Автореферат и диссертация по медицине (14.01.14) на тему:Молекулярно-генетические аспекты хронического генерализованного пародонтита (вопросы патогенеза, диагностики, лечения, профилактики)

На правах рукописи

ВИШНЯГОВА Наталья Александровна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ХРОНИЧЕСКОГО ГЕНЕРАЛИЗОВАННОГО ПАРОДОНТИТА (ВОПРОСЫ ПАТОГЕНЕЗА, ДИАГНОСТИКИ, ЛЕЧЕНИЯ, ПРОФИЛАКТИКИ)

14.01.14 - Стоматология

14.03.03 - Патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Омск - 2011

005000962

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Омская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития РФ»

Научные руководители: доктор медицинских наук

Горбунова Ирина Леонидовна (14.01.14) доктор медицинских наук, доцент Русаков Владимир Валентинович (14.03.03)

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Зырянов Борис Николаевич

(ГБОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития РФ»)

доктор медицинских наук, профессор Крнвохижина Людмила Владимировна

(ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития РФ»)

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития РФ» (г. Екатеринбург)

Защита диссертации состоится «

;—часов, на заседании диссертационного ^совета Д. 208.065.02

Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Омская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития РФ» по адресу: 644043, Омск, ул. Ленина, 12; тел. (3812) 231332

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного

бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Омская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития РФ».

Автореферат разослан « ^ » 1 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

В. Б. Недосеко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В структуре стоматологических заболеваний патология пародонта воспалительного характера занимает одно из ведущих мест и в настоящее время не имеет тенденции к снижению (ВОЗ, 1995; Грудянов А.И., 2009). Пути повышения эффективности лечения и профилактики хронического пародонтита направлены в основном на совершенствование методов терапии уже развившегося заболевания и устранение факторов, способствующих его развитию (Григорьян А.С. с соавт., 2001, 2004, 2006; Грудянов А.И., 2008; Модина Т.Н. с соавт., 2002). К сожалению, на практике, даже при проведении комплекса лечебно-профилактических мероприятий у больных хроническим генерализованным пародонтитом, мы зачастую сталкиваемся с рецидивами активного воспаления в тканях пародонта, прогрессированием заболевания и ухудшением качества жизни больного. При этом существующие диагностические методы позволяют констатировать уже развившийся патологический процесс (Грудянов А.И., с _ соавт., 2008; Барер Г.М., 2008; Алексеева Ю.В. с соавт., 2003; Дунязина Т.М., 2001; Канканян А.П., Леонтьев В.К., 1998; Иванов B.C., 1998; Цепов Л.М., 1997).

В патогенезе воспалительных заболеваний пародонта значительная роль принадлежит изучению молекулярно-генетических факторов, определяющих ключевые фенотипические характеристики заболевания - от исхода взаимодействия патогена и организма человека до риска развития тяжелых форм пародонтита (Безрукова И.В., 2008; Царёв В.Н., 2007; Орехова Л.Ю., 2004; Воложин А.И., 2005; Зырянов Б.Н., 1998; Kawai Т., et al.; Taubman М.А., et al., 2005). В настоящее время многие вопросы, касающиеся молекулярных основ воспаления в пародонте, остаются открытыми. В частности, до конца не установлены факторы, определяющие прогноз заболевания: от стойкой ремиссии и длительного бессимптомного течения до полной утраты зубов с изменением качества жизни. В этой связи дальнейшая разработка методов диагностики и лечения хронического пародонтита до этапа клинического проявления патологии на основании комплексного молекулярно-генетического анализа представляется весьма перспективной.

Цель исследования. Установить взаимосвязь между клиническими проявлениями и молекулярно-генетическими предпосылками развития хронического генерализованного пародонтита для повышения качества диагностики, лечения и профилактики заболевания.

Задачи исследования.

1. Провести сопоставление клинических и метаболических показателей состояния органов и тканей полости рта у лиц с хроническим генерализованным пародонтитом и пациентов без воспалительных изменений в пародонте в динамике наблюдения.

2. Изучить показатели неспецифической защиты десневой жидкости у лиц с хроническим генерализованным пародонтитом и пациентов без клинически выраженной патологии в пародонте.

3. В качестве генетических маркеров воспаления у больных хроническим генерализованным пародонтитом дать клиническую оценку полиморфизма генов провоспалительных цитокинов TNF-a G(-308)—»A, IL-ip C(-5l I)—»T, IL-2 T(-330)—G, [L-6 G(-174)—С, IL-8 A(-251)—T, а также состояния рецепторного аппарата макрофагов CD14 С(-260)—Т, TLR-2 Arg(-753)—Gly, TLR-4 Asp(-299)—Gly и TLR-6 Ser(-249)—Pro.

4. Проанализировать состояние неспецифической реактивности десневой жидкости и метаболических процессов в костной ткани больных хроническим генерализованным пародонтитом под влиянием полиморфизма генов провоспалительных цитокинов TNF-a G(-308)—>А, IL-ip С(-511)—>Т, IL-2 Т(-330)—G, IL-б G(-174)—>С, IL-8 А(-251)—Т и рецепторного аппарата макрофагов CD 14 С(-260)—Т, TLR-2 Arg(-753)—Gly, TLR-4 Asp(-299)—Gly и TLR-6 Ser(-249)—»Pro.

5. На основании полученных данных определить роль полиморфизма изученных генов провоспалительных цитокинов и рецепторного аппарата макрофагов в иммунопатогенезе хронического генерализованного пародонтита и разработать принципы персонифицированного подхода к диагностике, лечению и профилактике заболевания.

Научная новизна. В результате проведённого исследования дана комплексная оценка состояния тканей пародонта с учётом гуморального и клеточного звеньев иммунитета десневой жидкости и содержания остеопротегерина в сыворотке крови у больных ХГП и лиц без клинически выраженных признаков воспаления в пародонте. Установлена зависимость между концентрацией остеопротегерина в сыворотке крови и тяжестью воспаления в пародонте.

Обоснован выбор генов-кандидатов интенсивности воспалительной реакции, определяющих степень тяжести ХГП - TNF-a G(-308)—A, IL-ip С(-511)—Т, IL-2 Т(-ЗЗО)—G, IL-6 G(-174)-C, IL-8 А(-251)-Т; CD14 С(-260)—Т, TLR-2 Arg(-753)—Gly, TLR-4 Asp(-299)—Gly и TLR-6 Ser(-249)—Pro. Установлены корреляционные взаимосвязи между продукцией генов-кандидатов и клиническими проявлениями ХГП, выражающиеся посредством общепринятой индексной оценки. Выяснены особенности распределения генотипов по аллельным полиморфизмам изученных генов у больных ХГП различной степени тяжести, продемонстрирована их потенциальная генетическая информативность в качестве ранних маркеров заболевания.

Теоретическое и практическое значение исследования. В результате проведённых исследований установлена необходимость комплексного

клинико-лабораторного обследования больных ХГП с целью определения величины индивидуальной потенциальной вероятности прогрессирования воспаления.

Определена информативность полиморфизмов генов TNF-a G(-308)—>А, IL-Iß С(-511)—Т, IL-2 Т(-330)—G, IL-6 G(-I74)->C, IL-8 А(-251)—Т; CD14 C(-260)—>T, TLR-2 Arg(-753)—>GIy, TLR-4 Asp(-299)-+G!y и TLR-6 Ser(-249HPro, выбранных в качестве генетических маркеров воспаления в пародонте, уровень экспрессии которых может служить «тестом», обосновывающим прогноз заболевания (Патент на изобретение №2397707 от 05.12.2008. В соавт. с И.Л. Горбуновой, A.B. Кононовым, Е.Г. Поморгайло, А.Г. Ромашенко, В.Б. Недосеко. «Способ оценки интенсивности реакции воспаления у больных хроническим пародонтитом»).

С помощью предлагаемых маркеров иммунологической реактивности полости рта ([g А, ФИ, ИЗФ, ЦИК) представляется возможным выделение лиц, имеющих нарушения в клеточном и гуморальном звеньях иммунитета в «группу риска» по развитию/прогрессированию пародонтита.

Дополнительным тестом, определяющим индивидуальное критическое состояние прогрессирования болезни, является определение уровня остеопротегерина в сыворотке крови.

Экономическая эффективность исследования заключается в том, что позволяет диагностировать воспаление в пародонте на более ранних этапах, по сравнению с данными общеизвестных клинических индексов (PMA, SBI, PI, КП) и определяет целесообразность назначения дорогостоящих лечебных мероприятий применительно к конкретному пациенту.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 201 странице компьютерного текста, иллюстрирована 65 таблицами и 23 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследования, глав собственных исследований, обсуждения результатов исследования, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Библиографический указатель содержит 285 литературных источников, из которых 102 отечественных и 183 иностранных.

Проведённая работа является частью комплексной темы «Региональные особенности эпидемиологии, прогнозирования, профилактики и лечения стоматологических заболеваний у жителей Сибири».

Номер государственной регистрации 01.2.00107673

Внедрение результатов в практику. По основным результатам исследования получен Патент на изобретение №2397707 от 05.12.2008. «Способ оценки интенсивности реакции воспаления у больных хроническим пародонтитом». Результаты исследования внедрены в учебно-педагогический процесс кафедр стоматологии ЦПДО, терапевтической стоматологии ГОУ ВПО ОмГМА, используются в лечебном процессе терапевтических отделений МУЗ «ГСП №4 «ЛюксДент» г. Омска, включен в спектр лабораторных исследований АЦЛД ГОУ ВПО ОмГМА Минздравсоцразвития России.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на XV и XVI Международных симпозиумах-выставках «Новые материалы и оборудование, технологии их применения в стоматологической практике» (Омск, 2009;2010); на IV Сибирском конгрессе «Стоматология- и челюстно-лицевая хирургия» и Всероссийском Симпозиуме «Новые технологии в стоматологии» (Новосибирск, 2009); на межрегиональной научно-практической конференции «Инновационные технологии диагностики и лечения в здравоохранении», посвященной 45-летию Центральной научно-исследовательской лаборатории (Омск, 2009); на Международном конгрессе по пародонтологии «Новые направления научных и клинических исследований в области пародонтологии» (Москва, 2011); на Международной научно-клинической конференции «Актуальные вопросы теории и практики пародонтологии» (Москва, 2011); на совместном заседании кафедр терапевтической, ортопедической, хирургической стоматологии и стоматологии детского возраста Г'ОУ ВПО ОмГМА Минздравсоцразвития России (2011).

Публикация. По материалам диссертации получен Патент на изобретение №2397707 от 05.12.2008 «Способ оценки интенсивности реакции воспаления у больных хроническим пародонтитом», опубликовано 10 научных работ, из которых 3 - в журналах (Перечень ВАК РФ), 2 методические рекомендации: «Особенности течения хронического генерализованного пародонтита при различном «генетическом профиле» организма» и «Клиническое значение определения уровня остеопротегерина в сыворотке крови больных хроническим генерализованным пародонтитом».

На защиту выносятся следующие основные положения:

1. В диагностических и прогностических аспектах хронического генерализованного пародонтита гены, кодирующие провоспалительные цитокины TNF-ct G(-308)—А, IL-ф С(-511)—'Т, IL-2 T(-330)-+G, IL-6 G(-174)—>С, IL-8 А(-251)—>Т, а также рецепторы CD14 С(-260)—Т, TLR-2 Arg(-753)—G!y, TLR-4 Asp(-299)-Gly и TLR-6 Ser(-249)-»Pro в виде мутаитных аллелей G/G, Т/Т, соответствуют тяжёлому течению заболевания.

2. Хронический генерализованный пародонтит сопровождается изменениями состояния неспецифической резистентности десневой жидкости, а именно нарушениями как гуморального, так и клеточного звеньев местного иммунитета Количество остеопротегерина в крови является метаболическим маркером воспаления в тканях пародонта.

3. Совокупность клинических данных, иммунологических показателей десневой жидкости и особенностей генетического полиморфизма больных хроническим генерализованным пародонтитом целесообразно учитывать при составлении индивидуального плана диагностических, лечебных и профилактических мероприятий.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования. Исследование одобрено этическим комитетом Омской государственной медицинской академии и проведено в дизайне открытого, одноцентрового, стратифицированного, контролируемого, проспективного, поперечного кросс-секционного, сравнительного с формированием когорты из 131 человека с клиническими признаками хронического генерализованного пародонтита, из которых 68 мужчин и 63 женщины в возрасте 25-60 (48±1,2) лет европеоидной расы. Группы наблюдения сформированы с учётом степени тяжести ХГП: 42 человека имели признаки ХГПЛС (19 мужчин и 23 женщины); 45 человек - ХГПСС (23 мужчины и 22 женщины); 44 человека - ХГПТС (26 мужчин и 18 женщин). Распределение обследуемых по возрастным группам осуществлялось согласно Международной статистической классификации возрастов человека, рекомендованной Европейским региональным бюро Всемирной Организации Здравоохранения для международных сравнений 10-го пересмотра по распределению обследованного контингента в медико-биологических исследованиях (Женева, 1995). Предварительно у всех обследованных было получено письменное информированное согласие на участие в исследовании. Группа сравнения представлена пациентами с отсутствием клинических признаков пародонтита аналогичного возраста - 104 человека (56 мужчин и 48 женщин). Всего было обследовано 235 человек. При определении необходимого объёма выборки использовался расчёт по формуле Лера (R. Lehr, 1992) относительно основных переменных интереса, согласно которой минимально достаточное число пациентов в исследовании равно 41 в каждой группе.

Стоматологическое обследование пациентов проводили по схеме, предложенной А.И. Грудяновым и А.И. Ерохиным (1997) с углубленным изучением анамнестических данных, клиники, условий труда и быта, гигиены полости рта, вредных привычек. Стоматологическое обследование проводилось по двум исследовательским точкам: на момент первичного осмотра и по истечении одного года динамического наблюдения.

При объективном исследовании больных хроническим генерализованным пародонтитом воспалительный процесс был классифицирован по следующим признакам: гиперемия; отёчность; кровоточивость. Для клинической части основными переменными интереса являлись показатели РМА и индекса кровоточивости SBI.

Изучение местной иммунологической реактивности тканей пародонта предполагало определение в десневой жидкости иммуноглобулинов классов G, А, М; клеточного (CD-3, CD-4, CD-8, ЦИК, ИРИ) и фагоцитарного (процент фагоцитоза, ФИ, ИЗФ) звеньев . У всех пациентов дополнительно было определено количество остеопротегерина в сыворотке крови. Определение остеопротегерина осуществляли методом трёхфазного иммуноферментного анализа, тест-система компании «БиоХимМак» (Россия).

Популяционньгй анализ предполагал выделение образцов ДНК из венозной крови больных ХГП с последующим изучением аллельного полиморфизма генов-кандидатов, участвующих в воспалительных реакциях - TNF-a, IL-lp; IL-2; IL-6; IL-8, молекулы CD-14, а также некоторых паттерн-распознающих рецепторов (TLR-2, TLR-4, TLR-6).

Статистический анализ полученных клинических и лабораторных данных выполняли с использованием ППП «STATISTICA 6.0» и SPSS 11.5 for Windows, а также с применением пакета статистических программ «Biostat».

Клиническое обследование показало, что в обследованных группах больных ХГП, факторы, отражающие клиническое состояние полости рта связаны и взаимодействуют с показателями тяжести воспалительного процесса в пародонте.

Раздел работы выполнен на базе Академического центра лабораторной диагностики (АЦДЛ) ГОУ ВПО Омской государственной медицинской академии Росздрава (заведующая - д.м.н., профессор Т.И. Долгих).

Раздел работы выполнен на базе НИИ Цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук - (директор - акад. РАН, д.б.н. H.A. Колчанов) - Сибирский научный центр, г. Новосибирск.

Дизайн исследования

Клинические:

Оценка индекоов: КПУ, КПУП, тейп прироста, OHI-S по Green, Vermillion; PMA в модификации Parnia; PI по Rassel; КП по Fucsh, SB1 по Mühlemann H.R, Son S.; подвижность зубов.

Лабораторные:

1. Определение уровня lg G, A, M в десневой жидкости;

2. Исследование параметров клеточного иммунитета в десневой жидкости (фагоцитиующей способности нейтрофатьных гранулоцигов НФ, ФИ, ЗФ. ИЗФ, ЦИК);

3. Определение уровня остеопротегерта ^ в сыворотке крови.__^

^ Молекуляр во-генетические:

Популяционный анализ: выделение ДНК; Генотип»рование полиморфизмов генов провоспалительных цитокинов (TNF-a;IL-ф; tL-2; IL-t; IL-6; IL-8) и peuem-opoeCDH hTLR (TLR-2;TLR-4; TLR-6) .Секвениоование продуктов асимметричной ПЦР соответствующих фрагментов геновTNF-a ,IL-lp, IL-2 IL-4; IL-6; IL-8, а также CDU и TLR-^реиепторов.

Первая группа

Больные ХГП в возрасте 25-45 лет: мужчин - 26 человек; женщин - 17 человек. ВСЕГО: 43 человека

Вторая группа

Больные ХПТ в возрасте 46-60 лет: мужчин - 42 человека; женщин - 46 человек. ВСЕГО: 88 человек

Группа сравнения

Пациенты без клинических признаков пародонтнта мужчин - 56 человек; женщин - 48 человек. ВСЕГО: 104 человека

^ I

ИТОГО: 235 человек

в возрасте or 25 до 60 лег мужчин - 124 человека; женщин - И ¡человек.

Статистические:

Проверка нормальности распределения случайной величины проводилась в модуле Basic Statistics программы Statistica 6.0. Оценка критерия jf с помощью компьютерной программы SPSS 11.5 for Windows; критерия Вальда-Вольфовица, U-критерия Манна-Уигни, Н-кркгерияКраскеяла-Уоллиса с использованием ППП Statistica 6.0. в модуле «Непараметрические данные». t-критерия Стьюдента с поправкой Бонферони, Z-кригерия знаков и Т-критерия Вилкохсона парных сравнений (Wilcocxon Matched Pairs Test) - с использованием ППП SPSS 12.0 и StatSoft Statistica 6.0 for Windows.

Коэффициента корреляции Пирсона, ранговой корреляции Спирмена.

Отдалённые результаты наблюдения больных ХГП позволили выявить объективные признаки активного воспаления у 105 человек, что составило 80,2% от числа обследованных больных. Кроме того, когорта больных ХГП в возрасте 25-60 лет разделилась на две подгруппы: первую подгруппу составили лица, имеющие на момент повторного обследования ту же степень тяжести, что и при первичном осмотре; во вторую подгруппу вошли пациенты, у которых степень воспалительных изменений в пародонте трансформировалась в более тяжёлую форму, что подтверждалось клиническими индексами Р1 и КП (табл. 1).

Сравнительным лабораторным исследованием уровня ОРС в сыворотке крови больных ХГП различной степени тяжести было отмечено статистически значимое снижение его концентрации по мере прогрессировав^ деструктивного процесса в пародонте (рис. 1). При изучении корреляционных связей между количеством ОРО и степенью тяжести пародонтита, выражаемой посредством индекса Р1, выявлена отрицательная корреляция: чем тяжелее степень воспаления в пародонте, тем ниже уровень ОРО в сыворотке крови больных.

В результате анализа состояния местного иммунитета десневой жидкости больных ХГП в сопоставлении с клиническими проявлениями заболевания, удалось установить статистически значимое повышение содержания в десневой жидкости больных пародонтитом ^ в, а также снижение уровня М по сравнению с лицами без клинически выраженных признаков воспаления в тканях пародонта (табл. 2).

Рис. 1. Количество остеопротегерина (пмоль/л) в сыворотке крови больных пародонтитом различных степеней тяжести.

Сравнительная характеристика основных показателей состояния органов и тканей полости рта

Больпые ХГП Кол-во чел. (•/.) Р1 (балл) КП (балл)

25-45 лет 1-я контрольная точка Легкая степень тяжести 14 33,6 3,И±0,69 0,85±0,07

Средняя степень тяжести 15 34,2 3,96±0,74, р<0,05 0,66±0,12, р<0,01

Тяжёлая степень 15 34,2 6,23±0,63, р<0,01; р|<0,01 0,44±0,03, р<0,01; р|<0,001

2-я контрольная точка Лёгкая степень тяжести 2 22,4 3,38±0,72 0,79±0,04

Средняя степень тяжести 13 30,7 5,16±0,69 р<0,05; р2<0,05 0,61 ±0,13

Тяжёлая степень 29 46,8 6,11±0,73 р<0,0! 0,33±0,16 р<0,0!; р[<0,0;

46-60 лет 1-я контрольная точка Лёгкая степень тяжести 28 31,8 3,31±0,43 0,82±0,09

Средняя степень тяжести 30 34,1 4,23±0.52, р<0,05 0,56±0,11, р<0,01

Тяжёлая степень 29 33,9 7,01 ±0,78, р<0,01; Р|<0,01 0,40±0,08, р<0,001; р) <0,001

2-я контрольная точка Лёгкая степень тяжести 7 10,! 3,51±0,57 0,76±0,14

Средняя степень тяжести 25 36,2 5,87±0,94 р<0,01;р2<0,05 0,64±0,18 р<0,05

Тяжелая степень 37 53,6 7,23±0,82, р<0,01; р,<0,01 0,31 ±0,09 р<0,01;р!<0,01

Примечание: В таблице указаны только статистически значимые различия; коэффициент значимости р рассчитан по отношению к соответствующему показателю в группе больных ХГП лёгкой степени; коэффициент значимости рг рассчитан по отношению к соответствующему показателю в группе больных ХГП средней степени тяжести; коэффициент значимости р2 рассчитан по отношению к фоновому показателю в группе больных ХГП данной возрастной группы и соответствующей степени тяжести.

Содержание уровня иммуноглобулинов в десиевой жидкости больных ХГП и пациентов группы сравнения (г/л)

Группы наблюдения Количество обследованн ых (абс.числ) Н А 1«М

Больные ХГП 131 13,33±0,56, р<0,01 1,84±0,03 0,62±0,01 р<0,01

Группа сравнения 104 8,02±0,49 1,73±0,08 1,21±0,01

Примечание: В таблице представлены только статистически значимые различия;

р - значимость рассчитана по отношению к аналогичному показателю пациентов группы сравнения.

При ХГП наблюдается напряжение клеточного звена иммунитета (статистически значимое снижение количества СО-З и СО-4 лимфоцитов, увеличение количества СО-8 лимфоцитов, и, как следствие, изменение иммунорегуляторного индекса по отношению к пациентам группы сравнения (табл. 3).

Таблица 3

Показатели иммунокомпетентных клеток больных ХГП и пациентов группы сравнения (М+т)_

Группы наблюдения С1)-3 (%) СО-4 (%) СБ-8 (%) ИРИ (отн. ед.)

Больные ХГП п=131 17,00± 1,05 р<0,001 18,00±1,16 р<0,001 35,00±0,37 р<0,05 0,62±0,06 р<0,001

Группа сравнения п=104 53,00±1,37 49,00±1,60 22,00±0,29 1,78±0,09

Примечание: В таблице представлены только статистически значимые различия;

р - значимость рассчитана по отношению к аналогичному показателю пациентов группы сравнения.

При этом отмечено, что с увеличением степени тяжести воспаления в пародонте повышается уровень в в десневой жидкости и снижаются А и ^ М, а также значительно увеличивается количество циркулирующих иммунных комплексов и снижается количество иммунокомпетентных лимфоцитов. Кроме того, у больных ХГП по мере прогрессирования степени тяжести процесса снижаются все остальные показатели фагоцитарной активности иммунокомпетентных клеток: фагоцитарный индекс, индекс завершённости фагоцитоза, что свидетельствует о нарушении функции фагоцитов и несостоятельности всей фагоцитарной системы больных. При этом показатели ^ А, ФИ, ИЗФ и ЦИК в десневой жидкости обладают наибольшей

чувствительностью, специфичностью и прогностичностыо положительного результата при оценке характера течения воспаления в пародонте.

В группе больных хроническим генерализованным народонтитом тяжёлой степени установлена сильная корреляционная связь между количеством (g А и индексом PI, повышением количества ЦИК в десневой жидкости и показателями индексов PI и PMA, а также между показателями фагоцитарной активности иммунокомпетентиых клеток и значениями индексов кровоточивости, РМА и Pl. В ходе динамического наблюдения, осуществляемого в течение одного года, было выявлено, что у тех больных, у которых степень тяжести воспаления трансформировалась в более тяжёлую, отмечалось снижение концентрации 1g А, увеличение количества циркулирующих иммунных комплексов, снижение значений фагоцитарного индекса и индекса завершённости фагоцитоза. Установлено, что при таких изменениях в десневой жидкости вероятность прогрессирования воспаления составляет 41% при выявлении совокупности таких факторов, как: низкий уровень гигиены полости рта, определённый состав микрофлоры, свойства десневой жидкости, анатомические предпосылки, заключающиеся в мелком преддверии и низком прикреплении уздечек, несанированная полость рта (наличие кариозных полостей).

Уровни тканевой реактивности закреплены генетически, следовательно, определяющее значение имеет полиморфизм генов, кодирующих экспрессию факторов неспецифической резистентности (рецепторов, сорбирующих бактерии, системы макрофагальных клеток, цитокинов и рецепторов к цитокинам). Среди возможных кандидатов на роль генов, регулирующих реакцию воспаления при хроническом генерализованном пародонтите, нами выбраны следующие полиморфизмы: TNF-a G(-308)—»A, IL-ip С(-511)—>Т, IL-2 Т(-ЗЗО)—>G, IL-6 G(-174)—»С и IL-8 А(-251)—»Т. Способ оценки интенсивности воспаления у больных хроническим пародонтитом осуществлён по авторской методике.

В ходе проведённого исследования было установлено, что больший процент больных ХГП являются носителями генотипов «G/G» гена TNF-а при G(-308)—>А, «Т/Т» гена IL-if] при C(-5U)-»T, «G/G» гена IL-2 при T(-330)-*G, G/G гена IL-6 G(-174)—»С и Т/Т гена IL-8 А(-251)-»'Т, что обусловливает тяжёлое течение воспаления в пародонте. Корреляционный анализ позволил установить клинические эквиваленты этих ассоциаций, атрибутированные посредством общепринятой индексной оценки. Выявлено, что у носителей этих генотипов обострения возникали в 5,3 раза чаще, что выражалось в увеличении значений PMA, SBI и Pl. Наличие гомозиготных вариантов генов TNF-a, интерлейкинов ip, 2, 6 и 8 определялось в 8,5 раза чаще у больных хроническим пародонтитом, у которых после 1 года наблюдения течение пародонтита трансформировалось в более тяжёлую степень, что было подтверждено клинически. При ранжировании больных по тяжести течения воспаления отмечалось, что носительство данных генотипов, а также их сочетаний, чаще встречалось среди больных со средней и тяжёлой степенями течения пародонтита.

Анализ полиморфизма молекул TLR-2 Arg(-753)-*Gly; TLR-4 Asp(-299)~>GIy, TLR-6 Ser(-249)—Pro и CD14 C(-260)->T - рецепторов при ХГП выявил значительное преобладание полиморфизмов 1/1 и 1/2 генов TLR-2 Arg(-753)—Gly; TLR-4 Asp(-299)->Gly и TLR-6 Ser(-249)—Pro. Были установлены ассоциации данных полиморфизмов с клиническими параметрами, отражающими более высокие значения основных показателей воспаления в пародонте. Выявлено, что частота встречаемости 1/1 и 1/2 генотипов генов TLR-2 Arg(-753)->Gly; TLR-4 Asp(-299)-+Gly и TLR-6 Ser(-249)—Pro сопряжена с повышенными значениями индексов РМА и SBI (табл. 4). Полиморфизм 2/2 ассоциирован с повышенными значениями указанных индексов только при генотипировании по TLR-2 Arg(-753)—>Gly. Анализ полученных результатов показал, что пациенты с полиморфизмами 1/1 и 1/2 генов TLR-2 Arg(-753)->Gly; TLR-4 Asp(-299)-GIy и TLR-6 Ser(-249)-»Pro имеют более высокие значения основных показателей воспаления в пародонте. Представленные данные свидетельствуют о влиянии полиморфизмов 1/1 и 1/2 генов TLR-2 Arg(-753)—Gly; TLR-4 Asp(-299)-»Gly и TLR-6 Ser(-249)-*Pro на фенотипические проявления ХГП. Наибольшее количество больных ХГП имело сочетание полиморфизмов 1/1 генов TLR-2, TLR-4 и TLR-6 (97,4%). Комбинация 1/1 TLR-2 + 1/1 TLR-4 + 1/2 TLR-6 наблюдалась у 68,7% больных ХГП. Вариант 1/1 TLR-2 + 1/2 TLR-4 + 1/1 TLR-6 имел место у 54,3% больных ХГП. Больные ХГП, являющиеся носителями 1/1 TLR-2 + 1/2 TLR-4 + 1/2 TLR-6, встречались в 47,1 %. Наименьшее количество больных ХГП имело сочетание генотипов 1/2 TLR-2 + 1/1 TLR-4 + 1/1 TLR-6 (38,2%). Пациенты с комбинацией 1/2 TLR-2 + 1/2 TLR-4 + 1/2 TLR-6 были обнаружены лишь 2,3% и не имели статистически значимой разницы с популяционным контролем. У больных ХГП, имеющих по истечении 1 года наблюдения клинические и рентгенологические данные, подтверждающие трансформацию степени тяжести воспаления, отмечается сочетание генотипов 1/1 TLR-2 + 1/1 TLR-4 + 1/1 TLR-6. У больных ХГП, у которых степень тяжести воспаления в пародонте осталась неизменной, подобного сочетания не выявлено ни в одном случае.

Результаты исследования свидетельствуют о клинической информативности полиморфизма экспрессии гена CD 14 С(-260)—>Т в формировании генетической предрасположенности к пародонтиту у больных различного пола и возраста. Так, в группе женщин, больных ХГП, отмечается статистически значимое (р<0,01) увеличение частоты гомозиготных полиморфизмов Т/Т и С/С аллельного варианта С(-260)—>Т по сравнению с аналогичным показателем у женщин группы сравнения (примерно в 2 раза), а частота гетерозиготного полиморфизма С/Т у больных ХГП, напротив, значимо (р<0,0001) снижается. В группе мужчин отмечается статистически значимое (р<0,001) повышение частот генотипов С/Т и С/С.

Таблица 4.

Ассоциации полиморфизмов генов TLR-2 Arg(-753)-*Gly; TLR-4 Asp(-299)->Gly и TLR-6 Ser(-249)-»Pro с клиническими показателями состояния тканей пародонта у больных XI11

Некоторые клинические показатели состояния тканей пародонта Toll-like - рецепторы

TLR-2 (п=97) TLR-4 (п= 117) TLR-6 (п=124)

1/1 (п=62) 1/2 (п=21) 2/2 (п=14) 1/1 (п=74) 1/2 (п=33) 2/2 (п=10) 1/1 (п=79) 1/2 (п=32) 2/2 (п=13)

Индекс РМА (%) 42,17±9,96 32,56±7,39 37,34±9,71, 37,19±8,24 33,25±8,85 11,47±6,58, р<0,001 39,43±6,16 40,66±7,22 9,55±6,13, р<0,001

Индекс кровоточивости (балл) 2,94±0,33 2,69±0,26 2,08±0,41 1,98±0,12 2,06±0,21 0,35±0,07, р<0,001 1,67±0,18 1,88±0,10 0,26±0,04, р<0,001

Индекс PI (балл) 4,28±0,51 3,99±0,35 3,09±0,16 3,65±0,32 3,19±0,24 2,81±0,27 3,87±0,29 3,61 ¿0,14 1,94±0,12 р<0,05

КП Fucsh (балл) 0,59±0,04 0,38±0.05 0,46±0,09 0,64±0,02 0,43±0,08 0,55±0,04 0,43±0,07 0,48±0,03 0,42±0,06

Примечание: Для ТЬЯ-2: 1/1 - А^753Аг§; 12 - А^ЗСТу; 22 - ау75301у;

Для ТЬЯ-4: 11 - Азр299Азр; 12 - Азр29901у; 22 - ау29901у; Для ТЬЯ-б: 11 - 5ег2498ег; 12 - 5ег249Рго; 22 - Рго249Рго. Коэффициент значимости р- рассчитан по отношению к гомозиготному (2/2) полиморфизму гена ТЬК-2.

Клинические сопоставления полиморфизмов генов-кандидатов воспалительной реакции с показателями местного иммунитета полости рта позволили установить, что носительство указанных генотипов, а также их сочетаний обусловливает тяжёлое течение воспаления в пародонте. Так, у носителей гомозиготных полиморфизмов G/G генов TNF-a в позиции 308 и IL-2 в позиции 330 отмечалось статистически значимое (р<0,001) повышение уровня Ig G по отношению к пациентам с клинически интактным пародонтом. Максимальное увеличение титра [g G в десневой жидкости больных пародонтитом отмечается у носителей полиморфизма «Т/Т» гена IL-ip в позиции 511, а средний уровень Ig А у носителей полиморфизма был значимо (р<0,001) ниже аналогичного показателя лиц группы сравнения. Также было установлено, что в группе больных ХГП у носителей гомозиготных по нормальному аллелю и гетерозиготоных полиморфизмов toll-подобных рецепторов 2, 4 и 6, отмечается повышение уровня Ig G и снижение уровня Ig А по сравнению с лицами группы сравнения. При этом, было выявлено, что большинство людей, имеющих клинические и рентгенологические признаки пародонтита, в совокупности с повышенным содержанием в десневой жидкости Ig G и пониженном содержании Ig А в 75% имеют сочетание гомозиготных и гетерозиготного генотипов генов toll-лайк рецепторов 2, 4 и 6. У лиц группы сравнения подобное сочетание не встречалось. При сопоставлении экспрессии молекулы CD14 с уровнем иммуноглобулинов в десневой жидкости больных ХГП было установлено, что у больных ХГП, имеющих повышенное содержание Ig G в десневой жидкости отмечается статистически значимое (р<0,001) увеличение частоты полиморфизма С/С гена CD14 при С(-260)-*Т по сравнению с популяционным контролем. Кроме того, было установлено, что у больных ХГП, являющихся носителями гетерозиготного по мутантному аллелю генотипа Т/Т гена CD 14 при С(-260)->Т, отмечается статистически значимое (р<0,001) пониженное содержание Ig M в десневой жидкости. Наличие гомозиготного варианта Т/Т гена CD 14 при С(-2б0)->Т определялось в 6,9 раз чаще у больных ХГП, у которых через год наблюдения течение ХГП трансформировалось в более тяжёлую степень, что было подтверждено клинически.

При наблюдении больных ХГП было установлено, что наличие рецидивов заболевания и интенсивность воспалительного процесса в тканях пародонта, зависят от сочетания полиморфизмов генов, контролирующих воспалительную реакцию, следовательно, объём и кратность лечебных мероприятий целесообразно назначать в соответствии с «генетическим профилем» организма.

При наличии в крови пациентов полиморфизмов «А/А» гена TNF-a при G(-308)—* А, «ОС» гена IL-lp при С(-511)->Т, «Т/Т» гена IL-2 при T(-330)-G, С/С гена IL-6 G(-174)-»C и А/А гена IL-8 А(-251)->Т в сочетании с вариантом 2/2 TLR-2 Arg(-753)—>Gly; TLR-4 Asp(-299)-*Gly и TLR-6 Ser(-249)-> Pro отмечались наилучшие значения индексов PMA, SBI, PI и КП по Fucsh. Уровень OPG в крови этих больных достигал максимальных цифр и составлял от 8,000 пмоль/л до 11,999 пмоль/л. Среди представителей этой группы

встречались лица без клинически выраженных признаков воспаления в пародонте, а также больные ХГ'ПЛС. При этом, даже при наличии таких факторов, как ортопедические конструкции в полости рта, несостоятельность пломб при хорошем уровне гигиены, в динамике наблюдения обострения заболевания у больных ХГПЛС не фиксировались. Пациенты активно приглашались врачом на диспансерный осмотр 2 раза в год. Объём проведённых лечебных мероприятий сводился при этом к снятию назубных отложений, консультациям по выбору зубных щёток и паст, а также назначению курса орошений 0,05% р-ра Хлоргексидина биглюконата №10, инсталляций Метрогил Дента №10 на 20 минут. У представителей данной группы отмечались нормальные показатели местного иммунитета полости рта IgA, ЦИК, ФИ, ИЗФ. Указанный «генетический профиль» определён как низкий риск развития/прогрессирования ХГП.

Преобладание гетерозиготных вариантов указанных генов статистически значимо чаще фиксировался у больных ХГПСС по сравнению с больными ХГПЛС и лицами без клинически выявленных признаков воспаления в пародонте, что подтверждалось клиническими индексами (PMA, SBI, PI и КП по Fucsh). Уровень OPG в крови был в пределах от 3,000 пмоль/л до 7,999 пмоль/л. У больных этой группы отмечались изменения значений показателей местного иммунитета полости рта IgA, ЦИК, ФИ, ИЗФ при удовлетворительном уровне гигиены полости рта и наличии «факторов риска» развития ХГП: курение, патология прикуса, ортопедические конструкции. Количество обращений за стоматологической помощью у этих больных в среднем составило 3,96 раз в год. Основными жалобами, послужившими поводом для обращения к врачу при этом были кровоточивость, отёк, зуд дёсен, а также неприятный запах изо рта. Объём проводимого лечения таким больным включал в себя обучение гигиене полости рта с подбором гигиенических средств (щётка, паста, ополаскиватели, ершики, флоссы) с обязательным контролем гигиенических навыков; снятие назубных отложений; противовоспалительная терапия - орошение пародонтальных карманов 0,05% р-ром Хлоргексидина биглюконата, аппликации р-ром Ваготила или Ортохрома, аппликации 0,05% р-ра Хлоргексидина биглюконата в сочетании с табл. Метроиидазола 0,25 №10 на 20 минут, фиксации дипленовых плёнок с Хлоргексидином, втирание геля «Метрогил Дснта» в дёсны №10 - 2 раза в день, назначения препаратов линейки «Асепта» (гель, бальзам, ополаскиватель). По показаниям назначалась обработка пародонтальных карманов аппаратом «Vector», антибиотикотерапия. Наличие гетерозиготных вариантов полиморфизмов изученных генов определялся как «генетический профиль» со средней степенью риска развития/прогрессирования ХГП.

При носительстве генотипов «G/G» гена TNF-a при G(-308)—»А, «Т/Т» гена IL-ip при С(-511)—>Т, «G/G» гена IL-2 при Т(-ЗЗО)—>G, G/G гена IL-6 G(-174)—»С и Т/Т гена IL-8 А(-251)—Т, 1/1 TLR-2 Arg(-753)->Gly; TLR-4 Asp(-299)—»Gly и TLR-6 Ser(-249)-»Pro пациенты обращались за стоматологической помощью от 4,01 до 7,49 раз в год. При этом в данной группе значительно преобладали лица с ХГПТС по сравнению с лицами с ХГПЛС и ХГПСС, что

подтверждается сопоставлениями клинических индексов, характеризующих состояние пародонта (PMA, SBI, PI и КП по Fucsh). Наиболее частыми жалобами были подвижность зубов, неприятный запах изо рта, кровоточивость дёсен, выделение гноя из пародонтальных карманов при надавливании на десну. Следует отметить, что лица с клинически интактным пародонтом в данной группе не встречались. Уровень OPG в крови находился в пределах от 1,000 пмоль/л до 2,999 пмоль/л. У пациентов фиксировался плохой уровень гигиены полости рта, смещение и подвижность зубов, гноетечение из пародонтальных карманов. Отмечалось значительное изменение показателей местного иммунитета полости рта IgA, ЦИК, ФИ, ИЗФ. Объём консервативной терапии, этой группы пациентов, соответствовал таковому для больных со средней степенью риска развития/прогрессирования ХГП, однако увеличивалась кратность назначаемых процедур. Хирургический этап лечения больных ХГПТС, помимо удаления зубов, не представляющих функциональной ценности, включал в себя кюретаж пародонтальных карманов с подсадкой в рану остеотропных веществ («Коллапан», БТП). Ортопедический этап лечения предполагал восстановление функциональной ценности сохранённых зубов (шинирование, избирательная пришлифовка) и замещение дефектов зубных рядов. Носительство полиморфизмов «G/G» гена TNF-a при G(-308)—>А, «Т/Т» гена IL-ip при С(-511)—Т, «G/G» гена IL-2 при Т(-ЗЗО)—G, G/G гена ÏL-6 G(-174)—»С и Т/Т гена IL-8 А(-251)—Т, 1/1 TLR-2 Arg(-753)->Gly; TLR-4 Asp(-299)-»Gly и TLR-6 Ser(-249)—>Pro характеризовалось как неблагоприятный «генетический профиль» с высоким риском прогрессирования ХГП.

Указанные корреляции между генетическим статусом пациента и течением ХГП перспективны для персонификации объёма и кратности лечебных и профилактических мероприятий при мониторинге больных, а также скрининговых обследованиях населения.

ВЫВОДЫ

1. При хроническом генерализованном пародонтите различных степеней тяжести установлены взаимосвязь и взаимозависимость динамических индексов (OHI-S, PMA, SBI) с индексами, отражающими деструктивные процессы в тканях пародонта (PI и КГ1). У больных хроническим генерализованным пародонтитом с трансформацией степени тяжести заболевания имеется корреляционная связь между глубиной поражений тканей пародонта и количеством остеопротегерина в крови.

2. В десневой жидкости лиц с хроническим генерализованным пародонтитом выявлены нарушения как гуморального, так и клеточного звеньев иммунитета полости рта: отмечается повышение содержания иммуноглобулина G, снижение иммуноглобулина М, снижение количества CD-3 и CD-4 лимфоцитов, увеличение количества CD-8 лимфоцитов, снижение иммунорегуляторного индекса, увеличение циркулирующих иммунных комплексов1 снижение фагоцитарного индекса и индекса завершённости фагоцитоза по сравнению с показателями лиц, без клинически выраженных

признаков воспаления в тканях пародонта. Трансформация степени тяжести хронического генерализованного пародонтита ассоциируется со снижением концентрации иммуноглобулина А, увеличением циркулирующих иммунных комплексов, снижением фагоцитарного индекса и индекса завершённости фагоцитоза.

3. У больных хроническим генерализованным пародонтитом установлены ассоциации клинических показателей тяжести воспаления в пародонте с полиморфизмами генов-кандидатов провоспалительных цитокинов TNF-a G(-308)—»A, IL-ip С(-511 )—+Т, IL-2 Т(-330)—>G, IL-6 G(-174)—C, IL-8 А(-251)->Т. При генотипах «G/G» гена TNF-а, «Т/Т» гена IL-ip, «G/G» гена IL-2, «G/G» гена IL-6 и «Т/Т» гена IL-8 в течение года наблюдения увеличиваются значения показателей индексов PMA, SBI, PI и КП по Fucsh. Трансформация степени тяжести пародонтита зависит от состояния рецепторного аппарата макрофагов и чаще отмечается у носителей 1/1 и 1/2 TLR-2; TLR-4 и TLR-6 и Т/Т CD14 С(-260)—Т.

4. При хроническом генерализованном пародонтите установлены ассоциации снижения концентрации иммуноглобулина А, увеличения циркулирующих иммунных комплексов, снижения значений фагоцитарного индекса и индекса завершённости фагоцитоза в десневой жидкости с носительством генотипов «G/G» гена TNF-a, «Т/Т» гена IL-lp, «G/G» гена IL-2, «G/G» гена IL-6 и «Т/Т» гена IL-8, 1/1 и 1/2 TLR-2; TLR-4 и TLR-6 и Т/Т CD14 С(-260)—»Т - рецепторов, а также сочетаний вариантов указанных полиморфизмов. Уровень остеонротегерина у больных ХГП находится в прямой зависимости от экспрессии генов TNF-a, IL-ip, IL-2, IL-6 и IL-8, a также состояния рецепторного аппарата макрофагов CD14, TLR-2; TLR-4 и TLR-6. Получены положительные корреляции между уровнем OPG в крови и показателями иммуноглобулина А, циркулирующих иммунных комплексов и индекса завершённости фагоцитоза в десневой жидкости.

5. Неблагоприятный «генетический профиль» у больных хроническим генерализованным пародонтитом является иммуно-опосредованной причиной более продолжительного воспалительного ответа и частых рецидивов заболевания в отдалённые сроки после противовоспалительного лечения, что подтверждается значением общеизвестных клинических индексов, характеризующих состояние тканей пародонта - PMA, SBI, PI, КП, и некоторыми иммунологическими показателями десневой жидкости иммуноглобулина А, циркулирующих иммунных комплексов, фагоцитарного индекса, индекса завершённости фагоцитоза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

1. Для персонифицированного подхода в диагностике, лечении и профилактике хронического генерализованного пародонтита необходимо проведение комплексной клинико-лабораторной оценки состояния полости рта с обязательным определением уровня остеопротегерина в сыворотке крови, полиморфизмов генов TNF-a G(-308)—»A, IL-ip С(-51 [)—Т, IL-2 Т(-ЗЗО)—»G, 1L-6 G(-174)->C, IL-8 А(-251)—Т; CD14 С(-260)—Т, TLR-2 Arg(-753)—>Gly, TLR-4 Asp(-299)->Gly и TLR-6 Ser(-249)—»Pro, а также уровня Ig А, показателей ЦИК, ФИ и ИЗФ в десневой жидкости.

2. При выявлении благоприятного «генетического профиля» при хроническом генерализованном пародонтите для предупреждения рецидивов заболевания и профилактики его прогрессирования необходимо соблюдение пациентом гигиенических норм и проведение профессиональной гигиены полости рта (снятие назубных отложений) не реже двух раз в год. При этом объём консервативных вмешательств должен обязательно включать в себя комплекс противовоспалительных мероприятий (аппликации, орошения, инсталляции в пародонтальные карманы, местную антибактериальную терапию). При выявлении неблагоприятного «генетического профиля» при хроническом генерализованном пародонтите для предупреждения рецидивов заболевания и профилактики его прогрессирования указанные консервативные мероприятия необходимо проводить не реже четырёх раз в год.

Научные работы, опубликованные по теме диссертации

1. Способ оценки интенсивности реакции воспаления у больных хроническим пародонтитом: пат. 2397707 Рос. Федерация: МПК С1 А 61В 10/00, С 12Q1/68 / Горбунова И.Л., Кононов A.B., Поморгайло Е.Г., Ромащенко А.Г., Недосеко В.Б., Вишнягова H.A.; заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО ОмГМА Федерального агентства по здравоохр. и соц. развитию; заявл. 05.12.2008; опубл. 27.08.20010.

2. Гормональная регуляция уровня остеопротегерина в крови больных хроническим генерализованным пародонтитом / ИЛ. Горбунова, С.Б. Путинцев, H.A. Вишнягова, И.Р. Хришпенс II Институт стоматологии. - 2008.—№ 4. - С. 58-59.

3. Горбунова И.Л. Критерии ранней диагностики пародонтита до этапа клинических проявлений патологии I ИЛ. Горбунова, H.A. Вишнягова // Маэстро стоматологии. - 2009. -№1 (33). - С.22-26.

4. Вишнягова H.A. Влияние продукции TNF-a на показатели тканевой резистентности полости рта при хроническом

генерализованном пародонтите / H.A. Вишиягова, ИЛ. Горбунова // Сибирское медицинское обозрение. - 2009. - №6 (60). - С.45-48.

5. Вишиягова H.A. Особенности основных показателей состояния местного иммунитета полости рта больных хроническим генерализованным пародонтитом различной степени тяжести / H.A. Вишнягова // Материалы IV Сибирского конгресса «Стоматологи и челюстно-лицевая хирургия» и Всероссийского Симпозиума «Новые технологии в стоматологии». - Новосибирск, 2009. - С.33-38.

6. Горбунова И.Л. Особенности нарушений костного метаболизма у больных хроническим пародонтитом / И.Л. Горбунова, Т.В. При-гыкина, H.A. Вишнягова // Материалы межрегиональной научно-практической конференции «Инновационные технологии диагностики и лечения в здравоохранении». К 45-летию Центральной научно-исследовательской лаборатории. - Омский научный вестник. - 2009. -№1 (84). — С.101—102.

7. Вишнягова H.A. Влияние TNF-альфа и интерлейкина-1 бета на процесс ремоделирования костной ткани при хроническом генерализованном пародонтите / H.A. Вишнягова // Материалы межрегиональной научно-практической конференции «Инновационные технологии диагностики и лечения в здравоохранении». К 45-летию Центральной научно-исследовательской лаборатории. - Омский научный вестник. - 2009.-№1 (84).-С.98-100.

8. Вишнягова НА. О взаимосвязи полиморфизма некоторых генов-кандидатов с показателями местного иммунитета полости рта при хроническом генерализованном пародонтите / НА. Вишнягова. // Уральский медицинский журнал. - 2010. - №1 (66). - 30-33.

9. Вишнягова H.A. Экспрессия молекул TLR-2 Arg(-753)-+Gly, TLR-4 Asp(-299)—>GIy и TLR-6 Ser(-249)—»Pro - рецепторов у больных хроническим генерализованным пародонтитом / H.A. Вишнягова, И.Л. Горбунова-Маэстро стоматологии. -2011. -№1(41), 2011. - С.82-85.

10. Вишнягова H.A. Влияние однонуклеотидных полиморфных маркеров генов TLR-2, TLR-4, TLR-6, а также их сочетаний с показателями неспецифической резистентности десневой жидкости при хроническом генерализованном пародонтите / H.A. Вишнягова, И.Л. Горбунова // Маэстро стоматологии. - 2011. - №2(42), 2011. - С.84-86.

11. Вишнягова H.A. Повышение эффективности диагностики хронического пародонтита на ранних этапах течения заболевания / H.A. Вишнягова, И.Л. Горбунова // Маэстро стоматологии. - 2010.-№1 (37), 2010. - С.78-81.

12. Вишнягова H.A. Особенности течения хронического генерализованного пародонтита при различном «генетическом профиле» организма: методические рекомендации для врачей-

стоматологов, слушателей стоматологических ФУВ медицинских ВУЗов, врачей-интернов, клинических ординаторов / H.A. Вишнягова, . И.Л. Горбунова. - Омск, 2011. - 18 с.

13. Вишнягова H.A. Клиническое значение определения уровня остеопротегерина в сыворотке крови больных хроническим генерализованным пародонтитом: методические рекомендации для врачей-стоматологов, слушателей стоматологических ФУВ медицинских ВУЗов, врачей-интернов, клинических ординаторов / H.A. Вишнягова, И.Р. Хришпенс, И.Л. Горбунова - Омск, 2011. - 12 с.

ХГП - хронический генерализованный пародонтит;

ХГПЛС - хронический генерализованный пародонтит лёгкой степени тяжести; ХГПСС - хронический генерализованный пародонтит средней степени тяжести;

Xl II'1'С - хронический генерализованный пародонтит тяжёлой степени; РМА - папиллярно-маргинально-альвеолярный индекс, оценивающий степень

воспаления в разных зонах десны;, SBI - индекс кровоточивости;

PI - пародонтальный индекс, характеризующий распространенность и

интенсивность поражения тканей пародонта; КП Fuchs - костный показатель, определяющий степень резорбции костной ткани;

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;

ПЦР - полимеразная цепная реакция с индуктивно связанной плазмой;

TNF-a - фактор некроза опухоли альфа, провоспалительный цитокин;

IL - провоспалительные цитокины семейства интерлейкинов;

G/G - гомозигота по мутантному аллелю;

А/А - гомозигота по дикому аллелю;

G/A - гетерозигота;

TLRs - Толл-подобные рецепторы (разновидность патгернараспознающих

рецепторов); Ig G - иммуноглобулин G; Ig А - иммуноглобулин А; Ig M - иммуноглобулин M; ИРИ - иммунорегуляторный индекс; ИЗФ - индекс завершённости фагоцитоза; ФИ-фагоцитарный индекс; ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы; OPG - остеопротегерин; БТП - богатая тромбоцитами плазма крови;

ГКСП№1 - городская клиническая стоматологическая поликлиника №1; АЦДЛ - Академический центр лабораторной диагностики. .

Условные обозначения и сокращения

На правах рукописи

Вишнягова Наталья Александровна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ХРОНИЧЕСКОГО ГЕНЕРАЛИЗОВАННОГО ПАРОДОНТИТА (вопросы патогенеза, диагностики, лечения, профилактики)

14.01.14- Стоматология 14.03.03 - Патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Подписано к печати 01.11.2011. Формат бумаги 60x84 1/16. Печать оперативная. Гарнитура Times New Roman Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз.

Отпечатано с оригинал-макета в типографии ООО «Вариант-Омск» 644043, г. Омск, ул. Фрунзе, 1, кор, 3, оф.13. Тел./факс: 211-600.

Среди важнейших проблем современной стоматологии воспалительные заболевания пародонта занимают одно из ведущих мест [17;20;32;93;257]. В связи с этим потребность населения в пародонтологическом лечении остаётся достаточно высокой [39;90]. Актуальным аспектом практической стоматологии являются огромные экономические затраты на проведение комплексного лечения развившегося заболевания. В настоящее время отсутствуют достоверные маркеры как для оценки предрасположенности конкретного пациента к развитию пародонтита, так и для определения прогноза заболевания, четкие предикторы эффективности проведения дорогостоящих лечебных мероприятий применительно к конкретному пациенту [19;21;28;66;92;109;185]. Это затрудняет раннюю диагностику пародонтита, и как следствие, делает маловероятным проведение своевременных эффективных лечебных и профилактических мероприятий, основанных на сугубо индивидуализированном подходе. Особо следует подчеркнуть трудность прогнозирования характера течения заболевания, выявления предрасположенности/резистентности к развитию хронических форм пародонтита, отсутствие молекулярных технологий предупреждения развития осложнений, рецидивов заболевания и предупреждения перехода патологии в более тяжёлую форму.

Всё это обосновывает необходимость разработки дополнительных методов диагностики пародонтита до появления клинических признаков нозологии, индивидуальных критериев повышенного риска развития /прогрессирования заболевания.

В этом аспекте основная роль принадлежит изучению молекулярно-генетических факторов, определяющих ключевые фенотипические характеристики реактивности организма от которых зависит исход взаимодействия патогена и организма человека [1;64;66;93;185]. В настоящее время многие вопросы, касающиеся молекулярных основ воспаления в пародонте, остаются открытыми. В частности, до конца не установлены факторы, определяющие прогноз заболевания: от стойкой ремиссии и длительного бессимптомного течения до полной утраты зубов с изменением качества жизни.

Цель исследования. Установить взаимосвязь между клиническими проявлениями и молекулярно-генетическими предпосылками развития хронического генерализованного пародонтита для повышения качества диагностики, лечения и профилактики заболевания.

Задачи исследования.

1. Провести сопоставление клинических и метаболических показателей состояния органов и тканей полости рта у лиц с хроническим генерализованным пародонтитом и пациентов без воспалительных изменений в пародонте в динамике наблюдения.

2. Изучить показатели неспецифической защиты десневой жидкости у лиц с хроническим генерализованным пародонтитом и пациентов без клинически выраженной патологии в пародонте.

3. В качестве генетических маркеров воспаления у больных хроническим генерализованным пародонтитом дать клиническую оценку полиморфизма генов провоспалительных цитокинов ТЫБ-а 0(-308)—>А, 1Ь-1(3 С(-511)—>Т, 1Ь-2 Т(-330)^0, 1Ь-6 С(-174)—>С, 1Ь-8 А(-251)->Т, а также состояния рецепторного аппарата макрофагов СЭ14 С(-260)—ТЫ1-2 А^(-753)—>С1у, ТЬК-4 Азр(-299)—Ю1у и Т1Л1-6 8ег(-249)^Рго.

4. Проанализировать состояние неспецифической реактивности десневой жидкости и метаболических процессов в костной ткани больных хроническим генерализованным пародонтитом под влиянием полиморфизма генов провоспалительных цитокинов TNF-a G(-308)—>А, IL-1(3 С(-511)—>Т, IL-2 Т(-ЗЗО)—>G, IL-6 G(-174)—>С, IL-8 А(-251)->Т и рецепторного аппарата макрофагов CD14 С(-260)^Т, TLR-2 Arg(-753)^Gly, TLR-4 Asp(-299)^Gly и TLR-6 Ser(-249)—>Рго.

5. На основании полученных данных определить роль полиморфизма изученных генов провоспалительных цитокинов и рецепторного аппарата макрофагов в иммунопатогенезе хронического генерализованного пародонтита и разработать принципы персонифицированного подхода к диагностике, лечению и профилактике заболевания.

Научная новизна. В результате проведённого исследования дана комплексная оценка тканей пародонта с учётом состояния гуморального и клеточного звеньев иммунитета десневой жидкости и содержания остеопротегерина в сыворотке крови у больных ХГП и лиц без клинически выраженных признаков воспаления в пародонте. Установлена зависимость между концентрацией остеопротегерина в сыворотке крови и тяжестью воспаления в пародонте.

Обоснован выбор генов-кандидатов интенсивности воспалительной реакции, определяющих степень тяжести ХГП - TNF-a G(-308)—>А, IL-1(3 С(-511)—>Т, IL-2 Т(-ЗЗО)—»G, IL-6 G(-174)->C, IL-8 А(-251)->Т; CD14 С(-260)—>Т, TLR-2 Arg(-753)—>Gly, TLR-4 Asp(-299)^Gly и TLR-6 Ser(-249)—>Pro. Установлены корреляционные взаимосвязи между полиморфизмом генов-кандидатов и клиническими проявлениями ХГП, выражающиеся посредством общепринятой индексной оценки. Выяснив особенности распределения генотипов по аллельным полиморфизмам изученных генов у больных ХГП различной степени тяжести, мы продемонстрировали их потенциальную генетическую информативность в качестве ранних маркеров заболевания.

Теоретическая и практическая значимость.

В результате проведённых исследований установлена необходимость проведения комплексного клинико-лабораторного обследования больных ХГП с целью определения величины индивидуальной потенциальной вероятности прогрессирования воспаления.

Определена информативность полиморфизмов генов TNF-a G(-308)—»А, IL-1(3 С(-511)—>Т, IL-2 Т(-ЗЗО)—>G, IL-6 G(-174)^C, IL-8 А(-251)-+Т; CD14 С(-260)—>Т, TLR-2 Arg(-753)^Gly, TLR-4 Asp(-299)^Gly и TLR-6 Ser(-249)—>-Рго, выбранных в качестве генетических маркеров воспаления в пародонте. (Патент на изобретение №2397707 от 05.12.2008. В соавт. с И.Л. Горбуновой, А.В. Кононовым, Е.Г. Поморгайло, А.Г. Ромащенко, В.Б. Недосеко. «Способ оценки интенсивности реакции воспаления у больных хроническим пародонтитом»).

С помощью предлагаемых маркеров иммунологической реактивности полости рта (Ig А, ФИ, ИЗФ, ЦИК) представляется возможным выделение лиц, имеющих нарушения в клеточном и гуморальном звеньях иммунитета в «группу риска» по развитию/прогрессированию пародонтита.

Дополнительным тестом, определяющим индивидуальное критическое состояние прогрессирования болезни, является определение уровня остеопротегерина в сыворотке крови.

Экономическая эффективность исследования заключается в том, что позволяет диагностировать воспаление в пародонте на более ранних этапах, по сравнению с данными общеизвестных клинических индексов (PMA, SBI, PI, КП) и определяет целесообразность назначения дорогостоящих лечебных мероприятий применительно к конкретному пациенту.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 201 странице компьютерного текста, иллюстрирована 65 таблицами и 23 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, материала и методов

ВЫВОДЫ

1. При хроническом генерализованном пародонтите различных степеней тяжести установлены взаимосвязь и взаимозависимость динамических индексов (OHI-S, PMA, SBI) с индексами, отражающими деструктивные процессы в тканях пародонта (PI и КП). У больных хроническим генерализованным пародонтитом с трансформацией степени тяжести заболевания имеется корреляционная связь между глубиной поражений тканей пародонта и количеством остеопротегерина в крови.

2. В десневой жидкости лиц с хроническим генерализованным пародонтитом выявлены нарушения как гуморального, так и клеточного звеньев иммунитета полости рта: отмечается повышение содержания иммуноглобулина G, снижение иммуноглобулина М, снижение количества CD-3 и CD-4 лимфоцитов, увеличение количества CD-8 лимфоцитов, снижение иммунорегуляторного индекса, увеличение циркулирующих иммунных комплексовА снижение фагоцитарного индекса и индекса завершённости фагоцитоза по сравнению с показателями лиц, без клинически выраженных признаков воспаления в тканях пародонта. Трансформация степени тяжести хронического генерализованного пародонтита ассоциируется со снижением концентрации иммуноглобулина А, увеличением циркулирующих иммунных комплексов, снижением фагоцитарного индекса и индекса завершённости фагоцитоза.

3. У больных хроническим генерализованным пародонтитом установлены ассоциации клинических показателей тяжести воспаления в пародонте с полиморфизмами генов-кандидатов провоспалительных цитокинов TNF-a G(-308)->A, IL-lp С(-511)->Т, IL-2 T(-330)^G, IL-6 G(-174)—>C, IL-8 A(-251)—>T. При генотипах «G/G» гена TNF-а, «Т/Т» гена IL-1(3, «G/G» гена IL-2, «G/G» гена IL-6 и «Т/Т» гена IL-8 в течение года наблюдения увеличиваются значения показателей индексов PMA, SBI, PI и КП по Fucsh. Трансформация степени тяжести пародонтита зависит от состояния рецепторного аппарата макрофагов и чаще отмечается у носителей 1/1 и 1/2 TLR-2; TLR-4 и TLR-6 и Т/Т CD14 С(-260)^Т.

4. При хроническом генерализованном пародонтите установлены ассоциации снижения концентрации иммуноглобулина А, увеличения циркулирующих иммунных комплексов, снижения значений фагоцитарного индекса и индекса завершённости фагоцитоза в десневой жидкости с носительством генотипов «G/G» гена TNF-a, «Т/Т» гена IL-1(3, «G/G» гена IL-2, «G/G» гена IL-6 и «Т/Т» гена IL-8, 1/1 и 1/2 TLR-2; TLR-4 и TLR-6 и Т/Т CD 14 С(-260)—>Т - рецепторов, а также сочетаний вариантов указанных полиморфизмов. Уровень остеопротегерина у больных ХГП находится в прямой зависимости от экспрессии генов TNF-a, IL-1|3, IL-2, IL-6 и IL-8, a также состояния рецепторного аппарата макрофагов CD 14, TLR-2; TLR-4 и TLR-6. Получены положительные корреляции между уровнем OPG в крови и показателями иммуноглобулина А, циркулирующих иммунных комплексов и индекса завершённости фагоцитоза в десневой жидкости.

5. Неблагоприятный «генетический профиль» у больных хроническим генерализованным пародонтитом является иммуно-опосредованной причиной более продолжительного воспалительного ответа и частых рецидивов заболевания в отдалённые сроки после противовоспалительного лечения, что подтверждается значением общеизвестных клинических индексов, характеризующих состояние тканей пародонта - PMA, SBI, PI, КП, и некоторыми иммунологическими показателями десневой жидкости -иммуноглобулина А, циркулирующих иммунных комплексов, фагоцитарного индекса, индекса завершённости фагоцитоза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

1. Для персонифицированного подхода в диагностике, лечении и профилактике хронического генерализованного пародонтита необходимо проведение комплексной клинико-лабораторной оценки состояния полости рта с обязательным определением уровня остеопротегерина в сыворотке крови, полиморфизмов генов ЮТ-а 308)—>А, 1Ь-1|3 С(-511)—>Т, 1Ь-2 Т(-330)^С, 1Ь-6 С(-174)->С, 1Ь-8 А(-251)->Т; СБ14 С(-260)-*Т, ТЬЯ-2 Агё(-753)-+01у, ТЫМ Азр(-299)—>01у и ТЬЯ-б 8ег(-249)^Рго, а также уровня ^ А, показателей ЦИК, ФИ и ИЗФ в десневой жидкости.

2. При выявлении благоприятного «генетического профиля» при хроническом генерализованном пародонтите для предупреждения рецидивов заболевания и профилактики его прогрессирования необходимо соблюдение пациентом гигиенических норм и проведение профессиональной гигиены полости рта (снятие назубных отложений) не реже двух раз в год. При этом объём консервативных вмешательств должен обязательно включать в себя комплекс противовоспалительных мероприятий (аппликации, орошения, инсталляции в пародонтальные карманы, местную антибактериальную терапию). При выявлении неблагоприятного «генетического профиля» при хроническом генерализованном пародонтите для предупреждения рецидивов заболевания и профилактики его прогрессирования указанные консервативные мероприятия необходимо проводить не реже четырёх раз в год.