Автореферат и диссертация по медицине (14.00.30) на тему:Молекулярно-биологические и эпидемиологические аспекты патогенности холерного вибриона (по материалам Сибири и Дальнего Востока)

МИРОНОВА Лилия Валерьевна

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ И ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПАТОГЕННОСТИ ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА (по материалам Сибири и Дальнего Востока)

14.00.30 - эпидемиология

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Иркутск - 2004

Работа выполнена в ГУ Иркутский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научные руководители:

доктор медицинских наук,

старший научный сотрудник Балахонов Сергей Владимирович

доктор медицинских наук,

старший научный сотрудник Урбанович Людмила Яковлевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, старший научный сотрудник кандидат медицинских наук, доцент

Мамонтова Лилия Михайловна Владимиров Николай Иванович

Ведущая организация:

Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится .200. . в____________часов на

заседании диссертационного совета Д 001.038.01 при ГУ Научный центр медицинской экологии ВСНЦ СО РАМН по адресу: 664025, г. Иркутск, ул. К. Маркса, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научный центр медицинской экологии ВСНЦ СО РАМН

Автореферат разослан

Ученый секрет арь диссертационного совет а кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник

Коган В.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Холера — тяжелое инфекционное заболевание диарейного характера, склонное к эпидемическому и пандемическому распространению. Описано шесть пандемий холеры (начиная с 1817 г.), вызванных классическим холерным вибрионом. Последняя (седьмая) пандемия, этиологическим агентом которой является холерный вибрион эльтор, по сравнению с шестью предыдущими характеризуется наибольшей продолжительностью, охватывает все континенты. За период седьмой пандемии в ВОЗ зарегистрировано 5 110 089 случаев заболевания в 146 странах мира (Ломов Ю.М. с соавт., 1997; Онищенко Г.Г. с соавт., 2000; Москвитина Э.А. с соавт., 2003). Только за последнее десятилетие (1992—2001 гг.) 128 стран мира информировали ВОЗ о 2 583 742 больных (Москвитина Э.А. с соавт., 2002). Определенную опасность вызывает появление (в 1992 г.) возбудителя холеры новой серог-руппы — Vibrio cholerae 0139, который стал причиной крупных эпидемических вспышек в Бангладеш, Индии и отдельных заносов инфекции в Азию, Европу и Америку (Москвитина Э.А. с соавт., 2003; Albert M.J., 1996). В России же, на фоне снижения мировой заболеваемости, отмечена тенденция роста инфицированности холерой за счет вспышек в Приморском крае и на Сахалине (1999 г.), а также в Татарстане (2001 г.) (Онищенко Г.Г., 2002). Эпидемиологическая ситуация в стране определяется как угрозой завоза холеры на любую территорию из эндемичных стран (Ломов Ю.М. с соавт., 2000; Москвитина Э.А. с соавт., 2002), так и широким распространением вибрионов эльтор в объектах окружающей среды (Кюрегян А.А. с соавт., 1988; Марамович А.С. с соавт., 1988; Онищенко Г.Г. с соавт., 1992; Ломов Ю.М. с соавт., 1995; Москвитина Э.А. с соавт., 2002).

Экспериментально показанная возможность формирования токсиген-ных вариантов вибриона из авирулентных предшественников (Faruque S.M. et а!., 1998; Karaolis D.K.R. et al., 1999), а также зависимость объема профилактических и противоэпидемических мероприятий от эпидемической опасности Vibrio cholerae требуют постоянного контроля в изолируемых культурах маркеров патогенности. При этом определение их бактериологическими методами трудоемко и не всегда достоверно. Ключевая роль в оценке вирулентных свойств холерного вибриона отводится современным молекулярно-биологическим методам исследования, в частности, полимеразной цепной реакции (ПЦР), направленным на прямую детекцию генетических детерминант вирулентности микроорганизма. Усовершенствование этих методов и определение с их помощью эпидемической значимости возбудителя является важным звеном в системе эпидемиологического надзора за холерой.

Длительная циркуляция вибрионов эльтор в поверхностных водоемах, несмотря на значительный диапазон колебаний природно-климатических условий, связана с возможным сохранением их жизнеспособности в объектах окружающей среды. Наиболее логичным объяснением такой персис-тенции микроба может быть его переход в некультивируемое состояние

(НС), что является крайним вариантом адаптационной изменчивости (До-марадский И.В., 1997; Литвин В.Ю. с соавт., 2000, 2001). Представляет интерес вопрос о возможности и длительности сохранения некультивиру-емыми формами (НФ) эпидемически значимых штаммов их патогенных свойств. Кроме того, неизвестно, существуют ли различия в способности к переходу в некультивируемое состояние и возможности реверсии в вегетативную форму холерных вибрионов разной эпидемической значимости.

Цель настоящего исследования — на основе комплексного использования генодиагностических и бактериологических методов определить эпидемическую значимость обнаруживаемых на территории Сибири и Дальнего Востока холерных вибрионов, а также выяснить адаптационные возможности штаммов разных генотипов.

Задачи исследования

1. Охарактеризовать эпидемиологическую ситуацию по холере в Сибири и на Дальнем Востоке в период седьмой пандемии.

2. Оценить вирулентность разных штаммов холерного вибриона по данным комплексного бактериологического метода (чувствительность к холерным диагностическим фагам СТХ+ СТХ- и гемолитическая активность).

3. Разработать метод мультиплексной ПЦР для одновременной детекции трех основных генетических маркеров эпидемической опасности холерного вибриона — ctxAB, tcpA, toxR, ассоциированных с различными «блоками патогенности» на хромосоме возбудителя. Выявить присутствие указанных детерминант в геноме V. cholerae разных групп.

4. По комплексу генетических и фенотипических признаков определить эпидемическую значимость холерных вибрионов, изолируемых в разные годы на фоне возникновения вспышек холеры и при отсутствии эпидемических осложнений.

5. Установить распространенность некоторых «дополнительных» генов вирулентности - zot, ^С, nanH, omp U, xerC, xerD (локализованных на мобильных генетических элементах и консервативных участках хромосомы) в штаммах холерного вибриона разной эпидемической значимости.

6. Изучить адаптационные возможности штаммов холерного вибриона разных генотипов путем экспериментального получения некультивиру-емых форм микроорганизма. Охарактеризовать морфологию, жизнеспособность НФ, а также возможность сохранения ими исходных генетических детерминант вирулентности и реверсии в культивируемую форму.

Научная новизна и теоретическая значимость работы

По данным молекулярно-генетических и фенотипических методов представлена комплексная эпидемиологическая оценка изолированных на территории Сибири и Дальнего Востока штаммов холерного вибриона.

Разработан и многократно апробирован метод мультиплексной ПЦР для одновременной детекции трех основных детерминант патогенности возбудителя — ^АВ, ^рА и toxR.

Установлена распространенность «дополнительных» генов вирулентности (zot, rstC, nanH, ompU, xerC, xerD) среди штаммов холерного вибриона разной эпидемической значимости.

Выявлена однородность (по генетическим и фенотипическим признакам) популяции штаммов холерного вибриона периода эпидемических осложнений и их гетерогенность (в объектах окружающей среды) в период эпидблагополучия.

Экспериментально показан более быстрый переход в некультивируе-мое состояние токсигенных штаммов холерного вибриона по сравнению с нетоксигенными. При этом у токсигенного вибриона в некультивируемом состоянии наряду с антигенными детерминантами сохраняются связанные с патогенностью гены исходного штамма.

Установлена более длительная способность к реверсии в вегетативное состояние НФ эпидемически неопасных штаммов.

Предложенные методы комплексной оценки вирулентности холерного вибриона различного происхождения позволяют объективно оценить эпидемиологическую ситуацию и могут быть положены в основу дальнейшей оптимизации системы эпидемиологического надзора за холерой.

Практическая значимость работы

Разработан и внедрен в практику эпидемиологического надзора за холерой метод мультиплексной ПЦР, основанный на одновременной детекции в пробе трех основных генов вирулентности холерного вибриона, что позволяет оперативно определить эпидемическую опасность изолируемой культуры. Метод в течение ряда лет используется в системе экологического мониторинга и в рамках оперативного эпиднадзора за холерой (в том числе при расшифровке эпидосложнений, выявлении первых заносных случаев заболевания), а также в экспериментальных исследованиях. «Методические рекомендации по детекции детерминант вирулентности холерного вибриона с использованием мультиплексной ПЦР» одобрены Ученым Советом (протокол № 3 от 09.04.02) и утверждены директором Иркутского НИПЧИ.

Депонирован в Государственную коллекцию патогенных бактерий «Микроб» при Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» штамм Vibrio cholerae eltor И-1362, спонтанно утративший ctxAB оперон гена холерного токсина при сохранении гена tcpA. Штамм может быть использован в качестве перспективного для генетических исследований.

Положения, выносимые на защиту:

1. Ситуация по холере в Сибири и на Дальнем Востоке в период седьмой пандемии определяется регистрацией острых вспышек, отдельных случаев заболевания заносного характера, транзиторного вибрионо-носительства, а также длительной циркуляцией авирулентных вибрионов эльтор в поверхностных водоемах.

2. Предлагаемый вариант мультиплексной ПЦР для одновременной детекции ctxAB оперона гена токсинообразования, генов tcpA и toxR позволяет оперативно определить эпидемическую значимость возбудителя холеры.

3. При эпидемических осложнениях по холере (вспышки, заносные очаги) обнаруживаемые штаммы возбудителя характеризуются однородностью генотипа (ctxAB+tcpA+toxR+zot+rstC+nanH+ompU+) и по совокупности с результатами комплексного фенотипического теста соответствуют оценке как эпидемически опасные.

4. Популяция вибрионов эльтор от транзиторных носителей и из

объектов окружающей среды на фоне эпидемиологического благополучия в регионе отличается гетерогенностью. Все выделяемые штаммы лишены генов ^АВ, ^рА, zot, при наличии у большинства из них гена-регуло-

на toxR и генов папН, ompU. Комплексная оценка генетических свойств и чувствительности к фагам СТХ+ и СТХ- позволяет охарактеризовать изо-ляты как эпидемически неопасные.

5. Культивирование холерного вибриона в неблагоприятных условиях закономерно приводит к снижению популяции вегетативных особей микроба, наиболее четко выраженному у токсигенных штаммов, что, вместе с результатами комплексного (микроскопического, серологического, молекулярно-генетического, биохимического) исследования свидетельствует о более быстром их переходе в некультивируемое состояние.

6. Возможен обратный переход «молодых» некультивируемых форм холерного вибриона в вегетативное состояние с сохранением ревертанта-ми всех свойств исходного штамма, в том числе и вирулентного потенциала; при этом НФ нетоксигенных штаммов обладают более длительной (в сравнении с токсигенными) способностью к восстановлению первоначальных свойств.

Апробация работы

Исследования проводились в рамках плановых тем НИР: № ГР 01.9.60000200, Инв. № 02.99.0005736; № ГР 01.20.0013861.

Материалы исследований докладывались на: Проблемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы» Межведомственного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории РФ (Ростов-на-Дону, 2000-2004); 4-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 2003); конференции с международным участием, посвященной 80-летию кафедры инфекционных болезней Иркутского государственного медицинского университета (Иркутск, 2003), а также на трех научных конференциях Иркутского НИПЧИ. В виде тезисов или стендовых сообщений материалы диссертации представлялись на: Международной конференции «Инфекции, обусловленные иерсиниями (иерсиниоз, псевдотуберкулез), и другие актуальные инфекции» (Санкт-Петербург, 2000); 1-й Всероссийской научно-практической конференции «Генная диагностика особо опасных инфекций» (Саратов, 2000); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы обеспечения здоровья международных путешественников» (Улан-Удэ, 2001); III конференции молодых ученых «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины» (Новосибирск, 2001); I

Международном Симпозиуме «Стресс и экстремальные состояния» (Кара-Даг, 2002); юбилейной научно-практической конференции, посвященной 50-летию Ставропольского НИПЧИ «Эпидемиологическая безопасность на Кавказе. Итоги и перспективы» (Ставрополь, 2002); 4th Asia pacific travel health conference (Shanghai, P.R. China, 2002); VIII Всероссийском съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002).

Публикации

Результаты исследований отражены в одном заключительном отчете и 23 печатных работах, в том числе 2 в зарубежной печати.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы (302 цитируемых работы, в том числе 153 отечественных и 149 зарубежных авторов). Общий объем работы — 197 страниц, включая 10 таблиц и 32 рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы

В работе использовано 345 штаммов V. cholerae eltor, выделенных на территории Сибири и Дальнего Востока при разных эпидемиологических ситуациях, в том числе: 93 — от людей и из объектов окружающей среды во время острых вспышек (г.г. Омск, Новосибирск, Барнаул — 1972, 1973 гг.; г.г. Владивосток, Южно-Сахалинск — 1999 г.); 14 — от людей в заносных очагах (г.г. Сургут, Ялуторовск, Новокузнецк — 1970-е гг., г.г. Омск, Новосибирск, Барнаул — 1994 г., г.г. Иркутск, Ачинск — 1997 г., г.г. Уссурийск, Южно-Сахалинск — 1999 г.); 8 — от транзиторных носителей (г. Новосибирск - 1972 г., г. Ишим - 1974 г., г. Красноярск - 1976, 1979 гг., г. Уссурийск — 1982 г.); 230 — из объектов окружающей среды (1977—2003 гг.) в благополучный по холере период. Кроме того, исследовано 18 штаммов V. cholerae 0139 и 9 - V. cholerae не 01/0139.

Проводился ретроспективный и оперативный анализ эпидемиологической ситуации по холере на территории Сибири и Дальнего Востока в период седьмой пандемии (с 1970 по 2003 гг.) с оценкой сезонности эпидемических осложнений, показателей заболеваемости в зависимости от пола и возраста, удельного веса различных клинических форм в общей структуре заболеваемости (Беляков В.Д., 1989; Савилов Е.Д. с соавт., 1993). Оценивалась распространенность вибрионов эльтор в объектах окружающей среды отдельных территорий региона на протяжении 32-летнего периода (1972—2003 гг.). При проведении эпиданализа использованы первичные документы (паспорта штаммов, журналы идентификации культур, отчеты и донесения сотрудников института и региональных ЦСЭН о вспышках холеры) и опубликованные статьи.

Изучение культурально-морфологических, биохимических, серологических свойств, чувствительности исследуемых штаммов к диагностическим бактериофагам проводилось в соответствии с «Инструкцией по организации и проведению противохолерных мероприятий» (Москва, 1995) и МУ 4.2.109702 «Лабораторная диагностика холеры» (Москва, 2002). Определение холеро-генности V. с^1ете — по методу К.К. Бийа и М.К. ИаЬЬи (1955 г.).

Детекция основных генов вирулентности холерного вибриона (сЫАВ, крА, toxR) осуществлялась в мультиплексной ПЦР, «дополнительных» (z,ot, ^С, ompU, папН xerC, xerD) — в ПЦР с одной парой соответствующих праймеров. Подготовка проб для ПЦР проводилась в соответствии с МУ 1.3. 1794—03 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I—II групп патогенности» (Москва, 2003). Амплификация специфических фрагментов генов — по определенным программам на амплификаторе «Терцик-2» («ДНК-техно-логия», г. Москва). Учет результатов ПЦР — посредством электрофореза в 1,3 % агарозном геле с последующим видеодокументированием.

Некультивируемые формы холерного вибриона получали двумя методами: 1 — культивирование в условиях ограниченного содержания питательных веществ и низкой температуры (Подосинникова Л.С. с соавт., 1999; Хи И.8., 1982), 2 — инкубация в среде с высокой концентрацией солей при сравнительно оптимальной температуре микрокосма («солевой стресс») (Копёо К. й а1., 1994). Исследуемые культуры (4 эпидемически опасных штамма (ctxAB+tcpA+toxR+) V. с^1ете е1^г И-12б3, И-1298, И-1342, И-1345 от больных с типичной клинической картиной холеры; один штамм V. сЫ1ете eltor И-1362 — утративший токсигенные свойства при длительном хранении в лабораторных условиях (потенциально эпидемически опасный — ctxAB-tcpA+toxR+); два штамма V. с^1ете eltor И-1321, И-1355 — эпидемически неопасные (ctxABtcpAtoxR+) из поверхностных водоемов; два штамма V. cholerae 0139 серогруппы — И-10 (с^АВ^^рА^^К^), И-12 (ctxAB+tcpA+toxR+)) вносили в среду микрокосма (флаконы) в концентрации 107—109 м.к./мл. При заметном снижении КОЕ/мл содержимое флаконов подвергалось дифференцированной мембранной фильтрации, при отсутствии высеваемости — центрифугированию (5000 об./мин, 15 мин). Полученный материал исследовался комплексно с применением бактериологического, серологического, биохимического, молекулярно-генетического методов, световой, электронной и люминесцентной микроскопии. Реверсия НФ холерного вибриона в исходное состояние — посредством повышения температуры инкубации до 22 и 37 °С с одновременным внесением питательных веществ — ДС (бульон Хоттингера с 0,1 % дрожжевого экстракта), среды 199, Лурия-Бертани с добавлением антиоксидантов (витамин «Е», каталаза) или стимуляторов роста (экстракт алоэ, ФИБС, ли-поевая кислота), а также при постепенном повышении температуры инкубации до 22 °С без изменения среды микрокосма.

Статистическая обработка результатов проводилась с определением средних величин, их квадратических отклонений, стандартной ошибки средних показателей и относительных показателей в процентах (Бессмертный Б.С.,

Ткачева М.Н., 1961; Иванов Ю.И., Погорелюк О.Н., 1990; СавиловЕ.Д. с соавт., 1993). Оценка связи между качественными признаками — посредством вычисления коэффициента корреляции (г), его стандартной ошибки (Бг) и достоверности (1) (Иванов Ю.И., Погорелюк О.Н., 1990).

Характеристика эпидемиологической ситуации по холере в Сибири

и на Дальнем Востоке в период седьмой пандемии

Возникновение эпидемических осложнений (острые вспышки, заносные очаги) в Сибири и на Дальнем Востоке связано с изменениями ситуации по холере как в России, так и в мире. Заболеваемость холерой в регионе условно можно разделить на три временных периода.

Первый подъем заболеваемости холерой эльтор в мире и ее широкое распространение за пределы эндемичных территорий в 70-е годы прошлого столетия способствовали проникновению инфекции на территорию России (Онищенко Г.Г. с соавт., 1992; Марамович А.С., ПинигинА.Ф., 1994), в том числе и развитию острых вспышек и отдельных заносных случаев в Западной Сибири. В 1972 г. в г. Омске возникла вспышка холеры, в период которой выявлено 11 больных и 45 вибриононосителей. В следующем, 1973 г. эпидемические осложнения зарегистрированы в г. Новосибирске (12 больных и 21 вибриононоситель) и г. Барнауле (27 больных и 79 вибриононосителей). Наряду с острыми вспышками в этот период выявлены единичные случаи заболевания холерой и вибриононосительства в г.г. Сургут, Красноярск, Томск в 1973 г., в г. Ишиме в 1974 г., в г.г. Ялуторовске и Новокузнецке в 1975 г.

В последующие годы (второй период) установлены лишь случаи виб-риононосительства на фоне циркуляции вибрионов эльтор в объектах окружающей среды: в г. Омске (1976 г.), в г. Красноярске (1976 и 1979 гг.), в г. Уссурийске (1982 г.).

Третий период (90-е годы прошлого столетия) характеризуется новым подъемом заболеваемости холерой в мире и выраженной тенденцией роста инфицированности в России (начало 90-х годов). Активизация миграционных процессов за счет торгово-экономических и туристических связей региона с неблагополучными по холере странами способствовала заносам инфекции в 1994 г. в г.г. Омск, Новосибирск и Барнаул из Турции и Индии, в 1997 г. — в г.г. Иркутск, Ачинск из Казахстана. Резкое осложнение эпидемической ситуации произошло в 1999 г., когда в конце июля — начале августа были выявлены заносные случаи холеры в г.г. Уссурийск и Южно-Сахалинск из Китая, а позднее возникли острые эпидемические вспышки холеры в г. Владивостоке (23 больных, 5 вибриононосителей) и г. Южно-Сахалинске (11 больных, 11 вибриононосителей).

В целом, зарегистрированные в регионе острые эпидемические вспышки холеры характеризуются четкой летне-осенней сезонностью; продолжительность их составляет 16—35 дней (в среднем 24 ± 3,2 дня), что, вероятно, связано с климатическими условиями региона. Заболеваемость холерой в период вспышек составила от 2,7 ± 0,4 до 24,1 ± 2,3 на 100 тыс. населения (рис. 1).

Рис. 1

. Заболеваемость холерой в Сибири и на Дальнем Востоке в период острых вспышек: 1 - г. Омск (1972 г.), 2 - г. Барнаул (1973 г.), 3 - г. Новосибирск (1973 г.), 4 -г. Владивосток (1999 г.), 5 - г. Южно-Сахалинск (1999 г.).

В эпидемический процесс чаще вовлекаются люди наиболее активных возрастных групп от 20 до 59 лет с максимумом в возрастной категории 40—49 лет. Клинические проявления инфекции характеризуются большим количеством легких и бессимптомных форм (в 70-е гг. удельный вес вибриононосительства составил 74,4 % от количества инфицированных, легких форм заболевания — 15,4 % от общего числа больных, в 1999 г. — 32 и 38,2 % соответственно). Возникновение заболеваний в большинстве случаев связано с реализацией водного пути передачи инфекции, что подтверждается выделением вибрионов эльтор из объектов окружающей среды. Об этом же свидетельствует большой удельный вес очагов холеры с единичным случаем инфицирования. Так, в г.г. Новосибирске и Барнауле (1973 г.) выявлен низкий показатель очаговости — 1,0 и 1,17 соответственно. В 1999 г. на вспышках холеры отмечается увеличение числа зарегистрированных множественных очагов. В г. Владивостоке показатель очаговости соответствует среднему уровню — 1,55 (72,2% очагов с одним случаем заболевания). В г. Южно-Сахалинске из пяти зарегистрированных очагов — четыре (80 %) относятся к множественным (высокий показатель очаговости — 4,4). Тем не менее, эпидемиологический анализ всех случаев инфицирования во множественных очагах указывает на преимущественную связь заболеваний с контаминированными водоисточниками. При этом сроки возникновения заболеваний и вибриононосительства в очаге не выходят за временные рамки одного инкубационного периода, что также подтверждает водный путь инфицирования.

Наряду с регистрацией случаев заболевания холерой отмечается циркуляция вибрионов эльтор в объектах окружающей среды Сибири и Дальнего Востока. Всего за период с 1972 по 2003 гг. из поверхностных водоемов региона изолировано 2 459 культур холерного вибриона (рис. 2). Пик выделения культур приходится на 70-е годы прошлого столетия. В последующем отмечается снижение числа изолируемых штаммов и относительная стаби-

лизация интенсивности выделения вибрионов практически на одном уровне с незначительными отклонениями в отдельные годы.

т 400

1972 1974 1976 1978 1980 1982 1984 1986 1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002

Годы

Рис. 2. Динамика выделения вибрионов эльтор из объектов окружающей среды на территории Сибири и Дальнего Востока (1972-2003 гг.).

Изоляция холерного вибриона из поверхностных водоемов неравномерна по отдельным территориям региона (максимальное количество штаммов приходится на Приморский край — 44,3 % от общего числа вибрионов, Читинскую область — 14,2 %, Красноярский край — 11,3 %, Иркутскую область — 9,7 %). Длительность циркуляции вибрионов эльтор составляет от 20 лет и более (в Читинской области и Приморском крае) до 10—15 лет (в Омской, Новосибирской, Иркутской областях и республике Бурятия) и эпизодического выделения культур на остальных территориях. Наряду с вибрионами эльтор 01 серогруппы, в регионе (Новосибирская область) в 1996 г. впервые в России из поверхностного водоема (р. Обь) изолирован вибрион 0139 серогруппы. В последующие три года продолжалась изоляция V. скакте 0139 из р. Обь (Новосибирская область), а в 1999 и 2000 гг. подобные вибрионы обнаружены в поверхностных водоемах г. Иркутска и в 2003 г. в Кемеровской области.

В целом, оценивая ситуацию по холере в Сибири и на Дальнем Востоке необходимо отметить, что эпидемиологические проявления холеры в регионе выражаются в регистрации острых вспышек, отдельных заносных случаев, редкого обнаружения транзиторного вибриононоситель-ства, а также многолетней циркуляции вибрионов эльтор в поверхностных водоемах. Представляет бесспорный интерес зависимость эпидемиологических проявлений холеры от патогенных свойств возбудителя. Данный вопрос возникает в связи с необходимостью применения в каждой конкретной ситуации дифференцированного подхода к проведению комплекса профилактических и противоэпидемических мероприятий, осуществляемых в рамках эпидемиологического надзора при выделении холерного вибриона.

Оценка эпидемической значимости штаммов холерного вибриона разного происхождения с использованием фенотипических и молекулярно-генетических методов исследования

Эпидемическая значимость V. ска1егае, изолированных на территории Сибири и Дальнего Востока при различных эпидемиологических проявлениях (острые вспышки, заносные очаги, период эпидемиологического благополучия) на разных этапах седьмой пандемии холеры (1972—2003 гг.), оценивалась посредством изучения коллекции из 345 штаммов холерного вибриона по фено- и генотипическим свойствам, ассоциированным с патогенностью.

Определение вирулентных свойств штаммов холерного вибриона по чувствительности к холерным фагам ХДФ 3,4, 5 и гемолитической активности в пробе Грейга выявило снижение диагностической ценности указанного теста. Если на вспышках холеры в Западной Сибири в 1972—1973 гг. все культуры отнесены к вирулентным, то в период эпидосложнений в Приморском крае в 1999 г. таковыми оказались лишь 44,8 % изолятов. Вместе с тем, в объектах окружающей среды в благополучный по холере период обнаруживаются слабовирулентные (66,1 %) и, в редких случаях (2,6 %), вирулентные по этому тесту вибрионы, при отсутствии заболеваний среди людей.

Оценка вибрионов эльтор разного происхождения с помощью набора новых диагностических фагов эльтор СТХ+ СТХ- в комплексе с гемолитическим тестом показала, что большинство изолятов (98,1 %) в период эпидемических осложнений как в 70-е, так и в 90-е годы являются гемо-лизотрицательными и чувствительными к действию бактериофага СТХ+.

Среди штаммов, выделенных от людей при отсутствии вспышечной заболеваемости холерой или на фоне длительной циркуляции вибрионов эльтор в поверхностных водоемах в период эпидемиологического благополучия, выявлено два чувствительных к СТХ+ фагу. Остальные культуры из этой группы либо лизируются СТХ- бактериофагом, либо устойчивы к действию обоих фагов. Преобладающая часть штаммов (91,7 %) из поверхностных водоемов при отсутствии заболеваемости холерой отнесена по этому методу к эпидемически неопасным. Однако в объектах окружающей среды с применением этого метода обнаружено два (0,9 %) эпидемически опасных изолята и ряд культур (7,4 %), не укладывающихся в схему дифференциации, что требует более углубленного исследования их патогенных свойств.

Прямая детекция основных генных детерминант вирулентности холерного вибриона в ПЦР позволяет более достоверно определить эпидемическую значимость изолируемых культур. Нами предложен вариант мультиплексной ПЦР, основанный на одновременном выявлении трех генетических маркеров V. ска1егае, два из которых (сТхАВ, крЛ) характеризуют эпидемический потенциал штамма, а третий (1ахК) является регулятором их экспрессии. Амплификация исследуемых фрагментов ДНК холерного вибриона осуществляется в реакционной смеси с повышенным содержанием ионов магния и дНТФ при использовании следующей программы: стартовая денатурация 94 оС — 2 мин; 35 циклов: 94 оС — 45 сек, 57 оС — 45 сек, 72 оС - 45 сек; заключительная элонгация 72 оС — 10 мин. Положитель-

ный результат реакции, выражающийся в формировании специфических ампликонов размером 777 п.н. (сtxAB оперон), 560 п.н. (tаxR) и 471 п.н. (ген tcpЛ) позволяет характеризовать исследуемый штамм как эпидемически опасный. В случае выявления в пробе двух фрагментов в различных сочетаниях (ctxAB, tcpЛ), (ctxAB, tаxR) или (tcpA, tаxR) штамм расценивается как потенциально эпидемически опасный. При обнаружении одного фрагмента размером 560 п.н. или полном отсутствии амплификационного сигнала исследуемый штамм относится к эпидемически неопасному (рис. 3).

Рис. 3. Электрофореграмма продуктов амплификации в мультиплексной ПЦР (детекция генов ctxAB, tcpA, toxR) штаммов V. choleraeeltor. 1 - маркер молекулярного веса 100-1000 п.н., 2 - V. cholerae eltor И-1300 (больной), 3 - V. cholerae eltor И-1362 (больной), 4 - V. choleraeelto^-1321 (вода), 5 - V. choleraeeltor^1263 (больной), 6 - V. cholerae eltor И-1342 (больной), 7 - V. cholerae eltor И-1345 (больной), 8 -V. cholerae eltor^638 (вода), 9- V. cholerae eltorM-878 (положительный контроль), 10 - маркер молекулярного веса 100-1000 п.н.

Изучение концентрационной чувствительности тест-системы при исследовании чистой культуры V. cholerae показало возможность выявления искомых генов в пробах с концентрацией 104—105 м.к./мл. Однако оптимальной признана концентрация 106 м.к./мл (3 х 103 микробных клеток в 3 мкл. пробы), при которой достигается 100 % воспроизводимость и достоверность результатов тестирования штаммов холерного вибриона. Воспроизводимость мультиплексного ПЦР-анализа подтверждается результатами реакции отдельно с каждой парой праймеров. Специфичность тест-системы посредством постановки реакции с пробами ДНК Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Escherichia coli, Shigella dysenteriae и эукариотической ДНК составляет 100 %.

ПЦР-анализ показывает (табл. 1), что в геноме большинства культур, выделенных на вспышках в 70-е гг., присутствуют все тестируемые гены вирулентности — ctxAB, tcpA, toxR. Однако выявлено два штамма (г. Барнаул, 1973 г.), обнаружившие генотип ctxAB tcpA+toxR+, которые при перво-

начальном исследовании в ПЦР (1999 г.) давали положительный результат на наличие ctxAB оперона. Утрата гена холерного токсина (при сохранении детерминант токсинкорегулируемых пилей адгезии) сопровождается стойким отсутствием холерогенности на новорожденных крольчатах, где зарегистрирован лишь энтеропатогенный эффект. Данный факт свидетельствует о начале рекомбинационных событий с профага СТХ (Онищенко Г.Г. с соавт., 2000).

Таблица 1

Результаты тестирования V. cholerae eltor в мультиплексной ПЦР на наличие генов ctxAB, tcpA, toxR

Эпидемиол. ситуация Годы выделения Объект выделения Количество штаммов Результаты ПЦР

(ЯхАБг ахАБ ^оА~ tcpA ШЯТ ^хЯ

Эпидемические вспышки 1970-е годы люди 7 5/2 7/0 7/0

хроническии носитель 3 2/1 2/1 3/0

ООС* 7 7/0 7/0 7/0

1999 г люди 51 51/0 51/0 51/0

ООС 25 25/0 25/0 25/0

Заносные очаги 1970-е годы люди 3 2/1 2/1 3/0

1990-е годы люди 11 10/1 10/1 10/1

Период эпидемиол благополучия 1972-2003 гг. транзиторные носители 8 0/8 0/8 6/2

ООС 230 1/229 1/229 187/43

Примечание: *ООС - объекты окружающей среды.

Штаммы от больных, вибриононосителей и из объектов окружающей среды во время эпидосложнений в 1999 г. в г.г. Владивостоке и Южно-Сахалинске содержат гены холерного токсина, токсинкорегулируемых пилей и ген-регулон toxR, что свидетельствует об однородности генотипа изо-лятов на протяжении всего периода вспышки. На основании этого можно заключить, что непосредственно во время вспышки циркулируют культуры с полным набором генетических детерминант вирулентности. Однако, последующее пребывание изолятов в условиях, не требующих экспрессии факторов агрессии холерного вибриона (в частности, на питательных средах), в некоторых случаях может приводить к утрате генов вирулентности.

Заносные случаи холеры на территории в основном связаны с токси-генными штаммами вибриона эльтор (генотип ctxAB+tcpA+toxR+). Однако, представляет интерес факт выделения от прибывшего из Египта вибрио-ноносителя (г. Новокузнецк, 1975 г.) авирулентного вибриона, не содержащего генов ctxAB и tcpA, при наличии у него регуляторной последовательности toxR. Нетипичным по составу генов вирулентности оказался также другой вибрион эльтор в заносном очаге от носителя (г. Южно-Саха-

линск, 1999 г.). Исследование штамма в ПЦР в первых генерациях обнаружило положительный амплификационный ответ на наличие ctxAB оперона при отсутствии генов tcpA и toxR. После серии пассажей на питательных средах положительного ответа в ПЦР на наличие гена ctxAB не выявлено. Возможно, в данном случае СТХср мог находиться в репликативной форме и в последующем элиминировался. Однако неизвестно, какие факторы микроорганизма способствовали формированию вибриононосительства, продолжавшегося, по меньшей мере, семь дней. Не исключено, что рецептором для проникновения СТХ фага в клетку при отсутствии токсинкорегу-лируемых пилей могли служить маннозочувствительные пили адгезии (Campos J. et al., 2003), продукция которых у данного штамма выявлена в реакции гемагглютинации с эритроцитами морской свинки.

Среди вибрионов эльтор, выделенных от больных и носителей при спорадических случаях заболевания, а также от транзиторных вибрионо-носителей на фоне эпидемиологического благополучия, вариантов, содержащих основные гены вирулентности, не выявлено. В хромосоме большей части из них содержится регуляторный ген toxR.

В геноме подавляющего большинства штаммов V. cholerae eltor из объектов окружающей среды региона в благополучный по холере период отсутствуют генетические детерминанты холерного энтеротоксина и ток-синкорегулируемых пилей адгезии. Основная часть изолятов (187 из 230) характеризуется присутствием гена-регулона toxR. Исключением является один ctxAB+tcpA+toxR+ штамм, выделенный на фоне эпидблагополучия из р. Иркут в районе расположения воинской части, прибывшей из г. Луганска (Украина), где в том же году регистрировались заболевания холерой.

Культуры V. cholerae 0139, выделенные из рек в Новосибирской области и г. Иркутске, лишены генов ctxAB и tcpA и содержат лишь ген-регулон toxR. Среди штаммов холерного вибриона не 01/0139 серогрупп также не удалось выявить изоляты с генами вирулентности.

Комплексный анализ эпидемической опасности культур холерного вибриона показал (табл. 2), что в период острых вспышек холеры к эпидемически опасным по фаговому тесту относится 98,9 + 1,1 % изолятов, по ПЦР — 96,8 + 1,8 % (средней силы высокодостоверная прямая корреляционная связь ra= 0,69 ± 0,05; t= 14; р< 0,01). Различия здесь обусловлены выделенными на вспышках вибрионами, утратившими (при культивировании на питательных средах) ген холерного токсина (генотип ctxAB tcpA+toxR+) и потому расцененные как потенциально опасные. При этом они остаются гемолизотрицательными и чувствительными к фагу СТХ+. К эпидемически неопасному (по данным чувствительности к диагностическим фагам и результатам ПЦР) отнесен один штамм периода эпидослож-нений, изолированный от хронического носителя (г. Омск, 1973 г.) через восемь месяцев после перенесенного острого заболевания.

В заносных очагах охарактеризованы как эпидемически опасные по фаговому методу 92,9 ± 6,9 % культур, по ПЦР - 85,7 ± 9,4 % (ra = 0,68 ± 0,14; / = 4,85; р < 0,01). Несоответствие результатов фено- и генотипического тестирования выявлено только для одного изолированного

при активном обследовании от вибриононосителя (прибывшего из Египта) в 1975 г. в г. Новокузнецке штамма, который оказался гемолизнегатив-ным и чувствительным к фагу СТХ+. При этом, в момент выделения штамм обладал холерогенным эффектом (проба на крольчатах-сосунках). Однако, ретроспективное тестирование его в ПЦР обнаружило отсутствие в геноме детерминант холерного токсина и токсинкорегулируемых пилей, при наличии гена (охВ,, что позволяет отнести его к эпидемически неопасному.

Несколько иная ситуация по сопоставимости результатов двух методов сложилась при оценке эпидемической опасности вибрионов эльтор в период эпидемиологического благополучия. По данным чувствительности к диагностическим бактериофагам все штаммы, выделенные от транзиторных носителей, характеризуются как эпидемически неопасные, что подтверждается результатами ПЦР (генотип е1хЛВ (срА (охЯ+). Вместе с тем, культуры от больного и вибриононосителя (г. Ишим, 1974 г., клинический диагноз «острая дизентерия») оказались чувствительны к СТХ+ фагу. Исследование же в ПЦР показало отсутствие в геноме этих изолятов как основных генов вирулентности (с(хЛВ и (ерА), так и регуляторного гена (охЯ.

Таблица 2

Сравнительная оценка эпидемической значимости V. ско1егае по диагностическим фагам СТХ+СТХ и ПЦР

Эпидемиологическая ситуа ция Кол-во штам- мов Эпидемически опасные Эпидемически неопасные Потенциальноэпид. опасные или требуют дополнительных исследований

Фаги СТХ+/-абс. (% ± т ) ПЦР абс. (%±т) Фаги СТХ+/-абс. (% ± т) ПЦР абс. (%±т) Фаги СТХ+/-абс. (% ± т ) ПЦР абс. (% ± т )

Эпидемии- ческие осложнения вспышки 93 92 (98.9 ± 1.1%) 90 (96.8 ± 1,8%) 1 (1.1 ± 1,1%) 1 (1.1+ 1,1%) - 2 (2.1± 1,5%)

заносные очаги 14 13 (92.9 ± 6,9 %) 12 (85.7 ± 9,4 %) 1 (7.1 ± 6,9 %) 2 (14,3 ± 9,4 %) - -

Эпидемиол. благополу- чие транзи- торные носители 8 2 (25 ± 15,3%) - 6 (75 ± 15,3%) 8 (100 %) - -

ООС 230 2 (0.9 ± 0,6 %) 1 (0,4 ± 0,4 %) 211 (91.7 ± 1,8%) 229 (99,6 ± 0,4 %) 17 (7,4 ± 1,7%) -

Примечание: * - потенциально эпидемически опасные штаммы, ** - штаммы, требующие дополнительного исследования.

Среди культур вибриона эльтор из поверхностных водоемов к эпидемически неопасным по результатам ПЦР отнесено 99,6 ± 0,4 % изолятов, по чувствительности к фагам — 91,7 + 1,8 %. Один штамм из водоема г. Иркутска (1977 г.) расценен как эпидемически опасный при отсутствии заболеваемости холерой на данной территории. Необходимо отметить, что изоляты, отнесенные по результатам фагового теста к эпидемически опасным (0,4 ± 0,4 % — СТХ+ ( + ), гемолизотрицательные) или требующим проведения дополнительных исследований (7,4 ±1,7 % — гемолизположи-

тельные СТХ+ (+) или СТХ+ (+) СТХ- (+)), при ПЦР-анализе характеризуются как безопасные в эпидемическом плане, поскольку не содержат основных генов вирулентности. Но все же заслуживает внимания тот факт, что большая часть таких культур изолирована из поверхностных водоемов Приморья через год после вспышки холеры. Возможно, эти штаммы представляют собой измененные варианты токсигенных вибрионов эльтор, выявленных в поверхностных водоемах в период вспышки 1999 г., которые в результате воздействия условий среды обитания утратили гены вирулентности, но сохранили при этом признаки фенотипа вирулентных штаммов. Подобный тип изменчивости токсигенных вибрионов установлен при пассаже на питательных средах в лабораторных условиях. Кроме того, у части (7) этих культур определена принадлежность к RO сероварианту, в который, согласно литературным данным (Rashid M.N. et al., 2003), чаще способны переходить вирулентные вибрионы, приспосабливаясь, таким образом, к условиям среды обитания. В целом же, при изучении эпидемической значимости группы штаммов благополучного по холере периода прослеживается слабая корреляционная связь между результатами двух методов (га = 0,2 ± 0,06; t= 3,3; р < 0,01) и окончательный вывод сделан на основании данных ПЦР, в соответствии с которыми 100 % изолятов от людей и 99,6 + 0,4 % (229 из 230) из объектов окружающей среды расценены как неопасные в плане развития эпидемических осложнений и 0,4 ± 0,4 % (1 из 230) — как эпидемически опасные.

Таким образом, есть основания заключить, что выделение штаммов холерного вибриона с комплексом факторов патогенности в основном приурочено лишь к эпидемическим осложнениям. Такие вибрионы эльтор обусловили в свое время формирование временных местных очагов холеры (г.Омск, 1972г.; Г.Г.Новосибирск, Барнаул, 1973г.; Г.Г.Владивосток, Южно-Сахалинск, 1999 г.). С эпидемически опасными вибрионами связаны и отдельные заносные случаи холеры. Эпидемическая безопасность культур из объектов окружающей среды в благополучный по холере период и выявление лишь единичных случаев заболевания или транзиторного носи-тельства подобных штаммов подтверждает их неспособность к эпидемическому распространению.

Из второстепенных («дополнительных») генетических детерминант патогенности возбудителя холеры заслуживают внимания ген zot, кодирующий токсин проницаемости (Fasano A. et al., 1991, 1997; Baudry B. et al., 1992); ген rstC (в составе RSI (p), активирующий транскрипцию генов СТХ профага (Faruque S.M. et al., 2002, 2003); папН, контролирующий фермент нейраминидазу (Jermyn W.S., Boyd E.F., 2002); ompU порина наружной мембраны (Provenzano D., Klose K.E., 2000; SimonetV.C. et al., 2003).

Согласно детекции генов zot и rstC в различных группах штаммов их присутствие в геноме полностью коррелирует с эпидемической опасностью изолятов, определенной в мультиплексной ПЦР, а продукты этих генов, вероятно, принимают непосредственное участие в формировании вирулентного потенциала вибриона, поскольку все ctxAB tcpA+ toxR+ культуры в период эпидемических осложнений (эпидемические вспышки, заносные случаи), а

также один токсигенный вибрион эльтор из поверхностного водоема в период эпидемиологического благополучия оказались 1о( и гаС-положительными. Все штаммы (независимо от объекта выделения), лишенные основных генов вирулентности, характеризуются отсутствием 1о( и МС генов. В хромосоме V. ско1егаееНогИ-1362, И-566, утративших при пассажах на питательных средах детерминанты холерного токсина, ген 1о( не обнаружен, что свидетельствует о полной элиминации у них «кассеты вирулентности». Исходный же штамм (V. ско1егае е1(ог И-563), из гетерогенной популяции которого селекционирован V. ско1егае е1(ог И-1362, характеризуется как полным набором генов вирулентности в мультиплексной ПЦР, так и присутствием гена 1о( (рис. 4). Вместе с тем, элиминация филаментозного бактериофага СТХф не затронула фланкирующий этот фаг элемент К81, поскольку штаммы V. ско1егае еНог И-1362 и И-566 оказались гаС-позитивными.

Рис. 4. Электрофореграмма продуктов амплификации в ПЦР штаммов V. cholerae eltor(2-5 - детекция ctxAB, tcpA, toxR; 6-9 - детекция гена zot): 1,10- маркер молекулярного веса 100-1000 п.н.; 2,6 - V. choleraeeltorИ-563(г. Барнаул, 1973 г., больной); 3,7 - V. choleraeeltorИ-1362 (г. Барнаул, 1973 г., больной); 4, 8 - V. cholerae eltor И-638 (г. Иркутск, 1978 г., вода); 5,9 - V. cholerae eltorМ-878 (положительный контроль).

Присутствие генов нейраминидазы (папН) и белка наружной мембраны (отри) так же характерно практически для всех штаммов периода эпидемических осложнений. Следует отметить, что ген нейраминидазы выявлен и у большей части авирулентных штаммов, изолированных от людей как при эпидемических осложнениях (хронический вибриононоси-тель, Омск, 1973 г.), так и в период эпидемиологического благополучия от транзиторных вибриононосителей.

Геном отри обладает лишь небольшая часть эпидемически неопасных изолятов холерного вибриона от людей, а именно — два штамма от транзиторных носителей (г.Новосибирск, 1972г., г.Уссурийск, 1982г.) и один от носителя в заносном очаге (г. Новокузнецк, 1975 г.). Интересно,

что в двух других штаммах, изолированных от вибриононосителей, в ПЦР выявлен мажорный флуоресцирующий фрагмент меньшего размера в сравнении с положительным контролем (приблизительно 700 п.н.). Возможно, в этом случае имеет место делеционная мутация в гене, кодирующем белок наружной мембраны, за счет которой происходит сокращение нуклеотидной последовательности гена ompU. При этом один нетоксигенный штамм с возможной мутацией указанного гена изолирован от хронического вибриононосителя. Вполне вероятно, что длительное воздействие желчесодержащей среды (в кишечнике и гепатобилиарной системе человека) повлияло на структуру вибриона (ген omp U), связанную с формированием устойчивости микроорганизма к желчи.

Среди вибрионов эльтор из объектов окружающей среды при отсутствии заболеваемости холерой отмечается некоторое разнообразие структуры генома по наличию генов папНи ompU. HanH-положительными оказалась 51,1 % (24 из 47) исследуемых штаммов, ген ompU содержат 46,8 % (22 из 47) культур. Столь закономерное присутствие генов фермента ней-раминидазы и белка наружной мембраны в геноме штаммов холерного вибриона разного происхождения, надо полагать, связано с тем, что продукты этих генов в определенной мере необходимы вибриону не только во время инфекционного процесса, но и при адаптации микроорганизма к условиям среды обитания. При этом способность части вибрионов из поверхностных водоемов продуцировать нейраминидазу, возможно, придает им определенные преимущества, поскольку лишь nanH -культуры обнаруживаются у транзиторных вибриононосителей.

Выявленная мобильность генома холерного вибриона и неоднородность популяции авирулентных штаммов может рассматриваться как основа для изменчивости микроорганизма. При выяснении потенциальной способности холерного вибриона к рекомбинациям генома (выявление генов xerC, xerD, кодирующих ферменты рекомбиназы) установлено, что все изоляты V. cholerae eltor, V. cholerae 0139, V. cholerae не О1/О139, независимо от объекта выделения, обладают генами ферментов рекомбиназ. Вероятно, эти ферменты, выполняя функцию разделения димерных хромосом, принимают участие в различных перестройках генома микроорганизма, приводящих к изменению его первоначальных свойств.

Таким образом, в период эпидемических осложнений по холере выявляются в основном лишь вирулентные по комплексу тестов культуры возбудителя, содержащие в геноме детерминанты патогенности, локализованные как на мобильных генетических элементах — СТХ(р (ctxAB опе-рон, ген zot), VPI(|> (ген tcpA), RSI <р (ген rstC), так и в составе «острова патогенности» VPI-2 (ген папН) и консервативной части хромосомы (гены toxR, ompU). В благополучный по холере период в регионе среди людей и в объектах окружающей среды циркулируют штаммы, лишенные как основных (ctxAB, tcpA), так и дополнительных (zot, rstC) генов, непосредственно связанных с патогенностью возбудителя. Однако их популяция по ряду фенотипических признаков и наличию некоторых «дополнительных» генов вирулентности характеризуется гетерогенностью.

Адаптационные возможности штаммов V. cholerae разной эпидемической значимости (получение и характеристика некультивируемых форм холерного вибриона)

Как установлено выше, эпидемически опасные штаммы возбудителя холеры на территории региона обнаруживаются лишь кратковременно, в период эпидемических осложнений (при острых вспышках — от людей и из объектов окружающей среды, в заносных очагах — от людей). Эпидемически неопасные штаммы вибриона эльтор из поверхностных водоемов отдельных территорий региона изолируются в летне-осенний период практически ежегодно. При этом, вибрион, попадая в поверхностный водоем, сталкивается с неизбежным влиянием на него факторов среды обитания (низкая температура, недостаток питательных веществ, резкие колебания рН). Одним из механизмов адаптации к условиям окружающей среды может быть переход микроорганизма в некультивируемое состояние, при котором он перестраивается на минимальный уровень метаболизма, что, видимо, позволяет ему при стрессовых условиях среды обитания сохранять жизнеспособность (Домарадский И.В., 1997; Литвин В.Ю. с соавт., 2000, 2001; Гинцбург А.Л. с соавт., 1999; RoszakD.B., Colwell R.R., 1987).

По результатам нашего эксперимента, культивирование вибрионов разной эпидемической значимости в условиях физиологически низкой температуры и дефицита питательных веществ, а также «солевого стресса» вызывает в исходных пробах закономерное снижение концентрации вегетативных клеток и параллельный переход части популяции в некультивируе-мое состояние. При этом, у токсигенных вибрионов, в сравнении с неток-сигенными, наблюдается более значительное уменьшение числа КОЕ/мл, что особенно наглядно выражено в условиях «солевого стресса» (рис. 5а), при котором токсигенные вибрионы находятся в вегетативной форме лишь на протяжении одной недели (2-8 дней). В условиях низкой температуры (рис. 56) также характерно более быстрое снижение высеваемости токси-генных штаммов (с прекращением ее на 60—75 сутки, в то время как неток-сигенные штаммы продолжают высеваться до 110 суток от начала опыта).

Исследование материала (смыв с фильтра, осадок после центрифугирования) в разные сроки эксперимента при отсутствии роста на стандартных питательных средах показывает наличие в нем (под световым микроскопом) различной величины округлых грамотрицательных клеток.

При электронной микроскопии после 20—50 суточного пребывания холерного вибриона в условиях той и другой серии опытов популяция клеток в исследуемом материале (смыв с фильтра) — в виде одиночных особей (в среднем диаметр 0,2—0,5 мкм) или их скоплений, преимущественно округлой или овальной формы, у одних — более плотная периферическая часть, у других — электронно-плотное все тело, обычно с отходящим от тела жгутиком (рис. 6а). Нередки конгломераты из тесно соприкасающихся (от единичных до более многочисленных) клеток (рис. 66). На более поздних сроках (60—90 суток) отмечается значительное уменьшение диаметра каждой особи (до 0,1—0,2 мкм), они преимущественно округлой формы и более электронно-плотные.

Рис. 5. Динамика высеваемости штаммов холерного вибриона а) в условиях повышенной концентрации солей, б) в условиях дефицита питания и низкой температуры

Рис. 6. Электронограмма Смыв с фильтра диаметром пор 0,22 мкм после фильтрации V cholerae И-1362 на 50 сутки культивирования в условиях дефицита питания и низкой температуры Увеличение в 30 000 раз

Происходящие в НС структурные модификации вибриона могут рассматриваться как адаптационная реакция, которая обеспечивает микробу стабилизацию и персистенцию в неблагоприятных условиях (McDougald D. et al., 1998). Возможно, способность к формированию конгломератов НФ также увеличивает срок выживаемости вибриона в НС. Не исключено, что указанные конгломераты функционируют подобно биопленке, в составе которой, как известно (Смирнова Н.И., Лозовский Ю.В., 2003; Wai S.N. et al., 1999), микроорганизмы защищены от неблагоприятного воздействия среды обитания.

Прижизненное окрашивание акридиновым оранжевым обнаруживает (на 8—15 сутки отсутствия высеваемости) подвижные флуоресцирующие зеленым цветом клетки в пробах как токсигенных, так и атоксиген-ных штаммов. Позднее (на 20—30 сутки) клетки не проявляют способности к поступательному движению и регистрируется лишь их маятникообразное движение во всех направлениях плоскости. В дальнейшем подвижность клеток утрачивается полностью.

Путем постановки реакции прямой иммунофлуоресценции с диагностическими холерными люминесцирующими иммуноглобулинами (V. cholerae 01) и ФИТЦ-МКА 0139, а также в ориентировочной реакции агглютинации на стекле с холерными 01-, 0139-, Огава-, Инаба-сыво-ротками в исследуемом материале показано сохранение антигенных детерминант холерного вибриона.

При биохимическом исследовании дезинтегратов клеток (материал с фильтра на 70 и 90 сутки культивирования вибрионов в условиях низкой температуры и дефицита питательных веществ) показана их способность восстанавливать p-iodonitrophenyl tetrazolium violet (INT-редуктазная активность) как в присутствии интермедиатов цикла трикарбоновых кислот, так и без них.

Определение с помощью мультиплексной ПЦР генетических детерминант ctxAB, tcpA и toxR в материале, полученном через 1 сутки, а затем через каждые 15—20 суток культивирования, показало сохранение в нем клеток с исходным набором генов вирулентности. После полного прекращения высеваемости холерного вибриона из флаконов исходные детерминанты вирулентности обнаруживаются до 80 суток наблюдения.

Таким образом, прекращение высеваемости вибриона из исследуемого материала, сохранение специфических для микроба антигенных детерминант и исходного набора генов, а также нехарактерные для его вегетативных клеток малые размеры, кокковидная форма, изменение типичной для возбудителя холеры структуры клетки, но с сохранением при этом у него жгутика подтверждают приобретение взятыми в исследование штаммами состояния некультивируемости. На сохранение жизнеспособности полученных НФ указывает также их INT-редуктазная активность, повышающаяся (в 4,5—6,5 раз) в присутствии интермедиатов цикла Кребса, что свидетельствует о наличии у них ряда функционально активных дегидрогеназ.

Представляет интерес предпринятое выяснение жизнеспособности НФ возбудителя, в частности, возможности при наступлении благоприятных условий реверсировать в исходное вегетативное состояние. При повыше-

нии температуры инкубации в комплексе с добавлением питательных веществ, а также при постепенном повышении температуры без изменения среды микрокосма получен обратный переход некультивируемых форм в вегетативное состояние (с полным восстановлением биологических свойств исходного штамма, в том числе и вирулентного потенциала). При этом наиболее эффективным фактором, индуцирующим этот переход, является именно постепенное повышение температуры инкубации до физиологического оптимума, поскольку в этих условиях получена реверсия НФ всех исследуемых штаммов, в том числе и одного токсигенного, у которого в случае резкой смены температуры (от 4—6 до 22 и 37 оС) возврат в вегетативное состояние не наблюдался. Однако процесс рекультивирования возможен лишь в ранние сроки существования вибриона в некульти-вируемом состоянии. В эксперименте эпидемически опасные штаммы реверсируют в течение 25 суток некультивируемости. У эпидемически неопасных НФ переход в культивируемую форму наблюдается до 30 суток и на 50 сутки (в виде роста на жидкой среде реверсии). Позднее, несмотря на обнаружение в микрокосмах клеток, морфологически соответствующих некультивируемым, флуоресцирующих зеленым цветом при окраске акридиновым оранжевым, сохранивших специфические антигенные детерминанты и исходные гены вирулентности, возврата вибрионов в исходное вегетативное состояние не наблюдается.

В целом, в эксперименте показана способность вибрионов при наступлении неблагоприятных условий существования переходить в некуль-тивируемое состояние, сохраняя при этом, наряду с жизнеспособностью, патогенный потенциал исходного штамма. Подобное некультивируемое состояние у эпидемически опасных штаммов, вероятно, наступает быстрее, чем у эпидемически неопасных. При этом оптимальный характер параметров среды может индуцировать реверсию НФ (на начальных стадиях их развития) в исходное вегетативное состояние.

Проведенный комплексный анализ патогенных свойств штаммов холерного вибриона в различные временные периоды седьмой пандемии позволяет заключить, что эпидемиологическая ситуация в регионе в значительной степени определяется эпидемической опасностью циркулирующего варианта возбудителя, а длительность имеющих место эпидемических осложнений ограничивается как климато-географическими особенностями региона, так и адаптационными возможностями микроорганизма.

ВЫВОДЫ

1. Эпидемиологическая ситуация по холере в Сибири и на Дальнем Востоке характеризуется возникновением эпидемических вспышек или заносными случаями заболевания без укоренения инфекции. На отдельных территориях региона в период эпидемиологического благополучия в поверхностных водоемах наблюдается длительная циркуляция вибриона эльтор. На этом фоне возникают единичные случаи транзиторного вибриононоси-тельства.

2. Метод определения эпидемической значимости холерного вибриона с применением холерных диагностических бактериофагов СТХ+ СТХ-и учетом гемолитической активности обладает высокой специфичностью в отношении культур периода эпидемических осложнений. Вместе с тем, сложность определения по этому тесту эпидемической опасности части штаммов в благополучный по холере период позволяет применять его лишь в качестве ориентировочного.

3. Разработанный вариант мультиплексной ПЦР позволяет оперативно, с высокой чувствительностью и специфичностью определять наличие в геноме изолированных культур холерного вибриона основных детерминант вирулентности — генов холерного энтеротоксина (с1хАВ), токсинко-регулируемых пилей адгезии ((срА) и регулятора их экспрессии (1ахВ).

4. Во время эпидемических осложнений большинство штаммов холерного вибриона по комплексу фенотипических (чувствительность к СТХ фагам и гемолитическая активность) и генетических (наличие генов с1хАБ, КрА, 1ахВ) тестов характеризуется как эпидемически опасные; при этом в составе их хромосомы присутствуют и все тестируемые «дополнительные» гены вирулентности. Эти данные позволяют судить о фенотипической и генетической однородности популяции эпидемически опасных штаммов.

5. При отсутствии эпидемических осложнений по холере в объектах окружающей среды региона и у транзиторных вибриононосителей обнаруживаются эпидемически неопасные по комплексу признаков изоляты вибриона. Все они лишены как основных (ахАБ, КрА, 1ахВ), так и «дополнительных» (г,а1, кС) генов, непосредственно связанных с вирулентностью возбудителя. Однако, выявленная неоднородность некоторых изолятов по чувствительности к бактериофагам СТХ+ СТХ-, гемолитической активности, а также присутствие в геноме значительного количества эпидемически неопасных культур генетических детерминант нейраминидазы — папН и белка наружной мембраны — отр и свидетельствует о характерной для эпидемиологического благополучия гетерогенности популяции штаммов.

6. Под воздействием неблагоприятных факторов среды обитания (в условиях эксперимента) холерный вибрион может переходить в некульти-вируемое состояние. При этом, скорость подобного перехода у токсиген-ных штаммов выше, чем у нетоксигенных, что, вероятно, обусловлено их разными адаптационными способностями.

7. В некультивируемом состоянии у холерного вибриона происходит изменение морфологии клетки с сохранением его антигенных детерминант, исходных генов вирулентности, подвижности (на ранних этапах не-культивируемости) и определенного уровня метаболической активности. При наступлении благоприятных для вибриона условий возможна реверсия его «молодых» некультивируемых форм в вегетативное состояние, что наблюдается более длительное время у эпидемически неопасных штаммов.

8. Выявление в поверхностных водоемах региона токсигенных культур вибриона строго ограничено периодом вспышек, что может быть связано как с генетическими модификациями возбудителя (утрата детерминант вирулентности) под влиянием природно-климатических условий, так

и с меньшей способностью эпидемически опасных особей популяции (в сравнении с эпидемически неопасными) адаптироваться к условиям пребывания в объектах окружающей среды, быстрым переходом в некульти-вируемое состояние и коротким сроком возможной реверсии.

9. Применение молекулярно-генетических методов исследования в комплексе с фенотипическими тестами для оценки патогенных свойств изолированных культур холерного вибриона позволяет объективно оценить эпидемиологическую ситуацию и определить дифференцированный объем необходимых профилактических и противоэпидемических мероприятий.

Список опубликованных работ

1. Характеристика биологических свойств вибрионов эльтор, выделенных при различных эпидситуациях в Сибири и на Дальнем Востоке / Е.П. Голубинский, А.С. Марамович, Л.Я. Урбанович, B.C. Ганин, СВ. Балахонов, Л.В. Миронова и др. // Пробл. комис. «Холера и патогенные для человека вибрионы» Межведомств. науч. совета по сан.-эпидемиол. охране территории РФ. - Ростов н/Д, 2000. - Вып. 13. - С. 29-31.

2. Оценка вирулентности штаммов холерного вибриона эльтор при различных эпидситуациях / Е.П. Голубинский, А.С. Марамович, B.C. Ганин, СВ. Балахонов, Л.Я. Урбанович, Л.В. Миронова и др. // Инфекции, обусловленные иерсиниями (иерсиниоз, псевдотуберкулез), и другие актуальные инфекции: Матер. междунар. конф. (29—31 мая 2000 г., Санкт-Петербург). - СПб., 2000. - С. 114.

3. Оценка эпидемической значимости заносов холеры в регионы Сибири и Дальнего Востока / А.С. Марамович, В.И. Погорелов, Л.Я. Урбанович, B.C. Ганин, Л.В. Миронова // Актуальные проблемы обеспечения здоровья международных путешественников: Матер. междунар. науч.-практ. конф. (7-8 авг. 2001 г., Улан-Удэ). - Иркутск, 2001. - С. 73-75.

4. Оценка эпидемической значимости штаммов Vibrio cholerae eltor методом мультиплексной ПЦР / Е.П. Голубинский, А.С. Марамович, Л.В. Миронова, СВ. Балахонов и др. // Пробл. комис. «Холера и патогенные для человека вибрионы» Межведомств. науч. совета по сан.-эпидемиол. охране территории РФ. - Ростов н/Д, 2001. - Вып. 14. - С 18-20.

5. Особенности эпидемиологии и профилактики холеры на территории Сибири и Дальнего Востока / А.С. Марамович, В.И. Погорелов, Л.Я. Урбанович, B.C. Ганин, Л.В. Миронова // Журн. инфекц. патологии

- Иркутск, 2001. - Т. 8, № 2-3. - С. 52-60.

6. Миронова Л.В. Диагностическая тест-система для оценки эпидемической значимости Vibrio cholerae методом мультиплексной полимеразной цепной реакции / Л.В. Миронова // Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины: Тез. докл. III конф. молодых ученых. — Новосибирск, 2001. - С. 25.

7. К использованию ПЦР для детекции маркеров патогенности штаммов Vibrio cholerae / СВ. Балахонов, Л.В. Миронова, Л.Я. Урбанович, Е.П. Голубинский // Генная диагностика особо опасных инфекций: Матер.

1-й Всерос. науч.-практ. конф. (21—22 ноября 2000 г., Саратов). — Саратов, 2000. - С. 23-26.

8. ПЦР-детекция маркеров эпидемической значимости штаммов Vibrio cholerae 0139, изолированных в Сибири / С.В. Балахонов, Л.В. Миронова, А.С. Марамович, B.C. Ганин и др. // Молекул. генетика. — 2001. — № 2. — С. 24-26.

9. Оценка эпидемической значимости Vibrio cholerae eltor, изолированных на территории Сибири и Дальнего Востока, с помощью диагностических холерных фагов СТХ+ и СТХ- / Л.В. Миронова, А.С. Марамович, Л.Я. Урбанович, В.И. Погорелов и др. // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. -2002. - Т.1,№ 4. - С. 82-84.

10. Ускоренная диагностика холеры с помощью мультиплексной ПЦР / С.В. Балахонов, Л.В. Миронова, В.И. Погорелов, Л.Я. Урбанович и др. // Стресс и экстремальные состояния: 1 Междунар. Симпозиум (5-14 июня 2002 г. Кара-Даг, Феодосия, Украина). — Кара-Даг, Феодосия, Украина, 2002. - С 27-28.

11. Холерные диагностические фаги СТХ+ и СТХ- в комплексной оценке эпидемической значимости Vibrio cholerae eltor/Л. В. Миронова, А.С. Марамович, Л.Я. Урбанович, В.И. Погорелов // Актуальные проблемы эпидемиологической безопасности: Матер. Юбил. науч.-практ. конф. «Эпидемиологическая безопасность на Кавказе. Итоги и перспективы», посвящен. 50-летию Ставропольского НИПЧИ (15-16 окт. 2002, Ставрополь).

- Ставрополь, 2002. - С 183-185.

12. Rapid Diagnostics of Cholerawith MultiplexPCR/ S.W. Balakhonov, L.W. Mironova, W.I. Pogorelov, L.Ya. Urbanovich et al. // 4th Asia pacific travel health conference. - Shanghai, P.R. China. (20-23 oct. 2002). - P. 111.

13. Вибрионы эльтор в водоемах г. Иркутска / В.И. Погорелов, А.С. Марамович, Л.Я. Урбанович, B.C. Ганин, Л.В. Миронова и др. // Тез. докл. 1 съезда гигиенистов, эпидемиологов Иркутской области. — Иркутск,

2002.-С 169-171.

14. Закономерности циркуляции Vibrio cholerae на территории Сибири и Дальнего Востока и комплексная оценка их биологических свойств / Е.П. Голубинский, А.С. Марамович, Л.Я. Урбанович, В.И. Погорелов, Л.В. Миронова и др. // Пробл. комис. «Холера и патогенные для человека вибрионы» Межведомств. науч. совета по сан.-эпидемиол. охране территории РФ. - Ростов н/Д, 2002. - Вып. 15. - С. 21-24.

15. Генез эпидемических вспышек холеры / А.С. Марамович, В.И. Погорелов, Л.Я. Урбанович, B.C. Ганин, Л.В. Миронова // Матер. VIII Всерос. съезда эпидемиол., микробиол. и паразитол. — М., 2002. — Т. 1. — С. 74—75.

16. Оценка эпидемиологической ситуации по холере в условиях Сибири и Дальнего Востока / А.С. Марамович, Е.П. Голубинский, Л.Я. Урбанович, Л.В. Миронова и др. // Холера: Материалы VIII Рос. науч.-практ. конф. по проблеме «Холера» (4-5 июня 2003 г., Ростов н/Д). — Ростов н/Д,

2003. - С 39-44.

17. Опыт использования генодиагностических методов в эпиднадзоре за холерой на территории Сибири и Дальнего Востока / Л.В. Миронова,

С.В. Балахонов, E.^ Голубинский, Л.Я. Урбанович и др. II Современные технологии в диагностике особо опасных инфекций: Mатер. 4-й Mежгосy-дарств, науч.-практ. конф. государств-участников СНГ (30 сент. — 2 окт. 2003 г., Саратов). - Саратов, 2003. - С. 119-122.

18. Экспериментальное получение некультивируемых форм Vibrio cholerae и характеристика их биологических свойств I Э^. Тафелынтейн, E.^ Голубинский, А.С. Mарамович, Л.Я. Урбанович, Л.Ф. Буренина, Л.В. Mиронова и др. II Журн. микробиол. - 2004. - № 1. - С. 13-18.

19. Характеристика биологических свойств некультивируемых форм холерного вибриона и их способности к реверсии в экспериментальных условиях I Л.Я. Урбанович, А.С. Mарамович, Л.В. Mиронова, E.^ Голубинс-кий и др. II Пробл. комис. «Холера и патогенные для человека вибрионы» Науч. совета по сан.-эпидемиол. охране территории PФ. — Pостов нЩ, 2004.

- Вып. 17. - С. 45-48.

20. Некоторые «дополнительные» гены вирулентности штаммов холерного вибриона различного происхождения I Л.В. Mиронова, С.В. Балахонов, E.^ Голубинский, А.С Mарамович и др. II Пробл. комис. «Холера и патогенные для человека вибрионы» Науч. совета по сан.-эпидемиол. охране территории PФ. - Pостов н!Д, 2004. - Вып. 17. - С. 62-65.

21. Определение геномных маркеров патогенности штаммов Vibrio cholerae, выделенных в Сибири и на Дальнем Востоке IЛ. В. Mиронова, СВ. Балахонов, Л.Я. Урбанович, О.Б. Огарков и др. II Бюл. ВСНЦ СО PAMН.-2004.-T.2,№ 1.-С132-138.

22. Динамика изменчивости серо- и фаговариантов Vibrio cholerae eltor, выделенных от людей и из поверхностных водоемов на территории Сибири и Дальнего Востока в 1972—2002 гг. I B.C. Ганин, В.И. Погорелов, Л.Я. Урбанович, Л.В. Mиронова и др. II Бюл. ВСНЦ СО PAMН. - 2004. -Т.2, №1.-С. 65-72.

23. Холера в Сибири и на Дальнем Востоке Pоссии на этапах 7 пандемии I А.С. Mарамович, Л.Я. Урбанович, B.C. Ганин, Л.В. Mиронова и др. II Бюл. ВСНЦ СО PAMН. - 2004. - Т. 2, № 1. - С 116-125.

Подписано в печать 01.11.2004. Бумага офсетная. Формат 60х841/1в Гарнитура Таймс. Усл. печ. л. 1,1 Тираж 100 экз. Заказ № 299-04.

РИО НЦ РВХ ВСНЦ СО РАМН (Иркутск, ул. Борцов Революции, 1. Тел 29-03-37, E-mail: arleon@rol.ru )

1*2374 1

Актуальность проблемы

Холера - тяжелое инфекционное заболевание диарейного характера, склонное к эпидемическому и пандемическому распространению. Описания заболеваний, сходных по симптомам с холерой, встречаются в летописях, датированных более 2000 лет назад в Индии и Китае [259]. С 1817 г. описано шесть пандемий, вызванных классическим холерным вибрионом. Седьмая пандемия, этиологическим агентом которой явился холерный вибрион эльтор, началась в 1961 г. и продолжается до настоящего времени. Она характеризуется наибольшей продолжительностью по сравнению с шестью предыдущими, охватывает большее число стран Азии, Африки, Америки, Европы, Австралии с Океанией [108, 133]. За период седьмой пандемии в ВОЗ зарегистрировано 5 110 089 случаев заболевания в 146 странах мира [2, 109]. Только за последнее десятилетие (1992-2001 гг.) 128 стран мира информировали ВОЗ о 2 583 742 больных [141]. Определенную опасность вызывает появление в 1992 году возбудителя холеры новой серогруппы - V. cholerae 0139, который стал причиной крупных эпидемических вспышек в Бангладеш, Индии и отдельных заносов инфекции в Азию, Европу и Америку [66, 159]. В России же, на фоне снижения мировой заболеваемости, отмечена тенденция роста инфицированности холерой за счет вспышек в Приморском крае и па Сахалине (1999 г.), а также в Татарстане (2001 г.) [74]. Эпидемиологическая ситуация в стране определяется как угрозой завоза холеры на любую территорию из эндемичных стран [137, 141], так и широким распространением вибрионов эльтор в объектах окружающей среды [49, 107, 123, 136, 141].

Проявления холерной инфекции в Сибири и на Дальнем Востоке обусловлены географическим положением региона, его климатическими особенностями. В период седьмой пандемии в регионе холера давала о себе знать в виде эпидемических вспышек, отдельных заносных случаев и редкого обнаружения транзиторных носителей. Из объектов окружающей среды отдельных территорий Сибири и Дальнего Востока на фоне эпидемиологического благополучия практически ежегодно выделяются слабо- или авирулентные по фенотипиче-ским свойствам вибрионы эльтор, что свидетельствует о наличии соответствующих условий, способствующих сохранению и длительному существованию холерного вибриона в определенных экологических нишах [54, 148]. Установленная в последние годы возможность формирования (посредством фаговой трансдукции) токсигенных вариантов вибриона из авирулентных предшественников [154, 160, 202, 221], а также зависимость объема необходимых профилактических и противоэпидемических мероприятий от эпидемической опасности V. cholerae требует постоянного контроля в изолируемых культурах маркеров патогенности. При этом определение их бактериологическими методами трудоемко и не всегда достоверно. Ключевая же роль в оценке вирулентных свойств V. cholerae отводится современным молекулярно-биологическим методам исследования, в частности полимеразной цепной реакции (ПЦР), направленным на прямую детекцию генетических детерминант вирулентности микроорганизма. Усовершенствование этих методов и определение с их помощью эпидемической значимости возбудителя является важным звеном в системе эпидемиологического надзора за холерой.

Длительная циркуляция вибрионов эльтор в поверхностных водоемах Сибири и Дальнего Востока, несмотря на значительный диапазон колебаний природно-климатических условий в регионе, связана с возможным сохранением их жизнеспособности в объектах окружающей среды. Наиболее логичным объяснением такой персистенции микроба от одного сезона к другому может быть его переход в некультивируемое состояние, что является крайним вариантом адаптационной изменчивости под влиянием неблагоприятных условий среды обитания [26, 47, 73]. Исследователей интересует вопрос о возможности и длительности сохранения пекультивируемыми формами (НФ) эпидемически значимых штаммов их патогенных свойств. На этот счет имеет место противоречивость литературных данных, в связи с чем данный аспект в экологии холерного вибриона требует соответствующего выяснения. Кроме того, неизвестно, существуют ли различия в способности к переходу в некультивируемое состояние и возможности реверсии в вегетативную форму холерных вибрионов разной эпидемической значимости.

Цель настоящего исследования — на основе комплексного использования генодиагностических и бактериологических методов определить эпидемическую значимость обнаруживаемых на территории Сибири и Дальнего Востока холерных вибрионов, а также выяснить адаптационные возможности штаммов разных генотипов.

Задачи исследования

1. Охарактеризовать эпидемиологическую ситуацию по холере в Сибири и на Дальнем Востоке в период седьмой пандемии.

2. Оценить вирулентность разных штаммов холерного вибриона по данным комплексного бактериологического метода (чувствительность к холерным диагностическим фагам СТХ+ СТХ" и гемолитическая активность).

3. Разработать метод мультиплексной ПЦР для одновременной детекции трех основных генетических маркеров эпидемической опасности холерного вибриона - ctxAB, tcpA, toxR, ассоциированных с различными «блоками пато-генности» на хромосоме возбудителя. Выявить присутствие указанных детерминант в геноме V. cholerae разных групп.

4. По комплексу генетических и фенотипических признаков определить эпидемическую значимость холерных вибрионов, изолируемых в разные годы на фоне возникновения вспышек холеры и при отсутствии эпидемических осложнений.

5. Установить распространенность некоторых «дополнительных» генов вирулентности - zot, rstC, nanH, ompU, xerC, xerD (локализованных на мобильных генетических элементах и консервативных участках хромосомы) в штаммах холерного вибриона разной эпидемической значимости. 6. Изучить адаптационные возможности штаммов холерного вибриона разных генотипов путем экспериментального получения некультивируемых форм микроорганизма. Охарактеризовать морфологию, жизнеспособность НФ, а также возможность сохранения ими исходных генетических детерминант вирулентности и реверсии в культивируемую форму.

Научная новизна и теоретическая значимость работы

По данным молекулярно-генетических и фенотипических методов представлена комплексная эпидемиологическая оценка изолированных на территории Сибири и Дальнего Востока штаммов холерного вибриона.

Разработан и многократно апробирован метод мультиплексной ПЦР для одновременной детекции трех основных детерминант патогенности возбудителя - ctxAB, tcpA и toxR.

Установлена распространенность «дополнительных» генов вирулентности (zot, rstC, nanli, ompU, xerC, xerD) среди штаммов холерного вибриона разной эпидемической значимости.

Выявлена однородность (по генетическим и фенотипическим признакам) популяции штаммов холерного вибриона периода эпидемических осложнений и их гетерогенность (в объектах окружающей среды) в период эпидемиологического благополучия.

Экспериментально показан более быстрый переход в некультивируемое состояние токсигенных штаммов холерного вибриона по сравнению с нетокси-генными. При этом, у токсигенного вибриона в некультивируемом состоянии наряду с антигенными детерминантами сохраняются связанные с патогенно-стью гены исходного штамма.

Установлена более длительная способность к реверсии в вегетативное состояние НФ эпидемически неопасных штаммов.

Предложенные методы комплексной оценки вирулентности холерного вибриона различного происхождения позволяют объективно оценить эпидемиологическую ситуацию и могут быть положены в основу дальнейшей оптимизации системы эпидемиологического надзора за холерой.

Практическая значимость работы

Разработан и внедрен в практику эпидемиологического надзора за холерой метод мультиплексной ПЦР, основанный на одновременной детекции в пробе трех основных генов вирулентности холерного вибриона, что позволяет оперативно определить эпидемическую опасность изолируемой культуры. Метод в течение ряда лет используется в системе экологического мониторинга и в рамках оперативного эпиднадзора за холерой (в том числе, при расшифровке эпи-досложнений, выявлении первых заносных случаев заболевания), а также в экспериментальных исследованиях. «Методические рекомендации по детекции детерминант вирулентности холерного вибриона с использованием мультиплексной ПЦР» одобрены Ученым Советом (протокол № 3 от 09.04.02.) и утверждены директором Иркутского НИПЧИ.

Депонирован в Государственную коллекцию патогенных бактерий «Микроб» при Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» штамм Vibrio choleras eltor И-1362, спонтанно утративший ctxAB оперон гена холерного токсина при сохранении гена tcpA. Штамм может быть использован в качестве перспективного для генетических исследований.

Положения, вы носи мыс на защиту:

1. Ситуация по холере в Сибири и на Дальнем Востоке в период седьмой пандемии определяется регистрацией острых вспышек, отдельных случаев заболевания заносного характера, транзиторного вибриононосительства, а также длительной циркуляцией авирулентных вибрионов эльтор в поверхностных водоемах.

2. Предлагаемый вариант мультиплексной ПЦР для одновременной детекции ctxAB оперона гена токсинообразования, генов tcpA и toxR позволяет оперативно определить эпидемическую значимость возбудителя холеры.

3. При эпидемических осложнениях по холере (вспышки, заносные очаги) обнаруживаемые штаммы возбудителя характеризуются однородностью генотипа (ctxAB+tcpA+toxR+zot+rstC4rnanH+ompU&) и по совокупности с результатами комплексного фенотипического метода соответствуют оценке как эпидемически опасные.

4. Популяция вибрионов эльтор от транзиторных носителей и из объектов окружающей среды на фоне эпидемиологического благополучия в регионе отличается гетерогенностью. Все выделяемые штаммы лишены генов ctxAB, tcpA, zot, rstC, при наличии у большинства из них гена-регулона toxR и генов nanH, ompU. Комплексная оценка генетических свойств и чувствительности к фагам СТХ+ и СТХ" позволяет охарактеризовать изоляты как эпидемически неопасные.

5. Культивирование холерного вибриона в неблагоприятных условиях закономерно приводит к снижению популяции вегетативных особей микроба, наиболее четко выраженному у токсигенных штаммов, что, вместе с результатами комплексного (микроскопического, серологического, молекулярно-генетического, биохимического) исследования, свидетельствует о более быстром их переходе в некультивируемое состояние.

6. Возможен обратный переход «молодых» некультивируемых форм холерного вибриона в вегетативное состояние с сохранением ревертантами всех свойств исходного штамма, в том числе и вирулентного потенциала; при этом НФ нетоксигенных штаммов обладают более длительной (в сравнении с токсигенными) способностью к восстановлению первоначальных свойств.

Апробация работы

Исследования проводились в рамках плановых тем: «Изучение возможных путей распространения холеры на территории Сибири и Дальнего Востока и закономерностей циркуляции вибрионов эльтор в немых очагах» № ГР 01.9.60000200, инв. № 02.99.00 05736; «Экологические аспекты эпиднадзора за холерой на территории Сибири и Дальнего Востока» № ГР 01.20.0013861.

Материалы исследований докладывались на научных конференциях: Проблемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы» Межведомственного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории РФ (Ростов-на-Дону, 2000-2004 гг.); 4-ой Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней» (г. Саратов, 2003 г.); конференции с международным участием, посвященной 80-летию кафедры инфекционных болезней Иркутского Государственного медицинского университета (г. Иркутск, 2003 г.); а также на 3 научных конференциях Иркутского НИПЧИ. В виде тезисов или стендовых сообщений материалы диссертации представлялись на: Международной конференции «Инфекции, обусловленные иерсиниями (иерсиниоз, псевдотуберкулез), и другие актуальные инфекции» (г. Санкт-Петербург, 2000 г.); 1-й Всероссийской научно-практической конференции «Генная диагностика особо опасных инфекций» (г. Саратов, 2000 г.); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы обеспечения здоровья международных путешественников» (г. Улан-Удэ, 2001 г.); III конференции молодых ученых «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины» (г. Новосибирск, 2001 г.); 1 Международном Симпозиуме «Стресс и экстремальные состояния» (Кара-Даг, 2002 г.); юбилейной научно-практической конференции, посвященной 50-летшо Ставропольского НИПЧИ «Эпидемиологическая безопасность на Кавказе. Итоги и перспективы» (г. Ставрополь, 2002 г.); 4th Asia pacific travel health conference (Shanghai, P.R. China, 2002 г.); VTII Всероссийском съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (г. Москва, 2002 г.).

Материалы исследований отражены в одном заключительном отчете и 23 печатных работах, в том числе 2 в зарубежной печати.

ВЫВОДЫ:

1. Эпидемиологическая ситуация по холере в Сибири и на Дальнем Востоке характеризуется возникновением эпидемических вспышек или заносными случаями заболевания без укоренения инфекции. На отдельных территориях региона в период эпидемиологического благополучия в поверхностных водоемах наблюдается длительная циркуляция вибриона эльтор. На этом фоне возникают единичные случаи транзиторного вибриононосительства.

2. Метод определения эпидемической значимости холерного вибриона с применением холерных диагностических бактериофагов СТХ+ СТХ" и учетом гемолитической активности обладает высокой специфичностью в отношении культур периода эпидемических осложнений. Вместе с тем, сложность определения по этому тесту эпидемической опасности части штаммов в благополучный по холере период позволяет применять его лишь в качестве ориентировочного.

3. Разработанный вариант мультиплексной ПЦР позволяет оперативно с высокой чувствительностью и специфичностью определять наличие в геноме изолированных культур холерного вибриона основных детерминант вирулентности - генов холерного энтеротоксина (ctxAB), токсинкорегулируемых пилей адгезии (tcpA) и регулятора их экспрессии (toxR).

4. Во время эпидемических осложнений большинство штаммов холерного вибриона по комплексу фенотипических (чувствительность к СТХ фагам и гемолитическая активность) и генетических (наличие генов ctxAB, tcpA, toxR) тестов характеризуется как эпидемически опасные. При этом в составе их хромосомы присутствуют и все тестируемые «дополнительные» гены вирулентности. Эти данные позволяют судить о фенотипической и генетической однородности популяции эпидемически опасных штаммов.

5. При отсутствии эпидемических осложнений по холере в объектах окружающей среды региона и у транзиторных вибриононосителей обнаруживаются эпидемически неопасные по комплексу признаков изоляты вибриона. Все они лишены как основных (ctxAB, tcpA, toxR), так и «дополнительных» (zot, rstC) генов, непосредственно связанных с вирулентностью возбудителя. Однако, выявленная неоднородность некоторых изолятов по чувствительности к бактериофагам СТХ4" СТХ", гемолитической активности, а также присутствие в геноме значительного количества эпидемически неопасных культур генетических детерминант нейраминидазы - папН и белка наружной мембраны — ompU свидетельствует о характерной для эпидемиологического благополучия гетерогенности популяции штаммов.

6. Под воздействием неблагоприятных факторов среды обитания (в условиях эксперимента) холерный вибрион может переходить в некультивируемое состояние. При этом скорость подобного перехода у токсигенных штаммов выше, чем у нетоксигенных, что, вероятно, обусловлено их разными адаптационными способностями.

7. В некультивируемом состоянии у холерного вибриона происходит изменение морфологии клетки с сохранением его антигенных детерминант, исходных генов вирулентности, подвижности (на ранних этапах некультивируе-мости) и определенного уровня метаболической активности. При наступлении благоприятных для вибриона условий возможна реверсия его «молодых» некультивируемых форм в вегетативное состояние, что наблюдается более длительное время у эпидемически неопасных штаммов.

8. Выявление в поверхностных водоемах региона токсигенных культур вибриона строго ограничено периодом вспышек, что может быть связано как с генетическими модификациями возбудителя (утрата детерминант вирулентности) под влиянием природно-климатических условий, так и с меньшей способностью эпидемически опасных особей популяции (в сравнении с эпидемически неопасными) адаптироваться к условиям пребывания в объектах окружающей среды, быстрым переходом в некультивируемое состояние и коротким сроком возможной реверсии.

9. Применение молекулярпо-генетичееких методов исследования в комплексе с фенотипическими тестами для оценки патогенных свойств изолированных культур холерного вибриона позволяет объективно оценить эпидемиологическую ситуацию и определить дифференцированный объем необходимых профилактических и противоэпидемических мероприятий.

-----------------------XXX---------------------

В заключение выражаю благодарность директору института профессору Е.П. Голубинскому за предоставленную возможность выполнения диссертационной работы.

Признательна заместителю директора по научной работе доктору медицинских наук Т.Н. Иннокентьевой и ученому секретарю института кандидату медицинских наук А.Г. Трухиной за помощь в оформлении диссертации.

Искренняя признательность и благодарность заведующему эпидемиологическим отделом института профессору А.С. Марамовичу за консультативную помощь при выполнении эпидемиологического раздела работы.

Благодарю коллектив лаборатории холеры за помощь и поддержку на всех этапах выполнения работы. Признательна кандидату медицинских наук B.C. Ганину за консультации при проведении бактериологических исследований.

Благодарна заведующему отделом диагностических и профилактических МИБП кандидату медицинских наук Ю.В. Белобородову, кандидату биологических наук старшему научному сотруднику биохимического отдела Э.Е. Та-фелынтейну, сотрудникам патофизиологической лаборатории - кандидату медицинских наук С.Г. Саппо и научному сотруднику Ю.М. Капустину, с участием которых выполнялся раздел работы по получению и изучению некультиви-руемых форм холерного вибриона.

Выражаю искреннюю благодарность и признательность моим научным руководителям - доктору медицинских наук Л.Я. Урбанович, доктору медицинских наук С.В. Балахонову - за выбор направления исследований, теоретическое и практическое руководство на всех этапах работы.