFR "ТТ" /РА1-1 "4G/4G" 6 5** 00 26

РА1-1 "4G/5G" / Gpla "ТТ" 28 * 118 83

АроЕ "ЕЗ/Е4" / Gpina "ТС+СС" 09* 76 75

АроЕ "ЕЗ/Е4" /P2Y12 "Н1/Н2" 0 0*** 10 1 6 1

ATGR1 "АС" /P2Y12 "Н1./Н2" 56* 15 1 48

Комбинации из 3-х генотипов:

Фактор V "1691А(+)" / PAI-1 "4G/4G" / АСЕ "ID" 74* 08 04

Фактор V "1691 А(+)" / P2Y12 "Н1/Н2" / ТРА "1(+)" 74* 08 04

АроЕ "ЕЗ/Е4" / GplHa "ТС+СС" / PAI-1 "4G(+)" 00** 67 57

PAI-1 "4G/5G" / Gpla "ТТ" / фактор ХП "46Т(+)" 09* 76 3 9

AGT "СС" / Фактор I "А(+)" / ТРА "D(+)" 74** 00 75

Комбинации из 4-х генотипов.

Фактор V "1691А(+)" / PAI-1 "4G/4G" / АСЕ "!(+)" / ТРА "!(+)" 8 3** 08 09

Примечания t - Сравнение с группой "ТГВНК без рецидивов" * - р<0 05, ** - р<0 01, *** - р<0 001

Анализ "ген-генных взаимодейсгвий " выявил целый ряд комбинаций, характерных для больных с рецидивирующим ТГВНК. Так, среди носителей мутации FV Leiden из этой подгруппы значительную часть (21.7%) составили лица, в генотипе которых отсутствовал аллель "АроЕ ЕЗ" [вариант "АроЕ Е3(—тогда как у всех пациентов с мутацией в гене фактора V, перенесших единственный эпизод ТГВНК, обнаруживался аллель "АроЕ ЕЗ"" (рис. 10). Помимо варианта "АроЕ Е3(-)", риск повторных эпизодов ТГВНК у больных с мутацией в гене фактора V может возрастать при наличии в генотипе комбинации "РА1-1 4G/4G / АСЕ ГО" или/и "P2 Y12 Н1/Н2 / ТРА !(+)", каждая из которых обнаруживалась почти в 7 раз чаще у носителей варианта FV Leiden с рецидивирующим ТГВНК (34.8% против 5.0% у соответствующих лиц в группе сравнения, OR^lO.i, 95% CI: J. 1-90.3; р=0,024). Одновременное носительство мутации FV Leiden, генотипа "PAI-1 4G/4G", а также аллелей "ACE I" и "ТРА 1" обнаруживалось почта в 10 раз чаще среди пациентов, перенесших повторный(е) энизод(ы) ТГВНК (8.3% против 0.8% у больных с единственным эпизодом ТГВНК в анамнезе, OR-IO.7, 95% <Л: 1.3-86.2; р=0.008).

40 34,8 (р<0,03) 34,8 (р<0,03)

АроЕ "Е3(—)"

РАМ 4G/4G АСЕ I/D

P2Y12 Н1/Н2 ТРА |(+)

чв,%

21,7 (р<0,05)

□ ТГВНК без рецедивов @ Рецидивирующий ТГВНК

Рис. 10. Частота встречаемости некоторых генетических вариантов у носителей мутации FV Leiden с рецидивирующим течением ТГВНК.

Среди других сочетаний, характерных для больных с рецидивирующим тромбозом, стоит отметить комбинацию гомозиготных генотипов MTHFR и PAI-I, ассоциированных с риском развития ГГЦ и гипофибринолиэа. соответственно, а также сочетание генотипа "AGT 704СС" с носигельством аллелей "FI -455А" и "ТРА D", патогенетический механизм которого, скорее всего, реализуется посредством снижения фибринолигической активности на

фоне повышенного уровня фактора I Указанные межгенные комбинации были обнаружены исключительно у больных с рецидивирующим ТГВНК

В то же время, в группе пациентов, перенесших несколько эпизодов ТГВНК, не осложненного ТЭЛА, некоторые генотилические сочетания встречались существенно реже, чем у лиц с единственным эпизодом ТГВНК в анамнезе Наиболее выраженным отличием характеризовались комбинации генетических вариантов, ассоциированных с дисфункцией сосудистой стенки и активацией тромбоцитарного звена гемостаза В частности, среди больных с рецидивирующим течением ТГВНК, являющихся носителями варианта "АроЕ ЕЗ/Е4", не было выявлено лиц с гетерозиготным генотипом "P2Y12 Н1/Н2" тромбоцитарного рецептора АДФ Сочетание аллеля "GpIIIa 1565С" с генотипом "АроЕ ЕЗ/Е4" также встречалось гораздо реже у пациентов, перенесших более одного эпизода ТГВНК, а комбинация протромбогенных аллелей GpIIIa и PAI-1 у лиц с генотипом "АроЕ ЕЗ/Е4" обнаруживалась исключительно в группе больных с единственным эпизодом ТГВНК в анамнезе Одновременное носительство генотипа "АроЕ ЕЗ/Е4", варианта "PAI-I -675 4G" и хотя бы одного из аллелей "GpIIIa 1565С" или/и "P2Y12 Н2" наблюдалось исключительно среди лиц, перенесших единственный эпизод тромбоза (12 6% против 0.0% у пациентов с рецидивирующим течением ТГВНК, OR=32 2, 95% CI 1 9-545 2, р<0 0001)

Снижение ЧВ указанных сочетаний в группе больных, перенесших более одного эпизода "изолированного" ТГВНК, может быть связано с высоким риском развития ТЭЛА или иных тром ботичсских осложнений у пациентов, являющихся носителями этих межгенных комбинаций

С целью выявления генетических вариантов, характерных для больных с ТГВНК, осложненным ТЭЛА, были изучены особенности аллельного полиморфизма рассмотренных генов в подгруппе "ТГВНК+ТЭЛА", которую составили 117 пациентов (60 мужчин и 57 женщин, средний возраст -42 9±13 6 года) В группу сравнения вошли 303 индивида с "изолированным" ТГВНК (145 мужчин и 158 женщин, средний возраст - 42 3±15 5 года) Анализ распределения генотипов обнаружил почти двукратное снижение доли носителей мутации FV Leiden (OR=€ 5, 95% CI 0 2-0 9, pH) 029) и, напротив, более чем 10-кратное увеличение ЧВ гомозигот по аллелю "P2Y12 Н2" тромбоцитарного рецептора АДФ (QR=10 7,95% CI 1 297 0, р=0 023) в подгруппе "ТГВНК+ТЭЛА" (табл 4) Увеличение доли лиц с мутацией в гене протромбина среди пациентов, перенесших ТЭЛА, не достигало пределов статистической значимости Однако в результате анализа "ген-генных взаимодействий" были определены генетические варианты, увеличивающие риск развития ТЭЛА у больных с мутацией в гене фактора II Это - гетерозиготный генотип "P2Y12 Н1/Н2", а также аллель "АроЕ Е4" Сочетания мутации в гене протромбина с каждым из этих вариантов встречались примерно в 5 раз чаще в группе "ТГВНК+ТЭЛА", чем у больных с "изолированным" ТГВНК Одновременное носительство мутации в гене протромбина, гетерозиготного генотипа тромбоцитарного рецептора АДФ и аллеля "АроЕ Е4" наблюдалось исключительно в группе пациентов с ТГВНК,

ТАБЛИЦА 4

Генетические варианты у пациентов с ТГВНК, осложненным ТЭЛА

Частота встречаемости, %

Генетический вариант тгвнк, осложненный ТЭЛА Г Изолированный Контрольная ТГВНК группа

Генотипы•

Фактор V "1691А(+)" 10 3 * 19 5 44

Фактор II "2021 (ЮА" 12 0 73 22

Р2У12 "Н2/Н2" 3 4 * 03 34

Комбинации из 2-х генотипов

Фактор П "202100А' / АроЕ "Е4(+)" 5 1 * 1 0 04

Фактор П "2021 ОСА" / Р2У12 "Н1Ш2" 7 8 ** 1 7 04

МТНЖ "СТ" / Фактор XII "ТТ" 09* 5 3 22

МТНГЯ "ТТ" / врШа "С(+)" 5 1 * 1 0 44

АСТ "ТС" / РА1-1 "40/40" 20 5 * 12 6 17 5

АОТ иТС" / Фа1СГОр I "ОА" 29 9 ** 16 6 17 1

Р2У12 "Н2(+)" / АроЕ "Е2(+)" 94* 3 3 6 1

Р2У12 "112/112" / ТРА "ГО" 3 4** 00 26

Ко нбинации из 3-х генотипов

Фактор V "ОА" / \n HFR "Т(+)" / Фактор ХП "Т(+)" 69* 23 09

Фактор II "ОА" / АроЕ "Е4(+)" / Р2У12 "Н1/Н2" 4 3** 00 00

МТНРЯ "ТТ" / АроЕ "Е4(+)" / врШа "С(+)" 43 ** 03 1 8

ТАБЛИЦА 4 (продолжение)

Частота встречаемости, %

Генетический вариант ТГВНК, осложненный ТЭЛА t Изолированный Контрольная ТГВНК группа

Комбинации из 3-х генотипов-

AGT "ТС" У Фактор I "GA" / PAI-1 "4G(+)" 22 0 ** 11 3 13 6

AGT "ТС" / ATGR1 "АС" / Gpla ' ТТ" 6 0** 1 0 39

Фактор XII "ТТ" / P2Y12 "Н1/Н2" / AGT "ТТ" 4 3** 03 00

Комбинации из 4-х генотипов:

Фактор V "GA" / MTHFR "Т(+)" / AGT "ТС" / Фактор I "GA" 5 1 * 1 0 00

Фактор V "GA" / MTHFR "Т(+)" / AGT "С(+)" / Фактор ХП "Т(+)" 69* 20 04

MTHFR "ТТ" У АроЕ "Е4(+)" / GplIIa "С(+)" / Фактор ХП "Т(+)" 4 3 ** 03 1 3

AGT 'ТС" / Фактор I "GA" / PAI-1 "4G(+)" / АСЕ "D(+y 19 7** 86 10 5

Комбинации из 5-и генотипов:

Фактор V "GA" / MTHFR "Т(+)" / AGT "ТС" / Фактор XII "СГ" / Фактор I "GA" 34* 0,3 00

AGT "ТС" / Фактор I "А(+)" / PAI-1 "4G(+)" / АСЕ "D(+>" / Gpla "ТТ" 43 * 07 1 8

Примечания t - Сравнение с группой "Изолированный ТГВНК" * - р<0 05, ** - р<0 01

осложненным ТЭЛА (4.3% против 0.0% у пациентов с "изолированным" ТГВНК, OR=29.7,95% CI: 1.6-541.4; р=0.002).

Кооперативный эффект генетических вариантов, ассоциированных с эндотелиальной дисфункцией и гиперактивацией тромбоцитарного звена гемостаза, в формировании риска развития ТЭЛА у больных с ТГВНК, по-видимому, является характерным не только для случаев носительства мутации в гене протромбина. Об этом свидетельствуют, например, сочетание генотипа "MTHFR 377ТГ' с носительством аллелей "АроЕ Е4" и "ОрШа 1565С", которое встречалось почти в 15 раз чаще в группе "ТГВНК+ТЭЛА" (4.3% против 0.3% у пациентов с "изолированным" ТГВНК, OR=13,5, 95% CI: 1.6-116.7; р=0,007), а также комбинация "AGT 704ТС / ATGR1 1166АС/ Gpla 807ТТ", частота встречаемости которой у .тип с ТГВНК, осложненным ТЭЛА, в шесть раз превышала таковую в группе сравнения (6.0% против 1.0%, соответственно, OR=6.4, 95% CI: 1.6-25.1; р=0,006).

Несмотря на снижение доли носителей FV Leiden в группе "ТГВНК+ТЭЛА", были выявлены генетические варианты, сочетание которых с указанной мутацией увеличивает риск развития этого грозного осложнения у больных ТГВНК. Одновременное носительство аллея я "MTHFR 677Т", а также генотипов "FI -455GA", "FXO 46СТ" и "AGT 704ТС" наблюдалось почти в 20 раз чаще среди пациентов с вариантом FV Leiden, перенесших ТЭЛА, чем у соогвегхпвующих лиц с "изолированным" ТГВНК (33.3% против 1.7%, соответственно, OR=29.Q, 95% CI: 2.9-293.1; р=0.002) (рис. 11).

33,3%

FV Leiden(+) FV Leiden(-)

□ Изолированный ТГВНК ЕЭТГВНК+ТЭЛА

Рис. И. Частота встречаемости комбинации "MTHFR 677Т(+) / FI -455GA / FXfl 46СТ / AGT 704ТС" при различных проявлениях ВТ в зависимости от наличия мутации FV Leiden.

В то же время, при сравнении индивидов с нормальным генотипом фактора V, отличие ЧВ этой комбинации в группе "ТТБНК+ТЭЛА" от таковой у пациентов с неосложнешшм ТГВНК не достигало пределов статистической значимости (4 8% против 3 3%, соответственно, OR=l 5, 95% CI 0 5-4 6, р=0 54) Таким образом, увеличение риска ТЭЛА в случае одновременного носительства указанных генетических вариантов MTHFR, ангиотензиногена, факторов I и XII является характерным именно для больных ТГВНК с мутацией FV Leiden Как видно из таблицы 4, в группе "ТПВНК+ТЭЛА" обнаружено более чем 10-кратное увеличение ЧВ геногипического сочетания "FV 1691GA / MTHFR 677Т(+) / FI -455GA / РХП 46СТ / AGT 704ТС" (3 4% против 0 3% у пациентов с "изолированным" ТГВНК, OR=10 7,95% CI 1 2-96 7, р=0 023)

Возможно, именно редкой встречаемостью одновременного наличия в генотипе аллелей "MTHFR 677Т", "FI -455А", "FXH 46Г' и "AGT 704С" объясняется более низкая частота возникновения ТЭЛА у больных ТГВНК с мутацией FV Leiden (например, по сравнению с носителями мутации в гене протромбина)

Наконец, заслуживает внимания более чем двукратное увеличение в группе "ТГВНК+ТЭЛА" доли лиц с генотипическим сочетанием из четырех вариантов - генотипов "AGT 704ТС", "FI -455GA", а также аллелей "ACE D" и "PAI-1 -675 4G" (19 7% против 8 6% среди больных с "изолированным" ТГВНК, OR=2 6, 95% CI 1 4-4 8, р=0 004) Помимо высокой статистической значимости выявленного различия, эта комбинация интересна отсутствием в ее составе вариантов, ассоциированных с изменением функциональной активности тромбоцитарного звена гемостаза. Наиболее вероятным патогенетическим механизмом ТЭЛА, обусловленным данным сочетанием, является РАС-опосредованный гипофибринолиз при одновременном увеличении уровня фактора I в плазме

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о гетерогенном характере молекулярных механизмов предрасположенности к ВТ и влиянии генетического полиморфизма компонентов, вовлеченных в регуляцию функциональной активности гемостаза, не только на риск возникновения данной патологии, но и на особенности течения тромботического процесса

Расширение спектра анализируемых ДНК-полиморфизмов, их комплексная оценка с учетом "ген-генных взаимодействий" позволяет увеличить долю пациентов с известным генетическим фактором риска, что в перспективе будет способствовать разработке патогенетически направленных схем профилактики и лечения тромботических эпизодов в этих группах

Результаты исследования позволяют обосновать внедрение методов молекулярной диагностики наследственных тромбофилических состояний в широкую клиническую практику для совершенствования подходов к тактике ведения пациентов с ВТ, а также более эффективного формирования групп риска с целью принятия превентивных мер, направленных на снижение частоты ТЭЗ в популяции

Выявленные ассоциативные связи между компонентами плазменно! о и тромбоцитарного звеньев гемостаза с факторами, вовлеченными в патогенез эндотелиальной дисфункции, подтверждают на молекулярно-генетическом уровне положения классической гипотезы Рудольфа Вирхова о тромбозе как комплексной патологии сосудов и служат обоснованием для проведения дальнейших исследований в области молекулярного патогенеза ВТ и других тромбоэмболических заболеваний

Особенно ценными представляются результаты, полученные при анализе групп больных с различными клиническими проявлениями ВТ, поскольку их использование для прогнозирования рецидивирующего течения ТГВНК и оценки риска возникновения ТЭЛА у больных с тромбозом может способствовать снижению уровня смертности и инвалидизации населения

ВЫВОДЫ

1 Одним из ведущих патогенетических механизмов ВТ является генетическая предрасположенность, основу которой составляет аллельный полиморфизм генов, вовлеченных в регуляцию функциональной активности гемостаза Выявленное многообразие аллельных вариантов и их сочетаний, увеличивающих риск возникновения ВТ в популяции Северо-Западного региона России, подтверждает многофакгорный генез данной патологии, а также гипотезу о полигенном характере предрасположенности к ее развитию

2 В результате анализа распределения ДШС-полиморфизмов 16-ти генов, вовлеченных в регуляцию функциональной активности гемостаза, установлено,что

- наличие в генотипе аллелей '"FÜ 20210А" или/и "FV 1691 А" обнаруживается у 22 8% обследованных больных, по сравнению с 6 6% у лиц контрольной группы, и ассоциировано с более чем 4-кратным увеличением риска возникновения ВТ,

- частоты встречаемости генотипов "FI -455АА" и "АроЕ Е2/ЕЗ" у больных, перенесших ВТ, существенно ниже, чем в контрольной группе,

3 Показано, что сочетание аллелей "MTHFR 677Т" и "Gpla 807Т", а также комбинация генотипа "ТРА II" с носительством аллеля "АроЕ Е4" являются самостоятельными факторами риска развития ВТ в популяции Северо-Западного региона России

4 Генотип "Gpnia 1565СС" является самостоятельным фактором риска развития ВТ у женщин, особенно, в молодом возрасте, увеличение в группе больных, женского пола частоты встречаемости аллеля "MTHFR 677Т" наиболее характерно для пациенток старшего возраста и обусловлено положительной ассоциацией данного варианта с носительством мутации FV Leiden или/и аллеля "Gpla 807Т"

5 Наличие мутации FV Leiden в гетерозиготном состоянии значительно чаще обнаруживается у лиц с дебютом ВТ в возрасте после 45 лет У больных мужского пола с ранней манифестацией ВТ, являющихся носителями аллеля "FV 1691А" или/и "FII 20210А", увеличена частота встречаемости генотипа "P2Y12 Н1/Н2" тромбоцитарного рецептора АДФ

6 Аллельный полиморфизм генов, вовлеченных в регуляцию функциональной активности гемостаза, оказывает влияние не только на риск возникновения, но и на особенности манифестации ВТ, в том числе, характер его клинических проявлений

7 Для группы пациентов с рецидивирующим течением ТГВНК характерным является увеличение доли лиц с генотипом "PAI-1 5G/5G", а также снижение частоты встречаемости сочетаний генетических вариантов, ассоциированных с дисфункцией сосудистой стенки и активацией тромбоцитарного звена гемостаза

8 Наиболее характерными отличиями группы больных с ТГВНК, перенесших ТЭЛА, по сравнению с группой лиц с неосложненным ТГВНК, являются снижение доли носителей мутации FV Leiden, увеличение частот встречаемости генотипа "P2Y22 Н2/Н2", а также сочетаний генетических вариантов, ассоциированных с активацией тромбоцитарного звена гемостаза и дисфункцией сосудистой стенки

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 При обследовании больных с венозными тромбозами, наряду с общепринятыми методами оценки функциональной активности гемостаза, рекомендуется проведение молекулярно-генетической диагностики наследственных тромбофилических состояний, которая показана всем пациентам - независимо от пола, возраста, наличия иных факторов риска, предшествовавших тромботическому эпизоду, особенностей анамнеза и т д Молекулярно-генетическое тестирование может проводиться в любое время, поскольку его результата не зависят от особенностей функционального состояния пациента, характера проводимой терапии и т д

2 Наряду с выявлением "традиционных" генетических детерминант наследственной тромбофилии (мутаций в генах факторов П и V), для наиболее эффективного прогнозирования характера течения ТГВНК необходима комплексная оценка состояния адлельного полиморфизма генов, вовлеченных в регуляцию гемостаза

- в первую очередь, рекомендуется проведение генетического анализа компонентов плазменного (факторы I, П, V, XII свертывания крови, PAI-1) и тромбоцитарного (Gpla, GpIIIa, P2Y12) звеньев гемостаза, а также MTHFR и АроЕ,

- исследование полиморфизма генов TP А, Gplba, eNOS и компонентов РАС (AGT, АСЕ и ATGR1) может рассматриваться как факультативное

3 При обнаружении у пациентов с ТГВНК мутации FV Leiden следует обращать внимание на то, что одновременное наличие в генотипе аллелей "MTHFR 677Т", "FXII46Г', "FI -455А" и "AGT 704С" ассоциировано в этом случае с увеличением риска развития ТЭЛА Отсутствие в генотипе аллеля "АроЕ ЕЗ", генетически обусловленная тенденция к гипофибринолизу или/и повышенной АДФ-зависимой активации тромбоцитов могут рассматриваться как факторы риска развития повторных эпизодов ТГВНК у лиц с мутацией FV Leiden

4 При обнаружении у больных ТГВНК мутации "20210G/A" в гене протромбина особое внимание следует обращать на состояние полиморфизма генов АроЕ и P2Y12, поскольку наличие аллеля "АроЕ Е4" или/и "P2Y12 Н2" является в данном случае существенным фактором риска развития ТЭЛА

5 Генетически обусловленная склонность к повышению активации тромбоцитарного звена гемостаза должна рассматриваться как фактор риска ТЭЛА у пациентов с ТГВНК, особенно, при наличии в генотипе аллелышх вариантов, ассоциированных с дисфункцией сосудистой стенки

6 В связи с вариабельностью клинических проявлении ВТ и реальной возможностью принятия в значительной части случаев профилактических мер по предотвращению тромботических эпизодов, досимптоматическая диагностика наследственных тромбофилических состояний является одним из наиболее оптимальных подходов к формированию групп повышенного риска тромбоза и прогнозированию возможного характера его течения

7 Полученные данные о распределении генотипов 16-ти компонентов, вовлеченных в регуляцию функциональной активности системы гемостаза, в группе лиц, не имевших в анамнезе тромботических осложнений, могут быть использованы в качестве референтных при изучении основ генетической предрасположенности к различным тромбоэмболическим заболеваниям в популяции Северо-Западного региона России

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1 Капустин С.И Опыт проведения ПЦР для выявления мутации G1691 —> А в гене коагуляционного фактора V с целью дифференциальной диагностики АПС-резистентности при венозном тромбозе /СИ Капустин, В А Кобилянская, М Н Блинов, Л П Папаян, В Д Каргин // Вестник службы крови России - 1998 -№3 -С 26-27

2 Капустин С И Использование ПЦР для выявления мутации Arg506 Gin в коагуляционном факторе V, обусловливающей АПС-резистентпость при венозных тромбозах /СИ Капустин, В А Кобилянская, М Н Блинов, Л П Папаян // Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний Материалы 2-ой Всероссийской науч -практ конф -Москва, 1998 -С 129-130

3 Papayan L Factor V Leiden as an important nsk factor of hypercoagulation and thrombophilia / L Papayan, V. Kobilyanskaya, M Blinov, S Kapustm, S Baranovskaya, E Swartz, L Tarkovskaya, К Papayan, О Behazo, P Khrolova, V Kargm,N Saltykova//Hemostasis -1998 -V 28, Suppl 2 -P 405

4 Капустин С И Использование генетического тестирования при дифференциальной диагностике венозных тромбозов /СИ Капустин // Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром Проблемы лечения Материалы 5-ой Всероссийской науч -практ конф — Москва, 2000 — С 80-82

5 Капустин С И Роль генодиагностики при венозном тромбозе /СИ Капустин, В М Шмелева, Н Б Салтыкова, А М Паншина // Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии Материалы науч -практ конф -Санкт-Петербург, 2000 - С 191

6 Капустин СИ Частота мутаций FV Leiden, протромбин G20210-»A и МТГФР С677—»T при тромбоэмболии легочной артерии /СИ Капустин, В А Кобилянская, А М Паншина, В В Сабельников, Н Б Салтыкова, В Д Каргин, ЛП Папаян, МН Блинов // Тромбоз, гемостаз и реология -2001-№1(5) _с 94-95

7 Шмелева В М Гипергомоцистеинемия и полиморфизм гена метилентетрагидрофолат редуктазы как факторы риска развития артериальных и венозных тромбозов и атеросклеротического поражения сосудов / В М Шмелева, С И Капустин, Н Б Салтыкова, А Малефора, Д Харрингтон//Тромбоз, гемостаз и реология -2001 -№1(5) -С 144-145

8 Молекулярная диагностика тромбофилий 1 Блинов М Н, Капустин С И, Кобилянская В А , Папаян Л П // Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза // Баркаган 3 С, Момот А П - М Ньюдиамед, 2001 -296 с

9 Каргин ВД Фраксипарин в лечении тромботических проявлений при ангиопатиях / В Д Каргин, В Н Ржевская, Н Б Салтыкова, С И Капустин, ЛП Папаян // Терапевтический архив -2001 -Т 73, №12.-С 60-62

10 Shmeleva V Prevalence of hyperhomocysteinemia and the MTHFR C677T polymorphism ш patients with arterial and venous thrombosis from North

Western Russia / V Shmeleva, S. Kapustm, N Saltikova, A Malefora, G F Savidge, D Harrington II 18-th Congress of the International Society on Thrombosis and Hemostasis - Pans, France - 2001 - abstr № CD3628

11 Shmeleva V Hyperhomocysteinemia is a significant risk factor for thrombosis in Russia / V Shmeleva, S Kapustin, N Saltikova, A Malefora, D Harrington // International Congress in Predictive Medicine - Vichy, France - 2001 -abstr № PI5

12 Капустин С И Генетические детерминанты наследственной тромбофилии в патогенезе венозного тромбоза /СИ Капустин, МII Блинов, В Д Каргин, ЛИ Филановская, НБ Салтыкова, ОЕ Белязо, О Г Головина, В М Шмелева, А.М Паншина, Л П Папаян // Новое в изучении патогенеза, диагностике, профилактике и лечении патологии гемостаза Материалы VII национальной конференции - Москва, 2002 -С 69

13 Shmeleva V Gene-environment interaction A significant nsk factor for thrombosis ш North West Russia / V Shmeleva, S Kapustin, L Papayan, A Malefora, D J Harrington, G F Savidge // Pathophysiology of Haemostasis and Thrombosis -2002 -V 32, Suppl 2 -P 104

14 Panshma A The polymorphism P1A2 of platelet glycoprotein ПЬ-Ша, as a nsk factor for arterial thrombosis m North West Russia / A. Panshma, S Kapustin, M Bhnov//Pathophysiology of Haemostasis and Thrombosis -2002 -V 32, Suppl 2 -P 103

15 Saltikova N Prevalence of factor V Leiden, 20210GA prothrombin and C677T MTHFR mutations among patients with peripheral occlusive diseases ш the North-Westem Russia / N Saltikova, V Shmeleva, S Kapustm // 13-th Symposium of the Danubian League against thrombosis and hemorrhagic disorders, "La Cittadella" - Assisi, Italy -2002 -P 42

16 Kapustm SI Underrepresentation of the -455A p-fibrmogen allele in survivors of pulmonary embolism /SI Kapustm, M N Blinov, E N Imyaiutov, M J Mitchell, L P Papayan, G F Savidge // Thrombosis Research - 2002 - V 106 -P 89-90

17 Shmeleva V C677T substitution in the MTHFR gene is significant predictor of hyperhomocysteinemia ш patients with thrombotic disorders in North-Western Russia / V Shmeleva, S Kapustm, A Dmitneva, A Sobczynka-Malefora, D J Harrington, GF Savidge // Clinical Chemistry and Laboratory Medicine -2003 - V 41 - P A34-A3 5

18 Harrington DJ Genetic variations observed m arterial and venous thromboembolism - relevance for therapy, nsk prevention and prognosis / D J Harrington, A Malefora, V Schmeleva, S Kapustm, L Papayan, M Blinov, P Harrington, M Mitchell, GF Savidge // Clinical Chemistry and Laboratory Medicine -2003 -V 41 -P 496-500

19 Капустин С И Молекулярно-генетическая диагностика наследственных тромбофилии /СИ Капустин, М Н Блинов, Л.П Папаян / Материалы П-го Съезда Межрегиональной Ассоциации общественных объединений анестезиологов и реаниматологов Северо-Запада // Архангельск, 2003 - С 132-136

20 Kapustm SI Different risk of pulmonary embolism development in patients with deep-vein thrombosis from North-Western Russia having either factor V Leiden or prothrombin G20210A mutation /SI Kapustm, LI Filanovskaya, M J Mitchell, MN Blinov, G F Savidge // 19-th Congress of the International Society on Thrombosis and Hemostasis - Birmingham, UK - 2003 - abstr № P0357

21 PanshinaAM The prevalence of polymorphism P1A2 of platelet glycoprotein ПЬ-IIIa in the population of North-west Russia /AM Panshma, A S Shitikova, SI Kapustm, M N BJmov // 19-th Congress of the International Society on Thrombosis and Hemostasis - Birmingham, UK -2003 -abstr №P0377

22 Shmeleva VM Venous thromboembolism m North-western Russia and genetic polymorphisms / V M Shmeleva, SI Kapustm, LI Filanovskaya, M N Blinov // 19-th Congress of the International Society on Thrombosis and Hemostasis - Birmingham, UK -2003 -abstr № P0332

23 Бобылева ТА Полиморфизм гена рецептора тромбоцитов GpIIIa у больных с безболевой ишемией миокарда / ТА Бобылева, В А Лапотников, С И Капустин, В В Сергеева // Кардиология СНГ - Т 1 (приложение) -С 31

24 Капустин С И Генетические полиморфизмы тромбоцитарных рецепторов как новые маркеры предрасположенности к венозному тромбозу /СИ Капустин, JIИ Филановская, В М Шмелева, А М Паншина, М Н Блинов, JIП Папаян // Медицинский академический журнал - 2003 - Т 3, №3, прил 4 -С 92-93

25 Кобилянская В А Гиперкоагуляционный синдром при наследственной тромбофилии, обусловленной мутацией фактора V Leiden / В А Кобилянская, СИ Капустин // Медицинский академический журнал -2003 -Т3,№3,прил 4 -С 94-95

26 Шмелева ВМ Влияние полиморфизма С677Т гена фермента метилентетрагидрофолат редуктазы на уровень гомоцистеина плазмы у больных с тромботическими заболеваниями / В М Шмелева, С И Капустин, А Р Дмитриева // Медицинский академический журнал - 2003 - Т 3, №3, прил 4 - С 105-106

27 Капустин С И Генетические детерминанты наследственной тромбофилии в патогенезе венозного тромбоза / СИ. Капустин, МН Блинов, ЛП Папаян //Терапевтический архив -2003 -№10 - С 78-80

28 Шмелева В М Гипергомоцистеинемия - значимый фактор риска развития артериальных и венозных тромбозов / В М Шмелева, С И Капустин, М Н Блинов, Л П Папаян // Медицинский академический журнал - 2003 - Т 3, №4 -С 28-34

29 Особенности профилактики и лечения тромбозов при наследственных тромбофилиях Пособие для врачей / В Д Каргин, М Н Блинов, С И Капустин, Л П Папаян, А С Шишкова, Н Б Салтыкова, О Е Белязо, О Г Головина, Ю Л Кацадзе, В А Кобилянская, В М Шмелева, А М Паншина, Л Р Тарковская - СПб Изд-во СПбГМУ, 2003 - 16 с

30 Shmeleva V M. Prevalence of hyperhomocystememia and the MTHFR C677T polymorphem in patients with artenal and venous thrombosis from North Western Russia / V M Shmeleva, SI Kapustin, L P Papayan, A Sobczynska-Malefora, D J Hamngton, G F Savidge // Thrombosis Research - 2003 V 111 -P 351-356

31 Капустин С И Особенности распределения полиморфизмов -455 G/A в гене фактора I и -675 4G/5G в гене ингибитора активатора плазминогена типа I при венозном тромбозе /СИ Капустин, М Н Блинов, JIИ Филановская, В А Кобилянская, В М Шмелева, А М Паншина, JIП Папаян // Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии Материалы науч-практ конф - Санкт-Петербург, 2004 -С 91-92

32 Папаян JIП Новая мутация гена протеина S как этиопатогенетический фактор риска развития артериальных тромбозов в молодом возрасте / JIП Папаян, С И Капустин, В А Кобилянская, Н А Воробьева, М Митчелл, Г Mop, AM Паншина, ОЕ Белязо, МН Блинов, Д Севидж // Тромбоз, гемостаз и реология -2004 -№2 -С 30-37

33 Капустин СИ Генетическая предрасположенность к венозному тромбозу роль полиморфизмов компонентов плазменного и тромбоцитарного звеньев гемостаза /СИ Капустин, В М Шмелева, А М Паншина, JIИ Филановская, М Н Блинов, Л П Папаян // Ученые записки СПбГМУим акад ИП Павлова -2004 -Т 11,№3 -С 10-15

34 Папаян JIП Новая мутация гена протеина S как причина артериальных тромбозов в молодом возрасте / Л П Папаян, С И Капустин, В А. Кобилянская, Н А. Воробьева, М Митчелл, Г Мор, А М Панппша, О Е Белязо, М Н Блинов, Д Севидж // Ученые записки СПбГМУ им акад И П Павлова -2004 -Т 11,№3 -С 15-20

35 Shmeleva V Genetxc polymorphisms and environmental mfluences in artenal occlusive diseases / V Shmeleva, S Kapustin // 20-th Congress of the International Society on Thrombosis and Hemostasis - Sidney, Austraha -2005 -abstr №P2273

36 Капустин С И Наследственная тромбофшшя — акгуальная проблема современной медицины /СИ Капустин, М Н Блинов, Л П Папаян, Е А Селиванов // Медицинский академический журнал - 2006 - Т 6, № 1 - С 183-191

37 Капустин С И. Наследственная тромбофшшя как полигенная патология / С И Капустин // Тромбоз, гемостаз и реология. - 2006 - № 2 - С 24-34

Подписано в печать 19 02 07 Бумага офсетная Формат 60x84/16 Печать ризографическая. Тираж 150 экз

Ошечатано в ООО "КАДАНС" 191023, г Санкт-Петербург, ул Гороховая, 50 Тел 310-79-65

Актуальность темы

Несмотря на значительные успехи современной медицины, тромбоэмболические заболевания (ТЭЗ) по-прежнему представляют глобальную медико-социальную проблему, являясь основной причиной смертности и инвалидизации в индустриально развитых странах [3, 9]. По оценке экспертов, каждый десятый житель Земли испытывает в течение жизни такие серьезные последствия артериального и венозного тромбоза, как острый инфаркт миокарда (ОИМ), ишемический инсульт (ИИ), тромбоз глубоких и поверхностных вен, тромбоэмболия легочной артерии (ТЭЛА) [251]. Частота возникновения венозного тромбоэмболизма (ВТ) в общей популяции составляет 1-2 случая на тысячу населения ежегодно, при этом более 90% тромбозов локализуется в системе нижней полой вены [150, 266]. Тромбозы глубоких вен нижних конечностей (ТГВНК) являются основной причиной развития различных форм ТЭЛА - от асимптоматических до фатальных [33]. Особую проблему представляют рецидивирующие формы ВТ. В то же время, более половины тромботических эпизодов в венозном русле протекают бессимптомно и обнаруживаются впоследствии при развитии таких осложнений, как ТЭЛА, хроническая венозная недостаточность и, к сожалению, достаточно часто на аутопсии [135, 231]. Фатальная ТЭЛА нередко является первым и единственным проявлением ВТ и занимает третье место в общей структуре причин внезапной смерти [16, 150]. Именно внезапность и чрезвычайно высокая скорость развития патологического процесса являются, пожалуй, основными причинами, не позволяющими в значительной части случаев эффективно предотвращать тяжелые последствия тромбоза. В связи с этим, одним из наиболее перспективных путей борьбы с ТЭЗ представляется своевременное принятие профилактических мер у лиц с повышенным риском их развития [19, 32].

На основании многочисленных эпидемиологических исследований установлен целый ряд ставших уже классическими факторов риска ВТ [251, 254]. Наряду с ними, важная роль в патогенезе ВТ отводится феномену тромбофилии - повышенной склонности индивида к тромбозу [3, 6, 12]. Исследования последних лет существенно расширили наши представления о молекулярных механизмах формирования тромбофилических состояний. Во многом это объясняется успехами в изучении такой фундаментальной составляющей эндогенного риска, как генетическая предрасположенность. Еще в середине ХХ-го века, на основании клинических наблюдений семейных случаев ВТ, возникло предположение о том, что склонность к этой патологии может передаваться "по наследству", т.е. являться генетически опосредованной [164]. Однако, несмотря на выявление значительного числа протромботических аномалий гемостаза, феномен "наследственной тромбофилии" (НТ), в силу ряда причин, в течение долгого времени оставался невостребованным со стороны широкого круга специалистов практической медицины.

Настоящий прорыв в диагностике НТ и понимании ее роли в патологии человека начался с середины 90-х годов ХХ-го века, когда сперва Dahlback В. et al. охарактеризовали феномен "устойчивости к активированному протеину С" ("АПС-резистентности") как причину гиперкоагуляционного статуса почти у 50% пациентов с наследственной формой ВТ [92], а затем Bertina R.M. et al. выявили молекулярную основу данного феномена - мутацию Gl691А в гене фактора V свертывания крови (FV Leiden) [56]. Спустя всего 2 года после открытия мутации FV Leiden, Poort S.R. et al. при анализе гена протромбина у больных с ВТ обнаружили нуклеотидную замену G20210A, носительство которой было ассоциировано с повышенным уровнем фактора II в плазме и существенным риском развития заболевания [232]. Роль двух указанных мутаций в развитии гиперкоагуляционного синдрома и патогенезе ВТ была подтверждена целым рядом авторов, и сегодня эти генетические аномалии относят к числу наиболее распространенных форм НТ. Однако, несмотря на общепризнанную роль мутаций в генах факторов II и V в формировании генетической предрасположенности к ВТ, по-прежнему существует множество вопросов, касающихся целесообразности их диагностики в клинической практике. Сложившаяся ситуация во многом объясняется многофакторной природой ВТ и сложным характером взаимодействия генетических и экзогенных факторов риска (ФР), лежащих в основе или провоцирующих развитие патологических сдвигов в системе гемостаза [254]. Эпидемиологические исследования указывают также на возможность неодинакового вклада тех или иных факторов (в том числе, генетических) в патогенез ВТ у представителей различных популяционных групп [251].

Необходимость использования принципиально новых подходов при изучении основ генетической предрасположенности к тромбозу диктуется существующей на сегодняшний день концепцией о полигенном характере НТ, которая постулирует наличие в подавляющем большинстве случаев ТЭЗ не одного, а нескольких генетических вариантов, независимо или синергично модифицирующих риск развития заболевания [313]. В этой связи, особый интерес уделяется явлению аллельного полиморфизма, которое присуще большинству генов человека [5], в том числе, и тем, продукты которых участвуют в регуляции физиологического тока крови. К настоящему времени выявлено несколько десятков генетических вариантов, носительство которых ассоциировано с развитием протромботических сдвигов в системе гемостаза и/или риском ВТ [131, 191, 280]. Большинство из них кодирует компоненты плазменного и тромбоцитарного звеньев гемостаза, либо предрасполагает к развитию состояний, вовлеченных в патогенез эндотелиальной дисфункции (гипергомоцистеинемия, дислипидемия, артериальная гипертензия и др.).

Несмотря на интенсивный поиск новых генетических детерминант НТ, данные о роли большей части полиморфизмов ДНК в формировании индивидуальной предрасположенности к тем или иным тромботическим проявлениям остаются весьма противоречивыми. Практически отсутствуют работы, посвященные изучению распространенности уже известных и потенциальных факторов риска ВТ в зависимости от пола пациентов, возраста, в котором произошла клиническая манифестация тромбоза, наличия классических ФР и т.д. К сожалению, достаточно редкими остаются публикации, в которых авторами проводится анализ так называемых "ген-генных взаимодействий", способных приводить к появлению неслучайных сочетаний полиморфных вариантов различных генов, увеличивающих риск возникновения ВТ. Наконец, существует множество нерешенных вопросов относительно целесообразности диагностики определенных полиморфизмов ДНК в клинической практике, что в значительной мере объясняется недостаточным количеством исследований, направленных на установление коррелятивных связей между особенностями клинического течения тромботического процесса и наличием определенных маркеров в генотипе пациента. Все это обусловило актуальность детального изучения роли некоторых генетических вариантов, способных оказывать влияние на функциональную активность системы гемостаза, в развитии ВТ у жителей Северо-Западного региона России (СЗрР).

Цель исследования

Установить роль аллельного полиморфизма некоторых генов, вовлеченных в регуляцию функциональной активности гемостаза, в патогенезе наиболее распространенных клинических форм венозного тромбоэмболизма для совершенствования критериев при формировании групп повышенного риска и прогнозировании течения данной патологии.

Задачи исследования

1. Изучить характер распределения генетических полиморфизмов, ассоциированных с дисфункцией плазменного и тромбоцитарного звеньев гемостаза, а также сосудистой стенки, у больных с ВТ.

2. Провести анализ "ген-генных взаимодействий" в группе больных с ВТ и выявить генотипические сочетания, ассоциированные с риском развития данной патологии.

3. Исследовать распределение генетических полиморфизмов и характер "ген-генных взаимодействий" в зависимости от пола пациентов и возраста, в котором произошел дебют ВТ.

4. Выявить аллельные варианты и их сочетания, характерные для пациентов с рецидивирующим течением ТГВНК.

5. Выявить аллельные варианты и их сочетания, характерные для пациентов с ТГВНК, осложненным ТЭЛА.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Аллельный полиморфизм генов, вовлеченных в регуляцию функциональной активности гемостаза, составляет основу генетической предрасположенности к ВТ и является одним из важнейших факторов, определяющих характер его клинических проявлений.

2. Наиболее значимыми генетическими факторами риска ВТ у жителей Северо-Западного региона России являются мутации "169Ю/А" в гене фактора V и "2021(Ю/А" в гене фактора И, что согласуется с данными для других популяционных групп европеоидной расы. Неодинаковый характер "ген-генных взаимодействий" с аллельными вариантами, вовлеченными в регуляцию функциональной активности гемостаза, свидетельствует о различии патогенетических механизмов возникновения ВТ и особенностей его клинического проявления у носителей мутаций в генах факторов II и V.

3. Основу полигенной предрасположенности к ВТ составляют комбинации аллельных вариантов генов, ассоциированных с дисфункцией сосудистой стенки и развитием протромботических сдвигов в системе гемостаза. Увеличение спектра анализируемых ДНК-полиморфизмов и анализ их "ген-генных взаимодействий" позволяет установить причину тромбофилического статуса более чем у половины больных с ВТ.

4. Комплексный молекулярно-генетический анализ полиморфизмов, ассоциированных с дисфункцией гемостаза, может быть использован для прогнозирования рецидивирующего течения ТГВНК и оценки риска возникновения ТЭЛА. Генетически обусловленная склонность к повышенной активации тромбоцитарного звена гемостаза является фактором риска развития ТЭЛА у пациентов с ТГВНК.

Научная новизна

Впервые на большом клиническом материале проведен комплексный молекулярно-генетический анализ ДНК-полиморфизмов, ассоциированных с дисфункцией плазменного и тромбоцитарного звеньев гемостаза, а также сосудистой стенки, у жителей Северо-Западного региона России, перенесших эпизод(ы) наиболее распространенных проявлений венозного тромбоза -ТГВНК или/и ТЭЛА. Получены доказательства полигенной природы предрасположенности к ВТ, позволяющие обосновать необходимость расширения спектра анализируемых ДНК-полиморфизмов при установлении причин наследственных тромбофилических состояний.

Показана существенная роль полиморфизмов, ассоциированных с дисфункцией тромбоцитарного звена гемостаза, а также сосудистой стенки, в возникновении ВТ и некоторых особенностях его течения, в том числе, и у носителей мутаций в генах факторов II и V.

Впервые установлена роль полиморфизма гена аполипопротеина Е (АроЕ) в патогенезе ВТ. Показано, что частота встречаемости (ЧВ) генотипа "АроЕ Е2/ЕЗ" у больных с ВТ существенно ниже, чем в группе здоровых лиц, что позволяет рассматривать данный генетический вариант в качестве протективного фактора. Среди пациентов с мутацией в гене фактора II или/и V увеличена доля лиц, не содержащих в генотипе аллеля "АроЕ ЕЗ", а сочетание аллеля "АроЕ Е4" с мутацией в гене протромбина является существенным фактором риска развития ТЭЛА как осложнения ТГВНК.

Анализ распределения генетических полиморфизмов у больных с ВТ в зависимости от пола пациентов и возраста, в котором произошел дебют заболевания, выявил значительное увеличение доли носителей аллеля "677Т" гена метилентетрагидрофолат редуктазы (MTHFR) в группе женщин, впервые перенесших ВТ в возрасте старше 45 лет. Показано, что генотип "1565СС" гликопротеина (Gp) Illa является самостоятельным фактором риска ВТ у женщин, особенно, в молодом возрасте. Выявлено преобладание носителей мутации FV Leiden в группе пациентов с дебютом ВТ в возрасте 45 лет и старше; для лиц, перенесших эпизод(ы) ВТ в молодом возрасте, характерно увеличение доли носителей аллеля "1166С" гена рецептора ангиотензина II первого типа (ATGR1), особенно, в гомозиготной форме.

Впервые проанализирован характер "ген-генных взаимодействий" между изученными полиморфизмами, как в общей группе больных с ВТ, так и в зависимости от пола и возраста пациентов; выявлены генотипические сочетания, представляющие собой неизвестные ранее факторы риска данной патологии.

На основании анализа распределения изученных полиморфизмов ДНК, а также характера "ген-генных взаимодействий" между ними, у больных с различными проявлениями ВТ получены данные, свидетельствующие о целесообразности использования результатов генетического тестирования компонентов, вовлеченных в регуляцию гемостаза, в клинической практике для прогнозирования характера течения ТГВНК.

Практическая значимость

Использование молекулярно-генетического анализа изученных в работе ДНК-полиморфизмов в комплексе с существующими алгоритмами функциональной диагностики тромбофилических состояний позволит значительно повысить эффективность выявления факторов риска заболеваний, обусловленных патологией гемостаза.

Данные о распределении генотипов 16-ти компонентов, вовлеченных в регуляцию гемостаза, в популяции Северо-Западного региона России могут быть использованы в качестве референтных при изучении молекулярных основ генетической предрасположенности к ТЭЗ.

Полученные в результате исследования данные о встречаемости аллельных вариантов и их сочетаний у пациентов с различными проявлениями ВТ могут быть использованы при формировании групп повышенного риска с целью принятия своевременных профилактических мер, направленных на снижение частоты ТЭЗ в популяции.

Комплексная оценка аллельного полиморфизма генов, вовлеченных в регуляцию гемостаза, у пациентов с ТГВНК позволит прогнозировать рецидивирующее течение заболевания и риск возникновения ТЭЛА, что будет способствовать снижению уровня смертности и инвалидизации этих больных.

Апробация материалов диссертации

Основные положения диссертационной работы были представлены на Съездах Международного Общества по тромбозу и гемостазу: 15-ом (1998, Анталия, Турция), 18-ом (2001, Париж, Франция), 19-ом (2003, Бирмингем, Великобритания); на Съездах Европейской Ассоциации гематологов: 4-ом (1999, Барселона, Испания), 5-ом (2000, Бирмингем, Великобритания); на 17-ом Международном Конгрессе по тромбозу (2002, Болонья, Италия), на 3-ей Международной конференции по гипергомоцистеинемии (2003, Саарбрюкен, Германия), на 5-ой Всероссийской конференции "Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром. Проблемы лечения" (2000, Москва), на научно-практических конференциях "Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии" (2000, 2004 гг., Санкт-Петербург), на 6-ой Всероссийской конференции "Атеротромбоз и артериальная гипертензия" (2001, Москва), на научной конференции "Молекулярные механизмы типовых патологических процессов" (2003, Санкт-Петербург), на II Съезде реаниматологов и анестезиологов Северо-Запада России (2003, Архангельск).

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты диссертационной работы используются при оказании стационарной и амбулаторной помощи в Российском НИИ гематологии и трансфузиологии (РосНИИГТ), на неврологическом отделении ЦМСЧ-122 г. Санкт-Петербурга, на отделении анестезиологии, реанимации и интенсивной терапии МУЗ "Первая городская клиническая больница" г. Архангельска, а также в научной и педагогической работе в РосНИИГТ, на кафедре нейрохирургии и неврологии медицинского факультета Санкт-Петербургского государственного университета и на кафедре анестезиологии и реаниматологии лечебного факультета Северного государственного медицинского университета (г. Архангельск).

По результатам исследований написаны и утверждены:

1. Пособие для врачей "Методы диагностики АПС-резистентности, обусловленной мутацией гена фактора V", 2001 г.

2. Пособие для врачей "Методы диагностики тромбофилий, обусловленных мутацией генов протромбина и метилентетрагидрофолат редуктазы", 2001г.

3. Пособие для врачей "Особенности профилактики и лечения тромбозов при наследственных тромбофилиях", 2003 г.

4. Методические рекомендации "Алгоритм исследования системы гемостаза у больных с наследственными тромбофилиями", 2003 г.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 37 научных работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 294 страницах машинописного текста и состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Работа иллюстрирована 33 таблицами и 40 рисунками. Библиография включает 314 источников, из них 41 -отечественных и 273 - зарубежных.

выводы

1. Одним из ведущих патогенетических механизмов ВТ является генетическая предрасположенность, основу которой составляет аллельный полиморфизм генов, вовлеченных в регуляцию функциональной активности гемостаза. Выявленное многообразие аллельных вариантов и их сочетаний, увеличивающих риск возникновения ВТ в популяции Северо-Западного региона России, подтверждает многофакторный генез данной патологии, а также гипотезу о полигенном характере предрасположенности к ее развитию.

2. В результате анализа распределения ДНК-полиморфизмов 16-ти генов, вовлеченных в регуляцию функциональной активности гемостаза, установлено, что:

- наличие в генотипе аллелей "FII 20210А" или/и "FV 1691 А" обнаруживается у 22.8% обследованных больных, по сравнению с 6.6% у лиц контрольной группы, и ассоциировано с более чем 4-кратным увеличением риска возникновения ВТ;

- частоты встречаемости генотипов "FI -455АА" и "АроЕ Е2/ЕЗ" у больных, перенесших ВТ, существенно ниже, чем в контрольной группе;

3. Показано, что сочетание аллелей "MTHFR 677Т" и "Gpla 807Т", а также комбинация генотипа "ТРА II" с носительством аллеля "АроЕ Е4" являются самостоятельными факторами риска развития ВТ в популяции Северо-Западного региона России.

4. Генотип "GpIIIa 1565СС" является самостоятельным фактором риска развития ВТ у женщин, особенно, в молодом возрасте; увеличение в группе больных женского пола частоты встречаемости аллеля "MTHFR 677Т" наиболее характерно для пациенток старшего возраста и обусловлено положительной ассоциацией данного варианта с носительством мутации FV Leiden или/и аллеля "Gpla 807Т".

5. Наличие мутации FV Leiden в гетерозиготном состоянии значительно чаще обнаруживается у лиц с дебютом ВТ в возрасте после 45 лет. У больных мужского пола с ранней манифестацией ВТ, являющихся носителями аллеля "FV 1691 А" или/и "FII 20210А", увеличена частота встречаемости генотипа "P2Y12 Н1/Н2" тромбоцитарного рецептора АДФ.

6. Аллельный полиморфизм генов, вовлеченных в регуляцию функциональной активности гемостаза, оказывает влияние не только на риск возникновения, но и на особенности манифестации ВТ, в том числе, характер его клинических проявлений.

7. Для группы пациентов с рецидивирующим течением ТГВНК характерным является увеличение доли лиц с генотипом "PAI-1 5G/5G", а также снижение частоты встречаемости сочетаний генетических вариантов, ассоциированных с дисфункцией сосудистой стенки и активацией тромбоцитарного звена гемостаза.

8. Наиболее характерными отличиями группы больных с ТГВНК, перенесших ТЭЛА, по сравнению с группой лиц с неосложненным ТГВНК, являются снижение доли носителей мутации FV Leiden, увеличение частот встречаемости генотипа "P2Y12 Н2/Н2", а также сочетаний генетических вариантов, ассоциированных с активацией тромбоцитарного звена гемостаза и дисфункцией сосудистой стенки.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДА] ■ 51S

1. При обследовании больных с венозными тромбозами, наряду с общепринятыми методами оценки функциональной активности гемостаза, рекомендуется проведение молекулярно-генетической диагностики наследственных тромбофилических состояний, которая показана всем пациентам - независимо от пола, возраста, наличия иных факторов риска, предшествовавших тромботическому эпизоду, особенностей анамнеза и т.д. Молекулярно-генетическое тестирование может проводиться в любое время, поскольку его результаты не зависят от особенностей функционального состояния пациента, характера проводимой терапии и т.д.

2. Наряду с выявлением "традиционных" генетических детерминант наследственной тромбофилии (мутаций в генах факторов II и V), для наиболее эффективного прогнозирования характера течения ТГВНК необходима комплексная оценка состояния аллельного полиморфизма генов, вовлеченных в регуляцию гемостаза:

- в первую очередь, рекомендуется проведение генетического анализа компонентов плазменного (факторы I, II, V, XII свертывания крови, PAI-1) и тромбоцитарного (Gpla, GpIIIa, P2Y12) звеньев гемостаза, а также MTHFR и АроЕ;

- исследование полиморфизма генов ТРА, Gplba, eNOS и компонентов РАС (AGT, АСЕ и ATGR1) может рассматриваться как факультативное.

3. При обнаружении у пациентов с ТГВНК мутации FV Leiden следует обращать внимание на то, что одновременное наличие в генотипе аллелей "MTHFR 677Т", "FXII 46Т", "FI -455А" и "AGT 704С" ассоциировано в этом случае с увеличением риска развития ТЭЛА. Отсутствие в генотипе аллеля "АроЕ ЕЗ", генетически обусловленная тенденция к гипофибринолизу или/и повышенной АДФ-зависимой активации тромбоцитов могут рассматриваться как факторы риска развития повторных эпизодов ТГВНК у лиц с мутацией FY Leiden.

4. При обнаружении у больных ТГВНК мутации "2021(Ю/А" в гене протромбина особое внимание следует обращать на состояние полиморфизма генов АроЕ и Р2У12, поскольку наличие аллеля "АроЕ Е4" или/и "Р2У12 Н2" является в данном случае существенным фактором риска развития ТЭЛА.

5. Генетически обусловленная склонность к повышению активации тромбоцитарного звена гемостаза должна рассматриваться как фактор риска ТЭЛА у пациентов с ТГВНК, особенно, при наличии в генотипе аллельных вариантов, ассоциированных с дисфункцией сосудистой стенки.

6. В связи с вариабельностью клинических проявлений ВТ и реальной возможностью принятия в значительной части случаев профилактических мер по предотвращению тромботических эпизодов, досимптоматическая диагностика наследственных тромбофилических состояний является одним из наиболее оптимальных подходов к формированию групп повышенного риска тромбоза и прогнозированию возможного характера его течения.

7. Полученные данные о распределении генотипов 16-ти компонентов, вовлеченных в регуляцию функциональной активности системы гемостаза, в группе лиц, не имевших в анамнезе тромботических осложнений, могут быть использованы в качестве референтных при изучении основ генетической предрасположенности к различным тромбоэмболическим заболеваниям в популяции Северо-Западного региона России.