Автореферат и диссертация по медицине (14.03.10) на тему:МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ В ДИАГНОСТИКЕ, ПАТОГЕНЕЗЕ И ПРОГНОЗЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

На правах рукописи

004ЫЫОН

КАЗАКОВ Сергей Петрович

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ В ДИАГНОСТИКЕ, ПАТОГЕНЕЗЕ И ПРОГНОЗЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

14.03.10 - клиническая лабораторная диагностика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

" 2 ЛЕК 2010

Москва - 2010

004616104

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава»

Научные консультанты:

член-корреспондент РАМН, профессор КУШЛИНСКИЙ

Николай Евгеньевич

доктор биологических наук

ЗАБОТИНА Татьяна Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

тотолян

Арег Артёмович

РЕЗНИКОВ Юрий Петрович

ПОДВЯЗНИКОВ Сергей Олегович

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова».

Защита диссертации состоится « / Ь » декабря 2010 г. в 10.00 на заседании диссертационного совета Д 208.071.04 при Государственном образовательном учреждении дополнительного профессионального образования «Российская медицинская академия последипломного образования Росздрава» (123995, г. Москва, ул. Баррикадная, д. 2/1).

С диссертацией можно ознакомиться в медицинской библиотеке ГОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования Росздрава» (125445, г. Москва, ул. Беломорская, д. 19).

Автореферат разослан « 4 Ь » о!1 р 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

Морозова В.Т.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Несмотря на относительно скромное место (1-3%) в структуре злокачественных опухолей, проблема рака щитовидной железы (РЩЖ) в последние десятилетия серьезно волнует ученых и врачей из различных областей медицины [Валдина Е. А., 2005; Дедов И.И. и др., 2000; Знаменский А.А. и др., 2006]. Это во многом связано с крайне быстрым ростом заболевания среди лиц молодого и среднего возраста [Жуков С.А. и др., 2003 ; Davies L., Welch H., 2006]. По данным большинства исследователей, рост заболеваемости наблюдается в индустриально развитых странах и связан в первую очередь с увеличением радиационного воздействия [Берштейн Л.М., 2007; Валдина Е.А., 2001 ; Дедов И.И. и др., 2000; Williams D., 1996]. Сравнительно небольшие размеры органа и пошаговая прогрессия от гиперплазии до опухолевого узла, дифференциации и развития анапластической карциномы делают изучение опухолевого канцерогенеза и оценки иммунопатогенеза в этом достаточно обособленном органе удобным и оптимальным [Rzeszutko M. et al., 2007].

Основную надзорную функцию за опухолевой прогрессией несет в организме иммунная система, крайне важной задачей которой является сохранение неизменным антигенный гомеостаз жидкостей и тканей организма [Грачева Л.А., 1996; Скуинь J1.M., Кашкин К.П., 2001 ; Mazzoccoli G. et al., 2003]. Имеющиеся данные о патогенезе противоопухолевого иммунитета малочисленны и подчас противоречивы [КадагидзеЗ.Г. и др., 2000; ТелетаеваГ.М., 2007]. В защите от опухолевых клеток главным образом участвуют клеточные факторы иммунитета (естественные киллерные клетки, натуральные киллерные Т-клетки (TNK), цитотоксические Т-лимфоциты, макрофаги и моноциты, эозинофилы), оказывающие презентирую-щее, цитостатическое и цитолитическое действие [Князькин И.В., Цыган В.Н., 2007; Скуинь JI.M., Кашкин К.П., 2001]. Роль и функциональные особенности поведения этих иммунокомпетентных клеток при опухолях и аутоиммунных заболеваниях щитовидной железы (АИЗЩЖ) изучены крайне мало, а сведения о патогенетических механизмах взаимодействия между собой очень противоречивы [Mardente S. et al., 2005; Zeppa P. et al., 2009]. Регуляция в организме характера и напряженности антигенспецифических иммунных реакций осуществляется при непосредственном участии цитокинов, с использованием механизмов ауто- и пара-крийной регуляции [Кашкин К.П., 1998; Фрейдлин И.С., 2001]. Наряду с регуляцией иммунного ответа цитокины участвуют не только как позитивные регуляторы

клеточной пролиферации, они также могут контролировать аномальный клеточный рост, индуцируя дифференцировку и подавляя процессы опухолевой трансформации клеток [Антонов В.Г., Козлов В.К., 2004; Кашкин К.П., 1998; Mitsiades N. et al., 2001,2003]. Поэтому исследование динамики цитокинов представляется достаточно актуальной задачей.

Известно, что инвазия и злокачественный рост опухоли обусловлены не только высоким уровнем пролиферации клеток, но и недостаточной активностью апоптоза или сочетанием этих двух факторов [Антонов В.Г., Козлов В.К., 2004; Кушлинский Н.Е. и др., 2002]. Это является следствием нарушения экспрессии в клетках одного или нескольких нормальных генов пролиферации и дифференци-ровки так называемых протоонкогенов [Кашкин К.П., 2006; Пальцев М.А., 2004; Цыган В.Н., 2004]. Наиболее известные из них - это ген, запускающий апоптоти-ческую гибель генетически измененных клеток на определенной фазе клеточного цикла, - ген р53, и семейство генов, регулирующих активность апоптоза, - онкогены семейства bcl-2 - bcl-2, ВАХ, Bag 3, bcl-xl, Bad и др. [Дедов И.И., 2000; Князькин И.В., Цыган В.Н., 2007; Копнин Б.К., 2003; Chiappetta G. et al., 2007]. Мутации в гене р53 и его регуляторах являются достаточно широко распространенными и встречаются у онкологических больных с опухолями щитовидной железы в 3-67% случаев [Белохвостое А.С., 2003; Марченко И.А., 2009; Трошина Е.А., 1996]. Недостаточно исследованы мутации этого генау больных со злокачественными, доброкачественными и аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы. Неясна степень распространения этих мутаций в пораженных патологическим процессом тканях щитовидной железы и неизменной ткани в других долях железы [Марченко И.А., 2009]. Исследования взаимоотношений между различными параметрами апоптоза и пролиферации в щитовидной железе малочисленны и подчас носят неопределенный характер [Лукьянова Н.Ю. и др., 2000; Марченко И.А., 2009; Орлинская Н.Ю., 2009; Соколова О.В., 2009]. Оценка апоптотического индекса, различных параметров апоптоза и их взаимоотношений между собой (белка р53 и его мутаций, bcl-2, FAS-системы) и с показателями пролиферации (Ki-67) при переходе от доброкачественного процесса к злокачественному и роль в этом процессе аутоиммунных заболеваний (расстройств) являются важной проблемой, требующей своего решения [Зугаирова О.Н., 2010; Кушлинский Н.Е., Трапезников Н.Н., 2000; Соколова О.В., 2009; Bossowski A. et al., 2006, 2007; Rzeszutko М., 2007].

Большое значение имеет степень васкуляризации опухолей и кровоснабжения при онкологических процессах. Одним из основных механизмов инвазии злокачественных опухолей является нарушение окружающей базальной мембраны и внеклеточного матрикса, ассоциированными с опухолями протеазами [Трапезникова М.Ф. и др., 2002; Lan L. et al., 2009]. Решающую роль в процессе инвазии и метастазирования среди четырех основных классов протеаз играют сериновые протеазы. Их роль в регуляции межклеточного протеолиза в различных физиологических и патологических процессах: деструкции ткани и миграции клеток, воспалительные реакции, инвазивный рост трофобласта и опухолевых клеток - изучена недостаточно. Большую роль в этом процессе отводят активаторам и ингибиторам плазминогена урокиназного и тканевого типа [Кушлинский Н.Е., Трапезников Н.Н., 2000; Dass К. et al., 2008]. Их связь между собой может оказаться полезной для понимания процессов повышенной реваскуляризации при онкологических и неонкологических процессах в тканях щитовидной железы.

Несмотря на однозначный характер зависимостей апоптоза и пролиферации, необходимо выяснение взаимосвязи между ними для поиска дополнительных диагностических и прогностических критериев, обсуждения вопросов эффективности проводимой терапии. В целом, мутации в генах, в частности в гене р53, которые прямо или косвенно приводят к снижению апоптоза, в основном связаны с плохим прогнозом в отношении целого спектра опухолей [Дедов И.И. и др., 2000].

Таким образом, исследование механизмов функционирования иммунной системы, роли факторов апоптоза и пролиферации, онкогенов и антионкогенов их мутации, а также оценка роли сериновых протеаз в васкуляризации новообразований при опухолевых и аутоиммунных процессах в щитовидной железе являются крайне актуальными проблемами.

Цель работы: комплексное изучение основных иммунологических показателей, цитокинов и молекул межклеточной адгезии, молекулярно-биологических и генетических маркеров, регулирующих апоптоз и пролиферацию, а также некоторых компонентов системы фибринолиза в патогенезе, улучшении диагностики и прогнозе заболеваний щитовидной железы.

Задачи исследования:

1. Провести комплексную оценку состояния некоторых параметров иммунной системы у больных со злокачественными, доброкачественными и аутоиммун-

ными заболеваниями щитовидной железы и исследовать характерные особенности вариантов иммунных нарушений, встречающихся в каждой патологии.

2. Провести исследование цитокинов, хемокина, молекул межклеточной адгезии у больных с аутоиммунными, доброкачественными и злокачественными заболеваниями щитовидной железы.

3. Изучить экспрессию БАБ-Ь на хелперных и эффекторных иммунокомпе-тентных клетках крови у больных со злокачественными новообразованиями щитовидной железы.

4. Оценить молекулярно-биологические (основные, сочетанные) маркеры, регулирующие апоптоз и пролиферацию, в тканях щитовидной железы при аутоиммунных, доброкачественных и злокачественных заболеваниях щитовидной железы.

5. Исследовать возможные механизмы повреждений процессов апоптоза и пролиферативную активность у больных с основными формами ненаследственных (папиллярных и фолликулярных) раков щитовидной железы.

6. Определить фенотипические особенности доброкачественных новообразований щитовидной железы и охарактеризовать возможный прогноз развития аденом по данным маркеров апоптоза и пролиферации.

7. Оценить развитие процесса опухолевой трансформации, используя основные и сочетанные показатели клеток с белками, регулирующими апоптоз и пролиферацию, в морфологически не измененных тканях при раках и аденомах щитовидной железы (АЩЖ).

8. Количественно определить, сопоставить и оценить взаимосвязь основных компонентов активаторов плазминогенаурокиназного (иРА) и тканевого ^РА) типа, а также их ингибитора (РА1-1) в цитозолях тканей злокачественных и доброкачественных опухолей щитовидной железы с учетом основных клинических и морфологических характеристик заболевания.

9. Оценить значение и рассчитать частоту встречаемости мутаций гена р53 при доброкачественных и злокачественных новообразованиях и аутоиммунных заболеваниях щитовидной железы, проанализировать частоту мутаций в тканях щитовидной железы, не пораженных опухолевым процессом.

Научная новизна

Полученные комплексные данные об иммунной системе организма у больных с аутоиммунными, доброкачественными и злокачественными заболеваниями

щитовидной железы позволили раскрыть основные патогенетические механизмы и особенности иммунного ответа, сопровождающие изучаемые патологические процессы.

В работе представлены сравнительные данные одновременного исследования цитокинов, хемокина и молекул межклеточной адгезии, разработаны наиболее оптимальные соотношения (индексы) цитокинов.

Установлено, что в патогенезе заболеваний щитовидной железы некоторые цитокины играли ключевую роль и не могли быть использованы для диагностики в других исследуемых группах. При раке щитовидной железы определяющее значение играла растворимая форма молекулы адгезии эЕ-Бексйп, в патогенезе аденомы щитовидной железы—растворимая форма молекул межклеточной адгезии 1-го типа з1САМ-1, а в патогенезе аутоиммунных заболеваний — ИЛ-4.

Получены новые данные о количественном содержании на мембранах им-мунокомпетентных клеток рецепторов инициации апоптоза ЮТ-семейства (ИАБ-Ь) в хелперных и эффекторных субпопуляциях лимфоцитов периферической крови у практически здоровых пациентов и больных папиллярным раком щитовидной железы.

В работе комплексно определена взаимосвязь меяеду основными маркерами апоптоза и пролиферации (СБ95, СБ95Ь, р53 (рЗЗ'1™ р53ь"вМ), Ьс1-2 (Ьс1-2а11П, Ьс1-2ЬпеЫ), Ю-67) в патологически измененных тканях щитовидной железы у больных с аутоиммунными заболеваниями, доброкачественными и злокачественными новообразованиями.

Описаны и использованы в дифференциальной диагностике и патогенезе новые сочетанные (комбинированные) фенотипы клеток с маркерами апоптоза и пролиферации (р53/К-67, р53/СБ95, Ьс1-2/Ю-67, Ьс1-2/СБ95, СБ95/Кл-67, р53/С095Ь, СБ95/СВ95Ь, Ьс1-2/СВ95Ь), исследованы плотности экспрессии рецепторов/белков на поверхности и внутри изучаемых групп клеток.

Представлены новые данные по фенотипическим особенностям основных (СБ95Ь) и сочетанных (Ьс1-2/СБ95Ь) параметров клеток с использованием маркеров пролиферации и апоптоза у больных с разными вариантами (папиллярный и фолликулярный) рака щитовидной железы.

Впервые описаны разные варианты аденом щитовидной железы, отличающиеся по фенотипическим характеристикам основных (СБ95Ь, р53, р53с1'ш, р53Ьп8Ь',

Ю-67, Ьс1-2, Ьс1-2Лш, Ьс1-2Ь"®Н) и сочетанных (р53/Кл-67 и Ьс1-2/СБ95Ь) параметров клеток с маркерами, участвующими в процессах апоптоза и пролиферации.

Представлены данные о сравнительной характеристике «нормальной», морфологически не измененной и патологической ткани щитовидной железы, подверженной доброкачественному (С095+, рбЗ^, Ьс1-2/СБ95Ь) и злокачественному (СВ95/Кл-67) опухолевому процессу, у больных с аденомами и раками в этом органе.

Получены новые патогенетические данные по сравнительному исследованию маркеров реваскуляризации при доброкачественном и злокачественном процессе на основе анализа активаторов тканевого и урокиназного типа и его ингибитора у больных с аденомами и раками щитовидной железы.

Практическая значимость

Комплексный подход к оценке состояния некоторых компонентов иммунной системы у больных с аутоиммунными, доброкачественными и злокачественными новообразованиями позволил составить целостное представление о механизмах нарушения в иммунной системе и способствовал разработке оптимальных диагностических критериев у данных групп пациентов.

Разработаны наиболее оптимальные соотношения (индексы) цитокинов, которые можно использовать для дифференциальной диагностики аутоиммунных, доброкачественных и злокачественных заболеваний щитовидной железы.

Осуществлен расчет пороговых значений и диагностических показателей чувствительности, специфичности и точности методов диагностики с использованием цитокинов, хемокина и молекул межклеточной адгезии для улучшения дифференциальной диагностики практически здоровых пациентов, больных с аутоиммунными заболеваниями, аденомами и раками щитовидной железы. Установлено, что в дифференциальной диагностике целесообразнее использовать следующие показатели: между злокачественными и аутоиммунными заболеваниями -вЕ-БексЛт, между доброкачественными и аутоиммунными заболеваниями -ИЛ-6 и 81САМ-1, между раком и аденомой щитовидной железы - индекс ИЛ-6/у-ИНФ. Разработана логистическая регрессивная модель дифференциальной диагностики рака щитовидной железы у больных с новообразованиями щитовидной железы на основе оценки показателей ИЛ-6, вЕ-Бексйп и индекса ИЛ-6/у-ИНФ. Полученные данные рекомендуются к использованию в дополнительном исследовании для выявления рака щитовидной железы на этапе обследования больного.

В работе доказано, что определение показателей (количество клеток, плотность экспрессии рецепторов/белков) основных и сочетанных маркеров апоптоза и пролиферативной способности тиреоцитов может служить дополнительным диагностическим и прогностическим тестом к другим основным инструментальным, лабораторным и морфологическим методам исследования для улучшения диагностики исследуемых заболеваний щитовидной железы. Рекомендованы к использованию общие и сочетанные показатели маркеров апоптоза и пролиферации с расчетом пороговых значений величин и показателей диагностической эффективности для использования в дифференциальной диагностики аутоиммунных, доброкачественных, злокачественных заболеваний щитовидной железы (СБ95, СБ95Ь, р53 (р53,Шп, р53ь"в11'), Ьс1-2 (Ьс1-2с|'т, Ьс1-2Ьп8111), Кд-67 и р53/Кл-67, р53/СБ95, Ьс1-2/Кл-67, Ьс1-2/СБ95, СБ95/К1-67, р53/СБ95Ь, С095/СБ95Ь, Ьс1-2/СБ95Ь); папиллярного и фолликулярного рака щитовидной железы (С095Ь и Ьс1-2/СБ95Ь); аденом разных типов (СБ95Ь, р53, р53ё1т, р53ЫцМ, Кл-67, Ьс1-2, Ьс1-2Шт, Ьс1-2Ьп^' и р53/Кл-67, Ьс1-2/СБ95Ь).

Отсутствие значимых различий в молекулярно-биологических показателях «нормальных», морфологически не измененных тканей щитовидной железы у больных раком позволяет рекомендовать врачам-хирургам (онкологам) ставить вопрос о целесообразности полного удаления железы и отказываться от таких ор-ганосохраняющих хирургических методов лечения, как секторальные резекции, гемиэктомии. Использование общих (СБ95Ь) и сочетанных (Ьс1-2/СВ95Ь) показателей апоптоза и пролиферации помогает на основании фенотипических особенностей разных вариантов рака щитовидной железы провести дополнительную диагностику и, возможно, в будущем использовать эти данные для мониторирования динамики воздействия новых лекарственных средств и таргетной медикаментозной терапии, в механизмах которых лежит инициализация апоптоза в опухолевых клетках. Установлено, что применение общих (СБ95Ь, р53, р53а1т, р53Ьпв'", К-67, Ьс1-2, Ьс1-2*т, Ьс1-2Ьп8М) и сочетанных (р53/Ю-67 и Ьс1-2/СБ95Ь) параметров апоптоза и пролиферации в диагностике аденом щитовидной железы позволяет выявить тип аденом, который фенотипически отличается от основного типа доброкачественных новообразований, а также, возможно, имеет более неблагоприятный прогноз.

Получены новые данные о том, что в дополнительной дифференциальной диагностике злокачественных и доброкачественных новообразований щитовидной железы могут быть рекомендованы к использованию значения показателей активаторов урокиназного и тканевого типа и их ингибитора.

Своевременное выявление молекулярно-генетических дефектов - мутаций гена р53 у больных с ненаследственными формами злокачественных и доброкачественных новообразований - позволяет на доклинической стадии диагностировать развитие новообразования, своевременно начать терапию и тем самым улучшить прогноз развития заболевания.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

В практике работы онкологов при дифференциальной диагностике наиболее часто приходится отличать злокачественные новообразования от доброкачественных и аутоиммунных заболеваний щитовидной железы. С помощью клинико-инструментальных методов исследований не всегда можно получить исчерпывающие данные для дифференциальной диагностики, тогда как использование для целей диагностики ключевых параметров иммунной системы помогает получить дополнительную информацию о патологическом процессе.

В дифференциальной диагностике между практически здоровыми пациентами и пациентами с аутоиммунными, доброкачественными и злокачественными заболеваниями в качестве дополнительных критериев диагностики должны использоваться современные методы оценки цитокинов, атакже разработанные индексы (соотношения) цитокинов.

Использование логистической регрессивной модели, основанной на совместном расчете показателей ИЛ-6, вЕ-Бексйп в плазме крови и индекса ИЛ-6/у-ИНФ, позволяет с наиболее высокой эффективностью диагностировать рак у больных с новообразованиями щитовидной железы.

У изучаемых нами патологий отмечаются характерные фенотипические изменения в общих и сочетанных (комбинированных) показателях количества клеток и экспрессии на/в них молекулярно-биологических маркеров, участвующих в регуляции апоптоза и пролиферации, которые могут использоваться в дополнительной диагностике этих нозологий.

Исследования фенотипа клеток, основанного на определении мембранных рецепторов и внутриклеточных белков, участвующих в регуляции апоптоза и пролиферации, у больных папиллярным и фолликулярным РЩЖ позволили выявить особенности течения патологического процесса при бласт-трансформации в зависимости от варианта РЩЖ.

Наличие большого количества клеток с маркерами CD95L у больных с аденомами щитовидной железы позволяет выделить тип аденом, который отличается более напряженными изменениями в показателях количества клеток, содержащих рецепторы и белки, регулирующие апоптоз и пролиферацию, их экспрессии, и соответственно, более худшим прогнозом в развитии и озлокачествлении.

Сравнительная характеристика морфологически не измененных тканей и тканей с опухолевым процессом у больных с аденомами и раками щитовидной железы выявила незначительные различия по основным и сочетанным показателям апоптоза и пролиферации, наиболее фенотипически схожие данные были получены в тканях больных раком щитовидной железы.

Личный вклад автора

Автором проведены все исследования по иммунофенотипированию клеток периферической крови и тканей, исследованию сывороточных цитокинов, основные этапы по молекулярно-биологическим исследованиям мутаций гена р53 в клетках тканей ЩЖ. Автор самостоятельно осуществил всю необходимую статистическую обработку полученных данных, интерпретировал полученные результаты.

Реализация результатов исследования

Результаты исследования внедрены в лечебную практику и используются в эндокринологических, хирургических, радиохирургическом, лабораторных отделениях Главного военного клинического госпиталя им. H.H. Бурденко МО РФ,

2 Центрального военного клинического госпиталя им. П.В. Мандрыка МО РФ,

3 Центрального военного клинического госпиталя им. A.A. Вишневского МО РФ, 5 Центрального военного клинического госпиталя ВВС МО РФ, 32 Центрального военно-морского клинического госпиталя МО РФ, 12 Лечебно-диагностического

центра МО РФ. Материалы работы используются в лекциях и практических занятиях на кафедре хирургии Государственного института усовершенствования врачей МО РФ. Изданы методические рекомендации для медицинских учреждений Министерства обороны Российской Федерации «Полимеразная цепная реакция в клинико-диагностической практике многопрофильных лечебных учреждений» (2000).

По результатам научно-практической деятельности оформлено 8 рационализаторских предложений, которые внедрены в практику лечебно-диагностической деятельности Главного военного клинического госпиталя им. H.H. Бурденко и других военно-медицинских учреждений Министерства обороны Российской Федерации.

Апробация диссертации

Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских программ Главного военно-медицинского управления МО РФ. Апробация работы проведена на совместной научной конференции кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики ФПДО МГМСУ и лаборатории клинической биохимии НИИ клинической онкологии ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН 18 мая 2010 г. (протокол №7).

Основные положения работы доложены на: итоговой научно-практической конференции ГВКГ им. H.H. Бурденко «Современные подходы к диагностике и лечению злокачественных новообразований» (Москва, 2000); Национальных днях лабораторной медицины России (Москва, 2000); юбилейной научно-практической конференции «Современная специализированная амбулаторно-поликлиническая помощь в Московском регионе» (Москва, 2001); итоговой научно-практической конференции ГВКГ им. H.H. Бурденко «Клиническая и экономическая эффективность современных медицинских технологий, методов диагностики и лечения» (Москва, 2001); Всероссийской научной конференции «Биохимия - медицине» (Санкт-Петербург, 2002); юбилейной научно-практической конференции «Актуальные вопросы клинической и военно-морской медицины» (Московская область, г. Железнодорожный, 2003); итоговой научно-практической конференции ГВКГ им. H.H. Бурденко «Комбинированная и сочетанная патология: проблемы диагностики и лечения» (Москва, 2003); Третьем съезде онкологов Содружества независимых государств (Минск, 2004); Восьмом Всероссийском научном форуме с ме-

ждународным участием им. академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2004); Национальных днях лабораторной медицины России (Москва, 2004); The Tenth Joint Meeting of the International Cytokine Society (ICS) and the International Society for Interferon and Cytokine Research (ISICR) (Puerto Rico, San Juan, 2004); Третьем Всероссийском тиреоидологическом конгрессе «Диагностика и лечение узлового зоба» (Москва, 2004); XII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2005); итоговой научно-практической конференции ГВКГ им. Н.Н. Бурденко «Актуальные проблемы клинической онкологии» (Москва, 2005); VI Всероссийском съезде онкологов «Современные технологии в онкологии» (Ростов-на-Дону, 2005); 1-st Joint Meeting of European National Societies of Immunology Under the auspices of EFIS and 16-th European Congress of Immunology (France, Paris, 2006); 17th IFCC - FESCC European Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine; 60th National Congress of the Netherlands Society for Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (NVKC) (Netherland, Amsterdam, 2007); International Federation of Clinical Chemistry - WorldLab -Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (Brasil, Fortaleza, 2008); Тринадцатом Всероссийском научном форуме с международным участием им. академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2009), Всероссийской юбилейной научно-практической конференции ГВКГ им. Н.Н. Бурденко «Комбинированная и сочетанная патология: проблемы диагностики и лечения в условиях крупных военных лечебных объединений» (Москва, 2010).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 45 научных работ, из них 16 - в центральной печати, изданы одни методические рекомендации, получено 8 рационализаторских предложений.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 332 страницах машинописного текста и состоит из введения, 5 глав (обзор литературы, описание материала и методов исследования, собственные результаты и их обсуждение), заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы из 345 источников (125 отечественных и 220 иностранных авторов). Работа иллюстрирована 54 таблицами и 23 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клинический раздел работы включает анализ 178 больных с аутоиммунными, доброкачественными и злокачественными заболеваниями ЩЖ> средний возраст больных составил 49,4±13 (от 19 до 75) лет. Среди пациентов было 138 (77,53%) женщин и 40 (22,47%) мужчин. Все больные по характеру патологии были разделены на три основные группы: больные с аутоиммунными заболеваниями ЩЖ, больные с доброкачественными заболеваниями ЩЖ, больные со злокачественными заболеваниями ЩЖ (табл. 1).

Таблица 1

Распределение больных по нозологическим группам

Группа Клинико-патоморфологический диагноз Количество больных

абс. %

I Аутоиммунные заболевания ЩЖ: - Хашимото - Грейвса 16 15 1 100 93,75 6,25

II Доброкачественные заболевания ЩЖ: - аденома - цистаденома 61 60 1 100 98,36 1,64

III Злокачественные заболевания ЩЖ: - папиллярный рак - фолликулярный рак 101 92 9 100 91,09 8,91

Всего... 178 100

В группе больных аутоиммунными заболеваниями ЩЖ находились пациенты с аутоиммунным тиреоидитом Хашимото, болезнью Грейвса (16 больных); в группе с доброкачественными заболеваниями ЩЖ - пациенты с АЩЖ (61 больной); в группе со злокачественными заболеваниями ЩЖ - пациенты с преимущественно РЩЖ (101 больной).

Все больные перенесли оперативные вмешательства-тиреоидэктомия, субтотальная резекция, гемитиреоидэктоимия.

Группу больных с доброкачественными заболеваниями ЩЖ составили пациенты (61 больной), которым по клиническим и функциональным свойствам была показана частичная или полная тиреоидэктомия или тиреоидэктомия по поводу АЩЖ.

В группу больных с аутоиммунными поражениями ЩЖ входили больные с заболеваниями Хашимото (15 больных) и болезнью Грейвса(1 больной), которым в связи с выраженным объемом проводили оперативное удаление части ЩЖ с одновременным гистологическим подтверждением диагноза.

Наиболее значимую группу больных занимали пациенты со злокачественными новообразованиями (101 больной) в одной или нескольких долях ЩЖ. При этом по данным гистологических исследований злокачественные новообразования выявлялись в одной доле, а в другой доле, как правило, отмечались аутоиммунные расстройства, доброкачественные изменения (микро- и макрофол-ликулярная аденома) или неизмененные гистологические здоровые ткани.

В контрольную группу входили 25 пациентов - практически здоровых людей в возрасте от 19 до 57 лет, из них 9 - мужчины, 16 - женщины.

После операции проводился гистологический анализ удаленного препарата в соответствии с Гистологической классификацией опухолей щитовидной железы ВОЗ (1989) (табл. 2).

Таблица 2

Распределение больных раком щитовидной железы по стадиям заболевания

Стадии ткм Количество больных

FIGO (международная классификация) абс. %

I ТШ0М0,Т2ШМ0 до 41 года 1 1,01

II Т2Ы0М0; Т31Ч0М0 51 50,5

III Т4М)М0;Т любое N1 МО 42 41,56

IV Т любое, N любое, М1, низкодифференцированный рак 7 6,93

Всего... 101 100

Всем больным на этапе обследования проводилось иммунофенотипирование крови методом проточной цитометрии на аппарате COULTER EPICS XL-MCL фирмы «Beckman Coulter» (США) с рабочей станцией COULTER FLOW CENTRE в двух- и (или) трехцветных протоколах для определения основных субпопуляци-онных характеристик лимфоцитов, характеризующих клеточное звено специфического иммунитета с определением относительного и абсолютного количества основных иммунокомпетентных групп хелперных и эффекторных клеток: CD3 — зрелые Т-клетки, CD3 /4 , CD378 - субпопуляции Т -клеток, CD 19 —

В-лимфоциты, CD 16+5 6+ - NK-клетки, С D3+/16+5 6+ - TNK-клетки, CD3"/16+56+-NK истинные.

Подсчитывалось общее число поверхностных маркеров в условных единицах по средней интенсивности свечения флуоресценции (MFI), пропорциональной номеру канала, измеренного в логарифмическом режиме (средняя плотность экспрессии рецепторов в исследуемой группе клеток).

Для оценки состояния иммунитета рассчитывали также иммунорегулятор-ный индекс CD4/CD8.

Для оценки FAS-L на лимфоцитах использовали одинарные моноклональные антитела (МКА) - CD3-FITC, CD19-FITC, CD4-FITC, CD8-FITC, CD16-FITC - в комбинации с МКА CD95L-PE.

Оценку параметров клеточного звена иммунитета, распределение CD95L (FAS-L, CD178+) на основных субпопуляциях лимфоцитов проводили методом проточной цитометрии с подсчетом 3000 событий в лимфоцитарном гейте с определением относительного и абсолютного количества и плотности экспрессии рецепторов на клетке.

В основных исследуемых группах больных и в контрольной группе проводили определение цитокинов, хемокина и некоторых молекул межклеточной адгезии: INF-y, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-ß, МСР-1, sICAM-1 и sE-selectin. Для определения цитокинов использовали метод проточной цитометрии и симплексные наборы фирмы «Bender Medsystems Gmbh» (Австрия) с использованием технологии Multiplex. В работе с использованием логического метода сравнения изучены и используются для дополнительной дифференциальной диагностики обследуемых патологий следующие соотношения (индексы) цитокинов: y-INF/IL-4, y-INF/IL-10, y-INF/TNF-ß, IL-6/y-INF, y-INF/MCP-1, y-INF/sICAM-1, y-INF/sE-selectin. Расчеты соотношений (индексов) определяли по формуле

Индекс = (Цитокин1/Цитокин2)х100.

Также исследовали другие показатели, характеризующие гуморальное звено специфического и неспецифического иммунитета, - иммуноглобулины классов А, M, G, Е, компоненты комплемента СЗ, С4, ЦИК, некоторые показатели аутоимму-нитета - антитела к тиреоглобулину, тиреопероксидазе и микросомальной фракции, показатели, отражающие функциональное состояние ЩЖ—ТТГ, ТЗ, Т4, ТЗс, Т4с, паратгормона, показатель активации системы иммунитета - неоптерин.

У всех больных из операционного материала (тканей) готовили суспензию клеток, окрашивая тиреоциты моноклональными антителами к мембранным рецепторам и внутриклеточным белкам. В работе использовались МКА для оценки параметров апоптоза и пролиферации фирмы «САЕТАО» (Австрия) - Вс1-2- ИТС, СБ95-РЕ-Су5, СВ95Ь-РЕ-Су5 и фирм «ЭАКО» и «ВО» - рЗЗ-ИТС Кл-67-РЕ.

При подсчете клеток оценивали показатели в локальной области, используя гейтирование (рис. 1), при котором определялось окно, куда попадали клетки размером до 25 мкн.

| - Нипеа1ес1] Ш - □ X

1 1 ¿¡1

...... 0 ЭШ

1 0 1023

вТЯиСТиНЕ

Рис. 1. Гистограммы распределения суспензии клеток по размеру и структуре с ограниченной зоной гейтирования (Л)

Определяли количество белок (рецептор) положительных клеток, а также экспрессию маркеров, распределенных на поверхности клеток, - С095, СБ951-(ЕАБ-Е, СО 178), внутриклеточных маркеров пролиферации Ю-67 и апоптоза Ьс1-2, р53, в которых выделяли группы общих р53-клеток, клеток р53й,т, р53Ьп81й, общих Ьс1-2-клеток, клеток Ьс1-2Лш1, Ьс1-2ЬпбЬ1.

Фенотипирование проводили на проточном цитофлуориметре с подсчетом 100 ООО событий в образце и расчетом относительного количества клеток, а также показателя плотности экспрессии рецепторов (белков) на клетках или группе клеток.

Цифровые данные (гистограммы) в виде файлов (ЬУГО) анализировались в специальной аналитической программе СХР уег.2.2 с получением результатов проведенных исследований.

Также исследовали малочисленные группы клеток, образованные возможными комбинациями: p53/Ki-67, p53/CD95, bcl-2/Ki-67, bcl-2/CD95, CD95/Ki-67, p53/CD95L, CD95/CD95L, bcl-2/CD95L.

Показатели активаторов плазминогена урокиназного и тканевого типа и их ингибитора исследовали в цитозолях, приготовленных из тканей ЩЖ у больных с новообразованиями, иммунохимическим методом с использованием неконкурентного непрямого твердофазного гетерогенного иммуноферментного анализа (ELISE) в модификации двойного сендвич-метода и с применением наборов реактивов, разработанных в лаборатории профессора Т. Benraad'a (Ниймеген, Нидерланды) [Grebenschikov et al., 1997].

В материале, взятом из парафиновых блоков, у больных с аутоиммунными заболеваниями, доброкачественными и злокачественными новообразованиями проводили исследование мутаций гена р53 в 273 кодоне 6-го экзона методом по-лимеразной цепной реакции (ПЦР) по методике М. Zou и соавт. (1993).

Статистическая обработка результатов выполнялась на персональном компьютере с помощью статистического пакета SPSS 13,0 и MS Office Excel ХР с расчетом средних арифметических значений. Для оценки значимости различий между группами использовали непараметрический критерий Манна-Уитни. Корреляционный анализ проводили по методу Спирмена. Различия и рассчитанные коэффициенты корреляции (г) считались достоверными при уровне значимости р<0,05. Для расчета логистической регрессивной модели использовали регрессионный анализ [Реброва О.Ю., 2003]. Для оценки информативности диагностического теста использовали ROC-анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Клеточное звено иммунной системы

Для комплексного исследования механизмов нарушения иммунной системы у больных с аутоиммунными, доброкачественными и злокачественными заболеваниями щитовидной железы нами было изучено клеточное и гуморальное звено специфического и неспецифического иммунитета. Результаты исследования показывают, что у больных с АИЗЩЖ отмечаются выраженные изменения в Т-клеточном звене субпопуляции лимфоцитов, характеризующиеся наличием повышенного относительного и абсолютного количества Т-лимфоцитов (CD3+),

Т-хелперов (СВЗ+СВ4+), ТЖ.-лимфоцитов (СВЗ+СВ16+56+), относительного снижения Т-цитотоксических лимфоцитов (СВЗ+СВ8+). Аутоиммунные заболевания ЩЖ характеризовались также развитием и функционированием аутоаллергическо-го состояния в иммунной системе, которое характерно для всех аутоиммунных и аллергических заболеваний, проявившихся в повышении индекса СВ4/СВ8.

Показатели клеточного звена иммунной системы больных со злокачественными и доброкачественными новообразованиями ЩЖ имели сходные нарушения, проявляющиеся в относительном снижении процентного и абсолютного количества общих лимфоцитов, Т-лимфоцитов (СВЗ+), Т-хелперов (СВЗ+СВ4+), Т-цитотоксических лимфоцитов (СВЗ*СВ8+). Схожесть процессов онкогенеза у больных со злокачественными и доброкачественными новообразованиями ЩЖ характеризовалась и сходными нарушениями в иммунной системе. У больных с новообразованиями ЩЖ выявлено развитие иммунодефицитного состояния иммунной системы с характерным снижением иммунорегуляторного индекса. Больные со злокачественными новообразованиями имели более выраженные изменения в показателях основных субпопуляций лимфоцитов, характеризующих клеточное звено специфического иммунитета.

Сравнительная характеристика доброкачественных и злокачественных новообразований ЩЖ показала наличие у больных с аденомами повышенного относительного и абсолютного количества общих МС-клеток (СО 16+56"*), а также их субпопуляций - ТЖ- клеток (СВЗ+СВ16+56+) и натуральных киллерных клеток (СВЗ"СВ16+56+), что является патогномоничным признаком для пациентов с АЩЖ, в отличие от больных РЩЖ.

Гумморалъное звено иммунной системы

Анализ показателей гуморального звена неспецифического иммунитета показал, что потребление СЗ-компонента комплемента было наиболее выражено у больных с доброкачественными и злокачественными новообразованиями ЩЖ, менее - у больных с АИЗЩЖ. С4-компонент комплемента, по нашим данным, не играл значительной роли в патогенезе нарушений иммунной системы.

Исследование гуморального звена специфической иммунной системы у больных с аутоиммунными заболеваниями, доброкачественными и злокачественными новообразованиями ЩЖ показывает повышение количества иммуноглобулина Е в сыворотке всех исследуемых групп больных. Наиболее выраженное

повышение отмечалось в крови больных с АИЗЩЖ - 240,92 МЕ/мл. Менее выраженное повышение - 217,16 МЕ/мл - отмечено у больных со злокачественными новообразованиями ЩЖ. Повышенный уровень иммуноглобулина Е был отмечен и в группе больных с АЩЖ - 177,06 МЕ/мл.

Функциональные расстройства ЩЖ были более выражены у больных РЩЖ, чем у больных с доброкачественными новообразованиями. Функциональные расстройства характеризовались нормальной или сниженной до нижних границ концентрацией Т4, превышением концентрации ТЗ на 50-100% по сравнению с нормальным уровнем этого гормона.

Сывороточные цитокины и молекулы межклеточной адгезии, их соотношения

В патогенезе развития аутоиммунных, доброкачественных и злокачественных заболеваний ЩЖ большое значение придается интерлейкинам, хемокинам, молекулам адгезии и иным цитокинам, которые наряду с регуляцией антигенспе-цифических иммунных реакций иммунной системы, осуществляемых по механизмам аутокрийной и паракрийной регуляции, способны, несмотря на локальное их действие, показывать позитивный или негативный ответ на регуляторы клеточной пролиферации, механизмы апоптоза и способствовать клеточному росту, диффе-ренцировке, подавлять аномальный опухолевый рост, играть значительную роль в процессах трансформации иммунокомпетентных клеток и их субпопуляций.

В диагностике исследуемых патологий большую роль могут играть соотношения (индексы) цитокинов, использование которых позволяет получить дополнительные диагностические критерии с более высокими показателями диагностической эффективности.

Сравнительная характеристика цитокинов у больных с аутоиммунными, доброкачественными и злокачественными заболеваниями ЩЖ представлена в табл. 3, а соотношения (индексы) - в табл. 4.

Представлены данные по пороговым значениям, показателям диагностической эффективности (чувствительность, специфичность, точность, достоверность), которые могут использоваться в дифференциальной диагностике между группами контрольной, больных с аутоиммунными заболеваниями, доброкачественными и злокачественными новообразованиями ЩЖ по показателям цитокинов и их соотношений (индексов).

Таблица 3

Значения цнтокннов, молекул межклеточной адгезии и неоптерина в плазме крови у больных с аутоиммунными заболеваниями, доброкачественными и злокачественными опухолями щитовидной железы

Исследуемые показатели, пг/мл Группы больных и контроля

I (контроль), п=10 II (АИЗЩЖ), п=12 III (АЩЖ), п=15 IV (РЩЖ), п=24

у-ИНФ 8,47±0,26 7,55±3,01 9,5514,09 6,8915,56

ИЛ-4 40,66±12,73 111,71144,29° 83,47170,73 147,571126,02

ИЛ-6 7,61±0,63 34,28114,85 0 16,5317,16 31,3+17,41 °*

ИЛ-10 9,99±0,97 11,8812,77 21,78110,55 0 ~ 24,1113,67л

ФНО-ß 8,35±0,57 9,8211,34° 10,2511,5 0 11,7417,09

МСР-1 109,22±5,62 155,77127,2° 171,63143,3° 202,08159,65 ° л

sE-selectin 39,54±1,47 44,93120,63 45,83113,11 68,56+27,42 0 *л

sICAM-1 233,93±21,11 255,68130,56 412,90+159,03 0 ~ 296,86176,01

Неоптерин 2,02±0,26 3,7510,29 4,5+1,01 5,7113,63

Примечание.0 - статистическая достоверность между группами I и II, III, IV (р<0,05); — статистическая достоверность между группами II и III (р<0,05); *—статистическая достоверность между группами III и IV (р<0,05); А - статистическая достоверность между группами II и IV (р<0,05).

Таблица 4

Показатели некоторых расчетных индексов цитокинов, хемокина, молекул межклеточной адгезии в плазме крови в контроле, у больных с аутоиммунными заболеваниями, злокачественными и доброкачественными опухолями щитовидной железы

Исследуемые показатели Группы больных и контроля

I (контроль), п=10 II (АИЗЩЖ), п=12 III (АЩЖ), п=15 IV (РЩЖ), п=24

Индекс у-ИНФ/ИЛ-4 22,85±8,5 8,36±7,28° 214,38±172,69~ 7,72±5,45

Индекс 7-ИНФ/ИЛ-10 85,35±8,64 64,83±27,44 43,70±20,62 0 ~ 24,53±16,83 0 л

Индекс у-ИНФ/ФНО-Р 101,74±6,94 79,20±34,5 100,37±46,13 52,54±38,81

Индекс ИЛ-6/у-ИНФ 90,15±9,95 485,9±171,5° 282,4±169,2~ 2664,9±1198,5°*

Индекс у-ИНФ/МСР-1 7,78±0,65 5,00±2,35 5,42±2,53 4,19±3,52°

Индекс у-ИНФ/зЕ-эекаш 21,45±1,38 18,62±9,97 22,17±9,47 12,48±9,01°

Индекс у-ИНФ/ вЮАМ-! 3,64±0,33 2,97±1,11 2,78±1,74 2,3±1,12

Примечание. ° - статистическая достоверность между группами I и II, III, IV (р<0,05); — - статистическая достоверность между группами II и III (р<0,05);А - статистическая достоверность между группами II и IV (р<0,05); * - статистическая достоверность между группами III и IV (р<0,05).

Нами изучались данные по диагностике аутоиммунных заболеваний ЩЖ от контрольной группы. Для этих целей можно с высокой достоверностью использовать следующие цитокины и их соотношения: Ш1-4, ИЛ-6, ФНО-Р, МСР-1, индексы у-ИНФ/ИЛ-4 и ИЛ-6/у-ИНФ. Наиболее значимыми цитокинами в патогенезе аутоиммунных заболеваний являются ИЛ-6 и МСР-1.

Для диагностики доброкачественных новообразований ЩЖ от контрольной группы были выявлены такие показатели цитокинов, которые имеют высокую диагностическую эффективность: ИЛ-6, ИЛ-10, ФНО-Р, хемокин МСР-1, молекула адгезии 51САМ-1 и индекс у-ИНФ/ИЛ-10. Можно с уверенностью отметить, что цитокины, имеющие наиболее достоверные отличия, а также самую высокую диагностическую эффективность, играют значительную роль в патогенезе АЩЖ. Среди изучаемых цитокинов и их соотношений такими данными обладал ИЛ-6.

Для диагностики злокачественных новообразований ЩЖ от контрольной группы были получены пороговые значения для следующих показателей цитокинов: ИЛ-6, ИЛ-10, МСР-1, вЕ-БеЬсИп и соотношений - индекс у-ИНФ/ИЛ-4, индекс у-ИНФ/ИЛ-10, индекс у-ИНФ/МСР-1, индекс у-ИНФ/вЕ-зексйп и индекс ИЛ-6/у-ИНФ. Среди используемых в диагностике цитокинов важную роль в патогенезе развития РЩЖ имеют интерлейкины ИЛ-6, ИЛ-10 и хемокин МСР-1.

Нами определены и рассчитаны критические значения для показателей цитокинов и их соотношений, которые могли бы использоваться в дифференциальной диагностике злокачественных и аутоиммунных заболеваний ЩЖ. Это такие цитокины, как ИЛ-10, МСР-1, вЕ-БексНп, и индекс у-ИНФ/ИЛ-10. Эти показатели имели удовлетворительные и хорошие значения диагностической эффективности и поэтому в той или иной мере принимали участие в патогенезе развития РЩЖ.

В дифференциальной диагностике доброкачественных новообразований и аутоиммунного заболевания ЩЖ было доказано, что можно использовать показатели цитокинов ИЛ-6, ИЛ-10 и молекулы межклеточной адгезии з1САМ-1, а также с высокой эффективностью применять расчетные индексы у-ИНФ/ИЛ-4, у-ИНФ/ИЛ-10, ИЛ-6/у-ИНФ. Представленные показатели также имели хорошую и удовлетворительную диагностическую информативность, однако не было возможности выделить наиболее значимые цитокины, которые могли бы участвовать в патогенезе развития АЩЖ.

Наиболее сложной в диагностическом плане является дифференциальная диагностика злокачественных и доброкачественных новообразований, основанная на пороговых значениях цитокинов. Было выявлено, что в диагностике рака и аденомы ЩЖ можно применять ИЛ-6, зЕ-зе1есПп, а также использовать индекс ИЛ-6/у-ИНФ. В связи с относительно удовлетворительной и хорошей диагностической эффективностью используемых нами показателей не было возможности предложить наиболее эффективный цитокин, который мог бы вносить значительный вклад в патогенез РЩЖ и отличать ее от АЩЖ с 99,9% эффективностью.

В этой связи нами разработана на основе регрессивного анализа логистическая модель, которая включала используемые показатели некоторых наиболее значимых цитокинов и индекса ИЛ-6/у-ИНФ для улучшения диагностики рака щитовидной железы от аденомы. Полученная модель обладает более высокой достоверностью различия и более высокими показателями точности и специфичности и позволяет использовать ее для диагностики этих схожих по механизму канцерогенеза патологий.

В результате проведенного логического регрессивного анализа была получена следующая формула модели:

7= О,017Х, +0,005X2+0,0000774Хз+1,654, где У- рассчитанный коэффициент, равный 2,2485; Х1 - значение ИЛ-6; Х2- значение вЕ-зе^сйп; Х3 - значение индекса ИЛ-6/у-ИНФ; 1,654 - константа А (определяет смещение по оси ординат).

При Г более 2,2485 была высока вероятность развития РЩЖ.

При 7 менее 2,2485 вероятность развития рака отсутствовала и соответственно была высока вероятность развития АЩЖ.

Сравнительная характеристика 5Е-зе1есПп, ИЛ-6, индекса ИЛ-6/у-ИНФ и разработанной нами модели с показателями достоверности, площади под ЯОС-кривой, чувствительности, специфичности и точности методов представлена в табл. 5.

Таким образом, полученная в результате логистического регрессивного анализа модель диагностики РЩЖ у больных с доброкачественными и злокачественными новообразованиями, основанная на анализе показателей, имевших достоверные различия между группами, сравниваемыми по ИЛ-6 и БЕ-Бекйш, является более диагностически эффективной и обладает более высокой достоверностью (р=0,005) и более высокими значениями площади под ЯОС-кривой (0,914).

Таблица 5

Диагностическая эффективность использования зЕ-эекс^п, ИЛ-6, индекса ИЛ-6/у-ИНФ и разработанной логистической регрессивной модели при дифференциальной диагностике злокачественных и доброкачественных новообразований щитовидной железы

Показатель Значение Достоверность, Р Площадь под кривой АИС Чувствительность, % Специфичность, % Точность метода, %

ИЛ-6 Более 18,16 0,015 0,857 71,4 80 75,7

5Е-5е1еЫп Более 56,39 0,04 0,800 71,4 90 80,7

Индекс ИЛ-6/у-ИНФ Более 421,32 0,015 0,857 85,7 90 87,95

Логистическая модель Более 2,2584 0,005 0,914 85,7 80 82,85

В процессе исследования цитокинов и их индексов можно использовать следующий простой алгоритм диагностики по одному показателю между аутоиммунными, злокачественными и доброкачественными заболеваниями ЩЖ.

Для дифференциальной диагностики между злокачественными и аутоиммунными заболеваниями мог использоваться показатель МСР-1, который не был диагностическим критерием в других группах.

Показатель величины з1С АМ-1 был характерен для диагностики между доброкачественными и аутоиммунными заболеваниями ЩЖ.

Для дифференциальной диагностики между раком и аденомой ЩЖ можно использовать величину соотношения ИЛ-6/у-ИНФ или логистическую регрессионную модель.

Таким образом, в патогенезе заболеваний ЩЖ некоторые цитокины играли ключевую роль и не могли быть использованы для диагностики в других исследуемых группах. Так, например, при РЩЖ определяющее значение имела растворимая форма молекулы адгезии вЕ-зексйп, при АЩЖ - растворимая форма молекулы межклеточной адгезии 1 -го типа вЮАМ-1, а при аутоиммунных тиреоидитах определяющее значение имел цитокин ИЛ-4.

Коэкспрессия СВ95Ь(РАБ-Ь, СВ178+) на субпопуляциях лимфоцитов

В работе представлены исследования С095Ь-рецепторов на поверхности им-мунокомпетентных клеток основных, хелперных и эффекторных субпопуляциях лимфоцитов у больных со злокачественными заболеваниями ЩЖ и в контрольной группе.

У больных со злокачественными заболеваниями ЩЖ показана значительная коэкспрессия БАБ-Ь на основных субпопуляциях лимфоцитов: общих Т-лимфоцитах, В-лимфоцитах, Т-хелперах, Т-цитотоксических, натуральных кил-лерных клеток (лимфоцитов, несущих маркер СЭ16+). При одновременном значительном увеличении на основных, хелперных и эффекторных клетках маркеров СБ 178+ отмечалось незначительное снижение плотности распределения этого белка на поверхности клеток.

Значительное повышение СЭ178т-рецепторов на основных субпопуляциях иммунокомпетентных клеток у больных со злокачественными новообразованиями ЩЖ, особенно на эффекторных клетках (СБ8+- и СБ 16+ -лимфоцитах), позволяет предположить создание иммунной системой больного человека условий для контакта с опухолевыми клетками посредством механизма РАЗ-Ь/ТАБ-запуска процессов апоптоза в опухолевых клетках. Наличие повышенного количества Б АБ-Ь на других клетках позволяет предположить, что посредством механизма отбрасывания БАБ-Ь в растворимую форму увеличивается количество БАБ-Ь в крови и позволяет сывороточному БАБ-Ь достигать удаленных участков тканей и индуцировать апоптоз в клетках, содержащих большое количество БАБ-рецептора, например, на тиреоцитах у больных с АИЗЩЖ.

Были разработаны и представлены в работе критические значения и оценена диагностическая эффективность показателей, имеющих достоверные различия в контрольной группе и группе больных РЩЖ, для проведения дифференциальной диагностики РЩЖ по показателям количества иммунокомпетентных клеток и плотности распределения рецепторов на поверхности в каждой группе, несущих маркеры РАБ-Ь.

Интересные результаты получены при исследовании показателей апоптоза и пролиферации в тканях ЩЖ у больных с аутоиммунными заболеваниями, доброкачественными и злокачественными новообразованиями ЩЖ.

Общие и сочетанные маркеры апоптоза и пролиферации в тканях ЩЖ

Исследовалась суспензия клеток, приготовленных из морфологически измененной ткани ЩЖ, по данным основных маркеров, регулирующих апоптоз и пролиферацию (количество клеток, несущих маркеры СБ95, СБ95Ь (БАБ-Ь,

CD178+), p53, bcl-2, Ki-67, и плотность их экспрессии в группах клеток, позитивных по одному из маркеров).

В работе также представлено исследование количества клеток с сочетанными (комбинированными) маркерами апоптоза и пролиферации и плотности распределения рецепторов в этих группах клеток в тканях исследуемых групп больных.

Выявлено значительное увеличение количества клеток с маркерами FAS на мембранах тиреоцитов у больных с аутоиммунными тиреоидитами. У больных этой же группы отмечено повышенное содержание клеток с маркерами CD178+ по сравнению с больными из группы доброкачественных и злокачественных новообразований.

Анализ количества клеток с онкосупрессором р53 (общим) выявил наличие повышенного количества клеток в группе больных аутоиммунными тиреоидитами (66,9±3,9%). Значение плотности рецепторов р53 (общего) было наибольшим в группах больных АЩЖ (4,79±1,09) и аутоиммунными заболеваниями, где этот показатель составил 4,07±0,28. Количество клеток с белком p53dira было значительно повышено у больных РЩЖ - 51,07±6,81%, статистически достоверно (р=0,026) отличаясь от этого показателя у больных АЩЖ, где количество клеток с белком p53dim составило 38,73±5,42%. Обнаружено значительное снижение количества клеток с фенотипом p53bright в группе больных РЩЖ (9,07±3,85%) по сравнению с больными АЩЖ - 21,82±7,84% (р=0,003) и АИЗЩЖ - 19,21±1,75% (р=0,0001). Плотность экспрессии белка р53 в группе p53bnsht - клеток была значительно снижена у больных РЩЖ и составила 7,27±0,85 по сравнению с этим показателем в группах больных АЩЖ (10,93±2,21) (р=0,0001) и аутоиммунными тиреоидитами (9,28±1,07) (р=0,033).

Исследование внутриклеточного маркера пролиферации Ki-67 у пациентов с заболеваниями ЩЖ показало, что количество клеток, несущих данный маркер, было наибольшим при АИЗЩЖ (4,23±1,86%) и минимальным при АЩЖ (1,49±0,58%) и РЩЖ (1,45±0,77%).

Динамика содержания общего количества клеток с антиапоптотическим белком bcl-2 у больных с патологией ЩЖ выявила, что общее количество клеток с белком bcl-2 было наибольшим у пациентов с аутоиммунными тиреоидитами (82,52±2,01%) и сопровождалось повышенной величиной плотности распределе-

ния этого внутриклеточного белка (8,12±0,65). Общее количество клеток у больных АЩЖ составило 70,11±10,36%, авеличина его плотности-4,51±1,65. У больных РЩЖ количество клеток с Ьс1-2 составило 70,54±8,37%, показатель плотности распределения белка в исследуемых клетках был значительно снижен и составил 2,36±0,49.

Выявлено, что количество клеток с Ьс1-2а'ш у пациентов с аутоиммунными заболеваниями было минимальным и составило 28,25±4,48% при относительно небольшой величине плотности распространения этого белка —1,71±0,11. У больных АЩЖ показатели количества Ьс1-2(11т-клеток были более высокими в сравнении с группой пациентов с АИЗЩЖ и составили 48,47±12,83% и при более низких значениях плотности распространения Ьс1-2а1т-1,53±0,1. Наиболее высокие показатели количества Ьс1-2('"п-клеток обнаружены у больных РЩЖ - 56,44±9,95% при схожей с группой АЩЖ величине плотности распределения Ьс1-2-белка -1,59±0,15.

Наиболее интересные результаты получены при сравнительном анализе показателей количества Ьс1-2Ьп8Ы-клеток и величин плотности экспрессии Ьс1-2-белка в исследуемых группах. Наибольшее количество клеток с фенотипом Ьс1-2Ьп8Ь' и показатель плотности распределения белка Ьс1-2 в Ьс1-2ЬпеЬ'-клетках были обнаружены у больных аутоиммунными тиреоидитами и составили 51,48±3,82% и 12,32±0,08 соответственно. В группе больных с доброкачественными опухолями ЩЖ количество Ьс1-2Ьп811'-клеток было в 2,5 раза ниже, чем в группе больных АИЗЩЖ, и составило 18,12±7,29%; при этом показатель плотности экспрессии белка Ьс1-2 в этой группе клеток незначительно превышал этот же показатель в группе АИЗЩЖ и составил 13,66±2,79. В группе больных РЩЖ обнаружено значительное снижение показателя количества клеток с фенотипом Ьс1-2ЫвЬ' (8,85±2,76%), а также показателя плотности распределения белка Ьс1-2 в Ьс1-2Ьпб1"-клетках, значение которого не превышало 8,32±1,03. Получены статистически значимые различия по показателю количества Ьс1-2Ъп8Ь'-клеток как между группами больных РЩЖ и АЩЖ (р=0,042), так и между группами РЩЖ и аутоиммунными заболеваниями ЩЖ (р=0,0001), а также по величине плотности экспрессии Ьс1-2 в этой группе клеток между группами РЩЖ и АЩЖ (р=0,001) и в группах РЩЖ и аутоиммунными тиреоидитами (р=0,0001).

Представлены данные по исследованию комбинированных показателей апоптоза и пролиферации у больных с заболеваниями ЩЖ. Так, обнаружено, что у больных аутоиммунными тиреоидитами повышено количество всех групп соче-танных клеток (р53/Кл-67, р53/СБ95, Ьс1-2/Кд-67, Ьс1-2/СБ95, С095/И-67, р53/СБ95Ь, С095/СБ95Ь, Ьс1-2/СБ95Ь) в 3-25 раз по сравнению с группой пациентов с новообразованиями ЩЖ. Наибольшие различия выявлены в группе клеток Ьс1-2/ СБ95, которые имели более чем 25-кратное их превышение у больных АИЗЩЖ по сравнению с пациентами с новообразованиями.

Количество сочетанных клеток у больных с новообразованиями было значительно снижено, а достоверные различия между группами больных АЩЖ и РЩЖ выявлены только лишь при анализе количества р53/С095Ь-позитивных клеток. Достоверное превышение количества р53/СБ95Ь-клеток в группе аденом ЩЖ по сравнению с РЩЖ (р=0,005) позволяет использовать этот показатель в дополнительной диагностике раков и аденом ЩЖ. Достоверно сниженным в этой группе клеток оказался показатель плотности распределения белка р53 у больных РЩЖ в отличие от пациентов с аденомой ЩЖ. Еще одной характерной особенностью пациентов с новообразованиями ЩЖ явилось 4-7-кратное увеличение плотности СБ95Ь-рецепторов на СБ95/СВ95Ь-позитивных клетках, при этом плотность СВ95Ь-рецепторов на СБ95/С095 Ь-клетках ткани аденомы ЩЖ была наиболее высокой, а плотность этих рецепторов в тканях рака ЩЖ была минимальной для новообразований ЩЖ.

Нами были рассчитаны пороговые значения и диагностическая эффективность показателей количества клеток и плотности распределения общих рецепторов/белков по общим и сочетанным показателям апоптоза и пролиферации, которые имели достоверные различия между группами сравнения: группами больных с аутоиммунными, доброкачественными и злокачественными новообразованиями.

В дифференциальной диагностике рака и АИЗЩЖ наибольшую диагностическую информативность имели следующие показатели: количество СБ95-позитивных клеток, количество СБ95Ь-позитивных клеток, количество Ьс1-2с11т-позитивных клеток, количество Ьс1-2Ьп8Ь'-позитивных клеток и плотность распределения белка Ьс1-2Ьп8Ы в Ьс1-2 "8 -позитивных клетках ЩЖ. Остальные показатели имеют хорошую диагностическую эффективность и могут быть рекомендованы

как дополнительные маркеры дифференциальной диагностики РЩЖ и аутоиммунных тиреоидитов.

В дифференциальной диагностике аденом и аутоиммунных заболеваний ЩЖ высокие показатели достоверности, диагностической чувствительности и специфичности используемых методов выявили значения следующих показателей: количество С095-позитивных клеток, количество С095Ь-позитивных клеток и плотность распределения белка Ьс1-2 в Ьс1-2-позитивных клетках ЩЖ. Другие показатели, используемые в дифференциальной диагностике АЩЖ и аутоиммунного тирео-идита, показали отличную, хорошую и удовлетворительную диагностическую эффективность.

Наибольшие сложности возникали в дифференциальной диагностике рака и аденом ЩЖ. Нами были выявлены показатели, которые имели высокую достоверность получаемых результатов, но не обладали столь же хорошей и отличной диагностической эффективностью. Это создает определенные трудности в дифференциальной диагностике данных нозологий и не позволяет с высокой степенью надежности использовать показатели апоптоза и пролиферации для этих целей, что способствует поиску новых диагностических маркеров.

Для данного вида диагностики мы рекомендуем использовать комбинированные показатели апоптоза и пролиферации по количеству клеток, применение которых с высокой достоверностью и отличными показателями чувствительности, специфичности и точности позволяет дифференцировать РЩЖ от аутоиммунного тиреоидита: Ьс1-2/Кд-67, Ьс1-2/С095, р53/СБ95Ь, СБ95/С095Ь, Ьс1-2/СБ95Ь.

Содержание клеток с маркерами Ьс1-2/СБ95 (рис. 2) было очень высоким в группе пациентов с АИЗЩЖ и достигало значений 47,2±1,82%; количество Ьс1-2/СБ95-клеток у больных РЩЖ и АЩЖ было на низком уровне и составило 1,19±0,59 и 1,87±0,57% соответственно. Различия между группами больных со злокачественными новообразованиями и аутоиммунными заболеваниями ЩЖ были найдены по показателям количества Ьс1-2/СВ95-клеток (р=0,0001). Между группами больных с аденомами и аутоиммунными заболеваниями ЩЖ выявлены значимые различия по количеству Ьс1-2/СВ95-клеток (р=0,0001) и показателю плотности экспрессии белка Ьс1-2 (р=0,019). Отмечены лишь незначительные достоверно значимые различия в 98,9% по величине плотности экспрессии Ьс1-2-белка на СБ95/Ьс1-2-клетках у больных раком и аденомой ЩЖ.

а (П)[А] 20006655.1_м0 : П_1...

» (П)[А] 70006661.1 МО : П 1. . ЛН Х

ю' ! <1 К2

- 7.3% 47.4%

юг-= 47.3%

ю1—

10°- Ж'

ШщШёШ

• 10° 10' 10г 10®

Ьс|2-НТС

А

(Р1)[А] 20006640.1_м0 : П.1... □[□1®

в

Рис. 2. Гистограммы показателей групп Ьс1-2/С095-клеток с сочетаниями маркеров апоптоза в тканях щитовидной железы у больных с аутоиммунными (А), доброкачественными (£) и злокачественными (В) заболеваниями

Кроме пяти групп клеток в дифференциальной диагностике РЩЖ и аутоиммунного тиреоидита имеется достаточно большое количество показателей плотности экспрессии рецепторов в этих группах клеток, которые могут быть полезны как дополнительные дифференциально-диагностические маркеры с очень хорошими, хорошими и удовлетворительными показателями диагностической эффективности.

В дифференциальной диагностике аденом и аутоиммунных заболеваний ЩЖ наиболее значимыми показателями могут служить следующие сочетания клеток с фенотипами: р53/СЭ95, Ьс1-2/Кл-67, Ьс1-2/СБ95, СБ95/СВ95Ь, Ьс1-2/СБ95Ь,

отличающиеся наивысшей диагностической эффективностью. Выявлены и другие показатели, отвечающие высоким параметрам диагностической эффективности, которые можно использовать в дифференциальной диагностике аденом и аутоиммунных тиреоидитов, например по параметрам плотности распределения рецепторов/белков в группах клеток с сочетанными маркерами апоптоза и пролиферации.

Наибольшую сложность представляли дифференциальная диагностика рака и аденомы ЩЖ, а также выявление диагностических критериев, которые обладали высокой диагностической информативностью и позволяли дифференцировать рак и аденому ЩЖ.

Анализ полученных данных показал, что в диагностике этих двух схожих нозологий наибольшую диагностическую эффективность имели показатели количества р53/СБ95Ь-клеток, а также плотности распределения белка р53 в группе р53/СБ95Ь-клеток, но они не обладали отличной диагностической информативностью. Определены и другие показатели, в основном плотности распределения в комбинированных группах клеток рецепторов/белков, которые могли бы использоваться в дифференциальной диагностике рака и аденомы ЩЖ. Однако все эти показатели имели главным образом неудовлетворительную и удовлетворительную диагностическую эффективность, которая не может быть рекомендована в практику специалистам клинической лабораторной диагностики.

Общие и сочетанные маркеры апоптоза и пролиферации в тканях при папиллярном и фолликулярном раке ЩЖ

Проведенные исследования общих маркеров апоптоза и пролиферации у больных с папиллярным и фолликулярным РЩЖ показывают наличие значительных различий между этими вариантами РЩЖ.

Количество СБ 178+-клеток было повышено у пациентов с фолликулярным РЩЖ и составило 36,52±4,28%, при этом его плотность распространения была минимальной - 5,59±0,52. При папиллярном РЩЖ количество С0178+-клеток было минимальным (5,97±2,46%), почти в 6 раз отличалось от количества С0178+-клеток, выявленных при фолликулярном раке; при этом плотность экспрессии СБ95Ь-рецепторов значительно повышалась на мембране исследуемых клеток ткани папиллярного РЩЖ и составила 24,79±9,53.

Выявлены и другие показатели белков, регулирующих апоптоз, которые могут быть рекомендованы в дифференциальной диагностике папиллярного и фолликулярного варианта РЩЖ, однако они обладали меньшей, но вполне удовлетворительной диагностической информативностью.

Таким образом, фолликулярный вариант РЩЖ в основном характеризовался достоверно повышенным количеством клеток с рецептором СБ178+ (СБ95Ь, БАБ-Ц.

Были исследованы количество клеток и показатели плотности распределения рецепторов/белков с использованием комбинированных показателей апоптоза и пролиферации у пациентов с фолликулярными и папиллярными вариантами РЩЖ.

Выявлено несколько групп клеток с комбинированными маркерами, которые были повышены, а в некоторых случаях значительно повышены у больных фолликулярными РЩЖ. Это группы клеток с фенотипами: р53/Кл-67, Ьс1-2/Кл-67, р53/СБ95Ь, среди которых выделялась группа клеток с сочетанными маркерами Ьс1-2/СБ95Ь, повышение которых было максимальным и отличалось более чем в 10 раз от этого показателя в группе больных папилллярным РЩЖ.

Большое значение следовало бы уделить некоторым стабильным показателям сочетанных маркеров апоптоза и пролиферации, в частности показателям плотности распределения белков/рецепторов в/на поверхности клеток; их различие более чем на 20-30% позволяло предполагать значительный вклад этих параметров в диагностику разных вариантов РЩЖ. Нами выявлены достаточно убедительные превышения в показателях плотности экспрессии: белков р53 в клетках с фенотипом р53/Кл-67, белков Ьс1-2 и рецепторов СБ95 в клетках с фенотипом Ьс1-2/СБ95, рецепторов СБ95 и белка К>67 в клетках с фенотипом С095/Кл-67, белков р53 и рецептора СБ95Ь в клетках с фенотипом р53/С095Ь, рецепторов СБ95 в клетках с фенотипом СВ95Ь/С095 и белков Ьс1-2 и рецепторов СБ95Ь в клетках с Ьс1-2/СБ95Ь-фенотипом у больных папиллярным РЩЖ. Аналогичные изменения, выразившиеся в повышении плотности экспрессии белка Ьс1-2 в клетках с Ьс1-2/Кд-67-фенотипом, были нами зафиксированы у больных фолликулярным РЩЖ.

В работе представлены расчеты пороговых значений и оценена диагностическая эффективность общих и комбинированных показателей апоптоза и пролиферации, которые могут использоваться в дифференциальной диагностике папиллярного и фолликулярного РЩЖ.

Общие и сочетанные маркеры апоптоза и пролиферации в опухолевых и «нормальных» тканях ЩЖ

В исследовании были проанализированы результаты общих параметров апоптоза и пролиферации в морфологически не измененных тканях ЩЖ («нормальных»), забранных из доли органа, где опухолевого процесса не было, в сравнении с тканями, взятыми из участков, пораженных папиллярным РЩЖ.

Минимальные различия «нормальных» и опухолевых тканей в ЩЖ, пораженной опухолевым процессом, а также практическое отсутствие достоверных различий по большему количеству исследуемых показателей, в основном характеризующих наиболее важные параметры апоптоза, могут считаться достаточными аргументами в пользу поддержки гипотезы о генетически детерминированном процессе в органе, в котором выявлен папиллярный РЩЖ. Различия, выявленные лишь в количестве клеток с рецептором СБ95 и маркерами пролиферативной активности (Кл-67), не дают веских оснований дифференцировать эти ткани, взятые из одного органа.

Вне зависимости от того, в каком анатомическом участке ЩЖ морфологически выявлен рак, уже в морфологически не измененных участках нормальной ткани на внутриклеточном уровне отмечаются близкие к опухолевому процессу нарушения в механизмах апоптоза и пролиферативной активности клеток.

При продолжении поиска закономерностей были проанализированы параметры комбинированных маркеров апоптоза и пролиферации в «нормальных» тканях и опухоли при папиллярном РЩЖ. Выявлено пять групп клеток, которые достоверно различались между собой по количественному составу: р53/Кл-67, р53/СБ95, Ьс1-2/СБ95, СТО5/Кь67, Ьс1-2/С095Ь. В «нормальных» тканях ЩЖ количество клеток с выявленными фенотипами клеток было увеличено в 2-5 раз по сравнению с тканями, забранными из опухоли ЩЖ. Снижение количества клеток с комбинированными маркерами в опухолевых тканях могло быть косвенным свидетельством снижения полиморфизма клеток и характерным признаком бластомо-генеза. Полученные различия по пяти фенотипически малочисленным группам клеток позволяют нам использовать их в дополнительной диагностике зоны поражения опухолевого процесса, что было практически невозможным при анализе основных маркеров, регулирующих апоптоз и описанных выше.

С учетом наилучших показателей диагностической эффективности (по параметрам сходимости результатов, чувствительности, специфичности и точности) в дополнительной дифференциальной диагностике между «нормальной» и патологической тканями ЩЖ может применяться такой показатель, как количество клеток с фенотипом СБ95/К>67. Остальные четыре группы клеток показали хорошую диагностическую информативность и также могут быть рекомендованы для дифференциальной диагностики в следующем порядке по мере убывания эффективности диагностических показателей количества клеток с фенотипами: р53/С095, р53/Кл-67, Ьс1-2/СБ95Ь, Ьс1-2/СБ95.

Общие и сочетанные маркеры апоптоза и пролиферации в тканях при фолликулярных аденомах ЩЖ

Были проанализированы показатели общих маркеров апоптоза и пролиферации в тканях у больных с АЩЖ. В процессе исследования выявлено, что у больных с доброкачественными новообразованиями имелись два типа АЩЖ, различающихся по фенотипу. Основным отличием от основной (аденомы I типа) группы АЩЖ в выявленной группе аденом II типа явилось наличие повышенного количества клеток с мембранным рецептором БАЗ-Ь. По нашим данным, частота встречаемости аденом II типа составила 24%. Повышенная экспрессия БАБ-Ь в АЩЖ может служить фактором плохого прогноза опухоли, возможным ее быстрым ростом и перерождением из доброкачественного процесса в злокачественный. Поэтому выделение аденом с повышенной экспрессией в отдельную группу и изучение фенотипа этих новообразований представляет определенную научную и прогностическую ценность.

Анализ количества С095Ь-клеток, содержащихся в суспензии, приготовленной из аденом ЩЖ, показал, что число С0178+-клеток было очень высоким (рис. 3) у больных с аденомой И типа и составило 54,54±12,84%, статистически достоверно отличаясь (р=0,002) от этого показателя у больных с аденомой I типа, где этот показатель был равен 5,96±2,15%. Показатель плотности распределения рецептора СБ95Ь имел тенденцию к 3-кратному снижению в аденомах II типа (3,82±0,46), а в группе пациентов с основным типом АЩЖ это значение было равно 9,86±5,69.

В диагностике аденом разных типов могли помочь и показатели количества клеток с белком р53 и плотности распределения белка р53 в исследуемой группе р53-позитивных клеток. Значимыми оказались показатели количества р53-клеток, которые были наиболее высокими (93,74±4,98%) в аденомах II типа, достоверно отличаясь (р=0,002) от этого показателя в аденомах I типа (64,72± 15,2%). Значение плотности экспрессии белка р53 в этой группе клеток было наибольшим (13,56±3,08) в аденомах II типа, статистически отличаясь (р=0,002) от этого показателя (4,79±2,09) в аденомах I типа.

Заслуживают внимания данные, полученные при анализе общего количества р53Лт-клеток: наибольшее количество клеток отмечено в аденомах I типа -38,73±16,22%, в аденомах II типа- 8,5±2,67% (р=0,002) (см. рис. 3). Плотность распределения белка р53 в р53Лт-позитивных клетках изучаемых групп больных была достоверно большей в аденомах II типа (1,77±0,07), статистически достоверно отличаясь (р=0,005) от значения этого же показателя (1,55±0,08) в аденомах I типа. Подобные достоверные различия (р=0,002) выявлены и при сравнении количества р53Ьп8Ь'-клеток (см. рис. 3). Количество р53Ьп8Ь'-клеток было значительно повышено у больных с аденомой II типа - 83,25±9,8%, в то время как у больных с аденомой I типа количество р53Ьп81"-клеток было намного ниже - 21,82±19,84%. Обнаружены также статистически значимые различия (р=0,011) в величинах плотностей распределения белка р53 в р53Ьг'8М-клетках у больных с аденомой I типа (10,93±2,21) в сравнении с аденомами II типа (14,84±1,34).

Выявлено статистически значимое (р=0,002) более чем 40-кратное повышение количества клеток, экспрессирующих маркер Кь67, в группе пациентов с аденомой II типа-до 60,12±18,1% по сравнению с аденомой I типа, где этот показатель составил 1,45±0,77%. В то же время не было получено достоверных различий (р=0,131) между группами больных с аденомами двух типов по показателю плотности распределения бежа Кь67 в исследуемых клетках. Высокий показатель плотности распределения белка Кь67 обнаружен в аденомах II типа (4,83±0,73) против 3,26±3,68 в аденомах I типа.

Обнаружено различие в показателях количества Ьс1-2-клеток в аденомах разных типов. Так, число Ьс1-2-клеток в аденомах II типа было значительно достоверно выше (р=0,002) (95,47±4,2%) по сравнению с аденомами I типа (71,47±10,36%). Обнаружены статистически значимые различия (р=0,002) по вели-

чинам плотности распределения белка Ьс1-2 в Ьс1-2-позитивных клетках между аденомами II типа (16,22±2,23) и I типа (4,51±1,65).

— (р1)[а) 70006674.1.мо : и2 ... !1 е<р1)1а] 70006639.1 мо : п 2 ... лн

10° 1В' 102 10

СО 951--РЕ

С0951--РЕ

НЩИШН!'

С (Р1)[А] 70006659 1 МО П 1 106

А Б

Рис. 3. Гистограммы общего количества клеток с маркерами, регулирующими апоптоз С095Ц р53, р53"'га, р53ь"8|и, Ьс1-2, Ьс1-23<"га, Ьс1-2ЬпвМ у больных с разными типами аденомы щитовидной железы: А - аденома I типа; Б-аденома II типа

Показатели количества Ьс1-2Шш-клеток (см. рис. 3) также достоверно (р=0,002) повышены (48,47±12,83%) в аденомах I типа и значительно снижены в аденомах II типа (5,24±3,32%). Величина плотности распределения bcl-2-белка в исследуемой группе bcl-2dim-iuieTOK была повышена в аденомах II типа и составила 1,73±0,06, достоверно отличаясь (р=0,006) от этого показателя при аденомах II типа, где он был достоверно ниже и составил 1,51 ±0,1.

Иная динамика отмечена при сравнительном анализе показателей количества Ьс1-2ЬпеЬ'-клеток в группах сравнения (см.рис. 3). Количество Ьс1-2Ьп8,1'-клеток было значительно достоверно (р=0,002) выше в аденомах II типа (89,85±8,44%), чем в аденомах I типа (18,12±15,29%). Не выявлены достоверные различия (р=0,059) между показателями плотности экспрессии белка bcl-2 в группе Ьс1-2ЬпеЬ'-позитивных клеток в аденомах II типа (16,67±0,93) и I типа (13,66±2,79).

Таким образом, исследование общих маркеров, регулирующих апоптоз и пролиферацию в группе клеток у больных с АЩЖ, позволило выделить феноти-пически отличный вариант АЩЖ (аденома II типа) и изучить распределение числа клеток и плотности рецепторов/белков в двух типах аденом.

Выявленная группа аденом II типа обладала отличительными фенотипиче-скими особенностями, выраженными в повышенном, а иногда и в значительно повышенном количестве клеток с маркерами CD95L, р53, p53dim, p53bnght, Ki-67, bcl-2, bcl-2dim, bcl-2bnsht, что предполагало наличие агрессивной пролиферативной активности, повышенного участия клеток в механизмах апоптоза и, по всей видимости, неблагоприятного прогноза развития опухолей с возможностью перерождения доброкачественного процесса в злокачественный, например в фолликулярный РЩЖ, обладающий сходными фенотипическими особенностями.

Выявленное значительное повышение количества FAS-L в аденомах II типа может быть также плохим прогностическим признаком при проведении химиотерапии, так как считается, что в некоторых типах опухолевых клеток цитостатики индуцируют апоптоз, усиливая экспрессию лигандов и рецепторов семейства TNF. Следовательно, резистентность к сигналам рецепторов смерти наделяет опухолевые клетки химиорезистентным фенотипом.

Изучены диагностическая информативность и пороговые значения показателей маркеров, регулирующих апоптоз и пролиферацию, в дифференциальной

диагностике аденом I и II типа. Выявлены критические значения по всем исследуемым параметрам белков/рецепторов: СБ95Ь, р53, р53Шш, р53Ьп8Ь', К>67, Ьс1-2, регулирующих апоптоз и пролиферацию, с очень хорошими и отличными параметрами диагностической эффективности значений количества клеток ЩЖ и большинства показателей плотности распределения рецепторов и белков в/на клетках ЩЖ.

Проведены исследования количества клеток и плотности распределения рецепторов/белков сочетанных маркеров апоптоза и пролиферации в аденомах ЩЖ разных типов.

Проведены исследования количества клеток и плотности распределения рецепторов/белков в сочетании нескольких маркеров, регулирующих апоптоз и пролиферацию, в АЩЖ разных типов, что позволило выявить четыре группы клеток с фенотипами р53/Кл-67, Ьс1-2/Ка-67, СБ95/К1-67, Ьс1-2/СБ95Ь, которые достоверно отличали АЩЖ II типа от АЩЖ I типа. Однако лишь в двух группах клеток превышение было настолько значительным, что позволяло использовать эти показатели в диагностике с наибольшей достоверностью. Превышение в 58 раз количества клеток с фенотипом р53/Кл-67 и в 23 раза клеток с фенотипом Ьс1-2/СБ95Ь в аденомах ЩЖ II типа, бесспорно, делает использование этих показателей диагностически и практически эффективными в сравнении с аналогичными показателями в АЩЖ I типа (рис. 4).

Еще одной отличительной особенностью аденом II типа следует считать характеристики повышенной плотности экспрессии практически всех белков/рецепторов на диагностически важных фенотипически определенных группах клеток в сравнении с этими же показателями плотности в тканях АЩЖ I типа. Лишь в одном случае не соблюдалось характерологическое соответствие повышенной плотности экспрессии рецепторов (белков) повышенному количеству комбинированных (сочетанных) групп клеток в аденоме II типа, выразившееся в 3-кратном достоверном снижении показателя плотности экспрессии рецептора СБ95Ь на клетках с фенотипом СБ95/СВ95Ь в сравнении с АЩЖ I типа.

Были проанализированы расчеты критических показателей и значений диагностической эффективности для проведения дифференциальной диагностики аденом I и II типа по показателям групп клеток и плотности распределения бел-

ков/рецепторов с использованием общих и сочетанных маркеров апоптоза и пролиферации. Выявлено, что отличную диагностическую эффективность по показателям чувствительности, специфичности и точности оценки метода в 99,9% показали группы клеток с фенотипами р53/Кл-67, Ьс1-2/Кл-67 и Ьс1-2/СГ)95Ь и некоторыми показателями плотности распределения белков/рецепторов в других группах клеток.

0(F1)[A] Z0006666.LMD : FL1 ...'_ Г* ' (F1)[Aj Z0006658 LMD : FL1

tos 102-

52 1.2%

Sgi 40.74;

g 1.1*

34

57 Гк

Н(Г1)(А] Z0006669.LMD : FL1 ..... ЪЩ ^Н ' (F1)(A| /0006661 I Ml) : FL1 ...PTfNfX

Рис. 4. Гистофаммы количества р53/Кл-67- и Ьс1-2/С095Ь-клеток в различных типах аденом щитовидной железы: А - аденома I типа; Б - аденома II типа

Сравнительная характеристика общих показателей, регулирующих апоптоз и пролиферацию в «нормальных» тканях и АШЖ, выявила незначительные достоверные отличия в основном на мембранных рецепторах (СЮ95. СБ95Ь), принимающих участие в апоптозе, а также в перераспределении количества клеток с белком р53, выразившемся в снижении количества клеток р53Лт и повышении р53

bright

-позитивных клеток.

Так, количество клеток с рецепторами СБ95 у больных с аденомами ЩЖ в 3,3 раза превышало аналогичное число СБ95-позитивных клеток в морфологически не измененных тканях ЩЖ, забранных из другой доли пораженного аденомой органа. Количество клеток с фенотипом СБ95Ь в аденоматозной ткани ЩЖ превышало этот показатель в гистологически не измененных тканях на 75%. Отмечено, что при сравнимом уровне общего количества клеток с фенотипом р53+ в исследуемых тканях ЩЖ количество клеток р53<Цш достоверно снижалось в тканях с АЩЖ на 87%, а количество клеток с фенотипом р53Ьг№ в 2,8 раза достоверно резко возрастало. Такое перераспределение было характерным для АЩЖ и свидетельствовало о готовности и повышенной активности мембранных рецепторов и внутриклеточных апоптозных белков к запуску в трансформированных клетках естественного механизма программируемой клеточной гибели. Следует заметить, что в тканях АЩЖ отмечалось повышенное образование прежде всего апоптозных рецепторов и белков и практически отсутствовал достоверный рост анти-апоптозных белков.

Общие и сочетанные маркеры апоптоза и пролиферации в аденоматозных и «нормальных» тканях ЩЖ

Сравнительный анализ групп клеток и плотности распределения рецепторов/белков в/на клетках с сочетаниями маркеров апоптоза и пролиферации у пациентов, оперированных по поводу АЩЖ, в «нормальных» и патологических тканях выявил наличие четырех групп клеток с фенотипами р53/К>67, Ьс1-2/СБ95, СБ95/СБ95Ь, Ьс1-2/СБ95Ь.

Показатель количества р53/К1-67-клеток был увеличен на 77% при одновременно повышенной в 2,3 раза экспрессии белка р53 в р53/Кь67-позитивных клетках в тканях АЩЖ. Наиболее значительным ростом (в 3,5 раза) был отмечен уровень количества клеток с фенотипом Ьс1-2/СЭ95 в аденоматозной ткани ЩЖ. Почти в 2 раза выявлено увеличение количества клеток с фенотипами СБ95/СБ95Ь, Ьс1-2/СБ95Ь в тканях АЩЖ по сравнению с «нормальной» морфологически не измененной тканью.

Была изучена диагностическая эффективность при дифференциальной диагностике «нормальной» и патологической ткани ЩЖ у больных с аденомами.

Наиболее значимыми среди изученных показателей по критериям диагностической информативности являются показатели общего количества клеток с фенотипами СБ95+, р53(1ип+; среди сочетанных маркеров - группа клеток с феноти-

пом Ьс1-2/С095Ь (чувствительность - 83,3%, специфичность - 99,9%, точность метода-91,6%).

Урокиназные и тканевые протеазы в тканях ЩЖ

Нами изучались также процессы инвазии и метастазирования злокачественных и доброкачественных новообразований по некоторым компонентам системы фибринолиза.

Изучены урокиназные и тканевые протеазы и их ингибитор у больных раками ЩЖ в зависимости от стадии заболевания и вовлеченности в процесс лимфатических узлов. Величина активатора плазминогена урокиназного типа увеличивалась по мере развития злокачественного процесса, начиная со II стадии заболевания и по мере вовлеченности в процесс лимфатических узлов. Отмечалось также линейное повышение активатора плазминогена тканевого типа у больных РЩЖ во II и IV стадии заболевания, при этом динамики по вовлеченности в процесс лимфатических узлов показателей тканевой протеазы выявлено не было. В результате исследования значений ингибитора плазминогена 1-го типа выявлено, что наиболее высокое значение этого показателя было обнаружено в III стадии заболевания РЩЖ и при вовлечении в процесс лимфатических узлов. Все это могло свидетельствовать о влиянии повышенной концентрации РА1-1 на подавление активности онкосупрессора р53 и торможение процессов апоптоза.

Мутации гена р53 в тканях ЩЖ

В патогенезе развития и прогнозе злокачественных и доброкачественных новообразований ЩЖ в подтверждение генетически детерминированной гипотезы развития опухолевого процесса в организме, наверное, главную роль играют поломки в генетическом аппарате клеток.

Нами исследованы мутации гена р53 в целях изучения степени его влияния на нарушения процессов пролиферации и апоптоза в тиреоцитах. Выявлено, что мутации гена встречаются у больных с аутоиммунными заболеваниями ЩЖ в 7,15% случаев, с доброкачественными новообразованиями - в 9,09% случаев и со злокачественными новообразованиями—в 19,2% случаев. Общий процент выявления мутации гена р53 у исследуемых больных с заболеваниями ЩЖ составил 10,9.

Изучена частота встречаемости мутации гена р53 в тканях, взятых из разных участков ЩЖ при доброкачественных и злокачественных новообразованиях. Так, у больных с папиллярными раками ЩЖ выявлено в 12,5% случаев наличие мутации гена р53 в «нормальной» морфологически не измененной ткани ЩЖ. А у

больных с доброкачественными новообразованиями выявлен один образец «нормальной» ткани, где была обнаружена мутация гена р53, которая встретилась в том же образце, где была выявлена мутация гена р53 в АЩЖ.

В заключение хочется отметить, что выполнено обширное комплексное исследование иммунной системы, цитокинов и молекул адгезии, РАБ-Ь на иммуно-компетентных клетках крови, а также определены общие и сочетанные показатели апоптоза и пролиферации в тканях ЩЖ, компонентов системы фибринолиза, проведены исследования генетического дефекта гена р53 при аутоиммунных, доброкачественных и злокачественных заболеваниях ЩЖ.

Проведенные исследования позволили расширить наши познания о процессах в иммунной системе, в механизмах пролиферации и апоптоза тиреоцитов для более полного понимания патогенеза и прогноза развития прежде всего опухолевого и аутоиммунного процессов, а также использования в диагностической практике новых молекулярно-биологических маркеров.

ВЫВОДЫ

1. Комплексный анализ некоторых параметров иммунной системы у больных с аутоиммунными, доброкачественными и злокачественными заболеваниями щитовидной железы позволяет установить, что у разных групп пациентов имели место свои нарушения показателей иммунитета, выражавшиеся у больных с аутоиммунными расстройствами развитием аутоиммунного состояния с наличием повышенных концентраций антител к тиреопероксидазе (микросомальной фракции) и тиреоглобулину, а у больных с доброкачественными и злокачественными новообразованиями — иммунодефицитного состояния.

2. Результаты исследования цитокинов, хемокина и молекул межклеточной адгезии, соотношений цитокинов у больных с аутоиммунными заболеваниями, доброкачественными и злокачественными новообразованиями позволяют использовать их в дополнительной дифференциальной диагностике этих нозологических форм.

3. Исследования экспрессии РАЯ-Ь-рецепторов на иммунокомпетентных клетках основных хелперных и эффекторных субпопуляциях лимфоцитов у больных со злокачественными новообразованиями щитовидной железы выявили наличие повышенного количества лимфоцитов с БАБ-Ь, а также установили присутствие повышенного (в 100-70 раз) количества клеток с РАБ-Ь на основных (хелпер-

ных, эффекторных) субпопуляциях лимфоцитов, что является косвенным признаком противоопухолевой активности иммунной системы.

4. При анализе основных и сочетанных показателей апоптоза и пролиферации в тканях щитовидной железы у больных с аутоиммунными, доброкачественными и злокачественными новообразованиями выявлены фенотипические особенности количественного состава клеток ткани ЩЖ. При АИЗЩЖ по сравнению с новообразованиями ЩЖ отмечается наличие повышенного содержания количества клеток с РАБ-рецептором, РАБ-Ь-рецептором, маркером пролиферации Кл-67, 3-5-кратное увеличение клеток позитивных по белку Ьс1-2Ьп8Ь', наиболее выраженное 25-кратное увеличение Ьс1-2/СВ95 клеток. У больных с АЩЖ по сравнению с РЩЖ отмечается наличие повышенного содержания количества клеток с белком р53ЫеМ, Ю-67, увеличение клеток, несущих сочетанные маркеры р53/СБ95Ь. У больных с РЩЖ отмечается наличие повышенного содержания клеток с белком р53<Ьп, минимальными значениями клеток с маркерами пролиферации и апоптоза - Кь67, Р53ы®ь',Ьс1-2,Ьс1-2М8М.

5. Проведенные исследования фенотипа клеток в тканях щитовидной железы у больных с ненаследственными формами рака (папиллярный, фолликулярный) щитовидной железы выявили характерные различия в фенотипах общих и (СБ95Ь) и сочетанных (Ьс1-2/С095Ь) показателей и на их основе позволили классифицировать исследуемые варианты рака щитовидной железы. В дополнительной дифференциальной диагностике фолликулярного и папиллярного вариантов рака определяющее значение имеет показатель количества клеток с СБ95Ь, который при значениях более 20,64% с достоверностью (р=0,002) и диагностической эффективностью в 99,9% свидетельствовал о наличии фолликулярного рака щитовидной железы.

6. Выявлена группа аденом (аденомы II типа), значительно отличающихся по своим фенотипическим характеристикам, которая характеризовалась повышенным содержанием в суспензии клеток ткани ЩЖ маркеров пролиферации Кл-67 и рецепторов с СБ95Ь, имела более выраженные изменения по количественному составу клеток с р53 и Ьс1-2-белками в р53, р53ЬпеМ, Ьс1-2, Ьс1-2Ьп8Ь'-позитивных клетках и повышенной плотности распределения этих белков в р53Ьп8Ь\ Ьс1-2ЬпЕЬ1-клетках, а также большого количества клеток с сочетанными маркерами р53/Кл-67, Ьс1-2/Кл-67, СБ95/Ю-67, Ьс1-2/СБ95Ь. Все это может свидетельствовать о неблагоприятном прогнозе развития заболевания. В диагностическом плане для выявления аденом II типа нужно использовать показатели количества клеток р53/Кл-67, при

значениях которых более 30,89% с достоверностью (р=0,002) и диагностической эффективностью в 99,9% выявляются аденомы II типа.

7. Сравнительные исследования общих и сочетанных показателей апоптоза и пролиферации в морфологически не измененных и опухолевых тканях у больных с аденомами и раками щитовидной железы, взятых из одной железы, выявили наличие минимальных различий у больных со злокачественными новообразованиями и более выраженных изменений у больных с доброкачественными новообразованиями. Все это свидетельствовало о развитии на молекулярном (клеточном и внутриклеточном) уровне уже начавшихся процессов опухолевой трансформации в визуально и микроскопически не измененных тканях пораженной новообразованием щитовидной железы.

8. Уровень активатора плазминогена урокиназного типа (иРА) прогрессивно возрастает с увеличением стадии заболевания, размера опухоли и наличия регионарных метастазов. Не обнаружено четкой взаимосвязи содержания uPA, tPA и PAI-1 в злокачественных опухолях щитовидной железы со степенью дифференци-ровки и типом роста опухолевого процесса.

9. Выявлена частота мутации р53 у больных папиллярным раком ЩЖ -20,8%, аденомой - 9,1 %, аутоиммунными тиреоидитами - 7,1 %. Такая частота позволяет выполнять исследование на предмет выявления данной мутации для возможности начать противораковые мероприятия на ранних этапах развития патологического процесса в щитовидной железе.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для улучшения дифференциальной диагностики аутоиммунных, доброкачественных и злокачественных заболеваний щитовидной железы должны учитываться особенности нарушения иммунной системы, показателей цитокинов и иных параметров, характеризующих состояние иммунитета.

2. С высокой диагностической эффективностью рекомендуется использовать в дифференциальной диагностике злокачественных и аутоиммунных заболеваний показатели ИЛ-10 (значения более 13,94 пг/мл), sE-selectin (значения более 45,12 пг/мл), МСР-1 (значения более 170,58 пг/мл), индекс у-ИНФ/ИЛ-10 (значения менее 32,74), доброкачественных и аутоиммунных заболеваний -показатели ИЛ-6 (значения менее 18,57 пг/мл), sICAM-1 (значения более 304,48 пг/мл), ИЛ-10

(значения более 15,94 пг/мл), индексы ИЛ-6/у-ИНФ (значения менее 256,07), у-ИНФ/ИЛ-4 (значения более 10,09), у-ИНФ/ИЛ-10 (значения менее 48,18), злокачественных и доброкачественных новообразований - показатели ИЛ-6 (значения более 18,16 пг/мл), 5Е-5е1есип (значения более 56,39 пг/мл), индекс ИЛ-6/у-ИНФ (значения более 421,32).

3. Для улучшения диагностической эффективности разработана логистическая регрессивная модель диагностики рака щитовидной железы у больных с новообразованиями (доброкачественными и злокачественными) ЩЖ, основанная на совместном использовании показателей ИЛ-6, вЕ-Бексйп и индекса ИЛ-6/у-ИНФ, обладающая более высокой достоверностью и точностью в отношении дифференцированных ненаследственных форм раков щитовидной железы.

4. Рассчитаны пороговые значения для общих и сочетанных показателей апоптоза и пролиферации, которые могут быть использованы в дифференциальной диагностике этих патологий. Предложено их использовать в диагностической практике «нормальной» ткани ЩЖ, ткани больных аутоиммуными, доброкачественными и злокачественными заболеваниями щитовидной железы и в дифференциальной диагностике ткани исследуемых патологий ЩЖ, а также при мониторинге терапии и в перспективе для иных видов «таргетной» лекарственной терапии, в механизме действия которых мишенями являются пролиферативные и апоптозные белки.

5. Исследованные фенотипические особенности рецепторных и белковых маркеров, участвующих в регуляции апоптоза (СБ95Ь и Ьс1-2/СБ95Ь), в суспензии клеток при папиллярных и фолликулярных раках щитовидной железы, позволяют использовать с высокой эффективностью полученные их пороговые значения для улучшения дифференциальной диагностики на доклиническом этапе обследования пациента.

6. Оценка белков и рецепторов, участвующих в регуляции апоптоза и пролиферации, методом проточной цитометрии (Кл-67, СШ5Ь, р53 (р53Ьп^1), Ьс1-2 (Ьс1-2ЫвЬ), р53/Кл-67, Ьс1-2/К]-67, СШ5/К-67, Ьс1-2/СБ95Ц в группе больных АЩЖ позволяет диагностировать аденомы, фенотипически отличные от основного типа аденом, - АЩЖ II типа. Выявленные особенности аденомы II типа характеризуют неблагоприятный прогноз развития патологического процесса и требуют последующего изучения вопроса о разработке новых подходов к терапии пациентов с данной фенотипической формой аденомы ЩЖ.

7. Наличие, по данным общих и сочетанных показателей апоптоза и пролиферации, у больных раком щитовидной железы в морфологически и патологически визуально не измененной ткани щитовидной железы практически похожих феноти-пических изменений в тканях, где этот процесс визуализируется морфологами, позволяет рекомендовать онкологам выполнять операции по полному удалению органа и отказаться от использования таких органосохраняющих (паллиативных) оперативных вмешательств, как гемитомия, секторальная резекция щитовидной железы.

8. В целях дополнительной дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований рекомендуется использовать в практике пороговых значений показатели активаторов плазминогена урокиназного и тканевого типа и их ингибиторы.

9. Проведение исследований на выявление мутаций в гене р53 в ненаследственных раках щитовидной железы позволяет на более ранних стадиях выявлять начало опухолевого процесса и своевременно начинать проведение терапии, что в конечном итоге будет положительно отражаться на более благоприятном прогнозе заболевания.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Казаков С.П. ДНК-диагностика в клинической лабораторной практике. Харьков: Аналитика, 1999.25 с.

2. Владимиров В.Г., Карпищенко А.И., Скворцов C.B., Казаков С.П., Шарова Л.А., Трофимов Д.Ю., Мальков И.Г. Молекулярно-биологические методы исследований в клинической лабораторной практике // В кн.: Медицинские лабораторные технологии - программы и алгоритмы / Под ред. А.И. Карпищенко. СПб, 1999. Т. 2. С. 579-602.

3. Казаков С.П., Скворцов C.B., Изгородин A.C., Лешкина Г.В., Кушлин-ский Н.Е. Биохимические и иммунологические показатели в оценке аутоиммунных и гормональных нарушений у больных злокачественными и доброкачественными новообразованиями щитовидной железы // Клин. лаб. диагн. 2000. № 9. С. 4.

4. Скворцов C.B., Казаков С.П. Полимеразная цепная реакция в клинико-диагностической практике многопрофильных лечебных учреждений: Методические рекомендации. М.: ГВКГ им. H.H. Бурденко, 2000. 50 с.

5. Кушлинский Н.Е., Казанцева И.А., Герштейн Е.С., Харитиди Т.Ю., Лякина Л.Т., Богатырев О.П., Казаков С.П., Смирнов В.В., Карпищенков В.И., Калинин А.П. Сравнительный анализ уровня активаторов плазминогена урокиназного и тканевого типа и их ингибитора при заболеваниях щитовидной железы // Матер.

науч.-практ. конф.: Современные подходы к диагностике и лечению злокачественных новообразований. М.: ГВКГ им. H.H. Бурденко, 2000. С. 61-62.

6. Кушлинский Н.Б., Герштейн Е.С., Казанцева И.А., Харитиди Т.Ю., Казаков С.П., Лякина Л.Т., Богатырев О.П., Калинин А.П. Активаторы плазми-ногена урокиназного и тканевого типа и их ингибитор (PAI-1) в цитозольной фракции при заболеваниях щитовидной железы // Вестн. АМН. 2001. № 5. С. 32-34.

7. Казаков С.П., Харидити Т.Ю., Кибалко Е.И., Казанцева И.А., Кушлинский Н.Е. Динамика изменения количества сериновых протеаз и их ингибитора при злокачественных новообразованиях щитовидной железы // Матер, юбил. науч.-практ. конф.: Современная специализированная амбулаторно-поликлиническая помощь в Московском регионе. М.: 9 Поликлиника Московского гарнизона МВО МО РФ, 2001. С. 60-62.

8. Казаков С.П., Харидити Т.Ю., Казанцева И. А., Кушлинский Н.Е. Сериновые протеазы при доброкачественных и неонкологических заболеваниях щитовидной железы // Матер, науч.-практ. конф.: Клиническая и экономическая эффективность современных медицинских технологий, методов диагностики и лечения. М.: ГВКГ им. H.H. Бурденко, 2001. С.107.

9. Харитиди Т.Ю., Казанцева И.А., Герштейн Е.С., Казаков С.П., Смирнов

B.В., Карпищенко А.И., Калинин А.П., Кушлинский Н.Е. Активаторы плазминогена урокиназного (иРА) и тканевого (tPA) типа и их ингибитор (PAI-1) при заболеваниях щитовидной железы // Матер, всерос. науч. конф.: Биохимия - медицине. СПб, 2002.

C. 93-94.

10. Владимиров В.Г., Карпищенко А.И., Скворцов C.B., Казаков С.П., Шарова Л.А., Трофимов Д.Ю., Мальков И.Г. Молекулярно-биологические методы исследований в клинической лабораторной практике // В кн.: Медицинские лабораторные технологии - программы и алгоритмы / Под ред. А.И. Карпищенко. СПб, 2002. Т. 2. С. 533-555.

11. Казаков С.П., Харидити Т.Ю. Динамика уровней ингибитора и активаторов плазминогена урокиназного и тканевого типа при новообразованиях щитовидной железы // Матер, юбил. науч.-практ. конф.: Актуальные вопросы клинической и военно-морской медицины. Московская область, г. Железнодорожный, п/о Купавна: 32 ЦВМКГ, 2003. С. 92-94.

12. Казаков С.П., Харидити Т.Ю., Кушлинский Н.Е. Изменение уровней ингибитора и активаторов плазминогена урокиназного и тканевого типа при злокачественных и доброкачественных опухолях щитовидной железы // Матер, науч.-практ. конф.: Комбинированная и сочетанная патология: проблемы диагностики и лечения. М.: ГВКГ им. H.H. Бурденко, 2003. С. 183-184.

13. Казаков С.П., Кушлинский Н.Е. Оценка некоторых иммунологических и биохимических показателей у больных с онкологическими и аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы // Матер, науч.-практ. конф.: Комбинированная и сочетанная патология: проблемы диагностики и лечения. М.: ГВКГ им. H.H. Бурденко, 2003. С. 181-183.

14. Казаков С.П., Кушлинский Н.Е. Частота мутаций гена р53 в тканях солидных опухолей при злокачественных и доброкачественных новообразованиях щито-

видной железы // Матер, науч.-практ. конф.: Комбинированная и сочетанная патология: проблемы диагностики и лечения. М.: ГВКГ им. H.H. Бурденко, 2003. С. 180-181.

15. Казаков С.П., Скворцов C.B., Сухоруков A.JL, Кушлинский Н.Е. Динамика цитокинов у больных с онкологическими и аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы // Матер. 3-го съезда онкологов СНГ. Минск, 2004. Ч. 2. С. 28.

16. Казаков С.П., Федосюк А.М., Анфилов C.B., Коржиков A.B., Лапшин И.М., Кушлинский Н.Е. Изучение экспрессии маркеров CD95, р53, bcl-2 и Ki-67 у больных аутоиммунной патологией и новообразованиями щитовидной железы // Мед. иммунол. 2004. № 3-5. С. 296-297.

17. Казаков С.П., Кушлинский Н.Е. Исследование сочетанных параметров апоптоза и пролиферации в тканях щитовидной железы у больных с доброкачественными и злокачественными новообразованиями // Мед. иммунол. 2004. № 3-5. С. 362-363.

18. Казаков С.П., Кушлинский Н.Е. Исследования комбинационных параметров пролиферации и апоптоза в тканях больных с новообразованиями щитовидной железы // Клин. лаб. диагн. 2004. № 9. С. 8.

19. Казаков С.П., Скворцов C.B., Сухоруков А.Л., Кушлинский Н.Е. Оценка иммунологической реактивности больных с онкологическими и аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы // Матер. 3-го съезда онкологов СНГ. Минск, 2004. Ч. 2. С. 27,28.

20. Казаков С.П., Кушлинский Н.Е. Оценка маркеров FAS-системы, пролиферации и апоптоза у больных аутоиммунными и онкологическими заболеваниями щитовидной железы // Клин. лаб. диагн. 2004. № 9. С. 8-9.

21. Шебанкова В.Н., Казаков С.П., Сухоруков А.Л., Скворцов C.B., Кушлинский Н.Е. Сравнительная харакгеритика интерлейкинов IL-1-ß, IL-6, IL-10 и TNF-a у больных с новообразованиями и аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы // Мед. иммунол. 2004. № 3-5. С. 371.

22. Казаков С.П., Сандыбаев М.Н., Казанцева И.А., Джабаров А.К., Кушлинский Н.Е. Сравнительный анализ содержания интерлейкинов (ИЛ-1-ß, ИЛ-6, ИЛ-10) в плазме крови больных аутоиммунным тиреоидитом, аденомой и раком щитовидной железы // Матер. 3-го Всерос. тиреоидол. конгр.: Диагностика и лечение узлового зоба. М„ 2004. С. 152-153.

23. Kazakov S.P., Kushlinsky N. Ye. Cytokin's level IL-1 ß, IL-6, IL-10 and TNF-a from patients with autoimmune and oncology thyroid diseases // «Cytokines in Cancer and Immunity» - Tenth Joint Meeting of the International Cytokine Society (ICS) and the International Society for Interferon and Cytokine Research (ISICR). San Juan, Puerto Rico. October 21-25,2004. P. 322.

24. Казаков С.П., Скворцов C.B., Шебанкова В.Н., Сухоруков А.Л., Кушлинский Н.Е. Динамика интерлейкинов IL-lß, IL-6, IL-10 и TNF-a у больных с онкологической и аутоиммунной патологией щитовидной железы // Матер, науч.-практ. конф.: Актуальные проблемы клинической онкологии. М.: ГВКГ им. H.H. Бурденко, 2005. С. 33-34.

25. Казаков С.П., Серяков А.П., Харидити Т.Ю., Кушлинский Н.Е. Изменение уровней ингибитора и активаторов плазминогена урокиназного и тканевого типа при злокачественных и доброкачественных опухолях щитовидной железы // Матер. VI Всерос. съезда онкол.: Современные технологии в онкологии. Ростов-на-Дону, 2005. Т. 2. С. 39-40.

26. Казаков С.П., Кушлинский Н.Е., Сандыбаев М.Н., Казанцева И.А. Иммунологическая реактивность больных раком и аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы //Матер. XII Рос. нац. конгр.: Человек и лекарство. М., 2005. С. 130-131.

27. Казаков С.П., Серяков А.П., Сухоруков A.JL, Кушлинский Н.Е. Мутации гена р53 в тканях щитовидной железы при злокачественных и доброкачественных новообразованиях // Матер. VI Всерос. съезда онкол.: Современные технологии в онкологии. Ростов-на-Дону, 2005. Т. 2. С. 38-39.

28. Казаков С.П., Анфилов С.В., Лапшин И.М., Федосюк A.M., Кушлинский Н.Е. Сочетанные параметры апаптоза и пролиферации в тканях щитовидной железы у больных с онкопатологией // Матер, науч.-практ. конф.: Актуальные проблемы клинической онкологии. М.: ГВКГ им. Н.Н. Бурденко, 2005. С. 31-33.

29. Казаков С.П., Серяков А.П., Сухоруков A.JL, Кушлинский Н.Е. Уровень цитокинов у больных с онкологическими и аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы // Матер. VI Всерос. съезда онкол.: Современные технологии в онкологии. Ростов-на-Дону, 2005. Т. 2. С. 40-41.

30. Казаков С.П., Федосюк A.M., Анфилов С.В., Лапшин И.М., Кушлинский Н.Е. Экспрессия маркеров CD95, р53, bcl-2 и Ki-67 у больных с аутоиммунной и онкологической патологией щитовидной железы // Матер, науч.-практ. конф.: Актуальные проблемы клинической онкологии. М.: ГВКГ им. Н.Н. Бурденко, 2005. С. 34-35.

31. Казаков С.П., Кушлинский Н.Е., Сандыбаев М.Н., Казанцева И.А. Экспрессия некоторых маркеров апоптоза и пролиферации при раке и аденоме щитовидной железы // Матер. XII Рос. нац. конгр.: Человек и лекарство. М., 2005. С. 130.

32. Kazakov S.P., Kushlinsky N.Ye. Main parametrs expression of apoptosis and prolifiration in oncology thyroid diseases // First Joint Meeting of European National Societies of Immunology Under the auspices of EFIS and 16th European Congress of Immunology - ECI - September 6-9,2006. Paris, France. P. 547.

33. Kazakov S.P., Kushlinsky N.Ye. The investigation of CD 95, p53, bcl-2 and Ki-67 markers in autoimmune thyroid pathology patients // First Joint Meeting of European National Societies of Immunology Under the auspices of EFIS and 16th European Congress of Immunology - ECI - September 6-9,2006. Paris, France. P. 547.

34. Kazakov S.P., Kushlinsky N.Ye. Some well-known parametrs expression of apoptosis in thyroid cancer // 17th IFCC - FESCC European Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 60th National Congress of the Netherlands Society for Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (NVKC), 3-7 June 2007, Amsterdam / Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 2007. Vol. 45 (special Suppl.). P. S326.

35. Kazakov S.P., Kushlinsky N.Ye. Apoptosis and proliferation markers in thyroid tissue of oncology patients // IFCC - WorldLab Fortaleza 2008,28 Sep-2 Oct 2008, Brasil / Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 2008. Vol. 46 (special Suppl.). P. S404-405.

36. Казаков С.П. Исследование динамики цитокинов, молекул адгезии и их соотношения в диагностике аутоиммунных заболеваний, злокачественных и доброкачественных новообразований щитовидной железы // Мед. иммунол. 2009. № 4-5. С. 367-368.

37. Казаков С.П., Заботина Т.Н., Кушлинский Н.Е. Роль тканевых маркеров апоптоза и пролиферации в дополнительной дифференциальной диагностике папиллярного и фолликулярного рака щитовидной железы // Воен.-мед. журн. 2010. № 7. С. 48-50.

38. Казаков С.П. Исследование основных тканевых маркеров апоптоза и пролиферации, их диагностической эффективности при заболеваниях щитовидной железы // Воен.-мед. журн. 2010. № 9. С.73-77.

39. Казаков С.П., Заботина Т.Н., Короткова О.В., Джабаров А.К., Казанцева И.А. Сравнительный анализ клеток с комбинированными маркерами апоптоза и пролиферации в образцах тканей щитовидной железы при раках, аденомах и аутоиммунных заболеваниях // Бюл. экспер. биол. и мед. 2010. Т. 150, № 10. С. 427-432.

40. Казаков С.П., Заботина Т.Н., Зеленский A.A., Попова A.C., Кушлинский Н.Е. FAS-L на основных субпопуляциях лимфоцитов и показатели диагностической эффективности у больных папиллярным раком щитовидной железы// Воен.-мед. журн. 2010. № 10. С.73-75.

41. Казаков С.П. Уровень цитокинов, молекул межклеточной адгезии в плазме крови и их диагностическая эффективность при аутоиммунных и онкологических заболеваниях щитовидной железы // Мед. иммунол. 2010. Т. 12, № 6. С. 559-564.

42. Казаков С.П., Заботина Т.Н., Кушлинский Н.Е. Сравнительный анализ клеток с тканевыми общими маркерами, участвующими в регуляции апоптоза и пролиферации, их диагностическая эффективность у больных фолликулярными аденомами щитовидной железы // Вестн. нац. мед.-хир. Центра им. Н.И. Пирогова. 2010. Т. 5, № 4. С. 44-49.

43. Казаков С.П., Заботина Т.Н., Кушлинский Н.Е. Соотношения (индексы) цитокинов, молекул межклеточной адгезии в плазме крови и их диагностическая эффективность у больных с аутоиммунными тиреоидитами, аденомами и раком щитовидной железы // Мед. вестн. МВД. 2010. Т. 49, № 6. С.91-95.

44. Цыган В.Н., Казаков С.П., Заботина Т.Н., Кушлинский Н.Е. Маркеры апоптоза и пролиферации у больных с онкологическими и аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы (обзор литературы) // Вестн. Рос. воен.-мед. акад. 2010. № 4.- С.115-119.

45. Казаков С.П., Заботина Т.Н., Кушлинский Н.Е. Тканевые маркеры (общие и комбинированные) апоптоза и пролиферации при фолликулярном и папиллярном раке щитовидной железы. // Матер. Всерос. юбил. науч.-практ. конф., посвященная 200-летию со дня рождения Н.И.Пирогова: Комбинированная и сочетанная патология: проблемы диагностики и лечения в условиях крупных военных лечебных объединений. М.: ГВКГ им. H.H. Бурденко, 2010. С. 25-27.

Подписано в печать 11.11.2010. Формат 21x29,7. Бумага "Tum Lux". Ризография Тираж 100 экз. Зак. 178 Отпечатано в типографии ГВКГ им. H.H. Бурденко 105229, Москва, Госпитальная пл., 3

Несмотря на относительно скромное место (1-3%) в структуре злокачественных опухолей, проблема рака щитовидной железы (РЩЖ) в последние десятилетия серьезно волнует ученых и врачей из различных областей медицины [8, 9, 20, 34, 35, 36, 39, 44, 76, 315]. Это во многом связано с крайне быстрым ростом заболевания среди лиц молодого и среднего возраста [20, 35, 170]. По данным большинства исследователей, рост заболеваемости наблюдается в индустриально развитых странах и связан в первую очередь с увеличением радиационного воздействия [16, 19, 36, 170, 326, 337]. Сравнительно небольшие размеры органа и пошаговая прогрессия от гиперплазии до опухолевого узла, дифференциации и развития анапластической карциномы делают изучение опухолевого канцерогенеза и оценки иммунопа-тогенеза в этом достаточно обособленном органе удобным и оптимальным [128, 297].

Основную надзорную функцию за опухолевой прогрессией несет в организме иммунная система, крайне важной задачей которой является сохранение неизменным антигенного гомеостаза жидкостей и тканей организма [33, 98, 253]. Имеющиеся данные о патогенезе противоопухолевого иммунитета малочисленны и подчас противоречивы [41, 101]. В защите от опухолевых клеток главным образом участвуют клеточные факторы иммунитета (естественные киллерные клетки, натуральные киллерные Т-клетки (TNK), цитотоксические Т-лимфоциты, макрофаги и моноциты, эозинофи-лы), оказывающие презентирующее, цитостатическое и цитолитическое действие [52, 98]. Роль и функциональные особенности поведения этих иммуно-компетентных клеток при опухолях и аутоиммунных заболеваниях щитовидной железы (АИЗЩЖ) изучены крайне мало, а сведения о патогенетических механизмах взаимодействия между собой очень противоречивы [250, 344]. Регуляция в организме характера и напряженности антигенспецифических

11 , , << ( ; иммунных реакций осуществляется при непосредственном участии цитоки-нов, с использованием механизмов аутокрийной и паракрийной регуляции [48, 111]. Наряду с регуляцией иммунного ответа цитокины участвуют не только как позитивные регуляторы клеточной пролиферации, они также могут контролировать аномальный клеточный рост, индуцируя дифференци-ровку и подавляя процессы опухолевой трансформации клеток [4, 48, 263, 264]. Поэтому исследование динамики цитокинов представляется достаточно актуальной задачей.

Известно, что инвазия и злокачественный рост опухоли обусловлены не только высоким уровнем пролиферации клеток, но и недостаточной активностью апоптоза или сочетанием этих двух факторов [5, 60]. Это является следствием нарушения экспрессии в клетках одного или нескольких нормальных генов пролиферации и дифференцировки так называемых протоонкогенов [50, 78, 116]. Наиболее известные из них — это ген, запускающий апоптотиче-скую гибель генетически измененных клеток на определенной фазе клеточного цикла — ген р53, и семейство генов, ингибирующих апоптоз, — онкогены семейства bcl-2 - bcl-2, Вах, Bag 3, bcl-xl, Bad и др. [35, 52, 56, 163]. Мутации в гене р53 и его регуляторах являются достаточно широко распространенными и встречаются у онкологических больных с опухолями щитовидной железы (ЩЖ) в 3-67% случаев [10, 70, 107]. Недостаточно исследованы мутации этого гена у больных со злокачественными, доброкачественными и аутоиммунными заболеваниями ЩЖ. Неясна степень распространения этих мутаций в пораженных патологическим процессом тканях ЩЖ и неизменной ткани в других долях железы [70]. Исследования взаимоотношений между различными параметрами апоптоза и пролиферации в ЩЖ малочисленны и подчас носят неопределенный характер [65, 70, 97]. Оценка апоптотического индекса, различных параметров, регулирующих апоптоз, и их взаимоотношений между собой (белка р53 и его мутаций, bcl-2, FAS-системы) и с показателями пролиферации (Ki-67) при переходе от доброкачественного процесса к злокачественному и роль в этом процессе аутоиммунных заболеваний

1 1 расстройств)-являются важной'проблемой, требующей своего решения. [59, 97, 151, 152, 297].

Большое значение имеет степень васкуляризации опухолей и кровоснабжения при онкологических процессах. Одним из основных механизмов инвазии злокачественных опухолей является нарушение окружающей базальной мембраны и внеклеточного матрикса ассоциированными с опухолями протеазами [105, 237]. Решающую роль в процессе инвазии и метаста-зирования среди четырех основных классов протеаз играют сериновые про-теазы. Их роль в регуляции межклеточного протеолиза в различных физиологических и патологических процессах: деструкции ткани и миграции клеток, воспалительные реакции, инвазивный рост трофобласта и опухолевых клеток — изучена недостаточно. Большую роль в этом процессе отводят активаторам и ингибиторам плазминогена урокиназного и тканевого типа [59, 169]. Их взаимосвязь между собой может оказаться полезной для понимания процессов повышенной реваскуляризации при онкологических и неонкологических процессах в тканях ЩЖ.

Несмотря на однозначный характер зависимостей апоптоза и пролиферации, необходимо выяснение взаимосвязи между ними для поиска дополнительных диагностических и прогностических критериев, обсуждения вопросов эффективности проводимой терапии. В целом, мутации в генах, в частности в гене р53, которые прямо или косвенно приводят к снижению апоптоза, в основном связаны с плохим прогнозом в отношении целого спектра опухолей [35].

Таким образом, исследование механизмов функционирования иммунной системы, роли маркеров, регулирующих апоптоз и пролиферацию, онкогенов и антионкогенов их мутации, а также оценка роли сериновых протеаз в васкуляризации новообразований при опухолевых и аутоиммунных процессах в ЩЖ являются крайне актуальными проблемами.

Цель> работы: комплексное изучение основных иммунологических показателей, цитокинов и молекул межклеточной адгезии, молекулярно-биологических и генетических маркеров, регулирующих апоптоз и пролиферацию, а также некоторых компонентов системы фибринолиза в патогенезе, улучшении диагностики и прогнозе заболеваний щитовидной железы.

Задачи исследования:

1. Провести комплексную оценку состояния некоторых параметров иммунной системы у больных со злокачественными, доброкачественными и аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы и исследовать характерные особенности вариантов иммунных нарушений, встречающихся в каждой патологии.

2. Провести исследование цитокинов, хемокина, молекул межклеточной адгезии у больных с аутоиммунными, доброкачественными и злокачественными заболеваниями щитовидной железы.

3. Изучить экспрессию БАЗ-Ь на хелперных и эффекторных иммуно-компетентных клетках крови у больных со злокачественными новообразованиями щитовидной железы.

4. Оценить молекулярно-биологические (основные, сочетанные) маркеры, регулирующие апоптоз и пролиферацию, в тканях щитовидной железы при аутоиммунных, доброкачественных и злокачественных заболеваниях щитовидной железы.

5. Исследовать возможные механизмы повреждений процессов апоп-тоза и пролиферативную активность у больных с основными формами ненаследственных (папиллярных и фолликулярных) раков щитовидной железы.

6. Определить фенотипические особенности доброкачественных новообразований щитовидной железы и охарактеризовать возможный прогноз развития аденом по данным маркеров апоптоза и пролиферации.

7. Оценить развитие процесса опухолевой трансформации, используя основные и сочетанные показатели клеток с белками, регулирующими апоптоз > и, пролиферацию; в морфологически не> измененных тканях; при раках и аденомах щитовидной железы.

8. Количественно определить, сопоставить и оценить взаимосвязь основных компонентов активаторов плазминогена урокиназного (иРА) и тканевого ОРА) типа, а также их ингибитора (РА1-1) в цитозолях тканей злокачественных и доброкачественных опухолей щитовидной железы с учетом основных клинических и морфологических характеристик заболевания.

9. Оценить значение и рассчитать частоту встречаемости мутаций гена р53 при доброкачественных и злокачественных новообразованиях и аутоиммунных заболеваниях щитовидной железы, проанализировать частоту мутаций в тканях щитовидной железы, не пораженных опухолевым процессом.

Научная новизна

1. Полученные комплексные данные об иммунной системе организма у больных с аутоиммунными, доброкачественными и злокачественными заболеваниями щитовидной железы позволили раскрыть основные патогенетические механизмы и особенности иммунного ответа, сопровождающие изучаемые патологические процессы.

2. В работе представлены сравнительные данные одновременного исследования цитокинов, хемокина и молекул межклеточной адгезии, разработаны наиболее оптимальные соотношения (индексы) цитокинов.

3. Установлено, что в патогенезе заболеваний щитовидной железы некоторые цитокины играли ключевую роль и не могли быть использованы для диагностики в других исследуемых группах. Так, при раке щитовидной железы определяющее значение играла растворимая форма молекулы адгезии эЕ-БеЬсйп, в патогенезе аденомы щитовидной железы растворимая форма молекул межклеточной адгезии 1-го типа - 51САМ-1, а в патогенезе аутоиммунных заболеваний - интерлейкин-4.

4'. Получены новые данные о количественном г содержании на мембранах иммуннокомпетентных клеток рецепторов инициации апоптоза ТОТ-семейства (РАЭ-Ь) в хелперных и эффекторных субпопуляциях лимфоцитов периферической крови у практически здоровых пациентов и больных папиллярным раком щитовидной железы.

5. В работе впервые комплексно определена взаимосвязь между основными маркерами апоптоза и пролиферации (СЭ95, С095Ь, р53 (р53иш1, р53ЬНеЬ1), Ьс1-2 (Ьс1-2Шт, Ьс1-2Ьг№), Кл-67) в патологически измененных тканях щитовидной железы у больных с аутоиммунными заболеваниями, доброкачественными и злокачественными новообразованиями.

6. Описаны и использованы в дифференциальной диагностике и патогенезе новые сочетанные (комбинированные) фенотипы клеток с маркерами апоптоза и пролиферации (р53/Кл-67, р53/СБ95, Ьс1-2/Кл-67, Ьс1-2/С095, С095/Кл-67, р53/СБ95Ь, СБ95/СБ95Ь, Ьс1-2/СБ95Ь), исследованы плотности распределения (экспрессии) рецепторов/белков на поверхности и внутри изучаемых групп клеток.

7. Представлены новые данные по фенотипическим особенностям основных (СБ95Ь) и сочетанных параметров (Ьс1-2/С095Ь) клеток с использованием маркеров, регулирующих пролиферацию и апоптоз, у больных с разными вариантами (папиллярного и фолликулярного) рака щитовидной железы.

8. Впервые описаны разные варианты аденом щитовидной железы, отличающиеся по фенотипическим характеристикам основных (СЭ95Ь, р53, р53Шт, р53Ые1п, Кл-67, Ьс1-2, Ьс1-2Шт, Ьс1-2Ьп'^1) и сочетанных (р53/Кл-67 и Ьс1-2/С095Ь) параметров клеток с маркерами, участвующими в процессах апоптоза и пролиферации.

9: Представлены данные о сравнительной характеристике «нормальной», морфологически не измененной и патологической ткани щитовидной железы, подверженной доброкачественному (СБ95+, р53(11ГП+, Ьс1-2Л1Х>95Ь) и злокачественному (С095/Кь67) опухолевому процессу, у больных с аденомами и раками в этом органе.

10. Получены новые патогенетические данные по сравнительному исследованию маркеров реваскуляризации при доброкачественном и злокачественном процессе на основе анализа активаторов тканевого и урокиназно-го типа и его ингибитора у больных раками и аденомами щитовидной железы.

Практическая значимость

Комплексный подход к оценке состояния некоторых компонентов иммунной системы у больных с аутоиммунными, доброкачественными и злокачественными новообразованиями позволил составить целостное представление о механизмах нарушения в иммунной системе и способствовал разработке оптимальных диагностических критериев у данных групп пациентов.

Разработаны наиболее оптимальные соотношения (индексы) цитоки-нов, которые можно использовать для дифференциальной диагностики аутоиммунных, доброкачественных и злокачественных заболеваний щитовидной железы.

Осуществлен расчет пороговых значений и диагностических показателей чувствительности, специфичности и точности методов диагностики с использованием цитокинов, хемокина и молекул межклеточной адгезии для улучшения дифференциальной диагностики практически здоровых пациентов, больных с аутоиммунными заболеваниями, аденомами и раками щитовидной железы. Установлено, что в дифференциальной диагностике целесообразнее использовать следующие показатели: между злокачественными и аутоиммунными заболеваниями - БЕ-зеЬсйп, между доброкачественными и аутоиммунными заболеваниями - ИЛ-6 и бГСАМ- 1, между раком и аденомой щитовидной железы - индекс ИЛ-6/у-ИНФ.

Разработана логистическая регрессивная модель дифференциальной I диагностики рака щитовидной железы у больных с новообразованиями щитовидной железы на основе оценки показателей ИЛ-6, БЕ-БеЬкйп и индек са ИЛ-6/у-ИНФ. Полученные данные рекомендуются к использованию - в дополнительном исследовании для выявления рака щитовидной железы на этапе обследования больного.

Доказано, что определение показателей (количество клеток, плотность экспрессии рецепторов/белков) основных и сочетанных маркеров, регуляторов апоптоза и пролиферативной способности исследуемой суспензии клеток может служить дополнительным диагностическим и прогностическим тестом к другим основным инструментальным, лабораторным и морфологическим методам исследования для улучшения диагностики исследуемых заболеваний щитовидной железы.

Рекомендованы к использованию общие и сочетанные показатели маркеров апоптоза и пролиферации с расчетом пороговых значений величин и показателей диагностической эффективности для использования в дифференциальной диагностики аутоиммунных, доброкачественных, злокачественных заболеваний щитовидной железы (С095, СБ95Ь, р53 (р53^т, р53ыт), Ьс1-2 (Ъс\-2(Ит, Ьс1-2Ьпц1и), Кл-67 и р53/Кл-67, р53/С095, Ьс1-2/Кл-67, Ьс1-2/С095, СБ95/Кл-67, р53/СБ95Ь, СБ95/СБ95Ь, Ьс1-2/СЭ95Ь); папиллярного и фолликулярного рака щитовидной железы (СЭ95Ь и Ьс1-2/С095Ь); аденом разных типов (С095Ь, р53, р53а,т, р53Ъпф\ Кл-67, Ьс1-2, Ьс\-2йт, Ьс1-2Ьп®111 и р53/Кл-67, Ьс1-2/СЭ95Ь).

Отсутствие различий в молекулярно-биологических маркерах «нормальных», морфологически не измененных тканей и тканей, взятых из опухоли у больных папиллярным раком щитовидной железы, позволяет врачам-онкологам поставить вопрос о целесообразности полного удаления железы и рекомендовать отказываться от таких органосохраняющих хирургических методов лечения, как секторальные резекции, гемиэктомии.

Использование общих (СБ95Ь) и сочетанных (Ьс1-2/С095Ь) показателей апоптоза и пролиферации помогает на основании фенотипических особенностей разных вариантов рака щитовидной железы провести дополни 18 тельную диагностику и, возможно, в будущем применять ЭТИ'данные для'мо-ниторирования динамики воздействия новых лекарственных средств и для таргетной медикаментозной терапии, в механизмах которых лежит инициализация апоптоза в опухолевых клетках.

Установлено, что применение общих (СЭ95Ь, р53, р53<Ит, р53Ъг'щЫ, Кл-67, Ьс1-2, Ъс\-2й[т, Ьс1-2Ьг'ёЬ1) и сочетанных (р53/Ю-67 и Ьс1-2/СБ95Ь) параметров апоптоза и пролиферации в диагностике аденом щитовидной железы позволяет выявить тип аденом, который фенотипически отличался от основного типа доброкачественных новообразований, а также, возможно, имел более неблагоприятный прогноз.

Доказано, что в дополнительной дифференциальной диагностике злокачественных и доброкачественных новообразований щитовидной железы могут быть рекомендованы к использованию значения показателей активаторов урокиназного и тканевого типов и их ингибитора.

Своевременное выявление молекулярно-генетических дефектов — мутаций гена р53 у больных с ненаследственными формами злокачественных и доброкачественных новообразований позволяет на доклинической стадии диагностировать развитие новообразования, своевременно начать терапию и тем самым улучшить прогноз развития заболевания.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

В практике работы онкологов при дифференциальной диагностике наиболее часто приходится отличать злокачественные новообразования от доброкачественных и аутоиммунных заболеваний щитовидной железы. С помощью клинико-инструментальных методов исследований не всегда можно получить исчерпывающие данные для дифференциальной диагностики, тогда как использование для целей диагностики ключевых параметров иммунной системы помогает получить дополнительную информацию о патологическом процессе.

В дифференциальной, диагностике между практически здоровыми пациентами и пациентами с аутоиммунными, доброкачественными и злокачественными заболеваниями в качестве дополнительных критериев диагностики должны использоваться современные методы диагностики цитокинов, а также разработанные индексы (соотношения) цитокинов.

Использование логистической регрессивной модели, основанной на совместном расчете показателей ИЛ-6, зЕ-БеЬкйп в плазме крови и индекса ИЛ-6/у-ИНФ, позволяет с наиболее высокой эффективностью диагностировать рак у больных с новообразованиями щитовидной железы.

У изучаемых нами патологий отмечаются характерные фенотипиче-ские изменения в общих и сочетанных (комбинированных) показателях количества клеток и экспрессии на/в них молекулярно-биологических маркеров, участвующих в регуляции апоптоза и пролиферации, которые могут использоваться в дополнительной диагностике этих нозологий.

Исследования фенотипа клеток, основанного на мембранных рецепторах и внутриклеточных белках, участвующих в регуляции апоптоза и пролиферации, у больных папиллярным и фолликулярным раком ЩЖ позволили выявить особенности течения патологического процесса при бласттрансфор-мации в зависимости от варианта.

Наличие большого количества клеток с маркерами СЭ95Ь у больных с аденомами щитовидной железы позволяет выделить тип аденом, который отличается более напряженными изменениями в показателях количества клеток, содержащих рецепторы и белки, регулирующие апоптоз и пролиферацию, их экспрессии, и соответственно более худшим прогнозом в развитии и озлокачествлении.

Сравнительная характеристика морфологически не измененных тканей и тканей с опухолевым процессом у больных раками и аденомами щитовидной железы выявила незначительные различия по основным и соче-танным показателям апоптоза и пролиферации, наиболее фенотипически схожие данные были получены в тканях больных раком щитовидной железы.

Реализация результатов исследования

Результаты исследования и практические рекомендации внедрены в лечебную практику и используются в эндокринологических, хирургических, радиохирургическом, лабораторных отделениях Главного военного клинического госпиталя им. H.H. Бурденко МО РФ, 2-го Центрального военного клинического госпиталя им. П.В. Мандрыка МО РФ, 3-го Центрального военного клинического госпиталя им. A.A. Вишневского МО РФ, 5-го Центрального военного клинического госпиталя ВВС МО РФ, 32-го Центрального военно-морского клинического госпиталя МО РФ, 12-го Лечебно-диагностического центра МО РФ. Материалы работы используются в лекциях и практических занятиях на кафедре хирургии Государственного института усовершенствования врачей Министерства обороны Российской Федерации. Изданы методические рекомендации для медицинских учреждений Министерства обороны Российской Федерации «Полимеразная цепная реакция в клинико-диагностической практике многопрофильных лечебных учреждений» (2000).

По результатам научно-практической деятельности оформлено 8 рационализаторских предложений, которые внедрены в практику лечебно-диагностической деятельности Главного военного клинического госпиталя им. H.H. Бурденко и других военно-медицинских учреждений Министерства обороны Российской Федерации.

Апробация диссертации

Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских программ Главного военно-медицинского управления МО РФ. Апробация работы проведена на совместной научной конференции кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики ФПДО МГМСУ и лаборатории клинической биохимии НИИ клинической онкологии ГУ РОЩ им. Н.Н.Блохина РАМН 18 мая 2010 г., протокол № 7. Основные положения работы доложены на 20 конференциях: итоговой научнопрактической конференции Главного военного клинического госпиталя I им. H.H. Бурденко МО РФ «Современные подходы к диагностике и лечению злокачественных новообразований» (Москва, 2000); Национальных днях лабораторной медицины России (Москва, 2000); юбилейной научно-практической конференции «Современная специализированная амбулаторно-поликлиническая помощь в Московском регионе» (Москва, 2001); итоговой научно-практической конференции Главного военного клинического госпиталя им. H.H. Бурденко «Клиническая и экономическая эффективность современных медицинских технологий, методов диагностики и лечения» (Москва, 2001); Всероссийской научной конференции «Биохимия - медицине» (Санкт-Петербург, 2002); юбилейной научно-практической конференции «Актуальные вопросы клинической и военно-морской медицины» (Московская область, г. Железнодорожный, 2003); итоговой научно-практической конференции Главного военного клинического госпиталя им. H.H. Бурденко «Комбинированная и сочетанная патология: проблемы диагностики и лечения» (Москва, 2003); Третьем съезде онкологов Содружества независимых государств (Минск, 2004); Восьмом Всероссийском научном форуме с международным участием им. академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2004); Национальных днях лабораторной медицины России (Москва, 2004); The Tenth Joint Meeting of the International Cytokine Society (ICS) and the International Society for Interferon and Cytokine Research (ISICR) (Puerto Rico, San Juan, 2004); Третьем Всероссийском тиреоидологическом конгрессе «Диагностика и лечение узлового зоба» (Москва, 2004); XII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2005); итоговой научно-практической конференции Главного военного клинического госпиталя им. H.H. Бурденко «Актуальные проблемы клинической онкологии» (Москва, 2005); VI Всероссийском съезде онкологов «Современные технологии в онкологии» (Ростов-на-Дону, 2005); 1-st Joint Meeting of European National Societies of Immunology Under the auspices of EFIS and 16-th European Congress of Immunology (France, Paris, 2006);

17th IFCC - FESCC European Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine; 60th National Congress of the Netherlands Society for Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (NVKC) (Netherland, Amsterdam, 2007); International Federation of Clinical Chemistry - WorldLab - Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (Brasil, Fortaleza, 2008); Тринадцатом Всероссийском научном форуме с международным участием им. академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2009), Всероссийской юбилейной научно-практической конференции ГВКГ им. Н.Н. Бурденко «Комбинированная и сочетанная патология: проблемы диагностики и лечения в условиях крупных военных лечебных объединений» (Москва, 2010).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 45 научных работ, из них 16 - в центральной печати, изданы одни методические рекомендации, получено 8 рационализаторских предложений.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 332 страницах машинописного текста и состоит из введения, 5 глав (обзор литературы, описание материала и методов исследования, собственные результаты и их обсуждение), заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы из 345 источников (125 отечественных и 220 иностранных авторов). Работа иллюстрирована 54 таблицами и 23 рисунками.

2. Результаты исследования цитокинов, хемокина и молекул межклеточной адгезии, соотношений цитокинов у больных с аутоиммунными заболеваниями, доброкачественными и злокачественными новообразованиями позволяют использовать их в дополнительной дифференциальной диагностике этих нозологических форм.

3. Исследования экспрессии РАБ-Ь-рецепторов на иммунокомпетент-ных клетках основных хелперных и эффекторных субпопуляциях лимфоцитов у больных со злокачественными новообразованиями щитовидной железы выявили наличие повышенного количества лимфоцитов с РА8-Ь, а также установили присутствие повышенного (в 100-70 раз) количества клеток с РАБ-Ь на основных (хелперных, эффекторных) субпопуляциях лимфоцитов, что является косвенным признаком противоопухолевой активности иммунной системы.

4. При анализе основных и сочетанных показателей апоптоза и пролиферации в тканях щитовидной железы у больных с аутоиммунными, доброкачественными и злокачественными новообразованиями выявлены фено-типические особенности количественного состава клеток ткани ЩЖ. При АИЗЩЖ по сравнению с новообразованиями ЩЖ отмечается наличие повышенного содержания количества клеток с РАБ-рецептором, РАБ-ЬI рецептором, маркером пролиферации* Кь67, 3-5-кратное увеличение* клеток позитивных по белку Ьс1-2ЬпвЬ1, наиболее выраженное 25-кратное увеличение Ьс1-2/СБ95 клеток. У больных с АЩЖ по сравнению с РЩЖ отмечается наличие повышенного содержания количества клеток с белком р53Ьг1ё1и, Кл-67, увеличение клеток, несущих сочетанные маркеры р53ЛИ)95Ь. У больных с РЩЖ отмечается наличие повышенного содержания клеток с белком р53а'т, минимальными значениями клеток с маркерами пролиферации и апоптоза - Кл-67, р53Ьг№, Ьс1-2, Ьс1-2Ьпе1и.

5. Проведенные исследования фенотипа клеток в тканях щитовидной железы у больных с ненаследственными формами рака (папиллярный, фолликулярный) щитовидной железы выявили характерные различия в фенотипах общих и (СБ95Ь) и сочетанных (Ьс1-2/СБ95Ь) показателей и на их основе позволили классифицировать исследуемые варианты рака щитовидной железы. В дополнительной дифференциальной диагностике фолликулярного и папиллярного вариантов рака определяющее значение имеет показатель количества клеток с С095Ь, который при значениях более 20,64% с достоверностью (р=0,002) и диагностической эффективностью в 99,9% свидетельствовал о наличии фолликулярного рака щитовидной железы.

6. Выявлена группа аденом (аденомы II типа), значительно отличающихся по своим фенотипическим характеристикам, которая характеризовалась повышенным содержанием в суспензии клеток ткани ЩЖ маркеров пролиферации Кь67 и рецепторов с СЭ95Ь, имела более выраженные изменения по количественному составу клеток с р53 и Ьс1-2-белками в р53, р53Ьпе1п, Ьс1-2, Ьс1-2Ьг18'п-позитивных клетках и повышенной плотности распределения этих белков в р53Ьп8'п, Ьс1-2Ьпё'п-клетках, а также большого количества клеток с сочетанными маркерами р53/Ю-67, Ьс1-2/Кь67, СБ95/К1-67, Ьс1-2/СЭ95Ь. Все это может свидетельствовать о неблагоприятном прогнозе развития заболевания. В диагностическом плане для выявления аденом II типа нужно использовать показатели количества клеток р53/Кь67, при значениях. которых более 30,89% с достоверностью (р=0,002) и диагностической эффективностью в 99,9% выявляются аденомы II типа.

7. Сравнительные исследования общих и сочетанных показателей апоптоза и пролиферации в морфологически не измененных и опухолевых тканях у больных с аденомами и раками щитовидной железы, взятых из одной железы, выявили наличие минимальных различий у больных со злокачественными новообразованиями и более выраженных изменений у больных с доброкачественными новообразованиями. Все это свидетельствовало о развитии на молекулярном (клеточном и внутриклеточном) уровне уже начавшихся процессов опухолевой трансформации в визуально и микроскопически не измененных тканях пораженной новообразованием щитовидной железы.

8. Уровень активатора плазминогена урокиназного типа (иРА) прогрессивно возрастает с увеличением стадии заболевания, размера опухоли и наличия регионарных метастазов. Не обнаружено четкой взаимосвязи содержания иРА, 1РА и РА1-1 в злокачественных опухолях щитовидной железы со степенью дифференцировки и типом роста опухолевого процесса.

9. Выявлена частота мутации р53 у больных папиллярным раком ЩЖ -20,8%, аденомой - 9,1%, аутоиммунными тиреоидитами - 7,1%. Такая частота позволяет выполнять исследование на предмет выявления данной мутации для возможности начать противораковые мероприятия на ранних этапах развития патологического процесса в щитовидной железе.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для улучшения дифференциальной диагностики аутоиммунных, доброкачественных и злокачественных заболеваний щитовидной железы должны учитываться особенности нарушения иммунной системы, показателей цитокинов и иных параметров, характеризующих состояние иммунитета.

2. С высокой диагностической эффективностью рекомендуется использовать в дифференциальной диагностике злокачественных и аутоиммунных заболеваний показатели ИЛ-10 (значения более 13,94 пг/мл), зЕ-5е1ес1лп (значения более 45,12 пг/мл), МСР-1 (значения более 170,58 пг/мл), индекс у-ИНФ/ИЛ-10 (значения менее 32,74), доброкачественных и аутоиммунных заболеваний -показатели ИЛ-6 (значения менее 18,57 пг/мл), б1САМ-1 (значения более 304,48 пг/мл), ИЛ-10 (значения более 15,94 пг/мл), индексы ИЛ-6/у-ИНФ (значения менее 256,07), у-ИНФ/ИЛ-4 (значения более 10,09), у-ИНФ/ИЛ-10 (значения менее 48,18), злокачественных и доброкачественных новообразований - показатели ИЛ-6 (значения более 18,16 пг/мл), эЕ-Бексйп (значения более 56,39 пг/мл), индекс ИЛ-6/у-ИНФ (значения более 421,32).

3. Для улучшения диагностической эффективности разработана логистическая регрессивная модель диагностики рака щитовидной железы у больных с новообразованиями (доброкачественными и злокачественными) ЩЖ, основанная на совместном использовании показателей ИЛ-6, эЕ-зеЬсНп и индекса ИЛ-6/у-ИНФ, обладающая более высокой достоверностью и точностью в отношении дифференцированных ненаследственных форм раков щитовидной железы.

4. Рассчитаны пороговые значения для общих и сочетанных показате1 лей апоптоза и пролиферации, которые могут быть использованы в дифференциальной диагностике этих патологий. Предложено их использовать в диагностической практике «нормальной» ткани ЩЖ, ткани больных аутоим-муными, доброкачественными и злокачественными заболеваниями щитовидной железы и в дифференциальной диагностике ткани исследуемых патологий ЩЖ, а также при мониторинге терапии и в перспективе для, иных видов ■•■ ■ ■ ; : . ; ■ 29.2 ; \ ,'. -V ■• • ■' Л:.". ' таргетной» лекарственной терапии, в механизме действия которых мишенями являются пролиферативные и апоптозные белки.

5. Исследованные фенотипические особенности рецепторных и белковых маркеров, участвующих в регуляции апоптоза (СБ95Ь и Ьс1-2/СБ95Ь), в суспензии клеток при папиллярных и фолликулярных раках щитовидной железы, позволяют использовать с высокой эффективностью полученные их пороговые значения для улучшения дифференциальной диагностики на доклиническом этапе обследования пациента.

6. Оценка белков и рецепторов, участвующих в регуляции апоптоза и пролиферации, методом проточной цитометрии (Кл-67, С095Ь, р53 (р53Ьпе1и), Ьс1-2 (Ьс1-2Ьг'®ь), р53/Кл-67, Ьс1-2/Кл-67, СЭ95/Кл-67, Ьс1-2/СБ95Ь) в группе больных АЩЖ позволяет диагностировать аденомы, фенотипически отличные от основного типа аденом, — АЩЖ II типа. Выявленные особенности аденомы II типа характеризуют неблагоприятный прогноз развития патологического процесса и требуют последующего изучения вопроса о разработке новых подходов к терапии пациентов с данной фенотипической формой аденомы ЩЖ.

7. Наличие, по данным общих и сочетанных показателей апоптоза и пролиферации, у больных раком щитовидной железы в морфологически и патологически визуально не измененной ткани щитовидной железы практически похожих фенотипических изменений в тканях, где этот процесс визуализируется морфологами, позволяет рекомендовать онкологам выполнять операции по полному удалению органа и отказаться от использования таких органосохраняющих (паллиативных) оперативных вмешательств, как геми-томия, секторальная резекция щитовидной железы.

8. В целях дополнительной дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований рекомендуется использовать в практике пороговых значений показатели активаторов плазминогена урокиназного и тканевого типа и их ингибиторы. рецептором, маркером пролиферации. Ki-67, 3-5-кратное увеличение клеток позитивных по белку bcl-2br'sht, наиболее выраженное 25-кратное увеличение bcl-2/CD95 клеток. У больных с АЩЖ по сравнению с РЩЖ отмечается наличие повышенного содержания количества клеток с белком p53bnght, Ki-67, увеличение клеток, несущих сочетанные маркеры p53/CD95L. У больных с РЩЖ отмечается наличие повышенного содержания клеток с белком p53dim, минимальными значениями клеток с маркерами пролиферации и апоптоза-Ki-67, p53bnght, bcl-2, bcl-2br,ght.

5. Проведенные исследования фенотипа клеток в тканях щитовидной железы у больных с ненаследственными формами рака (папиллярный, фолликулярный) щитовидной железы выявили характерные различия в фенотипах общих и (CD95L) и сочетанных (bcl-2/CD95L) показателей и на их основе позволили классифицировать исследуемые варианты рака щитовидной железы. В дополнительной дифференциальной диагностике фолликулярного и папиллярного вариантов рака определяющее значение имеет показатель количества клеток с CD95L, который при значениях более 20,64% с достоверностью (р=0,002) и диагностической эффективностью в 99,9% свидетельствовал о наличии фолликулярного рака щитовидной железы.

6. Выявлена группа аденом (аденомы II типа), значительно отличающихся по своим фенотипическим характеристикам, которая характеризовалась повышенным содержанием в суспензии клеток ткани ЩЖ маркеров пролиферации Ki-67 и рецепторов с CD95L, имела более выраженные изменения по количественному составу клеток с р53 и bcl-2-белками в р53, p53br,ght, bcl-2, bel-2bngh-позитивных клетках и повышенной плотности распределения этих белков в p53bnght, Ьс1-2Ьг'8Ь1-клетках, а также большого количества клеток с сочетанными маркерами p53/Ki-67, bcl-2/Ki-67, CD95/Ki-67, bcl-2/CD95L. Все это может свидетельствовать о неблагоприятном прогнозе развития заболевания. В диагностическом плане для выявления аденом II типа нужно использовать показатели количества клеток p53/Ki-67, при значе

9. Проведение исследований на выявление мутаций в гене р53 в ненаследственных раках щитовидной железы позволяет на более ранних стадиях выявлять начало опухолевого процесса и своевременно начинать проведение терапии, что в конечном итоге будет положительно отражаться на более благоприятном прогнозе заболевания.