Автореферат и диссертация по медицине (14.00.24) на тему:Молекулярно-генетическая идентификация личности по исходам событий с массовыми человеческими жертвами: новый подход на основе компьютерной обработки данных

На правах рукописи

ЩЕРБАКОВА Елена Владимировна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЛИЧНОСТИ ПО ИСХОДАМ СОБЫТИЙ С МАССОВЫМИ ЧЕЛОВЕЧЕСКИМИ ЖЕРТВАМИ: НОВЫЙ ПОДХОД НА ОСНОВЕ КОМПЬЮТЕРНОЙ ОБРАБОТКИ ДАННЫХ

14.00.24 - судебная медицина

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2005

Работа выполнена в отделе судебно-медицинских генетических научных и экспертных исследований Федерального государственного учреждения Российский центр судебно-медицинской экспертизы Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию и в отделении молекулярно-генетических исследований 124 Центральной лаборатории медико-криминалистической идентификации Министерства Обороны Российской Федерации.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

- доктор биологических наук, профессор П.Л. Иванов

- Чл.-корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор Ю.И. Пиголкин

-доктор медицинских наук, профессор Г.А. Пашинян -доктор медицинских наук, профессор Л.О. Барсегянц

Ведущая организация: Бюро судебно-медицинской экспертизы Департамента здравоохранения г. Москвы.

Защита диссертации состоится «^У » -Ш 2005 года в^Г^часов на заседании диссертационного совета Д 280.070.01 при ФГУ Российский центр судебно-медицинской экспертизы Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию по адресу: 123242, Москва, ул. Садовая-Кудринская, д. 3, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения Российский центр судебно-медицинской экспертизы Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.

Автореферат разослан « 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

доцент O.A. Панфиленко

■WG-У

' езм

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В связи с участившимися в последнее время техногенными и природными катастрофами, вооруженными конфликтами и террористическими актами в судебно-медицинской практике все большую значимость приобретает задача идентификации останков тел в условиях массовой гибели людей. Между тем, при идентификации неопознанных останков при их массовом поступлении из зоны катастрофы, как правило, возникают значительные трудности.

В первую очередь, это связано со значительными повреждениями трупов (Плаксин ВО., Шапиро В.А., 1989; Нечаев Э.А., 1990; Пашинян ГА, Тучик Е.С., 1994). Многие тела оказываются сильно деформированы, подвергнуты обгоранию, частичному или полному разрушению Вследствие грубых повреждений тел погибших, тканей и органов трупов, а также поздних трупных изменений, наблюдается утрата идентификационно значимых признаков вплоть до того, что многие останки оказываются непригодными не только для визуального опознания, но и для экспертной идентификации с применением традиционных методов исследования, применяемых в судебной медицине. Например, в период вооруженного конфликта в Чеченской Республике в 1994-96 гг. поступление неопознанных погибших со значительными повреждениями, приведшими к утрате идентификационно значимых признаков, составило до 15% от общего числа погибших (Балдин Д.Г. и соавт., 1997).

При чрезвычайных ситуациях с массовыми человеческими жертвами существенные затруднения обусловлены и большим объемом проводимых идентификационных работ. Кроме этого, установление личности погибших осложняет то обстоятельство, что для экспертизы, как правило, бывают недоступны документированные биологические образцы от устанавливаемых лиц, которые могли бы послужить объектами сравнения для прямой идентификации.

В сложившихся условиях решить задачу идентификации тел, при их массовом поступлении из зоны катастрофы, только при помощи традиционных методов, применяемых в судебно-медицинской идентификации личности, не представляется возможным. Очевидно, что решающую роль здесь могут сыграть методы молекулярно-генетического анализа - благодаря своей высокой дискриминирующей способности и возможности использования схем непрямой идентификации, когда в качестве идентифицирующих объектов используются биологические образцы от родственников погибших (Иванов П.Л., 1999,2001,2002,2004).

Ранее были разработаны общие принципы использования молекулярно-генетических методик для целей судебно-медицинской идентификации в случаях массовых человеческих жертв, основанных на сочетанном типировании хромосомной и митохондриальной (мт) ДНК (Иванов П.Л. и соавт., 2002, 2004). Также были разработаны варианты экспертного применения информационных технологий в виде компьютерных автоматизированных аналитических систем (Гаврилей Ю.К. и соавт., 2002), обеспечивающие эффективный анализ больших массивов молекулярно-генетических экспертных данных.

Полученные в этих работах результаты и накопленный методический опыт обосновали внедрение этих методических подходов в практику экспертной работы при чрезвычайных происшествиях с массовыми человеческими жертвами и существенно расширили возможности экспертной идентификации личности В развитие этих исследований предпринята настоящая работа.

Цель исследования.

Разработка и оптимизация комплексного применения молекулярно-генетических и компьютерных методов анализа для идентификации личности при чрезвычайных ситуациях с массовыми человеческими жертвами.

Задачи исследования.

1 Разработка методических подходов для компьютерного анализа результатов молекулярно-генетического исследования.

2 Оптимизация молекулярно-генетических методов исследования для решения идентификационных задач применительно к ситуациям с массовыми человеческими жертвами.

3 Разработка алгоритма экспертного молекулярно-генетического исследования по исходам событий с массовыми человеческими жертвами.

4 Практическая реализация и оценка эффективности комплексного использования молекулярно-генетических и компьютерных методов анализа для решения вопросов идентификации личности при большом количестве неопознанных погибших

Научная новизна работы и практическое значение работы.

Для оптимизации процесса пробоподготовки предложена процедура глубокой очистки образцов костного и зубного материала с помощью применения стоматологических боров. Оптимизация процесса позволила повысить качество и эффективность проводимого молекулярно-генетического экспертного исследования.

Впервые была разработана и использована компьютерная программа ВИАбайо в целях идентификации личности при массовой гибели людей Для сравнительного анализа митохондриальной ДНК применена компьютерная программа шОЫАЬазе

Разработан алгоритм молекулярно-генетического исследования для целей идентификации личности с использованием компьютерных технологий применительно к массовому поступлению обезличенных погибших

На основании разработанного алгоритма и программного обеспечения проведена идентификация останков погибших.

Полученные результаты и накопленный методический опыт существенно расширили возможности экспертного исследования в плане идентификации личности в условиях массового поступления неопознанных тел и подготовили научное обоснование для внедрения этих методических подходов в практику судебно-медицинских учреждений страны.

Разработанный метод компьютерного анализа результатов молекулярно-генетического исследования, обеспечивающий эффективный анализ больших массивов молекулярно-генетических экспертных данных при значительном сокращении их сроков, внедрен в практику 124 Центральной лаборатории медико-криминалистической идентификации Министерства Обороны Российской Федерации. Полученные результаты внедрены в экспертную деятельность ФГУ Российского центра судебно-медицинской экспертизы Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию и используются в экспертной практике 124 ЦЛ МКИ МО РФ при проведении экспертиз в целях установления личности погибших в ходе вооруженных конфликтов, террористических актов и чрезвычайных ситуаций. Основные положения диссертационной работы внедрены в соответствующий раздел учебного плана кафедры судебной медицины Ижевской Государственной медицинской академии и нашли широкое применение в практике Бюро судебно-медицинской экспертизы Саратовской области при производстве молекулярно-генетических экспертиз по уголовным делам и установлении родства

Результаты работы нашли применение при проведении более 123 экспертиз и исследований, в числе которых идентификационные исследования по установлению личности жертв авиакатастрофы вертолета МИ-26 в населенном пункте Ханкала 19 августа 2002 г., террористического акта в г. Беслане, произошедшего 1 сентября 2004 года, а также останков тел военнослужащих, погибших в Чеченской Республике в 1994-2004 гг.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработаны методические подходы, позволяющие повысить эффективность молекулярно-генетического идентификационного исследования с помощью специализированных программных средств.

2 Оптимизированы отдельные этапы молекулярно-генетического исследования (пробоподготовка, экстракция ДНК и др) применительно к событиям с массовыми человеческими жертвами.

3 Комплексное использование молекулярно-генетических и компьютерных методов анализа продемонстрировало возможность эффективного решения задачи идентификации личности неопознанных тел при их массовом поступлении.

Апробация работы. Материалы диссертации отражены в научных статьях в рецензируемых изданиях, в том числе и в центральном отраслевом журнале «Судебно-медицинская экспертиза» Всего по теме диссертации опубликовано и принято к публикации 4 работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на конференции молодых ученых Ростовского государственного медицинского университета (апрель 2004 г), на заседаниях Ростовского отделения Всероссийского общества судебных медиков (март 2004 г.).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 126 страницах компьютерной печати и состоит го введения, обзора литературы, материалов и

методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения и выводов. Текст иллюстрирован 13 таблицами и 29 рисунками. Список литературы содержит 192 источника на русском и других языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом для молекулярно-генетического исследования явились 205 образцов биологических тканей (РМ-составляющая). Объекты исследования были представлены мышечной тканью, костной тканью, сухожилиями, ногтевыми пластинами, зубной тканью. В качестве сравнительного материала (АМ-сосгавляющая) были исследованы 194 образца крови родственников, представленные в виде предварительно высушенных образцов на марле, фильтровальной бумаге или на карточках «FTА» Gene Guard, («Fitzco Inc», США).

Проводимые исследования включали ряд последовательных этапов4 выделение ДНК из костной ткани методом фенол-хлороформной экстракции, выделение ДНК из пульпы зуба с применением хелатирующего реагента Chelex 100 и фенол-хлороформного метода, выделение ДНК из мышечной ткани и сухожилия фенол-хлороформным методом и с использованием Chelex 100, выделение ДНК из пятен крови с применением Chelex 100 и фенол-хлороформной экстракции, выделение ДНК из жидкой крови, выделение ДНК из ногтевых пластин

Для исследования полиморфизма длины амплифицированных фрагментов использовали автоматический секвенатор ABI Prism 377 производства фирмы «Perkin Elmer»

Разделение амплифицированных фрагментов мтДНК проводили в денатурирующем геле на автоматическом секвенаторе ABI Prism 377 Сравнительный анализ полиморфных нуклеотидных последовательностей сегментов ГВС1 и ГВС2 выполняли с помощью программы mDNAbase 2 10 (разработка НИИ нейрокибернетики им А.Б Когана Ростовского государственного университета и 124 Центральной лаборатории медико-криминалистической идентификации МО РФ).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Разработка и использование компьютерных методов оценки молекулярно-генетнческих данных в целях идентификации личности по исходам событий с массовыми человеческими жертвами

В работе рассматриваются вопросы разработки и применения компьютерного программного средства, которое характеризует метод непрямой ДНК-идентификации, основанный на установлении биологического родства Расчетные алгоритмы данного метода опираются на закономерности наследования признаков от родителей к детям и сводятся к сравнительному анализу аллельных состояний локусов хромосомной ДНК у неопознанных тел и возможных родителей этих неопознанных погибших и к вычислению коэффициентов правдоподобия гипотез их вероятного родства

Программные средства поддерживают базы данных с идентификационными характеристиками У>ГШ и ЯТЯ-локусов, локусов НЬА ЕК^А! и системы РМ (потенциальный набор 23-локуса). Для выполнения поиска предусмотрены режимы перекрестной обработки баз данных результаты идентификации, которых формируются в виде списков исключений и таблиц с рассчитанными коэффициентами правдоподобия для вероятностной экспертной оценки родства Программа поддерживает обновляемый расчет частот встречаемости аллелей. Предлагаемый компьютерный метод косвенной идентификации представляет собой новый высокоэффективный инструмент для решения задач идентификации личности по хромосомным маркерам в условиях поточной обработки информации при массовом поступлении неопознанных тел.

Программный пакет ЭМА<1ас1о структурно состоит из следующих частей (рисунок 1):

• База данных неопознанных тел. Включает записи номера тела, разновидность биоматериала; даты начала и окончания исследования; типированные локусы ДНК; фамилия эксперта; примечание и результат экспертизы;

• База данных родственников. Включает записи семейных групп с набором типированных локусов ДНК; с информацией о родственных отношениях и с указанием региона, в котором проживает данная группа;

• Таблицы частот встречаемости аллелей локусов ДНК;

• Вычислительные модули и интерфейс.

Рнс.1. Основное окно программы БКАсЗасЮ

В основные функциональные возможности программы входит: • Работа с базой данных с результатами молекулярно-генетического исследования (выполнение основных операций - ввод, редактирование, удаление записей, поиск записей и т.п.);

• Вычисление частот встречаемости аллелей осуществляется по данным таблиц базы дашшх уже идентифицированных лиц. При этом из расчета исключаются прямые потомки в родственной группе;

• Режимы идентификации - идентификация неопознанного тела по заданной родственной группе; идентификация принадлежности к некоторой родственной группе по заданному номеру тела; определение отцовства, материнства; уточнение идентификации на основе перекрестной обработки баз данных неопознанных тел и баз данных родственных групп;

• Формирование результатов идентификации в виде списков исключений и генерация рекомендательных списков на основе вероятностной оценки;

• Экспорт результатов идентификации (в виде таблиц и списков) в редакторы MS Excel/Word для создания актов экспертизы и заключений эксперта.

В программном пакете реализован базовый алгоритм идентификации, основанный на расчете коэффициента правдоподобия оценки гипотез Он состоит из следующих этапов обработки молекулярно-генетической информации:

1. Классификация родственной группы для определения сценария расчета в зависимости от ее состава и характеристик наблюдаемых генотипов (профилей ДНК);

2 Выполнение процедуры исключения из анализа данных о неопознанных телах, которые принципиально не могут быть в родсгве,

3 Вычисление коэффициента правдоподобия статистической оценки гипотезы о возможном кровном родстве.

4 Оценка коэффициента правдоподобия с целью формирования заключения проведенной экспертизы. Общая формулировка процедуры вероятностной оценки кровного родства основана на Байесовском методе оценки условных вероятностей [Иванов П Л, 1999; Brenner С. 1993; Evett IW. е а, 1989; Haghmd W.ü. е.а., 1990]. В таблице 1 отражена классификация значений коэффициента правдоподобия LR, которую можно оценивать в соответствии с формулировками, принятыми в работе [Evett I.W е.а., 1989] В правом столбце приведена соответствующая вероятностная оценка события.

Таблица 1

Классификация коэффициента правдоподобия по Еуей [Еуей I. XV. е.а, 1989] и оценка вероятности идентификации в

Значение коэффициента правдоподобия iT.RI Формулировка Вероятностная оценка (%)

ДО 10 Доказательство слабо подтверждает гипотезу о том, что данная родственная группа находится в кровном родстве с 90,909

от 10 до 100 Доказательство подтверждает гипотезу от 90,909 до 99,010

от 100 до 1000 Доказательство строго подтверждает гипотезу ... от 99,010 до 99,900

от 1000 Доказательство очень строго подтверждает гипотезу ... от 99,900

При генетическом анализе кровного родства, на основе результатов типирования ДНК по нескольким локусам, выделяются три сценария выполнения расчетов в зависимости от состава группы объектов сравнения

(а) объекты сравнения - оба родителя;

(б) объекты сравнения - один из родителей (либо ребенок);

(в) объекты сравнения - один го супругов и ребенок.

Таким образом, предлагаемый компьютерный метод представляет собой новый эффективный инструмент для решения задач идентификации личности по хромосомным маркерам в условиях поточной обработки информации при массовом поступлении неопознанных тел.

2. Выбор н оптимизация молекулярно-гепетических методов исследования применительно к идентификации останков из зоны катастроф

2.1. Сравнительная оценка эффективности процесса подготовки объектов для получения препаратов ДНК из костной и зубной ткани

Для достижения корректных результатов молекулярно-генетического исследования очередной задачей явилось повышение качества и эффективности процесса пробоподготовки для костного и зубного материала, подвергшегося воздействием физико-химических факторов. Нами были отработаны и внедрены дополнительные лабораторные процедуры очистки материала с использованием стоматологической бормашины и зуботехнических фасонных карборундовых головок, вулканитовых дисков и твердосплавных боров.

Для костного материала усовершенствованный вариант пробоподготовки состоял в том, что после стандартной процедуры обработки костного препарата и тщательного высушивания кости, с помощью бормашины со стерильными карборундовыми головками удалялись остатки надкостницы и губчатый слой а также обугленные и сильно загрязненные участки кости (Рис 2) После этого костную ткань измельчали и проводили экстрагирование ДНК стандартными методами

Рис. 2. Обработка костного препарата

Для зубной ткани усовершенствованный вариант пробоподготовки состоял в том, что после стандартной процедуры обработки и тщательного высушивания зуба, вместо полного его измельчения производили следующие манипуляции (Рис. 3, 4).

1 используя бормашину, вулканитовым диском отделялась коронка зуба на уровне коронковой части пульповой камеры,

2 пульпоэкстрактором извлекались остагки пульпы, и соскабливался парапульпарный слой дентина из корневых каналов.

3 бором снимался парапульпарный и плащевой слой дентина со стенок коронковой части полости зуба и плащевой дентин стенок корневых каналов

Рис. 4. Извлечение пульпы зуба из корневых каналов

Для оценки эффективности предложенных дополнительных процедур нами были проведены сравнительные экстракционно-амплификационные эксперименты

На Рис 5 результат эксперимента, в котором экстракт ДНК из образца кости, который был обработан с применением бормашины, и экстракт ДНК из образца той же кости подготовленного по стандартной схеме.

1 2 3

Рис.5. Амплификация на матрице ДНК локусов (Amelogemn, локусы STR D3S1358, vWA, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317 и D7S820) в препаратах, экстрагированных из образца кости, подвергнутого обработке бормашиной (Дорожка 1) и из образца той же кости, подготовленного по стандартной методике (Дорожка 2) Дорожка 3 - маркер молекулярных масс, ДНК фага X, обработанная рестриктазами E«, RI и Hind III.

На Рис 6 результат эксперимента, в ходе которого был амплифицирован экстракт ДНК из пульпы зуба, полученной с помощью пульпоэкстрактора и экстракт ДНК из целого измельченного зуба

1 2 3

Рис. 6. Амплификация на матрице ДНК локусов (Amelogenin, локусы STR-D3S1358, vWA, FGA, D8S1179, D2IS11, D18S51, D5S818. D13S317 и D7S820) в препаратах, экстрагированных из зуба, обработанного с применением бормашины (Дорожка 1) и из целого зуба, подготовленного по стандартной методике (Дорожка 2) Дорожка 3 - маркер молекулярных масс, ДНК фага Я, обработанная рестриктазами EC0RI и Hind III

Полученные в работе результаты демонстрируют заметно большую эффективность наработки специфического амплификационного продукта (и, соответственно, большую перспективность с точки зрения молекулярно-генетического экспертного исследования) в тех случаях, когда матричные препараты ДНК были получены из образцов костной ткани и зубной ткани подготовленной к экстрагированию с помощью предложенной нами усовершенствованной методики Всего было исследовано 19 и 5 объектов соответственно

Описанные выше действия явились существенным дополнением в процессе получения чистой фракции ДНК, уменьшения влияния фрагментов чужеродной ДНК, способных исказить результаты амплификации, снижение содержания солей кальция эмали зуба, как потенциальных ингибиторов реакции амплификации, уменьшение количества «шлаковых», с минимальным содержанием нуклеиновых кислот элементов зубных тканей в исследуемом материале.

2.2. Оценка методов экстракции ДНК из мышечной ткани и пятен крови для анализа в полимеразной цепной реакции

Для подбора соответствующей методики в зависимости от вида объекта, его состояния и количества нами был проведен сравнительный анализ метода

экстракции ДНК в присутствии СЪе1ех 100, относящегося, к так называемым, экспресс-методам, и классического фенольно-детергентного метода

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис.7. Тестовая электрофореграмма (окрашивание этидиумбромидом) продуктов амплификации локусов панели Profiler Plus на матрице суммарной ДНК в препаратах, полученных из референтных образцов крови с использованием Chelex 100 Сторожки 1-3) и фенольно - детергентным методом (дорожки 4-6) Дорожка 7 - отрицательный контроль Дорожка 8 - маркер молекулярных масс (ДНК фага 'К гидролизованная рестриктазами Eco R1 и Hind III)

На Рис 7 приведен результат оценки качества и количества амплификационных продуктов, полученных на матрице ДНК, выделенной из образцов крови экспресс-методом (первые три лунки, с затратой времени 1 час) и фенольным методом (вторые три лунки, с затратой времени не менее 10 часов).

При анализе продуктов амплификации (дорожки 1, 2, 3) заметна меньшая наработка продукта, чем в последующих трех дорожках, иллюстрирующих результаты фенольной экстракции При дальнейшем электрофоретическом разделении амплификационных продуктов в полиакриламидном геле, была получена картина, иллюстрирующая эффективность амплификации аллельных фрагментов всех полиморфных локусов мультиплексной системы Profiler Plus на матрице ДНК в препаратах, полученных из образцов крови и мягких тканей с использованием Chelex 100 (Рис. 8, 10).

Рис.8. Электрофореграмма (компьютерная расшифровка) аллелей полиморфных локусов системы Profiler Plus хромосомной ДНК полученной с применением Chelex 100 из образца крови, визуализированной на второй дорожке электрофореграммы (Рис 7), (ПО GeneScan, ABI 377 Prism)

1 2 3 4 5 6

Рис.9. Тестовая электрофореграмма (окрашивание этидиумбромидом) продуктов амплификации локусов панели Profiler Plus на матрице суммарной ДНК в препаратах, полученных из образцов мягких тканей с использованием Chelex 100 (дорожки 1, 2) и фенольно - детергентным методом (дорожки 3, 4) Дорожка 5 - отрицательный контроль Дорожка 6 - маркер молекулярных масс (ДНК фага "к, гидролизованная рестриктазами EcoRI и Hind III)

i 4 <. . ' "¿'ti X. -'iirz сям«ая»яйл->вву-1 1 с* i

»-Г ( У*

___J, -s __[_ j____

fed м »

■f ! |

QQ >. i

U" It" Й I. _ _

tm * «

\ ■4 ■ «

Рис.10. Электрофореграмма (компьютерная расшифровка) аллелей полиморфных локусов системы Profiler Plus хромосомной ДНК, полученной с применением Chelex 100 из образца мягкой ткани, визуализированной на первой дорожке электрофорегр&ммы (рис. 9), (ПО GeneScan, ABI 377 Prism)

Таким образом, при использовании экспресс-метода экстракции ДНК стало возможным в максимально короткие сроки получить воспроизводимые и приемлемые результаты при молекулярно-генетическом исследовании мягких тканей примерно в 51% случаев, и, практически, в 100 % случаев образцов крови

3. Алгоритм использования молекулярно-генетического анализа ядерной и митохондриальной ДНК с применением компьютерных технологий для целей идентификации личности по исходам событий с массовыми человеческими жертвами.

Для судебно-медицинской идентификации погибших, ранее были разработаны молекулярно-генетические технологии, основанные на комплексном типировании хромосомной и митохондриальной ДНК

В развитие этих исследований, на основе комплексного использования программных пакетов DNAdacto и тDNA base, нами был разработан алгоритм компьютеризированного анализа данных типирования хромосомной и митохондриальной ДНК Программное обеспечение mDNAbase предназначено для идентификации постмортальных объектов на основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей митохондриальной ДНК в родственных группах по материнской линии, и использовалось в комплексе с DNAdacto всего в 3 % случаев

Схематически алгоритм комплексного применения программных средств представлен на Рис. 11

Алгоритм использования ДНК-технологий в целях идентификации личности по исходам событий с массовыми человеческими жеотвами

Титрование хромосомной ДНК РМ- и АМ- объектов с формированием Базы данных ГЖАс1ас1о

■

Запуск процесса идентификации в оболочке программы ТУЫАНасГо

л

Выбор АМ- объектов с максимально! конкретному РМ- объ( \ мерой близости к ;кту

УСТАНОВЛЕ

НИЕ КРОВНОГО РОДСТВА

РЕЗУЛЬТАТ

Высоко вероятно «ДОСП» от 99,9% и выше

Вероятно, предположительно. 1 Отсутствие результата

амплификации какого-либо локуса, вследствие деградации ДНК;

2.Неполноценность АМ- материала (образец крови одного из родителей);

3. В списке вероятных объектов есть иные, имеющие меньшую меру близости.

Вероятно «ДСП» 99,0-99,9%

Предположительно «ДП» 90,9-99,0%

Увеличение количества типируемых локусов по системе СОЯег

Исследование нуклеотидной последовательности мтДНК

Формирование БД нуклеотидных последовательностей мтДНК РМ- и АМ-объектов в программе тОЫАЬаяе

Запуск процесса идентификации в оболочке программы тОИАЬазе

Положительный

Отрицательный

На первых этапах работы, после типирования хромосомной ДНК и с формированием базы данных, программой ЪШеЬгс1о запускается процедура идентификации, с исключением типированных объектов, которые не обнаруживают признаков кровного родства В случае, если кровное родство не исключено, проводится вероятностная оценка принадлежности неопознанного тела к родственной группе с вычислением коэффициента правдоподобия При получении результатов вероятно, и предположительно с соответствующими формулировками ДСП и ДП (а они получаются при отсутствии результата амплификации какого-либо из локусов; при наличии образца крови одного го родителей или в списке вероятных объектов имеются иные, имеющие меньшую меру близости) проводится дополнительный анализ с расширением панели исследуемых локусов. Если и в этом случае вероятностная оценка возрастает несущественно, то проводится исследование нуклеотидной последовательности мтДНК с последующим введением в базы данных программного пакета тОИЛЬюе. Далее производится процедура идентификации для выявления возможных родственных групп и формирования отрицательного или положительного результата, дающего уверенно формировать вывод о исключении или установлении кровного родства

При таком комплексном анализе данных реализуется принцип взаимопроверяемости и взаимодополняемости результатов идентификации.

Этот принцип наглядно представлен в следующем примере: Для фрагмента № 68-В (Рис. 12) был установлен подходящий вариант референтной группы, а именно, мать одного из погибших.

фио Родство D3S1358 VWA FGA D8S1179 D21S11 018S51 05S81I 0138)17 B7S820

с мать 15,16 15,17 1924 13,13 28,29 16,18 11,12 8,10 8,10

Идмтифм ■тор Источим ОЯ13Я VWA FGA 0881171 D21S11 D18S51 055818 013Я17 D7S820

218 не исключено 15,16 15,17 22,24 13,13 28,31 12,13 8.11 10,11

300* не исключено 15,18 17,18 24,26 12,13 28,30 13,16 10,11 8,8 10,12

№8 НЕ ИСКЛЮЧЕНО 15,16 16,17 24 24 13,14 29,29 9,11 10,11 8,12

Идектфштор Результат^-) D1S1J5I VWA FGA 08S11T9 D21S11 D18SS1 05S818 D1J8J17 073820

218 75,326 2,009 4,030 1,887 2,878 1,538 0.7s2 1,748 0,847

300* 12,457 0,685 1,000 1,887 1,439 1,538 1,786 0,837 3,497 0,847

о-в 12»,792 2.009 1,000 3,774 1,439 2.410 о да 4,806 1,613

Рис. 12. Распечатка программы DNAdacto с вариантами родства для образца сравнения С., установленными на основании результатов сравнительного анализа аллельных состояний полиморфных локусов панели Profiler Plus хромосомной ДНК в объектах исследования.

На Рис. 12 видно отсутствие результата амплификации одного из локусов. В подобных ситуациях вероятностная оценка существенно снижается. Однако кровное родство для этой женщины не исключалось с еще двумя неопознанными телами - №№ 300 и 218. Коэффициент правдоподобия гипотез (LR) для этих объектов существенно ниже объекта 68-В Тем не менее, вероятностная оценка для объекта 68-В все равно не превысила 99,20 %.

Поэтому для повышения доказательного значения экспертного вывода было проведено типирование по дополнительным четырем локусам (рис 13).

«ю Роушо доя т rat Dtstm tmsii го» ossri im от mtssa im ш csfipo

с ш 15,16 15,1719,2413,13 28# 16,18 11,12 8,10 8,10 8,14 7дз 8,12 12,13

Кршфипр Иаяиеяе М$1Я V» FGA 0И11Л D21S11 W8SS1 DSOIIИ3017 D7S8» МИ» ТНИ ТКИ CSRP0

68в неискпючвю 15,« 16,17 24,24 13,14 29.29 - 9,11 10,11 1,12 9,и 7,9 1,11 10,12

Иямпфтлу Р«эрты1г№ DJS1J58 ИМ F» DJS117J DM D1SS51 (ДОИ D13SM7 D7S828 D1K53J ТНИ ТЛИ CSFIPO

ш 817,963 2,009 1,000 3,774 1,439 2,410 — 0,637 w ш 10,401 1,689 0,473 0,758

Рис. 13. Распечатка программы DNAdacto с вариантами родства для образца сравнения С., установленным на основании результатов сравнительного анализа аллельных состояний полиморфных локусов панели Profiler Plus и COfiler хромосомной ДНК в объекте исследования.

В результате, кровное родство предполагаемой матери не исключил ось только с объектом 68-В, два других объекта были исключены из-за несовпадения генотипических признаков. При этом коэффициент правдоподобия для объекта № 68-В составил 817,963, а вероятностная оценка события повысилась до 99,87 %, тем не менее, эта величина, не была признана достаточной, поэтому был проведен анализ нуклеотидных последовательностей мтДНК При получении результатов, было обнаружено полное совпадение индивидуализирующих признаков мтДНК человека, останками которого является объект № 68-В с матрилинейными генотипическими характеристиками предполагаемой матери, дающее возможность уверено делать вывод о кровном родстве (таблица 2).

Таблица 2

Гаплотипы мтДНК объекта № 68-В и референтного образца крови С. Номенклатура отражает позиционные отличия в нуклеотиднон последовательности анализируемых мтДНК от (Ж».

Митотип (Ь-цепь) Объекты ГВС 1 ГВС 2

Фрагмент кости № 68-В 16093 С, 16192 Т, 16256 Т, 16270Т, 16291 Т 73 в, 263 в, 315.1С

Образец крови С. 16093 С, 16192Т, 16256 Т, 16270 Т, 16291Т 73 в, 263 в, 315.1 С

Проведенная оценка статистической значимости указывает на то, что такое совпадение митотипов можно считать закономерным, то есть обусловленным матрилинейным родством С. и мужчины, фрагмент биологических тканей которого представлен для исследования, с вероятностью не ниже 99,94% (Для расчета вероятности матрилинейного родства использованы консервативные оценки частоты митотипа для населения Центральной Европы, США, Азии и России. Приведенное выше значение вероятности соответствует Байесовой вероятности при 50%-ной априорной вероятности родства).

Расчетная условная вероятность по двум независимым системам генетических признаков (аллелыгым состояниям хромосомных генов и гаплотипам мтДНК) того, что установленные индивидуализирующие признаки объекта № 68-В могут быть отождествлены с индивидуализирующими признаками биологического сына С. и соответственно, вероятность того, что данный исследованный при экспертизе объект является фрагментом тела именно этого разыскиваемого мужчины, составляет не менее 99,99%.

Надо подчеркнуть, что по возможности (при наличии необходимого сравнительного материала) типирование мтДНК проводили и для тех фрагментов тел, которые уже были идентифицированы с помощью применения других (не молекулярно-генетических) экспертных методов или путем опознания или иных следственных действий Необходимость в этом возникала ' в случае недостаточной доказательственной значимости идентификационных выводов и возможных ошибок Кроме этого, анализ ППАФ мтДНК применяли во всех тех случаях, когда в распоряжении эксперта имелись в качестве сравнительного материала образцы крови только матери погибшего человека, его (ее) брата или сестры или дальних родственников по линии матери.

Широкое применение компьютерных программных средств позволило провести аналитическую работу в относительно короткие сроки для большого массива данных. Разработка и апробирование программы ОЫАскМо в 124

Центральной лаборатории медико-криминалистической идентификации МО РФ представило в распоряжение экспертов новый специализированный и полезный инструмент как для накопления баз данных молекулярно-генетической информации, так и для решения задач идентификации личности в условиях поточной обработки при массовом поступлении неопознанных тел из зоны катастроф и стихийных бедствий.

При использовании для проведения сравнительного анализа идентификационно значимых признаков хромосомной ДНК неполноценных баз данных по референтным образцам (неполные семьи), вероятностная оценка кровного родства часто не достигала желаемых высоких значений. Кроме того, понятно, что то или иное значение, принятое за условно допустимый нижний порог, не всегда может считаться удовлетворительным Поэтому, когда исследование хромосомной ДНК являлось недостаточным, нами осуществлялось комплексное применение программных средств DNAdacto и mDNAbase Компьютерная программа сравнения гаплотипов мтДНК (imDNAbase) использовалась в комплексе с DNAdacto для повышения дискриминирующей способности устанавливаемых комплексов индивидуализирующих признаков.

Таким образом, нами показано, что автоматизированные системы представляют собой чрезвычайно полезный инструмент для накопления и обработки больших массивов молекулярно-генетической информации, а также как средство экспертной оценки при решении задач ДНК-идентификации при массовом поступлении неопознанных тел из зон катастроф и стихийных бедствий.

ВЫВОДЫ

1 Разработаны методические подходы, позволяющие повысить эффективность молекулярно-генетического исследования больших массивов генетических данных. Полученные результаты реализованы в программном пакете «DNAdacto».

2. В целях совершенствования технологических приемов традиционных методов молекулярно-генетического исследования в процессе « пробоподготовки сильно загрязненного и подверженного термодесгрукции биоматериала оптимизированы процедуры глубокой очистки образцов костного материала, позволяющие повысить эффективность наработки специфического амплификационного продукта за счет использования стоматологических боров.

3. Показано, что при исследовании в качестве объекта идентификации целого зуба наиболее эффективны методы экстракции ДНК непосредственно то пульпы.

4. Предложен и апробирован алгоритм комплексного молекулярно-генетического исследования с использованием компьютерных

программных средств при чрезвычайных ситуациях с массовыми человеческими жертвами. 5 Показана возможность эффективного применения компьютерных программных средств для анализа молекулярно-генетических данных в решении практических задач идентификации личности при одновременной работе с большим количеством объектов исследования.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Гаврилей Ю.К., Корниенко И.В., Щербаков В В., Щербакова Е.В., Гуськов Г.Е., Иванов П.Л. Проблемы идентификации личности: Сб. науч. тр. / НИИ Нейрокибернетики им А Б Когана РГУ, 124 ЦЛ МКИ МО РФ, Российский центр судебно-медицинской экспертизы Минздрава РФ / Отв. ред Гуськов Г.Е.-Ростов-на-Дону,-2002 -С. 222-237.

2 Щербакова Е.В., Добринский P.A., Иванов П JI Усовершенствованный способ подготовки костной и зубной ткани для молекулярно-генетических экспертных исследований // Судебно-медицинская экспертиза. - 2003. - № 6. - С. 16-19.

3 Иванов П JI, Щербакова Е.В., Пиголкин Ю И Практическое использование молекулярно-генетических технологий для решения задач судебно-экспертной идентификации неопознанных останков при чрезвычайных ситуациях с массовыми человеческими жертвами. // Судебно-медицинская экспертиза. - № 5. - 2004. - С. 31-40.

4 Щербакова Е.В., Щербаков В В, Иванов П.Л Алгоритм компьютеризированного анализа молекулярно-генетических данных для решения задач идентификации личности по исходам событий с массовыми человеческими жертвами // Судебно-медицинская экспертиза - № 1 - 2005 - С 21-24 .

Список сокращений

AM - an tem ort em (терминология приведена в соответствии с используемой в подразделениях DVI (анпг Desaster Victim Identification) Интерпола. БД - База данных

ГВС 1 - гипервариабельный сегмент 1 митохондриальной ДНК ГВС 2 - гипервариабельный сегмент 2 митохондриальной ДНК ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота дНТФ - дезоксинуклеотидтрифосфат

мтДНК - митохондриальная дезоксирибонуклеиновая кислота

ДОСП - доказательство очень строго подтверждает

ДП - доказательство подтверждает

ДСП - доказательство строго подтверждает

ДТТ - дитиотрейтол

н.п. - нуклеотидные пары ЭДТА - зтилендиамингетраацеггат

CRS - Кембриджская референтная последовательность (англ: Cambridge Reference Sequence)

FTA Gene Guard - карта FT А с системой защиты генетического материала, «Fitzco Inc.», США

HVR - гипервариабельный участок (англ- hypervariable region)

LR - отношение правдоподобия (англ- Likelyhood Ratio)

РМ - postmortem (терминология приведена в соответствии с используемой в

подразделениях DVI (англ: disaster victim identification) Интерпола

SDS - додетщлсульфат натрия

SSC - стандартный солевой раствор

STR - короткие тандемные повторы (англ' short tandem repeat) ТВЕ -трис-боратный буфер

VNTR - вариабельное число тандемных повторов (англ: variable number of tandem repeats).

Уел печ л 1,16 Зак 300. Тираж 100 экз

Центр оперативной полиграфии Ф1ОУ ВПО МСХА им. К.А. Тимирязева 127550, Москва, ул Тимирязевская, 44

\

РНБ Русский фонд

2006-4 6368

В связи с участившимися в последнее время техногенными и природными катастрофами, вооруженными конфликтами и террористическими актами в судебно-медицинской практике все большую значимость приобретает задача идентификации останков тел в условиях массовой гибели людей. Между тем, при идентификации неопознанных останков при Pix массовом поступлении из зоны катастрофы, как правило, возникают значительные трудности.

В первую очередь, это связано со значительными повреждениями трупов (Плаксин В.О., Шапиро В.А., 1989; Нечаев Э.А., 1990; Пашинян Г.А., Тучик Е.С., 1994). Многие тела оказываются сильно деформированы, подвергнуты обгоранию, частичному или полному разрушению. Вследствие грубых повреждений тел погибших, тканей и органов трупов, а также поздних трупных изменений, наблюдается утрата идентификационно значимых признаков вплоть до того, что многие останки оказываются непригодными не только для визуального опознания, но и для экспертной идентификации с применением традиционных методов исследования, применяемых в судебной медицине. Например, в период вооруженного конфликта в Чеченской Республике в 199496 гг. поступление неопознанных погибших со значительными повреждениями, приведшими к утрате идентификационно значимых признаков, составило до 15% от общего числа погибших (Балдин Д.Г. и соавт., 1997).

При чрезвычайных ситуациях с массовыми человеческими жертвами существенные затруднения обусловлены и большим объемом проводимых идентификационных работ. Кроме этого, установление личности погибших осложняет то обстоятельство, что для экспертизы, как правило, бывают недоступны документированные биологические образцы от устанавливаемых лиц, которые могли бы послужить объектами сравнения для прямой идентификации.

В сложившихся условиях решить задачу идентификации тел при их массовом поступлении из зоны катастрофы, только при помощи традиционных методов, применяемых в судебно-медицинской идентификации личности, не представляется возможным. Очевидно, что решающую роль здесь могут сыграть методы молекулярно-генетического анализа - благодаря своей высокой дискриминирующей способности и возможности использования схем непрямой идентификации, когда в качестве идентифицирующих объектов используются биологические образцы от родственников погибших (Иванов П.Л., 1999, 2001, 2002, 2004).

Ранее были разработаны общие принципы использования молекулярно-генетических методик для целей судебно-медицинской идентификации в случаях массовых человеческих жертв, основанных на сочетанном типировании хромосомной и митохондриальной (мт)ДНК (Иванов П.Л. и соавт., 2002, 2004).

Также были разработаны варианты экспертного применения информационных технологий в виде компьютерных автоматизированных аналитических систем (Гаврилей Ю.К. и соавт., 2002), обеспечивающие эффективный анализ больших массивов молекулярно-генетических экспертных данных.

Полученные в этих работах результаты и накопленный методический опыт обосновали внедрение этих методических подходов в практику экспертной работы при чрезвычайных происшествиях с массовыми человеческими жертвами и существенно расширили возможности экспертной идентификации личности.

В развитие этих исследований целью настоящей работы явилась: разработка и оптимизация комплексного применения молекулярно-генетических и компьютерных методов анализа для идентификации личности при чрезвычайных ситуациях с массовыми человеческими жертвами.

Для реализации поставленной цели определены следующие задачи:

1. Разработка методических подходов для компьютерного анализа результатов молекулярно-генетического исследования.

2. Оптимизация молекулярно-генетических методов исследования для решения идентификационных задач применительно к ситуациям с массовыми человеческими жертвами.

3. Разработка алгоритма экспертного молекулярно-генетического исследования по исходам событий с массовыми человеческими жертвами.

4. Практическая реализация и оценка эффективности комплексного использования молекулярно-генетических и компьютерных методов анализа для решения вопросов идентификации личности при большом количестве неопознанных погибших.

Научная новизна

Для оптимизации процесса пробоподготовки предложена процедура глубокой очистки образцов костного и зубного материала с помощью применения стоматологических боров. Оптимизация процесса позволила повысить качество и эффективность проводимого молекулярно-генетического экспертного исследования.

Впервые была разработана и использована компьютерная программа ВКАёайо в целях идентификации личности при массовой гибели людей. Для сравнительного анализа митохондриальной ДНК применена компьютерная программа пЮЫАЬазе.

Разработан алгоритм молекулярно-генетического исследования для целей идентификации личности с использованием компьютерных технологий применительно к массовому поступлению обезличенных погибших.

На основании разработанного алгоритма и программного обеспечения проведена идентификация останков погибших.

Полученные результаты и накопленный методический опыт существенно расширили возможности экспертного исследования в плане идентификации личности в условиях массового -поступления неопознанных тел и подготовили научное обоснование для внедрения этих методических подходов в практику судебно-медицинских учреждений страны.

Практическая значимость

Разработанный метод компьютерного анализа результатов молекулярно-генетического исследования, обеспечивающий эффективный анализ больших массивов молекулярно-генетических экспертных данных при значительном сокращении их сроков, внедрен в практику 124 Центральной лаборатории медико-криминалистической идентификации МО РФ.

Для повышения эффективности результатов идентификационных исследований по исходам событий с массовыми человеческими жертвами внедрен комплекс молекулярно-генетических методов в практику 124 ЦЛ МКИ МО РФ.

Апробация работы и практическое внедрение

Полученные результаты внедрены в экспертную деятельность Российского Центра СМЭ МЗ РФ, используются в экспертной практике 124 ЦЛ МКИ МО РФ при проведении экспертиз в целях установления личности погибших в ходе вооруженного конфликта или чрезвычайных ситуаций. Основные положения диссертационной работы внедрены в соответствующий раздел учебного плана кафедры судебной медицины Ижевской Государственной медицинской академии и нашли широкое применение в практике Бюро судебно-медицинской экспертизы Саратовской области при производстве молекулярно-генетических экспертиз по уголовным делам и установлении родства. Материалы диссертации доложены и обсуждены на конференции молодых ученых Ростовского государственного медицинского университета (апрель 2004 г.), на заседаниях Ростовского отделения Всероссийского общества судебных медиков (март 2004 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 4 статьи, в том числе 3 статьи в журнале «Судебно-медицинская экспертиза».

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработаны методические подходы, позволяющие повысить эффективность молекулярно-генетического идентификационного исследования с помощью специализированных программных средств.

2. Оптимизированы отдельные этапы молекулярно-генетического исследования (пробоподготовка, экстракция ДНК и др.) применительно к событиям с массовыми человеческими жертвами.

3. Комплексное использование молекулярно-генетических и компьютерных методов анализа продемонстрировало возможность эффективного решения задачи идентификации личности неопознанных тел при их массовом поступлении.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Как показала практика экспертной работы, справиться с решением идентификационных задач по исходам событий с массовыми человеческими жертвами при использовании только традиционных методов анализа.

Огромный массив информации в целом при неполноценности как АМ -, так и РМ - составляющих определили с одной стороны необходимость разработки методов потоковой компьютерной обработки данных и компьютерную адаптацию традиционных методов идентификации личности.

Опыт работы 124 ЦЛ МКИ МО РФ привел к созданию комплексной • экспертно-диагностической системы идентификации личности погибших, на основе разработанных методов потоковой обработки данных, использования компьютерных методов с локальной обработкой данных, а также использования рутинных методов попарного сравнения объектов.

Общим содержанием цикла научно-методических разработок компьютеризированных методов идентификации личности в условиях массового поступления погибших явилось создание и использование:

• программного пакета анализа ядерной ДНК - «БМАс1ас1о». Программный пакет предназначен для создания и ведения базы данных типированных профилей ядерной ДНК с целью идентификации неопознанных тел людей, накопления статистики встречаемости различных аллелей исследуемых локусов ДНК, а также получение списка возможного кровного родства с использованием байесовских методов оценки правдоподобия гипотез.

• программного пакета анализа митохондриальной ДНК -«тБЫАЬазе». Программный пакет предназначен для экспертного анализа первичной базы данных молекулярно-генетических исследований митохондриальной ДНК (мтДНК) с целью идентификации неопознанных останков на основе сравнительного анализа их мтДНК с нуклеотидными последовательностями мтДНК родственных групп по материнской линии.

Эти научные разработки базируются на большом практическом материале. Так по состоянию на 30 января 2004 года в 124-й ЦЛ МКИ МО РФ по исходу вооруженного конфликта 1994-1996 гг. исследовано всего 1078 тел, установлена личность и отправлено к местам захоронения 795-объекта исследования (775 погибших), осталось не установленных объектов исследования 283 (см. рис. 28). Распределение объектов исследования по категориям пригодности для визуального опознания отображено на рис. 29.

Рис.28Соотношение общего числа установленных (зеленый) и не установленных по категориям - непригодные(красный), условно-пригодные(желтый), пригодные(белый) в абсолютном выражении

В период с 19 августа 2002 года по 27.11.2003 года в ходе контртеррористической операции в Чеченской республике исследовано всего -3092 объектов тел, установлена принадлежность части объектов одному целому и отправлено к местам захоронения - 2938 погибших (98,8%), осталось неустановленных объектов исследования - 54. Такое существенное повышение результативности идентификационных работ в сравнении с периодом первой Чеченской кампании объяснимо не только повышением эффективности уже отработанных алгоритмов использования биометрических методов исследования, но и пополнением арсенала используемых методов исследования технологиями ДНК-анализа.

Рис.29Соотношени абсолютного количества установленных (зеленый) и не установленных по категориям: непригодный(красный), условно пригодный (желтый) и пригодный(белый) для визуального опознания пригодные условно пригодные непригодные всего

2068

426 В г

525

51

3019 I

57

-Г-Г

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

Ряд1

Ряд2

Разработка и использование компьютеризированных методов идентификации с применением ДНК-технологий явилась важным этапом в формировании нового системного подхода в идентификации личности, работа которой, в настоящее время, в решающей степени, определяется техническими параметрами системы, а именно: составом компьютерных рабочих мест, оснащённостью их аппаратно-программными средствами, а также квалификацией экспертного состава.

Приведенные на рис. 28 и 29 статистические табличные и графические материалы касаются идентификационных исследований, связанных с ликвидацией последствий конкретных событий с массовой гибелью людей. Поэтому, они показательны в целом - как пример результативности развития методологии широкомасштабных идентификационных работ по исходу локального вооруженного конфликта.