Автореферат и диссертация по медицине (14.00.24) на тему:Изучение аналитических характеристик молекулярно-генетических индивидуализирующих систем в аспекте судебно-экспертного типирования ДНК

На правах рукописи

¿[сиг

ЗЕМСКОВА Елена Юрьевна

Изучение аналитических характеристик молекулярно-геиетических индивидуализирующих систем в аспекте судебно-экспертного типирования ДНК

14.00.24 - судебная медицина

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2008

003169815

Работа выполнена в отделе судебно-медицинских молекулярно-генетических научных и экспертных исследований Федерального Государственного учреждения «Российский центр судебно-медицинской экспертизы Росздрава»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Иванов Павел Леонидович

Официальные оппоненты: Заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор Пашинян Гурген Амаякович

Ведущая организация* ГОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Росздрава

заседании диссертационного совета Д 280.070.01 при ФГУ «Российский центр судебно-медицинской экспертизы Росздрава» по адресу 125284, Москва, ул. Поликарпова, д.12/13

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Российский центр судебно-медицинской экспертизы Росздрава»

Автореферат разослан »_^¿уСО-Л 2008 г

доктор медицинских наук, доцент Лапенков Михаил Иванович

» июня 2008 г в

//

часов на

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук, доцент О Л. Панфиленко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Объекты биологической природы являются самыми распространенными вещественными доказательствами по многим категориям уголовных и гражданских дел Результаты их судебно-медицинских экспертных исследований служат важнейшей доказательной базой при расследовании и раскрытии преступлений и изобличении лиц, их совершивших.

Поэтому методические подходы, направленные на разрешение задач в области судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств биологического происхождения, являются одними из наиболее востребованных в современной судебной науке. Их совершенствование и повышение эффективности представляет значительный интерес для судебных и следственных органов.

Все это, а также прогресс в области фундаментальных исследований и технологий, активное внедрение их результатов в практику, предопределяет неизбежное углубление содержания и расширение возможностей судебно-медицинских экспертиз вещественных доказательств, и в первую очередь, судебно-медицинских молекулярно-генетических исследований.

В последние годы наблюдается все более масштабное развитие новейших высокотехнологичных разработок в области анализа ДНК. Тем не менее, для целей судебно-медицинской экспертной практики не теряют актуальности базовые варианты молекулярно-генетических технологий. По сравнению с методиками, основанными на использовании роботизированных станций и автоматических генетических анализаторов, трудоёмкость и время анализа выше, но стоимость используемого оборудования и реагентов заметно меньше. Речь, в первую очередь, идет о ставшем уже классическим, анализе полиморфизма длины амшшфицированных фрагментов (ПДАФ) ДНК с помощью гель-электрофореза с последующей визуализацией элекгрофоретической картины путем окрашивания бромидом этидия или серебром.

Этот методический подход подробно описан, и его принципы положены в основу индивидуализирующих систем ПДАФ-типа, широко используемых в судебно-медицинской молекулярно-генетической экспертизе [Иванов ПЛ., 1999; Иванов П.Л., 2001; Иванов ПЛ., 2003] Он является весьма эффективным экспертным инструментом, и позволяет решать на высоком уровне доказательности самые сложные экспертные задачи. В то же время, он характеризуется высокой степенью сложности, в частности, в интерпретации полученных данных, и содержит в себе опасность экспертных ошибок, которые могут быть обусловлены недостаточно полным знанием свойств самого используемого инструмента, то есть, свойств тех молекулярно-генетических тест-

систем, которые применяются в анализе. Очевидно, что это может приводить к самым серьезным следственным и судебным ошибкам

В этом плане, углубленное знание аналитических свойств применяемых систем молекулярно-генетического титрования способно повысить эффективность работы эксперта, обеспечив его дополнительной информацией, необходимой для адекватной интерпретации получаемых экспертных данных. Поэтому изучение аналитических характеристик молекулярно-генетических индивидуализирующих систем в аспекте судебно-экспертного типирования ДЕК представляется весьма важной и актуальной исследовательской задачей.

Цель и задачи исследования

Цель диссертационной работа заключалась в проведении комплекса научно-методических исследований, направленных на дальнейшую методическую разработку судебно-медицинских аспектов применения молекулярно-генетических индивидуализирующих систем ПДАФ-типа, в частности, на изучение их аналитических характеристик, определения диапазона возможностей и ограничений, а также особенностей их использования дня решения ксифешыхэшЕрпыхзадач В соответствии с этим были поставлены и решены следующие экспериментальные задачи, имеющие теоретическое ицисгвдикзтзж Изучить особенности амелогенинового ДНК-теста определения биологического пола применительно к анализу половой принадлежности ДНК в смешанных биологических следах, содержащих биологический материал человека и животных;

Изучить свойства гетерологических маркерных систем - стандартов молекулярных масс, - определить диапазон возможностей и ограничений применения размерных стандартов данного типа при судебно-медицинском фрагментом анализе ДНК;

Изучить аналитические характеристики некоторых молекулярно-генетических индивидуализирующих систем, применяющихся в современной судебно-медицинской практике, включая уточнение номенклатуры аллельных вариантов и изучение потенциально сцепленных вариантов полиморфизма хромосомной ДНК, и оценить судебно-медицинское значение выявленных свойств;

Изучить популяционные характеристики некоторых индивидуализирующих систем ПДАФ-типа, применяемых для судебно-экспертного типирования ДНК, с целью оценки идентификационной значимости признаков, анализируемых на уровне ДНК.

Научная новизна и практическое значение работы

Настоящая работа является частью комплексных исследований полиморфизма ДНК в аспекте судебно-медицинской идентификации личности и установления биологического родства, проводимых в отде-

ле молекулярно-генетических научных и экспертных исследований Российского центра судебно-медицинской экспертизы Росздрава Таким образом, данная работа непосредственно связана с процессом разработки, развития и внедрения новых высокоэффективных технологий геномной идентификации в сферу деятельности отечественной судебно-медицинской экспертизы.

Проведенное в диссертационной работе целенаправленное научное исследование и углубленная разработка практических основ использования молекулярно-генетических индивидуализирующих тест-систем, основанных на анализе ПДАФ хромосомной ДНК применительно к анализу вещественных доказательств биологического происхождения, открывает новые аспекты судебно-экспертного типирования ДНК. Кроме того, оно представляется весьма актуальным и важным с точки зрения вопросов, решаемых судебно-медицинской идентификационной экспертизой Результаты диссертации могут служить дополнительным материалом для обеспечения системного внедрения молекулярно-генетических методов идентификации личности и определения биологического родства в практическую судебно-медицинскую деятельность экспертизы России.

Результаты работы нашли применение при проведении более чем 700 экспертиз, в числе которых идентификационные исследования по установлению личности неопознанных жертв террористических актов в Москве в 1999 г., останков генерала Г.Н. Шпигуна - заложника, погибшего в Чеченской Республике в 2000 г., останков украинского журналиста Г. Гонгадее в 2001 г., массового убийства малолетних детей в Красноярске 2005 г, убийства женщин, сопряженные с их изнасилованиями на территории Иркутской области в период с 1994 по 2000 г.г, умышленного убийства губернатора Магаданской области В.И. Цветкова в 2002 г., идентификация неопознанного тела задержанного по подозрению в подготовке теракта и погибшего при проведении следственных действий гражданина А.Г. Пуманэ, убийства женщин на территории Битцевского лесопарка в г. Москве 2006-2007 гг., а также идентификационные экспертизы, проведенные в рамках расследования целого ряда других преступлений, имеющих общественный резонанс

Основные положения, выносимые на защиту

1. Амелогениновый ДНК-тест определения биологического пола не является абсолютно видоспецифичным. При судебно-экспертном типировании гена амеяогенина в препаратах ДНК человека, к которым оказалась примешана ДНК животных, существует опасность ложного определения мужского пола в следах женского происхождения В биологических следах животного происхождения возможно ложное определение женского пола. Этому может способствовать неправильно подобранный стандарт молекулярных масс, его удаленное расположе-

ние на геле или использование неточного расчетного алгоритма для определения размеров анализируемых фрагментов.

2. Принципиальное значение для правильной идентификации аллельных вариантов полиморфных локусов ДНК имеет условие, что размерные стандарты (стандарты молекулярных масс) и анализируемые фрагменты гомологичны, то есть, представлены одинаковыми по-линуклеотидными последовательностями В ином случае - если нук-леотидный состав и первичная структура анализируемой и контрольной ДНК оказываются различными (такие ДНК называют гетероло-гичными), нельзя исключить, что в определении размеров фрагментов могут бьггь допущены серьезные ошибки, обусловленные различиями в физико-химических, и, как следствие, электрофоретических свойствах полинуклеотидных цепей с различным нуклеотидным составом.

3 Разрешены выявленные в литературных источниках и имеющие принципиальное значение противоречия, касающиеся структурной организации аллелей полиморфных локусов хромосомной ДНК человека D1S111 и HUMCD4. Преодоление этих противоречий важно с точки зрения применения этих молекулярно-генетических маркеров в судебно-медицинских молекулярно-генетических идентификационных исследованиях и при формировании референтных баз данных.

4. Между микросателлитными локусами генома человека vWA и vWFII существует достоверная генетическая взаимозависимость (неравновесие по сцеплению). Это означает, что при титровании локусов vWA и vWFII в составе одной мультилокусной панели, ввиду показанной в настоящей работе генетической сцепленности этих маркеров, правило перемножения частот аллелей (генотипов) неприемлемо.

Апробация работы

Материалы диссертации отражены в научных статьях, опубликованных в рецензируемых научных журналах и изданиях, определённых Высшей аттестационной комиссией, в том числе, в журнале "Судебно-медицинская экспертиза" (8 статей), а также в публикациях по материалам научных съездов и конференций. Всего по теме диссертации опубликовано 11 работ. Результаты диссертации докладывались на пяти научных конференциях Российского центра судебно-медицинской экспертизы, а также на 4, 5 и б Всероссийских съездах судебных медиков (Владимир, 1996; Астрахань, 2000; Тюмень, 2005). Апробация работы состоялась 10 апреля 2008 г. на расширенной научно-практической конференции ФГУ «РЦ СМЭ Росздрава».

Структура и объём диссертации

Диссертационная работа изложена на 148 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа

иллюстрирована 32 таблицами и 14 рисунками Список литературы включает 224 источника отечественных и зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Материалом для исследования послужили образцы жидкой крови и образцы крови на материале-носителе - марлевые, ватные и бумажные тампоны и аппликаторы, FTA-карты, следы 1фови и биологических выделений, следы слюны на окурках сигарет, образцы слюны на марлевых тампонах, мышечные ткани, части тела и другие объекты от неопознанных трупов людей и расчлененных трупов, мазки (соско-бы) со слизистой оболочки ротовой полости, волосы, гистопрепараты, парафиновые блоки и др, - порядка 1500 объектов, которые были представлены на экспертизу в ФГУ «РЦ СМЭ Росздрава» по более чем 700 уголовным и гражданским делам, при расследовании которых возникла необходимость судебно-медицинского исследования вещественных доказательств для целей идентификации личности или установления биологического родства.

При изучении видовой специфичности амелогениновой системы установления генетического пола для выделения ДНК использовали образцы слюны домашних животных - 8 кошек и 5 собак. Препараты ДНК животных экстрагировали из крови и мышечной ткани крупного рогатого скота, свиньи, барана и домашней птицы (курица). Всего было исследовано 13 образцов животных и птицы.

При изучении аналитических характеристик молекулярно-генетических индивидуализирующих систем, уточнении номенклатуры аллельных вариантов, изучении потенциально сцепленных вариантов полиморфизма хромосомной ДНК были проанализированы более 2000 препаратов амплифицированной ДНК - продуктов ПНР, фракционированных электрофоретически в агарозных, полиакриламидных гелевьгх средах и анализированных в УФ-свете после окрашивания бромидом этидия или визуализированных путем окрашивания серебром.

Для оценки генетического разнообразия и вероятностно-статистического анализа данных использовали компьютерные программы SPSS v 7.5 for Windows, RxC (Rown x Columns) на основе алгоритма, описанного ранее [Roff & Bentzen, 1989], Arlequm [Schneider S. e.a., 2000], GDA [Lewis P. e.a., 1999] и PowerStats [Tereba А. e a., 1999].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изучение видовой специфичности амелогениновов системы установления генетического пола

Амелогениновый тест на половую принадлежность ДНК широко используют в судебном молекулярно-генетическом идентификацион-

ном анализе по причине его надежности и простоты. Кроме того, считается, что он превосходит по чувствительности многие известные на сегодняшний день амплификацию иные индивидуализирующие системы, оперирующие на уровне хромосомной ДНК человека, позволяя даже в базовой постановке (УФ-детекция) диагностировать генетическую половую принадлежность препаратов, содержащих единичные молекулы ДНК.

В настоящей работе мы использовали праймеры, позволяющие амплифицировать очень короткие участки, содержащие ХАГ-гетероморфный сайт: X и У-специфические продукты амплификации имеют длину соответственно 106 и 112 п.н.; дублет 106/112 п.н. -«ХУ» - соответствует мужскому генетическому полу, а полоса 106 п.н., представляющая на самом деле дублет 106/106 п.н. - «XX» - женскому (рис. 1а).

Препараты ДНК, экстрагированной из биологических образцов крупного рогатого скота, свиньи, барана и домашней птицы, животных семейства псовых (собака) и вида кошачьих (кошка), использовали в качестве матрицы для постановки ПНР. При этом было установлено, что ДНК всех исследованных организмов, кроме домашней птицы, дают положительный сигнал (рис. 16).

а) М 1 2 б) М 3 4 5 6 М

Рис. 1. Электрофоретическое фракционирование фрагментов гена амелогенина, амплифицированных на матрице ДНК а) мужчины и женщины (дорожка 1 и 2 соответственно); б) в препаратах, полученных из биологического материала от коровы, быка, свиньи и барана (дорожки 3,4,5,6 соответственно) в ПААГ с концентрацией 8%. М - маркерные фрагменты ДНК рВЮ22/Мзр1. Окрашивание бромидом этидия. Размеры указаны в парах нуклеотидов. УФ-визуализация.

При этом видно, что амплификационный продукт для всех ДНК животных был получен одинакового размера, из чего можно сделать вывод об отсутствии межвидового полиморфизма нуклеотидных последовательностей гена амелогенина у исследованных организмов. Примечательно, что и внутри каждого вида во всех исследованных случаях (независимо от пола животных) продукт амплификации локуса амелогенина также являлся мономорфным. Это означает, что в отличие

от ДНК человека, для ДНК исследованных животных амелогениновый тест не может служить пол-специфическим маркером.

На электрофореграмме (рис. 2а) хорошо видно, что продукты амплификации, полученные на матрице ДНК коровы, барана и ДНК женщины, визуализировались как фрагменты, различавшиеся по размерам на очень небольшую величину. Измерения показали, что фрагменты ДНК животного происхождения имели длину 103 п_н

Полученный результат дает основания считать вполне возможным получение "нетипичных" продуктов амплификации при судебно-экспертном типировании гена амелогенина в препаратах ДНК человека, к которым оказалась примешана ДНК (домашних) животных. Мы подтвердили это предположение экспериментально: при смешивании продуктов амплификации вышеуказанных препаратов и внесении их в одну дорожку ПААГ, амплификационнные фрагменты выглядели как фрагменты, свойственные мужской ДНК, хотя их размеры отличались: получился дублет 103/106 п.н., тогда как дублет ХУ имеет размер 106/112 п.н. (рис. 26). На это нужно обращать особое внимание при выполнении экспертных исследований, так как дублет 103/106 п.н. ошибочно может быть воспринят экспертом как характеристический признак мужской ДНК - дублет ХУ 106/112 п.н. (ср. с рис. 1а).

а) 1 2 М 3 б) М 4

5". •'•

Рис. 2. Эяектрофоретическое фракционирование продуктов амплификации гена амелогенина а) в препаратах ДНК коровы, барана и препарата женской ДНК (дорожки 1,2,3 соответственно); б) в экспериментальном препарате.

Следующим экспериментом была совместная амплификация гена амелогенина на матрице ДНК, выделенных из биологических образцов человека и животных. На рис. 3 приведены результаты опыта, показывающего, что при введении в реакционную смесь ДНК мужчины/женщины в смеси с ДНК крупного рогатого скота амплификацион-ные фрагменты выглядели соответственно как триплет и дублет. Подобные результаты получены также при типировании препаратов ДНК, в которых ДНК человека была смешана с ДНК собаки или кошки.

Очевидно, что с точки зрения судебно-медицинской экспертизы особую опасность представляет случай смешения ДНК животного

именно с ДНК женщины (рис. 3, дорожка 2), поскольку дублет 103/106 п.н. при поверхностной оценке может быть воспринят экспертом как характеристический признак мужской ДНК, то есть как дублет XY 106/ 112 п.н. (рис. 3, дорожка 5).

В случае неправильно подобранного стандарта молекулярных масс, его отсутствия или удаленного расположения, а также неточного определения характера зависимости электрофоретической подвижности анализируемого фрагмента от его размера, такая ситуация может привести к неправильной интерпретации результата типирования.

М 1 2 3 4 5 М

Рис. 3. Элекгрофореграмма продуктов совместной амплификации гена амело-генина в смеси ДНК барана с ДНК мужчины и женщины (дорожки 1 и 2 соответственно), продуктов амплификации гена амелогенина в ДНК барана (дорожка 3), продуктов амплификации контрольных женской и мужской ДНК (дорожки 4 и 5 соответственно) (условия электрофореза см. рис. 1).

Так, например, при смешении крови человека с кровью животного возможно ложное определение мужского пола в следах женского происхождения (как это показано в приведенном выше примере - рис. 3). В свою очередь в биологических следах животного происхождения возможно ложное определение женского пола.

В этом плане большое значение играет качество гель-электрофоретической системы. На рис. 4 приведены результаты смоделированного электрофореза, при котором специально были нарушены технологические параметры, такие как напряженность электрического поля - в сторону увеличения, а также нарушение технологии приготовления геля - концентрация полиакриламида в растворе была уменьшай

1 М 2345

Рис. 4. Электрофореграмма продуктов амплификации гена амелогенина в ДНК барана, коровы, свиньи (дорожки 3,4,5 соответственно), продуктов амплификации контрольных женской и мужской ДНК (дорожки 1 и 2 соответственно) в

ПААГ с концентрацией 5% М - маркерные фрагмента ДНК рВЮ22/М5р1 Окрашивание бромидом этидия Размеры указаны в парах нуклеотидов УФ-визуализация

При этом на первый взгляд, была получена картина линейного искажения подвижности амплифицированных фрагментов ДНК Однако эта ошибка может представлять очевидную опасность при невнимательной оценке, т.к. фрагмент 103 п н. можно с уверенностью принять за фрагмент длиной 106 п н, что также приведет к ложному определению женского пола.

2. Изучение свойств гегерологических маркерных систем применительно к фрагментному анализу ДНК

Отождествление или дифференциация объектов экспертизы осуществляется на основании сравнительного анализа (совпадение -несовпадение) индивидуализирующих признаков ДНК - генотипиче-ских характеристик полиморфных локусов, - выявленных в ходе исследования. Для правильного решения экспертной задачи требуется установить (идентифицировать) выявленные аллели, то есть в точности определить, какие именно аллели данного локуса совпали. Аллели, которые сильно разнятся по частоте встречаемости, могут различаться по размеру весьма незначительно - всего на одно повторяющееся звено, а это для некоторых локусов всего 2-3% длины фрагмента. Если на геле один из таких аллелей ошибочно принять за другой, то это может обусловить серьезные ошибки в выводах.

На практике для идентификации аллелей определяют условный молекулярный размер фрагментов ДНК - например, длину в парах нуклеотидов Часто размер фрагментов определяется расчетным путем на основании измерений их пробега на электрофореграмме. Для этого нужно проанализировать профиль элеетрофоретического разделения для данного конкретного геля и определить точный характер зависимости электрофоретической подвижности фрагментов от их размеров с использованием специальных алгоритмов и стандартов молекулярных масс Однако следует подчеркнуть, что принципиальное значение для всех алгоритмов имеет условие, что стандарты (маркерные фрагменты) и анализируемые фрагменты - гомологичны, то есть, представлены одинаковыми полинуклеотидными последовательностями. Между тем, на практике это условие не всегда выполняется, и тогда нуклео-тидный состав и первичная структура анализируемой и контрольной ДНК оказываются различными. Такие ДНК называются гетерологич-ными. В этом случае нельзя исключить, что в определении размеров фрагментов могут быть допущены серьезные ошибки, обусловленные различиями в физико-химических, и как следствие, электрофоретиче-

ских свойствах полинуклеотидных цепей с различным нуклеотидным составом.

Так, при измерении фрагментов локуса D1S80 в ПААГ по маркеру pBR322/AluI мы наблюдали позиционное искажение при определении молекулярного веса амплифицированных фрагментов ДНК, что выражалось в неправильном определении аллельного профиля ДНК -например, контрольная ДНК была определена как фрагмент, отличающийся от истинного на 3 аллеля (таблица 1).

Таблица 1

Наблюдаемая погрешность (%) при определении размеров амплифицированных фрагментов контрольной ДНК по локусу D1S80

Истинные аллели Наблюдаемые в ПААГ Погрешность,% Погрешность, п а

24 (529 п.н) 21 (488 п.н) -7,75 41

18 (433 па) 17 (420 пл.) -3,00 13

17 (417 п. н.) 17(416п.н) •0,24 1

При измерении маркерных фрагментов относительно друг друга в нативном ПААГ, т.е. фрагментов с известными молекулярными массами, погрешность измерения составила порядка 10%, как в сторону увеличения, так и в сторону уменьшения.

Надо заметить, что в целом, гели агарозы в гораздо меньшей степени, чем полиакриламидные среды, чувствительны к случайным флуктуациям в макроструктуре молекул ДНК, и потому менее склонны к артефактам, которые могут приводить к позиционным искажениям в анализируемом геномном профиле. По этой причине для дальнейшей работы мы использовали только гели агарозы При этом учитывался тот факт, что разделяющая способность обычных агарозных гелей в отношении фрагментов ДНК малого размера намного ниже, чем у полиакрил амидаых Для разделения же аллелей локусов с варьирующимся числом тавдемных повторов, таких как БШ-локусы (длина повторяющейся последовательности 2-4 п.н.) и \ОТЛ-локусы с коротким шагом (в частности, минисателлитного локуса 01880, где длина повторяющейся последовательности составляет 16 п.н), необходимо иметь возможность различать фрагменты ДНК, которые отличаются по длине на 2-3%. Для удовлетворения этих требований в настоящей работе использовали 2^%-гепи специальной агарозы Ми8аеуеишМЕйЕ^(ШК^<311А).

Эксперименты по определению размеров амплифицированных фрагментов 3-х разных локусов ДНК - Аро В, В1Б80,018111 - проводили по разным маркерам - ВЫ. 123, рВИ322/А1и1, которые наиболее часто используются при производстве молекулярно-генетических исследований в судебной медицине. Также определяли длину маркерных фрагментов ВЫ, 123 по маркеру рВЮ22/А1и1 и наоборот, рВЯ322/А1и1 по ВКЬ 123, т.е. измерение одних заведомо известных фрагментов по другим заведомо известным размерным стандартам.

Определяемые размеры маркерных фрагментов рВ11322/А1и1, Вт, 123 при проведении двадцати серий контрольных тестов в геле агарозы МиБюуе с концентрацией 2,5 %, продемонстрировали отклонения от ожидаемых размеров, как в сторону увеличения, так и в сторону уменьшения от 3,5% до 2,44% (таблица 2). Примечательно, что одинаковые маркерные фрагменты давали разные погрешности при определении их размеров по разным маркерам

Таблица 2

Наблюдаемые погрешности (%) при определении размеров маркерных фрагментов рВЮ22/АМ __

Ожидаемый размер, п н Наблюдаемый размер, п н. Погрешность, %

910 898 -1,32

659 655 +0,61

521 517 -0,77

403 394 -2,28

281 275 -2,14

257 252 -1,95

226 228 +0,89

Полученный массив данных наглядно демонстрирует, что гено-типические характеристики, рассчитанные с использованием гетероло-гичных стандартов молекулярных масс, действительно могут довольно сильно отличаться в зависимости от природы маркера и самого анализируемого локуса. При этом расчет алгоритма погрешности аналитической системы в каждом конкретном случае - для тех или иных размерных стандартов - зависит от многих факторов. Это не позволяет провести стандартизацию нормирования ошибки для каждой гетероло-гичной системы.

Соответственно, надо признать, что точное определение размеров анализируемых фрагментов по гетерологичным стандартам молекулярных масс оказывается весьма проблематичным, и как минимум, требует использования дополнительного контрольного образца ДНК с заранее известным генотипом по каждому исследуемому локусу Но даже в этом последнем случае, важно понимать, что генотипические характеристики, получаемые расчетным путем на основании величины электрофоретической подвижности гетерологичных стандартов молекулярных масс, являются не абсолютными, а относительными или условными и потому не могут быть напрямую использованы как элементы банка данных.

Этот последний вывод был нами подтвержден дальнейшими исследованиями свойств молекулярно-генетической индивидуализирующей системы на основе хромосомного локуса 013111.

3. Изучение аналитических характеристик молекулярно-генетических индивидуализирующих систем, оперирующих на

уровне полиморфизма длины амплифицированных фрагментов хромосомной ДНК

3.1. Изучение свойств молекулярно-генетической индивидуализирующей системы на основе хромосомного локуса D1S111

Уровень полиморфизма хромосомного локуса D1S111 до настоящего времени был охарактеризован недостаточно полно и на относительно малочисленных выборках. Кроме этого, в литературных данных имелись определенные неясности и разночтения, касающиеся структурной организации аллелей данного локуса.

В настоящей работе был проведен сравнительный анализ имеющихся в литературе референтных нуклеотидных последовательностей Это позволило вывести усредненную «структурную формулу» для ми-нисателлитной ДЙК этого локуса.

На основании этой структуры были рассчитаны размеры для всех известных аллелей D1S111, которые приведены в таблице 3. Эти данные, в свою очередь, были нами использованы как опорные параметры для определения основных характеристик полиморфизма данного локуса в репрезентативной выборке российского населения

Всего было обследовано более 1000 биологических образцов и объектов, принадлежащих лицам из разных регионов России преимущественно русской национальности. В ходе настоящего исследования общая обследованная выборка из гетерогенной популяции была разбита на две группы. Первая группа (далее по тексту - выборка 1) была составлена из числа фигурантов судебно-медицинских экспертиз, назначенных в Бюро СМЭ ДЗ г.Москвы (594 неродственных человека). Вторая группа (выборка 2), объемом в 545 неродственных человек, была сформирована из числа фигурантов судебно-медицинских экспертиз, назначенных в РЦ СМЭ МЗ РФ.

Аллельные варианты локуса D1S111 идентифицировали по внешним стандартам молекулярных масс двумя разными методами. Для выборки 1 в качестве стандарта прямого соответствия использовали искусственно синтезированную "псевдоаллельную лестницу", содержащую 17 негомологичных фрагментов ДНК длиной от 381 до 973 п.н., с шагом в 37 п н. Эти фрагменты по размеру соответствуют аллелям 9-25 минисателлита D1S111.

Аллельные варианты локуса D1S111 для выборки 2 определяли другим методом: не непосредственным поиском прямого соответствия по размеру, а опосредованно, расчетным путем с помощью аппаратно-программной системы Kodak ED AS 120 (Кодак, США) с использованием в качестве маркера ДНК pBR322/AluI. В таблице 3 приведены результаты, полученные при анализе массива данных по двум выборкам.

Таблица 3

Распределение аллелей локуса D1S1.11 в двух исследованных выборках

Аллель Размер, ПН Выбо рка 1 Выбо рка 2

Число наблюдений Частота аллеля (*) Число наблюдений Частота аллеля (*)

9 383 27 0,023±0,004 33 0,030±0,005

10 420 18 0,015±0,004 11 0,010±0,003

11 457 5 0,004±0,002 6 0,006*0,002

12 494 131 0,110±0,009 139 0,128±0,010

13 531 10 0,008±0,003 6 0,006±0,002

14 568 11 0,009±0,003 5 0,005±0,002

15 605 402 0,338±0,014 317 0,291*0,014

16 642 12 0,010±0,003 15 0,014±0,004

17 679 22 0,019±0,004 23 0,021±0,004

18 716 447 0,376±0,014 310 0Д84±0,014

19 753 43 0,036±0,005 149 0,137±0,010

20 790 10 0,008±0,003 13 0,012±0,003

21 827 21 0,018±0,004 26 0,024±0,005

22 864 20 0,017±0,004 24 0,022±0,004

23 901 3 0,003±0,001 6 0,006±0,002

24 938 3 0,003±0,001 3 0,003±0,002

25 975 2 0,002±0,001 4 0,004±0,002

26 1012 1 0,001±0,001 0 0,00(Ы>,000

Суммарно 1188 1,000 1090 1,003

Всего нами было выявлено 18 аллелей, содержащих от 9 до 26 повторов (таблица 3). Примечательно, что в ходе настоящего исследования было выявлено 4 новых, то есть не описанных ранее, высокомолекулярных аллеля для этого маркера- это аллели с 23 (901 п.н.) по 26 (1012 п н.). Значения основных популяционных характеристик локуса ШБШ для обеих исследованных выборок приведены в таблице 4.

По этим данным, информативность 018111 превышает или сравнима с информативностью таких минисателлитов, как Б1785 [Чистяков Д А.и др. 1993; С1ш1уакоу Б. е а., 2000], но уступает таким индивидуализирующим системам как Б1880 и АроВ [Ефремов И А. и др., 1996; БпкЛуашйку А. е.а, 2003]

Распределение аллелей в целом оказалось достаточно сходным в обеих выборках, за исключением двух важных моментов. Во-первых, для самого распространенного в выборке 1 аллеля 18 частота наблюдений в выборке 2 оказалась существенно ниже (0,376 против 0,284). Во-вторых, аллель 19 в выборке 2 наблюдался в 3,8 раза чаще по сравнению с выборкой 1 (0,137 против 0,036). Кроме этого, уровень полиморфизма для выборки 2 оказался существенно выше по сравнению с выборкой 1.

Таблица4

Значения основных параметров прикладной информативности локуса Э1Б111 в двух исследованных выборках_

Оценочный параметр Выборка 1 Выборка 2

Объем выборки, человек 594 545

Число выявленных аллелей 18(9-26) 17(9-25)

Число наблюдавшихся генотипов ю общего числа возможных, (%) 66 из 171 (39%) 65 из 153 (42%)

Наблюдаемая гетерозиплность 0,685 0.732

Ожидаемая гетерозиготность 0,729 ±0,008 0,797 ±0,006

Вероятность случайного совпадения генотипов 0,116 0,071

Дискриминирующий потенциал 0,884 0,929

Потенциал исключения отцовства 0,406 0,480

Усредненный индекс отцовства 1,59 1,87

Индекс полиморфизма 0,69 0,77

Наиболее вероятное объяснение этому заключается в том, что при электрофоретическом определении размеров амплифицированных фрагментов по гетерологичному внешнему высокомолекулярному стандарту ДНК рВЮ22/А1и1 имеет место системная ошибка. При этом аллель 18 (716 пн) может ошибочно определяться как аллель 19 (753пн).

Это объяснение выглядит достаточно убедительным в свете ранее полученных в работе [Земскова Е Ю. и др. 2000] данных, касающихся изучения свойств гетерологичных маркерных систем применительно к фрагментному анализу ДНК, а именно, что определение размеров амплифицированных фрагментов по нелокусным внешним стандартам ДНК как в агарозных гелях, так и в ПААГ сложным образом зависит от экспериментальных условий и может быть некорректным в определенных диапазонах длин.

3.2. Уточнение номенклатуры аллельных вариантов и характеристика аллельиого полиморфизма молекулярно-геиетической индивидуализирующей системы на основе пентануклеотидного тандемного повтора НЦМСТМ

В настоящей работе, в ходе изучения феномена неравновесия по сцеплению между близкорасположенными генетическими маркерами (см. раздел 3.3), нами были проведены популяционно-генетические исследования локуса НЦМСШ. При этом наше внимание привлекли обнаружившиеся в источниках литературы существенные разночтения при обозначении аллелей данного локуса. Это вызывает определенную путаницу в описании базовых генотшгаческих характеристик данного маркера, является препятствием для его использования в межлабораторных исследованиях и, как следствие, не позволяет использовать локус НЦМСШ при формировании референтных баз данных.

Проведенная нами аналитическая разработка этого вопроса показала, что причина в том, что в настоящее время для нумерации аллелей микросателлитных локусов может применяться номенклатура, основанная на нумерации тацдемных повторов как по одной, так и по другой олигонуклеотидной цепи референтной последовательности ДНК Однако, дело в том, что в зависимости от того, как именно определена структура повторяющегося звена в тандемно организованной последовательности (так называемый "мотив"), один и тот же вариант аллельного состояния такого локуса может получить разные обозначения. Для локуса HUMCD4 это имеет принципиальное значение. При использовании нумерации по "верхней" цепи тандемный блок содержит 10 пентануклеотидных повторов: (ТТТТ<^(СТТГСКТТПС)*, тогда как при использовании нумерации по "нижней" цепи одно звено - повтор комплементарного мотива (AAAAG) - теряется, н в этом случае насчитывается только 9 полных повторов: (AAAAG)<(AAAGG) (ДАЛАСЬ

Такая ситуация с очевидностью указывает на необходимость унификации номенклатуры аллельных вариантов локуса HUMCD4. Учитывая рекомендации [Gill Р. е.а, 1997; Bar W. е.а., 1997], мы сочли целесообразным в качестве стандарта для локуса HUMCD4 принять номенклатуру, основанную на нумерации повторяющихся тандемных повторов по "верхней" цепи матричной ДНК. В своей дальнейшей работе мы придерживались именно этой номенклатуры.

В качестве биологического материала для анализа использовали биологические образцы и объекты от 407 человек из разных регионов РФ с включенными мигрантами из других популяций.

Таблица 5

Распределение аллелей локуса HUMCD4 в исследованной выборке

Аллель Число наблюдений Частота аяпеля

4 1 0,001

5 286 0.351

6 289 0,355

7 2 0.002

8 1 0,001

9 2 0.002

10 203 0Д49

И 24 0.029

12 6 0,007

Всего в исследованной выборке выявлено 9 аллелей (таблица 5) и выявлено 16 (36%) из 45 возможных различных генотипов. Наиболее частыми оказались аллели 5, 6 и 10, тогда как на долю остальных 6 аллелей пришлось всего 4,5% наблюдений. Распределение аллелей в целом являлось весьма сходным с аналогичными данными для других европеоидных популяций (см. например, [НискепЬеск W. е.а., 1997]). Количественная оценка степени различий частотного распре

деления аллелей в данной выборке по сравнению с другими популяциями не являлась предметом настоящего исследования. Тем не менее, на основании полученных показателей можно отметить, что значения основных популяционных параметров локуса HUMCD4 для исследованной выборки оказались сходными с аналогичными данными для некоторых других европеоидов [Kornienko IV. е.а, 2002; Fernandes А. е а., 2002]. Информативность HUMCD4 для русских сравнима с таковой молекулярно-генетических маркеров LPL и DSS818 [Корниенко И.В и др., 2002], но в разной степени уступает таким индивидуализирующим системам, как ТН01, vWA, D3S1358, D8S1179,D18S51, D13S317.

3.3. Изучение потенциально сцепленных вариантов полиморфизма хромосомной ДНК в аспекте судебно-экспертного применения молекулярно-генетических индивидуализирующих систем HUMCD4, vWA и vWFII

При вероятностных расчетах в экспертных молекулярно-генетических приложениях по идентификации личности и установлению родства популяционная частота встречаемости мультилокусного генотипа определяется как произведение соответствующих частот для всех исследованных независимых локусов [Иванов ПЛ, 1999, National Research Council of the USA, 1996]

Для правомерного использования правила перемножения частот аллелей (генотипов) принципиально важным является соблюдение двух главных условий: 1) наблюдаемое распределение генотипов для каждого отдельного локуса в референтной популяции должно соответствовать таковому, ожидаемому из равновесия Харди-Вайнберга (РХВ); 2) анализируемые локусы должны быть генетически независимыми, те.не должно имеш место межюк>аюе>ф2вшвеаЕ гоанизио(НС).

Под НС понимают любую неслучайную ассоциацию (взаимозависимость) между аллелями разных локусов Анализ НС используют при картировании генов наследственных заболеваний, а также для выстраивания генетических маркеров относительно друг друга на хромосомных картах

Для нейтральных локусов величина НС является своего рода мерой генетической дистанции, их разделяющей: обычно можно ожидать увеличения НС при уменьшении физической дистанции между маркерами, низких частотах рекомбинации и мутирования. Из этого следует, что расположение маркерных локусов, близкое друг к другу на одном участке хромосомы, может рассматриваться как сигнал, указывающий на их возможную взаимозависимость. В случае выявления статистически значимого НС, правила перемножения частот для таких маркёрных локусов при судебно-экспертных вероятностных расчетах, неприемлемо.

В настоящей работе изучены параметры и даны оценки неравновесия по сцеплению для 4 мижросателлитных локусов генома человека: ЬРЬ, СБ4, vWA и уМЗД, которые широко используют в формате мультилокусных панелей при идентификации личности в России и за рубежом Отправным моментом для исследования послужило то обстоятельство, что СГ)4, и vWFII расположены относительно близко друг к другу - в теломерной области 12р1ег-12р12 на коротком плече хромосомы 12, поэтому вопрос об их возможной взаимозависимости является актуальным. Для локуса ЬРЬ, расположенного на хромосоме 8, нет очевидных причин предполагать генетическую ассоциацию (сцепленность) с каким-либо из маркеров хромосомы 12, поэтому он должен был играть роль отрицательного контроля на НС.

Исследованная выборка включала 92 неродственных человека, в отношении которых в РЦ СМЭ МЗ РФ проводились молекулярно-генетические экспертизы и исследования.

Наиболее информативным оказался локус уЦгА (таблица б). Дня него выявлено максимально описанное число аллелей - 8, тогда как для локусов СБ4 и ЬРЬ информативность оказалась приблизительно на одном уровне и при этом наименьшей (для обоих локусов было выявлено по 5 аллелей) Это также согласуется с известными данными лигершуры.

Таблица б

Распределение аллелей в исследованной выборке для 4 локусов

Аллель Число наблюдений/частота

ЬРЬ СЕМ УТОИ т

5 73/0397

6 68/0370

7

8

9 5/0,027 20/0,109

10 90/0,489 39/0Д12 9/0,049

11 35/0,190 3/0,016 62/0,337

12 49/0,266 1/0,005 68/0,370

13 5/0,027 17/0,092 2/0,011

14 7/0,038 11/0,060

15 1/0,005 23/0,125

16 46/0Д50

17 53/0,288

18 34/0,185

19 10/0,054

20 5/0,027

Для проверки исследуемых референтных выборок на возможные отклонения от РХВ использовали точный (вероятностный) тест Фишера, что является стандартной практикой для микросателлитных локусов [Ма1йе Р. еа, 1995; ги1шц в, 1990] Наблюдавшееся распределение генотипов для 4 исследованных локусов не отклонялось от РХВ.

Достоверное НС было выявлено только между локусами и (таблица 7).

Таблица 7

Результаты попарного тестирования на НС исследованных локусов В скобках указано число степеней свободы_

Пары локусов Значения х2 Значение вероятности

vWA/vWFH 6*5103 f42V 0.006024.

vWFII/LPL 26.0629(24) 0,349980

yWA/LPL 30,3681 (28) 0,345841

VWA/CD4 22,0355(28) 0,779644

VWFII/CD4 15,7756(24) 0,896004

CD4/LPL 7,39569 (16) 0,964860

Сравнительный анализ абсолютных значений вероятностей, позволяет сделать вывод, что локус CD4 не обнаруживает НС с локусами vWA и vWFII, как и с локусом LPL. Для последнего также показано отсутствие НС со всеми остальными исследованными маркерами. Отметим, что полученные результаты не противоречат логике, построенной на относительной физической локализации СЕН, vWA и vWFII

Следовательно, можно заключить, что при типировании локусов vWA и vWFII в составе одной многолокусной панели ввиду показанной в настоящей работе генетической сцепленности этих маркеров, правило перемножения частот аллелей (генотипов) неприемлемо.

Таким образом, в настоящее время при вероятностных оценках результата типирования ПДАФ локусов vWA и vWFII возможно учитывать данные, полученные только для какого-нибудь одного (любого) локуса из этой пары В то же время совместное титрование локусов CD4, LPL и любого (но только одного) из исследованных в настоящей работе локусов гена vWF можно проводить без каких-либо ограничений на правило перемножения частот аллелей или генотипов.

3.4. Популяционные аспекты экспертного применения молеку-лярно-генетических индивидуализирующих систем ПДАФ-типа 3.4.1. Распределение аллелей локуса D1S80 в выборке населения Российской Федерации

Анализ распределения частот встречаемости аллелей локуса D1S80 в случайной (с точки зрения этнической принадлежности и территориального происхождения образцов) проводился в популяционной выборке, состоящей из 225 человек, не являющихся кровными родственниками, из 56 регионов Российской Федерации.

В таблице 8 приведены частоты встречаемости аллелей локуса DIS80 в исследованной популяционной выборке. Для сравнения показаны частого аллелей для некоторых других расовых групп.

Как следует из полученных данных, распределение частот встречаемости аллелей локуса D1S80 в исследованной российской по-

пуляции имеет наибольшее совпадение с распределением частот аллелей у европеоидов, проживающих на территории США. Тем не менее, в российской выборке отмечаются свои особенности. Так, в ней ¡фактически не встречаются генотипы, в которых присутствуют аллели 14, 15, 17, 19, 34, 38, 39,40 и 41. С другой стороны, в российской (как и в японской) популяции аллель 16 встречается более часто, чем у белых американцев. Отметим, что эти различия носят минорный характер, и аналогичные результаты были получены при исследовании распределения аллельных частот у европеоидов Уральского региона России [Пушкарев В.П., Новиков ПИ., 2001] и Среднего Поволжья [Поно-маренко И.Б., 2004]. Общие тенденции распределения заметно различаются только у разных расовых групп.

Таблица 8

Частоты аллелей локуса D1S80 среди исследованной выборки в сравнении с некоторыми другими выборками (данные литературы)

Российская Европеоиды Афро- Итальянцы Греки- Иорданцы Евреи Японцы

выборка США амсршсанцы пшрноты

Аллель ir=255 п»718 11=606 п* 141 ож 107 п-215 11 = 256 4 = 222

<14 — 0,002 — —

14 Jj — — — — 0,002 — —

16 0,014 0,001 0,002 _ _ 0 0 0,002 0,002 0,0225

17 0,0 0,002 0 028 — 0,014 0,0 о.о 0,0315

18 0,261 0,237 0,073 0,223 0,178 0,161 0,205 0,1757

19 0,0 0,003 0,003 0,007 0,014 0,002 0,002 0,0135

20 0,027 0,018 0,032 0,010 0,005 0,012 0,014 0,0225

21 0 017 0,021 0,115 0,056 0,037 0,044 0 037 0,009

22 0,063 0,038 0,081 0,070 0 079 0,051 0,035 0,009

23 0,006 0,012 0,014 0,010 0,005 0,016 0008 0,0

24 0,339 0,378 0,234 0,368 0,393 0,388 0,473 0,2432

25 0,051 0,046 0,045 0,028 0,051 0,035 0,070 0 0045

26 0,010 0,020 0,006 0,010 0,019 0023 0,014 0,0045

27 0,006 0,007 0,008 0014 0,056 0,005 0,010 0,072

28 0 055 0,063 0130 0,049 0 075 0,070 0,055 0,0946

29 0,041 0,052 0,053 0,085 0,042 0,058 0,014 01054

30 0,010 0,008 0,009 0,028 0,014 0,005 0,002 0,1171

31 0,074 0 072 0,054 0,021 0,019 0,056 0,039 0,045

32 0,002 0,006 0,007 0,0 — 0,014 0,014 0,0135

33 0,002 0,003 0,004 0,007 — 0,0 0,0 0,0045

34 0,0 0 001 0,086 0,007 — 0,009 0,004 0,0045

35 0,004 0,003 0,002 — — 0,002 0002 0,0

36 0,012 0,004 0,001 — — 0,005 0,0 0,009

37 0,006 0,001 0,0 — — 0,007 0,002 0,0135

38 — 0,0 0,0 — — 0,0 — 0,0

39 — 0,003 0,003 — — 0,002 _ 0,009

40 — 0,0 0,0 — — 0,0 — 0,0

41 — 0,0 0,002 — — 0,0 — 0,0045

>41 — 0,001 0,007 — — 0,028 — 0,0225

Таблица 9

Основные популяционные характеристики локуса D1S80_

Вероятность случайного совпадения 0,068

Дискриминирующий потенциал 0,932

Индекс полиморфизма 0,77

Потенциал исключения 0,472

Усредненный индекс отцовства 1,83

Наблюдаемая гомозиплность 0,273

Ожидаемая гомозигогаость 0,196

Генетическое разнообразие 0,802

3.4.2. Исследование аллельного полиморфизма молекулярно-генетических индивидуализирующих систем иа основе тетранук-леотидных тандемных повторов 1РЦ \ЛУАи ТН01 среди наоеташяРьоаш

В настоящей работе проведено систематизированное исследование распределения аллелей локусов ЬРЬ, у>УА и ТН01 среди 442 человек, не являющихся кровными родственниками из 57 регионов России с целью уточнения базовых оценочных характеристик локусов и повышения эффективности экспертного применения индивидуализирующих систем. Для аллелей изученных локусов размер амплифи-цированных фрагментов ДНК находится в диапазоне 105-203 п.н., что позволяет эффективно использовать их даже в случаях сильно деградированных препаратов матричной ДНК.

До недавнего времени базы данных по частотам встречаемости аллелей локусов системы ЬРЬ, у\УА и ТН01 для популяций России отсутствовали или были фрагментарными С целью получения этих характеристик для популяции нашей страны мы провели масштабное исследование распределения аллелей указанных локусов

Таблица 10

Частоты аллелей локусов ЬРЬ, и ТН01 среди населения РФ

Аллель (номер отражает число повторов) Локус

ЬРЬ ТН01

5 0,0

6 0,2053

7 0,0014 0,1524

8 0,0 0,1240

9 0,0476 0,1667

93 0,3333

10 0,4678 — 0,0142

11 0,2297 0,0 0,0041

12 0,2255 0,0 —

13 0,0280 0,0045 —

14 0,0 0,0796 —

15 — 0,0976 —

16 — 0,2237 —

17 — 0,2718 —

18 — 0,2027 —

19 — 0,0976 —

20 — 0,0225 —

21 — 0,0 —

22 — 0,0 —

23 — 0,0 —

24 — 0,0 —

Таблица 11

Значения основных популяционных характеристик локусов ЬРЬ, vWA и ТН01 для населения РФ

Локус Ш- vWA ТН01

Показатель

Вероятность случайного совпадения 0,164 0,062 0,081

Дискриминирующий потенциал 0,836 0,938 0,919

Индекс полиморфизма 0,62 0,78 0,75

Потенциал исключения 0,399 0,564 0,513

Усредненный индекс отцовства 1,57 2,28 2,02

Наблюдаемая гетерозиготность 0,681 0,781 0,752

Ожидаемая гетерозиготность 0,675 0,810 0,782

Значение х2 3,07 937 7,08

Как следует из полученных данных (таблица 11), из трех исследованных ЗТИ-локусов наиболее информативным является локус (вероятность случайного совпадения генотипов 0,062, вероятность исключения ложно указанного отцовства 0,564). При совместном типи-ровании изученных трех локусов вероятность случайного совпадения генотипов уменьшается до величины 0,000824, что соответствует 1:1214

При сравнительном анализе распределения частот встречаемости аллелей в локусах и ТН01, исследованных в российской выборке в настоящей работе с распределением частот в других популяционных выборках, наблюдалось характерное сходство в доминировании частот у европеоидов, проживающих на территории США [Арр1е1с1 Вшву^ии, 2003], у европеоидов Уральского региона России [Пушкарев В.П, 2006].

ВЫВОДЫ

1. В отличие от человека, у исследованных в настоящей работе животных, ген амелогенина не обладает половым диморфизмом и потому не может служить пол-специфическим маркером. Тем не менее, амелогениновый ДНК-тест определения биологического пола не является абсолютно вндоспецифичным для человека. Это означает, что при судебно-экспертном тшшровании гена амелогенина в препаратах ДНК человека, к которым оказалась примешана ДНК (домашних) животных, возможно получение «нетипичных» амплификационных продуктов, искажающих истинный результат.

2. Установлено, что при использовании амелогенинового ДНК-теста, при определенных условиях, в биологических следах животного происхождения возможно ложное определение женского пола человека. Кроме этого, при судебно-экспертном тшшровании гена амелогенина в препаратах Д НК человека, к которым оказалась примешана ДНК животных, существует опасность ложного определения мужского пола в следах женского происхождения. Этому может способствовать

неправильно подобранный стандарт молекулярных масс, его удаленное расположение на геле или использование неточного расчетного алгоритма для определения размеров анализируемых фрагментов.

3. Показано, что если нуклеотидный состав и первичная структура анализируемой ДНК и стандартной ДНК (стандарта молекулярных масс) оказываются различными (такие ДНК называют гете-рологичными), то в определении размеров фрагментов и, соответственно, в идентификации аллельных вариантов полиморфных локусов ДНК могут быть допущены серьезные ошибки, обусловленные различиями в физико-химических, и, как следствие, электрофоретических свойствах полинуклеотидных цепей с различным нуклеотидным составом. Это явление наиболее сильно выражено в случае использования в качестве электрофоретаческой среды разделения ПААГ и в несколько меньшей степени при электрофоретическом фракционировании в гелях агарозы.

4. Уточнена структурная организация аллелей полиморфных локусов хромосомной ДНК человека 013111 и НЦЖЛМ, и разрешены противоречия в этом вопросе, имеющиеся в литературных источниках Это снимает ограничения на возможность сравнения результатов экспертиз, полученных в разных лабораториях при применении этих мо-лекулярно-генетических маркеров, а также позволяет использовать эти результаты при формировании референтных баз данных

5 Установлено достоверное неравновесие по сцеплению между локусами уУ/А и У^ЙТП. Это означает, что при титровании локусов

и vWFII в составе одной многолокусной панели, ввиду показанной в настоящей работе генетической сцепленности этих маркеров, правило перемножения частот аллелей (генотипов) неприемлемо.

6 Определены основные популяционные характеристики полиморфизма (аллельного разнообразия) локусов хромосомной ДНК человека. 018111, Б1880, НЦМСБ4, ЬРЬ, у\УА и ТН01 в исследованной выборке населения России.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При молекулярно-генетическом анализе пол-специфических вариантов гена амелогенина, для того, чтобы избежать опасности ложного типирования пола человека в препаратах, содержащих ДНК животных, необходимо правильно подобрать стандарт молекулярных масс, не допускать его удаленного расположения на геле и использовать для определения размеров амплифицированных фрагментов ДНК точный расчетный алгоритм. В случае получения "нетипичных" продуктов амплификации в исследуемых препаратах ДНК, необходимо провести дополнительное исследование исходных биологических объектов для верификации их видовой принадлежности

2. Для корректного определения размеров анализируемых фрагментов и идентификации аллельных вариантов полиморфных локусов, ДНК, применяемая в качестве стандарта молекулярных масс, должна быть гомологична анализируемой ДНК, то есть иметь одинаковые с ней нуклеотидный состав и первичную структуру. Определение размеров фрагментов ДНК по гетерологачным стандартам молекулярных масс нежелательно при использовании электрофоретического фракционирования в гелях агарозы, и категорически противопоказано в случае использования в качестве среды разделения ПААГ. Отметим, что для гелей агарозы это в принципе возможно, но как минимум, требует использования специальных гелевых сред и введения в анализ дополнительного контрольного образца ДНК с заранее известным генотипом по каждому исследуемому локусу. Но даже в этом последнем случае, важно понимать, что генотипические характеристики, получаемые расчетным путем на основании величины электрофоретической подвижности гетерологичных стандартов молекулярных масс, являются не абсолютными, а относительными (условными) и потому не могут быть напрямую использованы как элементы банка данных

3. Номенклатуру аллельных вариантов локуса НЦМСШ следует унифицировать. На основании полученных в настоящей работе результатов, считаем целесообразным в качестве стандарта для локуса НЦМСШ принять номенклатуру, основанную на нумерации повторяющихся тандемных повторов по "верхней" цепи матричной ДНК.

4. При титровании локусов у\УА и у^П в составе одной мно-голокусной панели, по причине показанной в настоящей работе генетической сцепленности этих маркеров, правило перемножения частот аллелей (генотипов) для них неприемлемо. Таким образом, при вероятностных оценках результата типирования ПДАФ локусов и

возможно учитывать данные, полученные только для какого-нибудь одного (любого) локуса из этой пары В то же время совместное типирование локусов СБ4, ЬРЬ и любого (но только одного) из исследованных в настоящей работе локусов гена у\УР можно проводить без каких-либо ограничений на правило перемножения частот аллелей или генотипов.

5. Полученные в настоящей работе характеристические данные о распределении аллелей исследованных полиморфных локусов хромосомной ДНК среди российского населения могут быть использованы для получения референтных данных для вычисления необходимых расчётных параметров при интерпретации результатов судебно-экспертных молекулярно-генетических идентификационных экспертиз и исследований и создании банков генетической информации.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Е.Ю.Земскова, П.ЛИванов. Изучение свойств гетерологич-ных маркерных систем применительно к фрагментному анализу ДНК. Пфсшаивыришггаиажршнсявсга^ 5 Всероссийский съезд судебных меджов.Аарахаш^28-30аз^сга2000г,с244-246.

2. И.В. Корниенко, Е.Ю. Земскова, С.А. Фролова, В В. Якушев, ПЛ. Иванов Исследование аллельного полиморфизма молекулярно-генетических индивидуализирующих систем на основе тетрануклео-тидных тандемных повторов LPL, vWA и ТН01 среди населения России. Судебно-медицинская экспертиза, 2002, № 5, с. 12-15

3 ПЛ. Иванов, Е.Ю. Земскова, Т.А. Тарасова, С.А. Фролова, Л.С. Михалкович, И.В. Корниенко Опыт использования FTA-носителей для хранения образцов крови при проведении молекулярно-генетических идентификационных исследований неопознанных погибших - жертв военных действий на территории Чеченской Республики. Судебно-медицинская экспертиза, 2002, № б, с. 20-27.

4 ИВ Корниенко, Е.В.Щербакова, Е.Ю.Земскова,П.Л.Иванов. Распределение аллелей локуса D1S80 в случайной выборке населения Российской Федерации. Судебно-медицинская эютрпса,2002)№б,с27-31

5. Е.Ю. Земскова, С А. Фролова, Ж.В Слепцова, П.Л. Иванов. Изучение видовой специфичности амелогениновой системы установления генетического пола. Судебнонукящданэаяжз1ршза,2003,№4,с20-25.

6. Е.Ю. Земскова, С.А. Фролова, Ж.В. Слепцова, П.Л. Иванов. О видоспецифичности амелогенинового теста на половую принадлежность ДНК. Аюуашые цмбжмы судебной мэдюцш. Оосрик щчых трудя ЩСМЭМЗРФ,Мхнва,2003,с2й2-266.

7. И В. Корниенко, В.В. Якушев, С.А Фролова, Е.Ю. Земскова, Н П. Кабанова, П Л.Иванов. Некоторые результаты использования молекулярно-генетических маркеров хромосомной ДНК дм вдзпифика-пданэспэзшнщ.косганксввоешхпуш1^

вервсмКшкаэе. Судебно-медицинская экспертиза, 2003, № 5, с.36-41.

& ПЛ. Иванов, EJO. Земскова, НН Лебедева, ИА Ефремов. Укянжие номеяюгауры аляэжй и хараюерилига аткяыш) тлимсрфима мюли^гсро-

irmcpa ШМС1ХС>яг0и>м5дтот<эт^

9. ШШванов, PK Туракулов, ЕЛО. Земскова, ИА Ефремов. Изучаю пииодавшсцгпга^варшотхт^

экпршяо гршшя хиЕкугирнмэсшяшсих щииводгитавдукхщк сияем ССА, VWAHVWFIL С^ебЕюади1И*з<аязшЕрпщ2005,№2) CÄ35

10. ИА Ефремов, НЛ. Лебедева, EJO. Земскова, ПЛ. Иванов. Харакго-рилика мсдафотрютеагпязсюй ивдивич^шшч^кяп^ силам ш <хшае минаа-теллипсго маркера D1S111 Пероткгиш развшет и осверснгюташя судеб®-

дтавдЕЮСкайгартсиицяюши-Мшсргат^

сапЯэря 2005г, Мхкга-Ткмен^ «Акадмга»,с 97-99.

11ИА Ефремов, НЛ Лебедева, ЕЛО. Земскова, ПЛ. Ивашв. Изучение свойлвмх^:1Е|нна1шжнйшди^

нго ладта 018111 в аогюе судгбнмшьршиш тапцхвании ДНК. Суцгбн> мэддадазе» экщтаиза,2005, № 5, с.29-33.

Заказ № 22/04/08 Подписано к печати 28 04.2008 Тираж 100 экз. Уел пл. 1,5 Отпечатано в Рио РМАПО тел 681-58-66

Актуальность проблемы. Объекты биологической природы являются самыми распространенными вещественными доказательствами по многим категориям уголовных и гражданских дел. Результаты их судебно-медицинских экспертных исследований служат важнейшей доказательной базой при расследовании и раскрытии преступлений и изобличении лиц, их совершивших.

Поэтому методологические подходы, направленные на разрешение задач в области судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств биологического происхождения, являются наиболее востребованными для современной судебной науки. Их совершенствование и повышение эффективности представляет значительный интерес для судебных и следственных органов.

Все это, а также прогресс в области фундаментальных исследований и технологий, активное внедрение их результатов в практику, предопределяет неизбежное углубление содержания и расширение возможностей судебно-медицинских экспертиз вещественных доказательств, и, в первую очередь, судебно-медицинских молекулярно-генетических исследований.

Молекулярно-генетический идентификационный анализ" - новое научно-практическое направление, сложившееся за последние десятилетия на стыке наук молекулярной биологии, молекулярной генетики и судебной медицины, - на сегодняшний день является самым доказательным методом анализа биологических объектов при производстве судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств [Иванов П.Л., 2006; Иванов П.Л., Клевно В.А., 2008]. Эти технологии позволяют эксперту с максимальной вероятностью высказаться о принадлежности следов на вещественных доказательствах конкретному лицу - что, по существу, является предназначением и конечной целью данного вида экспертизы. Определен спектр экспертных приложений, где молекулярно-генетические методы оказались наиболее востребованы с точки зрения задач судебно-медицинской экспертизы. Это идентификация личности и установление биологического родства, которые относятся к одним из самых востребованных видов экспертных задач. Молекулярно-генетические , судебно-медицинские экспертные; технологии включают в себя комплекс методик, которые позволяют, в частности, на уровне геномной ДНК, выявлять индивидуализирующие, признаки в биологических следах на вещественных доказательствах и проводить сравнительный анализ этих признаков с соответствующими генетическими характеристиками проходящих по делу лиц. Указанные технологии отличаются высокой дифференцирующей способностью -благодаря использованию в качестве индивидуализирующих характеристик высокополиморфных генетических локусов, а также чрезвычайно высокой чувствительностью - благодаря применению процесса энзиматической амплификации молекул ДНК, известному как полимеразная цепная реакция (ПЦР). Энзиматическая амплификация в полимеразной цепной реакции тандемно организованных гипервариабельных локусов мини- и микросателлитной природы ядерной (хромосомной) ДНК приводит к формированию индивидуально специфичных продуктов (аллельньрс фрагментов), различающихся по длине, которые дифференцируют путем электрофоретического фракционирования. Этот методический подход, основанный на анализе полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ) ДНК подробно описан, и его принципы положены в основу индивидуализирующих систем ПДАФ-типа, широко используемых в судебно-медицинской молекулярно-генетической экспертизе [Иванов? П.Л., 1999; Иванов П.Д., 2001; Иванов П.Л:, 2003].

В последние годы наблюдается все более масштабное развитие новейших высокотехнологичных разработок в области анализа ДНК. Тем не менее, для целей судебно-медицинской экспертной практики по-прежнему актуальны базовые варианты молекулярно-генетических технологий. По сравнению с методиками, основанными на использовании роботизированных станций и автоматических анализаторов, трудоёмкость и время анализа выше, но стоимость используемого оборудования и реагентов заметно меньше. Речь, в первую очередь, идет о ставшем уже классическим анализе ПДАФ ДНК с помощью гель-электрофореза с последующей визуализацией электрофоретической картины путем окрашивания бромидом этидия или серебром. Этот методический подход является эффёктивным экспертным инструментом, и позволяет решать на высоком уровне доказательности самые сложные экспертные задачи. В то же время, он характеризуется высокой степенью сложности, в .частности, в интерпретации полученных данных, и содержит в себе опасность экспертных ошибок, которые могут быть обусловлены недостаточно полным знанием свойств самого используемого инструмента, то есть, свойств тех молекулярно-генетических тест-систем, которые применяются в анализе [Гыскэ Л.И., 1995b; Исаенко М.В., 2000 и др.]. Очевидно, что это может приводить к самым, серьезным следственным и судебным ошибкам.

В этом плане, углубленное знание аналитических свойств применяемых систем молекулярно-генетического типирования, способно наглядно повысить эффективность работы . эксперта, обеспечив его дополнительной, информацией, . необходимой для адекватной интерпретации получаемых экспертных данных. Поэтому изучение аналитических характеристик молекулярно-генетических индивидуализирующих систем в аспекте судебно-экспертного типирования ДНК представляется весьма важной и актуальной исследовательской задачей.

В качестве решения данной задачи, в настоящей диссертационной j работе планировалось изучить аналитические характеристики ряда молекулярно-генетических индивидуализирующих систем, применяющихся в современной судебно-медицинской практике, и определить диапазон возможностей и ограничений этих систем, а также особенности их использования для решения конкретных экспертных задач.

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы являлось проведение комплекса научно-методических исследований, направленных на дальнейшую методическую разработку судебно-медицинских аспектов применения молекулярно-генетических индивидуализирующих систем ПДАФ-типа (то есть основанных на феномене полиморфизма длины амплифицированных фрагментов ДНК). В работе планировалось изучить аналитические характеристики ряда молекулярно-генетических. - индивидуализирующих .систем, применяющихся в современной судебно-медицинской практике, ш определить диапазон возможностей и ограничений этих систем, а также особенности их использования для решения конкретных экспертных задач. .

Согласно указанным целям, в работе были поставлены следующие экспериментальные задачи:

Изучить особенности амелогенинового ДНК-теста определения? биологического пола применительно к анализу половой принадлежности ДНК в смешанных биологических следах, содержащих биологический-материал человека и животных;

Изучить свойства гетерологических маркерных систем - стандартов молекулярных масс, - определить диапазон возможностей и ограничений применения размерных стандартов данного типа при судебно-медицинском фрагментом анализе ДНК;

Изучить аналитические характеристики некоторых молекулярно-генетических индивидуализирующих систем, применяющихся в современной судебно-медицинской практике, включая уточнение номенклатуры аллельных вариантов и изучение потенциально сцепленных вариантов полиморфизма хромосомной ДНК, и оценить судебно-медицинское значение выявленных свойств;

Изучить популяционные характеристики некоторых индивидуализирующих систем ПДАФ-типа, применяемых для судебно-экспертного типирования ДНК, с целью оценки идентификационной значимости признаков, анализируемых на уровне ДНК, и вычисления необходимых расчетных параметров при /интерпретации результатов судебно-экспертных молекулярно-генетических идентификационных исследований.

Научная новизна?ишрактическое значение работы;

Настоящая работа является частью комплексных исследований полиморфизма ДНК в аспекте судебно-медицинской идентификации личности и установления биологического родства,, проводимых в отделе молекулярно-генетических научных и экспертных исследований Российского центра судебно-медицинской" экспертизы Росздрава; Таким образом, данная работа непосредственно связана с процессом разработки; развития и внедрения новых высокоэффективных технологий геномной идентификации в сферу деятельности отечественной судебно-медицинской экспертизы.

Проведенное в диссертационной работе целенаправленное научное исследование и углубленная разработка практических основ использования молекулярно-генетических индивидуализирующих тест-систем, основанных на анализе ПДАФ хромосомной ДНК применительно к анализу вещественных доказательств биологического происхождения, открывает новые аспекты судебно-экспертного типирования ДНК. Кроме того, оно представляется весьма актуальным и важным с точки зрения вопросов, решаемых судебно-медицинской идентификационной экспертизой. Результаты диссертации могут служить дополнительным материалом для обеспечения системного внедрения молекулярно-генетических методов, идентификации личности и определения биологического родства в практическую судебно-медицинскую деятельность экспертизы России.

Результаты работы нашли применение при проведении более чем 700 ю экспертиз, в числе которых идентификационные исследования^ по установлению личности неопознанных жертв террористических актов в Москве в 1999 г., останков генерала Г. Н. Шпигуна - заложника, погибшего в Чеченской Республике в 2000 г., останков украинского журналиста F. Гонгадзё в 2001 г., массового убийства малолетних детей в Красноярске 2005 г., убийства женщин, сопряженные с их изнасилованиями .на территории Иркутской области в период с 1994 по 2000 гг., умышленного убийства губернатора Магаданской области В. И: Цветкова в 2002, г., идентификация неопознанного тела задержанного по подозрению в; подготовке теракта и погибшего при проведении следственных действий гражданина A. F. Пуманэ, убийства женщин на территории Битцевского лесопарка в г. Москве .2006-2007 гг., а также идентификационные экспертизы, проведенные в рамках расследования целого ряда других преступлений, имеющих общественный ,резонанс.

Основные положения, выносимые нагзащиту.

1. Амелогениновый ДНК-тест определения биологического пола не является абсолютно видоспецифичным. При судебно-экспертном типировании гена амелогенина в препаратах ДНК человека, к которым оказалась примешана ДНК животных, существует опасность ложного • определения мужского пола в следах женского происхождения. В биологических следах животного происхождения возможно ложное определение женского пола. Этому может способствовать неправильно подобранный стандарт молекулярных масс, его удаленное расположение на геле или использование неточного расчетного алгоритма для определения размеров анализируемых фрагментов.

2. Принципиальное значение для правильной идентификации аллельных вариантов полиморфных локусов ДНК имеет условие, что размерные стандарты (стандарты молекулярных масс) и анализируемые фрагменты гомологичны, то есть, представлены одинаковыми полинуклеотидными последовательностями; В ином случае - если нуклеотидный состав и первичная структура анализируемой и контрольной ДНК оказываются различными (такие ДНК называют гетерологичными), нельзя исключить, что в определении размеров фрагментов могут быть допущены серьезные ошибки; обусловленные различиями в физико-химических, и, как следствие, электрофоретических свойствах полинуклеотидных цепей с различным нуклеотидным составом.

3. Разрешены выявленные в литературных источниках и имеющие, принципиальное значение . противоречия^ касающиеся структурной организации аллелей полиморфных локусов хромосомной ДНК человека D1S111 и IIUMCD4. Преодоление этих противоречий важно с точки зрения применения этих молекулярно-генетических маркеров в судебно-медицинских молекулярно-генетических идентификационных исследованиях и при формировании референтных баз данных.

4. Между микросателлитными локусами генома человека vWA и vWFII существует достоверная генетическая взаимозависимость (неравновесие по сцеплению). Это означает, что при типировании локусов vWA и vWFII в составе одной мультилокуснои панели, ввиду показанной в настоящей работе генетической сцепленности этих маркеров, правило перемножения частот аллелей (генотипов) неприемлемо.

Апробация работы ^практическое внедрение.

Полученные результаты внедрены в экспертную деятельность отдела судебно-медицинских молекулярно-генетических экспертных и научных исследований Российского центра СМЭ Росздрава, используются в экспертной практике генетической лаборатории Бюро СМЭ Департамента здравоохранения г. Москвы и Бюро СМЭ Московской области при проведении экспертиз в целях установления личности и установления биологического родства.

Материалы диссертации отражены в научных : статьях; опубликованных в рецензируемых научных, журналах и изданиях, определённых Высшей аттестационной комиссией; в том числе, в журнале "Судебно-медицинская экспертиза" (8- статей), а также в публикациях по материалам научных съездов и конференций. Всего по теме диссертации-опубл и ковано 11 работ. Результаты диссертации докладывались на пяти научных конференциях Российского центра судебно-медицинской экспертизы, а также на 4, 5 и 6 Всероссийских съездах судебных медиков (Владимир, 1996; Астрахань, 2000; Тюмень, 2005). Апробация работы состоялась 10 апреля 2008 г. на расширенной научно-практической конференции ФГУ «РЦ СМЭ Росздрава». ;

Структура и объём диссертации;

Диссертационная работа изложена на 148 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и- списка литературы. Работа; иллюстрирована^ 32 таблицами- и - 14 рисунками. Список литературы включает 224 источника отечественных и зарубежных авторов.

выводы

1. В отличие от человека, у исследованных в настоящей работе животных, ген амелогенина не обладает половым диморфизмом и потому не может служить пол-специфическим маркером. Тем не менее, амелогениновый ДНК-тест определения биологического пола не является абсолютно видоспецифичным для человека. Это означает, что при судебно-экспертном типировании гена амелогенина в препаратах ДНК человека, к которым оказалась примешана ДНК [домашних] животных, возможно получение «нетипичных» амплификационных продуктов, искажающих истинный результат.

2. Установлено, что при использовании амелогенинового ДНК-теста, при определенных условиях, в биологических следах животного происхождения возможно ложное определение женского пола человека. Кроме этого, при судебно-экспертном типировании гена амелогенина в > препаратах ДНК человека, к которым оказалась примешана ДНК животных, существует опасность ложного определения мужского пола в следах женского происхождения. Этому может способствовать неправильно подобранный стандарт молекулярных масс, его удаленное расположение на геле или использование неточного расчетного алгоритма для определения размеров анализируемых фрагментов.

3. Показано, что если нуклеотидный состав и первичная структура анализируемой ДНК и стандартной ДНК (стандарта молекулярных масс) оказываются различными (такие ДНК называют гетерологичными), то в определении размеров фрагментов и, соответственно, в идентификации аллельных вариантов полиморфных локусов ДНК могут быть допущены серьезные ошибки, обусловленные различиями в физико-химических, и, как следствие, электрофоретических свойствах полинуклеотидных цепей с различным нуклеотидным составом. Это явление наиболее сильно выражено в случае использования в качестве электрофоретической среды разделения

ПААГ и в несколько меньшей степени при электрофоретическом фракционировании в гелях агарозы.

4. Уточнена структурная организация аллелей полиморфных локусов хромосомной ДНК человека D1S111 и HUMCD4, и разрешены противоречия в этом вопросе, имеющиеся в литературных источниках. Это снимает ограничения на возможность сравнения результатов экспертиз, полученных в разных лабораториях при применении этих молекулярно-генетических маркеров, а также позволяет использовать эти результаты при формировании референтных баз данных.

5. Установлено достоверное неравновесие по сцеплению между локусами vWA и vWFII. Это означает, что при типировании локусов vWA и vWFII в составе одной многолокусной панели, ввиду показанной в настоящей работе генетической сцепленности этих маркеров, правило перемножения частот аллелей (генотипов) неприемлемо.

6. Определены основные популяционные характеристики полиморфизма (аллельного разнообразия) локусов хромосомной ДНК человека: D1S111, D1S80, HUMCD4, LPL, vWA и ТН01 в исследованной выборке населения России.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При молекулярно-генетическом анализе пол-специфических вариантов гена амелогенина, для того, чтобы избежать опасности ложного типирования пола человека в препаратах, содержащих ДНК животных, необходимо правильно подобрать стандарт молекулярных масс, не допускать его удаленного расположения на геле и использовать для определения размеров амплифицированных фрагментов ДНК точный расчетный алгоритм. В случае получения "нетипичных" продуктов амплификации в исследуемых препаратах ДНК, необходимо провести дополнительное исследование исходных биологических объектов для верификации их видовой принадлежности.

2. Для корректного определения размеров анализируемых фрагментов и идентификации аллельных вариантов полиморфных локусов, ДНК, применяемая в качестве стандарта молекулярных масс, должна быть гомологична анализируемой ДНК, то есть иметь одинаковые с ней нуклеотидный состав и первичную структуру. Определение размеров фрагментов ДНК по гетерологичным стандартам молекулярных масс нежелательно при использовании электрофоретического фракционирования в гелях агарозы, и категорически противопоказано в случае использования в качестве среды разделения ПААГ. Отметим, что для гелей агарозы это в принципе возможно, но как минимум, требует использования специальных гелевых сред и введения в анализ дополнительного контрольного образца ДНК с заранее известным генотипом по каждому исследуемому локусу. Но даже в этом последнем случае, важно понимать, что генотипические характеристики, получаемые расчетным путем на основании величины электрофоретической подвижности гетерологичных стандартов молекулярных масс, являются не абсолютными, а относительными (условными) и потому не могут быть напрямую использованы как элементы банка данных.

3. Номенклатуру аллельньгх вариантов локуса HUMCD4 следует унифицировать. На основании полученных в настоящей работе результатов, считаем целесообразным в качестве стандарта для локуса HUMCD4 принять номенклатуру, основанную на нумерации повторяющихся тандемных повторов по "верхней" цепи матричной ДНК.

4. При типировании локусов vWA и vWFII в составе одной многолокусной панели, по причине показанной в настоящей работе генетической сцепленности этих маркеров, правило перемножения частот аллелей (генотипов) для них неприемлемо. Таким образом, при вероятностных оценках результата типирования ПДАФ локусов vWA и vWFII возможно учитывать данные, полученные только для какого-нибудь одного (любого) локуса из этой пары. В то же время совместное типирование локусов CD4, LPL и любого (но только одного) из исследованных в настоящей работе локусов гена vWF можно проводить без каких-либо ограничений на правило перемножения частот аллелей или генотипов.

5. Полученные в настоящей работе характеристические данные о распределении аллелей исследованных полиморфных локусов хромосомной ДНК среди российского населения могут быть использованы для получения референтных данных для вычисления необходимых расчётных параметров при интерпретации результатов судебно-экспертных молекулярно-генетических идентификационных экспертиз и исследований и создании банков генетической информации.