Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Молекулярно-генетическая характеристика делеций генов короткого плеча 11-й хромосомы в некоторых ..арциномах у человека

На правах рукописи

ЛАУР

ОСКАР ЮРЬЕВИЧ

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДЕЛЕЦИЙ ЕНОВ КОРОТКОГО ПЛЕЧА 11-й ХРОМОСОМЫ В НЕКОТОРЫХ АРЦИНОМАХ У ЧЕЛОВЕКА

Специальность - 14.00.14 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1995

Научный руководитель: член-корр. РАМН, проф. К.П. Хансон

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте онкологи! им.

проф. Н. Н. Петрова МЗ и МП РФ.

Научный руководитель: чл.-корр. РАМН, проф. К. П. Хансон

Официальные оппоненты:

член-корр. РАМН, доктор медицинских наук, проф. В. С. Гайцхоки

доктор медицинских наук М.А.Забежинский

Ведущее научное учреждение:

Центральный научно-исследовательский рентгено-радиологический институт.

Защита диссертации состоится "..." .................1995г. в"..."часо

на заседании специализированного совета НИИ онкологии им. про4 Н. Н. Петрова (189646, Санкт-Петербург, Песочный-2, Ленинградска ул., 68).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан "...."........................1995г.

Ученый секретарь специализированного совета

доктор медицинских наук

Е.В. Деми

Актуальность работы.

В настоящее время достигнут значительный прогресс в понимании ¡нетических основ канцерогенеза ( Киселев Ф.Л. и др., 1990; Сейц И.Ф., нязев П.Г., 1986). Разработаны генетические диагностические тесты для экоторых опухолей и уже есть первые протоколы генной терапии, дентифицировано большое количество онкогенов, активация которых взывает злокачественную трансформацию клеток. Ведутся активные эиски антионкогенов, потеря функции которых также приводит к )ансформации.

Важнейшим методом поиска антионкогенов и выяснения их эвлеченности в том или ином заболевании является аллелотипирование, эзволяющее установить делеции различных участков хромосом. С змощью этого метода были выявлены делеции генов в некоторых юмосомах, в частности, на коротком плече 11-й хромосомы. Так, потери :терозиготности в локусе 11 р15.5 часто встречаются в опухолях легкого яичника, в то время как литературные данные по раку молочной железы гсьма противоречивы. При исследовании генетической природы опухоли /тьмса у детей было показано, что в развитии этого заболевания играют эль делеции как антионкогена WT1, расположенного в локусе 11 р 13 и эдавно клонированного (Call К.М. et al., 1990), так и антионкогена, годящегося в локусе 11 р15.5 (последний до сих пор не клонирован), юлне вероятно участие этих двух антионкогенов в генезе опухолей у ¡рослых.

Известно что, поломки некоторых антионкогенов могут сочетаться с дологической активацией онкогенов, оказывая влияние на течение 1ухолевого процесса (Bonsing R.A. et al., 1993; Knyazev P.G. et al., 1993). этом плане представляются интересными исследования амплификации жогена INT-2, так как он располагается также на 11-й хромосоме (локус Iq13). В лаборатории молекулярной генетики НИИ онкологии им. Н.Петрова накоплен опыт работы по поиску амплификации онкогена Т-2 в некоторых опухолях у человека. Было сделано предположение, что

это событие является маркером пролиферативной активности в опухоли молочной железы (Черница О.И. и др., 1996), проводились также попытк рассмотреть это явление в свете теории аллельного имбаланса, хотя пок безуспешные. Разногласия в литературе по поводу корреляци амплификации онкогена 1МТ-2 с клинико- патологическими показателям опухолевого процесса до сих пор не разрешены.

Цель и задачи исследования.

Целью работы является: молекулярно- генетическг характеристика делеций генов короткого плеча 11 -й хромосомы опухолях молочной железы, легкого и яичника, а также изучение р сочетания с амплификацией онкогена 1МТ-2 и установление I возможного клинического значения.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Выявить частоту и структуру делеций на коротком пле1 хромосомы 11 в опухолях молочной железы, легкого и яичника.

2. Выявить частоту амплификации локуса 11 3 в данных опухоля;

3. Оценить комбинаторику генных повреждений в опухолях.

4. Изучить клинико- патологическое значение выявленнь молекулярно- генетических аномалий.

Научная новизна и практическая значимость полученнь результатов.

В ходе выполнения диссертационного исследования впервь показано:

- делеции локусов региона 11 р13 встречаются довольно часто п[ немелкоклеточном раке легкого (локус 0113324- 36%, локус 011532 25%) и с несколько меньшей частотой при раке яичника (011532 27%, 0115323- 19%) и молочной железы (0113324- 24%, 011532 15%).

делеции локусов региона 11р13 являются маркерами ютастатического потенциала опухоли (р<0.02 для рака молочной елезы) и её агрессивности (р<0.01 для рака яичника).

- делеции локусов региона 11р13- событие гГозднее, т.к. имеет ильную тенденцию к корреляции со стадией заболевания (р<0.1 для лоскоклеточного рака легкого и рака молочной железы).

- делеции региона 11р15.5 не встречаются при аденокарциноме эгкого.

- нет взаимосвязи между делециями локусов 11 р13 и 11 р15.5.

- нет взаимосвязи между делециями локусов 11 р и амплификацией экуса 11q13.

Диссертационная работа имеет научно- теоретический характер, э практическая ценность заключается в следующем.

Впервые выявлены клинико- патологические корреляции делеций жусов D11S323 и D11S324, которые непосредственно фланкируют тгионкоген WT1, с метастатическим потенциалом опухолей и их -рессивностью в опухолях у человека, что позволит в будущем азработать новые методы диагностики прогноза онкологических 1болеваний.

Апробация работы.

Основные положения диссертации были представлены на: 3 еждународной Конференции "СПИД, рак и связанные с ними юблемы" Санкт- Петербург, Россия 22- 26 Мая, 1995; - 3-rd ternational Conference "AIDS, Cancer and Related Problems". May 22-26, I95, Saint- Petersburg, Russia, №10.2.; "Первом Мировом Конгрессе по эстижениям в Онкологии" 22- 26 октября, 1995, Афины, Греция- 1st orld Congress on Advances in Oncology, Oral & Posters.- 1995,- N'298.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 104 раницах машинописного текста и состоит из введения, обзора тературы, глав материалов и методов, результатов исследований,

обсуждения полученных данных и выводов. Работа иллюстрирована ' таблицами и 6 рисунками. Библиографический указатель включает 22 публикации на русском и английском языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве материала исследования использовались хирургическ удаленные участки тканей опухолей, полученные из клиники НИ! Онкологии им.H.H.Петрова. Для контроля использовал макроскопически неизмененные ткани по краю резекции того ж органа, а также периферическую кровь от этих же больных. Beer материал для исследования получен от 248 пациентов, в том числ< 158 образцов рака молочной железы; 54 - рака легкого; 36 - рак яичников.

Выделение ДНК проводили, используя метод, описанный Maniatis и др. (1982). Также применяли более простой метод очистк нуклеиновых кислот. После лизиса к препаратам добавляли NaCI f. концентрации 1,5 M и равный объем хлороформа, встряхивали 'течение 30 минут и центрифугировали (Müllenbach R. et al., 1989 Затем, независимо от применяемой модификации метода, супернатанту добавляли 2 объема этанола, после чего нити ДН "выкручивали" из раствора при помощи быстрого вращения стекляннс палочки. Нити ДНК тщательно отмывали в 70% этаноле (2-3 смены) растворяли в минимальном объеме 1-х ТЕ буфера (10 мМ трис-HCI, р 7,5; 1 тМ ЭДТА) (Maniatis T. et al., 1982) и хранили при 4 С.

10 мкг ДНК обрабатывали соответствующей эндонуклеазс рестрикции ("Biolabs", Германия), затем фрагменты Д1-электрофоретически разделяли в 0,8-1% геле агарозы ("Pharmacie Швеция) и переносили на нейлоновые мембраны ("Hybond-N "Amersham", Англия; "Хию-Калур", Таллин) (Southern Е. et al, 1975).

В работе использовались следующие зонды: анонимные марке|: на короткое плечо 11-й хромосомы (см. рис.1) р60Н1.4 ( 11 р 13, лок

11S324), p5S1.6 (11p13, локус D11S323),- предоставлены A.Ullrich, ¡рмания; 0,9 т.п.н. Sacl-Sacl фрагмент онкогена INT2 (плазмида SS6, )едоставлена С. Dickson, Англия); зонд pHRAS-Th-3 (11 р15.5, локус 3AS-1)- плазмида предоставлена П.Г. Князевым, НИИ онкологии им.

H. Петрова, Санкт-Петербург. Для контроля эквивалентности шичества нуклеиновых кислот фильтры с ДНК перегибридизовывали

I,6 т.п.н. Hindlll-EcoRI фрагментом онкогена RAF-1 ("Amersham", зликобритания). Зонды р60Н1.4 и p5S1.6 впервые использовались лесто зонда для гена WT1, так как они обладают гораздо более >юокой полиморфностью и в то же время непосредственно ланкируют последний, входя в ядро делеций гена WT1 при опухолях лльмса. В данной работе эти зонды были использованы по причине 13кого процента гетерозиготности зонда для гена WT1. Выделение эепарата ДНК плазмиды из E.coli (штамм НВ101) осуществляли по одифицированному методу Maniatis Т. и др. (1982).

Рис.1 Локусы короткого плеча 11-й хромосомы

11р14

11р13 11 р12

011531

01189 1Э14

СЕЫ

011517

РБНВ

0115151

011816

АМ2

0115415 0115323 011Б324 УУТ САТ

Нгаз1 - зонд рША8-ТЪ-3 Р115323 -зонд р5б1.6 0115324 -зонд р60Н1.4

Мечение специфических зондов осуществляли в реакции н^ трансляции или в реакции со "статистической затравкой" пут< встраивания "горячих" нуклеотидов, несущих в альфа- положен: радиоактивную фосфатную группу 32Р. Для проведения реакц

пользовались набором, предлагаемым фирмой "Amersham" (Великобритания) или "Фермент" (Вильнюс).

Меченую ДНК денатурировали в кипящей водяной бане в течение 5 мин, быстро охлаждали и сразу использовали для гибридизации с образцами ДНК, иммобилизованными на фильтрах. Предварительно нейлоновые фильтры с фиксированной на них ДНК

предгибридизовали в течение 2 часов при 42 С в растворе, содержащем 50% формамид; 5-х SSC; 0,1% SDS; 0,05% поливинилпирролидон; 0,05% фикол; 0,05% БСА; 100 мкг/мл дрожжевой тРНК. Затем этот раствор заменяли гибридизационным, содержащим наряду со всеми перечисленными компонентами раствора для предгибридизации специфический зонд, меченный 32Р. Гибридизацию ДНК на фильтрах вели при 42С в течение 16-24 часов.

По завершениии гибридизации фильтры промывали при 42 С в iex сменах раствора N1 (1-х SSC; 0,1% SDS) и в трех сменах раствора 2 (0,1-х SSC; 0,1% SDS). Затем проводили 5-минутную отмывку в эследнем растворе при 65 С. Отмытые фильтры высушивали и сспонировали на рентгеновской пленке в кассетах с усиливающими :ранами при -70 течение 3-21 суток (Laskey L.A., Mills A.D., 1977). нтенсивность гибридизации определяли денситометрически по степени ггемнения рентгеновской пленки, а также визуальным сравнительным нализом. Статистическая обработка полученных результатов доводилась по методу Хи-квадрат

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Частота делеций короткого плеча 11-й хромосомы в опухоля молочной железы, легкого и яичника.

В таблице 1 представлены результаты изучения делеций тре локусов на коротком плече 11- й хромосомы анонимными зондам! р60Н1.4 (11р13, локус D11S324), p5S1.6 (11р13, локус D11S323) i pHRAS-Th-3 (11 р15.5, локус HRAS-1) в ДНК опухолей от больных раког молочной железы, легкого и яичника.

Данные по частоте потерь гетерозиготности локуса HRAS-1 карциномах молочной железы проясняют значительные расхождения m этому поводу в литературе, т.к. это вторая после статьи Chen L.C. и др (1992) работа, выполненная на большом материале (131 образец). I если в цитируемой работе частота делеций этого же зонда составил 4%, то у нас 21% (такие же цифры давали Devilee Р. и др. (1989) Mackay J. и др. (1988) на меньшей выборке больных). Учитывая то факт, что в работе Chen L.C. и др. (1992) группа больных раког молочной железы состояла в основном из пациентов со стадие заболевания I, а в нашей работе в исследованной когорте больных с стадией заболевания I было около 30%, можно предположить, что эт противоречие обусловливается неоднородным составом изучаемы групп больных.

Данные о частоте делеций локусов D11S324 и D11S323 при рак молочной железы получены впервые и свидетельствуют о возможно роли супрессорного гена WT1 в развитии этих новообразований, т.к. большом количестве работ по изучению опухоли Вильмса был показано, что эти локусы всегда входят в ядро делеций этого ген (Gessler М. and Bruns G.A.P., 1989; Mannens М. et al., 1991; и др.).

Результаты по частоте делеций локуса HRAS-1 (43%) плоскоклеточном раке легкого согласуются с данными других авторо (Weston A. et al., 1989- 50%; Shiraishi М. et al., 1987- 41%; Bepler G. an Garcia-Blanco M.A., 1994- 45%; и др.). В группе аденокарцином легког

елеций локуса HRAS-1 не наблюдалось ни в одном из 7 нформативных образцов, что противоречит работе Weston А. и др. 1989), обнаруживших эти делеции в

Таблица 1. Частота делеций локусов 0113324, 0113323, НРАЗ-1 в арциномах молочной железы, легкого и яичника у человека.

Тип опухоли Зонд Информативность зонда Частота делеций

эак молочной келезы р60Н1.4 97/158 (61%) 23/97 (24%)

P5S1.6 34/52 (65%) 5/34 (15%)

pHRAS-Th-3 77/131 (59%) 16/77 (21%)

зсе елкоклеточн. л легкого Р60Н1.4 P5S1.6 28/48 (58%) 28/48 (58%) 10/28 (36%) 7/28 (25%)

pHRAS-Th-3 28/48 (58%) 9/28 (32%)

зкоклеточные эаки легкого Р60Н1.4 p5S1.6 20/36 (56%) 21/36 (58%) 7/20 (35%) 5/21 (24%)

pHRAS-Th-3 21/36 (58%) 9/21 (43%)

-юкарциномы :ого P60H1.4 p5S1.6 8/12 (67%) 7/12 (58%) 3/8 (37.5%) 2/7 (29%)

pHRAS-Th-3 7/12 (58%) 0/7 (0%)

лелкоклеточн )аки легкого p60H1.4 5/6 (83%) 0/5 (0%)

P5S1.6 3/6 (50%) 0/3 (0%)

pHRAS-Th-3 4/6 (67%) 2/4 (50%)

)ак яичника P60H1.4 26/36 (72%) 7/26 (27%)

P5S1.6 26/36 (72%) 5/26 (19%)

pHRAS-Th-3 21/36 (58%) 5/21 (24%)

5 из 13 образцов. Этот локус делецировался и в мелкоклеточны раках легкого (в 2 из 4 информативных образцов). К сожалению репрезентативную группу собрать не удалось из-за редко! встречаемости данного гистотипа. Вкупе с работами Shiraishi М. и др (1987) (67%) и Yokota J. и др. (1987) (25%), которые были сделаж также на очень малой выборке больных, можно сказать, что делеци! локуса HRAS-1 имеют место при мелкоклеточном раке легкого.

Нами впервые при использовании зондов р60Н1.4 и p5S1.' выявлена значительная частота делеций локусов на 11 р! 3 пр плоскоклеточном раке и аденокарциномах легкого. Наши данные ' делециях 11 р13 в аденокарциномах совпадают с данными Fong К.М. др. (1994), которые использовали зонд WT1. В среднем для групт немелкоклеточных раков легкого частота делеций этих локусо составила около 30%. Полученные результаты в целом подтверждаю работу Bepler G. and Garcia-Blanco М.А., 1994, которые дают 459 делеций этих локусов для немелкоклеточного рака легкого (также бы использован зонд WT1). В то же время наши данные противореча результатам работы Fong К.М. и др. (1994), которые выявили делеци лишь в 9% для группы из 101 образца немелкоклеточных раков легкогс По-видимому, это свидетельствует о разном составе исследованны когорт больных (в работе Fong К.М. и др. (1994) эти данные н приведены).

В группе рака яичника данные, касающиеся делеций локуса HRAS 1 (24%), подтверждают работы Yang-Feng T.L. и др. (1992), Sato Т. и д^ (1991), Eccles D.M. и др. (1992), сделанные на сходном по количестЕ материале. В то же время наши данные противоречат работам Ehlen " and Dubeau L. (1990), Lee J.H. и др. (1990), которые приводят цифру 48- 50% делеций. Отметим, что последние две работы выполнены н небольшом материале.

Что же касается данных по частоте делеций в локусах на 11 р13 пр раке яичника (в среднем 23%), то эти данные являются приоритетным! поскольку в работе Bruening W. и др. (1993) лишь 5 образцов рак

чичника исследовались на наличие делеций в локусе Ч\П"\, каковых в ой работе обнаружено не было.

2. Ассоциация между делециями 11р и клиническими параметрами опухолей.

В группе больных раком молочной железы впервые удалось збнаружить корреляцию делеций локуса 0115324 с наличием иетастазов в регионарных лимфоузлах (р<0.02) (см. табл.2). Учитывая акже данные о наличии тенденции к корреляции с поздней стадией ¡аболевания и размером, можно однозначно отметить, что делеции )того локуса встречаются на поздних стадиях заболевания в результате эпухолевой прогрессии. Что же касается делеций локуса 0115323, то |десь статистических закономерностей не было выявлено из-за малой (ыборки больных, хотя обнаруженные тенденции носили тот же :арактер.

Таблица 2. Делеции 11 р и клинические параметры рака молочной

пезы.

Клинические >аметры рака ючной железы Частота делеций локуса HRAS-1+ Частота делеций локуса D11S324+ Частота делеций локуса D11S323+

метастазы в л/узлы имеются не имеются 11/41 (27%)# 5/36 (14%) 12/34 (35%)** 11/63 (17%) 3/14(21%) 2/20 (10%)

возраст больше 50 лет меньше50 лет 10/47 (21%) 6/30 (20%) 13/62 (21%) 10/35 (29%) 4/21 (19%) 1/13 (8%)

размер опухоли больше 2см меньше 2см 9/43 (21%) 7/34 (21%) 17/60 (28%)# 6/37 (16%) 5/27 (19%) 0/7 (0%)

стадия 1- II III- IV 8/43 (19%) 8/34 (24%) 10/62 (16%)* 11/35 (31%) 2/21 (10%) 3/13 (23%)

Всего 16/77 (21%) 23/97 (24%) 5/34 (15%)

**- р<0.02 + в числителе- количество делеций в данной группе

*- р<0.1 в знаменателе-количество образцов данной группы #- р<0.2

Для локуса HRAS-1 при раке молочной железы была отмечена только тенденция к корреляции (р<0.2) с наличием метастазов в регионарны> лимфоузлах, что подтверждается литературными данными (Takita К., ei а!., 1992; Ali I.U. et al„ 1987).

Таблица 3. Делеции 11 р и клинические параметры плоскоклеточногс

рака легкого.

Клинические параметры плоскоклеточного рака легкого Частота делеций локуса HRAS-1 + Частота делеций локуса D11S3244- Частота делеций локуса D11S323+

метастазы в л/узлы имеются не имеются 5/11 (45%) 4/10 (40%) 5/10 (50%) 2/10 (20%) 4/10 (40%) 1/11 (9%)

Гистологическ тип рака плоскокл.орогов.. плоскокл.неорог. 2/4 (50%) 7/17 (41%) 3/6 (50%) 4/14 (29%) 1/4 (25%) 4/17 (24%)

Инвазия + 2/3 (67%) 7/18 (39%) 2/3 (67%) 5/17(29%) 1/4 (25%) 4/17 (24%)

размер опухоли больше 5см меньше 5см 5/7 (71%)# 4/14 (29%) 2/6 (33%) 5/14 (36%) 1/8 (12.5%) 4/13 (31%)

стадия I- II III- IV 3/10 (30%) 6/11 (55%) 1/10 (10%)* 6/10 (60%) 3/6 (50%) 2/15 (13%)

Всего 9/21 (43%) 7/20 (35%) 5/21 (24%)

*- р<0.1 + в числителе- количество делеций в данной группе

#-р<0.2 в знаменателе- количество образцов данной группы

В группе плоскоклеточного рака легкого статистически достоверны) корреляций частоты делеций с клиническими параметрами не былс обнаружено, но отмечен ряд интересных тенденций (см. табл.3). Так выявлена тенденция к связи (р<0.1) делеций локуса 0115324 с продвинутой стадией заболевания. Частота делеций этого локуса былг выше при наличии метастазов в лимфоузлах (50% против 20% для зондг

>60Н 1.4). Аналогичная тенденция отмечена и для локуса D11S323 (40% |ротив 9%). Установлена также тенденция к связи частоты делеций юкуса HRAS-1 (р<0.2) с размером опухоли больше 5 см, что до этого не )ыло отмечено в литературе. Корреляций частоты делеций этого гена с метастазами в лимфоузлы, гистологическим типом опухоли и стадией ¡аболевания не выявлено, что согласуется с работами Ludwig C.U. и др. 1991), Weston А. и др. (1989). Поиск связей частоты делеций локусов ороткого плеча 11-й хромосомы с клиническими параметрами при денокарциноме и мелкоклеточном раке легкого дал отрицательный юзультат из-за малой выборки больных.

Интересные данные впервые получены по раку яичника (см. табл.4). Оказалось, что частота делеций локуса D11S323 достоверно (р<0.01) коррелирует с выживаемостью больных. В 5 случаях из десяти

Таблица 4. Делеции 11р и клинические параметры рака яичника

Клинические ¡араметры рака яичника Частота делеций локуса HRAS-1 + Частота делеций локуса D11S324+ Частота делеций локуса D11S323+

метастазы в л/узлы имеются не имеются 3/12 (25%) 2/9 (22%) 4/16 (25%) 3/10 (30%) 5/19 (26%) 0/7 (0%)

Возраст больше 50 лет меньше50 лет 3/11 (27%) 2/10 (20%) 5/15 (33%) 2/11 (18%) 4/16 (25%) 1/10 (10%)

Выживаемост живы умерло 4/15 (27%) 1/6 (17%) 5/19 (26%) 2/7 (29%) 0/16 (0%)* 5/10 (50%)

размер опухоли больше 10см меньше 10см 2/12 (17%) 3/9 (33%) 3/13 (23%) 4/13 (31%) 1/10 (10%) 4/16 (25%)

стадия I- II III- IV 2/10 (20%) 3/11 (27%) 3/12 (25%) 4/14 (29%) 1/12 (8%) 4/14 (29%)

Всего 5/21 (24%) 7/26 (27%) 5/26 (19%)

*- р<0.01 + в числителе- количество делеций в данной группе

в знаменателе- количество образцов данной группы

умерших больных этот локус был делецирован при отсутствии делеций \ 16 живых пациентов. Для локуса 011Б324 подобной связи установить не удалось. Заметим, что эти данные нуждаются в дополнительной проверке т.к. выборка была не очень большой (26 информативных образцов). Поис! корреляций делеций локуса НПА5-1 с клиническими параметрам!, заболевания результатов не дал.

Подводя итоги анализу делеций локусов короткого плеча 11 -£ хромосомы, можно прийти к заключению о вовлеченности этих локусов е опухолевый процесс при раке молочной железы, легкого и яичника Частота делеций оказалась различной в зависимости от локуса ! локализации новообразования. Для делеций локуса 11 р15.5 наибольша! ассоциация отмечена с плоскоклеточным раком легкого и в несколькс меньшей степени- с опухолями других локализаций. В то же время н< удалось обнаружить статистически достоверных корреляций клинически: параметров изученных новообразований с частотой делеций данной локуса. Можно предположить, что возникновение делеций происходит н; ранних этапах канцерогенеза, до клинического обнаружения опухоли. Чт( касается делеций локусов 11р13, то их частота в целом не отличалась I значительной степени от делеций локуса 11 р15.5. Однако для эти: локусов удалось выявить ряд корреляций частоты делеций I клиническими параметрами. При этом в первую очередь была обнаружен; тенденция к корреляции со стадией заболевания, что свидетельствует I пользу предположения о том, что делеции в этой области- событи! позднее, связанное с опухолевой прогрессией. Это предположена подтверждается также тем, что частота делеции этих локусов возрастал с увеличением метастатического потенциала и агрессивности опухолу Данный факт имеет не только теоретическое, но и практическое значение поскольку делеции локусов 11 р13 можно использовать в качеств! маркеров прогноза развития заболевания.

3. Амплификация локуса 11ц13 в опухолях у человека.

В группе рака молочной железы частота амплификации локус 11д13 составила 9% (10 из 109), в группе плоскоклеточных рако

югкого 10% (3 из 30), аденокарцином легкого 8% (1 из 12) и в группе >ака яичника 11% (4 из 36). При мелкоклеточном раке легкого 1мплификация гена INT-2 не была обнаружено ни в одном из 6 •бразцов. Эти данные вполне согласуются с литературными (Черница ).И. и др., 1996; Borg A., et al., 1991; Henry J.A. et al., 1993; Brison О., 993). Эти авторы дают 10- 20% амплификаций локуса INT-2 для рака юлочной железы и 10- 13% для плоскоклеточного рака легкого. 1олученные данные по раку яичника несколько отличаются от 1итературных, т.к. Brison О. (1993) и Sasano H.J.и др. (1990) показали, то это событие скорее спорадическое для данной локализации и ¡оставляет от 3 до 6%. Объяснение этому может быть кроется в том, то выборка была небольшой (36 больных), а кроме того в основном юстояла из больных с далеко зашедшей стадией процесса. Однако в юследнее время появились работы с применением количественной 1ЦР на парафиновых срезах, где амплификации INT-2 были »бнаружены в 15- 20% рака яичника и коррелировали с аггресивностью тухоли (Hruza С. et al., 1993; Rosen A. et al., 1993).

Что касается клинических коррелятов этого события, то было юказано только наличие тенденции к корреляции с большим размером >пухоли (р<0.2) при раке молочной железы. Ранее (Черница О.И. и др., 996) в лаборатории молекулярной генетики НИИ Онкологии была 1айдена достоверная связь между этими параметрами.

4. Картирование делеций 11р, оценка комбинаторики генных ювреждений.

В 1987 году впервые было показано (Ali I.U. et al., 1987), что ^елеции локуса 11 р15.5 часто встречаются при раке молочной железы. 1озже многочисленные исследователи выявили этот феномен при раке ¡егкого, яичника, а также во многих других локализациях. Затем артирование делеций при опухоли Вильмса выявило частые потери етерозиготности в локусе 11 р13 и в 1990 году был клонирован ген VT1. Причем было показано (Haber D.A. et al.,1990; Henry I. et al., 1989), то в развитии этой редкой опухоли задействованы потери

гетерозиготности в обоих локусах . Резонно было предположить, чт< подобная закономерность может иметь место и в тех опухолях взрослых, где встречаются делеции 11 р15. Это предположение нашл! свое подтверждение в данной работе.

В свете теории аллельного имбаланса (Bonsing R.A. et al., 1993 Knyazev P.G. et al., 1993) нами проводились попытки найт! корреляционные связи между делециями локусов 11 р13 и 11 р15.5. амплификацией региона 11 q 13 и влиянием, сочетанности этих тре событий на клиническое течение заболевания. Оказалось, что делеци! 11 р13 и 11 р15 не связаны между собой. Сочетание делеций локус 11 р15.5 с делецией одного из локусов 11 р 13 отмечено лишь в тре случаях рака молочной железы и трех случаях плоскоклеточного рак; легкого. Такая же закономерность была обнаружена и в опухоля Вильмса (Schwartz С.Е. et al, 1991). Доказать наличие статистическ! достоверной связи между делециями 11 р и амплификацией гена INT-: также не удалось из-за малого числа случаев амплификаци!/ Сочетание амплификации локуса 11q13 с делецией одного из локусо 11 р отмечено при раке молочной железы в 4 случаях, npi плоскоклеточном раке легкого в 2, при раке яичника в одном.

Таким образом, в данной работе прояснены некоторые разногласия в литературных данных, касающиеся делеций 11р15.5, i впервые приведены сведения об ассоциации делеций генов локуса WT с изученными опухолями у взрослых. Найдены важные клинически^ корреляции, позволяющие начать разработку прогностически маркеров. С другой стороны данные о биохимии продукта гена WT (либо идентификация других антионкогенов на 11 р13) смогут ближайшем будущем пролить свет на механизмы его действия i степень участия в генезе опухолей у взрослых.

ВЫВОДЫ.

1. Делеции региона 11 р15.5 встречаются при плоскоклеточног раке легкого (9/21- 43%), мелкоклеточном раке легкого (2/4- 50%; опухолях яичника (5/21- 24%) и молочной железы (16/77- 21%;

.елеции этого локуса не обнаружены ни в одном из 7 информативных бразцов аденокарциномы легкого.

2. Делеции региона 11 р15.5 не коррелируют с клинико-атологическими характеристиками опухолей, что может видетельствовать о том, что они возникают на ранних этапах анцерогенеза.

3. Делеции локусов D11S324 и D11S323 региона 11р13 зтречаются при плоскоклеточном раке легкого (соответственно, в 35%

24% случаев), аденокарциномах легкого (37.5% и 29%), при раке очника (27% и 19%) и молочной железы (24% и 15%). Делеции этих □кусов не обнаружены ни в одном из исследованных случаев елкокпеточного рака легкого.

4. Делеции локусов региона 11р13- событие позднее, т.к. имеет знденцию к корреляции со стадией заболевания (р<0.1 для поскоклеточного рака легкого и рака молочной железы).

5. Делеции локусов региона 11р13- являются маркерами етастатического потенциала опухоли (р<0.02 для рака молочной елезы) и её агрессивности (р<0.01 для рака яичника).

6. Нет взаимосвязи между делециями локусов 11 р13 и 11 р15.5

7. Локус 11q13 амплифицируется нечасто в опухолях молочной елезы (9%), легкого (10%) и яичника (11%)

8. Нет взаимосвязи между делециями локусов 11 р и лплификацией локуса 11 q13

******

Выражаю сердечную признательность руководителю чссертационной работы чл.-корр. РАМН, проф. Кайдо Пауловичу 1нсону за постоянное внимание к работе. Приношу глубокую пагодарность за огромную помощь в выполнении работы своим зузьям и коллегам к.б.н. Того A.B., д.м.н. Князеву П.Г., к.м.н. Чернице И., к.м.н. Имянитову E.H., Белогубовой Е.В., Чебуркину Ю.В., к.м.н. энцеву A.A., Вишняковой С.И., Рикуновой Л.В., к.б.н. Никифоровой

И.Ф. Выражаю глубокую благодарность также проф. Семиглазову B.ct проф. Барчуку А.С., проф. Винокурову В.Л., д.м.н. Симонову Н.Н., к.м. Ивановой О.А., д.м.н. Лемехову В.Г., к.м.н. Гуляеву А.В., : предоставление опухолевого материала.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Laur O.Y., Chernitsa О.I., Imyanitov E.N., Cheburkin YA Belogubova E.V., Knyazev P.G., Togo A.V. Deletions of the short arm chromosome 11 in some human carcinomas. Abstract N'298. 1st Wor Congress on Advances in Oncology. October 22-26, 1995, Vouliagmer Athens, Greece.

2 Chernitsa O.I., Laur O.Yu., Cheburkin Yu.V., Imyanitov E.N Belogubova E.V., llyushik E.C., Lemekhov V.G., Ivanova O.A., Gulyaev АЛ Knyazev P.G., Togo A.V. Deletions of the short arm of chromosome 17 ar amplification of INT-2 oncogene in some human carcinomas- 3-i International Conference "AIDS, Cancer and Related Problems". May 22-2 1995, Saint- Petersburg, Russia, №10.2.

3. Имянитов E.H., Черница О.И., Никифорова И.Ф., Серова О.IV Соколов С.И., Лаур О.А., Того А.В., Князев П.Г. Амплифи-кац1 онкогенов ERBB-2 (HER-2/NEU), ERBB-1 (HER-1) и C-MYC час" сочетается с делецией короткого плеча хромосомы 17 в карцином, у человека. - Мол. биол.-1993.- 27.- N'4-C.888-894.

4. О.И.Черница, О.Ю.Лаур, Е.Н.Имянитов, Ю.В.Чебурки Е.В.Белогубова, Э.С.Илюшик, Зайцева О.А., А.В.Того, О.А.Иванов П.Г.Князев, В.Ф.Семиглазов, К.П.Хансон. Ассоциация амплификащ онкогена INT-2 с увеличенным размером опухоли при раке молочнс железы- Вопросы онкологии - 1996 - принято в печать.