Автореферат и диссертация по медицине (14.03.02) на тему:Морфологическая оценка прогностических и предиктивных факторов при аденокарциноме толстой кишки

На правах рукописи

РАСКИН Григорий Александрович

МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПРОГНОСТИЧЕСКИХ И ПРЕДИКТИВНЫХ ФАКТОРОВ ПРИ АДЕНОКАРЦИНОМЕ ТОЛСТОЙ КИШКИ

14.03.02 - ПАТОЛОГИЧЕСКАЯ АНАТОМИЯ 14.01.12 - ОНКОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ ДОКТОРА МЕДИЦИНСКИХ НАУК

15 ЯНВ 2015

Санкт-Петербург 2014

005557331

005557331

Работа выполнена на кафедрах госпитальной хирургии и онкологии медицинского факультета федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет», в патологоанатомической лаборатории высоких технологических методов морфологического исследования Российского научного центра радиологии и хирургических технологий.

Научные консультанты:

Петров Семен Венедиктович, доктор медицинских наук, профессор. Орлова Рашида Вахидовиа, доктор медицинских наук, профессор.

Официальные оппоненты:

Криволапое Юрий Александрович - доктор медицинских наук, профессор, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова», заведующий патологоанатомическим отделением клинической молекулярной морфологии клиники им. Э.Э. Эйхвальда. Нейштадт Эдуард Львович - доктор медицинских наук, профессор, Санкт-Петербургское государственное бюджетного учреждения здравоохранения «Городское патологоанатомическое бюро», врач-патологоанатом. Гафтон Георгий Иванович — доктор медицинских наук, федеральное государственное бюджетное учреждение «НИИ онкологии им. H.H. Петрова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующий отделением общей онкологии.

Ведущая организации: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится « 31» марта 2015 года в 10.00 часов на заседании диссертационного совета Д.208.086.06 при государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «СевероЗападный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (195067, Санкт-Петербург, Пискаревский пр., д. 47).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте www.szgmu.ru ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (195067, г. Санкт-Петербург, Пискаревский пр., д. 47).

Автореферат разослан «.б » О/_2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук__uC 1 Шевяков Михаил Александрович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования: -

Современной тенденцией, как в России, так и по всему миру, является ежегодный прирост онкологических больных, составляющий 2,2% и превышающий естественный прирост населения (1,3%) (P. Boyle et al., 2004; C.L. Vecchia et al., 2005). Несмотря на то, что общая смертность от онкологических заболеваний с 1990-1994 годов к 2000-2004 снизилась в Евросоюзе со 185,2 до 168,0/100 000 у мужчин и со 104,8 до 96,9/100 000 у женщин (C.L. Vecchia et al., 2005), в России на 2012 год она остается достаточно высокой и составляет 204,3/100 000 (GLOB ОС AN, 2012). Рак толстой кишки - одна из наиболее распространенных форм злокачественных опухолей, занимающая лидирующие позиции по летальности от рака в мире. По данным Всемирной организации здравоохранения (J. Ferlay et al., 2012), рак толстой кишки в мире занимает третье место по заболеваемости у мужчин (663 000 случаев в 2012 г., 10,0% от всех случаев злокачественных новообразований) и второе у женщин (571 000 случаев, 9,4% от общего числа). 60% случаев рака толстой кишки приходится на развитые страны. В мире зарегистрировано около 693000 летальных исходов от рака толстой кишки на 2012 г., что составляет 8% от общей онкологической смертности. Таким образом, рак толстой кишки занимает четвертое место по смертности среди новообразований.

Основными причинами высокой смертности от аденокарциномы толстой кишки можно считать: 1) Биологические особенности опухоли (кинетика роста, способность к метастазированию, механизмы резистентности и т.д.); 2) Выявление заболевания в местно распространенной и метастатической стадиях; 3) Отсутствие четких факторов, определяющих прогноз и алгоритмы противоопухолевого лечения.

В настоящее время известно, что существует несколько альтернативных механизмов канцерогенеза аденокарциномы толстой кишки. Но все они основываются на данных о главной роли стволовых раковых клеток. Основная сложность при исследовании данной популяции клеток состоит в том, что она

малочисленная и трудно идентифицируемая, а кроме того, вероятно, является нестабильной с возможным переходом в другие популяции клеток и обратно.

Последнее десятилетие ознаменовалось прогрессом в лечении рака толстой кишки. Наряду с совершенствованием хирургического лечения, большой вклад в увеличение показателей выживаемости этой категории больных внесли цитостатики с принципиально новыми механизмами действия (элоксатин, иринотекан). Их комбинация с 5-фторпиримидинами (РОЬРОХ, РОЫЧШ) увеличила показатели выживаемости в несколько раз. Однако назначение химиотерапии производят эмпирически, без определения каких-либо предиктивных маркеров чувствительности.

Многие маркеры, которые возможно исследовать иммуногистохимическим способом, рассматривают с точки зрения не только прогностического значения, но и предиктивного (как факторы, предсказывающие эффективность противоопухолевого лечения). К таким маркерам относят: тимидилат синтазу (ТБ), тимидин фосфорилазу, дигидропиримидин дегидрогеназу (БУРО), ЕЯСС-1, Ш-класс-бета-тубулина, ЕЯСС-1, топоизомеразу-Н-альфа, Кь67. Какие из этих маркеров или их сочетания могут определять эффективность предстоящей стандартной химиотерапии (РОЬРОХ, РОЬР1Я1, де Грамонт) остается неясным.

Таким образом, определение предиктивного и прогностического значения имеющихся факторов, их сочетания, а также поиск новых маркеров является актуальной проблемой.

Степень разработанности исследования:

Систематических исследований по данной теме ранее не проводилось. Известными прогностическими факторами с точки зрения показателей выживаемости являются стадия заболевания, дифференцировка опухоли, инвазия сосудов, параканкрозное воспаление, микросателлитная нестабильность и др. (Р.Т. ВоБгпап й а1. 2010). В настоящее время накоплен достаточно большой опыт по определению пролиферативной активности при помощи иммуногистохимического исследования белка К>67 (М. 81агЬог£ е1 а1., 1996; Т. 8а1\уа1а е1 а1., 2005), экспрессии ге-

нов неспаренных нуклеотидов ДНК (MSH2, MSH6, MLH1, PMS2) (N.M. Lindor et al., 2002). Все больше работ направлено на выявление стволовых раковых клеток при помощи различных маркеров: CD133, CD24, LGR5, ALDH1 (F.T. Bosman et al., 2010). Однако до сих пор не сделаны выводы о влиянии этих маркеров и их сочетания на показатели выживаемости больных раком толстой кишки, кроме того, в литературе нет работ, направленных на изучение специфических факторов, определяющих потенциал метастазирования при аденокарциноме толстой кишки, в то время как при опухолях других локализаций уже показано значение рецепторов к хемокинам (в частности, CXCR4).

Работ по комплексному морфологическому изучению прогностических и предиктивных факторов при аденокарциноме толстой кишки, а также по оценке влияния этих маркеров и их сочетания на показатели выживаемости больных раком толстой кишки в отечественной и зарубежной литературе нет.

Цель исследования.

Морфологическими методами оценить предиктивные и прогностические факторы у больных аденокарциномой толстой кишки для увеличения показателей выживаемости.

Для достижения цели исследования решались следующие задачи:

1. Исследовать экспрессию рецепторов к хемокинам (CXCR4, CCR10), маркера стволовых клеток (ALDH1), пролиферативную активность (Ki-67) в аденокарциноме толстой кишки.

2. Оценить пролиферативную активность стволовых раковых клеток в сравнении с общей клеточной популяцией аденокарциномы толстой кишки.

3. Исследовать прогностическое значение экспрессии рецептора к хемокину CXCR4, альдегиддегидрогеназы 1 (ALDH1), Ki-67 и их сочетания в качестве показателей распространенности аденокарциномы толстой кишки и выживаемости.

4. Провести сравнительное исследование микросателлитной нестабильности и репарационной системы неспаренных нуклеотидов ДНК методами ПЦР и

иммуногистохимии.

5. Оценить частоту объективного ответа и время до прогрессирования при стандартной химиотерапии (РОЬРОХ, РОЬРЮ, де Грамонт) у больных дис-семинированным раком толстой кишки с учетом значения экспрессии маркеров (ТБ, ТР, ЭУРО, Е11СС-1, Ш-класс-бета-тубулина, топоизомеразы-И-альфа, К-67).

Научная новизна:

Установлено, что прогноз течения аденокарциномы толстой кишки определяется: 1) пролиферативной активностью по индексу Кл-67; 2) способностью раковых клеток к хемотаксису (рецептор к хемокину СХС 4 типа (СХСЯ4)); 3) состоянием системы репарации неспаренных нуклеотидов ДНК: экспрессией генов МБНб, МЗШ, МЬН1, РМБ2 - и не связан с уровнем дифференцировки клеток опухоли (экспрессией АЬОН1). К предиктивным факторам эффективности химиотерапии относятся ферменты, участвующие в метаболизме 5-фторпиримидинов (тимидин фосфорилаза, тимидилат синтаза).

Впервые показано, что способность клеток аденокарциномы толстой кишки к хемотаксису определяется степенью выраженности экспрессии рецептора к хемокину 4 типа (СХСЯ4). Продукция данного рецептора опухолевыми клетками чаще наблюдается при диссеминированной форме рака толстой кишки, чем при локализованной (90% и 41% случаев, соответственно, р=0,019). Кроме того, у 68% больных II стадией с позитивной реакцией на СХСЯ4 заболевание прогрессирует после радикального хирургического лечения, а у 75% пациентов с негативным статусом СХСР14 наблюдается 5-летний безрецидивный период (р=0,02).

Определено, что пролиферативная активность клеток аденокарциномы толстой кишки по индексу Кь67 значимо ниже в диссеминированной форме рака толстой кишки и у больных II стадией с низкими показателями безрецидивной выживаемости после радикального хирургического лечения (р<0,05).

Доказано, что совместное использование СХСЯ4 с И-67 усиливает прогностическую значимость маркеров (медиана безрецидивной выживаемости неблаго-

приятной группы II стадии составила 16,5 месяцев с СХСЯ4<30%, К]-67>70%), кроме того, выявлена обратная корреляции экспрессии СХСЯ4 и Кл-67 в клетках опухоли.

Установлено, что соотношение стволовых непролиферирующих (А1ЛЭН1+, Кь67-), стволовых пролиферирующих (АЬОН1+, И-67+), амплифицирующихся (АЬОН1-; Кь67+), дифференцирующихся (АЬОН1-; Кл-67-) клеток в аденокарци-номе толстой кишки составляет 9:1:60:30. Преобладающей популяцией являются амплифицирующиеся клетки (медиана 60%), а наименьшей - пролиферирующие стволовые раковые (медиана 1%). Изменение количества стволовых клеток не является прогностически значимым для прогрессирования рака толстой кишки.

Показано, что сочетание экспрессии тимидин фосфорилазы (ТР) и отсутствия тимидилат синтазы (ТБ) в диссеминированном раке толстой кишки связано с увеличением частоты объективного ответа на химиотерапию, содержащую 5-фторпиримидины, до 39%. В свою очередь, при обратном сочетании экспрессии данных маркеров частота объективного ответа была 13% (р=0,04). При этом не отмечено связи экспрессии Кл-67, ЕЯСС-1, топоизомеразы-П-а, Ш-класса-бета-тубулина и эффективности лечения у пациентов с аденокарциномой толстой кишки, получавших стандартную химиотерапию (РОЬРОХ, РОЬР1Я1, Де Грамонт) (Р>0,05).

Теоретическая и практическая значимость:

Иммуногистохимическое исследование СХСЯ4 может быть рекомендовано для оценки метастатического потенциала аденокарциномы толстой кишки, так как экспрессия СХС114 статически значимо выше при диссеминированной форме аденокарциномы (IV стадия), чем при локализованной форме рака (1-П стадия, р=0,019), исследование ССШО в раке толстой кишки значения не имеет, так как во всех изученных случаях данный рецептор отсутствовал.

Рекомендуется использовать комплексную иммуногистохимическую оценку Кь67 и СХСЯ4 в качестве прогностических маркеров безрецидивной выживаемости больных аденокарциномой толстой кишки II стадии после радикального

хирургического лечения, так как экспрессия СХСРМ статически значимо выше у пациентов II стадии после радикального хирургического лечения, у которых в дальнейшем наблюдалось прогрессирование заболевания, чем у больных с 5-летним безрецидивным периодом (68% и 32%, р=0,02). Однако даже в случаях с прогрессированием заболевания высокий пролиферативный уровень опухоли (>70%) в совокупности с низкой экспрессией СХСЯ4 (<30%) связаны с высокой безрецидивной выживаемостью (медиана 16,5 месяцев). Низкий уровень пролиферации (<30%) с высокой экспрессией СХСЯ4 (>70%) связаны с низкой безрецидивной выживаемостью (медиана 7 месяцев).

Иммуногистохимическое исследование МБШ, МБНб, МЬН1, РМБ2 может быть применено в первичном скрининге пациентов с синдромом Линча (наследуемого неполипозного рака толстой кишки), так как мутации этих генов в 100% случаев сопровождаются выпадением экспрессии.

Рекомендуется использовать иммуногистохимическое исследование тими-дилат синтазы (ТБ), тимидин фосфорилазы (ТР) в прогнозировании эффективности химиотерапии пациентов с диссеминированной аденокарциномой толстой кишки, получающих 5-фторпиримидин содержащие препараты. Частота объективного ответа при наличии экспрессии ТР и отсутствии ТБ составила 39%, при обратном сочетании (экспрессия ТБ и отсутствие ТР) была 13% (р=0,04).

Для практического использования нецелесообразно исследовать экспрессию топоизомеразы-И-а, Ш-класса-бета-тубулина, ЕЯСС-1, Кл-67 для оценки прогноза эффективности стандартной химиотерапии (РОЫЮХ, РОЬРИИ, де Грамонт) при аденокарциноме толстой кишки, так как не было выявлено связи экспрессии данных маркеров с частотой объективного ответа.

На основании полученных результатов были разработаны практические рекомендации по диагностике и лечению рака ободочной кишки, утвержденные на заседании ученого совета КБ 122 им. Л.Г. Соколова, получен патент на изобретение № 2494402, опубликование в бюллетене № 27 от 27.09.2013 г., подана заявка на патент № 201350900 от 20.01.2014. Результаты исследования внедрены в практическую и учебную деятельность ФГБУ «Российский научный центр радиологии

и хирургических технологий» МЗ РФ, ГБУЗ «Городской клинический онкологический диспансер», медицинского факультета Санкт-Петербургского государственного университета.

Методология и методы исследования:

В соответствии с дизайном исследования, на основании анализа архивной медицинской документации и данных текущего наблюдения за пациентами, находящимися на стационарном обследовании, были отобраны 776 больных аденокар-циномой толстой кишки I-IV стадий со средним возрастом 57,6 лет. Из них 105 случаев рака прямой кишки (исследовалась только микросателлитная нестабильность) и 671 больной раком ободочной кишки (изучались все параметры). Для исследования прогностических факторов ретроспективно был отобран архивный операционный материал 38 пациентов с I стадией рака, 205 - со II стадией, 120 - с III стадией, 273 - с IV стадией. В этом материале при помощи иммуногистохими-ческого исследования изучались рецепторы к хемокинам (CCR10, CXCR4), маркер стволовых клеток (ALDH-1), пролиферативная активность (Ki-67), гены репарации неспаренных нуклеотидов ДНК (MSH6, MSH2, MLH1, PMS2), при помощи ПЦР была изучена микросателлитная нестабильность. У пациентов со II стадией был прослежен 5-летний период и оценивалась безрецидивная выживаемость в зависимости от изученных прогностических факторов. У больных с IV стадией исследовались как прогностические, так и предиктивные факторы. Последние включали Ki-67, топоизомеразу-Н-альфа, III-класс-бета-тубулина, TS, ТР, DYPD, PTEN, ERCC1. Исследовалась частота объективного ответа, время до прогресси-рования у 104 пациентов с IV стадией аденокарциномы ободочной кишки, получавших 5-фтор-пиримидин содержащую химиотерапию. Полученные показатели сопоставлялись с результатами иммуногистохимического исследования предик-тивных маркеров. Группой сравнения при исследовании предиктивных факторов были 34 случая диссеминированной формы аденокарциномы желудка и 12 - легкого. Кроме того, экспрессия всех изученных маркеров сопоставлялась у больных II и IV стадий с целью оценки прогностического их значения с точки зрения рас-

пространенносги рака ободочной кишки. У пациентов I и III стадий исследовалась степень выраженности исследованных маркеров без анализа параметров выживаемости. Статистическая обработка полученных результатов осуществлялась при помощи метода множественной регрессии и кси-квадрат.

Положения, выносимые на защиту:

1. Прогноз течения аденокарциномы толстой кишки определяется: 1) индексом Кл-67; 2) выраженностью экспрессии рецептора к хемокину СХС 4 типа (СХС114); 3) состоянием системы репарации неспаренных нуклеотидов ДНК: экспрессией генов МБН6, МБШ, МЬН1, РМБ2 - и не связан с уровнем дифференцировки клеток опухоли (экспрессией А1ЛЭН1).

2. Сочетание высокой пролиферативной активности опухоли (>70%), низкой экспрессии СХСЯ4 (<30%) связано с высокой безрецидивной выживаемостью больных аденокарциномой толстой кишки II стадии после радикального хирургического лечения (р<0,05).

3. Сочетание экспрессии тимидин фосфорилазы (ТР) и отсутствия тимидилат синтазы (ТБ) в диссеминированном раке толстой кишки связано с увеличением частоты объективного ответа на химиотерапию, содержащую 5-фторпиримидины (39% в сравнении с обратным сочетанием: экспрессия ТБ и отсутствие ТР - 13%, р=0,04).

4. Стволовые клетки аденокарциномы толстой кишки (АЬОН1-позитивные) представляют собой малочисленную субпопуляцию раковых клеток с низким пролиферативным потенциалом (Ю-67 0,1-10% в сравнении с 30-90% общей пролиферации опухоли).

Степень достоверности и апробация результатов исследования:

Результаты диссертационного исследования достоверны и обоснованы, что обеспечивается достаточным количеством исследованного материала (776 случаев аденокарциномы толстой кишки), использованием современных методов морфологического исследования: иммуногистохимическое исследование с применением

большого спектра различных антител, отражающих различные метаболические процессы раковых клеток. Использование методов множественной регрессии и кси-квадрат при статистической обработке полученных результатов позволяет говорить о достоверности проведенного исследования.

Результаты работы были представлены в докладах на:

конференции Лугано ESMO (ECLU, Лугано, Швейцария, 2008); 28 Всемирном конгрессе Международной академии патологии (Сан-Пауло, Бразилия, 2010); конференции Евразийского общества онкологов по улучшению морфологической верификации рака легкого (Санкт-Петербург, Россия, 2011); Зальцбургском семинаре по патологии Американско-Австрийского фонда (Зальцбург, Австрия, 2012), VIII Международном конгрессе: рациональная фармакотерапия - 2013. Санкт-Петербург, 10-12 октября 2013 г., II Конгрессе Национальной ассоциации фтизиатров, Санкт-Петербург, 28-30 ноября 2013 г., VIII Съезде онкологов и радиологов СНГ и Евразии, Казань, 16-18 сентября 2014 г.

Публикации:

Материалы диссертации отражены в 24 опубликованных работах, в том числе 15 в рецензируемых изданиях.

Личный вклад автора в проведенное исследование:

Автор непосредственно собрал первичный материал, провел анализ данных отечественной и зарубежной литературы в отношении выбранной темы исследования, выполнял иммуногистохимические исследования, проводил оценку микропрепаратов, самостоятельно проводил статистическую обработку полученных результатов. Доля участия автора в сборе информации, проведении и интерпретации исследований — до 100%, в математико-статистической обработке - до 90%, в обобщении результатов исследования - до 90%.

Структура и объем диссертации:

Диссертация изложена на 250 страницах машинописи и состоит из введе-

ния, пяти глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, приложения, списка литературы. Текст иллюстрирован 32 таблицами, 43 рисунками. Список литературы содержит 478 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования

В диссертационном исследовании проведено клинико-морфологическое изучение 776 больных аденокарциномой толстой кишки из них 105 случаев рака прямой кишки, 671 случай рака ободочной кишки.

Средний возраст пациентов составил 57,6 лет, соотношение по полу было: 367 мужчин (47%), 409 женщин (53%) (таблица 1).

Иммуногистохимически исследовались альдегиддегидрогеназа 1 (ALDH1), Ki-67, CXCR4, CCR10, тимидин фосфорилаза, тимидилат синтаза, дигидропи-римидин дегидрогеназа, ERCC-1, Ш-класс-бета-тубулина, топоизомераза-П-альфа, MSH2, MSH6, MLH1, PMS2, а также методами ПЦР оценивалась микро-сателлитная нестабильность, мутации генов репарации неспаренных нуклеоти-дов ДНК (MMR) (рисунок 1). Иммуногистохимическое исследование выполнялось по стандартному протоколу. Оценка иммуногистохимического окрашивания осуществлялась путем подсчета числа позитивных клеток относительно общего числа опухолевых клеток. Во всех препаратах имелся внутренний контроль в виде нормальной слизистой оболочки толстой кишки. Исследование пролиферативной активности стволовых клеток проводилось с применением метода двойного иммуногистохимического окрашивания. Для этого использовались кроличьи моноклональные антитела к ALDH1, мышиные - к Ki-67. Из разведенных антител приготавливалась смесь в соотношении 1:1, после чего полученный коктейль из антител наносился на исследуемые образцы.

Таблица 1 - Характеристика исследованного материала

Изучение состояние клеток Количество случаев Распределение по стадиям Средний возраст пациентов (лет) Распределение по полу

Прогностические факторы

Исследование рецепторов к хемоки-нам и пролифера-тивной активности 301 I-II - 86 (29%) III-53(18%) IV-162 (53%) 59,0 М: 144 (48%) Ж: 157 (52%)

Стволовые раковые клетки толстой кишки 102 1-11-32(31%) III -26(25%) IV-44 (44%) 60,2 М: 50 (49%) Ж: 52 (51%)

Пролиферативная активность стволовых раковых клеток 20 I-II- 10(50%) IV- 10 (50%) 59,7 М: 8 (40%) Ж: 12 (60%)

Исследование MSI 196 I-II - 103 (53%) III-38(18%) IV-55 (29%) 63,0 М: 89 (45%) Ж: 107 (55%)

Исследование генов репарации неспа-ренных нуклеоти-дов ДНК (MSH2, MSH6, PMS2, MLH1) 17 1-11-12(71%) III-3(18%) IV-2 (11%) 41,5 М: 10 (59%) Ж: 7 (41%)

Предиктивные факторы

Предикторы эффективности химиотерапии 140 1-11-36(26%) IV-104 (74%) 62,5 М: 66 (47%) Ж: 74(53%)

Всего 776 1-11-279(36%) III-120(15%) IV-377 (49%) 57,6 М: 367 (47%) Ж: 409 (53%)

Было протестировано несколько систем визуализации с двойной меткой. Неудовлетворительными были признаны системы визуализации, которые использовали в качестве второго красителя синий цвет, так как в этом случае контрокрашивание гематоксилином нельзя было проводить. Наш выбор остановился на системе визуализации DBS Montage Multiplex System с пероксидазной меткой и диаминобензидином против мышиных антител и щелочной фосфата-зой с красным прочным против кроличьих антител.

Таким образом, пролиферативная активность выявлялась коричневым окрашиванием ядер раковых клеток, а экспрессия ALDH-1 ядерно-цитоплазматической реакцией красно-сиреневого цвета.

Рисунок 1 - Дизайн исследования.

Так как окраска диаминобензидином была более интенсивная, это создавало возможность оценки пролиферативной активности как в ALDH1 негативных клетках, так и позитивных. Кроме того, использование таких красителей дало возможность применить гематоксилин Майера в качестве дополнительного красителя.

Статистическая обработка полученных результатов проводилась при помощи метода множественной регрессии, кси квадрат.

Иммуногистохимическое исследование рецепторов к хемокинам (CXCR4, CCR10), маркера стволовых клеток (ALDH1), пролиферативной активности (Ki-67) в аденокарциноме толстой кишки

Для идентификации стволовых клеток мы выбрали альдегидцегидрогена-зу 1 (ALDH1), потому что выработка этого фермента является одним из основных свойств стволовой клетки. Для формирования опухоли в экспериментальных условиях требуется минимальное количество ALDH-1-позитивных клеток, относительно всех изученных маркеров (С. Ginestier С. et al., 2007; F. Jiang et al., 2009).

Было исследовано 102 аденокарциномы толстой кишки. Во всех случаях оценивалась экспрессия ALDH1, в том числе в нормальной слизистой оболочке толстой кишки, прилежащей к опухоли. Позитивная реакция в виде ядерно-цитоплазматического окрашивания во всех случаях выявлялась в единичных клетках дна крипты.

При оценке экспрессии ALDH1 в аденокарциноме толстой кишки была выявлена широкая вариабельность частоты позитивных раковых клеток (от 1% до 80%) с парадоксальным субтотальным окрашиванием некоторых раковых комплексов, интенсивность окраски также варьировала. Кроме того, количество позитивных на ALDH1 клеток было неравномерным в пределах одной опухоли. Так, в некоторых раковых железах процент позитивных клеток мог достигать 50% и более, в то время как в рядом лежащих комплексах выявлялись единич-

ные позитивные клетки.

Пролиферация опухолевых клеток - это неотъемлемая черта злокачественной опухоли и часто связана с ее агрессивностью. Исследование Кл-67 217 аденокарцином толстой кишки показало, что 86% случаев имеют высокую про-лиферативную активность опухоли (индекс Кь67>30%), из них в 39% случаев пролиферация раковых клеток превышала 70% (таблица 2).

Таблица 2 — Пролиферативная активность аденокарциномы толстой кишки

(п=217)

Индекс К1-67 Частота встречаемости

<30% 32 (14 ±4,6%)

30%-50% 45 (21 ± 5,4%)

50%-70% 68 (31 ±6,15%)

>70% 72 (33 ± 6,26%)

Для изучения пролиферации стволовых клеток была использована методика двойного иммуногистохимического окрашивания. Вначале была оценена экспрессия в нормальной слизистой оболочке толстой кишки. Было выявлено значительное отличие в пролиферативной активности АЬОН1-позитивных и негативных клеток (р<0,001). Нормальные стволовые ткань-коммитированные клетки практически не пролиферировали. При исследовании с использованием аналогичной методики раковых комплексов, все 20 случаев показали значительное различие в пролиферации стволовых раковых клеток (0,1-10%) и общей клеточной популяции (30-90%, р<0,001). В среднем пролиферация стволовых раковых клеток не превышала 10% (рисунок 2).

В нашем исследовании мы изучили экспрессию двух основных рецепторов к хемокинам: ССШО и СХСЯ4. Экспрессия СХСГМ была выявлена в 77% случаев рака толстой кишки с широкой вариабельностью частоты позитивных клеток (от 10% до 90%). Экспрессия ССШО не была выявлена ни в одном случае аденокарциномы толстой кишки. В слизистой оболочке толстой кишки ко-

ричневое окрашивание СХСЯ4 (хромоген-диаминобензидин) выявлялось в виде 1-5 гранул, расположенных над нуклеолеммой, обращенной в сторону просвета кишки (рисунок 3). Причем наиболее выраженная экспрессия отмечалась в средних отделах и ослабевала к поверхностной и глубокой частям крипт.

Рисунок 2 — Очень редкие пролиферирующие стволовые опухолевые клетки в аденокарциноме толстой кишки (розово-красное окрашивание) в сравнение с общей популяцией опухоли, Х400.

Таким образом, исходя из полученных данных, клеточный состав адено-карциномы толстой кишки условно можно разбить на 4 популяции: 1) стволовые непролиферирующие (А1ЛЭН1+, Кл-67-), 2) стволовые пролиферирующие (АЬБН1+, Кл-67+), 3) амплифицирующиеся (АЬОН1-; Кл-67+), 4) дифференцирующиеся (А]1ЛЭН1-; Кл-67-). Соотношение данных популяций в аденокарциноме толстой кишки в среднем составляет 9:1:60:30. Преобладающей популяцией являются амплифицирующиеся клетки (медиана 60%), а наименьшей -

пролиферирующие стволовые раковые (медиана 1%). Кроме того, мы определили, что часть клеток аденокарциномы толстой кишки имеет экспрессию рецептора хемокина СХСК4, который в литературе при изучении других локализаций показывал связь с развитием метастазов. Определение прогностической значимости изученных маркеров с точки зрения распространенности аденокарциномы толстой кишки и показателей выживаемости стало следующей задачей нашего исследования.

Рисунок 3 - СХС114 в виде коричневых гранул (окраска диаминобензидином), расположенных над нуклеолеммой клеток, обращенных в просвет желез слизистой оболочки толстой кишки, Х1000.

Исследование прогностического значения экспрессии рецептора к хе-мокину СХС114, альдегиддегидрогеназы (А1ЛШ1), Ю-67 и их сочетания с точки зрения распространенности аденокарциномы толстой кишки, показателей выживаемости

Для изучения связи пролиферативной активности аденокарциномы толстой кишки со стадией опухоли мы проанализировали уровень пролиферации, измеренный по индексу Кл-67, в случаях диссеминированной (IV стадии) и локализованной (1-Н стадий) форм аденокарциномы толстой кишки. Для этого мы выделили 4 интервала: Кл-67<30%, 30-50%, 50-70%, >70% (таблица 3).

Таблица 3 - Сравнение пролиферативной активности опухоли при диссеминированной (IV стадии) и локализованной (1-П стадиях) формах аденокарциномы толстой кишки (п=217)

Индекс Ю-67 IV стадия 1-П стадии

Ю-67<30% 30 (19 ± 6,04%) 2 (4 ±5,18%)

30%<Ю-67<50% 40 (25 ± 6,67%) 5 (9 ± 7,6%)

50%<К1-67<70% 49 (30 ± 7,05%) 19 (34 ± 12,5%)

Ю-67>70% 43 (26 ± 6,75%) 29 (53 ± 13,2%)

Всего случаев 162 55

Как видно из таблицы 3, в случае диссеминированного рака нет вариабельности между выделенными нами интервалами пролиферативной активности опухоли, в локализованной же форме относительно низкий уровень К1-67 (<30%) наблюдался в 4% случаев, а высокий (>70%) в 53% наблюдений.

Для статистической оценки связи пролиферативной активности опухоли с ее распространенностью мы взяли крайние интервалы пролиферативной активности (таблица 4).

Таблица 4 - Сравнение крайних интервалов пролиферативной активности опухоли при IV и 1-П стадиях аденокарциномы толстой кишки (п=104)

Индекс Ю-67 Всего случаев IV стадия 1-Н стадии Хи- квадрат=10,6883, р=0.0019

К1-67<30% 32 30 (41%) 2 (6%)

К1-67>70% 72 43 (59%) 29 (94%)

Всего случаев 104 73 31

Как видно из таблицы 3.4, имеется значительное отличие процента случаев с относительно низким (<30%) и высоким (>70%) уровнями пролиферации опухоли группы с локализованным раком (1-П стадии). В случаях же диссеми-нированного рака это отличие было маловыраженным. Таким образом, выявлена статистически значимая обратная корреляция между индексом Кл-61 и распространенностью аденокарциномы толстой кишки (р=0,0019).

Для оценки безрецидивной выживаемости был отобран 31 пациент со II стадией аденокарциномы толстой кишки, у которых в течение 5 лет было выявлено прогрессирование заболевания. При оценке связи пролиферативной активности опухоли с безрецидивной выживаемостью у пациентов после радикального хирургического лечения медиана выживаемости с низким индексом К1-67 (<30%) составила 7 месяцев в сравнении с высоким индексом (>70%) -11 месяцев.

В группе пациентов с диссеминированной формой аденокарциномы (IV стадия) в 28 случаях из 31 (90%) была позитивная реакция на СХСЯ4. Ее уровень варьировал от 10% до 90%. В аденокарциномах толстой кишки II стадии также преобладала позитивная реакция на СХСЯ4, но число случаев без экспрессии рецептора к хемокину было значительно выше в сравнении с первой группой (41% и 10% соответственно). Таким образом, негативная реакция на СХСЯ4 статистически значимо коррелирует с локализованной формой аденокарциномы толстой кишки (р=0,0196).

При изучении связи экспрессии СХСЯ4 с развитием прогрессирования заболевания в течение 5 лет в другой группе пациентов - II стадии аденокарци-номы толстой кишки после радикального хирургического лечения - оказалось, что в 68% случаев с позитивной реакцией на СХСЯ4 заболевание прогрессирует, а у 75% пациентов с негативным статусом СХСЯ4 наблюдается 5-летний безрецидивный период (р=0,02, таблица 5). При оценке экспрессии СХСЯ4 в группе со II стадией, где произошло прогрессирование заболевания, оказалось, что медиана выживаемости у больных с высоким СХСЯ4 (>70%) составляет 8 месяцев против 11 - при низком СХСЯ4 (<30%). Однако связь экспрессии СХСЯ4 в данной подгруппе с безрецидивной выживаемостью была статистически недостоверной (р=0,15).

Таблица 5 - Значение СХСЯ4 при II стадии аденокарциномы толстой кишки в зависимости от развития прогрессирования заболевания в течение 5 лет

Рецептор к хемокину 4 Всего случаев II стадия без прогрессирования II стадия, прогрессирование Хи-квадрат=5,5 р= 0.02

СХСЯ4 позитив 41 13 (32%) 28 (68%)

СХСЯ4 негатив 12 9 (75%) 3 (25%)

Всего случаев 53 22 31

В наших исследованиях мы не выявили корреляции между экспрессией А1ЛЭН1 и распространенностью рака толстой кишки, а также с безрецидивной выживаемостью больных II стадией. Вероятно, простое увеличение стволовых раковых клеток в аденокарциноме толстой кишки еще не приводит к усилению метастатической активности опухоли, а для этого должен произойти ряд до-

полнительных событий, таких как увеличение экспрессии рецепторов хемоки-нов и др.

Все это заставило нас оценить совокупное влияние экспрессии хемокино-вых рецепторов и пролиферативной активности опухоли на безрецидивную выживаемость больных аденокарциномой толстой кишки II стадии после радикального хирургического лечения, у которых наблюдалось прогрессирование заболевания. В целом повышение экспрессии СХСЯ4 сопровождалось снижением пролиферативной активности. Несмотря на то, что обратная корреляция между СХСЯ4 и Кь67 была статистически недостоверной (р=0,06), в нашем исследовании не было наблюдений с синхронно высокими или низкими СХСЯ4 и Кд-67 (таблица 6).

Таблица 6 - Значение СХСЯ4 и Кл-67 в зависимости от безрецидивной выживаемости больных аденокарциномой толстой кишки II стадией после радикального хирургического лечения с прогрессированием заболевания в течение 5 лет (п=31)

Значение маркеров Безрецидивная выживаемость

Высокий СХСК4 (>70%), низкий Кл-67 (<30%) 7 месяцев

Средние СХСИ4 и Ю-67 (30-70%) 9 месяцев

Низкий СХСГ14 (<30%), высокий Ю-67 (>70%) 16,5 месяцев

Синхронное снижение экспрессии СХСЯ4 и повышение Кл-67 связано с увеличением безрецидивной выживаемости больных аденокарциномой толстой кишки II стадии после радикального хирургического лечения. Медиана безрецидивной выживаемости с высоким СХСЯ4 (>70%) и низким Кл-67 (<30%) составила 16,5 месяцев, а с низким СХСЯ4 (<30%) и высоким К1-67 (>70%) 7 месяцев. В связи с этим результатом уместно напомнить, что СХСЯ4 и Кь67 по отдельности не связаны с безрецидивной выживаемостью (таблица 7).

Таблица 7 — Регрессионная модель Кокса. Связь экспрессии маркеров с безрецидивной выживаемостью пациентов со II стадией рака толстой кишки после радикального хирургического лечения с прогрессированием заболевания в течение 5 лет

Исследуемый параметр 1(28) уровень р

СХСИ4 + К1-67 2,4 0,02

СХСЯ4 -1,5 0,153

Ю-67 -0,14 0,89

При оценке влияния совокупности факторов с использованием метода множественной регрессии снижение экспрессии СХСЯ4 вместе с увеличением К1-67 статистически значимо улучшало безрецидивную выживаемость (р<0,05, таблица 7). Таких закономерностей не было выявлено при изучении маркера стволовых клеток - А1ЛЭН1.

Сравнительное исследование микросателлитной нестабильности и репарационной системы нсспарснных нуклеотидов ДНК методами ПЦР и иммуногистохимии

При исследовании 196 больных аденокарциномой толстой кишки лишь у 3-х из них все 6 маркеров выявили микросателлитную нестабильность и, таким образом, были расценены как опухоли с высоким ее уровнем. Иными словами, лишь 1,5% случаев аденокарциномы толстой кишки были ассоциированы с микросателлитной нестабильностью. Помимо этого, в исследование были включены пациенты с клиническими признаками синдрома Линча. Для этого было просмотрено 1500 историй болезни пациентов с аденокарциномой толстой кишки. В результате этого были отобраны 17 пациентов, у родственников которых были выявлены опухоли, наиболее часто встречаемые при синдроме

Линча. Материал для иммуногиетохимического исследования был доступен у 10 пациентов.

В наших исследованиях была выявлена аденокарцинома толстой кишки с негативной иммуногистохимической реакцией на PMS2 и MLH1, в которой микросателлитная нестабильность была низкой.

Как видно из таблицы 8, в 2 случаях аденокарциномы толстой кишки с микросателлитной нестабильностью была экспрессия всех генов MMR. В остальных 8 случаях часть маркеров показывали негативную иммуногистохими-ческую реакцию.

Таблица 8 — Сопоставление исследования MSI и иммуногиетохимического исследованием экспрессии MMR генов (MLH1, PMS2, MSH2, MSH6) у пациентов с клиническими признаками синдрома Линча

Микросателлитная Всего ИГХ негатив ИГХ негатив Экспрессия всех

нестабильность MLH1/PMS2 MSH2/MSH6 генов MMR

(MSI)

MSI-H 7 (70%) 3 (60%) 3 (100%) 1 (50%)

MSI-L 3 (30%) 2 (40%) 0 1 (50%)

Нет MSI 0 0 0 0

Всего 10 5 (50%) 3 (30%) 2 (20%)

Как видно из таблицы 9, в двух случаях с сохранной экспрессией МБШ, 6, МЬН1, РМБ2 гены MMR были дикого типа. В большинстве случаев выпадение экспрессии сопровождалось мутацией соответствующих генов, однако в 2 случаях MMR гены также были дикого типа.

В 2002-2003 годах было сообщено, что мутация У600Е в ВЯАР-гене связана с микросателлитной нестабильностью в опухоли (Н. Оау1ез й а1., 2002; С. ОНуеиа е1 а1., 2003; Н. RajagopaIan е1 а1., 2003). Мутация В11АР (У600Е) часто выявляется в спорадических колоректальных раках с гиперметилированным МЬН1, но не бывает при наследуемом неполипозном колоректальном раке

(синдроме Линча).

Таблица 9 - Сопоставление исследования экспрессии и мутаций MMR генов (MLH1, PMS2, MSH2, MSH6) у пациентов с клиническими признаками синдрома Линча

Гены репарации неспаренных нуклеотидов ДНК (MMR) Всего ИГХ негатив MLH1/PMS2 ИГХ негатив MSH2/MSH6 Экспрессия всех генов MMR

Мутация гена MMR 6 (60%) 4 (80%) 2 (66%) 0

Гены MMR дикого типа 4 (40%) 1 (20%) 1 (33%) 2 (100%)

Всего 10 5 (50%) 3 (30%) 2 (20%)

В наших 17 случаях с выявленной микросателлитной нестабильностью мутация BRAF (V600E) не выявлялась. Из них в 6 случаях гены MMR были дикого типа с сохранной экспрессией MSH2, MSH6, MLH1, PMS2 в 2 наблюдениях (в 2 случаях материал для ИГХ был недоступен).

Таким образом, признаком микросателлитной нестабильности ДНК опухолевых клеток, свидетельствующей о более благоприятном течении заболевания, является отрицательная иммуногистохимическая реакция на белки системы репарации неспаренных нуклеотидов ДНК: MSH2, MSH6, MLH1, PMS2 (прогностическая значимость отрицательного результата близка к 100%).

Иммуногистохимическое исследование экспрессии генов репарации неспаренных нуклеотидов ДНК можно использовать в первичном скрининге пациентов с синдромом Линча (наследуемого неполипозного рака толстой кишки), так как мутации этих генов в 100% случаев сопровождаются выпадением экспрессии.

Изучение предиктивной значимости маркеров и их сочетания в оценке предполагаемой эффективности стандартной химиотерапии (РОЬРОХ, РОЬНШ, де Грамонт) аденокарциномы толстой кишки

Во второй части исследования мы оценили частоту объективного ответа и время до прогрессирования при стандартной химиотерапии (РОЬРОХ, РОЬРЮ, де Грамонт) у больных диссеминированным раком толстой кишки с учетом значения экспрессии маркеров (ТБ, ТР, БУРО, ЕЯСС-1, Ш-класс-бета-тубулина, топоизомеразы-И-альфа, Км-67). Для этого было проведено исследование 104 больных IV стадией рака ободочной кишки. В исследование были включены больные с диссеминированной стадией опухолевого процесса с преимущественным поражением печени, лёгких, лимфатических узлов, костей. Средний возраст больных составил 62,5.

При исследовании экспрессии анализируемых маркеров в сопоставлении со временем до прогрессирования заболевания была выявлена связь показателей при анализе ТБ (р=0,0036, рисунок 4) и ТР (р=0,0058, рисунок 5) (таблица 10).

Таблица 10 - Регрессионная модель Кокса. Связь экспрессии маркеров со временем до прогрессирования

п=104 1 р-1еуе1

Модель в целом -2,18811 0,037

ЕЯСС-1 0,69261 0,49

ТР ^НН 2,98683 0,0058

ТБ 3,17173 0,0036

РРУР 0,77468 0,3503

Ш-класс-бета-тубулина 0,76468 0,4509

К1-67 2,04661 0,0502

Топоизомераза-Н-а -0,77134 0,447

Из этой же таблицы следует, что связь уровня пролиферации раковых клеток со временем до прогрессирования близко к статистически достоверному (р=0,0502), однако это не связано с эффективностью химиотерапии, так как при анализе пролиферации и прогрессирования заболевания в течение химиотерапии р=0,1048. Более того, при дальнейшем анализе оказалось, что влияние на время до прогрессирования заболевания обратно ожидаемому, то есть высокий уровень пролиферации сопровождался длинным периодом стабилизации процесса (медиана времени до прогрессирования 11,5 месяцев), а низкий - быстрым прогрессированием опухоли (медиана 7 месяцев).

При оценке связи экспрессии маркеров с частотой объективного ответа (полный и частичный регресс), результаты были схожие (таблица 11).

Таблица 11 - Регрессионная модель Кокса, связь экспрессии маркеров с частотой объективного ответа (полный и частичный регресс)

п=104 I р-1еуе1

Модель в целом -ЗД9 0,0034

ER.CC-! 1,007 0,3224

ТР 3,123 ;#§о,оо41

Т5 3,702 Ц,0009 ■■I

РРУР 0,775 0,4503

Ш-класс-бета-тубулина 0,581 0,5661

К1-6/ 1,/03 0,0996

Топоизомераза-Н-а -1,152 0,2591

Частота объективного ответа при наличии экспрессии ТР и отсутствии Т8 составила 39%, при обратном сочетании (экспрессия Т8 и отсутствие ТР) - была 13%, (р=0,04).

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

ТБ-негатив

ТБ-позитив

I Стабилизация, частичный или полный регресс

' Прогрессирование

Рисунок 4 - Связь экспрессии ТБ с эффективностью химиотерапии рака ободочной кишки.

Как видно из рисунка 4, стабилизация, частичный или полный регресс опухоли в ответ на стандартные линии химиотерапии (РОЬРОХ, РОГЛМ, де Грамонт) наблюдался в при негативном ТБ в 83% случаев, а при позитивном в 56% наблюдений (р=0,0047).

80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10%

■ Стабилизация, частичный или полный регресс

■ Прогрессирование

Рисунок 5 - Связь экспрессии ТР с эффективностью химиотерапии рака ободочной кишки.

Как видно из рисунка 5, стабилизация, частичный или полный регресс опухоли в ответ на стандартные линии химиотерапии (РОЬРОХ, РОЬР1Я1, де Грамонт) наблюдался в при позитивной ТР в 73% случаев, а при негативном - в 52% наблюдений (р=0,009).

Таким образом, иммуногистохимическое исследование ТБ, ТР может быть использовано в прогнозировании эффективности химиотерапии пациентов

с аденокарциномой толстой кишки, получающих 5-фторпиримидин содержащие препараты.

Алгоритм использования морфологических прогностических и предиктивных факторов при аденокарциноме толстой кишки

Адъювантная химиотерапия толстой кишки, хотя и вошла в стандарты лечения диссеминированной ее формы, при локализованных и местно распространенных стадиях остается камнем преткновения. В нашей практике, к сожалению, часто бывает операционный материал, неадекватно вырезанный, по которому невозможно выставить стадию рП\1М. Одной из причин этого является недостаточное количество забранных на исследование лимфоузлов, второй — трудности оценки степени инвазии рака. Но даже в случае, когда все необходимые условия для стадирования аденокарциномы толстой кишки выполнены, ведение II стадии остается нерешенной проблемой у врачей-онкологов. В нашем исследовании мы выделили две различные по прогнозу группы пациентов. Так, больным II стадией аденокарциномы толстой кишки с высоким индексом Кл-67 и низкой экспрессией СХСЯ4, вероятно, не следует назначать адъювантную химиотерапию, так как в 75% случаев после радикального хирургического лечения безрецидивный период у них превысит 5 лет. В то же время, у пациентов с низким индексом Кл-67 и высокой экспрессией СХСЯ4 наблюдается низкая безрецидивная выживаемость, и им, вероятно, требуется адъювантное лечение (рисунок 5.4). В качестве дополнительного прогностического фактора у данной группы пациентов можно использовать иммуногистохимическое исследование М8Н2, МБН6, РМЯ2, МЬН1 для косвенного определения микросател-литной нестабильности.

В случае необходимости проведения адъювантной химиотерапии (диссе-минированная форма аденокарциномы) одним из факторов для принятия решения об использовании 5-фторпиримидинов может быть иммуногистохимическое исследование тимидилат синтазы (ТБ) и тимидин фосфорилазы (ТР). При

условии низкой экспрессии ТБ и высокой ТР можно предполагать лучший эффект от лечения данной группой химиопрепаратов (рисунок 6).

Иммуногистохимическое исследование других маркеров, изученных в данной работе: АЬЭШ, ССШО, Е11СС-1, БУРБ, РТЕГЧ, топоизомеразы-П-альфа, Ш-класса-бета-тубулина, для выбора тактики лечения больных адено-карциномой толстой кишки значения не имеет.

ТР+, Т8-

IV стадия

ТР-, ТБ+

Частота объективного ответа на 5 фторпиримидины 39%

Частота объективного ответа на 5-фторпиримидииы 13%

Рисунок 6 - Схема результатов исследования аденокарциномы толстой кишки. Звездочками изображены опухолевые клетки: красные - экспрессия Кл-67, желтые - СХС114, черные - АЬОШ, зеленые - ТР, синие - ТБ.

выводы

1. Фенотип аденокарциномы толстой кишки характеризуется признаками, которые имеют прогностическое и предиктивное значения.

Прогноз течения аденокарциномы толстой кишки определяется: 1) пролиферативной активностью по индексу К1-67; 2) способностью раковых клеток к хемотаксису (рецептор к хемокину СХС 4 типа (СХС114)); 3) состоянием системы репарации неспаренных нуклеотидов ДНК: экспрессией генов М8Н6, МБН2, МЬН1, РМБ2 - и не связан с уровнем дифференцировки клеток опухоли (экспрессией АЫ)Н1).

К предиктивным факторам эффективности химиотерапии относятся ферменты, участвующие в метаболизме 5-фторпиримидинов (тимидин фосфорила-за, тимидилат синтаза).

2. Пролиферативная активность клеток аденокарциномы толстой кишки по индексу К'1-67 значимо ниже в диссеминированной форме рака толстой кишки и у больных II стадией с низкими показателями безрецидивной выживаемости после радикального хирургического лечения (медиана 7 месяцев).

3. Способность клеток аденокарциномы толстой кишки к хемотаксису определяется степенью выраженности экспрессии рецептора к хемокину 4 типа (СХСЯ4). Продукция данного рецептора опухолевыми клетками чаще наблюдается при диссеминированной форме рака толстой кишки (90%, при локализованной - 41%, р=0,019); у 68% больных II стадией с позитивной реакцией на СХС114 заболевание прогрессирует после радикального хирургического лечения, а у 75% пациентов с негативным статусом СХС 114 наблюдается 5-летний безрецидивный период (р=0,02).

4. Совместное использование СХСЯ4 с К1-67 усиливает прогностическую значимость маркеров (большая продолжительность безрецидивной выживаемости неблагоприятной группы II стадии - 16,5 месяцев с СХСГЫ<30%, Киб7>70%). Отмечается обратная корреляция экспрессии

СХСЯ4 и К1-67 в клетках опухоли.

5. Признаком микросателлитной нестабильности ДНК опухолевых клеток, свидетельствующей о более благоприятном течении заболевания, является отрицательная иммуногистохимическая реакция на белки системы репарации неспаренных нуклеотидов ДНК: МБН2, МБН6, МЬН1, РМБ2 (прогностическая значимость отрицательного результата близка к 100%).

6. Соотношение стволовых непролиферирующих (АЬБН1+, К1-67-), стволовых пролиферирующих (А1ЛЭН1+, К1-67+), амплифицирующихся (А1ЛЭН1-; К1-67+), дифференцирующихся (АЬЭШ-; К¡-67-) клеток в аденокарциноме толстой кишки составляет 9:1:60:30. Преобладающей популяцией являются амплифицирующиеся клетки (медиана 60%), а наименьшей пролиферирующие стволовые раковые (медиана 1%). Изменение количества стволовых клеток не является прогностически значимым для прогрессирования рака толстой кишки.

7. Чувствительность клеток диссеминированной формы аденокарциномы толстой кишки к стандартным схемам химиотерапии (РОЬРОХ, РОЬР1Ш, де Грамонт) связана с высокой экспрессией в опухоли тимидин фосфорилазы (ТР) и низкой — тимидилат синтазы (ТБ) (частоты объективного ответа при диссеминированном раке 39% против 13%, р=0,04) и не связана с экспрессией К1-67, ЕЯСС-1, топоизомеразы-Н-а, Ш-класс-бета-тубулина (р>0,05).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Рекомендуется использовать комплексный иммуногистохимический анализ К1-67 и СХСЯ4 для оценки прогноза безрецидивной выживаемости больных аденокарциномой толстой кишки II стадии после радикального хирургического лечения, так как экспрессия СХС114 статически значимо выше у пациентов II стадии после радикального хирургического лечения, у которых в

дальнейшем наблюдалось прогрессирование заболевания, чем у больных с 5-летним безрецидивным периодом (68% и 32%, р=0,02).

2. Иммуногистохимическое исследование MSH2, MSH6, MLH1, PMS2 рекомендуется использовать в первичном скрининге пациентов с синдромом Линча (наследуемого неполипозного рака толстой кишки), так как мутации этих генов в 100% случаев сопровождаются выпадением экспрессии.

3. Рекомендуется иммуногистохимическое исследование тимидилат синтазы (TS), тимидин фосфорилазы (TP) в качестве предикторов эффективности химиотерапии пациентов с диссеминированной аденокарциномой толстой кишки, получающих 5-фторпиримидин содержащие препараты. Частота объективного ответа при наличии экспрессии TP и отсутствии TS составила 39%, при обратном сочетании (экспрессия TS и отсутствие TP) была 13% (р=0,04).

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Raskin, G.A. Immunocytochemical investigation of effusions suspicious for adenocarcinoma / G.A. Raskin, S.V. Petrov, R.V. Orlova, V.A. Kotov // Histopathol-ogy. - 2010. - Vol. 57, Suppl. 1. - P.50.

2. Беляев, A.M. Экспериментальное обоснование адъювантного режима внутрибрюшинной химиогипертермической перфузии / A.M. Беляев, А.А. Захаренко, Т.Е. Кошелев, Г.А. Раскин // Вестник Российской военно-медицинской академии. - 2010. - Т. 2. - С. 153-157.

3. Строкова, Л.А. Трансректальная мультифокальная пункционная биопсия в дифференциальной диагностике образований малого таза / Л.А. Строкова, Г.А. Раскин, Б.К. Комяков // Российский электронный журнал лучевой диагностики = Russian Electronic Journal of Radiology. - 2011. - T. 1, № 4. - С. 149150.

4. Раскин, Г.А. Иммуноцитохимическое исследование цитологических препаратов жидкостной цитологии плевритов и асцитов неясной этио-

логин / Г.А. Раскин, А.Э. Протасова, В.А. Котов и др. //Врач-аспирант. -2011. - Том 46. - С.568-572.

5. Беляев, А.М. Иммуиоцитохимическое исследование цитологических препаратов жидкостной цитологии злокачественных плевритов и асцитов / A.M. Беляев, Г.А. Раскин, A.A. Захаренко, С.А. Кондрацов // Medline.ru. - 2011. - Т. 12, № 1-1. - С. 179-184.

6. Раскин, Г. А. Иммуиогистохимическое исследование аденокарцииомы толстой кишки для оценки прогностических факторов / Г.А. Раскин, Р.В. Орлова, C.B. Петров, А.Э. Протасова // Вестник Санкт-Петербургского университета. - 2012. - Серия 11. - №1. — С.172-182.

7. Глушаков, Р.И. Экспрессия хемокиновых рецепторов в опухолевой ткани у пациенток с гипертиреозом / Р.И. Глушаков, А.К. Иванова, Г.А. Раскин, Н.И. Тапильская // Вестник Российской военно-медицинской академии. - 2012. - Т. 4. - С. 82-86.

8. Авдюшкин, A.A. Рак ободочной кишки: практические рекомендации / A.A. Авдюшкин, В.П. Акимов, Г.А. Раскин и др. // Санкт-Петербург. - 2012. - 40 с.

9. Белоусова, Т.А. Диагностика послеоперационных осложнений у больных колоректальным раком / Т.А. Белоусова, Т.Ю. Галунова, Г.А. Раскин // Материалы конференции шестой российской школы колоректальной хирургии. - Москва. 5-6 апреля 2012. - С. 89.

10.Белоусова, Т.А. Микробиологический мониторинг и Толл-подобные рецепторы в диагностике инфекционных осложнений у больных колоректальным раком в послеоперационном периоде / Т.А. Белоусова, Г.А. Раскин, Т.Ю. Галунова // Сборник научных трудов. Конференция молодых ученых 27 марта 2012г. Санкт-Петербург, 2012 г. - С. 12-18.

П.Кащенко, В.А. Спонтанный разрыв гастроинтестинальной опухоли тонкой кишки, осложненный гемоперитонеумом / В.А. Кащенко, В.В. Тоидзе, Г.А. Раскин и др. // Клиническая больница. - 2012. - № 4. - С. 142-145.

12.PacKiin, Г.А. Роль стволовых раковых клеток, хемокинов и их рецепторов в канцерогенезе, рецидивировании и метастазировании опухолей / Г.А. Раскин, Р.В. Орлова, K.M. Пожарисский и др. // Вопросы Онкологии. - 2013. - №6. - С. 694-700.

13.Белоусова, Т.А. Прогностические признаки и факторы риска послеоперационных инфекционных осложнений у больных колоректальном раком / Т.А. Белоусова, Г.А. Раскин, Т.Ю. Галунова // Инфекции в хирургии. - 2013.- Т.11, №1. - С. 34-39.

14.Раскин Г.А. Роль хемокина CXCR4 в метастазировании аденокарцином толстой кишки в рамках стволовоклеточной концепции канцерогенеза / Г.А. Раскин, K.M. Пожарисский // Материалы IV съезда Российского общества патологоанатомов. - 2013. - С. 273-275.

15.Беляев, A.M. Прогностические факторы и ранняя диагностика послеоперационных инфекционных осложнений у больных колоректальным раком / A.M. Беляев, Т.А. Белоусова, Г.А. Раскин, Т.Ю. Галунова // Medline.ru. -2013. - Т. 14, СТ.38. - С. 440-454.

16.Патент на изобретение №2494402: «Способ определения TLR2, TLR3, TLR4 у больных колоректальном раком в послеоперационном периоде». Опубликовано в бюллетене №27 от 27.09.2013. Авторы: Белоусова Т.А., Раскин Г.А., Беляев A.M., Байкова О.В., Орлова Р.В., Протасова А.Э.

17.Раскин, Г.А. Пролиферация стволовых раковых клеток аденокарцино-мы толстой кишки / Г.А. Раскин, Р.В. Орлова, K.M. Пожарисский и др. // Вопросы онкологии. - 2014. - №1. - С. 47-51.

18.Раскин, Г.А. Значение экспрессии хемокина CXCR4 в метастазировании аденокарцином толстой кишки / Г.А. Раскин, А.Э. Протасова, Р.В. Орлова, C.B. Петров// Вестник Санкт-Петербургского университета. -2014. - Серия 11. - №2. - С. 140-149.

19.Раскин, Г.А. Иммуногистохимическое исследование MSH2, PMS2, MLH1, MSH6 в сопоставлении с анализом микросателлитной неста-

бильности в аденокарциноме толстой кишки / Г.А. Раскин, Г.А. Янус, K.M. Пожарисский и др. // Вопросы онкологии. — 2014. - №2. - С 47-50.

20.Раскин, Г.А. Низкий уровень пролиферации — плохой прогностический признак в аденокарциноме толстой кишки / Г.А. Раскин, C.B. Петров // Казанский медицинский журнал. — 2014. - №3. - С. 378-383.

21.Раскин, Г.А. Морфологическая оценка предсказательных факторов при аденокарциноме толстой кишки / Г.А. Раскин, K.M. Пожарисский, Р.В. Орлова // Вопросы онкологии. - 2014. - №5. - С 619-624.

22.Раскин, Г.А. Иммуногистохимическое исследование ферментов метаболизма химиопрепаратов при аденокарциноме толстой кишки / Г.А. Раскин, K.M. Пожарисский, C.B. Петров, Р.В. Орлова, А.Э. Протасова // Вопросы онкологии. - 2014. - №6. - С. 718-721.

23.Пожарисский, K.M. Морфологические и молекулярно-генетические особенности светлоклеточной саркомы гастроинтестинального типа / K.M. Пожарисский, Г.А. Раскин, М.С. Мухина // Евразийский онкологический журнал. — 2014. - №3. - С. 102.

24.Раскин, Г.А. Молекулярно-биологические особенности аденокарциномы толстой кишки, определяющие ее клиническое течение / Г.А. Раскин, K.M. Пожарисский, Р.В. Орлова, М.С. Мухина // Евразийский онкологический журнал. - 2014.-№3.-С. 509.

Раскин Г.А. Морфологическая оценка прогностических и предиктивных факторов при аденокарциноме толстой кишки // Автореферат дис. ... докт. мед. наук : 14.03.02 - патологическая анатомия, 14.01.12 - онкология.-СПб., 2014.-36 с.

Подписано в печать 24.12.2014 г. Формат бумаги 60X84/16 Бумага офсетная. 2,0 усл. печ. л. Тираж 100 экз. Печать цифровая, Заказ №2023

Отпечатано в типографии ООО «Радуга» 195273, Санкт-Петербург, ул. Руставели д. 13 тел.: 988-6-888,912-66-04, тел/факс: 309-09-24 E-mail: k.profit@mail.ru