Автореферат и диссертация по медицине (14.01.17) на тему:Иммуногистохимические маркеры как фактор прогноза при хирургическом лечении колоректального рака

На правах рукописи

САМОФАЛОВА Ольга Юрьевна

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ КАК ФАКТОР ПРОГНОЗА ПРИ ХИРУРГИЧЕСКОМ ЛЕЧЕНИИ КОЛОРЕКТАЛЬНОГО РАКА

14.01.17 - Хирургия

14.00:15 - Патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 7 МАЙ 2012

Москва 2012

005043845

005043845

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский научный центр хирургии имени академика Б.В. Петровского» Российской академии медицинских наук и ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздравсоцразвития

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук

Петр Владимирович Царьков Екатерина Михайловна Пальцева

Официальные оппоненты:

Олег Эммануилович Луцевич - доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой факультетской хирургии № 1 ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет» Минздравсоцразвития; Ирина Николаевна Волощук - доктор медицинских наук, профессор кафедры патологической анатомии ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздравсоцразвития

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И.Пирогова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита диссертации состоится « 29 » мая 2012г. в 15.00 часов

на заседании диссертационного совета Д 001.027.02 ФГБУ «РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского» РАМН

Адрес:119991, г. Москва, ГПС-2, Абрикосовскиий пер., д.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «РНЦХ им. акад.

Б.В.Петровского» РАМН

Автореферат разослан «28» апреля 2012г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор медицинских наук

Э.А. Годжелло

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность

Колоректальный рак занимает одно из самых значимых мест среди онкологических заболеваний. Несмотря на высокий уровень развития онкологии и широкое использование комбинированного лечения, пятилетний рубеж переживают лишь 44-74% больных раком толстой кишки (РТК) [А.М.Аминев, 1969; Ганичкин A.M., 1975; Яицкий H.A., 2004; Candioti A.N., 1964].

Внимание ученых сосредоточено на проблеме ранней диагностики РТК, методах комбинированного лечения, в то время как факторы, определяющие прогноз течения заболевания с позиций биологических характеристик опухоли, остаются не затронутыми [Sulzyc-Bielicka V., 2009; Perez R.O., 2011].

Как правило, факторами прогноза течения принято считать характер местного распространения, степень поражения лимфатической системы и гематогенное метастазирование, что лежит в основе стадирования заболевания по системе TNM, в соответствии с которой в пред- и послеоперационном периодах осуществляется планирование лечения. Частота рецидивов после радикальных операций по поводу рака ободочной и прямой кишок, по данным различных авторов, составляет от 8 до 39% и от 20 до 82%, соответственно [В.И.Кныш, 1997]. Между тем, даже среди пациентов, имеющих одинаковую стадию заболевания, могут быть получены значимо отличающиеся результаты. Этот факт послужил посылом для поиска предикторов, основанных не только на клинической картине и данных стандартного морфологического исследования, но и на исследовании молекулярно-биологических свойств опухоли.

Внедрение в клиническую практику иммуногистохимических (ИГХ) методов диагностики ознаменовало собой переход онкологии на качественно иной уровень развития. Изучение молекулярно-биологических характеристик опухоли и их влияния на течение основного заболевания с помощью ИГХ исследования является перспективным научным направлением.

Цель исследования

Определение значения некоторых молекулярно-биологических маркеров в аденокарциномах толстой кишки (АТК) с целью прогнозирования течения заболевания после радикального хирургического лечения.

Задачи исследования

1. Оценить безопасность выполнения операций с применением БЗ-лимфаденэктомии, изучить особенности лимфогенного распространения первичных аденогенных злокачественных новообразований толстой кишки на основе исследования удаленных препаратов.

2. Изучить иммуногистохимические особенности экспрессии белковых маркеров в первичных аденокарциномах толстой кишки на основе сравнительного анализа с неизмененной слизистой оболочкой толстой кишки, а также взаимосвязь иммуногистохимических характеристик АТК с различными клинико-морфологическими параметрами заболевания.

3. Провести сравнительный анализ иммуногистохимических особенностей первичных АТК и пораженных регионарных лимфатических узлов.

4. Оценить онкологические результаты хирургического лечения РТК.

5. Определить иммуногистохимические предикторы неблагоприятного течения колоректального рака.

Научная новизна

В ходе исследования продемонстрирована высокая эффективность выполнения лимфаденэктомии в объеме БЗ с санацией потенциально опасных по метастазированию лимфоузлов. Изучены отдаленные результаты радикального хирургического лечения с применением расширенной лимфаденэктомии больных РТК без гематогенных метастазов.

Впервые выявлено сочетание молекулярно-биологических маркеров, которое является значимым предиктором неблагоприятного прогноза и повышенного метастатического потенциала первичных АТК после радикального хирургического лечения. Продемонстрировано, что изменение характера экспрессии Е-кадгерина, Р-катенина, тенасцина С (ТН С), сосудистого эндотелиального фактора роста (УЕОБ) и рецептора эпидермального фактора роста (ЭФРР) коррелируют с большей глубиной прорастания опухоли. Было установлено, что показателями повышенного метастатического потенциала при РТК являются изменения экспрессии Е-кадгерина, ТН С, КА1-1 и К>67. Впервые предложена методика определения прогноза течения заболевания с использованием сочетания показателей экспрессии иммуногистохимических маркеров в ткани опухоли,

4

характеризующаяся высокой специфичностью. Продемонстрировано различие экспрессии Е-кадгерина, ТН С, КАИ, УЕОР, ЕвРЯ и тимидилатсинтазы (ТС) в первичных АТК и ткани пораженных лимфатических узлов.

Практическая значимость

Настоящая работа представляет практический интерес для оценки прогноза такого распространенного и социально значимого заболевания как РТК. На основании полученных данных выявлено, что определение нарушения экспрессии Е-кадгерина, ТН С, КА1-1 и Кь67 в ткани первичной опухоли может помочь в прогнозировании развития лимфогенных и гематогенных метастазов. Предложена совокупность молекулярно-биологических маркеров АТК, характеризующая неблагоприятный онкологический прогноз колоректального рака.

Продемонстрирована клиническая эффективность выполнения ИЗ-лимфодиссекции при различных вариантах резекции толстой кишки по поводу рака. Отработана методика исследования препарата толстой кишки с опухолью и лимфатическими узлами, позволяющая выявлять и картировать узлы диаметром менее 5 мм. Изложены варианты лимфогенного распространения аденогенных раков толстой кишки различной локализации и их влияние на окончательный исход лечения.

Внедрение результатов исследования

Разработанная методика расширенных лимфодиссекций, исследования удаленного препарата с изучением максимально возможного количества лимфатических узлов, иммуногистохимическое исследование первичной опухоли толстой кишки используются в работе отделения колопроктологии ФГБУ «Российский научный центр хирургии им. акад. Б.В. Петровского» РАМН и лаборатории электронной микроскопии и иммуногистохимии Централизованного патологоанатомического отделения ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова».

Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано 8 печатных работ: 3 статьи и 5 тезисов.

Апробация работы

Апробация диссертации проведена 23 декабря 2011 г. на совместном заседании хирургических отделений торакоабдоминального отдела, патологоанатомического отделения ФГБУ «Российский научный центр хирургии им. акад. Б.В. Петровского» РАМН и лаборатории электронной микроскопии и иммуногистохимии Централизованного патологоанатомического отделения ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова».

Материалы диссертации доложены на первой международной конференции по торакоабдоминальной хирургии (Москва, 2008г.); Европейском мультидисциплинарном конгрессе по колоректальному раку 2012 (Прага, Чехия, 2012г.).

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 162 страницах, и включает: введение, обзор литературы, описание материалов и методов, 4 главы результатов собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации, список использованной литературы. Список литературы содержит 203 источника, из них 28 - работы отечественных авторов. Работа иллюстрирована 57 рисунками и 19 таблицами.

Положения, выносимые на защиту

1. Применение метода расширенной лимфаденэктомии в объеме БЗ в комплексе с удалением пораженного органа в пределах собственной фасции (мезоколон-и мезоректумэктомия) при злокачественном поражении разных отделов толстой кишки позволяет обеспечить высокую онкологическую эффективность хирургической операции.

2. Выполнение экстрафасциальных вмешательств, сочетающихся с лимфодиссекцией в объеме БЗ, позволяет обеспечить высокую безрецидивную выживаемость в группе больных с местнораспространенным РТК.

3. Изменение интенсивности и локализации экспрессии Е-кадгерина, р-катенина, ТН С, УЕОБ и ЭФРР достоверно связано с глубиной прорастания АТК.

4. Определение интенсивности и локализации экспрессии Е-кадгерина, ТН С, KAI-1 и Ki-67 могут быть использованы в качестве критериев повышенного метастатического потенциала АТК.

5. Иммунофенотип метастазов аденокарциномы в лимфатических узлах существенно отличается от иммунофенотипа первичной опухоли.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Клинические наблюдения и методы исследования

Для достижения поставленной цели был выполнен анализ 72 пациентов с гистологически верифицированными АТК, пролеченных на базе отделения колопроктологии РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского РАМН в период с июля 2007 по июнь 2008. Средний возраст пациентов составил 62,21±10,6 года (мин. - 28; макс. - 79). Распределение по половой принадлежности: 56% мужчины (п=40) и 44% женщины (п=32).

Техника хирургических вмешательств при раке толстой кишки В отделении колопроктологии с хирургией тазового дна принята концепция хирургического лечения колоректального рака с применением расширенной лимфаденэктомией (ЛАЭ) в объеме D3. Для правосторонней локализации опухоли, под которой мы понимаем расположение опухоли в той части толстой кишки, кровоснабжение которой осуществляется в основном за счет верхней брыжеечной артерии, объем ЛАЭ заключался в удалении лимфоузлов, расположенных вдоль основного ствола верхней брыжеечной артерии и ее крупных ветвей. Для рака левой половины ободочной и прямой кишок апикальными узлами являлись лимфоузлы, расположенные парааортально в области устья нижней брыжеечной артерии. Пораженный орган всегда удалялся в пределах собственной фасции кишки - мезоколонэктомия для рака ободочной кишки (OK) и мезоректумэктомия для рака прямой кишки (ПК).

Лимфатические узлы, удаляемые в ходе оперативного вмешательства, были картированы с использованием японской классификации колоректальных злокачественных опухолей [Japanese Society for Cancer of the Colon and Rectum, 2006]. Они были ранжированы по порядкам в зависимости от расположения по отношению к первичной опухоли и основным питающим сосудам. Таким образом, применяемая концепция обработки лимфатического аппарата пораженной кишки

7

предполагала полную санацию всего потенциально опасного по поражению лимфатического коллектора.

В соответствии с видом выполненных оперативных вмешательств больные были распределены следующим образом: в 11 наблюдениях при поражении правых отделов толстой кишки была выполнена правосторонняя гемиколэктомия, в 20 наблюдениях по причине поражения левых отделов ОК выполнены различные варианты резекции левых отделов ободочной и сигмовидной кишок. При раке ПК 41 пациенту выполнены резекционные вмешательства или экстирпация органа. Все операции по поводу рака ОК правосторонней локализации сопровождались лимфаденэктомией вдоль верхних брыжеечных артерии и вены. В случае локализации опухоли в левой половине ОК или в ПК выполнялась парааортальная ЛАЭ. В пяти наблюдениях операция была расширена выполнением латеральной ЛАЭ по причине подозрения опухолевого поражения запирательных лимфатических узлов (табл. 1).

Таблица 1

Характер оперативных вмешательств

Название операций абс. %

Правосторонняя гемиколэктомия 11 15,3

Левосторонняя гемиколэктомия 4 5,5

Резекция левых отделов, сигмовидной кишки 16 22,2

Передняя резекция прямой кишки 35 48,6

Брюшно-анальная резекция прямой кишки 4 5,6

Брюшно-промежностная экстирпация прямой кишки 2 2,8

В пяти наблюдениях (7%) оперативные вмешательства носили сочетанный характер и включали в себя: холецистэктомию и резекцию левого яичника (п=1), герниопластику (п=2), холецистэктомию (п=1), резекцию правого яичника и резекцию пресакральной кисты (п=1).

Удаленные препараты были подвергнуты патологоанатомическому исследованию. При первичной оценке определяли длину удаленного сегмента кишечника и размер сосудистой ножки. Далее препарат исследовался путем выполнения серийных срезов с шагом 3-5 мм в направлении от сосудистой ножки к опухоли. Затем препарат фиксировали в формалине, фрагмент опухоли для ИГХ исследования - в 10% нейтральном забуференном формалине.

Морфологическое исследование проводили на парафиновых срезах толщиной 3-4 мкм, окрашенных гематоксилином и эозином. В случае обнаружения пораженных метастазами лимфатических узлов, они также были исследованы ИГХ методом.

Иммуногистохимическое исследование осуществляли с использованием системы визуализации Super Sensitive Polymer-HRP ШС Detection System/DAB (BioGenex) в соответствии с прилагаемой инструкцией. Использовали первичные антитела к Е-кадгерину (DakoCytomation, разведение 1:400), ß-катенину (DakoCytomation, разведение 1:800), ТН С (Novocastra, разведение 1:800), KAI-1 (CD82) (Santa Cruz Biotechnology, разведение 1:1500); ТС (DakoCytomation, разведение 1:400), VEGF (DakoCytomation, разведение 1:400), ЭФРР (DakoCytomation, разведение 1:800), Ki-67 (DakoCytomation, разведение 1:500).

Интенсивность реакции оценивали полуколичественным методом. При иммунопероксидазной реакции с антителами к KAI-1 количество окрашенных клеток оценивалось в расчете на 10 полей зрения (ПЗ) и было разделено на три группы: 1 группа - 0-50 кл/10 ПЗ, 2 группа - 50-100 кл/10 ПЗ, 3 группа - >100 кл/10 ПЗ. Пролиферативная активность Ki-67 оценивалась как количество окрашенных ядер на 500 учтенных клеток.

Статистическая обработка результатов исследования

Для оценки результатов исследования использовали точный тест Фишера, анализ таблиц сопряженности, метода Каплана-Майера и сравнение кривых выживаемости с использованием логарифмически рангового критерия (log-rank). Для категоризованных переменных различия в группах проверялись с помощью критерия х_кваДРат Пирсона для таблиц сопряженности. С целью выявления маркеров, изменение экспрессии которых ассоциировано с факторами, достоверно влияющими на неблагоприятный прогноз течения заболевания (лимфогенные и гематогенные метастазы, локорегиональный рецидив и смерть по причине прогрессии основного заболевания), был выполнен унивариантный анализ. Кроме того, для тех маркеров, которые статистически значимо коррелировали с неблагоприятным развитием заболевания, были рассчитаны чувствительность, специфичность, диагностическая точность.

Результаты исследования

Непосредственные результаты хирургического лечения рака толстой кишки

С целью оценки безопасности предложенных операций были оценены интраоперационные параметры, среди которых: объем кровопотери (359,9±269,4мл.), средняя продолжительность операции (219,8±74,9мин). Оба фактора достоверно зависели от местнораспространенного характера роста опухоли и/или выраженного перифокального воспаления со спаечным процессом (р<0,01) и от характера оперативного вмешательства, определяющегося уровнем локализации опухоли в толстой кишке (р=0,04). Более того, на увеличение объема кровопотери влияла приндалежность пациента к мужскому полу (р=0,04), что вероятнее всего объясняется более узкими анатомическими размерами мужского таза по сравнению с женским. Осложнения раннего послеоперационного периода имели место у 13 (18,2%) больных, из них в 9 (12,6%) случаях потребовалось повторное оперативное вмешательство. Госпитальной летальности не было.

Во всех случаях резекции были выполнены в пределах здоровых тканей - Ш). Длина препарата при раке ОК в среднем составила 28,3±9,1 см, при раке ПК-23,7±6,4 см. Размер сосудистой ножки - 12,1±3,4 см.

Среднее число исследованных лимфатических узлов составило 38,83±22,78; из них к первому порядку в среднем относилось 15,61±12,14; ко второму -17,53±14,6; к третьему - 4,65±3,7. При анализе общего числа исследованных лимфоузлов при раке ОК и ПК статистически значимых различий получено не было: 41,03±5,14 и 37,17±14,6, соответственно (р=0,67). Общая частота поражения лимфоузлов составила 33,3%, частота вовлечения лимфоузлов в зависимости от их расположения -1, II, Ш порядков - составила 43,1%, 20,8% и 2,8%, соответственно. У двух больных обнаружен феномен «скип-метастазирования». Из 26 пациентов, имеющих пораженные лимфатические узлы, 20 больных имели глубину инвазии опухоли, обозначаемую как рТЗ, и по три человека - рТ2 и рТ4.

При анализе больных с наличием пораженных лимфоузлов средний индекс метастазирования (ИМ)составил 0,8±0,1. Доля метастатически пораженных среди всех найденных лимфатических узлов у всех больных раком правой половины ОК составила лишь 1,9%, что незначительно меньше этого показателя при раке левой половины ОК (2,8%, р=0,36) и достоверно меньше, чем при раке ПК (4,8%,

10

р=0,011). Среднее значение ИМ среди пациентов с III стадией заболевания было наименьшим при локализации опухоли в правой половине ОК (0,07±0,04), незначительно больше среднее значение этого индекса отмечено при расположении опухоли в левой половине ОК (0,09±0,07), и наибольшее его среднее значение получено у больных раком ПК (0,16±0,13). Среднее значение ИМ в общей когорте пациентов составило 0,13±0,11 (0,03-0,38).

Важное значение в патоморфологическом исследовании приобрел поиск лимфатических узлов размером менее 5 мм. Так, у пациентов из общей когорты в среднем 59% найденных лимфоузлов имели диаметр менее 5 мм. Часть из этих лимфоузлов вошла в группу пораженных метастазами опухоли. Периневральная и/или сосудистая инвазия имела место у 8 (11,1%) больных.

Результаты патоморфологического и иммуногистохимического исследования

У всех больных опухоль была представлена аденокарциномой: высокодифференцированная - в 2 (2,8%) наблюдениях, умереннодифферен-цированная - в 63 (87,5%) и низкодифференцированная - в 7 (9,7%) наблюдениях.

По данным исследования, значимо различаются показатели экспрессии Е-кадгерина у больных РТК и пациентов, не страдающих этим заболеванием (р<0,05) (табл. 2). В контрольной группе в основном встречалось выраженное мембранное окрашивание, в то время как в опухоли - слабая интенсивность окрашивания цитоплазмы части опухолевых железистых эпителиальных клеток (28%). При развитии аденогенного рака толстой кишки происходит уменьшение экспрессии Е-кадгерина и изменение его локализации в клетке, а именно исчезновение мембранного окрашивания и аномальное накопление в цитоплазме опухолевых клеток. Также выявлены статистически достоверные ассоциации показателей экспрессии Е-кадгерина и глубины прорастания опухоли (р=0,035). При рТ2 отмечалась слабая интенсивность окрашивания цитоплазмы, при рТЗ -выраженная мембранно-цитоплазматическая экспрессия, при рТ4 вновь появлялась слабая окраска цитоплазмы. При анализе зависимости между показателями экспрессии данного маркера и наличием или отсутствием пораженных лимфатических узлов достоверных различий не выявлено (р=0,86), также как и наличием местного рецидивирования (р=0,72). Обнаружение слабой

11

интенсивности окрашивания цитоплазмы как части клеток, так и равномерно всех клеток достоверно коррелирует с развитием гематогенного метастазирования в послеоперационном периоде (р= 0,045).

Таблица 2

Особенности экспрессии Е-кадгерина, р-катенина, тенасцина С и КА1-1 в аденокарциномах толстой кишки и метастазах в лимфатических узлах

МАРКЕР ПРИЗНАК ~---- Экспрессия

Е-кадгернн Р-катенин га с КА1-1

Отличия экспрессии в первичной опухоли и неизмененной слизистой оболочке толстой кишки <0,001 <0,001 <0,001 <0,001

Глубина прорастания опухоли, (рТ) 0,035 0,035 0,001 0,18

Наличие или отсутствие пораженных лимфатических узлов 0,47 0,36 0,027 0,046

Появление гематогенных метастазов 0,045 0,25 0,44 0,028

Возврат заболевания 0,72 0,61 0,72 0,01

Отличие экспрессии в первичной опухоли и метастазах в лимфатических узлах 0,002 0,07 0,04 0,0001

В представленном исследовании обнаружены статистически значимые различия между экспрессией Е-кадгерина в основной опухоли и в регионарных лимфатических узлах (р=0,0022), что указывает на значительную вариабельность опухоли в основном очаге и ее метастатических отсевах. В пораженных лимфоузлах отмечалось снижение интенсивности цитоплазматической экспрессии Е-кадгерина до полного ее исчезновения.

Таким образом, уменьшение экспрессии и появление цитоплазматической локализации Е-кадгерина ассоциировано с прогрессией и метастазированием РТК.

В проведенном анализе значимо различаются показатели экспрессии р-катенина у больных РТК и у пациентов, не страдающих данным заболеванием (р<0,05) (см. табл. 2). В неизмененной слизистой оболочке толстой кишки отмечалась преимущественно мембранная экспрессия, в то время как цитоплазматическая и ядерная окраска отмечалась только в клетках аденокарциномы. Была выявлена статистически значимая корреляция между наличием ядерной экспрессии р-катенина и глубиной инвазии опухоли (р=0,03).

В полученных результатах не удалось обнаружить различие между

показателями экспрессии р-катенина при сравнении следующих клинико-

12

морфологических признаков: в первичных АТК у пациентов с пораженными лимфатическими узлами и у пациентов без поражения лимфатических узлов (р=0,36), при появлении гематогенных метастазов (р=0,25) и местного рецидивирования (р=0,61), в пораженных лимфатических узлах и в основной опухоли (р=0,07). Хотя отмечено, что в опухолях пациентов с гематогенными метастазами чаще выявлялась ядерная окраска, при их отсутствии - ядерная экспрессия маркера чаще отсутствовала.

Таким образом, в полученных результатах прослеживается потеря мембранной экспрессии опухолевыми клетками, накопление молекул р-катенина в цитоплазме и ядрах клеток аденокарциномы. Известно, что ядерная локализация Р-катенина увеличивается при прогрессировании РТК. Результаты данного исследования подтверждают, что белок Р-катенин играет важную роль в регуляции межклеточных отношений и вовлечен в формирование инвазивного фенотипа РТК.

При изучении антиадгезивной молекулы ТН С выявлено, что значимо различаются показатели маркера для больных РТК и пациентов контрольной группы (р=0,0004) (см. табл. 2). В контрольной группе наиболее часто (86%) отмечалась выраженная экспрессия ТН С во внеклеточном матриксе (ВКМ) стромы, сопровождающаяся умеренным или выраженным окрашиванием сосудов, также как и в ткани опухоли (32%). Однако для АТК также была характерна слабая экспрессия маркера, практически не встречавшаяся в норме. В данном исследовании выявлено, что при большей глубине прорастания отмечалась более выраженная экспрессия ТН С (р=0,001).

По полученным данным, выявлено статистически значимое различие между показателями экспрессии ТН С и наличием или отсутствием поражения регионарных лимфатических узлов: слабая экспрессия маркера в ВКМ стромы, сопровождающаяся слабой окраской стенок сосудов, связана с наличием метастазов (р=0,027). Однако не удалось установить зависимости между возникновением гематогенных метастазов и интенсивностью окрашивания ВКМ стромы первичной опухоли, а также интенсивностью окрашивания сосудов (р=0,69 и р=0,44, соответственно).

Экспрессия данного маркера в первичной опухоли и пораженных лимфатических узлах значимо различалась (р=0,04). В пораженных лимфоузлах

13

значительно чаще встречалась выраженная экспрессия ТН С в ВКМ и стенках сосудов, что может указывать на большую агрессивность метастатических опухолей.

Таким образом, экспрессия ТН С, способствующего отделению опухолевых клеток от их окружения и, следовательно, прогрессии РТК, изменяется при прогрессировании опухолевого процесса.

При анализе экспрессии молекулы инвазии и метастазирования KAI-1 различаются показатели экспрессии маркера в первичной опухоли у больных РТК и в неизмененной слизистой оболочке толстой кишки (р<0,05) (см. табл. 2). Для большинства здоровых пациентов (93%) была характерна экспрессия в 51-100 или >100 клетках лимфогистиоцитарного ряда стромы слизистой оболочки в 10 ПЗ, в то время как для АТК наиболее характерно было отсутствие экспрессии KAI-1 (26%) или окрашивание <50 клеток в 10 ПЗ (24%). Анализ полученных результатов не выявил зависимости экспрессии маркера от глубины прорастания опухоли (р=0,18).

В данном исследовании одним из факторов, достоверно влияющим на риск поражения лимфатических узлов, является окраска <50 лимфоидных клеток стромы в 10 ПЗ при исследовании KAI-1 (р=0,046). Также была выявлена следующая закономерность: чем больше количество окрашенных клеток в препарате, тем меньше вероятность возникновения гематогенных метастазов (р=0,028) и вероятность возврата заболевания в целом, включая возникновение рецидива (р=0,01). Различия экспрессии KAI-1 в первичной опухоли и метастазах в регионарные лимфатические узлы статистически достоверны (р=0,0001).

Таким образом, экспрессия фактора супрессии метастазов KAI-1 уменьшается при прогрессии колоректального рака.

При изучении VEGF отмечены значимые различия показателей экспрессии для больных РТК и пациентов, не страдающих данным заболеванием (р=0,02). Для большинства случаев как в контрольной группе (50%), так и в группе с АТК (57%) была характерна слабая/умеренная интенсивность экспрессии в цитоплазме части опухолевых эпителиальных клеток, но окрашивание стенок сосудов отмечалось более выраженное в неизмененной слизистой оболочке (табл. 3).

Было обнаружено, что с увеличением глубины прорастания опухоли сосудистая экспрессия VEGF уменьшалась (р=0,02).

Таблица 3

Особенности экспрессии сосудистого эндотелиального фактора роста, рецептора эпидермального фактора роста, тимидилатсинтазы и Ю-67 в аденокарциномах толстой кишки и метастазах в лимфатических узлах

~----_^__МАРКЕР ПРИЗНАК ~ '--- экспрессия

УЕвР ЭФРР ТС Ю-67

Отличия экспрессии в первичной опухоли и неизмененной слизистой оболочке толстой кишки 0,02 0,06 <0,001 0,28

Глубина прорастания опухоли, (рТ) 0,02 0,015 0,82 0,46

Наличие или отсутствие пораженных лимфатических узлов 0,70 0,76 0,57 0,95

Появление гематогенных метастазов 0,035 0,85 0,88 0,025

Возврат заболевания 0,11 0,63 0,94 0,003

Отличие экспрессии в первичной опухоли и метастазах в лимфатических узлах 0,0003 0,025 0,001 —

Статистической достоверности в отличиях экспрессии маркера в первичных АТК при наличии или отсутствии поражения лимфатических узлов не найдено (р=0,7). Выявлено, что при наличии экспрессии УЕйР в цитоплазме железистых эпителиальных клеток аденокарциномы и в стенках сосудов уменьшается вероятность возникновения гематогенных метастазов этой опухоли (р=0,035). Зависимость экспрессии маркера от факта возврата заболевания не выявлена (р>0,05).

Отмечено значимое различие экспрессии УЕОБ в основной опухоли и пораженных лимфоузлах (р=0,0003). При анализе пораженных лимфоузлов наиболее характерным показателем было отсутствие иммунопероксидазной реакции, в первичной опухоли наиболее часто отмечалось слабое окрашивание цитоплазмы части железистых эпителиальных клеток. По результатам данного исследования выявлено, что объем и интенсивность экспрессии УЕвР в стенках сосудов опухоли уменьшается с опухолевой прогрессией.

При сравнении экспрессии ЭФРР в аденокарциноме с показателями контрольной группы получены статистически значимые отличия (р=0,06): в большинстве случаев АТК (53%) было отмечено отсутствие экспрессии, в то время как в контрольной группе наиболее часто отмечалась умеренная/выраженная мембранно-цитоплазматическая экспрессия (50%) (см. табл. 3).

Найдена корреляция иммунореактивности ЭФРР с глубиной прорастания АТК (р=0,015). С увеличением глубины прорастания уменьшается частота выраженной мембранно-цитоплазматической экспрессии, а при стадии рТ2-Т4 наиболее характерно отсутствие экспрессии маркера.

В исследовании не выявлено достоверных зависимостей при изучении связи экспрессии ЭФРР со следующими клинико-морфологическим признаками: наличие метастазов в регионарные лимфатические узлы (р=0,76), появление гематогенных метастазов (р=0,85), возврат заболевания (р=0,63).

Отмечены статистически достоверные отличия между показателями экспрессии данного маркера в основной опухоли и в пораженных лимфоузлах (р=0,025). При анализе последних наиболее характерным показателем был высокий уровень мембранно-цитоплазматической экспрессии, в то время как в основной опухоли было наиболее характерно отсутствие реакции.

По данным анализа выявлено, что ослабление/потеря экспрессии ЭФРР, являющаяся неблагоприятным прогностическим фактором, усиливается от начальных стадий РТК к более поздним. Также показатели экспрессии в первичной опухоли не всегда согласуются с показателями в метастатических отсевах в лимфатических узлах, и это приводит к потере прогностической ценности исследования первичной опухоли для выбора послеоперационной терапии.

При сравнении показателей экспрессии ТС у больных РТК с контрольной группой отличие было достоверным (р<0,05) (см. табл. 3). В АТК наиболее часто отмечалась слабая интенсивность окраски цитоплазмы клеток паренхимы опухоли (26%), в части случаев она сопровождалась окраской ядер (25%); в неизмененной слизистой оболочке наиболее часто было отмечено ядерное окрашивание при отсутствии экспрессии в цитоплазме железистых эпителиальных клеток (50%).

При изучении глубины прорастания опухоли достоверных корреляций с экспрессией ТС не отмечено (р>0,05).

При анализе ассоциации выраженности экспрессии ТС в первичной опухоли с рядом показателей статистически значимых различий не выявлено: с наличием или отсутствием поражения регионарных лимфатических узлов (р=0,57), появлением гематогенных метастазов (р=0,88 для экспрессии в ядре и р=0,13 для экспрессии в цитоплазме), а также с возвратом заболевания (р=0,94 для

16

экспрессии в ядре и р=0,96 для экспрессии в цитоплазме). Однако у пациентов с пораженными лимфатическими узлами в два раза чаще наблюдалось отсутствие иммунопероксидазного окрашивания в первичной опухоли, чем у пациентов без их поражения. Ядерная и слабая цитоплазматическая экспрессии ТС коррелировали с риском смерти от основного заболевания, критерий достоверности составил 0,02 и 0,004, соответственно (см. табл. 3).

Выявлено значимое различие в показателях экспрессии ТС при исследовании основной опухоли и пораженных лимфоузлов (р=0,001). В метастазах в лимфатические узлы наиболее характерным показателем было отсутствие реакции при ИГХ исследовании (73%).

Таким образом, отсутствие иммунопероксидазной реакции с антителами к ТС, а также увеличение ядерной экспрессии в клетках опухоли, по данным проведенного исследования, указывает на ухудшение онкологического прогноза. Различие экспрессии ТС в основной опухоли и ее метастатических отсевах может сказываться на эффективности дальнейшей терапии.

По полученным данным, отличие индекса пролиферации (ИП), определяемого с помощью Ш-67, между группой больных РТК и группой здоровых пациентов статистически незначимо (р=0,28) (см. табл. 3).

При анализе ИП достоверных отличий не выявлено при различной глубине прорастания (р=0,4б), в подгруппах с поражением и без поражения лимфатических узлов (р=0,95).

В представленном исследовании возникновение гематогенных метастазов, а также возврат заболевания в целом реже наблюдались при опухолях с большей пролиферативной активностью. ИП достоверно различался среди групп больных с возникшими гематогенными метастазами и без таковых и составил 24,3±16,5 и 37,3±19,7, соответственно (р=0,025). Существует распространенное мнение, что увеличение ИП клеток опухоли напрямую связано с неблагоприятным онкологическим прогнозом. Полученные нами результаты отличаются от устоявшихся представлениий и предполагают необходимость более детальных исследований этого вопроса. Нельзя исключить, что существуют некие дополнительные факторы, оказывающие влияние на связь ИП с прогрессированием опухолевого процесса и клиническим прогнозом в целом. Вероятно, сегодня ИП не стоит рассматривать как самостоятельный предиктор.

Таким образом, при определении статистической корреляции между результатами исследования иммуногистохимических маркеров и неблагоприятным исходом заболевания (лимфогенное и гематогенное метастазирование) получены данные о значимой связи между экспрессией Е-кад и Кь67 и развитием гематогенного метастазирования, экспрессией ТН С и КА1-1 и вероятностью поражения опухолью лимфатических узлов. Следовательно, исследование таких ИГХ маркеров как Е-кадгерин, ТН С, КА1-1, К1-67 является важным фактораом прогноза течения заболевания.

Как правило, показаниями для проведения комбинированной терапии при РТК являются наличие пораженных лимфатических узлов и/или рТЗ-Т4 стадия по результатам патоморфологического исследования. К сожалению, использование только морфологических критериев демонстрирует достаточно высокий уровень ложно-отрицательных результатов. Так, у 23,5% пациентов из тех, у которых реализовались негативные проявления онкологического процесса в виде появления метастатического поражения и/или местного возврата заболевания, не имели патоморфологических критериев, которые, как правило, ассоциируются с негативным прогнозом. Применение стандартного морфологического исследования в совокупности с ИГХ исследованием повысит эффективность определения прогноза данного заболевания. При анализе значимости комбинаций исследованных маркеров получены данные о крайне специфичном (96,4%) и диагностически точном (77,8%) сочетании следующих показателей экспрессии: слабая очаговая экспрессия во внутриклеточном матриксе стромы, сопровождающаяся слабой окраской сосудов при исследовании тенасцина С; слабая интенсивность окрашивания цитоплазмы в фокусах клеток при исследовании Е-кадгерина.

Отдаленные результаты хирургического лечения колоректального рака

Прослежены все больные. Медиана прослеженности составила 39,26±15,1мес. (максимальный срок прослеженности - 53 месяца, минимальный - 36 месяцев после операции). За исследуемый период среди всех больных умерло 12 человек, 8 из них - по причине прогрессии основного заболевания. Средний срок до наступления летального исхода, обусловленного прогрессией основного заболевания, составил 24,1±10,3 мес. Кроме того, еще у 7 пациентов, находящихся

18

под наблюдением в настоящее время, были обнаружены признаки гематогенного метастазирования, у 2 - локорегионарный рецидив. Во всех наблюдениях рецидивные опухоли и метастатическое поражение паренхиматозных органов были признаны не подлежащими хирургическому удалению, все больные направлены на комбинированное лечение с использованием лучевой и/или химиотерапии.

Таким образом, трехлетняя выживаемость в общей когорте больных составила 83%, канцерспецифическая выживаемость - 89%. При исследовании канцерспецифической выживаемости в группах, стратифицированных по принципу наличия пораженных опухолью лимфатических узлов статистически достоверной разницы получено не было - при поражении лимфоузлов трехлетняя выживаемость составила 81%, при N0 - 93% (log-rank - 0,065). Наиболее вероятно, что отсутствие статистической разницы между группами, сформированными по принципу наличия пораженных лимфатических узлов, обусловлено особенностью выполняемых в отделении вмешательств - рутинное использование расширенной ЛАЭ в объеме D3. Таким образом, полное удаление потенциально опасных лимфоузлов нивелирует разницу в выживаемости среди пациентов с поражением лимфатических узлов и без такового. Свободная от заболевания трехлетняя выживаемость составила 78%.

В ходе проведенной работы были определены и описаны технические особенности выполнения расширенных ЛАЭ при злокачественном поражении толстой кишки различной локализации. Оценен характер лимфогенного распространения опухоли на основании патоморфологического исследования картированных по порядкам лимфоузлов. Впервые проведен анализ экспрессии иммуногистохимических маркеров в ассоциации с клиническими и патоморфологическими данными, определены на основании статистически значимых результатов факторы негативного прогноза течения основного заболевания. В представленном исследовании продемонстрирована высокая эффективность предлагаемых оперативных вмешательств для лечения колоректального рака и прогностическая ценность комплекса иммуногистохимических характеристик опухоли в совокупности с данными патоморфологического исследования для определения прогноза заболевания.

выводы

1. Длительность операции и интраоперационная кровопотеря достоверно зависят от локализации опухоли толстой кишки (р=0,04) и местнораспространенного характера ее роста (р<0.01). Увеличение кровопотери также было связано с мужским полом пациента (р=0,04). Среднее число исследованных лимфоузлов после удаления опухоли толстой кишки в объеме БЗ лимфодиссекции составило 38,83±22,78. Из них среднее количество лимфатических узлов размером <5мм было равно 22,76±14,72. Поражение лимфоузлов было выявленно в 33,3% наблюдений, частота вовлечения лимфатических узлов в зависимости от их расположения -I, II, Ш порядков - составила 43,1%, 20,8% и 2,8% соответственно.

2. По сравнению с неизмененной слизистой оболочкой, для аденокарцином толстой кишки характерно уменьшение экспрессии и аномальное накопление в цитоплазме опухолевых клеток Е-кадгерина, появление цитоплазматической и ядерной экспрессии р-катенина, уменьшение содержания тенасцина С во внеклеточном матриксе стромы и сосудистого эндотелиального фактора — в опухолевых клетках и стенках сосудов, снижение или исчезновение экспрессии КА1-1, а также экспрессия тимидилатсинтазы одновременно в ядре и цитоплазме опухолевых клеток. Выявлена статистически значимая зависимость между большей глубиной прорастания опухоли и уменьшением содержания в цитоплазме Е-кадгерина (р=0,035), появлением ядерной экспрессии Р-катенина (р=0,03), увеличением отложения тенасцина С во внеклеточном матриксе стромы и стенках сосудов (р=0,001), исчезновением экспрессии сосудистого эндотелиального фактора роста (р=0,02) и рецептора эпидермального фактора роста (р=0,015).

3. Отличиями иммунофенотипа метастазов аденокарциномы в лимфатических узлах от иммунофенотипа первичной опухоли являются: цитоплазматическая экспрессия Е-кадгерина наиболее характерна для аденокарцином толстой кишки, а мембранно-цитоплазматическая - для пораженных лимфоузлов (р=0,002); более выраженная интенсивность экспрессии тенасцина С в строме (р=0,04), более частое отсутствие экспрессии КА1-1 (р=0,0001), сосудистого эндотелиального фактора роста (р=0,0003) и тимтидилатсинтазы (р=0,001) в метастатических лимфоузлах; выраженная мембранно-цитоплазматическая

20

экспрессия рецептора эпидермального фактора роста характерна для метастазов в лимфатические узлы, а отсутствие экспрессии - для первичной опухоли (р=0,025).

4. Выполнение БЗ-лимфаденэктомии позволяет получить высокую трехлетнюю выживаемость в группе с метастазами в регионарных лимфатических узлах: при поражении лимфоузлов трехлетняя выживаемость составила 81%, без поражения - 93% (log-rank - 0,065). Свободная от заболевания трехлетняя выживаемость составила 78%, частота местного рецидивирования - 5,6%. Истинная трехлетняя выживаемость в общей когорте больных составила 83%, канцерспецифическая выживаемость - 89%.

5. Показателями неблагоприятного прогноза с позиции лимфогенного и гематогенного распространения являются: слабая цитоплазматическая экспрессия Е-кадгерина (р=0,045); слабая экспрессия тенасцина С во внеклеточном матриксе стромы, сопровождающаяся слабой окраской стенок сосудов (р=0,027); снижение экспрессии KAI-1 (р=0,046); более низкая пролиферативная активность, определяемая с помощью Ki-67 (р=0,025). Совокупность данных показателей экспрессии Е-кадгерина и тенасцина С с морфологическими критериями обеспечивают 96% специфичность прогноза течения заболевания после радикального хирургического лечения.

Практические рекомендации

1. Выполнение расширенной лимфаденэктомии в объеме D3 является важным условием обеспечения онкологического радикализма хирургического лечения рака толстой кишки. Использование этого приема позволяет во многом нивелировать разницу выживаемости в зависимости от наличия пораженных лимфатических узлов.

2. Тщательный морфологический анализ удаленного препарата толстой кишки с опухолью в нативном состоянии позволяет выделить большее количество лимфатических узлов, включая узлы диаметром менее 5 мм, что способствует точному стадированию колоректального рака.

3. При раке толстой кишки целесообразно определять экспрессию Е-кадгерина, тенасцина С, KAI-1 и Ki-67 в ткани первичной опухоли для прогнозирования развития лимфогенных и гематогенных метастазов. Указанные маркеры должны

21

рассматриваться как признаки, требующие оценки при решении вопроса о

проведении комбинированного лечения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Самофалова О.Ю., Пальцева Е.М., Царьков П.В. Иммуногистохимические маркеры как фактор прогноза при хирургическом лечении колоректального рака. Проблемы амбулаторной хирургии. // Материалы восьмой научно-практической конференции ассоциации хирургов малых стационаров и поликлиник Москвы и Московской области. — М. - 2007. - С. 193-194.

2. Самофалова О.Ю., Пальцева Е.М., Царьков П.В. Прогностическое значение иммуногистохимических маркеров при хирургическом лечении колоректального рака. // Первая международная конференция по торакоабдоминальной хирурги. Сборник тезисов. М. - 2008 .- С.4.

3. Царьков П.В., Тулина И.А., Башанкаев Б.Н., Самофалова О.Ю., Кравченко А.Ю. Полная мезоколонэктомия с расширенной БЗ-лимфаденэктомией в хирургическом лечении рака правой половины ободочной кишки. // Научно-практическая конференция с международным участием «Совершенствование медицинской помощи при онкологических заболеваниях, включая актуальные проблемы детской гематологии и онкологии. Национальная онкологическая программа» VII съезд онкологов России. Сборник материалов. М. - 2009. - Т. II. - С. 34

4. Царьков П.В, Тулина И.А., Федоров Д.Н., Кравченко А.Ю., Самофалова О.Ю. Отдаленные результаты хирургического лечения местнораспрост-раненного рака прямой кишки с использованием экстрафасциального принципа выделения. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - М. - 2010. - Т. XX, № 4. - С. 75-82.

5. Башанкаев Б.Н., Кравченко А.Ю.,П Тулина И.А., Самофалова О.Ю., Царьков П.В. Оценка безопасности и эффективности мезоколонэктомии с расширенной D3 - лимфаденэктомией в хирургии рака правой половины ободочной кишки. // Конференция «Современные принципы диагностики и лечения колоректального рака», посвященная памяти проф. В.И. Кныша. -Москва.-2011.-С. 14.

6. Tsarkov P.V., Samofalova O.Yu., Paltseva E.M., Tulina I.A., Kravchenko A.Yu. Can immunohistochemical markers predict unfavourable prognosis in colorectal cancer patients? // European multidisciplinary colorectal cancer congress 2012. Prague, Czech Republic. - 2012. - P. 43.

7. Самофалова О.Ю., Тулина И.А., Кравченко А.Ю., Башанкаев Б.Н., Федоров Д.Н., Пальцева Е.М., Царьков П.В. Анализ лимфогенного метастазирования рака толстой кишки I-III стадии по результатам D3 лимфодиссекции. // Креативная хирургия и онкология. - Уфа: ООО Медиа Группа «Здоровье». -2012,-№2.-С. 57-68.

8. Царьков П.В., Кравченко А.Ю., Тулина И.А., Башанкаев Б.Н., Самофалова О.Ю. Скелетизация нижней брыжеечной артерии с парааортальной лимфаденэктомией в лечении рака левой половины ободочной кишки. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. — М. -2012. - Т. XXII, № 2. - С. 60-70.

Список сокращений

АТК - аденокарцинома толстой кишки ВКМ - внеклеточный матрикс ИГХ - иммуногистохимия

ИМ - индекс метастазирования (отношение пораженных лимфатических

узлов к общему числу исследованных)

ИП - индекс пролиферации

ЛАЭ - лимфаденэктомия

OK - ободочная кишка

ПЗ - поле зрения

ПК - прямая кишка

РТК - рак толстой кикши

ТН С - тенасцина С

ТС - тимидилатсинтаза

ЭФРР - рецептор эпидермального фактора роста VEGF - сосудистый эндотелиальный фактор роста

Подписано в печать: 24.04.12

Объем: 5,5 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 1701 Отпечатано в типографии «Аи1:ой^» 129110, г. Москва, Проспект Мира д. 48, стр.2 (495) 980-45-65; www.autograff.ru