Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Молекулярно-генетическая диагностика меланоцитарных поражений кожи с помощью реакции флуоресцентной in situ гибридизации

004616000

На правах рукописи

СЕНДЕРОВИЧ Анастасия Ильинична

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА МЕЛАНОЦИТАРНЫХ ПОРАЖЕНИЙ КОЖИ С ПОМОЩЬЮ РЕАКЦИИ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ IN SITU ГИБРИДИЗАЦИИ

14.01.12,- Онкология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

- 2 пен 2010

Москва-2010

004616000

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Российском онкологическом научном центре имени Н.Н.Блохина РАМН (директор - академик РАН и РАМН, профессор Давыдов М.И.).

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

Карселадзе Аполлон Иродионович

доктор медицинских наук

Харатишвили Теймураз Кобаевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Петерсон Сергей Борисович

доктор медицинских наук

Карамышева Аида Фуадовна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава».

Защита диссертации состоится с$3, 2010 г. в N на заседании

диссертационного совета Д 001.017.01 при Российском онкологическом научном центре им. Н.Н.Блохина РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, д.24).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН.

Автореферат разослан « // »¿¿ЯЛСМ?2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор мед. наук, профессор -Шишкин Ю.В.

Актуальность темы Меланома кожи является одной из самой агрессивных опухолей человека. Следует отметить, что среди всех злокачественных опухолей кожи меланома занимает особое место. Так, составляя структурно не более 10% от всех форм рака кожи, она ответственна за 80% смертей, приходящихся на группу злокачественных опухолей кожи [2]. Причина этого феномена состоит в том, что в отличие от базальноклеточного и плоскоклеточного рака кожи меланома в значительно большей степени представляет собой модель злокачественной опухоли, для которой характерны не только местный рецидив или появление регионарных лимфогенных метастазов, но в значительно большей степени развитие отдаленных метастазов в различных тканях и внутренних органах [2].

Как известно, из меланоцитов могут развиться как доброкачественные, так и злокачественные новообразования. Доброкачественные меланоцитарные опухоли называются меланоцитарными невусами, а злокачественные опухоли - меланомами. Гистологическое исследование на настоящий момент является золотым стандартом для диагностической классификации меланоцитарных новообразований. Однако, несмотря на то, что гистологические критерии позволяют отнести большинство меланоцитарных опухолей либо к невусу, либо к меланоме, существуют так называемые неясные случаи [57, 84, 104]. Ошибочный диагноз меланоцитарных новообразований достаточно распространен и может привести к неправильному выбору терапии больного [77,118].

По современным воззрениям установлено, что в основе злокачественного роста меланоцитов лежит нестабильность генома, которая возникает преимущественно на хромосомном уровне [15, 32]. В отличие от этого у большинства меланоцитарных невусов существует контроль над геномной целостностью, а потому их можно отличить от меланомы путем обнаружения увеличения или потери молекул ДНК [32]. То, что меланома и невус значительно отличаются друг от друга по набору изменений в области ДНК, является полезным диагностическим инструментом, а также может помочь в установлении генетических механизмов прогрессирования меланомы [35].

Вышеприведенные данные свидетельствуют о чрезвычайной актуальности изучения гентических нарушений при различных меланоцитарных поражениях кожи.

Цель работы: Разработка уточняющего метода для первичной и дифференциальной диагностики меланоцитарных поражений кожи на молекулярно-генетическом уровне с помощью реакции флуоресцентной in situ гибридизации (FISH).

Задачи исследования:

1. Дать качественную и количественную характеристику изменений в области генов RREBI (6р25), MYB (6q23), CCNDl (llql3) с помощью реакции флуоресцентной

in situ гибридизации при доброкачественных меланоцитарных поражениях и меланоме кожи.

2. Оценить частоту и спектр генетических нарушений для тех случаев, которые изначально вызывали диагностические трудности у патоморфолога или классифицировались как диспластический невус, невус Шпиц, Рида, голубой невус.

3. Провести исследование изменений генов RREBI (6р25), MYB (6q23), CCND1 (llql3) в опухолях кожи и мягких тканей немеланоцитарной природы для выявления возможности использовать особенности состояния этих генов для дифференциальной диагностики.

4. Сопоставить полученные данные в указанных группах с клиническим течением процесса и сформулировать возможные прогностические критерии.

Научная новизна исследования: работ по систематическому изучению меланоцитарных поражений кожи с помощью FISH-реакции на большом репрезентативном материале в литературе нет.

Показано, что при доброкачественных меланоцитарных поражениях кожи копийность генов RREBI, CCND1 и MY В меняется как в сторону увеличения, так и в сторону уменьшения. Однако диапазон этих изменений достаточно узок и никогда не достигает тех величин, которые характерны для злокачественных меланоцитарных опухолей кожи. Вьивлена зависимость копийности генов от типа невуса. Во внутридермальном невусе генетических поломок наблюдается больше, чем в невусе с преимущественно эпидермальным компонентом. Кроме того наблюдается прямая зависимость числа копий генов от глубины кожи. По мере продвижения в дерму частота нарушений возрастает.

Выявлен комплекс показателей, характерный для меланомы. Образец соответствует меланоме, если: среднее количество гена CCND1 на ядро >2,5; процент ядер с «ненормальным» количеством гена RREB1 (т.е. ядра с сигналами RREB1 более или менее 2) >63%; процент ядер с потерей гена MYB относительно СЕРб >31%; среднее количество гена MYB на ядро >2,5. Установлено, что генетические нарушения присутствуют как на ранней стадии формирования опухоли (фаза радиального роста), так и на более поздней (фаза вертикального роста). При этом степень выраженности этих нарушений не зависит от фазы развития опухоли. Помимо этого отмечено существование меланом с преобладающим типом нарушений: с амплификацией исследуемых генов, или с делецией. Также было установлено, что в наибольшей степени (в 72,1%) подвержен аберрациям ген RREBI.

Показана определенная специфичность генетических аберраций для того или иного вида меланоцитарного поражения. Установлено, что нарушения в области гена RREB1 чаще всего встречаются при меланоме (72,1%), невусе Рида (28,6%) и диспластическом невусе (10,7%). Аберрации гена CCND1 с наибольшей частотой вьмвляются при диспластическом невусе (9,7%), изменение числа копий гена ШВ - при невусе Шпиц (20,0%).

Впервые изучен характер аберраций генов RREB1, CCND1 и MYB при опухолях немеланоцитарной природы. Показано, что количественный диапазон данного типа нарушений не превышает пограничных значений, установленных для меланомы.

Практическая цешюсть работы: Разработана и внедрена методика, которая послужит для улучшения и уточнения диагноза. Данный метод позволит диагностировать меланому на ранних стадиях, что поможет дополнить прогностические критерии особенностями нарушения генов RREB1, CCND1 и MYB. Также перспективным является использование указанных аберраций при дифференциальной диагностике между меланомой и опухолями немеланоцитарной природы.

Материал и методы исследования: в диссертации осуществлен анализ генетических особенностей 153 случаев. Из них 143 образца составляют меланоцитарные поражения кожи и 10 образцов опухолей немеланоцитарной природы. Все больные лечились в РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН в период 1995-2008 гг.

В качестве основного метода исследования в работе использовалась методика флуоресцентной in situ гибридизации.

Апробация диссертации проведена 17 сентября 2010 года на совместной научной конференции отдела патологической анатомии опухолей человека, лаборатории клинической цитологии, лаборатории клинической онкогенетики, отделения опухолей опорно-двигательного аппарата, отделения биотерапии опухолей НИИ клинической онкологии РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН

Внедрение результатов работы: результаты диссертации опубликованы в специальной литературе (3 журнальных публикации), включены в диагностический процесс отдела патологической анатомии опухолей человека РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из 4 глав, изложена на 116 страницах машинописного текста, содержит 19 таблиц, 23 рисунка и 1 график.

Основные положения, выносимые на защиту 1. Существует ряд генетических нарушений, которые характерны для меланоцитарных поражений кожи.

2. Указанные аберрации имеют четкие количественные различия между доброкачественными и злокачественными новообразованиями.

3. Существуют специфические количественные характеристики генетических нарушений применительно к разным подгруппам новообразований, неясных в диагностическом плане.

4. Описанные генетические аберрации характеризуют морфологические подтипы голубого невуса.

5. Совокупность генетических нарушений имеет определенную специфичность, она отсутствует в опухолях немеланоцитарной природы. Это дает основание считать определение данных аберраций перспективным для дифференциальной диагностики между опухолями меланоцитарной и немеланоцитарной природы.

Содержание диссертационного исследования Характеристика материала и методов исследования. Для выполнения поставленных нами задач было изучено 150 случая, из них 140 образцов меланоцитарных поражений кожи и 10 образцов опухолей немеланоцитарной природы. Среди меланоцитарных поражений кожи было рассмотрено 20 доброкачественных пигментных образований, 40 меланом, 80 случаев, неясных в диагностическом плане. Среди доброкачественных пигментных образований было рассмотрено 9 внутридермальных и 11 сложных невусов. Группа меланомы была представлена И случаями узловой меланомы, 5 случаями поверхностной меланомы, 2 случаями сочетания узловой и поверхностной форм, 2 случаями акральной меланомы, а также 20 случаями меланомы, для которых существовали результаты отдаленных наблюдений. Группа сложных для диагностики случаев состояла из 8 случаев голубого невуса (3 образца клеточного голубого невуса, 5 образцов простого голубого невуса), 28 случаев диспластического невуса, 7 случаев невуса Рида, 5 случаев невуса Шпиц, 32 случая сложного невуса. Группа опухолей немеланоцитарной природы включала в себя образцы: базальноклеточного рака, рака желудка in situ, фибросаркому челюсти, рабдомиосаркому, веретеноклеточную синовиальную саркому, 2 случая протокового рака молочной железы, 2 случая светлоклеточной саркомы, рака полового члена. Все препараты были получены от больных, оперированных в РОНЦ им. Н.Н.Блохина за период 1995-2008 гг.. Операционный материал был фиксирован в 10% нейтральном забуференном формалине в течение 24 ч, дальнейшая его обработка проводилась по традиционной гистологической методике. После этого были приготовлены парафиновые срезы толщиной 4 мкм. Препараты окрашивались гематоксилином и эозином,

пикрофуксином, на железо. В отдельных случаях (10 препаратов) проводилась иммуногистохимическая (ИГХ) реакция с использованием следующих антител: S100, Rb, 1:700 (Dako), НМВ 45, клон НМВ 45, 1:140 (BioGenex), Melan А, клон А 103, 1:700 (BioGenex), Tyrosinase, клон Т 311, 1:210 (Diagnostic BioSystems), Mitf-Pan, клон C5+D5, 1:140, (Diagnostic BioSystems). В качестве вторичных антител и системы детекции использовался реактив Super Sensitive Polymer-HRP Detection System/DAB, BioGenex.

Для выявления наличия/отсутствия генетических нарушений, материал был исследован с помощью методики флуоресцентной in situ гибридизации (FISH-реакция).

Исследование проводилось на парафиновых срезах, толщиной 4 мкм, и мазках-отпечатках. Пунктаты для анализа не использовались.

Для установления состояния генов RREB1{6р25), MYB{6q23), CCND1{\ 1 q 13) использовалась проба LSI RREB1/ LSI MYB/ LSI CCND1/ CEP6 фирмы Abbott-Vysis.

Оценка результатов проводилась с использованием флуоресцентного микроскопа Axioscop2Plus (Zeiss).

Для статистической обработки данных использовались следующие методы: корреляция по Спирмену и по Кэндаллу, непараметрический тест Манна-Уитни, сравнительный анализ выживаемости по Каплан-Мейеру, метод регрессии Кокса, построение деревьев решений.

Результаты собственных исследований

Доброкачественные меланоцитарные новообразования

Среди 20 пациентов было 5 детей в возрасте от 7 до 13 лет и 15 взрослых в возрасте от 21 до 49 лет. Невусы, взятые для исследования, располагались на коже туловища, конечностей, лица и шеи. Их размеры по длине колебались от 5 до 25 мм, по ширине - от 2 до 18 мм, по толщине - от 2 до 8 мм.

В результате FISH-реакции флуоресцентные сигналы были четко видны и легко поддавались интерпретации, морфология ткани была сохранна. Обнаруженные нами в эпидермисе и дерме незначительные нарушения копийности генов RREB1 (6р25), MY В (6q23), CCND1 (1 lql3), по-видимому, связаны с потерей некоторого количества ядерного материала при приготовлении парафинового среза. Нами был произведен подсчет сигналов трех генов RREBJ, MYB, CCND1 и центромеры хромосомы б в 30 невусных клетках. Суммарных генетических признаков, характерных для меланомы, выявлено не было. Наличие генетических нарушений в данных клетках, не превышало пограничных значений.

В результате анализа 20 невуеов ни один из них генетически меланоме не соответствовал. Тем не менее, мы произвели статистическую обработку полученных результатов с целью обнаружить некоторые закономерности, например, существует ли корреляция копийности между генами.

Нами было установлено, что чаще всего, 71,7% случаев, наблюдается нарушение копийности гена МУВ однако этот параметр не превышает уровня 2,5, установленного для злокачественной опухоли. Кроме того, копийность указанного гена зависит от распространения невоидных клеток в дерму. По мере продвижения в дерму частота нарушений возрастает (Табл.1).

Слой эпидермиса Копийность гена

0 | 1 | 2 | 3 | 4

ССЫО!

Поверхностный 11 21 73 2 0

Глубокий 6 12 55 0 0

= 0.2892, р = 0.5908

ЯЯЕВ1

Поверхностный 3 23 73 6 2

Глубокий 3 16 54 0 0

М' = 1.7595, р = 0.1847

ШВ

Поверхностный 0 32 72 3 0

Глубокий 5 22 46 0 0

М* = 3.861, р = 0.04942

Таблица 1. Расчет корреляции между копийностью генов и глубиной слоя.

Отсюда можно сделать вывод, который подтвержден и статистически, что во внутридермальном невусе генетических поломок наблюдается больше, чем в невусе с преимущественно эпидермальным компонентом (Табл.2).

Тип невуса Копийность гена

0|1|2|3|4|5|6

ССАВ/

Сложный 24 57 236 11 2 0 0

Внутридермальный 14 33 207 13 2 0 1

М2 = 5.1162, р = 0.02370

КИЕВ!

Сложный 9 63 246 9 3 0 0

Внутридермальный 4 53 196 12 4 1 0

М2= 1.502, р = 0.2204

МУВ

Сложный 10 85 218 16 1 0 0

Внутридермальный 7 52 188 19 3 1 0

М2 = 5.6222, р = 0.01773

Таблица 2. Расчет корреляции между типом невуса и количеством копий генов.

Как видно из таблицы число клеток с нормальной копийностью превалирует в случаях сложного невуса, в то время как во внутридермальных невусах наиболее часто встречаются ядра с 3-5 копиями указанных генов.

Злокачественные меланоцитарные новообразования ч Группу из 20 пациентов составляли взрослые в возрасте от 30 до 85 лет. Мелапомы, взятые для исследования, располагались на коже туловища и конечностей. Их размеры по длине колебались от 9 до 45 мм, по ширине - от 5 до 45 мм, толщина по Бреслоу составила от 0,6 до 7 мм, уровень инвазии по Кларку составил от II до V.

Нами было установлено, что генетические нарушения присутствуют как на ранней стадии формирования опухоли (фаза радиального роста), так и на более поздней (фаза вертикального роста). При этом степень выраженности этих нарушений не зависит от фазы развития опухоли. Из чего можно сделать вывод, что данные аберрации, характерные для меланомы, не являются следствием прогрессии процесса малигнизации.

Помимо этого нами было отмечено существование меланом, как с амплификацией исследуемых генов, так и с делецией.

Также было выявлено, что в веретенообразных клетках генетических нарушений больше, чем в эпителиоидных того же образца.

Узловая нодулярная меланома

Нами было исследовано 11 случаев данного вида меланомы. Меланомы, взятые для исследования, располагались на коже спины и нижних конечностей. Их размеры по длине колебались от 1,3 до 8,5 мм, по ширине - от 1,0 до 2,5 мм, толщина по Бреслоу - от 1,0 до 3,5 мм, уровень инвазии по Кларку составил от от II до IV.

При исследовании с помощью РКН-реакции было установлено, что в данной группе меланом преобладают нарушения по одному параметру: гену ЯЯЕВ1 (27%, 3/11). Также были обнаружены другие одиночные нарушения ССМ)7 (18%, 2/11), и делеция МУВ относительно СЕР 6 (18%, 2/11), нарушения по двум и трем параметрам составляет 18% (2/11) соответственно. Суммируя количество нарушений (единичные и сочетанные) во всех случаях, следует отметить, что наиболее часто присутствует нарушение копийности гена КИЕВ! (64%, 7/11). Изменение в области гена ССЫО!, а также делеция МУВ/ СЕР6 встречаются в 45% (5/11) случаях. Увеличение копийности гена МУВ ни в одном из 11 случаев не наблюдалось.

Нами было рассмотрено два случая сочетанного варианта меланомы (узловая+поверхностная), в одном из которых следует отметить нарушение в области только гена ЯЯЕВ1, в другом - генов КЯЕВ] и €€N01.

Акральная меланома

Нами было рассмотрено 2 случая данного вида меланомы. Они были расположены на коже стоп. Их размеры по длине колебались от 3,0 до 4,0 мм, по ширине - от 1,5 до 2,0 мм, толщина по Бреслоу - от 0,6 до 3,5 мм, уровень инвазии по Кларку составил от от II

ДоУ.

При ИЗН-реакции данного типа меланом в обоих случаях было отмечено нарушение копийности только гена ИКЕВ! (100%, 2/2).

Поверхностно распространяющаяся меланома

Нами было исследовано 5 случаев данного вида меланомы. Меланомы, взятые для исследования, располагались на коже спины и нижних конечностей. Их размеры по длине колебались от 1,3 до 8,5 мм, по ширине - от 1,0 до 2,5 мм, толщина по Бреслоу - от 1,3 до 7,0 мм, уровень инвазии по Кларку составил от от II до IV.

При ПЭН-реакции данного типа меланом было отмечено нарушение копийности гена 1ШЕВ1 (40,0%, 2/5), увеличение копийности ССЫй1, изменение копийности МУВ и делеция МУВ/СЕР6 в остальных 60,0% случаев.

В данной группе меланом следует отметить наличие так называемых РКН-негативных случаев, в которых не было генетических поломок ни по одному параметру. При пересмотре гистологических и иммуногистохимических препаратов данных больных разными специалистами, диагноз меланома был подтвержден. Возможно, полученный отрицательный результат можно связать с благоприятным течением и прогнозом заболевания, однако, учитывая небольшой период, прошедший с момента операции до РЙН-исследования формулировать данные предположения пока рано.

Объединив полученные результаты от 20 случаев меланомы, мы изучили зависимость между копийностью генов и уровнем инвазии (Табл.3) и толщиной опухоли (Табл.4).

Коэффициент корреляции

Ген по Кендаллу по Спирмену

СЕР6 0.229 0.250

КИЕВ 0.285 0.327

ССЫй! 0.157 0.176

МУВ 0.019 0.021

Таблица 3. Расчет корреляции между копийностью генов и уровнем инвазии.

Коэффициент корреляции

Ген по Кендаллу по Спирмену

СЕР6 0.050 0.060

ЯКЕ В 0.070 0.100

ССЛ'Ш -0.010 -0.020

МУВ -0.070 -0.090

Таблица 4. Расчет корреляции между копийностью генов и толщиной опухоли.

Статистически достоверной корреляции между указанными параметрами не установлено. Вероятно, это связано с тем, что исследуемые нами аберрации возникают на ранних этапах формирования опухоли.

Далее мы отранжировали гены по степени отклонения от нормы. Для каждого гена просуммировали абсолютное значение разности между фактической копийностью и копийностью в норме. Получили следующие значения: СЕР6 (411), ССМ)7 (492), ККЕВ1 (647), МУВ (425).

Следовательно, можно установить следующий порядок генов по мере увеличения степени отклонения копийности от нормы: СЕР6, МУВ, ССЫ01, Ш(ЕВ1.

Если же не учитывать абсолютные значения копийности, а рассматривать только число клеток с нормальной копийностью, то порядок генов по мере увеличения степени отклонения от нормы будет следующим: МУВ (309 клеток), ССИИ! (300 клеток), СЕР6 (299 клеток), ВИЕВ] (206 клеток).

Если рассматривать генетические нарушения в пределах клинических случаев, то ген Ш1ЕВ1 нарушен в 13 образцах из 20 (65,0%).

Таким образом, по трем указанным критериям, по сравнению с нормой, чаще выявляются нарушения в области гена ЕЯЕВ/.

Сведенья о копийности были доступны для 630 клеток. Нами было установлено, что в 11% (66/600) не отмечается никаких генетических нарушений, одиночные

нарушения встречаются в 20% (120/600). Остальные 69% (414/600) составляют сочетанные нарушения, из них 7,1% (29/414) составляет уменьшение копийности всех генов, 7,0% (29/414) уменьшение копийности всех генов кроме CCND1, а также увеличение копийности всех генов 6,3% (26/414) и увеличение копийности всех генов кроме MYB 5,8% (24/414). Остальные типы сочетанных нарушений встречаются приблизительно в два раза реже.

Следует отметить, что из 20 изученных нами меланом 3 (15,0%) оказались FISH-отрицательными (рис. 13 а, б).

В исследуемых образцах меланомы нами было обнаружено 90 клеток с отрицательной FISH - реакцией и 540 клеток с положительной FISH - реакцией.

При сравнении двух групп с отрицательным и положительным FISH-результатами нами было установлено, что копийность генов CCND1 (р=0.009) и RREB1 (р<0.001) статистически значимо различаются у обеих групп (копийность генов в случае отрицательной FISH -реакции в среднем ниже). Также уровень инвазии и толщина слоя в среднем меньше для отрицательной FISH-реакции (р<0.001) (табл. 5).

Среднее (FISH-положительные образцы) Среднее (FISH-отрицательные образцы) р(уровень значимости)

СЕРб 1.917 1.756 0.292

CCND1 2.198 1.811 0.009

RREB1 2.619 1.878 <0.001

MYB 1.700 1.789 0.255

Уровень инвазии 3.500 2.667 <0.001

Толщина слоя 4.678 3.100 <0.001

Таблица 5. Сравнение копийности генов между группами меланом с отрицательной и положительной РВН-реакпией с помощью непараметрического теста Манна-Уитни.

Было установлено, что две подгруппы меланомы (FISH+ и FISH-) больше всего различаются по копийности гена RREB1. Для FISH+ одиночное нарушение в виде увеличения его копийности встречается в 10,7% (58/540 клеток) случаев, а для FISH-аналогичное нарушение встречается всего в 1,1% (1/90 клеток) случаев.

Напротив, в группе FISH- чаще встречаются одиночное уменьшение CCND1 (6,7%, 6/90 клеток) и одиночное уменьшение MYB (6,7%, 6/90 клеток) по сравнению с аналогичными частотами встречаемости в FISH+ (4,8%, 26/540 клеток и 3,2%, 17/540 клеток соответственно).

При сравнении увеличения/уменьшения копийности для каждого гена в отдельности было установлено, что указанные параметры различаются для FISH+ и FISH- групп, но RREB1 и CCND1 - намного больше по сравнению с MYB (табл. 6).

FISH-положительные образцы (всего 540 клеток)

Нет нарушений 5.9% (32/540)

Одиночные нарушения 19.6% (106/540)

Наиболее часто встречающиеся нарушения 1. Увеличение копийности ХЛЕВ/ - 10.7% (58/540) 2. Уменьшение копийности всех генов - 5.3% (29/540) 3. Увеличение копийности всех генов - 4.8%(26/540) 4. Уменьшение копийности всех генов кроме ССЛЩУ- 4.8% (26/540) 5. Увеличение копийности всех генов кроме МУВ - 4.6% (25/540)

FISH-отрицательные образцы (всего 90 клеток)

Нет нарушений 38.9% (35/90)

Одиночные нарушения 22.2% (20/90)

Наиболее часто встречающиеся нарушения 1.Уменьшение копийности всех генов кроме RREB1 - 8.9% (8/90) 2. Уменьшение копийности CCND1 - 6.7% (6/90) 3. Уменьшение копийности MYB - 6.7% (6/90)

Таблица 6. Степень генетических нарушений в группах с отрицательной и положительной FISH-реакцией.

Меланомы, для которых существуют результаты отдаленных наблюдений. Группу из 20 пациентов составляли взрослые в возрасте от 35 до 83 лет. Меланомы, взятые для исследования, располагались на коже туловища и нижних конечностей. Их размеры по длине колебались от 10 до 40 мм, по ширине - от 10 до 50 мм, толщина по Бреслоу составила от 1 до 26 мм, уровень инвазия по Кларку составил от II до V. Общая выживаемость больных прослеживалась с 1995 г. по 2008г. Все 20 случаев были Р181 {-положительными. В данной группе деление на нозологические формы не производилось.

Оценить выживаемость можно, построив кривую по методу Каплана-Мейера (рис.

1.0 0.9 0.8 0.7

Я 0.6

м

и

I"0'5

3

Щ 0.4

0.3 0.2 0,1 0.0

Рис.1. Кривая общей выживаемости

Как видно из рисунка 40,0% (8/20) больных погибают в первые 3 года наблюдений. Рассмотрим модель Кокса, оценивающую пропорциональный риск выживаемости (Табл.7).

Название гена Коэффициент модели р (уровень значимости)

СЕР6 -0.313 б.Ое-Об

(ХЖ>У -0.203 8.8е-06

ККЕВ1 0.117 4.5е-02

МУВ -0.241 2.2е-03

Таблица 7. Модель Кокса

Как видно из таблицы 10 все гены статистически значимо влияют на выживаемость, однако ЯКЕ£1 влияет меньше всего (относительно). Также значение имеет знак коэффициента модели: знак «-» говорит о том, что, чем больше копийность генов ССЛФ/ и МТБ, тем меньше риск смертности, и наоборот, знак «+» свидетельствует о том, что, чем больше копийность ККЕВ1, тем больше риск смертности.

Построим дерево решений.

1996 199в 2000 2002 200-5 2006 2008

Время

о Известные » Цензурировзнныа

MYB

<1

>1

0.8 - 1 0.8 -

0.6 - 0.6 -

-1 0.4 - 0.4 -

0.2 ' 0.2 -

Mil!; 0 lililí 0 ■ I i , , ¡ ,-

\УЛ '-VA ÍXA XOl

n = 96

iw Ü&M :ooi

11 = 70

»и» i») xw ; л = 175

Рис. 2. Дерево решений, для группы меланом, для которых существуют результаты отдаленных наблюдений. На рисунке представлены различные варианты кривой общей выживаемости в зависимости от копийности генов. Ось У - функция выживаемости, ось X - время, п - число клеток с определенной копийностью гена.

В результате анализа зависимости выживаемости от типа генетических нарушений, нами было установлено, что гены МУВ и ССЫВ1 связаны с выживаемостью: чем больше число копий указанных генов, тем меньше риск смертности в первые годы после заболевания (р<0,001). Напротив, ген ЯКЕВ1 с выживаемостью пациента статистически достоверно не коррелирует (рис.2).

Следовательно, установив тип аберраций в конкретном случае, тем самым можно дополнить прогностические критерии заболевания.

Меланоцитарпые поражения, неясные в диагностическом плане

Голубой невус

В нашей работе было рассмотрено 8 случаев голубого невуса, среди них 5 простых голубых невуса, которые были обнаружены у детей и 3 клеточных, которые были обнаружены у взрослых. Голубые невусы, взятые для исследования, располагались на коже туловища и конечностей.

Следует отметить, что все 5 случаев простых голубых невусов оказались РВН-негативными (62,5%), в то время как 3 случая голубого клеточного невуса - ИБН-

позитивными (37,5%) (рис.16). Следовательно, в данном случае БКИ-реакция подтверждает гистологический диагноз.

В результате Р18Н-реакции в подгруппе клеточного голубого невуса были обнаружены следующие аберрации. См.табл.8.

Нарушения в подгруппе клеточного голубого невуса (всего 90 клеток)

Нет нарушений 2,2% (2/90)

Одиночные нарушения 16,7% (15/90)

Наиболее часто встречающиеся нарушения Увеличение копийности всех генов - 8,9% (8/90) Увеличение копийности всех генов, кроме МУВ - 7,8% (7/90) Уменьшение копийности МУВ - 7,8% (7/90)

Таблица 8. Нарушения в подгруппе клеточного голубого невуса.

Для двух случаев клеточного голубого невуса было проведено ИГХ исследование для уточнения диагноза (НМВ-45+, MART-1+, S-100 protein+, Melan А+, индекс пролиферации Ki-67 составил 1 и 12% соответственно).

При этом в случае с высоким индексом пролиферации (12%) наблюдаются более высокие показатели амплификации генов, однако это статистически не достоверно. Третий случай был проконсультирован еще одним врачом и был расценен как злокачественный голубой невус (меланома) и иммуногистохимическое исследование не проводилось. Данным пациентам рекомендовано динамическое наблюдение у онколога, однако повторных обращений с момента операции зафиксировано не было.

Сложный невус

В нашей работе было рассмотрено 32 случая сложного невуса, из них 6 были получены от взрослых пациентов, а 26 - от детей. Невусы, взятые для исследования, располагались на коже туловища, паховой и ягодичной областей.

В результате проведенной FISH-реакции, ни в одном из 32 случаев генетических

нарушений, характерных для меланомы обнаружено не было. Тем не менее, для данного типа невуса была установлена общая тенденция к снижению копийности генов (Табл. 9).

Нарушения в подгруппе сложного невуса (всего 960 клеток)

Нет нарушений 34.0% (327/960)

Одиночные нарушения 21.9% (210/960)

Наиболее часто встречающиеся нарушения Уменьшение копийности ШВ и СЕРб - 7.7% (74/960) Уменьшение копийности всех кроме ССИ01 - 6,5% (62/960) Уменьшение копийности СЕР6 - 5.8% (56/960) Уменьшение копийности всех генов - 5.5% (53/960) Уменьшение копийности МУВ - 5.4% (52/960)

Таблица 9. Нарушения в подгруппе сложного невуса.

Мы проследили, существует ли связь между числом копий генов и возрастом пациента. Было установлено, что чем старше пациент, тем сильнее выражены генетические аберрации (Табл. 10).

Возраст пациента Копийность гена

0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6

CCND1

Дети 11 151 576 32 10 0 0

Взрослые 6 52 106 14 2 0 0

у2 = 4.2106, р = 0.04017

RREB1

Дети 13 141 557 55 13 1 0

Взрослые 6 52 104 14 4 0 0

Х2 = 5.6666, р = 0.01729

МУВ

Дети 38 210 486 34 11 1 0

Взрослые 11 63 98 5 3 0 0

Z2= 4.2257, р = 0.03982

Таблица 10. Зависимость копийности генов в образцах сложного невуса от возраста

пациента. Невус Шпиц

Нами было рассмотрено 5 случаев Шпиц невусов. Все образцы были получены от взрослых пациентов и располагались на коже туловища и верхних конечностей. Следует отметить, что 1 случай из 5 оказался Р18Н-положительным (20,0%) (результат ИГХ: НМВ-45+, МАЯТ-1+, Э-ЮО ркЛепН-, Ме1ап А+, индекс пролиферации Кл-67<1%) (Рис.17). В результате динамического наблюдения за пациентом в течение 10 лет после операции рецидива и/или метастазов выявлено не было.

Аберрации установленные в подгруппе Шпиц невуса приведены в табл.11.

На рушения в подгруппе Шпиц невуса (всего 150 клеток)

Нет нарушений 22.0% (33/150)

Одиночные нарушения 27.3% (41/150)

Наиболее часто встречающиеся нарушения Уменьшение копийности CCND1 - 8.0% (12/150). Уменьшение копийности MYB - 7.3% (11/150) Уменьшение копийности MYB и СЕР6 - 6.0% (9/150)

Таблица 11. Нарушения в подгруппе Шпиц невуса

Если рассматривать генетические нарушения в пределах клинических случаев, то ген МУВ нарушен в 1 образце из 5 (20,0%).

Невус Рида

В работе было изучено 7 случаев невуса Рида, из 3 были получены от детей, 4 - от взрослых пациентов. Располагались указанные невусы на коже нижних конечностей, спины, также рассматривалить множественные невусы.

Результатом ИБН-реакции является обнаружение 2 положительных случаев из 7 (28,6%). Проследить дальнейшее течение заболевания удалось лишь для второго клинического случая (результат ИГХ: НМВ-45+, МАЯТ-1+, Б-100 рго1ет+, Ме1ап А+, индекс пролиферации Кл-67<1%). У данного пациента спустя 6 лет после операции рецидива и/или метастазов не обнаружено.

Общая картина результатов Р18Н-реакции для невуса Рида представлена в таблице

12.

Нарушения в подгруппе невуса Рида (всего 210 клеток)

Нет нарушений 25.7% (54/210)

Одиночные нарушения 27.1% (57/210)

Наиболее часто встречающиеся нарушения Уменьшение копийности всех генов, кроме €€N01 -14.7% (22/210) Уменьшение копийности СЕР6-8.6% (18/210) Уменьшение копийности МУВ - 6.7% (14/210) Уменьшение копийности всех генов - 5.2% (11/210) Уменьшение копийности ССЫй! - 5.2% (11/210)

Таблица 12. Нарушения в подгруппе невуса Рида

Если рассматривать генетические нарушения в пределах клинических случаев, то ген КЛЕВ1 нарушен в 2 образцах из 7 (28,6%).

Диспластический невус

В работе было изучено 28 случаев диспластического невуса, из них 11 были получены от детей, 17 - от взрослых пациентов. Располагались указанные невусы на коже нижних конечностей и спины.

Из 28 рассмотренных нами в данной работе случаев диспластического невуса в 6 (21,4%) были обнаружены генетические нарушения, характерные для меланомы.

Клинический случай №5. В 1999 г. было обнаружено меланоцитарное новообразование, которое изначально было расценено как диспластический невус. Спустя 2 года после операции рецидив и метастазы в легкие. Гистологическое заключение рецидивирующей опухоли - меланома. Смерть в 2001 г. от основного заболевания. При Р18Н-исследовании первичной опухоли было установлены высокая амплификация гена ЯЯЕВ1 и потеря МУВ относительно СЕР6.

В клиническом случае №6 метастазы возникли в брюшной полости в 2003г., спустя 4 года после операции в 1999г. В том же году смерть от основного заболевания. При этом

также наблюдались высокая амплификация гена RREB1 и потеря MYB относительно СЕР6.

При изучении метастазов от этих двух случаев с помощью FISH были отмечены те же генетические аберрации, что и в первичном очаге. Это свойство можно использовать, когда в лимфоузле обнаруживаются доброкачественные скопления меланоцитов. На наш взгляд отсутствие генетических нарушений в такого рода скоплениях однозначно исключает метастатических характер их возникновения и в то же время подтверждает дистопическую природу появления меланоцитов в лимфоузле.

Результаты FISH-исследования группы диспластического невуса приведены в таблице 13.

Нарушения в подгруппе диспластического невуса (всего 840 клеток)

Нет нарушений 30.1% (253/840)

Одиночные нарушения 23.2% (195/840)

Наиболее часто встречающиеся нарушения Уменьшение копийности СС№1 - 6.3% (53/840) Уменьшение копийности RREB1 и МУВ - 6.3% (53/840) Увеличение копийности все генов - 5.6% (47/840) Уменьшение копийности МУВ - 5.4% (45/840)

Таблица 13. Нарушения в подгруппе диспластического невуса

Если рассматривать генетические нарушения в пределах клинических случаев, то ген RREB1 нарушен в 3 образцах из 28 (10,7%).

Для группы диспластического невуса удалось проследить связь с возрастом пациента. Увеличение копийности чаще встречается у взрослых, однако копийность гена МУВ статистически достоверно с возрастом не изменяется. Корреляция выражена сильнее, чем в случае сложного невуса (Табл.14).

Возраст пациента Копийность гена

0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16

ССИй!

Дети 9 62 247 5 7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Взрослые 23 86 303 46 27 13 5 3 2 1 1 0 0 0 0 0 0

= 18.7285, р= 1.507е-05

МЕВ1

Дети 7 66 236 19 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Взрослые 10 107 262 66 29 8 4 6 2 7 0 1 2 2 0 1 3

5^ = 28.0100, р = 1.207е-07

МУВ

Дети 8 82 233 5 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Взрослые 40 139 250 41 25 9 2 1 3 3 0 0 0 0 0 0 0

3.7663, р = 0.0523

Таблица 14. Зависимость копийности генов в образцах диспластического невуса от возраста пациента.

Для изучения зависимости между генетическими нарушениями и результатом FISH использовали деревья решений (рис. 3). Целесообразно применить данный метод только для групп с FISH+ результатами. Как видно из рисунка За для диспластического невуса наиболее характерны нарушения в области генов RREB1 и CCND1.Чем ниже копийность CCNDI, тем больше образец генетически соответствует невусу, и наоборот, копийность RREB1 определяет FISH-положительный результат, что соответствует меланоме. В группе Шпиц невуса чаще всего обнаруживаются аномалии гена MYB (р<0.001) (рис. 3 б), для невуса Рида наиболее характерны аберрации гена RREB1 (рО.ОО!) (рис. 3 в).

Рис.3 а. Дерево решений для диспластического невуса

Рис. 3 б. Дерево решений для рИс. 3 в. Дерево решений для

невуса Шпиц невуса Рида

РКН-положительный результат | |- ИКН-отрицательный результат п - число клеток у - уровень ошибки

Опухоли немеланоцитарной природы

В результате проведенной РВН-реакции во всех исследуемых случаях флуоресцентные сигналы были четко видны и легко поддавались интерпретации, морфология ткани была сохранна.

Рассмотренные нами опухоли принадлежали к мягкотканным новообразованиям и раки немеланоцитарной природы. Результаты РВН-реакции для данного вида опухолей представлены в табл. 15.

Гистологический тип опухоли Результат FISH-реакции

Базальноклеточный рак кожи FISH-отрицательный

Рак желудка in situ FISH-отрицательный

Фибросаркома челюсти FISH-отрицательный

Веретеноклеточная синовиальная саркома боковой поверхности бедра FISH-отрицательный

Светлоклеточная саркома боковой поверхности бедра FISH-отрицательный

Рак полового члена FISH-отрицательный

Инфильтрирующий протоковый рак молочной железы FISH-отрицательный

Инфильтрирующий протоковый рак молочной железы FISH-отрицательный

Рабдомиобластома предстательной железы FISH-пол ожительный

Светлоклеточная саркома лобно-теменной области FISH-пол ожительный

Табл. 15. Результаты FISH-реакции, проведенной на опухолях немеланоцитарной

природы.

В 8 из 10 (80%) случаях генетических аберраций, характерных для меланомы выявлено не было.

Следует уделить особое внимание двум случаям, в которых были обнаружены генетические нарушения.

Клинический случай № 1.

У больного У, 2008 г.р. обнаружено уплотнение внизу живота. В результате УЗИ обнаружена опухоль предстательной железы. По месту жительства произведено 6 курсов химиотерапии. Направлен в РОНЦ им. Н.Н.Блохина. Произведено хирургическое иссечение образования. Назначена дополнительная химиотерапия. Гистологическое

заключение: опухолевый узел овальной формы; ткань узла волокнистого вида, серого цвета, мягкоэластичной консистенции. Микроскопическое описание удаленной биопсии опухоли: рабдомиосаркома предстательной железы. При НЭП-реакции было отмечено нарушение копийности гена ССММ. Поскольку исследование копийности генов проводилось после 6 курсов химиотерапии, то нельзя исключить неспецифического влияния лекарственных препаратов на геном опухолевых клеток.

Проследить дальнейшее течение заболевания не удалось по причине смены места жительства больного.

Клинический случай № 2.

Больная X, 1983 г.р. отметила уплотнение в области темени. В онколошческом диспансере по месту жительства новообразование расценено как менингиома. В результате неэффективного химиотерапевтического лечения больная обратилась в РОНЦ им. Н.Н.Блохина. Микроскопическое описание: среди фиброзной ткани разрастание злокачественной опухоли, представленной полигональными, местами вытянутыми светлыми клетками с эозинофильной цитоплазмой, формирующими гнездные скопления, разделенные соединительнотканными септами. Для уточнения гистогенеза опухоли проведено ИГХ исследование с использованием антител к виментину, Б-100 протеину, панцитокератину, ЕМА, гладкомышечному актину, десмину, СО 34, СО 31, СО 68, МПТ, тирозиназе, миогенину, НМВ-45, мелану А, ОРАР, синаптофизину, хромогранину А. Опухолевые клетки диффузно экспрессируют виментин, Б-100 протеин, фокально ОБ АР, экспрессии остальных маркеров нет. Морфологическое строение и иммуногистохимические характеристики опухоли соответствуют светлоклеточной саркоме мягких тканей II степени злокачественности. При Р18Н-реакции была отмечена делеция гена МУВ относительно СЕРб.

О сроках наблюдения говорить рано, т.к. пациентка обратилась в РОНЦ РАМН несколько месяцев назад.

Выводы

1. Ген КЯЕВ1 в наибольшей степени подвержен аберрациям при меланоме (в 65,0% случаев), невусе Рида (28,6%) и диспластическом невусе (10,7%). Копийность гена ККЕВ! влияния на выживаемость пациента не оказывает.

2. Поломки в области гена €€N01 наиболее характерны для диспластического невуса (в 9,7% случаев). Длительная выживаемость пациента связана с увеличением числа копий ССМ); (р<0,001).

3. При доброкачественных меланоцитарных новообразованиях чаще всего наблюдается нарушение копийности гена МУВ (71,7% поражения гена), однако этот параметр находится ниже уровня значений, установленных для меланомы. В наибольшей степени ген МУВ подвержен нарушениям при невусе Шпица (20,0%). В результате ретроспективного анализа группы меланом установлено, что длительная выживаемость пациента связана с увеличением числа копий МУВ (р<0,001).

4. В группе доброкачественных меланоцитарных образований, значимых изменений, характерных для меланомы не обнаружено. Среднее количество гена ССЛФУ на ядро < 2,5; среднее количество гена МУВ на ядро < 2,5; процент ядер с «ненормальным» количеством гена ИЯЕВ! < 63,0%; процент ядер с потерей гена МУВ относительно СЕР6 < 31,0%. Установленные количественные нарушения в геноме ниже пороговых величин.

5. В клетках простого голубого невуса установленные поломки генов ЯЯЕВ1, ССМ01 и МУВ ниже пороговых величин. В подгруппе клеточного голубого невуса, который иногда клинически протекает агрессивно, обнаружены генетические аберрации, характерные для меланомы.

6. В группе меланоцитарных поражений, неясных в диагностическом плане установлены генетические аберрации наиболее характерные для того или иного вида новообразования. Поломки в области генов ЯЯЕВ! и ССМ)У наиболее характерны для диспластического невуса, с невусом Шпиц чаще всего ассоциировано нарушение в области гена МУВ, с невусом Рида - нарушение в области гена ЯЯЕВ1.

7. Среди злокачественных меланоцитарных поражений кожи суммарное нарушение копийности генов НИЕВ1, ССЫП! и МУВ встречается в 92,5% случаев.

8. В опухолях немеланоцитарной природы в 80,0% случаев установленные количественные нарушения в геноме ниже пороговых величин. Среднее количество гена С СN01 на ядро < 2,5; среднее количество гена МУВ на ядро < 2,5; процент ядер с

«ненормальным» количеством гена RREB1 < 63,0%; процент ядер с потерей гена MYB относительно СЕР6 < 31,0%. Следовательно, оценку копийности генов RREB1, CCND1 и MYB с помощью реакции флуоресцентной in situ гибридизации можно использовать в качестве первичной дифференциальной диагностики между опухолями меланоцитарной и немеланоцитарной природы.

1. При неясных в диагностическом плане случаях в целях дифференциальной диагностики проведение FISH-реакции с флуоресцентной пробой LSI RREB1/ LSI MYB/ LSI CCND1/ CEP6 Abbott-Vysis может помочь для установления правильного гистогенеза и степени злокачественности пигментных новообразований.

2. С помощью FISH-метода можно проводить дифференциальную диагностику между теми опухолевыми процессами, которые при традиционных методах исследования с трудом можно отличить от новообразований меланоцитарной природы.

3. Изучение копийности генов RREB1, MYB, CCND1 можно рекомендовать для выявления ранних стадий малигнизации в образованиях, доброкачественность которых клинически не вызывала сомнений.

1. Сендерович, А.И. Молекулярно-генетические нарушения меланоцитарных поражений человека / А.И. Сендерович, A.M. Строганова, А.И. Карселадзе // Вестник РОНЦим. Н.Н.БлохинаРАМН.- 2010,- Т. 21, №2.-С. 19-28.

2. Молекулярно-генетическое исследование доброкачественных пигметных новообразований с помощью реакции флуоресцентной in situ гибридизации / А.И. Сендерович [и др.] // Архив патологии. - 2010. - Т.12, № 4. - С. 27-30.

3. Использование FISH-реакции для диагностики меланоцитарных новообразований / А.И. Сендерович [и др.] // Вестник РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. - 2010. - Т. 21, № 3. -С. 54-60.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

Подписано в печать 01.11.10 Формат 60x84/16. Бумага офисная «ЗуеЬСору». Тираж 100 экз. Заказ № 858 Отпечатано на УМТ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

Меланома кожи (МК) - одно из наиболее злокачественных новообразований человека. В современных эпидемиологических исследованиях четко выявлен стремительный рост заболеваемости МК; за 2002 год темп прироста заболеваемости увеличился с 3 до 7% [108]. Это самый« быстрый темп прироста, который был отмечен среди основных форм рака. Данная ситуация наблюдается в разных странах, в том числе в России, что позволяет рассматривать этот факт, как общую тенденцию в мире. В 2002г. приблизительно у 79 000 мужчин и 81 000 женщин по всему миру была констатирована меланома, из них 80% составляет население с белой кожей, проживающее в Северной Америке, Австралии, Новой Зеландии и Европе (преимущественно в северно-западной ее части). По данным мировой статистики, меланома по частоте заболеваемости занимает 16-е место среди мужчин и 15-е среди женщин и наиболее часто диагностируется в Австралии и Новой Зеландии (4-е место среди мужчин, 3-е - среди женщин), в Северной Америке (б-е место среди мужчин, 5-е - среди женщин) и Европе (16-е место среди мужчин, 8-е — среди женщин). В 2002 г. по всему миру от меланомы умерли около 22 000 мужчин и 19 000 женщин [108].

Одним из основных пусковых механизмов, лежащих в основе роста заболеваемости меланомой, считается произошедшее за последнее время по различным причинам увеличение суммарного времени воздействия ультрафиолетовой части спектра естественного солнечного света на кожу человека, не всегда подготовленную к этому генетически. Среди других факторов риска меланомы в настоящее время выделяют: фототип кожи I-II (склонность к солнечным ожогам кожи, рыжие волосы, голубые глаза, светлая кожа), общее число доброкачественных меланоцитарных невусов на коже индивидуума, присутствие лентиго и веснушек, наличие 3 атипичных меланоцитарных невусов и более, 3 эпизода тяжелых солнечных ожогов кожи в течение жизни и более, а также семейное накопление случаев меланомы у близких родственников [108].

Новые познания, в биологии опухоли приводят к разработке новых подходов к лечению меланомы: В настоящее время, проводятся крупные исследования по оценке возможностей генной* терапии, вакцинотерапии, антиангиогенной терапии, моноклональных антител. Это, в свою очередь, требует внедрения в повседневную практику современных методов* диагностики, меланомы кожи.

Один из них - метод флуоресцентной« in situ гибридизации (FISH), который в настоящее время является оптимальным методом визуализации нарушений генома. В основе FISH-метода лежит реакция гибридизации между искусственно созданным ДНК-зондом и комплементарной ему нуклеотидной последовательностью ядерной.ДНК.

Для»диагностики »меланоцитарных поражений кожи недавно предложено использовать новый' ДНК-зонд LSI RREB1/ LSI MYB/ LSI CCND1/ CEP6 (Abbott Molecular Inc, США), который с наибольшей чувствительностью- и специфичностью подчеркивает различия между доброкачественным, и злокачественным новообразованием. Гены, которые окрашены.флуорофором-в данномзонде играют важную роль в развитии меланомы.

Первый из них — RREB1 (Ras Responsive Element Binding Protein» 1) — расположен на коротком плече хромосомы 6. Белок RREB1 является транскрипционным фактором, который вовлечен' в RAS/RAF-опосредованную дифференцировку клеток.

Второй - это клеточный онкоген c-myb, расположенный на длинном плече хромосомы 6, является гомологом птичьего вирусного онкогена, вызывающего миелоидную лейкемию. Этот ген кодирует ядерный белок, вовлеченный в регуляцию транскрипции, и играет важную ролы в. пролиферации клеток.

И ген ССЫО!, расположенный на 11 хромосоме, кодирует циклин Э1, который в комплексе с циклинзависимыми киназами 4,6 (Сйк 4,6), регулирует переход из фазы 01 клеточного цикла в фазу 8.

Кроме генов при изготовлении флуоресцентного зонда флуорофором был окрашен альфа-сателлит ДНК, локализованный на центромере хромосомы, СЕР б (6р 11.1-я 11.1).

Для диагностики меланоцитарных поражений кожи Р18Н-метод используется впервые. С помощью него можно установить генетические повреждения, характерные для того или иного вида меланоцитарного новообразования. Это имеет большое значение, особенно при меланоцитарных поражениях, неясных в диагностическом плане и при проведении дифференциальной диагностики между меланомой и опухолями немеланоцитарной природы. Отработанная методика с успехом может применяться в качестве дополнения к основным подходам.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Разработка уточняющего метода для первичной и дифференциальной диагностики меланоцитарных поражений кожи на молекулярно-генетическом уровне с помощью реакции флуоресцентной in situ гибридизации (FISH).

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для реализации поставленной цели были поставлены следующие задачи:

1. Дать качественную и количественную характеристику изменений в области генов RREB1 (6р25), MYB (6 q23), CCND1 ( llql3) с помощью реакции- флуоресцентной in situ гибридизации при доброкачественных меланоцитарных поражениях и меланоме кожи.

2. Оценить частоту и спектр генетических нарушений для тех случаев, которые изначально вызывали диагностические трудности у патоморфолога или классифицировались как диспластический невус, невус Шпиц, Рида, голубой невус.

3. Провести исследование изменений генов RREB1 (бр25), MYB (6q23), CCND1 (1 lql3) в опухолях кожи и мягких тканей немеланоцитарной природы для выявления возможности использовать особенности состояния этих генов для дифференциальной диагностики.

4. Сопоставить полученные данные в указанных группах с клиническим течением процесса и сформулировать возможные прогностические критерии.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Работ по систематическому изучению меланоцитарных поражений кожи с помощью БШН-реакции на большом репрезентативном материале в литературе нет.

Показано, что при доброкачественных меланоцитарных поражениях кожи копийность генов ЛЯЕВ1, ССАЮ7 и МУВ меняется как в сторону увеличения, так и в сторону уменьшения. Однако диапазон этих изменений достаточно узок и никогда не достигает тех величин, которые характерны для злокачественных меланоцитарных опухолей кожи. Выявлена зависимость копийности генов от типа невуса. Во внутридермальном невусе генетических поломок наблюдается больше, чем в невусе с преимущественно эпидермальным компонентом. Кроме того, наблюдается прямая зависимость числа копий генов от глубины и уровня расположения невоидных клеток. По мере продвижения в дерму частота нарушений возрастает.

Систематизирован комплекс показателей, характерный для меланомы. Образец соответствует меланоме, если: среднее количество , копий гена ССЖ)7 на ядро >2,5; процент ядер с «ненормальным» количеством копий гена ЯЯЕВ1 (т.е. ядра с сигналами ЯЯЕВ1 более или менее 2) >63,0%; процент ядер с потерей копий гена МУВ относительно СЕРб >31,0%; среднее количество копий гена МУВ на ядро >2,5. Установлено, что генетические нарушения присутствуют как на ранней стадии формирования опухоли (фаза радиального роста), так и на более поздней (фаза вертикального роста). При этом степень выраженности этих нарушений не зависит от фазы развития опухоли. Помимо этого отмечено существование меланом с преобладающим типом нарушений: с ампли фикацией исследуемых генов, или с делецией. Также было установлено, что в наибольшей степени (в 65,0%) подвержен аберрациям ген 1№ЕВ1.

Показана определенная специфичность генетических аберраций для того или иного вида меланоцитарного поражения. Установлено, что нарушения в области гена ЯЯЕВ1 чаще всего встречаются при меланоме

65,0%), невусе Рида (28,6%) и диспластическом невусе (10,7%). Аберрации гена ССУШ7 с наибольшей частотой выявляются при диспластическом невусе (9,7%), изменение числа копий гена МУВ - при невусе Шпиц (20,0%).

Впервые изучен характер аберраций генов ЯЯЕВ1, ССИ01 и МУВ при опухолях немеланоцитарной природы. Показано, что данный тип нарушений не характерен для опухолей немеланоцитарной природы.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Разработана и внедрена методика, которая послужит для улучшения и уточнения диагноза. Данный метод позволит диагностировать меланому на ранних стадиях, что поможет дополнить прогностические критерии особенностями нарушения генов ККЕВ1, ССЖ)/ и МУВ. Также перспективным является использование указанных аберраций при дифференциальной диагностике между меланомой и опухолями немеланоцитарной природы.

выводы

1. Ген ЯЛЕВ! в наибольшей степени подвержен аберрациям при меланоме (в 65,0% случаев), невусе Рида (28,6%) и диспластическом невусе (10,7%). Копийность гена ЯЯЕВ1 влияния на' выживаемость пациента* не оказывает.

2. Поломки в области гена ССЫВ1 наиболее характерны для диспластического невуса (в 9,7% случаев). Длительная выживаемость пациента связана с увеличением числа копий ССИй1 (р<0,001).

3. При доброкачественных меланоцитарных новообразованиях чаще всего наблюдается нарушение копийности гена МУВ (71,7% поражения гена), однако этот параметр находится-ниже уровня значений, установленных для меланомы. В наибольшей степени ген МУВ подвержен, нарушениям при невусе Шпица (20,0%). В« результате ретроспективного анализа группы меланом установлено, что длительная выживаемость пациента связана^ с увеличением числа копий МУВ (р<0,001).

4. В группе доброкачественных меланоцитарных образований, значимых изменений, характерных для меланомы не обнаружено: Среднее количество гена ССИ01 на ядро < 2,5; среднее количество гена МУВ на ядро < 2,5; процент ядер с «ненормальным» количеством* гена ВЯЕВ1 < 63,0%; процент ядер с потерей гена МУВ относительно СЕРб < 31,0%. Установленные количественные нарушения? в геноме ниже пороговых величин.

5. В клетках простого голубого невуса установленные поломки генов ЯЯЕВ1, ССЖ>7 и МУВ ниже пороговых величин. В подгруппе клеточного голубого невуса, который иногда клинически протекает агрессивно, обнаружены генетические аберрации, характерные для меланомы.

6. В группе меланоцитарных поражений, неясных в диагностическом плане установлены генетические аберрации наиболее характерные для того или иного вида новообразования. Поломки в области генов RREB1 и CCND1 наиболее характерны для диспластического невуса, с невусом Шпиц чаще всего ассоциировано нарушение в области гена MYB, с невусом Рида - нарушение в области гена RREB1.

7. Среди злокачественных меланоцитарных поражений кожи суммарное нарушение копийности генов RREB1, CCND1 и MYB встречается в 92,5% случаев.

8. В опухолях немеланоцитарной природы в 80,0% случаев установленные количественные нарушения в геноме ниже пороговых величин. Среднее количество гена CCND1 на ядро < 2,5; среднее количество гена MYB на ядро < 2,5; процент ядер с «ненормальным» количеством гена RREB1 < 63,0%; процент ядер с потерей гена MYB относительно СЕР6 < 31,0%. Следовательно, оценку копийности генов RREB1, CCND1 и MYB с помощью реакции флуоресцентной in situ гибридизации можно использовать в качестве первичной дифференциальной диагностики между опухолями меланоцитарной и немеланоцитарной природы.