Автореферат и диссертация по медицине (14.01.01) на тему:МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ФОРМИРОВАНИЯ ЭНДОКРИННО-МЕТАБОЛИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ ПРИ СИНДРОМЕ ПОЛИКИСТОЗНЫХ ЯИЧНИКОВ

БИРЮКОВА Альмина Михайловна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ФОРМИРОВАНИЯ ЭНДОКРИННО-МЕТАБОЛИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ ПРИ СИНДРОМЕ ПОЛИКИСТОЗНЫХ ЯИЧНИКОВ

14.01.01 - Акушерство и гинекология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

- 6 ОПТ 2077

Москва - 2011 год

4855277

Работа выполнена в отделении сохранения и восстановления репродуктивной функции ФГУ «Научный центра акушерства гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России и в лаборатории молекулярной генетики человека ФГУ «Научно-исследовательский институт физико-химической медицины» Федерального медико-биологического агентства России.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, академик РАМН, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Назаренко Татьяна Алексеевна Сухих Геннадий Тихонович

Манухин Игорь Борисович Сметник Вера Петровна

Ведущая организация: Российский университет дружбы народов Защита диссертации состоится «18» октября 2011г. в 13.00 ч. на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.125.01 при ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И.Кулакова» Минздравсоцразвития России по адресу: 117997, г. Москва, ул. Академика Опарина, д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан «17» сентября 2011 года.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета, доктор медицинских наук

Е.А. Калинина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Синдром поликнстозных яичников (СПКЯ) до настоящего времени является актуальной проблемой гинекологической эндокринологии. Частота СПКЯ составляет примерно 11-17% среди женщин репродуктивного возраста, а в структуре эндокринного бесплодия достигает 75% (Balen А.Н., 2001, De Leo V., 2001).

Основываясь на вариабельности клинических и биохимических проявлений, большинство клиницистов устанавливают диагноз СПКЯ на основании трех главных критериев: хронической ановуляции, гиперандрогении (ГА) и эхографических признаков поликистозных яичников, которые были закреплены Роттердамским консенсусом в 2003 году. Согласно данному документу, наличие 2-х из 3-х вышеперечисленных критериев позволяет установить диагноз СПКЯ при исключении других патологических состояний, имеющих сходные клинические и лабораторные симптомы (21-22 ноября 2003г.; Лос-Анджелес, США).

К началу третьего тысячелетия СПКЯ стали рассматривать уже как глобальную проблему соматического здоровья пациентов эндокринно-метаболического статуса, сердечно-сосудистого и онкологического риска, а не только как частой патологии исключительно репродуктивного плана.

В этиологии синдрома поликистозных яичников большое значение имеет генетическая предрасположенность (Franks and McCarthy, 2004; Escobar-Morreale et al., 2005; Nam Menke and Strauss, 2007; Urbanek, 2007). Ключевые гены, имеющие отношение к развитию клинических проявлений СПКЯ, представлены двумя основными группами: гены, контролирующие метаболические процессы обмена глюкозы и, соответственно, состояния гиперинсулинемии и инсулинрезистентности и гены, отвечающие за синтез

стероидных гормонов и индивидуальную чувствительность тканей к андрогенам. Изменения в структуре одного или нескольких из этих генов могут вызвать развитие тех или иных клинических симптомов (или симптомокомплексов), характерных для синдрома поликистозных яичников.

Вместе с тем до настоящего времени не были определены достоверные молекулярно-генетические дефиниции, которые бы объединяли пациентов с СПКЯ.

Целью исследования явился поиск молекулярно-генетических факторов, участвующих в формировании эндокринно-метаболических нарушений при СПКЯ, и уточнение патогенетических механизмов развития заболевания.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ клинико-анамнестических и эндокринных характеристик пациенток с СПКЯ и пациенток без СПКЯ;

2. Изучить особенности углеводно-липидного спектра с оценкой состояния толерантности к глюкозе и инсулинрезистентности у пациенток исследуемых групп;

3. Провести поиск, направленный на установление ассоциативных связей между полиморфизмами ряда генов и СПКЯ;

4. Изучить ассоциативные связи, способствующие формированию эндокринно-метаболических нарушений у пациенток с СПКЯ и пациенток группы сравнения.

Научная новизна

Полученные результаты показали, что объединяющими для СПКЯ клиническими признаками являются: ановуляция, нарушение

менструального цикла и ультразвуковые признаки поликистозных яичников. Показано, что ведущими эндокринными характеристиками, подтверждающими патогномоничность гиперандрогении для СПКЯ являются биохимическая и клиническая гииерандрогения и повышенный уровень ЛГ.

В сравнительном аспекте проанализированы параметры углеводно-липидного обмена у женщин с СПКЯ и без него и показана значимость избыточной массы тела в формировании метаболических нарушений. Кроме того показано, что указанные нарушения усугубляются у пациенток с СПКЯ.

Впервые на российской популяции выявлены ассоциации полиморфизмов генов 11182 (ге 1827845) и НШ (гб 1801278) участвующие в формировании СПКЯ, а также в развитии инсулинрезистентности и нарушении толерантности к глюкозе у пациенток с синдромом.

Практическая значимость

На основании полученных данных разработаны практические рекомендации по совершенствованию диагностики СПКЯ, инсулинрезистентности и нарушений толерантности к глюкозе у пациенток с СПКЯ и осуществлению профилактических мероприятий, направленных на предупреждение развития эндокринно-метаболических нарушений при СПКЯ.

Положения, выносимые на защиту

I. Ведущими эндокринными характеристиками СПКЯ являются гиперандрогения и повышенный уровень ЛГ, обуславливающие ановуляцию, нарушение ритма менструаций и поликистозные яичники. Основное значение в формировании метаболических

нарушений имеет избыточная масса тела, а на фоне эндокринных изменений, характерных для СГТКЯ, усугубляются нарушения углеводного и липидного обмена. И. Полиморфизмы генов IRS2 (rs 1827845) и IRS1 (rs 1801278) напрямую ассоциированы с развитием СПКЯ, а также являются предрасполагающими факторами в развитии инсулинрезистентности и нарушений толерантности к глюкозе у пациенток с СПКЯ.

Внедрение в практику

Результаты исследования внедрены в практическую работу отделения сохранения и восстановления репродуктивной функции ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России. Материалы работы используются для практических занятий и лекций со слушателями семинаров ФГУ «НЦ АГиП имени академика В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России, аспирантами и клиническими ординаторами. По теме диссертации опубликовано 3 научные работы, из них 3 - по перечню ВАК РФ.

Апробация работы

Апробация диссертации была проведена на заседании Апробационной комиссии ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России 14.03.2011.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 115 страницах, содержит 6 рисунков, 12 таблиц. Список литературы содержит 131 работу, в том числе: 26 работ отечественных авторов и 105 работ зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования

Для выполнения поставленных задач в отделении сохранения и восстановления репродуктивной функции проведено обследование 160 пациенток. Исследуемые пациенты были разделены на две группы.

1-ю (основную) группу исследования составили 98 женщин с сиидромом поликистозных яичников.

П-ю группу сравнения - 62 женщины с бесплодием трубно-перитонеального или мужского генеза, имеющие регулярный овуляторный менструальный цикл.

Дизайн работы заключался в проведении одномоментного прямого проспективного исследования, когда обследование всех пациенток проводилось в течение не менее трех менструальных циклов.

В работе были использованы общепринятые клинико-лабораторные и специальные молекулярно-генетические методы исследования.

Изучали анамнез заболевания, характер менструального цикла, репродуктивную функцию.

При осмотре обращали внимание на тип оволосения, наличие полос растяжений кожи, гиперпигментаций, угревой сыпи, определяли особенности волосяного покрова головы с целью выявления андрогенной алопеции. Для оценки выраженности гирсутизма применяли шкалу Ферримэна - Голвея. Проводили типобиологическую оценку женщины -рост, вес, вычисляли ИМТ; обращали внимание на тип телосложения, развитие и распределение жировой ткани, измеряли окружность талии и бедер для установления типа ожирения.

В работе был применен комплекс современных дополнительных методов исследования.

Ультразвуковое исследование (УЗИ) проводили всем пациенткам в отделении функциональной диагностики ФГУ НЦАГиП (руководитель -профессор Гус А.И.) для дефиниции ПКЯ на 2-5 день менструального цикла или менструальноподобной реакции, затем на 12-13 и 20-22 дни цикла для оценки фолликулогенеза и констатации овуляции или ее отсутствия и наличия желтого тела в яичнике в течение 3-х менструальных циклов.

Концентрацию гормонов в плазме крови определяли натощак на 3-5 день менструального цикла или менструально-подобной реакции. За нормативные показатели принимали результаты, полученные в лаборатории эндокринологии НЦ АГиП (руководитель - к.м.н. Иванец Т.Ю). Всем пациенткам определяли гормоны крови: ЛГ, ФСГ, Т, ДГЭА-S, эстрадиол (Е2), 17-ОПН, кортизол (К). Уровень прогестерона (Р) определяли на 20-22 день цикла.

Диагностику овуляции проводили в домашних условиях при помощи тестов для определения овуляции в течение 5 дней с 11 дня менструального цикла.

Толерантность к глюкозе определяли с помощью перорального глюкозотолерантного теста (ПГТТ). Рассчитывали индекс инсулинрезистентности НОМА. Оценивали параметры липидного обмена -измерение концентраций холестерина, ЛПНП, ЛПВП, триглицеридов; определяли уровни креатинина, активности ACT, АЛТ.

К специальным методам были отнесены молекулярно-генетические исследования, которые проводились пациенткам обеих групп в «Научно-исследовательском институте физико-химической медицины»

Федерального медико-биологического агентства (заведующий - к.б.н. Генерозов Э.В., исполнитель - Захаржевская Н.Б.) с последующей статистической обработкой полученных результатов.

Молекулярно-генетические методики включали в себя: полимеразную цепную реакцию (ПЦР), реакцию минисеквенирования, агарозный гель-электрофорез, масс-спектрометрию.

В ходе исследования были проанализированы полиморфизмы генов: субстрат инсулинового рецептора-1 (1RS 1), субстрат инсулинового рецептора-2 (IRS2), 17-ß гидроксистероид дегидрогеназа 5 (HSD17B5), 17-ß гидроксистероид дегидрогеназа 6 (HSD17B6), ген

фолликулостимулирующего гормона (FST), шоперон андрогенового рецептора (SGTA), белок, ассоциированный с ожирением (FTO), транскрипционный фактор гамма - рецептора, активируемый пролифераторами пероксисом (PPARg). Также были исследованы гены, полиморфизмы которых ассоциированы с СПКЯ согласно работам, полученным на модельных животных: гомолог белка FEM1 A, FEM1B.

Для проведения исследования была использована венозная кровь пациентов в объёме 5 мл. Свежезамороженные при -20 С0 образцы передавали в лабораторию для выполнения генетического исследования.

ДНК выделяли при помощи набора Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, США) по протоколу производителя, а также посредством фенолхлороформного метода.

Последовательности праймеров подбирали с использованием программных пакетов Vector NTI 9 и Primer Express 2.0. Специфичность подобранных вариантов проверяли с помощью он-лайн ресурсов.

Для удаления из смеси всех незадействованных дезоксинуклеотидтрифосфатов проводили реакцию дефосфорилирования.

Для анализа полиморфизмов генов использовали метод масс-спектрометрического минисеквенирования. Данный метод представляет комбинацию минисеквенирования и масс-спектрометрического анализа продуктов реакции минисеквенирования на времяпролетном спектрометре (MALDI-TOF масс-спектрометрия).

Для осуществления реакции минисеквенирования использовали синтетические однонуклеотидные зонды, комплементарные последовательности, непосредственно прилегающие к точке мутации.

Статистический анализ осуществляли с использованием критериев Шапиро-Уилка для проверки правильности распределений; критерия у_2 для таблиц сопряженности признаков 2*2, 2*3 и 2*4, в том числе с использованием поправки Бонферрони; сравнительного анализа средних тенденций с помощью Т-критерия Стьюдента для несвязанных совокупностей. Для автоматизации статистической обработки использовали статистический пакет Statistica for Windows 6.0.

При анализе данных молекулярно-генетических исследований статистические различия оценивали с использованием критерия %2 Для таблицы сопряженности признаков 3*2. Наряду с общепринятыми методиками мы применили программы RxC (RowsxColumns), с помощью которых наблюдаемые частоты встречаемости генотипов исследованного локуса проверяли на отклонение от равновесия Харди-Вайнберга по критериям с2 и G-статистики. Сравнение распределения частот встречаемости аллелей и генотипов в группах исследования, проводили с использованием точного критерия Фишера. Для определения достоверности возрастных различий в парных группах применяли t-критерий Стьюдента. Статистически значимыми считали различия при р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение 1. Клинико-лабораторная характеристика пациенток

Согласно поставленным задачам исследования проведено обследование 160 пациенток, наблюдавшихся на базе Центра в отделении сохранения и восстановления репродуктивной функции. Основную группу исследования составили 98 пациенток с СПКЯ, средний возраст - 27,7 +4,2 лет. Группа сравнения была представлена 62 пациентками с трубно-перитонеальным или мужским фактором бесплодия без СПКЯ; средний возраст - 28,4 + 3,2 лет. Обязательным условием исследования было отсутствие в анамнезе терапии, направленной на снижение веса и оперативных вмешательств на яичниках.

Целью первого этапа работы было выделение признаков, патогномоничных для пациенток с СПКЯ.

Вначале мы проанализировали клинические и эндокринные характеристики пациенток обеих групп. Сравнение женщин с СПКЯ и без такового, с нашей точки зрения, было предпринято для большей объективизации клинических и лабораторных критериев синдрома, так как известна его гетерогенность и неспецифичность признаков, которые могут встречаться и на популяционном уровне со значительной частотой.

Сравнительный анализ основных клинических параметров пациенток обеих групп представлен в таблице 1.

Клинические характеристики пациенток обеих групп

Клинические признаки Основная группа (п-98) Группа сравнения (п-62)

Олигоменорея 94 (96%*) 2 (3,2%)

Аменорея 4 (4%) 0

Ановуляция 98 (100%*) 1(1,6%)

Регулярный менструальный цикл (28-35 шей) 0* 59 (95%)

Увеличение объёма яичников более 9 см 82 (84%*) 2 (3,2%)

Наличие периферических гипоэхогенных структур диаметром 6-10 мм, не менее 8 95 (97%*) 2 (3,2%)

Отсутствие желтого тела 98 (100%*) 4 (6,4%)

Гирсутизм 23 (23,5%) 12 (19%)

Избыточная масса тела 44 (45%) 24 (39%)

*- достоверные различия с группой сравнения (р<0,05)

Ранжирование клинико-лабораторных признаков позволило нам показать, что объединяющими для СПКЯ и резко отличающимися характеристиками от группы сравнения явились: ановуляция, нарушение менструального цикла и ультразвуковые признаки поликистозных яичников, которые фиксировались практически у всех пациенток с СПКЯ, тогда как в группе сравнения эти признаки встречались в единичных случаях - от 1,5 до 5%.

Результаты гормонального обследования (таблица 2) выявили достоверно значимые различия у пациенток основной группы по уровням ЛГ и тестостерона, т.е. биохимические признаки яичниковой ГА. Это в очередной раз подтвердило патогномоничность ГА при СПКЯ.

Сравнительный анализ результатов гормонального обследования пациенток двух групп

Уровни гормонов Основная группа (п=98) Группа сравнения (п=62)

Средние значения % пациенток, имеющих повышенные значения Средние значения % пациенток, имеющих повышенные значения

ЛГ (2,3-15 МЕ/л) 12,1±2,4* 56%* 7,3±1,6 9,9%

ФСГ (2,0-10 МЕ/л) 4,7±0,9 0% 5,2±1,2 0%

Г (1,0-2,5 нмоль/л) 2,2±1,1 68%* 2,0±0,4 9%

17-ОПН (0,3-3 нмоль/л) 2,8±0,4 0,7% 1,7±0,9 0%

ЦГЭА-С (0,9-11,7 мкмоль/л) 8,9±2,2 1,1% 6,7±0,9 0%

* - достоверные различия с группой сравнения (р<0,05)

Число женщин, имеющих избыточную массу тела, оказалось практически одинаковым как в группе с СПКЯ, так и без него, т.е. этот признак явился объединяющим обе группы. Однако при анализе типобиологических характеристик пациенток обеих групп (таблица 3) отмечено преобладание висцерального типа ожирения у женщин с СПКЯ.

Таблица 3

Сравнительный анализ типобиологических характеристик пациенток обеих групп

Тнпобиологические характеристики Основная группа (п-98) Группа сравнения (п-62)

ИМТ 25-29,99 кг2 44 (45%) 24 (39%)

ИМТ 30-34,99 кг2 14 (14,2%) 9 (14,5%)

ОТ> 0,85 см 52 (53,06%)* 19 (30,6%)

ОТ/ОБ > 0,85 53 (54,2%)* 21 (33,87%)

* - достоверные различия с группой сравнения (р<0,05)

Представленный анализ первого этапа работы позволил определить ановуляцию в сочетании с менструальной дисфункцией и соответствующими ультразвуковыми признаками поликистозных яичников как абсолютные диагностические критерии СПКЯ, а ГА - как превалирующий признак. Эти данные дают основание постановки диагноза СПКЯ по трем основным критериям (а не двум из трех, как указано в Роттердамских соглашениях). Подобный подход не является новым и широко использовался и ранее (S. Franks 1995, Г.Е.Чернуха 2002). Более того, он принципиально не противоречит Роттердамскому соглашению, а, на наш взгляд, позволяет более четко и однозначно выделить нозологию, исключая многие сходные патологические состояния.

Повышенный уровень ЛГ и биохимическая ГА, выявленные у более половины женщин с СПКЯ, еще раз подтверждают их значение, как ведущих эндокринных характеристик синдрома и роль в патогенезе ановуляции.

В то же время, такой признак как ожирение, присущ и пациенткам без СПКЯ и практически с такой же частотой встречается в популяции. Сравнительный анализ типов ожирения в группах с СПКЯ и без него четко продемонстрировал преобладание висцерального типа ожирения у женщин с СПКЯ, что подтверждается многочисленными литературными данными (М.А. Геворкян 1999, Г.Е. Чернуха 2002 и др.), указывающими о наличии метаболического синдрома, в развитии которого большую роль играет не абсолютная масса тела, а характер распределения жировой ткани.

На втором этапе нашего исследования мы проанализировали параметры углеводно-липидного обмена у пациенток обеих групп.

Сравнивая биохимические показатели плазмы крови женщин с СПКЯ и без такового мы не нашли достоверных различий по уровню триглицеридов, общего холестерина, ЛПВП, ЛПНП и КА (рисунок 1).

Основная группа (п=98) Группа сравнения (п=62)

□ Триглицериды>1,7 ммопь/л ■ Холестерин>5,2 ммоль/л

□ ЛПНП>3,5 ммоль/л

□ ЛПВП< 0,9 ммоль/л ВКА>3,0

Рисунок 1. Показатели липидного профиля пациенток обеих групп

Естественно, что биохимические показатели могут различаться в зависимости от наличия или отсутствия избыточной массы тела, в связи с чем мы дифференцированно сравнили эти показатели у женщин с избыточной массой тела и без таковой среди пациенток обеих групп (таблица 4).

Таблица 4

Сравнительный анализ липидного профиля у пациенток обеих групп с различными значениями ИМТ

Группа с СПКЯ (п-98) Группа сравнения(п-62)

Показатели ИМТ > 25(п-58) ИМТ < 25 (п-40) ИМТ > 25 (п-33) ИМТ < 25 (п-29)

Абс. число,% Абс. число,% Абс. число,% Абс. число, %

Григлицериды > 1,7 ммоль/л 38 (65,5%) 12 (30%)* 19 (57,5%) 2 (7%)

Холестерин общий > 5,2 ммоль/л 44 (76%) 15 (37,5%)* 24 (73%) 4 (14%)

ЛПНП > 3,9 ммоль/л 30 (52%) 9 (22,5%)* 13 (40%) 0

ЛПВП < 0,9 ммоль/л 26 (45%) 7 (17,5%)* 11 (33,3%) 0

КА>3,0 16 (27,5%) 2 (5%)* 7(21,2%) 0

* - достоверные различия с группой сравнения (р<0,05)

Выявленные закономерности были вполне предсказуемыми, т.е. у пациенток с избыточной массой тела отмечены худшие показатели липидного профиля, как в группе с СПКЯ, так и в группе сравнения.

Таким образом, результаты анализа липидного профиля продемонстрировали, что именно избыточная масса тела вносит значимый вклад в формирование метаболических изменений. Тем не менее, многие ученые указывают на связь СПКЯ с нарушениями в липидограмме вне зависимости от индекса массы тела (¿Е. ЫсБ11ег 1997, М.В. Шестакова 2002, М.А. Геворкян 2006). Мы сравнили показатели липидного профиля у пациенток обеих групп имеющих нормальные значения ИМТ и выявили, что треть пациенток с СПКЯ и нормальным ИМТ имели нарушения липидного профиля, в отличие от пациенток группы сравнения, которые практически не имели этих нарушений.

Вопросы инсулинрезистентности и СПКЯ по сей день оживленно дискутируются среди ученых во всем мире (А. БшшГ 1992, И.Б. Манухин 2006). Сообщения о распространенности этого феномена у женщин с СПКЯ варьируют, что обусловлено чувствительностью и специфичностью используемых тестов. И мы не обошли эту проблему.

При анализе результатов теста на толерантность к глюкозе и индекса НОМА достоверно значимых различий между женщинами с СПКЯ и без такового показать не удалось. В группе пациенток с СПКЯ нарушение толерантности к глюкозе выявилось у 41%, в группе сравнения - у 32%, а увеличенные значения индекса НОМА в 45% и 37% случаев соответственно.

Далее мы сравнили результаты теста на толерантность к глюкозе и превышающие значения индекса НОМА у женщин с избыточной массой

тела и без таковой среди пациенток обеих групп. Были получены достоверные различия между женщинами с избыточной массой тела и без таковой, но какой-либо яркой корреляции пациенток с СПКЯ и без СПКЯ, имеющих избыточную массу наше исследование не выявило (таблица 5).

Таблица 5

Сравнительный анализ результатов орального теста на толерантность к глюкозе и индекса НОМА > 2,77 у пациенток двух групп исследования с различным значениями ИМТ

Показатели углеводного обмена Основная группа (п-98) Группа сравнения (п-62)

ИМТ >25 (п-58) ИМТ <25 (п-40) ИМТ >25 (п-33) ИМТ <25 (п-29)

Абс. число,% Абс. число,% Абс. число, % Абс. число,%

Нарушение толерантности к глюкозе 33 (57%; 1(17,5%)* 17 (51,5%) 3 (10%)

Индекс НОМА > 2,77 32 (55%) 12(30%)* 18 (54,5%) 6(17%)

* - достоверные различия с группой сравнения (р<0,05)

Таким образом, проведенный анализ не позволил определить патогномоничные для СПКЯ признаки метаболического синдрома. Наоборот, было продемонстрировано, что изменения углеводно-липидного обмена связаны с избыточной массой тела и встречаются как среди женщин с СПКЯ, так и без него. Основное значение в формировании метаболических нарушений имеет избыточная масса тела, а на фоне эндокринных изменений, характерных для СПКЯ, нарушения углеводного и липидного обмена усугубляются.

На данном этапе были использованы рутинные общеклинические методы обследования, и по общепринятым лабораторным тестам нам не удалось продемонстрировать прямых ассоциаций СПКЯ с

метаболическими нарушениями. В этой связи перспективной является попытка выявить какие-либо генетические маркеры, предрасполагающие к развитию как самого СПКЯ, так и клинических симптомов этого заболевания, что и было предпринято в дальнейшем.

Приступая к молекулярно-генетическому этапу работы мы ориентировались на исследования ведущих специалистов и публикации зарубежной печати. Для исследования были отобраны гены, полиморфизмы которых потенциально могут быть ответственны за возникновение, как самого СПКЯ так и эндокринно-метаболических нарушений.

Мы сформировали признаки, которые в той или иной степени ассоциированы с СПКЯ и с эндокринно-метаболическими нарушениями:

1. Ассоциации развития синдрома поликистозных яичников с анализируемыми полиморфизмами генов;

2. Ассоциации нарушения толерантности к глюкозе и изменений значения индекса НОМА у пациенток с СПКЯ и без СПКЯ с анализируемыми полиморфизмами генов.

Среди всех проанализированных ассоциаций полиморфизмов генов были определены значимые. Все данные были проанализированы на уровне значимости р<0,05. Для достоверных различий были определены относительные риски (011). При 0Л>1, носительство данного полиморфизма считалось вариантом риска, соответственно при 0Л<1 данный полиморфизм определялся как протективный по отношению к анализируемому признаку. Значимые ассоциации, выявленные в ходе исследования, представлены в таблице 6.

Ассоциации, выявленные в ходе исследования

Ген (полное название) Полиморфизм Ив номенклатура но N881 Нуклеотидная замена Ассоциация с риском развития СПКЯ Ассоциация с риском развития нарушений толерантности к глюкозе Ассоциация с риском повышения значений индекса НОМА >2,77

[1^2 - субстрат инсулинового рецептора 2 1805097 от Минорный Минорный

аллелкТ аллель-Т

((Ж=2,908; С1=[1.246-6.787], р=0,01) Гомозиготный генотип - ТТ (ОЯ=1,02; С1= [1,048-2,269], (р=0,03)) при СПКЯ. ((Ж=2,115; С1= |1.048-4.269|, р=0.03).

Ш51- субстрат инсулинового рецептора 1 1(5 1801278 С>Т ОТ Минорный Гомозиготный Гомозиготный

аллель-Т

(ОК=2,115; С1=|1.048-4.269], р=0.03487), Гомозиготный генотипа ТТ (ОЯ=5,885; С1=[1.082- 52.0141, р=0.02856)

генотип СС генотип ТТ

(011=0,07; С1= |0,003-0,5], р=0,02). (ОЯ=5,885; С1= 11.082-32.014], р-0.02)

ШОб-гидростероид (17 бетта) дегидрогеназа 6 898611 С>А Не выявлено Не выявлено Минорный

аллель - А

(СЖ=2,554; С1= [1.091-5.977], р=0.02835). Гомозиготный

генотип - вС

(СЖ=0,060; С1= [0.003-1.222], р=0.01835)

ШБэ -гндростероид (17 бетта) дегндрогеназа 5 На 3763676 С>А С>А Не выявлено Не выявлено Минорный

аллель - А

(СЖ=2,087; С1= [1.022-4.259], р=0.04161).

Для полиморфизма гена 11182 была определена значимая ассоциация с риском развития СПКЯ, а также с риском развития метаболических нарушений на фоне синдрома, таких как ИР и нарушение толерантности к глюкозе. При носительстве либо минорного аллеля Т в гетерозиготном

состоянии, либо гомозиготного генотипа ТТ у женщин определялся риск развитии СПКЯ - от трехкратного до десятикратного. Минорный аллель Т показал наличие трендового риска в отношение развития нарушения толерантности к глюкозе. При носительстве минорного аллеля Т определился двукратный риск увеличения значений индекса НОМА. Для полиморфизма гена 11181 была определена значимая ассоциация с риском развития СПКЯ, а также с риском развития на фоне СПКЯ метаболических нарушений. Однако для гомозиготного генотипа СС эффект оказался обратным, т.е. генотип СС является протективным в отношении риска развития нарушения толерантности к глюкозе на фоне СПКЯ. При носительстве гомозиготного генотипа ТТ определяется пятикратный риск увеличения значений индекса НОМА. Для полиморфизмов генов Ш017В5 и ШБПВб, ассоциаций с риском развитием СПКЯ не выявлено. Однако для полиморфизма гена НБ017В6 при носительстве минорного аллеля А был определен трехкратный риск увеличения значений индекса НОМА, а носительство гомозиготного генотипа вв определяло протективный эффект в отношении того же признака. Для полиморфизма гена Н8Б17В5 был определен двукратный риск увеличения значений индекса НОМА при носительстве минорного аллеля А.

Суммирование полученных значимых ассоциаций отчетливо продемонстрировало, что наибольшее количество взаимосвязей полиморфизмов генов с изучаемыми признаками определено для генов Ш82 и 11181. Однако для некоторых полиморфизмов найдены протективные эффекты в отношении изучаемых признаков. Следует еще раз подчеркнуть, что данные ассоциации выявлены у женщин с СПКЯ и не обнаружены ни у одной пациентки группы сравнения, что ещё раз указывает на патогномоничность выявленных ассоциаций именно для СПКЯ.

При исследовании остальных изучаемых полиморфизмов генов (РБТ, РТО, РЕМ1А, РЕМ1В, РРАЯ§, БОТА) значимых ассоциаций выявлено не было ни в группе с СПКЯ, ни в группе сравнения.

Таким образом, молекулярно-генетическое исследование позволило нам выявить ассоциации полиморфизмов генов с риском развития как СПКЯ непосредственно, так и с его клиническими симптомами, способными в дальнейшем приводить к нарушениям соматического состояния женщины, а также своевременно выявить степень риска развития СПКЯ и его клинических симптомов у девочек в пубертатном периоде, имеющих отягощенный наследственный анамнез и клинические проявления эндокринно-метаболических нарушений.

ВЫВОДЫ

1. Признаками, объединяющими больных с СПКЯ, являются: нарушения менструального цикла, преимущественно по типу олигоменореи (у 98%), ановуляция (у 100%), ультразвуковые признаки поликистозных яичников у (100%) и биохимическая гиперандрогения (у 68%). Среди пациенток группы сравнения, указанные признаки представлены с частотой 3,2%; 5%; 1,63% и 9% соответственно.

2. Распределение избыточной массы тела и ожирения I степени не продемонстрировало достоверных различий среди пациенток обеих групп: избыточная масса тела имела место у 45%, а ожирение I степени - у 14,2% пациенток с СПКЯ; в группе сравнения - у 39% и 14,5% соответственно. В то же время отмечено преобладание висцерального типа ожирения в группе пациенток с СПКЯ - 54,2% и 33,8% в группе сравнения.

3. Показатели липидного обмена, орального глюкозо-толерантного теста и результаты индекса НОМА изменены у женщин с избыточной массой тела, как при СПКЯ, так и в группе сравнения.

4. Не обнаружены прямые ассоциации полиморфизмов генов БЯТ, РТО, РЕМ1А, РЕМ1В, РРАЯ§, БСТА с риском формирования СПКЯ, а также с риском развития инсулинрезистентности, ожирения, нарушенной толерантности к глюкозе, как в группе с СПКЯ, так и у пациенток без СПКЯ.

5. Обнаружены прямые ассоциативные связи полиморфизмов генов 11182 (гб1 827845) и 11^1 (ге 1801278) с развитием СПКЯ и риском развития инсулинрезистентности и нарушения толерантности к глюкозе при этом заболевании.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для установления диагноза СПКЯ необходимо подтвердить наличие следующих клинических признаков: ановуляция, сочетающаяся с нарушениями менструального цикла, преимущественно по типу олигоменореи; абсолютные ультразвуковые признаки поликистозных яичников, которые могут присутствовать в различных комбинациях, но не менее трех эхо-графических характеристик; гиперандрогения, определяемая в периферической крови и/или гирсутизм, диагностированный по шкале Ферримэна-Голвея.

2. Для профилактики формирования СПКЯ целесообразно девочкам, имеющим отягощенный наследственный анамнез, избыточную массу тела, отсутствие своевременных менархе и нарушений менструальной функции, признаки гирсутизма в период пубертата определять полиморфизмы генов 11182 (ге 1827845) и ПШ (ге1801278).

3. В случае выявления полиморфизма 11182 (ге 1827845) и ЖБ) (гб1801278) в сочетании с клиническими симптомами СПКЯ пациенткам необходимо рекомендовать модификацию образа жизни: диету, физические упражнения, отказ от вредных привычек, гормональную терапию.

4. Женщинам, имеющим ИМТ > 25 кг/м2; уровень глюкозы в крови натощак > 6,7 ммоль/л и через 2 часа после перорального приема 75г. глюкозы > 7,8 ммоль/л, индекс НОМА>2,77, необходимо проводить регулярный скрининг на наличие инсулинрезистентности и оценивать липидный профиль для предотвращения развития сердечно-сосудистой патологии и СДII типа.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сухих Г.Т., Бирюкова A.M., Назаренко Т.А., Дуринян Э.Р. Эндокринно-метаболические особенности у пациенток с синдромом поликистозных яичников // Акуш. и гинек. 2011. № 4. С. 45-49.

2. Сухих Г.Т., Бирюкова A.M., Назаренко Т.А., Захаржевская Н.Б., Дуринян Э.Р., Генерозов Э.В., Говорун В.М. Анализ ассоциативных связей полиморфизмов генов с СПКЯ и эндокринно-метаболическими нарушениями // Акуш. и гинек. 2011. № 5. С. 45-49.

3. Сухих Г.Т., Бирюкова A.M., Назаренко Т.А. Генетические аспекты метаболических изменений у женщин с синдромом поликистозных яичников (обзор литературы) // Проблемы репродукции. 2011. № 4. С.7-9.

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

AJIT - аланиновая трансамииаза ACT - аспарагиновая трансамииаза ГА - гиперандрогения

ДГЭА-S - дегидроэпиандростерона сульфат

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

Е2 -эстрадиол

ИМТ - индекс массы тела

ИР - инсулинрезистентность

К -кортизол

К А - коэффициент атерогенности

ЛГ - лютеинизирующий гормон

ЛПВП - липопротеиды высокой плотности

ЛПНП - липопротеиды низкой плотности

ОБ - окружность бедер

ОТ - окружность талии

ПГТТ - пероральный глюкозотолерантный тест

ПКЯ - поликистозные яичники

ПЦР - полимеразная цепная реакция

СД - сахарный диабет

СПКЯ - синдром поликистозных яичников

Т - тестостерон

УЗИ - ультразвуковое исследование ФСГ - фолликулостимулирующий гормон FEM1A - гомолог белка, найденного у С. Elegans в яичниках FEM1B - гомолог белка рецептора клеточной гибели

FTO - белок, ассоциированный с ожирением

НОМА - математическая гомеостатическая модель оценки инсулиирезистентности

HSD17B6 - гидроксистероид (17-бетта) дегидрогеназа 6

HSD17В5 - гидроксистероид (17-бетта) дегидрогеназа 5

INS - ген человеческого инсулина

IRS1 - субстрат инсулинового рецептора -1

IRS2 - субстрат инсулинового рецептора -2

OR - относительные риски

PPARg - активируемый пролифератором пероксисом рецептор у

SGTA - ко-шоперон андрогенового рецептора

SNP - единичные нуклеотидные полиморфизмы

VNTR - варьирующие по числу тандемные повторы

17-ОПН - оксипрогестерон

Подписано в печать 16.09.2011 Заказ 494 Тираж 100 экз. Печать трафаретная. Объём: 1,0 усл.п.л. ООО «Копи-Принт» 105064, г. Москва, ул. Земляной вал, д.24/32.

Актуальность темы

Прошло более 70 лет с момента первой зарубежной публикации о патологии, которая впоследствии получила название синдрома Штейна-Левенталя, по фамилиям авторов - чикагских гинекологов. Спустя некоторое время, обозначение синдрома Штейна-Левенталя, сменилось на клинико-патогенетическое - синдром поликистозных яичников (СПЕСЯ), а представление медиков об этом эндокринном заболевании (Е28.2 по МКБ-10) трансформировалось из разряда редкой патологии в категорию чрезвычайно распространенной и поэтому - социально-значимой [115].

Синдром поликистозных яичников (СПКЯ) до настоящего времени является актуальной проблемой гинекологической эндокринологии. Частота СПКЯ составляет примерно 11-17% среди женщин репродуктивного возраста, а в структуре эндокринного бесплодия достигает 75% [33].

Не утихают дискуссии по вопросам патогенеза, диагностики и лечения СПКЯ. Несмотря на проводимые исследования, многие вопросы этиопатогенеза данного синдрома до настоящего времени остаются спорными. Изучение различных механизмов патогенеза показало многофакторность развития СПКЯ с вовлечением многих органов и систем, в частности гипоталамо-гипофизарного комплекса, овариальных и экстраовариальных структур [103].

Основываясь на вариабельности клинических и биохимических проявлений, большинство клиницистов устанавливают диагноз СПКЯ на основании трех главных критериев: хронической ановуляции, гиперандрогении и эхографических признаков поликистозных яичников, которые были закреплены Роттердамским консенсусом в 2003 году [102]. Согласно данному документу, наличие 2-х из 3-х вышеперечисленных критериев позволяет установить диагноз СПКЯ при исключении других патологических состояний, имеющих сходные клинические и лабораторные симптомы.

Тем не менее, Роттердамские соглашения не принесли полную удовлетворенность и согласие среди исследователей, потому что многие аспекты СПКЯ, например инсулинрезистентность и риск развития сахарного диабета II типа, не были отражены в этой классификации.

К началу третьего тысячелетия пришло новое осмысление СПКЯ: уже как глобальной проблемы соматического здоровья пациентов эндокринно-метаболического статуса, сердечно-сосудистого и онкологического риска, а не только как частой патологии исключительно репродуктивного плана [4, 68].

Известно, что метаболический синдром может быть установлен по наличию хотя бы 2 из 4 суррогатных признаков: по повышению уровня триглицеридов, снижению уровня холестерина, липопротеидов высокой плотности, артериальной гипертензии, гипергликемии натощак или через 2 часа после углеводной нагрузки [5]. Указанные признаки достаточно часто диагностируются у пациенток с СПКЯ, а снижение чувствительности периферических тканей к инсулину в среднем на 50% выявляется при СПКЯ как минимум в 2-3 раза чаще, чем в общей популяции, что обуславливает необходимость скрупулезного изучения параметров метаболических процессов у пациенток с СПКЯ.

В этиологии синдрома поликистозных яичников большое значение имеет генетическая предрасположенность; предполагается полигенный характер наследования [67, 97]. Многие исследователи отмечают семейные случаи СПКЯ. Отмечено, что наличие гиперандрогении у матери или сестер ассоциируется с повышенным риском СПКЯ. В частности, описана связь между андрогенной алопецией, инсулинрезистентностью и наличием СПКЯ в семьях. При наличии СПКЯ у матери и сестер существует генетическая предрасположенность к заболеванию (в 100% и в 50% случаях соответственно) с вероятностью пенетрации в 77% и 88% случаев [67].

Ключевые гены, имеющие отношение к развитию клинических проявлений СПКЯ, представлены двумя основными группами [63]. В первую группу включены гены, контролирующие метаболические процессы обмена глюкозы и, соответственно, состояния гиперинсулинемии и инсулинрезистентности. Во вторую группу включены гены, отвечающие за синтез стероидных гормонов и индивидуальную чувствительность тканей к андрогенам.

Изменения в структуре одного или нескольких из этих генов могут вызвать развитие тех или иных клинических симптомов (или симптомокомплексов), характерных для синдрома поликистозных яичников.

Вместе с тем до настоящего времени, несмотря на достаточно большие усилия, не были определены достоверные молекулярно-генетические дефиниции, которые бы объединяли пациентов с СПКЯ. Современный уровень науки, появление высоких технологий и достижения молекулярно-генетических исследований, естественно, предрасполагают к новому этапу в попытках детерминировать клинические признаки СПКЯ на молекулярно-генетическом уровне.

Цель исследования

Поиск молекулярно-генетических факторов, участвующих в формировании эндокринно-метаболических нарушений при СПКЯ, и уточнение патогенетических механизмов развития заболевания.

Задачи исследования

1. Провести сравнительный анализ клинико-анамнестических и эндокринных характеристик пациенток с СПКЯ и пациенток без СПКЯ;

2. Изучить особенности углеводно-липидного спектра с оценкой состояния толерантности к глюкозе и инсулинрезистентности у пациенток исследуемых групп;

3. Провести поиск, направленный на установление ассоциативных связей между полиморфизмами ряда генов и СПКЯ;

4. Изучить ассоциативные связи, способствующие формированию эндокринно-метаболических нарушений у пациенток с СПКЯ и пациенток группы сравнения.

Положения, выносимые на защиту

I. Ведущими эндокринными характеристиками СПКЯ являются гиперандрогения и повышенный уровень ЛГ, обуславливающие ановуляцию, нарушение ритма менструаций и поликистозные яичники. Основное значение в формировании метаболических нарушений имеет избыточная масса тела, а на фоне эндокринных изменений, характерных для СПКЯ, усугубляются нарушения углеводного и липидного обмена. II. Полиморфизмы генов IRS2 (rs 1827845) и IRS1 (rs 1801278) напрямую ассоциированы с развитием СПКЯ, а также являются предрасполагающими факторами в развитии инсулинрезистентности и нарушений толерантности к глюкозе у пациенток с СПКЯ.

Научная новизна

Полученные результаты показали, что объединяющими для СПКЯ клиническими признаками являются: ановуляция, нарушение менструального цикла и ультразвуковые признаки поликистозных яичников. Показано, что ведущими эндокринными характеристиками СПКЯ являются гиперандрогения и повышенный уровень ЛГ, подтверждающими патогномоничность гиперандрогении для СПКЯ.

В сравнительном аспекте проанализированы параметры углеводно-липидного обмена у женщин с СПКЯ и без него и показана значимость избыточной массы тела в формировании метаболических нарушений. Кроме того, показано, что указанные нарушения усугубляются у пациенток с СПКЯ.

Впервые на российской популяции выявлены ассоциации полиморфизмов генов IRS2 (rsl827845) и IRS1 (rsl801278) с формированием СПКЯ, а также с развитием инсулинрезистентности и нарушений толерантности к глюкозе у пациенток с СПКЯ.

Практическая значимость

На основании полученных данных разработаны практические рекомендации по совершенствованию диагностики СПКЯ, инсулинрезистентности и нарушений толерантности к глюкозе у пациенток с СПКЯ и осуществлению профилактических мероприятий, направленных на предупреждение развития эндокринно-метаболических нарушений при СПКЯ.

Апробация работы

Апробация диссертации была проведена на заседании Апробационной комиссии ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России 14.03.2011.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 114 страницах, содержит 6 рисунков, 12 таблиц. Список литературы содержит 131 работу, в том числе 26 работы отечественных авторов и 105 работ зарубежных авторов.

выводы

1. Признаками, объединяющими больных с СПКЯ, являются: нарушения менструального цикла, преимущественно по типу олигоменореи (у 98%), ановуляция (у 100%), ультразвуковые признаки поликистозных яичников у (100%) и биохимическая гиперандрогения (у 68%). Среди пациенток группы сравнения (без СПКЯ) указанные признаки представлены с частотой 3,2%; 5%; 1,63% и 9% соответственно (р<0,05).

2. Распределение избыточной массы тела и ожирения I степени не продемонстрировало достоверных различий среди пациенток обеих групп: избыточная масса тела имела место у 45%, а ожирение I степени — у 14,2% пациенток с СПКЯ; в группе сравнения - у 39% и 14,5% соответственно. В то же время отмечено преобладание висцерального типа ожирения в группе пациенток с СПКЯ - 54,2% и 33,8% в группе сравнения.

3. Показатели липидного обмена, перорального глюкозотолерантного теста и результаты индекса НОМА изменены у женщин с избыточной массой тела, как при СПКЯ, так и в группе сравнения.

4. Не обнаружены прямые ассоциации полиморфизмов генов РБТ, БТО, РЕМ1А, БЕМШ, РРАЕ^, 80ТА с наследственной предрасположенностью к развитию СПКЯ, а также с риском развития инсулинрезистентности, ожирения, нарушенной толерантности к глюкозе, как в группе с СПКЯ, так и у пациенток без СПКЯ.

5. Обнаружена прямая ассоциативная связь полиморфизмов генов IRS2 (rs 1827845) и IRS1 (rs1801278) с развитием СПКЯ и риском развития инсулинрезистентности и нарушения толерантности к глюкозе при этом заболевании.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для установления диагноза СПКЯ необходимо подтвердить наличие следующих клинических признаков: ановуляция, сочетающаяся с нарушениями менструального цикла, преимущественно по типу олигоменореи; ультразвуковые признаки поликистозных яичников, которые могут присутствовать в различных комбинациях, но не менее трех характеристик; гиперандрогения, определяемая в периферической крови и/или гирсутизм, диагностированный по шкале Ферримэна-Голвея.

2. Для профилактики формирования СПКЯ целесообразно девочкам, имеющим избыточную массу тела, отягощенный наследственный анамнез, нарушения менструальной функции, признаки гирсутизма в период пубертата определять IRS2 (rs 1827845) и IRS1 (rsl801278).

3. В случае выявления полиморфизма IRS2 (rs 1827845) и IRS1 (rs 1801278) в сочетании с клиническими симптомами СПКЯ пациенткам необходимо рекомендовать изменение образа жизни: диета, физические упражнения, отказ от курения и приема алкоголя, гормональную терапию.

4. Женщинам, имеющим ИМТ >25 кг/м2; уровень глюкозы в крови натощак > 6,7 ммоль/л и через 2 часа после перорального приема 75г. глюкозы > 7,8 ммоль/л и индекс НОМА>2,77, необходимо проводить регулярный скрининг на наличие инсулинрезистентности и оценивать липидный профиль для предотвращения развития сердечно-сосудистой патологии и СДII типа.