Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Молекулярно-биологические маркеры метастазирования и прогноза при раке толстой кишки

На правах рукописи

ДЕЛЕКТОРСКАЯ Вера Владимировна

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ МЕТАСТАЗИРОВАНИЯ И ПРОГНОЗА ПРИ РАКЕ ТОЛСТОЙ КИШКИ

14.00.14 — онкология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва — 2007

003061477

Работа выполнена в ГУ Российском онкологическом научном центре им. Н.Н.Блохнна Российской академии медицинских наук (директор — академик РАН и РАМН, профессор М.И.Давыдов)

Официальные оппоненты

доктор медицинских наук, профессор

И.А.Казанцсва

доктор медицинских наук, профессор

Ю.А.Барсуков

профессор, член-корреспондент РАМН

И.В.Поддубнап

Ведущая организация —

ФГУ Российский научный центр рентгенорадиологии Росмедтехнологий

заседании диссертационного совета по присуждению ученой степени доктора медицинских наук (Д001 017 01) Российского онкологического научного центра им Н Н Блохина РАМН (Москва, 115478, Каширское шоссе, 24)

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ГУ Российского онкологического научного центра им Н Н Блохина РАМН

Автореферат разослан 2007г

Защита диссертации состоится

в 14 часов на

Ученый секретарь диссертационного совета Л [)

ГУ РОНЦ им Н Н Блохина РАМН ¡У \

доктор медицинских наук пА Ю В Шишкин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Рак толстой кишки (РТК) является одним нз наиболее распространенных видов злокачественных новообразований человека Согласно статистическим данным последнего десятилетия показатели заболеваемости и смертности больных РТК неуклонном растут в России и экономически развитых странах мира [Давыдов М И , Аксель Е М , 2005, Барсуков Ю А , Кныш В И , 2006, Greenlee RT et al, 2000] Поскольку самым грозным проявлением опухолевой прогрессии и основной причиной смерти больных злокачественными новообразованиями чаще всего являются отдаленные метастазы, изучение феномена метастазирования продолжает оставаться важной и актуальной задачей современной онкологии

Известно, что более 30% больных РТК имеют клинически выявляемые метастазы на момент первичной диагностики [Давыдов М И, Аксель Е М , 2002] По данным ряда авторов, еще у 30-40% пациентов метастазы имеются в скрытом виде и проявляются в дальнейшем [Vogel I et al, 2000 , Трапезников НН, Аксель ЕМ, 2001] Это служит основанием для разработки дополнительных методов оценки метастатического потенциала раковых клеток и выявления групп риска для адъювантной терапии после радикального хирургического вмешательства с целью улучшения отдаленных результатов лечения Вместе с тем, многие вопросы, касающиеся корреляции кпинико-морфологических характеристик опухоли и изменений биологических показателей, происходящих в процессе метастазирования РТК, нуждаются в уточнении

К формированию злокачественного фенотипа клеток РТК приводит изменение активности целого ряда молекулярных факторов, среди которых особое место занимают маркеры, прогнозирующие метастазирование Ключевыми факторами, влияющими на инвазивные способности раковых клеток, являются белки межклеточной адгезии, ферменты внеклеточного матрикса, компоненты системы активации плазминогена, структурные

компоненты базальных мембран, белки — супрессоры опухолевого роста и метастазирования

Роль изменений экспрессии молекул межклеточной адгезии Е-кадхерина (E-cad), (3-катенина (P-cat) и CD44variant6 (CD44v6) в развитии метастазов РТК в печени изучена недостаточно [Wong N А, Pignatelli V , 2002] Редукция экспрессии E-cad и последующее нарушение межклеточных связей, которые обеспечивают эти молекулы, способствует прогрессированиго опухолевого процесса и свидетельствует о неблагоприятном течении заболевания [Kaihara Т, et al, 2003] P-cat считается регулятором целого ряда процессов, влияющих на клеточную пролиферацию [Morin Р J., 1999] CD44v6 является белком, который играет важную роль не только при взаимодействии клеток друг с другом, но и с внеклеточным матриксом [Jungling В et al, 2002, Bendardaf R et al, 2004]

Большой интерес представляет изучение ферментов, способствующих деградации внеклеточного матрикса, к которым относятся матриксные металлопротеиназы (ММР-2 и ММР-9). Выработка раковыми клетками этих протеаз, влияющих на подвижность опухолевых клеток, лежит в основе инвазии и метастазирования и может служить показателем агрессивности опухоли ММР не только облегчают опухолевый рост, раковую инвазию и метастазирование, но и могут быть мишенью для противоопухолевой терапии и лечения метастазов [Mysliwill AG et al, 2002] Аналогичными свойствами обладают представители другого семейства протеолитических ферментов — сериновые протеазы и компоненты системы активации плазминогена (uPA, tPA, PAI-1) [Gontero P et al., 2004].

Основные белки базальных мембран коллаген IV типа (Coll IV) и ламинин (Lam) являются не только структурным барьером для метастатического распространения раковых клеток, но и важной функциональной единицей, участвующей в опухолевой прогрессии [Galbavy S et al, 2002]

Данные о влиянии белка-супрессора метастазирования nm23 на метастатическую активностью РТК крайне противоречивы, однако, несомненно, что он является одним из потенциально важных маркеров, вовлеченных в процессы клеточной пролиферации и дифференцировки [Bazan V et al, 2002, Berney C.R et al, 2001, Dursun A et al, 2002]

Большое значение при оценке метастатического потенциала опухоли имеет гиперэкспрессия оикобелка с-егЬВ-2 Установлено, что высокая экспрессия белка, в основном, связана с амплификацией гена с-егЬВ-2 и коррелирует с плохим прогнозом при раке молочной железы Существует предположение, что гиперэкспрессия белка может быть необходимым условием инвазии опухолевых клеток также и при РТК [Forte A et al, 2002, Hayer J et al, 2001, Lee J С et al, 2002].

Кроме того, соотношение скорости клеточной пролиферации и активности индукторов и ингибиторов апоптоза, которое оценивается с помощью факторов Ki67, PCNA, р53, Bcl-2, Вах, sFas, обуславливает опухолевую прогрессию и, как следствие, приобретение клетками РТК дополнительных компонентов метастатического фенотипа

Актуальным и перспективным направлением является возможность использования этих маркеров для прогнозирования течения опухолевого процесса и выявления больных РТК с высоким риском развития метастазов и рецидива заболевания

Цель исследования - изучение экспрессии молекулярно-биологических маркеров в опухолях и сыворотке крови больных РТК иммуно1 истохимическими, ультраструктурными и биохимическими методами с учетом основных клинико-морфологических характеристик опухоли и возможности использования этих показателей для оценки клиническою течения болезни и прогноза развития метастазов

Задачи исследования: 1 Изучить иммуногистохимические особенности экспрессии белковых маркеров в клетках первичных РТК и в прилежащей к опухоли слизистой

оболочке толстой кишки

2 Исследовать особенности иммунофенотипа метастазов РТК в лимфатических узлах, печени и других органах, а также местных рецидивов опухолей

3 Провести сравнительный анализ особенностей иммунофенотипа первичных и метастатических опухолей толстой кишки и выявить их взаимосвязь с основными клинико-морфологическими параметрами заболевания

4 Определить клиническую роль особенностей экспрессии маркеров в первичных опухолях и их метастазах при оценке прогноза заболевания

5 Провести иммуноферментное определение ряда молекулярно-биологических маркеров в сыворотке крови больных РТК и изучить корреляцию биохимических показателей с клинико-морфологическими параметрами РТК

6 Выявить ультраструктурные маркеры клеток РТК в первичных опухолях и их метастазах в лимфатических узлах и печени

7 Провести статистическую обработку данных и определить на основании анализа результатов исследования наиболее значимые прогностические показатели

Научная новнзна. Новый подход к диагностике и прогнозированию клинического течения РТК основан на использовании показателей экспрессии молекулярно-биологических маркеров, определяющих инвазивно-метастатический потенциал опухолевых клеток Впервые проведен комплексный клинико-морфологический, иммуногистохимический, ультраструктурный и биохимический анализ целого ряда современных молекулярных факторов, таких как молекулы межклеточной адгезии, компоненты внеклеточного матрикса, белки-супрессоры метастазирования, факторы апоптоза, маркеры пролиферативной активности Показана четкая взаимосвязь экспрессии ряда белков с развитием метастазов и рецидивов РТК и, как следствие, возможность использования данных маркеров для

уточнения диагноза и прогноза выживаемости На основании исследования молекулярных характеристик опухолей разработаны фенотипические критерии, позволяющие идентифицировать случаи РТК с повышенным риском развития отдаленных метастазов Молекулярные изменения, изученные в ткани первичных опухолей толстой кишки и в отдаленных метастазах в печени, позволили оценить факторы прогноза РТК не только после проведенного хирургического удаления первичной опухоли, но и после резекции печени по поводу метастазов Впервые при РТК проведен анализ взаимосвязи между экспрессией супрессоров метастазирования, белков межклеточных контактов и базальных мембран и активностью протеолитических ферментов. Изучение экспрессии белковых маркеров в первичных опухолях и метастазах РТК позволило уточнить некоторые механизмы, обеспечивающие метастазированне опухолевых клеток

Практическая значимость исследования. Настоящее исследование представляет практический интерес для оценки прогноза больных РТК и выделения групп повышенного риска развития метастазов и рецидивов, требующих дополнительного лечения или более тщательного динамического наблюдения Выделение групп больных РТК с высоким риском отдаленного метастазирования на основании изучения иммунофенотипа опухолей имеет важное практическое значение как для диагностики, так и для оценки прогноза заболевания и лечения больных РТК

На основании анализа молекулярных особенностей опухоли определены дифференциально-диагностические критерии для оценки предрасположенности больных РТК к развитию метастазов и выделению наиболее прогностически неблагоприятных случаев Разработаны рекомендации по использованию прогностических критериев в диагностике опухолей человека с использованием иммуногистохимических, электронно-микроскопических и биохимических методов Результаты исследования внедрены в клиническую практику в НИИ КО ГУ РОНЦ им Н Н Блохина РАМН

Апробация работы. Диссертация апробирована на совместной научной конференции с участием научных сотрудников патологоанатомического отделения, лаборатории гистохимии и электронной микроскопии, лаборатории клинической цитологии, лаборатории молекулярной патологии, лаборатории клинической биохимии, отделения проктологии НИИ клинической онкологии ГУ РОНЦ им. Н Н Блохина РАМН 13 июня 2007г

Основные положения работы были доложены и обсуждены на III конференции Российского общества патологоанатомов «Новые методы и разработки в онкоморфологии» (Москва, 15-17 сентября 2003г), на III съезде онкологов и радиологов стран СНГ (Минск, 25-28 мая 2004г), на XI Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 19-23 апреля 2004г), на научно-практическом симпозиуме «Прогрессивные аналитические технологии и доказательная лабораторная медицина» (Москва, 20-22 октября 2004г.), на I Всероссийской научно-практической конференции патологоанатомов «Актуальные вопросы патологической анатомии» (Орел, 30 мая - 2 июня 2005г), на III (VII) Съезде научного общества специалистов клинической лабораторной диагностики (Москва, 1114 октября 2005г), на II Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 20-21 октября 2005г), на XIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 3-7 апреля 2006г)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 35 научных

работ

Объем работы. Диссертация изложена на 230 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, 5 глав результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и практических рекомендаций Текст иллюстрирован 27 таблицами и 33 рисунками и микрофотографиями Указатель литературы содержит 337 работ отечественных и зарубежных авторов

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Общая характеристика обследованных больных В исследование были включены 264 больных РТК 1-1У стадии, которые получали лечение в ГУ РОНЦ им. ННБлохина РАМН в период с 1984 по 2006г. Средний возраст обследованных больных составил 60 5 (±0 63) лет, медиана 62.0, интервал 34-79 лет, преобладали больные старше 60 лет (64 0%) В общую группу больных РТК вошли 127 мужчин (48 1%) и 137 женщин (51 9%)

Больные РТК на момент операции в 66 (25.0%) случаях имели I - II стадии и в 198 (75 0%) наблюдениях - Ш-1У стадии опухолевого процесса Наличие регионарных метастазов отмечено у 178 пациентов (67 4%), прорастание опухоли в соседние органы и ткани (мочевой пузырь, матку, тонкую кишку) - в 18 наблюдениях (6.8%)

При гистологическом исследовании материала у всех больных были диагностированы аденокарциномы толстой кишки различной степени дифференцировки Опухоли были представлены железистыми, алвеолярными, папиллярными, трабекулярными и солидными вариантами строения Слизеобразование различной степени выраженности отмечено в 51 (19 3%) наблюдении. Высокодифференцированные аденокарциномы толстой кишки выявлены у 79 (29.9%) пациентов, умереннодифференцированные - у 151 (57 2%), низкодифференцированные - у 34 (12 9%) В ряде случаев в одной и той же опухоли имелись участки различной степени дифференцировки Микроинвазия лимфатических и кровеносных сосудов в изученных опухолях обнаружена в 81 (30 7%) случае, выраженная лимфоидная инфильтрация в опухоли - в 78 (29 5%) наблюдениях

За 5-летний период наблюдения отдаленные метастазы были диагностированы у 135 (51.1%) пациентов, из них у 25 (9 5%) было множественное поражение внутренних органов, местные рецидивы выявлены в 37 (14.0%) случаях. С целью исследования молекулярно-биологических особенностей метастазирования все больные РТК были разделены на две

группы основную группу составили 135 пациентов с синхронными и метахронными метастазами в печени, контрольную группу — 129 больных без отдаленных метастазов

В основной группе больным РТК выполнено удаление первичной опухоли и в 110 случаях - резекция печени по поводу метастазов Анализ данной группы пациентов осуществлялся на основе исследования образцов ткани первичных опухолей толстой кишки и их метастазов в печени Исследованные метастазы РТК в печени были представлены аденокарциномами различной степени дифференцировки и имели аналогичное строение с исходными опухолями. Синхронные метастазы, удаленные одновременно с первичной опухолью толстой кишки, были исследованы в 63 (57 3%) случаях. Метахронные метастазы, удаленные в течение года или через 1-2-3 года после первой операции, изучены в 47 (42 7%) наблюдениях Дополнительно исследованы образцы тканей местных рецидивов (п=37), метастазов в регионарных лимфатических узлах (п=127), отдаленных метастазов в легком (п=6), надпочечнике (п=2), яичнике (п=3), повторных метастазов в печени (п=12) В контрольной группе больным РТК произведены стандартные операции удаления первичной опухоли и исследованы образцы ткани этих опухолей и пограничной с опухолью слизистой оболочки толстой кишки.

Методы нммуиогистохимнческого исследования.

Иммуногистохимическое исследование выполнено на серийных парафиновых срезах ткани опухолей и их метастазов с помощью биотин-стрептавидинового иммунопероксидазного метода с антителами к следующим белковым маркерам молекулам межклеточной адгезии Е-кадхерину (E-cad), Р-катенину (P-cat) и CD44variant6 (CD44v6), матриксным металлопротеиназам 2 и 9 (ММР-2 и ММР-9), компонентам базальных мембран коллагену IV типа (Coll IV) и ламинину (Lam), белку - супрессору метастазирования nm23, онкобелку с-егЬВ-2, мутантному белку р53,

антигенам клеточной пролиферации PCNA и Ki67, белкам - регуляторам апоптоза - Вс1-2 и Вах (табл 1)

Таблица 1. Характеристика использованных в исследовании антител

Антиген Антитело, Фирма клон Рабочее разведение Функция белка

E-cad Mouse mAb Novocastra 36B5 RTU Супрессор межклеточной адгезии

p-cat Mouse mAb Novocastra 17C2 1 . 200 Внутриклеточный прикрепляющий белок

CD44 v6 Mouse mAb Novocastra VFF-7 1 50 Клеточно-магриксный рецепторный белок

ММР-2 Mouse mAb Novocastra 17B11 1 40 Фермент межклеточного матрикса

ММР-9 Mouse mAb Novocastra 15W2 1 80 Фермент межклеточного матрикса

Coll IV Mouse mAb Novocastra PHM-12 1 : 200 Компонент базальных мембран

Lam Rabbit pAb Dako 1 .50 Компонент базальных мембран

nm23 Rabbit pAb Dako 1 50 Супрессор метастазирования

c-erbB-2 Rabbit pAb Dako 1 200 Рецепторная тирозинкиназа

PCNA Mouse mAb Zymed PC10 1 •50 Антиген пролиферирующих клеток

Ю67 Mouse mAb Dako MIB-1 1 •150 Антиген клеточной пролиферации

p53 Mouse mAb Dako DO-7 1 •50 Регулятор клеточного цикла и апоптоза

Bcl-2 Mouse mAb Zymed bcl-2-100 1 •50 Ингибитор апоптоза

Bax Mouse mAb Zymed 2D2 1 : 50 Активатор апоптоза

Срезы толщиной 3-5 мкм депарафинировали и регидратировали по стандартной схеме. Для демаскировки антигенов проводили предварительную обработку парафиновых срезов в микроволновом режиме при мощности 650W 2 раза по 5' с использованием восстанавливающего раствора рН 6,0 (фирма «Dako», Дания) с перерывом 2' между процедурами для охлаждения Для выявления Coll IV дополнительно проводили обработку трипсином (фирма «Dako», Дания) в течение 30". Срезы инкубировали с первичными антителами на протяжении 18 часов при +4°С В качестве вторичных антител и пероксидазного комплекса использовали стандартный набор реагентов LSAB+ Kit или систему En Vision (Mouse) (фирма «Dako», Дания) Для визуализации реакции применяли раствор диаминобензидина DAB+ (фирма «Dako», Дания) Ядра клеток докрашивали гематоксилином Майера Контрольный срез оставляли без первой инкубации.

Оценку реакции в клетках первичных опухолей, а также регионарных и отдаленных метастазов проводили полуколичественным методом с учетом интенсивности окрашивания и количества антиген-позитивных клеток Иммуногистохимическая реакция оценивалась как негативная («-» - нет реакции), слабопозитивная («+» - <10% окрашенных клеток), умереннопозитивная («++» - >10% клеток средней интенсивности окраски) и сильноиозитивная («+++» - >10% клеток высокой интенсивности окраски) Для дальнейшего сравнительного иммуногистохимического исследования выделяли два основных уровня иммунореактивности: низкий уровень или редуцированная экспрессия белков (—/+) и высокий уровень или гиперэкспрессия маркеров (++/+++)

Для каждого антигена оценивали тип специфического окрашивания, который зависел от локализации продукта реакции в клетке (цитоплазматический, мембранный, ядерный, смешанный) Экспрессию белка с-егЬВ-2 считали повышенной только при интенсивном окрашивание мембран раковых клеток (++/+++)

Результаты реакций с антигенами, имеющими ядерную локализацию (РСИА, К167, р53, Р-са1, пгп23) выражали в процентах с учетом количества окрашенных ядер на 100 учтенных опухолевых клеток в 5-10 репрезентативных полях зрения Пролиферативная активность с учетом индексов пролиферации Кл67 и РСЫА оценивали как низкую (0% - 20%), умеренную (21% - 50%) и высокую (51% - 100%) Для дальнейшего сравнительного исследования проводили разделение больных РТК на группы с учетом порогового индекса пролиферации. низкий уровень пролиферативной активности (<20%) и высокой уровень пролиферативной активности (>20%) Экспрессия белка р53 считалась низкой при окрашивании ядер <10% опухолевых клеток и высокой при количестве антиген-позитивных клеток в первичной опухоли или метастазе >10% Специфическую реакцию ряда маркеров в волокнах и клетках стромы опухолей расценивали как позитивную «ли негативную

Методы электронно-микроскопического исследования.

Для электронно-микроскопического изучения образцы ткани опухолей и их метастазов фиксировали в 2 5% растворе глутарового альдегида на 0 1 М фосфатном буфере (рН 7 4) при +4°С в течение 10-12 часов, постфиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия в течение 1 5 часов при комнатной температуре Дегидратацию материала и заливку образцов ткани из 5 участков исходной опухоли и каждого метастаза производили в ЭПОН-812 по общепринятой методике. Полутонкие срезы толщиной 1 мкм готовили на ультратоме ЬКВ-З (Швеция), окрашивали толуидиновым синим и проводили прицельную заточку блоков в выбранных участках Ультратонкие срезы готовили на ультратоме ЬКВ-З (Швеция), контрастировали ацетатом уранила и цитратом свинца и исследовали в электронном микроскопе ХЕМ-1200ЕХ11 (Япония)

Методы биохимического исследования.

Биохимическое исследования проведено с помощью иммуноферментного определения в сыворотке крови ММР-9, sFas и иммуноферментного исследования в ткани опухоли ММР-9, uPA, tPA, PAI-1

Для иммуноферментного определения концентрации ММР-9 и sFas использованы образцы сыворотки крови больных РТК до проведения лечения и в качестве контроля - образцы сыворотки крови практически здоровых людей

Иммуноферментное определение тканевых маркеров ММР-9, uPA, tPA, PAI-1 проводили в цитозольной фракции опухолевой ткани и непораженной слизистой оболочки толстой кишки, которую получали непосредственно после операции.

Концентрацию sFas в сыворотке крови определяли иммунофермектным методом, разработанным в Институте биоорганической химии им M M Шемякина и Ю А Овчинникова РАН и лаборатории клинической биохимии ГУ РОНЦ им H H Блохина РАМН (Аббасова С.Г и соавт., 1999)

Определение uPA, tPA, PAI-1 в опухоли проводили иммуноферментным методом с использованием наборов реактивов, разработанных в лаборатории проф. T.Benraad'a (г Ниймеген, Нидерланды)

Определение ММР-9 в опухоли и сыворотке крови выполняли с помощью стандартных наборов для прямого иммуноферментного анализа "Human ММР-9 (total)" (Quantikme®, R&D Systems, США)

Методы статистического анализа данных.

Математический анализ полученных результатов проводили с использованием пакета статистических программ SPSS 9 0 и Microsoft® Office Excel 2003 Рассчитывали среднее значение показателей, стандартную ошибку среднего, а также их медианы Определение достоверности различий частот признаков в изучаемых группах проводили с использованием критерия х2 и непараметрического точного критерия Фишера для малых

выборок. Различия между показателями считали статистически значимыми при р<0 05

Анализ кривых выживаемости проводили методом Kaplan-Mayer Сравнение кривых выживаемости и определение достоверности различий между группами больных РТК осуществляли с помощью теста Log-rank Различия между группами считали достоверными при р<0 05 С помощью однофакторного анализа выживаемости больных РТК были отобраны наиболее значимые клинико-морфологические и молекулярно-биологические показатели Многофакторный анализ влияния отобранных признаков на общую и безрецидивную выживаемость проводили с использованием модели регрессионного анализа - Сох Proportional hazard regression model

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Иммуногистохимические особенности содержания Е-кадхерииа, [i-катенина и CD44v6 в опухолях больных РТК. Показано, что экспрессию трансмембранного гликопротеина E-cad демонстрируют раковые клетки первичных аденокарцином толстой кишки (128/264, 48 5%), части регионарных (29/127, 22 8%) и отдаленных (23/110, 20 9%) метастазов На ранних стадиях РТК наблюдается незначительное ослабление мембранной экспрессии E-cad На поздних стадиях развития опухоли происходит редукция экспрессии белка (рис. 1а) и изменение его локализации в раковой клетке, а именно, исчезновение мембранного окрашивания и аномальное накопление E-cad в цитоплазме. Полная потеря мембранной экспрессии белка способствует формированию инвазивного фенотипа раковых клеток и усилению как местной, так и отдаленной распространенности опухоли Статистический анализ показал, что уровень экспрессии E-cad имел обратную взаимосвязь с Т-стадией опухолевого процесса (р=0 002), степенью гистологической дифференцировки (р=0 008) и был значительно снижен в клетках опухолей с регионарными метастазами (р=0 027) (табл 2)

Выявлено, что аномальная экспрессия E-cad имела тесную взаимосвязь с наличием метастазов РТК в печени (табл. 3) Редукцию экспрессии E-cad или отсутствие белка чаще выявляли у больных РТК при наличии метастазов в печени (89/135, 65 9%) и значительно реже - в контрольной группе пациентов (61/129,47 3%) (р=0 003)

Кроме того, у больных РТК отмечено наличие ассоциации между исчезновением мембранной экспрессии E-cad и ухудшением клинического течения заболевания Редукция экспрессии белка была связана с уменьшением общей выживаемости больных РТК (р=0 01).

Позитивная экспрессии ß-cat выявлена в большинстве исследованных первичных опухолей толстой кишки (223/264, 84 5%), а также их метастазов в лимфатических узлах (93/127, 87 5%), печени (98/110, 89 5%) и местных рецидивах (24/34, 84 7%) В первичных опухолях больных РТК на ранних стадиях фиксировалась мембранная или мембранно-цитоплазматическая реакция различной интенсивности В опухолях, метастазиругощих в отдаленные органы, отмечена ядерная локализация ß-cat (рис 16), которая была наиболее выражена в раковых клетках, расположенных в зонах опухолевого роста и инвазии (рис 1в) Аналогичные особенности экспрессии белка наблюдали в метастазах в печени (рис 1г)

Высокий уровень ядерно-цитоплазматической экспрессии ß-cat имел статистически достоверную взаимосвязь с инвазией опухолью сосудов (р=0 003) (табл 2), а также с наличием у больных РТК метастазов в печени (табл 3) и выявлялся значительно чаще в группе пациентов с отдаленными метастазами (96/135, 71 1%), чем в контрольной группе (66/129, 51 2%)

О=о ooi)

Рис. 1. Экспрессия молекул межклеточной адгезии п первичных РТК И на метастазах* а. фокус мембранцо-цшоплазматнчсскои экспрессии Е-ея 11 н клетках первичной опухоли (х250); б. Ядерно-цнтоилазмэтическая экспрессия (1-са( в клетках первичной опухоли (х200); п. Накопление (}-са( в инвазнвном компоненте первичной опухоли (х 150); г. Ядерпо-цнтоплазматическая экспрессия (1-с:и в клетках метастаза в печени (х400).

Ядерная экспрессия белка была достоверно связана с ухудшением как общей (р=0.001), так и безрецидивной (р=0.01) выживаемости больных РТК (рис. 2), кроме того риск развития метастазов о печени в первые 3 года после операции в фуппе больных с высоким уровнем экспрессии /3-са( в опухоли был в 2.7 раза выше, чем в группе пациентов с р-саН)егативн ы м и опухолями.

Увеличение количества цитоплазм этического р-са[ ь опухолевых клетках и траислокация последнего из цитоплазмы в ядро служило признаком, прогнозирующим повышенный метастатический Потенциал при

РТК Кроме того, в большинстве неблагоприятных случаев наблюдали

сочетание высокого уровня Р-са1 с минимальной экспрессией Е-сас1

Таблица 2. Взаимосвязь между экспрессией Е-сас1 и р-са! в аденокарциномах толстой кишки н клиннко-морфологическими признаками заболевания

Экспрессия Е-сас1 Экспрессия [5-са1 Признак _ _

Высокая Низкая р Высокая Низкая р - /7=114 и =150 и =162 «=102

Возраст (лет) >60 78 91 101 68

<60 36 59 0 242 61 34 0 562

Пол м 55 72 74 53

ж 59 78 0 932 88 49 0 385

Т стадия т,,т2 40 26 34 32

Т3,Т4 74 124 0.002* 128 70 0 080

Степень выс/ум 107 123 144 86

дифферен-ки низкая 7 27 0 008* 18 16 0 372

Стадия по А/В 39 38 41 36

Dukes' C/D 75 112 0 151 121 66 0 110

Метастазы в + 68 110 105 73

лимфоузлах - 46 40 0 027* 57 29 0315

Инвазия + 30 51 61 20

сосудов - 84 99 0 228 101 82 0 003*

Локализация пр/пол 42 47 51 38

опухоли лев/пол 72 103 0 420 111 64 0 405

Слизеобразо- + 29 38 35 32

вание - 85 112 0 902 127 70 0 103

Лимфоидная + 37 41 48 30

инфильтрация — 77 109 0 443 114 72 0 920

Примечание * - статистически значимые показатели (р<0 05)

Различные уровни позитивной иммунореактивности молекул С044у6 в раковых клетках наблюдали только в части изученных аденокарцином толстой кишки (152/264, 57 6%), а также их метастазов в лимфатических узлах (92/127, 32 0%), печени (59/110,28%) и местных рецидивов (4/37, 21%)

Общая выживаемость. %

Время наблюдения, месяцы

— низкий Р-са( -- пысокпП р-са!

Безрецидпвная выживаемость, %

— низкий Р-са( -- пысокнй Р-сп!

Время наблюдения, месяцы

Рис. 2. Общая и безрецидивная выживаемость больных РТК и зависимости от содержания Р-са1 в аденокарцнномах толстой кишки (сравнение групп больных с высокой и низкой экспрессией Р-са^.

Экспрессия белка часто была низкой не только в первичных метастазирующих опухолях, но и в их метастазах в печени и других органах Не обнаружено достоверной взаимосвязи между экспрессией белка СС44\б и основными клинико-морфологическими параметрами заболевания Отмечена тенденция к уменьшению накопления маркера при наличии метастазов опухолей в отдаленных органах (р=0 053) (табл. 3) Анализ прогностической значимости содержания СЭ44у6 в опухолях не выявил взаимосвязи маркера с показателями общей и безрецидивной выживаемости больных РТК

Показано, что изменения экспрессии молекул межклеточной адгезии не всегда сопровождаются нарушениями ультраструктурной организации эпителиальных клеточных контактов в первичных РТК и их метастазах в печени Нами описаны ультраструктурные особенности нескольких типов клеточных контактов, представляющих различные формы межклеточного взаимодействия Среди них - плотные контакты, зоны адгезии, десмосомы, полудесмосомы и интердигитации" при установлении таких контактов могут образовываться комплексы, включающие клетки с различной метастатической способностью. Клетки, сохраняющие ультраструктурные признаки специфической дифференцировки и особенности организации

клеточных контактов, свойственные исходным органам и тканям, обнаружены как в первичных опухолях, так и в их метастазах в лимфатических узлах и печени Зоны адгезии ("zona adhaerence") выявлены электронно-микроскопически в виде участков плотного соприкосновения апикальных мембран соседних клеток. Этот тип контактов является ключевым структурно-функциональным фактором, который участвует в синтезе и обмене белков межклеточной адгезии и передаче молекулярных сигналов роста между соседними клетками

Таблица 3. Уровень экспрессии молекул межклеточной адгезии в первичных аденокарщшомах толстой кишки с учетом статуса отдаленною мсгастазиропания опухолей

Маркер Число наблюдений (абс, %)

Уровень экспрессии Основная группа Контрольная группа Р

E-cad

низкий(+/-) 89/135, 65.9% 61/129, 47.3%

высокий (++/+++) 46/135, 34.1% 68/129, 52 7% 0 003*

p-cat

низкий(+/-) 39/135, 28 9% 63/129, 48.8%

высокий (++/+++) 96/135, 71 1% 66/129, 51.2% 0 001*

CD44v6

низкий(+/-) 89/135, 65.9% 69/129, 53.5%

высокий (++/+++) 46/135,34.1% 60/129, 46.5% 0 053

Примечание * статистически значимые показатели (р<0 05)

Таким образом, результаты исследования содержания молекул межклеточной адгезии в опухолях больных РТК свидетельствуют, что для прогностически неблагоприятных случаев РТК, сопровождающихся развитием у больных метастазов в печени, характерна с одной стороны редукция экспрессии Е-саё (в меньшей степени С044у6) в клетках аденокарцином, с другой стороны аккумуляция Р-са1 в цитоплазме и на определенном этапе накопление белка в ядрах раковых клеток Эти

изменения наблюдаются в первичных опухолях в процессе развития отдаленных метастазов, иногда задолго до клинического проявления прогрессии заболевания, и являются факторами неблагоприятного прогноза для больных РТК. При анализе прогностической значимости содержания белков в опухоли отмечена достоверная взаимосвязь между ядерной аккумуляцией р-са1 в клетках аденокарцином толстой кишки и уменьшением показателей безрецидивной выживаемости больных. В раковых клетках в метастазах в лимфатических узлах и печени белки демонстрировали такие же закономерности экспрессии, как и в клетках исходных новообразований.

Иммуногистожимичсскне и биохимические особишосги содержании ММР-2 и ММР-9 н РТК- В результате проведенного исследования показано, что наиболее значимо в опухолях больных РТК увеличивалась экспрессия ММР-9 {133/264; 50.4%) и несколько менее выражено - экспрессия ММР-2 {102/264; 38.6%). Л роте азы накапливались в цитоплазме раковых клеток (рис. За), иногда в клетках стромы вокруг опухолевых комплексов. Содержание ММР-9 особенно часто было повышено в зонах роста и инвазии опухоли {рис. 36).

Рис. 3. Экспрессия ММР-9 в опухолях больных РТК: а. ЦИТО плазматическая экспрессия ММР-9 в части клеток первичной опухоли (х250); б. Повышенное накопление ММР-9 и железистых структурах первичной опухоли в зоне ннвазнвного фронта (х(50).

В группе больных метастатическим РТК содержание ферментов в

опухолях значительно увеличивалось (табл 4). Повышенная экспрессия

ММР-2 и ММР-9 обнаруживалась в 45,9% (62/135) и 62,2% (84/135)

опухолей при наличии у больных РТК отдаленных метастазов по сравненшо

с 31,0% (40/129) и 38,0% (49/129) опухолей в группе пациентов без

метастазов в печени (р~0 018 и р=0 0001, соответственно)

Таблица 4. Анализ экспрессии ММР-2 и ММР-9 в РТК в зависимости от клшшко-морфологических параметров заболевания

Экспрессия в раковых клетках Признак ММР"2 ММР-9

Высокая Низкая р Высокая Низкая р

и=102 «= 162 «=133 «=131

Возраст (лет) >60 58 111 81 88

<60 44 51 0 074 52 43 0 351

Пол м 50 77 61 66

ж 52 85 0 913 72 65 0.541

Т стадия т,,т2 30 36 26 40

Т3,Т4 72 126 0 243 107 91 0 055

Степень выс/ум 84 146 110 120

дифферен-ки низкая 18 16 0.100 23 11 0 048

Стадия по А/В 27 50 29 48

Dukes' C/D 75 112 0 532 104 83 0 012

Метастазы в + 76 102 97 81

лимфоузлах - 26 60 0 070 36 50 0 073

Метастазы в + 62 73 84 51

печени — 40 89 0 018* 49 80 0 000

Лимфоидная + 37 41 32 46

инфильт-ция - 65 121 0 078 101 85 0 067

Инвазия + 40 51 45 36

сосудов - 62 111 0 248 88 95 0 324

Локализация пр/пол 34 55 39 50

опухоли лев/пол 68 107 0.976 94 81 0 165

Слизеобразо- + 30 37 27 40

вание 72 125 0 294 106 91 0 077

Примечание * - статистически значимые показатели (р < 0 05)

У больных РТК с синхронными метастазами в печени позитивная экспрессия протеаз в опухолях выявлялась чаще (ММР-2 - 32/63, 50 8%, ММР-9 — 40/63, 63 5%), чем в метахронной метастатической группе (ММР-2 - 20/47, 42.5%, ММР-9 - 28/47, 59.6%).

Высокий уровень экспрессии ММР-9 встречался почти в 2 раза чаще у больных РТК с синхронными метастазами в печени, чем в контрольной группе и, кроме того, сочетался с низким уровнем гистологической дифференцировки опухоли (р=0.048) и увеличением глубины опухолевой инвазии (р=0 012)

Однофакторный анализ показал, что гиперэкспрессия ММР-9 в опухоли в 3.4 раза увеличивала риск развития отдаленных метастазов и/или рецидивов опухоли в первые 3 года после операции и сочеталась с ухудшением как общей (¿>=0.001), так и безрецидивной (р=0 01) выживаемости больных РТК (рис. 4). *

Общая выживаемость, %

Безрецпдпвиая выживаемость, %

О 20 « ю_ низкий ММР-9

Длительность -высокий ММР-9 наблюдения, месяцы

. я « " — НИЗКИЙ ММР-9 Время наблюдения, . . высокий ММР-9 месяцы

Рис. 4. Общая и безрсцидивпая выживаемость больных РТК в зависимости от продукции ММР-9 в опухоли (сравнение групп больных с высокой и низкой экспрессией ММР-9).

При иммуноферментном определении ММР-9 в опухоли (рис 5а) у 60 0% больных отмечено увеличение содержания фермента по сравнению с окружающей тканью, однако средние и медианные значения этого показателя достоверно не различались (62 0±5 7, медиана 62 8 и 51 7±5 5,

медиана 48.7, соответственно). Сравнительный анализ концентрации ММР-9 в плазме крови больных РТК (рис. 56) до начала лечения и после удаления первичной опухоли, а также в контрольной группе показал достоверное повышение медианных показателей у больных РТК (140.0 нг/мл) по сравнению с таковыми в контрольной группе (32.9 нг/мл), при этом верхняя граница нормы была превышена у 64.0% пациентов (р<0.01).

Рис. 5. И мму но ферментное определение ММР-9 в опухоли Н сыворотке крови больных РТК: а. Содержание ММР-9 в опухоли повышено гю сравнении» с неизмененной слизистой оболочкой толстой кишки; б. Концентрация ММР-9 в плазме кропи больных РТК достоверно повышена по сравнению с контролем.

Полученные данные позволяют предположить, что ММР-9 является важным показателем для клинического наблюдения и оценки прогноза заболевания пациентов с данной локализацией опухолевого процесса.

Особенности содержания компонентов системы активации плазмнногена (uPA, tPA, РАН) в опухолях больных РТК. По данным им му ноферментного исследования средние уровни плазминогена урокиназцогр типа и cío ингибитора в опухолях больных РТК достоверно повышены по сравнению с непораженной слизистой оболочкой толстой кишки (рис. 6а). Для üPA эти показатели составили в опухоли - 2.07 пг/мг белка и в слизистой оболочке толстой кишки — 0.64 нг/мг белка. Аналогичная тенденция отмечена для РА1-1, показатели которого в опухоли и слизистой оболочке составили 2.52 пг/мг и 1.1 нг/мг, соответственно. Для tPA

наблюдалась обратная зависимость: показатели содержания белка в слизистой оболочке (4,62 нг/мг) были выше, чем в опухоли больных РТК (2.95 нг/мг).

Показатели содержания белков в опухоли не зависели от наличия или отсутствия рецидива и метастазов РТК в первый год после операции (рис. 66). Не обнаружено достоверной взаимосвязи концентраций иРА, РЛ1-1 и 1РЛ с основными клипико-морфологическими факторами прогноза РТК (стадией, характером роста, локализацией, глубиной инвазии и степенью дифференцировки опухоли).

Концентрация, иг/мг белка Концентрация, яг/мг белка

иРА iPA PAt-1 , и PA tPA РАИ

Piic. 6. Содержание основных компонентон системы активации плазм и н о ген а в РТК: а. Уровни белков в опухоли и неизмененной слизистой оболочке толстой кишки; б. Уровни белков при раннем рецидиве РТК.

Таким образом, при РТК наблюдали достоверное увеличение концентраций иРА в опухолевой ткани по сравнению с неизмененной слизистой оболочкой толстой кишки.

Иммуншистохимическне и ультра структурные особенности Эпителиальных базальных мембран в РТК. В настоящем исследовании в аденокарциномах толстой кишки при иммуногистохимическом окрашивании опухолей на Coll IV и Lam (рис. 7а) и электронно-микроскопическом изучении внеклеточного матрикса (рис. 76) в ряде случаев выявлены тонкие структуры базальиых мембран вокруг опухолевых комплексов.

I'nc. 7. Компоненты внеклеточного матрикса н опухолях больных РТК: а. Иммуногнстохнмнческое определение Coll IV в базальиых мембранах вокруг железистых опухолевых комплексов и сосудов (х!50); б. Ультраструктурные признаки базальной мембраны (стрелки), окружающей раковые клетки п метастазе в печени (х15000). Я - ядро, БМ - базальная мембрана, М - митохондрии, 13КМ - внеклеточный матрикс.

В метастаз и руга i цих адепокарциномах толстой кишки по сравнению с опухолями без отдаленных метастазов чаще наблюдали исчезновение Coll IV- и Lam-позитивной окрашенности базальных мембран (р=0.0001), а также увеличение иммунореактивностя в фибриллярных компонентах стромы и появление аномальной экспрессии Lam в цитоплазме раковых клеток (/;=0.007). Отложения ламинлна в цитоплазме раковых клеток были наиболее интенсивными вдоль инфильтративнош края опухоли. Сопоставление экспрессии Lam с кл и н и ко -м орф о л оги ч ее к и м и параметрами позволило выявить значимую ассоциацию аномального накопления белка в цитоплазме раковых клеток с местной инвазивностыо РТК в соответствии со стадией по Dukes (А-С) (р=0.001) и инфильтративным характером роста (р=0.0001). Статистически значимые различия также были отмечены между высокой экспрессией маркера и уменьшением степени дифферениировки опуходи (р~0.002). Экспрессия белка не была связана с локализацией опухоли в правой или левой половине толстой кишки и с вероятностью развития местных рецидивов. Однофакторный анализ не подтвердил значение Coll IV

и Lam для прогноза безрецидивной выживаемости больных РТК (р=0 11 и р=0 4, соответственно).

Отсутствие Coll IV-позитивных базальных мембран и цитоплазматическое отложение ламинина в клетках опухоли сочетались с повышенной экспрессией ММР-9 в метастазирующих РТК Таким образом, повышенное содержание ММР-9 и накопление Lam в цитоплазме раковых клеток, а также отсутствие Coll IV-содержащих базальных мембран было характерно для аденокарцином толстой кишки с высоким инвазивно-метастатическим потенциалом.

Подводя итог анализу особенностей экспрессии данной группы факторов можно заключить, что две взаимосвязанные системы (кадхерин-катениновой межклеточной адгезии и протеолитического разрушения внеклеточного матрикса) играют ключевую роль в процессах инвазии и выявление закономерностей их функционирования и взаимодействия в процессе метастазирования РТК является основой для разработки новых диагностических и прогностических подходов к лечению опухолей данной локализации

Иммуногистохнмическое исследование особенностей содержания белка пш23 в PKT. В настоящем исследовании повышенное накопление белка nm23 в цитоплазме клеток первичной опухоли (рис 8а) наблюдали в 53 4% (141/264) случаев Более выраженную экспрессия nm23 в опухолевых клетках отмечали в случаях РТК с метастазами в печени (табл 5) В основной группе больных РТК с развившимися метастазами в печени частота выявления высокого уровня экспрессии белка nm23 в первичной опухоли была достоверно выше, чем в контрольной группе пациентов без клинически выявленных отдаленных метастазов (89/135, 65 9% и 52/129, 40 3%, соответственно, р=0 0001) (табл 5)

Экспрессия белка nm23 увеличивалась при развитии отдаленных метастазов вне зависимости от таких важных прогностических критериев как

степень гистологической дифференцировки, размер опухоли, глубина

инвазии и вовлечение регионарных лимфатических узлов

Таблица 5. Экспрессия белка пш23 в опухолях больных РТК с учетом статуса отдаленного метастазирования

Экспрессия пш23 Первичные опухоли метастазы в печени метастазы в печени не обнаружены обнаружены (основная группа) (контрольная группа) Всего больных

(++/+++) 89, 65 9% 52, 40 3% 141

(+/-) 46,34 1% 77; 59 7% 123

Всего 135 129 264

Статистический анализ показал, что гиперэкспрессия пш23 в аденокарциномах толстой кишки ассоциирована с уменьшением показателей безрецидивной выживаемости больных РТК (р<0 01) (рис 86) Относительный риск развития метастазов в печени не позднее 3 лет после операции был в 3 3 раза выше при неблагоприятном, высоком уровне экспрессии маркера в опухолях больных РТК по сравнению с пациентами с пш23-негативным статусом опухоли Повышенное накопление белка пш23 выявили в 57 5% (73/127) метастазов РТК в лимфатических узлах (рис 8в) и в 66 4% (73/110) - в печени (рис 8г)

К особенностям экспрессии белка пгп23 на поздних этапах развития РТК можно отнести его повышенное содержание в клетках первичных опухолей и метастазов, преимущественно цитоплазматический характер накопления маркера и редкое появление ядерной иммунореактивности, а также значительные отличия в характере экспрессии белка в клетках первичных и метастатических опухолей Белок пш23 демонстрировал расхождения в частоте выявления и в уровне экспрессии как в сторону уменьшения, так и увеличения выраженности реакции в метастазах по сравнению с первичной опухолью Кроме того, увеличенное накопление

белка в зонах инвазии!того фронта опухоли выявлено только н клетках отдаленных метастазов РТК.

Рис. 8. Экспрессия белка nni23 в первичных опухолях и метастазах РТК: а. Окрашивание части клеток умеренноднфференцированной аден о карциномы толстой кишки (х250); б. Безрецнднвиая выживаемость больных РТК в зависимости от содержания белка um2.1; п. Накоплений белка в клетках метастаза РТК в лимфатическом узле (х200); Г. Экспрессия белка в цитоплазме раковых клеток метастаза а печени (х 180).

Таким образом, изучение изменений экспрессии белка пт23 на поздних стадиях развития опухолевого процесса не позволяет подтвердить гипотезу о роли маркера как супрессора метастазирования. Прослеживается тенденция к увеличению накопления белка nm23 п метастазах РТК в печени, а также в первичных метастазирующих опухолях толстой кишки. Эти факты свидетельствуют в пользу предположения, что белок по-разному функционирует на ранних этапах канцерогенеза и в период рецидивировавия и метастазирования опухоли.

Иммуногистохимическое исследование Экспрессии белки с-егЬВ-2 и РТК. Функционирование многих молекулярно-биологичёских факторов, в том числе маркеров межклеточной адгезии и апоптоза, находится в тесной взаимосвязи с таким важным фактором опухолевой профессии как онкобелок с-егЬВ-2. Результаты проведенного исследования позволили выявить наличие умеренного или сильного окрашивания мембраны > 10% раковых клеток в 10.2% (27/264) опухолей больных РТК (рис. 9а). В большинстве изученных случаев наблюдали накопление белка в цитоплазме раковых клеток (153/264; 58.0%). Мембранная гиперэкспрессия белка с-егЬВ-2 демонстрировала тенденцию к увеличению при развитии у больных метастазов в печени (р=0,057), при этом не зависела от известных факторов риска: размера опухоли, вовлечения регионарных лимфатических узлов, степени гистологической дифференцировки и экспрессии в клетках первичной опухоли других маркеров. При статистическом анализе полученных результатов показано, что обнаружение с-егЬВ-2-позитивных клеток в первичной опухоли является фактором неблагоприятного прогноза, предсказывающим ухудшение безрецидивной выживаемости больных РТК (р=0.001) (рис. 96).

Рис. 9. Экспрессия опкобелка с-егЬВ-2 при РТК: а. Мембранное окрашивание большинства раковых клеток (х400); б. Без ре ц ид и в на я выживаемость больных РТК в зависимости от экспрессии с-егЬВ-2.

Гиперэкспрессия c-erbB-2 на поверхности метастатических клеток определялась в 11 8% (15/127) при поражении лимфатических узлов и в 10 9% (12/110) при поражении печени

Небольшое число c-erbB-2-позитивных первичных аденокарцином толстой кишки (10 2%) ограничивает значение маркера при опухолях данной локализации

Иммуногнстохнмическне особенности экспрессии белка р53 в РТК.

Подавление р53 зависимого апоптоза увеличивает жизнеспособность опухолевых клеток и ведет к значительному повышению вероятности метастазирования [Russo A et al, 2002; Saw R Р et al, 2002] Полученные нами данные указывают, что белок р53 накапливается в ядрах раковых клеток примерно в половине случаев исследованных первичных аденокарцином толстой кишки (43.2%; 114/264), а также их метастазов в лимфатических узлах (48 0%, 61/12.7), печени (52 7%, 58/110) и местных рецидивов (47 1%, 16/34) (рис 10а)

Наблюдается близкое к достоверному повышение ядерной аккумуляции белка р53 (р=0 073) в опухолях больных с метастазами в печени по сравнению с пациентами без клинически выявленных метастазов Кроме того, отмечается тенденция к увеличению содержания белка р53 в случаях опухолей толстой кишки с большой глубиной инвазии в кишечную стенку, а также при наличии местных рецидивов и прорастания опухоли в соседние органы и ткани Аккумуляция р53 в ядрах опухолевых клеток (>10%) ассоциировалась не только с признаками местной и отдаленной распространенности опухоли, но и с ухудшением показателей общей (р=0 001) и безрецидивной (р=0 01) выживаемости больных РТК (рис 106) Кроме того, результаты исследования показывают, что белок р53 является фактором, прогнозирующим выживаемость и риск развития рецидивов после операции резекции печени по поводу метастазов (р=0 04)

Таким образом, гиперэкспрессия р53 ассоциируется с высоким риском развития отдаленных метастазов, местных рецидивов и низкой безрециднвпой выживаемостью больных РТК.

Рис. 10. Экспрессия белка р53 в РТК: а. Ядерная аккумуляция белка в кДеткаХ первичной опухоли (х250); б. Безрецндивная выживаемость больных РТК в зависимости от уровня экспрессии белка р53 в опухоли.

Обобщая выявленные особенности экспрессии данной группы факторов (c-erbB-2, nm23 и р53), следует отметить, что белки демонстрируют сходные закономерности экспрессии в клетках опухолей больных РТК при развитии отдаленных метастазов и в комплексе с другими клинико^морфодогическими параметрами могут давать дополнительную диагностическую информацию, характеризующую особенности течения и прогноз заболевания.

Биохимическое исследование экспрессии растворимого Fas-антигена (sFas) в сыворотке крови больных РТК. Изменения в соотношение процессов пролиферации и апоптоза во многом определяют Приобретение раковыми клетками дополнительных признаков, облегчающих метастазирование. Иммуноферментное определение sFas, регулирующего развитие Fas-опосредуемого апоптоза, показало увеличение частоты выявления и концентрации белка в сыворотке крови больных РТК по сравнению С практически здоровыми людьми (группа контроля) (рис. 11а). В

настоящем исследовании sFas был обнаружен в образцах сыворотки Крови 73.5% больных РТК в концентрации от 0.6 до 4.2 иг/мл. Частота выявления sFas в сыворотке крови практически здоровых людей составила 33.3%, показатели его количественного содержания варьировали в пределах от 0.5 до 0.9 иг/мл. Среднее содержание sFas (2.4±1.1 нг/мл) в сыворотке кропи больных РТК было вьнце соответствующего показателя в группе контроля (0.9±0.1 нг/мл) (рис. 116). Более того, концентрация sFas увеличивалась с ростом стадии заболевания и была максимальной при наличии у больных РТК отдаленных метастазов (рис. Пв). Следует отметить, что sFas был обнаружен у всех больных РТК в стадии D по Dukes, причем в наиболее высоких концентрациях (4.67 нг/мл). Средний уровень sFas в этой группе был достоверно выше данного показателя в контроле (р<0.05).

Частота пмяплспия, %

КоНЦСПТрШДОЯ, нг/мл г,4

Г К "Я 11 pn I II.

ImLJ

Рис. П. Иммуноферментиое определение sFas в сыворотке крови больных РТК и в контроле: а. Частота выявления sFas в сыворотке крови больных РТК и в контроле; б. Уровни sFas в сыворотке крови больных РТК н в контроле; в. Уровни sFas в сыворотке крови больных РТК с учетом стадии по Duke's.

Не обнаружено зависимости между концентрацией sFas и степенью дифференцировки опухоли, однако, чаще sFas выявляли в образцах сыворотки крови больных РТК, опухоли которых имели высокую степень дифференцировки Частота выявления и средний уровень sFas в сыворотке крови больных РТК не зависел достоверно от глубины инвазии опухолью кишечной стенки, вместе с тем наиболее часто sFas выявляли в сыворотке крови пациентов, опухоли которых прорастали все слои стенки толстой кишки Более высокий средний уровень sFas наблюдали в сыворотке крови больных РТК с наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах по сравнению с его показателями в группе пациентов без поражения лимфатического аппарата, однако эти различия также не были статистически достоверными

Таким образом, в результате проведенного исследования показано, что частота выявления и уровень sFas в сыворотке крови больных РТК выше, чем у практически здоровых людей Выявлена тенденция к повышению концентрации sFas в сыворотке крови с увеличением распространенности опухолевого процесса, при этом у больных с диссеминированным поражением среднее содержание sFas достоверно выше этого показателя в контроле

Иммуногнстохнмические особенности экспрессии белков Вс1-2 и Вах в РТК. Положительная экспрессия антиапоптотического белка Вс1-2 была выявлена в 35 4% (67/264) исследованных первичных РТК, в 29 1% (37/127) метастазов РТК в лимфатических узлах и в 24 5% (27/110) метастазов РТК в печени в виде диффузного цитоплазматического окрашивания, более интенсивного в участках цитоплазмы вокруг ядер Положительная экспрессия проапоптотического белка Вах была выявлена в 27 7% (73/264) исследованных первичных РТК, в 30 7% (39/127) метастазов в лимфатических, в 26 4% (29/110) метастазов в печени и имела вид неоднородного мелкозернистого окрашивания цитоплазмы Повышенная экспрессия Вс1-2 отмечена чаще при ранних (Dukes А и В), чем при поздних

(Dukes С и D) стадиях РТК (р=0 030) Кроме того, обнаружена тенденция к увеличению частоты выявления высокого уровня экспрессии белка при отсутствии метастазов опухоли в регионарных лимфатических узлах (р=0 087) и печени (р=0 056) Положительную экспрессию Вах в первичных опухолях при метастатическом РТК обнаруживали реже, чем в аденокарциномах толстой кишки без отдаленных метастазов (р=0 060) Вероятность развития апоптоза при оценке с помощью соотношения экспрессии Bcl-2/Bax у больных РТК с метастазами в печени была снижена, однако также не была достоверно связана с наличием у больных отдаленных метастазов

Анализ прогностической значимости содержания белков семейства Вс1-2 в опухолях толстой кишки позволил выявить, что низкий иммуногистохимический уровень экспрессии белков Вс1-2 (рнс 12а) Вах (рис 126) являлся неблагоприятным прогностическим признаком, достоверно ухудшающим показатели безрецидивной выживаемости больных РТК (р=0 02 и р=0 004, соответственно)

-высокие Вс1-2 - низкие Bel 2

— низкие Вах '- - высокие Вах

Враиа яабмодема* нмзвцы

Рис. 12. Безрецидивнаи выживаемость больных РТК в зависимости от экспрессии Вс1-2 (а) и Вах (б) (сравнение групп больных с высокой и низкой экспрессией маркеров).

Более всего с благоприятными признаками течения заболевания была связана позитивная экспрессия ингибитора апоптоза Вс1-2 Особенно отчетливо высокая экспрессия Вс1-2 была связана с лучшим клиническим

течением заболевания в подгруппе больных с опухолями, демонстрирующими отсутствие р53 иммунореактивности

Иммуногнстохимнческое исследование иролиферативной активности первичных опухолей и метастазов РТК. Индексы пролиферации Ki67 варьировали в широких пределах в первичных метастазиругощих опухолях и их метастазах в лимфатических узлах и печени и не отличались достоверно от таковых в опухолях больных РТК, которые не имели метастазов в печени У 53 4 % (141/264) больных РТК выявлен высокий уровень пролиферативной активности Ki67 в первичных опухолях, при этом большой процент К1б7-позитивных клеток (>50%) отмечен в 35 случаях и умеренные индексы пролиферации (20%-40%) - в 106 наблюдениях (рис 13а)

Индексы пролиферации PCNA были высокими (>20%) в большинстве изученных первичных РТК (199/264, 75 4%), а также их метастазов в печени (рис 136)

Процент Кл67-позитивных клеток был выше в опухолях больных РТК на поздних Т стадиях (ТЗ-4) по сравнению с ранними стадиями (Т1-2) и у больных с отдаленными, особенно синхронными, метастазами в печени по сравнению с пациентами без метастазов, однако различия не достигали достоверности (р=0 093 и р=0 078) Индексы пролиферации Ki67 уменьшались при увеличении степени дифференцировки первичных опухолей толстой кишки и их метастазов (р=0 067 и р=0 172, соответственно).

При увеличении процента К167-позитивных клеток наблюдали статистически значимое снижение показателей общей 5-летней выживаемости, которые составили 65 1±0 05% при индексе Ki67 < 20% и 37 0% при индексе KÍ67 > 20% (р=0 0003) (рис 13 в) Однако экспрессия маркера не была связана с показателем безрецидивной выживаемости больных РТК (р=0 8) (рис 13г) Высокий уровень экспрессии PCNA также был ассоциирован с ухудшением общей выживаемости больных РТК (р=0 02)

(рис. 13д), но не демонстрировал связи с безрецидивной выживаемостью (р=0.9) (рис. 13е).

Viivl-i'r's* ■ '

■ ¡<ч о ,! v Щ л

Рис. 13. Маркеры пролиферативной активности при РТК: а. Экспрессия Ki67 в клетках первичной опухоли (х15(>); б. Экспрессия PCNA в клетках метастаза в печени (х250); в. Общая выживаемость больных РТК в зависимости от экспрессии Ki67 в опухоли; г. Безрецидивная выживаемость больных РТК в зависимости от экспрессии Ki67 и опухоли; д. Общая выживаемость больных РТК в зависимости от экспрессии PCNA в опухоли; е. Кезрецнднвная выживаемость больных РТК в зависимости от экспрессии PCNA в опухоли.

Таким образом, высокий уровень экспрессии маркеров пролиферативпой активности следует считать признаком неблагоприятного прогноза при оценке показателей общей выживаемости, но не связанным с показателем безрецидивной выживаемости больных РТК. Результаты исследования позволяют предположить, что, несмотря на то, что апоптоз и клеточная пролиферация являются взаимосвязанными процессами, оказывающими сильное влияние на биологическое поведение опухолей, при оценке риска метастазирования РТК экспрессия этих факторов должна учитываться в комплексе с маркерами более тесно связанными с инвазивным потенциалом раковых клеток

Ультраструктурные признаки дифферснцнровки и апоптоза в первичных РТК и их метастазах. Проведенное электронно-микроскопическое исследование показало неоднородность

ультраструктурной организации как первичных метастазирующих опухолей, так и их отдаленных метастазов Кроме того, ультраструктурная организация метастазов не всегда повторяла строение первичной опухоли Соотношение ультраструктурно дифференцированных (рис. 14а) и недифференцированных клеток в пользу последних было связано с увеличением индекса пролиферации Ki67 (р=0 015), выявленного иммуногистохимически в тех же опухолях, и послужило ключевым показателем, отражающим зрелость опухоли и взаимосвязь с неблагоприятным прогнозом общей выживаемости (р=0 00008) Кроме того, электронно-микроскопическое исследование продемонстрировало возможность морфологической идентификации апоптоза по состоянию ультраструктуры митохондрий и ядра (рис 146), что может являться дополнительным критерием данного процесса («маркером» апоптоза) Таким образом, ультраструктурные особенностей клеток РТК, в комплексе с иммуногистохимическими и биохимическими данными, помогают определить степень зрелости и агрессивности опухолевого процесса и более объективно проводить морфологическое исследование и дифференциальную диагностику новообразований данной локализации

Рис. 14. Ультра структурные особенности дифференцирован и признаки а not поза и РТК: а. Раковые клетки тина каемчатых энтсроцитов с типичными пучками тоиофнбрнлл (стрелки) в основании микроворенпок (хЮООО). б. Конденсация хроматина н изменение структуры сконцентрированных вокруг ядра мнггохондрпй в раковой клетке в состоянии зпоптоза {х20000). М - митохондрии, MB — микроворсинки,Я - ядро.

Миогофакторный анализ комплекса клиника-морфологических и молекулярно-биолотческих факторов в оценке прогноза РТК. Нами проведен многофакторный анализ выживаемости больных РТК без учета содержания молекулярно-биологических маркеров в опухолях, который подтвердил прогностическую значимость основных клиниксь морфологических параметров заболевания.

Многофакторный анализ общей выживаемости больных РТК показал, что независимыми и значимыми прогностическими признаками следует считать: степень дифференцироаки опухоли (р=0.00001), наличие инвазии сосудов (р-0.00001), глубину инвазии опухоли (р=0.001), наличие метастазов в регионарных лимфатических узлах (р=0.022).

Много факторный анализ безрецидивной выживаемости больных РТК определил, что независимыми и значимыми прогностическими признаками являются; глубина инвазии опухоли (р=0.0002), наличие метастазов в регионарных лимфатических узлах (р=0.001), степень дифференцировки опухоли (р-0.02).

При однофакторном анализе выявлено, что содержание большинства изученных белков в опухолях обладает определенной прогностической ценностью, однако, при многофакторном анализе в группах со сходными клиническими и морфологическими признаками, были выявлены различия в прогностической значимости некоторых маркеров и определены наиболее ценные независимые показатели

Многофакторный анализ общей выживаемости больных РТК с учетом содержания маркеров в опухоли показал, что независимыми и значимыми прогностическими признаками следует считать- глубину инвазии опухоли (р=0 0004), степень дифференцировки опухоли (р=0 003), белки Coll IV (р=0 003), Вс1-2 (р=0 02)

Многофакторный анализ безрецидивной выживаемости больных РТК выявил, что независимыми и значимыми прогностическими признаками являются маркеры P-cat, ММР-9, nm23, р53 (р=0 0003)

Многофакторный анализ определил, что наиболее значимыми молекулярно-биологическими факторами, прогнозирующими выживаемость и риск развития рецидивов в группе больных РТК, перенесших операцию резекции печени по поводу метастазов, являются белки р53, p-cat и ММР-9

При изучении взаимосвязи между содержанием маркеров в опухолях больных РТК с помощью «факторного» анализа выделено 3 группы маркеров, демонстрирующих согласованные изменения в опухолях (рис 15) К первой группе белков (1 фактор), наиболее тесно связанных с повышенным риском метастазирования, относятся p-cat, ММР-9, пт23, р53 В данную группу вошли основные маркеры инвазии из семейства молекул межклеточной адгезии (P-cat), протеолитических ферментов внеклеточного матрикса (ММР-9), супрессоров метастазирования (шп23) и регуляторов клеточного цикла (р53) Вторую группу белков (2 фактор) составили маркеры пролиферативной активности Ki67, PCNA, а также белки ММР-2 и Lam. Третья группа белков (3 фактор) объединила маркеры апоптоза Вс1-2 и Вах

■ нее неблагоприятные Овсе благоприятные К различаются

Рис. 15. Связь между содержанием маркеров в опухолях больных РТК.

При изучении согласованных изменений экспрессии маркеров установлено, что белки 1 общего фактора, важные для оценки безрецндивной выживаемости больных РТК, демонстрировали согласованно неблагоприятные изменения в 39%, благоприятные - в 34% и расхождения экспрессии - в 27% наблюдений.

При изучении прогностической значимости комплексного определения белков В опухоли установлено, что такие морфологические признаки как низкая степень дифференцировки опухоли и наличие прорастания опухоли в сосуды снижали прогностические возможности большинства маркеров.

Показано, что у больных РТК III стадии с благоприятными морфологическими признаками для выделения [руипы с высоким риском развития метастазов в печени в первые 3 года после операции следует определять маркеры: (3-cat, ММР-9, пш23, р53 (1 общий фактор). Так, 3-летняя безрецидивная выживаемость составила 19,3±П.5% При одновременно неблагоприятных, 72.8+7.0% при благоприятных и 68.3±8.0% при различающихся уровнях экспрессии указанных маркеров. Анализ согласованных изменений экспрессии белковых маркеров в опухоли может иметь прогностическую ценность и давать дополнительную информацию в отношении риска развития метастазов в печени у больных после хирургического лечения но поводу РТК.

Заключение. Подводя итог проведенного исследования, следует заключить, что процессы инвазии и метастазирования РТК сопровождаются значительными изменениями иммунофенотипа клеток первичных опухолей и метастазов и затрагивают многие биохимические процессы. Нарушения функционирования и экспрессии специфических маркеров, определяемых в цитоплазме и ядрах раковых клеток, а также внеклеточном матриксе и базальных мембранах, влияют на целый ряд клеточных характеристик и приводят к возникновению злокачественного фенотипа, что в последствии способствует прогрессии опухоли, развитию отдаленных метастазов и ухудшению выживаемости больных РТК. Таким образом, наряду с основными классическими параметрами, определяющими риск прогрессии РТК, такими как стадия и степень дифференцировки, важную роль для оценки прогноза заболевания играют молекулярно-биологические факторы инвазии, содержание которых часто различается в пределах небольших подгрупп опухолей со сходными морфологическими признаками

Анализ полученных данных позволил выделить иммунофенотип, характеризующий варианты аденокарцином толстой кишки с благоприятным и неблагоприятным течением заболевания, а также определить наиболее надежные признаки повышенного риска отдаленного метастазирования, которые могут использоваться для индивидуального прогнозирования течения заболевания и формирования групп риска среди больных РТК К неблагоприятной прогностической группе относятся больные РТК, в опухолях которых определяется ядерная аккумуляция Р-са1 и р53, и цитоплазматическая гиперэкспрессия ММР-9 и пт23 Принадлежность пациента по результатам оценки экспрессии маркеров к группе неблагоприятного прогноза позволяет предложить более тщательную программу диагностических мероприятий, проведение расширенного объема обследований, планирование адъювантной химиотерапии на более ранних стадиях РТК

43

ВЫВОДЫ

1. Иммуногистохимическое исследование первичных и метастатических РТК выявило изменения молекулярно-биологических характеристик опухолевых клеток, с которыми ассоциирован риск развития отдаленных метастазов На основании полученных результатов установлено, что системы кадхерин-катениновой межклеточной адгезии и протеолитического разрушения внеклеточного матрикса наиболее тесно связаны с инвазивно-метастатическим потенциалом опухоли

2. Показателями неблагоприятного прогноза и повышенного метастатического потенциала РТК являются, отсутствие или редукция экспрессии E-cad в раковых клетках; увеличение количества p-cat в цитоплазме и аккумуляция белка в ядрах раковых клеток, сочетание высокого уровня ядерного P-cat с минимальной экспрессией E-cad При этом показано, что высокий уровень содержания p-cat в опухоли был значимо связан с ухудшением общей и безрецидивной выживаемости больных РТК Риск развития метастазов в печени в первые 3 года после операции в группе больных с P-cat-позитивными опухолями возрастал в 2 7 раза

3. Показателем метастатического фенотипа РТК является высокий уровень содержания в опухоли и сыворотке крови больных внеклеточных протеолитических ферментов ММР-9, ММР-2 и компонентов системы активации плазминогена uPA, PAI-I Показано, что гиперэкспрессия ММП-9 в опухоли достоверно связана с высокой частотой отдаленных метастазов после операции и с ухудшением общей и безрецидивной выживаемости больных РТК Риск развития метастазов в печени в первые 3 года после операции у пациентов с антиген-позитивными опухолями увеличивался в 3 4 раза

4 Экспрессия структурных компонентов базальных мембран Coll IV и Lam достоверно связана с наличием метастазов РТК в печени Неблагоприятными иммуногистохимическими показателями являются уменьшение Coll IV- и

Lam-позитивной окрашенности базальных мембран, накопление Lam в цитоплазме раковых клеток Многофакторный анализ показал, что Coll IV наряду с глубиной инвазии и степенью дифференцировки опухоли следует считать независимым показателем прогноза общей выживаемости больных РТК

5 Высокая пролиферативная активность клеток РТК, исследованная с помощью индексов Ki67 и PCNA, является достоверным фактором неблагоприятного прогноза общей выживаемости, но не связана с показателями безрецидивной выживаемости больных РТК

6. Установлены следующие закономерности в изменении экспрессии факторов апоптоза - белков семейства Вс1-2 и sFas при РТК- достоверное повышение среднего содержания sFas в сыворотке крови больных РТК с диссемининрованным процессом по сравнению с этим показателем в контроле, низкий уровень экспрессии белков Вс1-2 и Вах в метастазирутощих РТК, высокий уровень экспрессии Вс1-2 при благоприятном клиническом исходе и прогнозе выживаемости.

7 Показателями неблагоприятного прогноза при анализе метастатической активности опухолей и показателей выживаемости больных РТК были высокий уровень содержания nm23 в цитоплазме раковых клеток, ядерная аккумуляция р53, мембранная гиперэкспрессия с-егЬВ-2. Высокий уровень экспрессии белков nm23 и р53 в опухолях больных РТК был достоверно связан с низкой безрецидивной выживаемостью больных РТК Риск развития метастазов в печени в первые 3 года после операции возрастал в 3 5 раза при неблагоприятном высоком уровне экспрессии маркеров в опухолях больных РТК

8. Специфические изменения экспрессии молекулярно-биологических маркеров в инвазивном компоненте РТК тесно связаны с метастатической активностью опухолей Показателями высокого метастатического потенциала являются следующие изменения экспрессии белков в зонах роста

и инвазии опухоли повышенная ядерная аккумуляция p-cat, гиперэкспрессия ММР-9 в цитоплазме раковых клеток, аномальная цитоплазматическая экспрессия Lam

9. Результаты исследования свидетельствуют, что аденокарциномы толстой кишки в течение длительного времени сохраняют метастатический иммунофенотип, при этом сходные изменения наблюдаются в отдаленных метастазах опухолей Для метастазов РТК в печени характерны следующие изменения содержания белков гиперэкспрессия P-cat, ММР-9, Lam, nm23, р53, тенденция к увеличению накопления ММР-2 и с-егЬВ-2 и редукция экспрессии E-cad, CD44v6 и Coll IV

10. Электронно-микроскопическое исследование выявило, что варианты аденокарцином толстой кишки, в которых преобладают ультраструктурно недифференцированные раковые клетки, достоверно связаны с неблагоприятным прогнозом общей 'выживаемости и высоким индексом пролиферативной активности Ki67.

11. Многофакторный анализ прогностической значимости комплекса клннико-морфологических признаков с учетом экспрессии молекулярно-биологических маркеров позволил выявить тесную связь между белками р~ cat, ММР-9, шп23 и р53 и рассматривать согласованные изменения их экспрессии как общий независимый фактор прогноза безрецидивной выживаемости больных РТК. Безрецидивная 3-летняя выживаемость составила 19,3±11,5% при одновременно неблагоприятных, 72,8±7,0% при благоприятных и 68,3±8,0% при различающихся уровнях указанных маркеров Полученные результаты позволяют рассматривать иммуногистохимический анализ белков p-cat, ММР-9, nm23 и р53 в опухоли как метод прогнозирования развития отдаленных метастазов у больных РТК после операции

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Делекторская В В , Перевощиков А Г , Кушлинский Н Е Экспрессия белков пш23 и с-егЬВ-2 в клетках первичного колоректального рака и его метастазов // Архив патологии - 2003 — том 65, №5. - с 11-18

2 Delektorskaya V , Perevoschikov А , Kyshhnsky N Е Prognostic value of run 23 and c-erbB-2 expression in colorectal cancer // Virchows Archiv - 2003 -v 443, №3 - p 390 (P-302)

3 Делекторская В В, Перевощиков А Г, Кушлинский Н Е Иммуногистохимическое исследование экспрессии пш23 и с-егЬВ-2 в первичной опухоли и метастазах аденокарциномы толстой кишки // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2003 - том 135, №5 -с 575-581

4 Delektorskaya V, Perevoschikov А, Kyshhnsky N Е Expression of nm23 and c-erbB-2 proteins in metastatic colorectal adenocarcinomas // From tumor biology to clinical oncology» Abstracts of the XXXIst Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicme, ISOBM (Edinburgh, United Kingdom, August 30-September 4, 2003) - Edinburgh, United Kingdom - 2003 - p 56 (P-28)

5 Делекторская В. В, Перевощиков А Г, Кушлинский Н Е Иммуногистохимическое исследование экспрессии nm23 и с-егЬВ-2 при раке толстой кишки // В материалах IX научной конференции «Новые направления и разработки в онкоморфологии» (Москва, 16-18 апреля 2003г) - М - 2003 - с 8-9

6 Делекторская В В, Перевощиков А Г, Кушлинский Н Е Особенности экспрессии белков nm23 и с-егЬВ-2 в клетках метастазов колоректалыки о рака // В материалах XI Российского Национального Конгресса «Человек и лекарство» (Москва, 19-23 апреля 2004г ) - М - 2004 -с 141

7 Кушлинский Н Е , Исаков В А , Делекторская В В , Кусаинов Г X , Гольдберг В Е Колоректальный рак Опухолевые маркеры и молекулярно-биологические методы диагностики // Сибирский онкологический журнал -2004 -№2-3(10-11) - с 134-148

8 Делекторская В В, Перевощиков А Г, Кушлинский Н Е Прогностическая значимость молекулярно-биологических маркеров при раке толстой кишки // В материалах III съезда онкологов и радиологов СНГ (Минск, 25-28 мая 2004г) -Минск - Из-во ОДО «Тонпик». - 2004 - Часть I -с 275

9 Делекторская В В , Перевощиков А Г., Кушлинский Н Е Экспрессия nm23 и с-егЬВ-2 в первичных и метастатических опухолях толстой кишки // В материалах Российской научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической

онкологии», посвященной 25-летию НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН (Томск, 24-25 июня 2004г) - 2004 - Томск. -2004. - Часть II - с 120-121

10 Делекторская В.В, Перевощиков АГ, Кушлинский НЕ Молекулярно-биологические маркеры прогноза в первичных и метастатических опухолях толстой кишки // Клиническая лабораторная диагностика - 2004 - №9 - с 5

11 Делекторская В В, Перевощиков А Г Исследование закономерностей ультраструктурной дифференцировки клеток колоректалыюго рака в метастазах в печени // В материалах XX Российской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, 1-4 июня 2004г) - Черноголовка - 2004 - с 223

12. Делекторская В В , Перевощиков А Г., Головков Д А , Кушлинский Н Е Иммуногистохимическое исследование экспрессии Е-кадгерина, ß-катешша и CD44v6 в клетках первичного рака толстой кишки и его метастазов // Архив патологии -2005 —том 67, №6 - с 34-38

13 Делекторская В В , Перевощиков А Г , Головков Д А , Кушлинский Н Е Экспрессия молекул клеточной адгезии Е-кадхерина, ß-катенина и CD-44v6 в первичных опухолях и метастазах аденокарциномы толстой кишки II Бюллетень экспериментальной биологии и медицины -2005 - том 139, №6 -с 675-679

14 Делекторская В В , Перевощиков А Г , Кушлинский Н Е Изучение экспрессии молекул клеточной адгезии в первичных опухолях и метастазах рака толстой кишки // В материалах I Всероссийской научно-практической конференции патологоанатомов «Актуальные вопросы патологической анатомии» (Орел, 30 мая-2 июня 2005г.). - Орел -2005 - с 215-217

15 Делекторская ВВ, Перевощиков АГ, Кушлинский НЕ Экспрессия молекул клеточной адгезии в первичных опухолях и метастазах рака толстой кишки // Клиническая лабораторная диагностика - 2005 - №9 -с 18-19

16 Делекторская В В , Перевощиков А Г , Кушлинский Н Е Особенности экспрессии молекул клеточной адгезии в клетках первичного рака толстой кишки и его метастазов // Вопросы онкологии - 2005 - том 51, №3 - с 328-333.

17 Delektorskaya V V , Perevoschikov A G., Kushlinsky N Е Expression of E-cadherin, Beta-catenin and CD44V6 ш colon cancer correlation with cancer metastasis // Virchows Archiv - 2005 - vol 447, №2 - p 286

18 Делекторская В В , Перевощиков А Г , Кушлинский Н Е Иммуногистохимическое изучение экспрессии Е-кадхерина, ß-катенина и CD-44v6 в первичных аденокарциномах толстой кишки и их метастазах // В материалах IV конференции Российского общества патологоанатомов «Новые методы и разработки в онкоморфологии (К 100-летию со дня

рождения академика РАМН Н А Краевского)» (Москва, 5-7 октября 2005г ) -М - 2005. - с 44-45

19 Делекторская В В , Перевощиков А Г, Головков Д А, Кушлинский Н Е Экспрессия молекул клеточной адгезии в первичных опухолях и метастазах рака толстой кишки // Материалы Российской научно-практической конференции с международным участием «Новые технологии в онкологии»(Барнаул, 7-8 июня 2005г) - Барнаул -2005 -с 219-220

20 Делекторская В В , Перевощиков А Г, Головков Д А , Кушлинский Н Е Экспрессия молекул клеточной адгезии в метастазах аденокарциномы толстой кишки // В материалах VI Всероссийского съезда онкологов (Ростов-на-Дону, 9-14 октября 2005г ) - Ростов-на-Дону. - 2005 - с 303

21 Делекторская В В , Перевощиков А Г, Головков Д А Экспрессия молекулярно-биологических факторов прогноза и метастазирования при раке толстой кишки // В материалах II Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 20-21 октября 2005г) -М -2005 - с 115

22 Делекторская В В , Перевощиков А Г, Кушлинский Н Е Изучение экспрессии молекулярно-биологических маркеров в клетках метастазов аденокарциномы толстой кишки // Сибирский онкологический журнал -2006 -№2(18) - с 32-36

23 Делекторская В В , Перевощиков А Г, Головков Д А, Кушлинский Н Е Прогностическая значимость молекул межклеточной адгезии при раке толстой кишки // Тезисы докладов в материалах XIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство» (Москва, 3-7 апреля 200бг) -М -2006 - с 116

24 Делекторская В В , Перевощиков А Г., Головков Д А , Гольдберг В Е, Кушлинский Н Е Иммуногистохимическое исследование межклеточных и кпеточно-матриксных взаимодействий в аденокарциномах толстой кишки // Сибирский онкологический журнал —2006 -№3(19) - с 99

25 Делекторская В В, Перевощиков А Г, Головков Д А Прогностическая значимость молекул межклеточной адгезии при раке толстой кишки // В тезисах международной научно-практической конференции «Ведущий многопрофильный госпиталь страны основные функции, достижения и направления развития» (Москва, 1-2 июня 2006г) -Вопросы клинической онкологии и онкогематологии. - М - 2006 — том 1-2, №6 - с 169

26 Делекторская В В, Перевощиков А Г Ультраструктурные и иммуногистохимические особенности межклеточных взаимодействий при раке толстой кишки // В материалах XXI Российской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, 5-10 июня 2006г.) -Черноголовка -2006 - с 225.

27 Делекторская В В , Перевощиков А Г , Головков Д А Значение системы межклеточной и клеточно-матриксной адгезии в метастазирутощих аденокарциномах толстой кишки // В материалах Российской научно-практической конференции с международным участием «Современные методы лечения онкологических больных: достижения и неудачи» (Барнаул, 4-5 июля 2006г) -Барнаул -2006 - с 182-183

28 Делекторская В В., Перевощиков А Г, Головков Д А , Кушлинский Н Е Молекулярные маркеры инвазии и метастазирования при раке толстой кишки // В материалах IV съезда онкологов и радиологов СНГ (Баку, 28 сентября - 1 октября 2006г ) - Баку. - 2006. - с.41.

29 Делекторская В В, Перевощиков А Г Электронно-микроскопические аспекты межклеточных взаимодействий в первичных аденокарциномах толстой кишки и их метастазах // В материалах IV съезда онкологов и радиологов СНГ (Баку, 28 сентября - 1 октября 2006г) - Баку -2006 - с 57

30 Делекторская В В , Перевощиков А Г , Головков Д А , Кушлинский Н Е Особенности экспрессии матриксных металлопротеиназ в аденокарциномах толстой кишки и их метастазах // В материалах X Российского онкологического конгресса (Москва, 21-23 ноября 2006г ) - М -2006 - с 217

31 Delektorskaya V., Perevoschikov A., Kushlinsky N Expression of E-cadhenn, beta-catenm, and CD44v6 in metastatic colon adenocarcinomas // Abstracts of the 8th World Congress on Gastrointestinal Cancer (Barcelona, 28 June - 1 July 2006) - Annals of Oncology. - 2006, suppl - p 303

32 Делекторская В В , Перевощиков А Г , Головков Д А Молекулы межклеточной адгезии как факторы инвазии и метастазирования при раке толстой кишки // Молекулярная медицина - 2007 - №1 - с 50-54

33 Делекторская В.В, Перевощиков А Г, Головков Д А, Кушлинский НЕ Прогностическая значимость экспрессии матриксных металлопротеиназ в аденокарциномах толстой кишки и их метастазах // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2007 - том 143, №4 -с 434-438

34 Делекторская В В , Перевощиков А Г., Головков Д А Роль компонентов базальных мембран в процессе метастазирования аденокарцином толстой кишки // В материалах XIV Российского национального конгресса «Человек и лекарство» (Москва, 16-20 апреля 2007г.) -М -2007 - с 85

35 Делекторская В В, Перевощиков А Г, Головков Д А, Кушлинский НЕ Влияние матриксных металлопротеиназ на инвазивно-метастатический потенциал клеток рака толстой кишки // В материалах XIV Российского национального конгресса «Человек и лекарство» (Москва, 16-20 апреля 2007г) -М.-2007 -с 85-86.

Подписано в печать 04 07 07 г Формат 60x84/16 Тираж 100 экз Заказ 371 Отпечатано в службе множительной техники ГУ РОНЦ РАМН им Н Н Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш , 24

Актуальность темы.

РТК является одним из наиболее распространенных видов злокачественных новообразований человека, показатели заболеваемости и смертности от которого согласно статистическим данным последнего десятилетия неуклонном растут в России и экономически развитых странах мира [Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2005; Барсуков Ю.А., Кныш В.И., 2006; Greenlee R.T. et al., 2000; Engstrom P.F., 2000]. Рак данной локализации занимает 2-е место в структуре женской онкологической заболеваемости после рака молочной железы и 3-е место в структуре мужской онкологической заболеваемости после рака предстательной железы и легкого [Engstrom P.F., 2000]. Ежегодно в мире регистрируется более 800 тысяч новых случаев РТК [Трапезников Н.Н., Аксель Е.М., 2000; Мартынюк В.В., 2000; Симонов Н.Н. и соавт., 2000; Parkin D.M. et al., 1999].

Поскольку самым грозным осложнением и основной причиной смерти больных злокачественными новообразованиями чаще всего являются отдаленные метастазы, изучение феномена метастазирования продолжает оставаться важной и актуальной задачей современной онкологии.

Инвазия и метастазирование — главные проявления прогрессии злокачественных новообразований человека, в том числе РТК. Известно, что более 30% больных РТК имеют клинически выявляемые метастазы на момент первичной диагностики [Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2002]. По данным ряда авторов, еще у 30-40% пациентов метастазы имеются в скрытом виде и проявляются в дальнейшем [Трапезников Н.Н., Аксель Е.М., 2001; Имянитов Е.Н., 2005]. I. Vogel и соавт. (2000) указывают, что циркулирующие в крови опухолевые клетки можно обнаружить у 40%, а микрометастазы в костном мозге - у 39% больных I—II стадиями рака ободочной кишки [Vogel I., Soeth Е.,

Ruder С. et al., 2000]. По некоторым данным, метастазы в печени выявляются у 55% больных РТК, подвергшихся радикальному удалению первичной опухоли [Патютко Ю.И. и соавт., 2001]. Это служит основанием для разработай дополнительных методов оценки метастатического потенциала раковых клеток и выявления групп риска для адыовантной терапии после радикального хирургического вмешательства с целыо улучшения отдаленных результатов лечения.

Основными параметрами, определяющими риск прогрессии РТК, остаются стадия заболевания (TNM) и степень дифференцировки опухоли. Классификация Dukes, отражающая глубину инвазии опухолью стенки ТК, также часто рассматривается как важный критерий послеоперационного прогноза заболевания [Baldus S.E., 2003; Baldus S.E., 2003; Yamada Н. et al., 2001; Piard F. et al., 2002]. Однако агрессивность опухолевого процесса не всегда определяется этими критериями. В настоящее время проводится активный поиск дополнительных маркеров, которые предсказывают высокий риск опухолевой прогрессии. Правильная оценка биологических факторов, коррелирующих с прогнозом заболевания и продолжительностью жизни пациентов, важна как при локализованных формах РТК, так и при наличии отдаленных метастазов опухоли [Aldrighetti L. et al., 2005; Ambiru S. et al., 1999].

Исследование особенностей биологического поведения опухоли является в настоящее время одной из наиболее актуальных проблем онкологии. Основой для выделения клинически значимых молекулярных факторов послужило открытие наблюдаемых в процессе развития и прогрессии опухоли структурных и функциональных изменения онкогенов и генов-супрессоров [Копнин Б.П., 2000; Vogelstein В. et al., 1988; Pasche В. et al., 2003]. Особенности экспрессии кодируемых этими генами белков могут выявляться иммуногистохимическими методами в клетках РТК и служить специфическими показателями биологической активности раковых клеток. Кроме того, расширяются возможности для биохимического определения растворимых рецепторов антигенов в сыворотке крови больных РТК и в ткани опухоли с помощью иммуноферментных методов [Kahlenberg M.S. et al., 2003; Davies R.J. et al., 2005].

Среди большого количества молекулярно-биологических показателей, которые могут влиять на клиническое течение РТК, особое место отводится поиску маркеров, прогнозирующих метастазирование [Forte A. et al., 2002; Yamada Н. et al., 2001; Davies R.J., et al., 2005;].

Большинство работ, посвященных изучению клинической значимости молекулярных маркеров при РТК, сосредоточено на факторах, ответственных за пролиферацию и апоптоз (Ki67, PCNA, р53, bcl-2, bax, Fas/FasL). Соотношение скорости клеточной пролиферации и активности индукторов и ингибиторов апоптоза обуславливает опухолевую прогрессию и влияет на развитие дополнительных компонентов зокачественного фенотипа клеток РТК [Houlston R.S. et al., 2001; Bendardaf R. et al., 2004; Arnold C.N., Blum H.E., 2005].

He менее важными показателями профессии опухолевого роста являются молекулы, непосредственно влияющие на приобретение опухолевыми клетками высокой инвазивной способности [Ahmed F.E. et al., 2007; Muller W.et al., 1998; Sarris M., Lee C.S., 2001]. К формированию метастатического фенотипа клеток РТК приводит изменение активности таких факторов, как молекулы межклеточной адгезии (E-cad, P-cat, CD44v6), ММР (ММР-2 и ММР-9), компоненты система активации плазминогена (uPA, tPA, PAI-1), основные структуры БМ (Coll IV, Lam), белки nm 23 и c-erbB-2(Her-2/neu).

Особую значимость в оценке инвазивных способностей раковых клеток имеет определение уровня экспрессии молекул межклеточной адгезии, таких как E-cad, p-cat и CD 44v6, роль которых в развитии метастазов РТК в печени изучена недостаточно [Wong N.A., Pignatelli V., 2002]. Редукция экспрессии Е-cad и последующее нарушение межклеточных связей, которые обеспечивают эти молекулы, способствует прогрессированию опухолевого процесса и свидетельствует о неблагоприятном течении заболевания [Kaihara Т., et al.,

2003]. p-cat считается регулятором целого ряда процессов, влияющих на клеточную пролиферацию [Morin P.J., 1999]. Различные модели экспрессии Е-cad и (З-cat отражают особенности состояния адгезивного комплекса и могут иметь большое значение при оценке злокачественного потенциала РТК. CD44v6 является белком, который играет важную роль не только при взаимодействии клеток друг с другом, но и с ВКМ. Известно, что CD44v6 существенно влияет на инвазивный и метастатический потенциал клеток некоторых типов опухолей человека, однако данные о роли белка в опухолях ТК имеют противоречивый характер [Jungling В. et al., 2002; Bendardaf R. et al.,

2004]. Большой интерес представляет изучение ферментов, способствующих деградации ВКМ, к которым относятся ММР-2 и ММР-9. Выработка раковыми клетками этих ферментов, влияющих на подвижность опухолевых клеток, лежит в основе инвазии и метастазирования и может служить показателем агрессивности опухоли. ММР не только облегчают опухолевый рост, раковую инвазию и метастазирование, но и могут являться мишенью для противоопухолевой терапии и лечения метастазов [Mysliwill A.G., Ornstein D.L., 2002; Waas Е.Т. et al., 2002]. Аналогичными свойствами обладают представители другого семейства протеолитических ферментов — сериновые протеазы и компоненты системы активации плазминогена (uPA, tPA, PAI-1) [Gontero P. et al., 2004]. Основные белки БМ (Coll IV и Lam) являются не только структурным барьером для метастатического распространения раковых клеток, но и важной функциональной единицей, участвующей в опухолевой прогрессии [Galbavy S. et al., 2002]. Данные о влиянии белка nm 23 на метастатическую активность РТК крайне противоречивы, однако, несомненно, что он является одним из потенциально важных маркеров, вовлеченных в процессы клеточной пролиферации и дифференцировки [Bazan V. et al., 2002; Berney C.R. et al., 2001; Dursun A. et al., 2002]. Большое значение при оценке метастатического потенциала опухоли имеет суперэкспрессия онкобелка с-егЬВ-2. Установлено, что высокая экспрессия белка, в основном, связана с амплификацией гена c-erbB-2 и коррелирует с плохим прогнозом при раке молочной железы. Существует предположение, что гиперэкспрессия белка может быть необходимым условием инвазии опухолевых клеток также и при РТК [Forte A., et al., 2002; Haycr J. et al., 2001; Lee J.C. et al., 2002]. Актуальным и перспективным направлением является возможность использования этих маркеров для прогнозирования течения опухолевого процесса и выявления больных РТК с высоким риском развития метастазов и раннего рецидива заболевания [Aldrighetti L, et al., 2005; Neal C.P. et al., 2006; Ahmed F.E., 2005].

Несмотря на то, что в последние годы накапливается все больше данных о нарушениях нормальной экспрессии и функционирования молекулярных факторов при РТК, их влияние на клиническое течение и прогноз заболевания изучено недостаточно. Многие вопросы, касающиеся корреляции клинико-морфологических характеристик опухоли и изменений биологических показателей, происходящих в процессе метастазирования РТК, нуждаются в уточнении. Необходимость поиска новых методов диагностики и более точного прогнозирования течения заболевания определяет актуальность изучения молекулярных критериев, обусловливающих инвазивно-метастатический фенотип РТК. Цель работы.

Изучение экспрессии молекулярно-биологических маркеров в опухолях и сыворотке крови больных РТК иммуногистохимическими, ультраструктурными и биохимическими методами с учетом основных клинико-морфологических характеристик опухоли и возможности использования этих показателей для оценки клинического течения болезни и прогноза развития метастазов.

Задачи исследования.

1. Изучить иммуногистохимичсскне особенности экспрессии белковых маркеров в клетках первичных опухолей ТК и в прилежащей к опухоли слизистой оболочке ТК.

2. Исследовать особенности иммунофенотипа метастазов РТК в лимфатических узлах, печени и других органах, а также местных рецидивов опухолей.

3. Провести сравнительный анализ особенностей иммунофенотипа первичных и метастатических опухолей ТК и выявить их взаимосвязь с основными клинико-морфологическими параметрами заболевания.

4. Определить клиническую роль особенностей экспрессии маркеров в первичных опухолях и их метастазах при оценке прогноза заболевания.

5. Провести иммуноферментное определение ряда молекулярно-биологических маркеров в опухоли и сыворотке крови больных РТК и изучить корреляцию биохимических показателей с клинико-морфологическими параметрами РТК.

6. Выявить ультраструктурные маркеры клеток РТК в первичных опухолях и их метастазах в лимфатических узлах и печени.

7. Провести статистическую обработку данных и определить на основании анализа результатов исследования наиболее значимые прогностические показатели.

Научная новизна.

Новый подход к диагностике и прогнозированию клинического течения РТК основан на использовании показателей экспрессии молекулярно-биологических маркеров, определяющих инвазивно-метастатический потенциал опухолевых клеток. Впервые проведен комплексный клинико-морфологический, иммуногистохимический, ультраструктурный и биохимический анализ целого ряда современных молекулярных факторов, таких как молекулы межклеточной адгезии, компоненты ВКМ, белки-супрессоры метастазирования, факторы апоптоза, маркеры пролиферативной активности. Показана четкая взаимосвязь экспрессии ряда белков с развитием метастазов и рецидивов РТК и, как следствие, возможность использования данных маркеров для уточнения диагноза и прогноза выживаемости. На основании исследования молекулярных характеристик РТК разработаны фенотипические критерии, позволяющие идентифицировать случаи РТК с повышенным риском развития отдаленных метастазов. Молекулярные маркеры, изученные в ткани первичных опухолей ТК и в отдаленных метастазах в печени, позволили оценить факторы прогноза РТК не только после проведенного хирургического удаления первичной опухоли, но и после резекции печени по поводу метастазов. Впервые при РТК изучена корреляция между экспрессией супрессоров метастазирования, белков межклеточных контактов и БМ и активностью протеолитических ферментов и компонентов системы активации плазминогена. Изучение экспрессии белковых маркеров в первичных опухолях и метастазах РТК позволило уточнить некоторые механизмы, обеспечивающие метастазирование опухолевых клеток. Практическая значимость.

Настоящая работа представляет практический интерес для оценки прогноза больных РТК и выделения групп повышенного риска развития метастазов и рецидивов, требующих дополнительного лечения или более тщательного динамического наблюдения. Проведенное исследование позволило на основании полученных данных выделить наиболее надежные признаки повышенного риска отдаленного метастазирования РТК, которые могут использоваться для индивидуального прогнозирования течения заболевания у больных РТК. Принадлежность пациента по результатам оценки экспрессии маркеров к группе неблагоприятного прогноза позволяет предложить более тщательную программу диагностических мероприятий, проведение расширенного объема обследований, планирование адъювантной химиотерапии на более ранних стадиях РТК.

На основе анализа молекулярных особенностей опухоли определены прогностические критерии для оценки предрасположенности больных РТК к развитию метастазов с использованием иммуногистохимических, электронно-микроскопических и биохимических методов. Результаты исследования будут внедрены в клиническую практику в НИИ КО ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.

Апробация работы.

Основные положения работы были доложены и обсуждены на III конференции Российского общества патологоанатомов «Новые методы и разработки в онкоморфологии» (Москва, 15-17 сентября 2003г.), на III съезде онкологов и радиологов стран СНГ (Минск, 25-28 мая 2004г.), на XI Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 19-23 апреля 2004г.), на научно-практическом симпозиуме «Прогрессивные аналитические технологии и доказательная лабораторная медицина» (Москва, 20-22 октября 2004г.), на I Всероссийской научно-практической конференции патологоанатомов «Актуальные вопросы патологической анатомии» (Орел, 30 мая - 2 июня 2005г.), на III (VII) Съезде научного общества специалистов клинической лабораторной диагностики (Москва, 11-14 октября 2005г.), на II Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 20-21 октября 2005г.), на XIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 3-7 апреля 2006г.).

Диссертация апробирована на совместной научной конференции с участием научных сотрудников патологоанатомического отделения, лаборатории гистохимии и электронной микроскопии, лаборатории клинической цитологии, лаборатории молекулярной патологии, лаборатории клинической биохимии, отделения проктологии НИИ клинической онкологии ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 13 июня 2007г. Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 35 научных работ. Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 240 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, 5 глав результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, практических рекомендаций и выводов. Текст иллюстрирован 31 таблицей и 42 рисунками и микрофотографиями. Указатель литературы содержит 338 работ отечественных и зарубежных авторов.

9. Результаты исследования свидетельствуют, что аденокарциномы толстой кишки в течение длительного времени сохраняют метастатический иммунофенотип, при этом сходные изменения наблюдаются в отдаленных метастазах опухолей. Для метастазов РТК в печени характерны следующие изменения содержания белков: гиперэкспрессия p-cat, ММР-9, Lam, nm23, р53, тенденция к увеличению накопления ММР-2 и с-егЬВ-2 и редукция экспрессии E-cad, CD44v6 и Coll IV.

10. Электронно-микроскопическое исследование выявило, что варианты аденокарцином толстой кишки, в которых преобладают ультраструктурно недифференцированные раковые клетки, достоверно связаны с неблагоприятным прогнозом общей выживаемости и высоким индексом пролиферативной активности Ki67.

11. Многофакторный анализ прогностической значимости комплекса клинико-морфологических признаков с учетом экспрессии молекулярно-биологических маркеров позволил выявить тесную связь между белками p-cat, ММР-9, nm23 и р53 и рассматривать согласованные изменения их экспрессии как общий независимый фактор прогноза безрецидивной выживаемости больных РТК. Безрецидивная 3-летняя выживаемость составила 19,3±11,5% при одновременно неблагоприятных, 72,8±7,0% при благоприятных и 68,3±8,0% при различающихся уровнях указанных маркеров. Полученные результаты позволяют рассматривать нммуногистохимический анализ белков P-cat, ММР-9, nm23 и р53 в опухоли как метод прогнозирования развития отдаленных метастазов у больных РТК после операции.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Определена совокупность молекулярно-биологических маркеров, которые являются значимыми и независимымы факторами прогноза БРВ больных РТК. На их основе выделены наиболее надежные признаки повышенного риска отдаленного метастазирования РТК, которые могут использоваться для индивидуального прогнозирования различного течения опухолевого заболевания у больных после радикальной операции. Последние рекомендуются для внедрения в практику лечебных учреждений онкологического профиля, использующих методы иммуногистохимического исследования в процессе морфологической диагностики опухолей человека. Оценка выявленных признаков неблагоприятного прогноза заболевания является одним из путей улучшения результатов лечения пациентов с высокими факторами риска развития метастазов и рецидивов РТК.

2. Использование результатов иммуногистохимического исследования содержания молекулярно-биологических маркеров в опухоли позволяет в зависимости от прогнозируемого исхода заболевания у больного предложить более тщательную программу диагностических мероприятий, проведение расширенного объема обследований, планирование адъювантной химиотерапии на более ранних стадиях РТК, а также стимулирует дальнейший поиск дополнительных молекулярно-биологических факторов прогноза для различных новообразований человека.

3. Электронно-микроскопическое исследование опухолей ТК, наряду с гистологическим, может использоваться для более точной оценки степени дифференцировки и ультраструктурных вариантов, которые связаны с прогнозом ОВ больных РТК. Выявление ультраструктурных дифференциально-диагностических критериев опухоли способствует более точному установлению гистогенеза новообразований и рекомендуется использовать в процессе электронно-микроскопической диагностикой опухолей человека.

4. Рекомендуется внедрение иммуногистохимического и биохимического определения содержания маркеров в работу научно-исследовательских институтов биологического и медицинского профиля, как методов, позволяющих не только прогнозировать течение заболевания, но и служащих перспективной моделью для разработки препаратов направленного действия для противоопухолевой и антиметастатической терапии. Определение экспрессии ряда факторов может использоваться для оценки эффективности химиотерапии, а также для изучения механизмов канцерогенеза, обеспечивающих метастазирование опухолевых клеток.