Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Молекулярно-биологические характеристики мышиного перевиваемого миелопролиферативного заболевания

004'

На правах рукописи УДК612.119: 616.006.446

Бигильдеев Алексей Евгеньевич

Молекулярно-биологические характеристики мышиного перевиваемого миелопролиферативного заболевания.

14.01.21 - гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 3 СЕН 2010

Москва 2010

004609100

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр РАМН

Научный руководитель:

доктор биологических наук Нина Иосифовна Дризе. Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Борис Владимирович Афанасьев; доктор биологических наук Мария Андреевна Лагарькова.

Ведущее научное учреждение:

Учреждение Российской академии медицинских наук Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина РАМН.

Защита состоится «_»_2010 г. в_часов

на заседании диссертационного Совета Д 208.074.01 при Федеральном Государственном Учреждении Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии.

по адресу: 193024, Россия, г. Санкт-Петербург, 2-я Советская ул., д.16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального Государственного Учреждения Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии.

Автореферат разослан «__»_2010 года

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат медицинских наук

Т.В.Глазанова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Изучение свойств эмбриональных и взрослых стволовых клеток в настоящее время является наиболее интенсивно развивающейся областью биологии и медицины. Наличие во взрослом организме стволовых клеток, которые обладают высоким пролиферативным потенциалом и способны дифференцироваться во все виды клеток той или иной ткани, показано для кроветворной системы, скелета, кожи, кишечника, мозга и других систем. Было выдвинуто предположение, что не только нормальные ткани взрослого организма, по и опухоли тоже обладают стволовыми клетками. Открытие клоналыюстн лейкозов привело к возникновению понятия лейкозных стволовых клеток (JICK) - небольшой популяции клеток, которые производят основную массу опухолевых клеток и ответственны за длительное поддержание опухоли. Понимание концепции ЛСК, изучение их свойств и отличий от нормальных стволовых кроветворных клеток (СКК) привело к открытию и применению лекарственных препаратов, нацеленных на причину болезни, а не на её симптомы, к возникновению новых курсов химиотерапии, постоянному мониторингу минимальной остаточной болезни у больных, например, хроническим миелолейкозом (ХМЛ). Одним из специфических препаратов является ингибитор тирозиновых киназ STI 571, известный как Гливек (Имахиниб), который на сегодняшний день является терапией 1 линии при ХМЛ и приводит к 96% полных гематологических ответов у этих больных. К сожалению, этот препарат является не полностью специфичным и помимо активности сливного белка BCR-ABL, который является причиной ХМЛ, ингибирует и другие тирозиновые киназы, важные для нормального функционирования СКК. Результатом изучения отличий между ЛСК и СКК и специфических сигнальных каскадов, активированных в ЛСК, станет возникновение лекарственных средств, избирательно действующих на ЛСК.

Дальнейшее изучение ЛСК привело к гипотезе о том, что многие лейкозы организованы в иерархию клеток, аналогичную иерархии нормальных кроветворных клеток, на вершине которой находится ЛСК, способная к самоподдержанию и дифференцировке, ниже располагаются активно пролиферирующие и частично дифференцированные потомки ЛСК, а подножие составляют клетки основной массы опухоли, не способные к самоподцержанию.

Одним из главных инструментов для изучения нормальных СКК и ЛСК являются мышиные модели лейкозов. Широкое применение в изучении острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) получили иммунодефицит! lue NOD/SCID мыши. Серийные трансплантации человеческих клеток от больных ОМЛ таким мышам позволили, например, оценить концентрацию ЛСК в данном типе лейкозов. Для изучения ХМЛ активно используются

трансгенные мыши, в геном которых встроен гибридный ген, кодирующий ВСЯ-АВЬ. Отдельную проблему при изучении ЛСК составляет их низкая концентрация в общей популяции опухолевых клеток, которая может составлять всего 1 ЛСК на 2500000 клеток опухоли. Проводится специальный генный скрининг дня получения мышиных моделей различных гематологических заболеваний для изучения их ЛСК и подбора специфической для данного заболевания терапии.

Одна из таких моделей представлена и охарактеризована в данной работе. Согласно гипотезе В.Г. Савченко, трансформированные клетки, способные привести к лейкозу, находятся в КМ людей с рождения, но находятся в «дремлющем» состоянии. Лейкоз не возникает до тех пор, пока такая клетка не получит сигнал к пролиферации. Если стимулировать кроветворные клетки-предшественники к делению, то повышается вероятность того, что «дремлющая» трансформированная клетка войдет в клеточный цикл, что приведет к возникновению лейкоза. Эта гипотеза была проверена на мышах, которым в качестве стимулятора к пролиферации кроветворных предшественников использовали гранулоцитарный колоние-сшмулирующий фактор (Г-КСФ). У мышей после нескольких курсов введения Г-КСФ развились различные гематологические заболевания. В том числе у одной из них был обнаружен миелоидный лейкоз, который оказался перевиваемым, то есть заболевание можно было перенести сингенным реципиентам клетками костного мозга мышей, находившихся в терминальной фазе лейкоза Согласно международной классификации мышиных лейкозов, описанное заболевание характеризуется как подобный миелопролифератавному заболеванию лейкоз с элементами гистиоцитарной саркомы. При этом заболевании опухолевые клетки активно инвазируют печень и животные погибают очень быстро от острой печеночной недостаточности.

Цель работы:

Цель данной работы состояла в том, чтобы охарактеризовать полученный миелоидный лейкоз на клеточном и молекулярном уровне и выяснить возможный механизм произошедшей опухолевой трансформации, изучить свойства ЛСК данного заболевания и исследовать иерархию опухолевых клеток.

Задачи:

1. Выяснить, какие популяции клеток костного мозга способны переносить заболевание сингенным реципиентам.

2. Установить концентрацию ЛСК в различных популяциях клеток, переносящих заболевание.

3. Сравнить костный мозг больных и здоровых мышей и установить изменения, происходящие на клеточном и генетическом уровне.

4. Установить роль Г-КСФ в возникновении данного лейкоза

5. Проследить за динамикой заселения печени лейкозными клетками.

6. Получить популяцию, обогащенную ЛСК, и изучить их свойства, анализируя экспрессию генов.

Научная новизна:

Показано, что ЛСК содержатся в популяции, несущей как маркеры ранних кроветворных предшественников, так и монопотентных клеток-предшественников. Установлено, что лейкоз организован в иерархию, которая подобна иерархии нормальных кроветворных клеток, однако, способность к самоподдержанию и переносу заболевания сохраняется на каждой ступени иерарх™ опухолевых клеток. Этот результат позволяет объединить две существующие на данный момент концепции организации лейкозов - иерархическую и стохастическую. Обнаружено, что микроокруженис печени способно поддерживать пролиферацию ЛСК, что позволяет утверждать существование ниш, поддерживающих кроветворение в печени, не утраченных и после окончания эмбрионального кроветворения в этом органе. Показано, что одним из компонентов этих ниш являются хемокины, секретируемые печенью, и их рецепторы на поверхности опухолевых клеток. Удалось выделить популяцию клеток, обогащенную ЛСК, и установить гены, экспрессия которых повышена в ЛСК. Показано, что многие факторы транскрипции принимают участие в возникновении данного лейкоза. Установлено, что в ЛСК активирован сигнальный путь М*1-кВ, что может способствовать удержанию ЛСК в кроветворных нишах печени. В целом, обнаружены новые свойства ЛСК.

Научно-практическое значение работы:

Результаты исследований могут быть использованы в экспериментальной гематологии. Использование охарактеризованной модели может привести к лучшему пониманию клеточной организации гемобластозов, механизмов инвазии лейкозными клетками экстрамедулляриых территорий и к разработке препаратов, препятствующих распространению опухоли. Данная модель может служить инструментом для изучения свойств ЛСК и поиска их отличий от нормальных СКК, что имеет значение для мониторинга и предотвращения рецидивов лейкозов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Изучаемое гемагопролиферативное заболевание переносится лейкозными стволовыми клетками (JTCK), организованными в иерархию, на вершине которой находятся ранние мультипотентные предшественники. Клетки, находящиеся на более низких ступенях иерархии, с дифференцировочными маркерами коммитированных предшественников сохраняют свойства ЛСК и могут переносить заболевание при пассировании in vivo.

2. Основная масса опухолевых клеток инвазирует печень. По мере развития заболевания в печени нарастает количество CD45 положительных клеток, что приводит к гибели животных от печеночной недостаточности.

3. Заселение опухолевыми клетками печени может быть обусловлено повышенной экспрессией на них рецепторов к некоторым хемокинам, секретируемым клетками печени, а также способностью опухолевых клеток использовать сгромальное микроокружение печени в качестве «ниш» для ЛСК.

4. В опухолевых клетках значительно увеличена экспрессия онкогенов, генов, отвечающих за самоподдержание, пролиферацию, адгезию клеток к субстрату. Активированы многие факторы транскрипции, в том числе сигнальные пути NF-kB и Runx 1, связанные с опухолевой трансформацией.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ.

Апробация работы

Диссертационная работа апробирована 31 мая 2010 года на заседании проблемной комиссии «Гемопоэз, молекулярная биология, биотехнология, иммуногемагология; гемобластозы и депрессии кроветворения» Учреждения Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр РАМН.

Материалы работы были представлены на следующих конференциях и симпозиумах:

1. "Alterations in gene expression in murine leukemia cells developed after G-CSF treatement." 11th Congress of the European Hematology Association, Amsterdam, The Netherlands, June, 2006.

2. "Analysis of gene expression pattern in bone marrow and liver of mice developed myeloproliferative disease after long-term G-CSF treatement." 12th Congress of the European Hematology Association, Vienna, Austria, June 7-10,2007.

3. . Characteriazation of gene expression in malignant hematopoietic cells invading the liver of mice developed transplantable myeloproliferative disease. 36th Annual Scientific Meeting of ISEH International Society for Hematology and Stem Cells, Hamburg, Germany, September 28-30,2007.

4. "Dynamics of leukemia development on murine model of myeloproliferative disorder. Mechanisms of early differentiation: embryogenesis, myogenesis and

hematopoiesis/lymphopoiesis", Summer School of Mechanisms of Early Differentiation, Barsinghausen, Germany, September 1-5,2008.

5. "Murine myeloproliferative disorder with liver lesion: characteristics of leukemia stem cells and phenotype of cells invaded livei." 14th Congress of the European Hematology Association, Berlin, Germany, June 12-15,2009.

6. "Characteristics of leukemia stem cells in murine myeloproliferative disorder with liver lesion." 38th Annual Scientific Meeting of ISEH International Society for Hematology and Stem Cells, Athens, Greece, September 9-12,2009.

7. "Leukemia stem cells (LSCs) invading liver in the murine MPD-like myeloid leukemia with liver lesion: Molecular characteristics." I5th Congress of the European Hematology Association, Berlin, Germany, June 12-15,2009.

8. "The dynamics of the formation of extranodal leukemia metastasis in the liver leading to acute liver failure in mice." Congress of International Society for Cellular Oncology, Dresden, Germany, March 17-19,2010.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, собственных результатов, обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы и двух приложений. Материалы диссертации изложены на 180 страницах машинописного текста и включают 31 рисунок, 20 таблиц и список литературы из 352 источников.

Личный вклад автора

Автором лично выполнены эксперименты по исследованию экспрессии генов в КМ и печени больных животных, эксперименты по исследованию динамики заселения печени опухолевыми клетками, включавшие в себя сортировку клеток и изучение экспрессии генов. Проведена обработка данных, статистический анализ, обобщение результатов исследований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Обзор литературы

Обзор литературы посвящен модельным системам in vivo изучения лейкозов, описанию свойств ЛСК и возможных клеточных источников ЛСК. Описаны свойства Г-КСФ и клинические аспекты применения этого ростового фактора. Кроме того, охарактеризованы свойства и функции генов, нарушения в экспрессии которых были обнаружены в изучаемом заболевании. Отдельное внимание уделено факторам транскрипции, поверхностным антигенам и хемокинам, как возможному компоненту ниш, поддерживающих ЛСК в печени.

Материалы и методы

В работе использовали полученный ранее в лаборатории физиологии кроветворения ГНЦ РАМН перевиваемый мышиный лейкоз. Изначально этот лейкоз был получен после

нескольких курсов введения Г-КСФ мышам-гибридам первого поколения линии (CBAxC57Bl/6)Fl. Согласно международной классификации мышиных лейкозов это заболевание характеризовали как подобный миелопролиферативному заболеванию миелоидоый лейкоз с элементами гисгиоцигарной саркомы. Клетки костного мозга (КМ) и печени заболевшего животного способны при внутривенном введении сингенным реципиентам привести к развитию аналогичного лейкоза и гибели животных в течение 13-55 дней. У всех больных животных увеличена печень (вес 3,1 ± 0,7 г против 1,4 + 0,1 г у здоровых) и селезенка (вес 215 ± 73 мг против 93 ± 2 мг у здоровых). На настоящий момент заболевание было последовательно перенесено сингенным здоровым реципиентам клетками КМ или печени более 10 раз.

Окрашивание и анализ гистологических препаратов печени, селезенки, костного мозга и мазков периферической крови производили по стандартной методике. Для приготовления гистологических срезов печени и селезенки ткань фиксировали в растворе Буэна и заливали в парафин по стандартной методике.

Клетки КМ выделяли из бедер и голеней животных, промывая полость костей фосфатным буфером, а затем гомогенизировали клетки, пропуская через нейлоновое сто с размером пор 40 мкм, после чего проводили лизис эритроцитов с помощью гипотонического раствора. Клетки печени выделяли, вырезая небольшой кусочек ткани и растирая его в ручном гомогенизаторе. Полученную суспензию клеток протирали через нейлоновое сито, как и КМ.

Количество кроветворных клеток-предшественников анализировали с помощью функциональных тестов, таких как подсчет колониеобразующих единиц в культуре (КОЕк) в полужидкой среде и подсчет колониеобразующих единиц в селезенке (КОЕс) в летально облученных мышах.

Поверхностный фенотип клеток КМ и печени больных и здоровых мышей анализировали с помощью проточной цитофлуориметрии (FASC). Исследуемые образцы инкубировали с крысиными антителами против CD45, CDllb (Мас-1 альфа-цепь), Ly-6D (Мас-3), CD117 (c-kit), CD135 (FIG) (BD Pharmingen), а затем клетки окрашивали вторыми антителами, конъюгированными с флюоресцеин изотиоцианатом (FITC) - goat-anti-rat-FITC conjugated IgG/IgM (BD Pharmingen). Кроме этого клетки были напрямую окрашены F1TC-коньюгированными антителами против CD3 (hamstei-anti-mouse-IgGl, FITC conjugated, BD Pharmingen). Уровень неспецифического связывания учитывали с помощью изотопического контроля, для этого исследуемые клетки инкубировали с тотальной фракцией крысиных иммуноглобулинов (все изотипы). Для оценки жизнеспособности анализируемых клеток использовали 7-аминоакгиномицин Д (7AAD, Sigma). Анализ клеток производился на

приборе FACSCalibur (BD Biosciences), полученные результаты были обработаны в программах WinMDI v.2.8 (© Joseph Trotter) и FlowJo v.7.2.4 (Tree Star Inc.).

Для того чтобы охарактеризовать J1CK опухоли, клетей КМ мышей в терминальной фазе заболевания были отсортированы при помощи системы магнитной сепарации Miltenyi Biotec® MACS®, в которой применяли антитела, коныогированные с парамагнитными наночастицами. Отсортированные популяции клеток с фенотипом c-Kit"CD45", c-Kit+, c-Kit" CD45+, Tcrl 19+, Terl 19' вводили внугрнвенно сингенным реципиентам по 106 клеток/мышь (c-Kit+ вводили по 105 клеток/мышь). Для того чтобы подсчитать концентрацию клеток, инициирующих лейкоз, c-Kit+ клетки КМ и несортированные клетки печени больных животных были введены внутривенно в лимитирующих разведениях (концентрации 100 ООО; 20 ООО; 4 ООО; 800; 160 клеток/мышь и 106; 105; 104; 103; 100; 10; 1 клеток/мышь соответственно). Для этого клетки ресуспендировали в среде RPMI 1640 (ICN) и вводили клетки внутривенно в объёме 0,5 мл среды. В каждой группе было по 10 мышей-реципиентов, за исключением группы, которой вводили по 1 клетке печени больных животных, - в этой группе было 20 реципиентов. Время между делениями ЛСК (to) вычисляли, исходя из экспериментально установленных концентраций ЛСК в популяциях с-Kit+ клеток КМ и клеток несортированной печени больных животных, а также из продолжительности жизни животных-реципиентов в этих группах по формуле:

lg

~ïg2 ""

где ti - время жизни реципиентов в группе, получившей c-Kit+ клетки, fc - время жизни реципиентов в группе, получившей несортированные клетки печени, 3,3 - поправка на разное количество клеток, введенных реципиентам.

Выделяли РНК из клеток по стандартному протоколу, используя тиоцианат гуанидина.

Оценку качества выделенной РНК проводили с помощью электрофореза РНК в

денатурирующих условиях, по соотношению интенсивностей полос 28S и 18S рибосомной

РЖ и по отсутствию следов деградации. Для построения первых цепей кДНК по матрице

РНК поли-Т праймеры или набор случайных нуклеотидных гексамеров гибридизовали с РНК

и осуществляли синтез цепи кДНК с помощью обратной транскрштгазы M-MLV (Promega).

Экспрессию генов анализировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и ПЦР в

режиме реального времени. Разделение ПЦР продуктов проводили методом электрофореза в

агарозном геле. Полуколичесгвенную оценку относительного уровня экспрессии генов

проводили, сравнивая яркость свечения полосы амплификата в ультрафиолетовом свете в

опытном и контрольном образце с помощью программы GelPro4.0. Для нормализации

количества кДНК при исследовании экспрессии генов в КМ больных и здоровых мышей в

9

(и

качестве референсных использовали гены «домашнего хозяйства», кодирующие HPRT1, RPL13A, UBC, GAPDH. Нормализацию проводили, деля относительной уровень экспрессии каждого гена на фактор нормализации, вычисленный как среднее арифметическое из относительных уровней экспрессии референсных генов. Экспрессию генов изучали и с помощью ПЦР в режиме реального времени. Относительный уровень экспрессии генов вычисляли по методу AACt. В случае КМ в качестве референсных генов служили Hprtl, Rp!13a, Übe, Gapdh. При исследовании экспрессии генов в печени с помощью ПЦР-аррея (с SYBR Green) в качестве референсных генов были выбраны 10 генов: Hspbl, Etsl, Csfl, Fnl, Gadd45a, HdacT, Jagl, Kit, Notch4. Фактор нормализации вычисляли как среднее геометрическое относительного уровня экспрессии этих генов. Секвенирование по Сэнгеру отдельных генов проводили по стандартной методике.

Для того чтобы проследить за динамикой развития заболевания, 24 самкам мышей-гибридов (С57В1/6 х СВА) Fl в хвостовую вену вводили 106 клеток КМ от сингенных животных, находившихся на терминальной стадии болезни. Каждые сутки после введения клеток двух мышей забивали, выделенные печень и селезенку взвешивали, делали гистологические срезы печени, сортировали клетки печени на CD45+ и CD45- популяции с помощью системы магнитной сепарации Miltenyi Biotec® MACS®. Подсчитывали процент CD45+ клеток в печени, из отсортированных клеток выделяли РНК и исследовали экспрессию генов с помощью традиционного ПЦР и ПЦР в режиме реального времени. Для одновременного анализа нескольких десятков генов использовали наборы RT2 Profiler™ PCR Array «Signal Transduction Pathway Finden) или «Mouse Hematopoietic Stem Cells and Hematopoesis» (SABiosciences).

Статистический анализ проводили по /-критерию Стыодента.

Результаты работы

Исследуемое заболевание развивается стремительно. Клетки КМ и печени заболевшего животного способны при внутривенном введении сингенным реципиентам привести к развитию аналогичного лейкоза и гибели животных в течение 13-55 дней. Средний вес печени (по многим экспериментам) к концу болезни составляет ЗД6 ± 0,71 г, а селезенки -215 ± 73 мг против 93 ± 2 мг у здоровых. Часто поверхность печени покрыта белесыми бляшками, видны точечные геморрагии.

Поскольку заболевание переносится сингенным реципиентам трансплантацией 106 клеток КМ мышей, находящихся на терминальной стадии заболевания, в КМ больных мышей содержатся ЛСК. Для того чтобы охарактеризовать поверхностный фенотип ЛСК опухоли, клетки КМ мышей в терминальной фазе заболевания были отсортированы при помощи системы магнитной сепарации по различным маркерам и введены внутривенно сингенным

реципиентам (Ю6 клеток/мышь). Вводили следующие фракции клеток: с-Кй"СЕ)45", с-К]1+ (105 клеток/мышь), с-0"СШ5+, Тег119+, Тег119" (рис.1).

Рис.1. Кривые выживания животных после введения отсортированных популяций клеток КМ от больных доноров. По оси абсцисс - время, дни (за 0 принят день введения клеток). По оси ординат-доля выживших животных.

1.0 0,8 .0.6 0.4 0.2 О.О

Введение каждой из отсортированных популяций клеток привело к гибели всех реципиентов в различные сроки. Основная масса мышей погибла в течение 20 дней после введения опухолевых клеток (табл.1).

Таблица 1. Средняя продолжительность жизни реципиентов после введения различных клеточных популяций и вычисленная концентрация ИСК во введенных популяциях.

Продолжительностъ жизни животных, дни Концентрация ЛСК (1 ЛСК на...клеток)

с-ки-СЕИ5+ 15,4 ±0,3 200

Несортированный КМ 17,0 ±0,1 1200

Тег119- 17,7 ±3,9 . 2 600

Тег119+ 18,2 ±0,4 4 500

с-кИ+ 22,2 ±3,2 37 000

с-кй-С1345- 23,9 ±4,1 2 500 000

В данной модели лейкоза ЛСК присутствуют во всех проанализированных популяциях клеток костного мозга (с-кй."СВ45', с-кк+, с-кк'С045+, Тег119+, Тег119"). Более того, время, необходимое для развитая заболевания, убывает от с-кй"СШ5" до с-кЙ"С1М5+ клеточной популяции, т.е. от менее дифференцированных к более дифференцированным клеткам.

Для того чтобы установить концентрацию ЛСК в КМ и печени больных животных, был поставлен эксперимент, в котором несортированные клетки печени и с-кк+ клетки КМ больных животных были введены внутривенно сингенным реципиентам в лимитирующих разведениях. Динамика гибели реципиентов представлена на рис. 2.

I .:

■ С-кй+

......

: д- - - . 1 • -

•« 1 Т«г119+

* о- т«те-

Г ^;Неео(пфованный мдегныймоаг '

I т

ч

Г

0 4 в 12 18 20 24 23 32 40 44 49 52

Рис.2. Кривые выживания животных после введения с-кк+ клеток КМ от больных доноров в лимитирующих разведениях. По оси абсцисс - время, дни (за 0 принят день введения клеток). По оси ординат-доля выживших животных.

Наблюдая за количеством умерших от развившегося лейкоза животных в каждой группе, с помощью статистики Пуассона определили концентрацию ИСК в с-кк+ клетках КМ. Оказалось, что 1 ЛСК приходится на 37000 с-кН+ клеток КМ. Зная среднюю продолжительность жизни при введении различных популяций КМ, количество введенных клеток, и сделав некоторые предположения, удалось теоретически оценить скорость деления опухолевых клеток. Сделанные расчеты свидетельствуют о том, что на 1 деление опухолевые клетки затрачивают всего 15 часов. Также удалось теоретически оценить концентрацию ЛСК во всех введенных популяциях введенных клеток (табл. 1).

Концентрация ЛСК в КМ терминально больных мышей оказалась невысокой и составила 1 ЛСК на 1200 клеток КМ. Концентрация ЛСК в КМ больных мышей больше в тех популяциях клеток, которые соответствуют более дифференцированным кроветворным клеткам-предшественникам и концентрация ЛСК минимальна в популяциях, соответствующих ранним кроветворным клеткам-предшественникам и СКК. В связи с невысокой концентрацией ЛСК в КМ больных мышей, тщательное исследование КМ больных мышей с помощью других методов не выявили существенных отличий между КМ больных и здоровых животных.

Анализ поздних отго-монопотентых кроветворных предшественников, КОЕк, и более ранних, полипотенгных предшественников - 8-днсвных КОЕс проводили на 8, 14 и 18 день (только КОЕк) после введениям мышам 106 клеток КМ терминально больных мышей. В концентрации КОЕк и КОЕс не было выявлено существенных отличий в опытной и контрольной группах (Табл. 2).

Таблица 2. Анализ кроветворных клеток-предшественников в КМ мышей после введения клеток КМ терминально больных животных.

Группа животных Концентрация КОЕк (на 103 клеток КМ) Концентрация КОЕс (на 103 клеток КМ)

день после введения лейкозных клеток

8-й 14-й 18-й 8-й 14-й

Опытная 56 ±10 39 ±5 62 ± 9 11,3 ±3,0 13,3 ±3,0

Контрольная 57 ±6 28 ±5 - 15,3 ±3,8 6,8 ±0,5

Качественный состав КОЕс в КМ контрольных и подопытных животных на 8-е и 14-е сутки после введения клеток опухолевого КМ различался, но незначительно. Через 8 дней после инъекции опухолевых клеток процентное содержание колоний каждого типа не отличалось от такового в контрольной группе, за исключением гранулоцитарных колоний, процент которых оказался в 2 раза снижен по отношению к контролю (р < 0,02). На 14-е сутки относительное содержание гранулоцитарных колоний не отличалось от ко!проля, и единственное статистически значимое различие состава КОЕ-с от контрольных показателей состояло в отсутствии мсгакариоцитарных колоний.

Таким образом, показано, что даже к терминальной стадии заболевания на уровне поздних кроветворных предшественников не происходит существенных изменений в КМ.

С помощью ПЦР в КМ терминально больных мышей была проанализирована экспрессия 30 генов. В результате оказалось, что из них, экспрессия только семи {Мус, Мро, Сак, П1г2, А1р5Ь, Мсф (С$/1г), Са/(Сф)) достоверно повышена в клетках КМ больных животных, и только у 4 экспрессия оказалась повышена более чем в 2 раза по сравнению с клетками КМ здоровых животных. Этими генами являются Мус, Мро, Скк и 111г2 (Табл. 3). Таблица 3. Сравнение экспрессии генов, выявленных при вычитающей гибридизации, в клетках КМ терминально больных и здоровых животных.

Название гена Относительный уровень экспрессии в клетках КМ больных мышей Название гена Относительный уровень экспрессии в клетках КМ больных мышей

МУС 3,4 ±«.9 С50 2,1 ±0,6

111 г2 3,6 ± 0.3 СзОг 0,4 ±0.1

««к 7,1 ± 0.7 Схсг4 0,7 ±0,1

Моо 3.5 ±1.2 81аО 1.0 ±0.1

СэПг 2,2 ±0.2 51а15а 0,9 ±0.1

Ай>5Ь 1.5 ±0.2 Впн1 1,2 ±0,1

Ген Мус является онкогеном, активация экспрессии или увеличение стабильности продукта которого (например, в лимфоме Беркита) приводит к повышенной пролиферации клеток. Повышенная экспрессия или амплификация гена Мус часто ассоциируется с

возникновением миелопролиферативных заболеваний. Повышенная экспрессия гена Мро, с одной стороны, наблюдается в зонах воспаления и приводит к увеличению антибактериальной активности гранулоцитов. С другой стороны, повышенный уровень Мро в КМ термиально больных животных может свидетельствовать об увеличении доли гранулоцитов. Ген Сй£ кодирует лизосомный фермент цистеиновую протеазу, которая участвует в деградации белков внеклеточного матрикса. Повышенный уровень экспрессии С/лАг, как и других цистеиновых протеаз, часто связывают с увеличенной способностью опухолевых клеток к разрыву связей с микроокружением и шшазии. Из генов, кодирующих поверхностные молекулы клетки, увеличена экспрессия рецептора II типа интерлейкина 1 (1Ь1) и рецептора макрофагального колоние-стимулирующего фактора (М-КСФ). Рецептор 1ЫН2 связывает 11Л конкурентно с рецептором I типа, но не передает сигнал от 1Ь1 внутрь клетки, подавляя возникновение неспецифического иммунного ответа.

Полученные результаты сравнения экспрессии генов с помощью ПЦР свидетельствуют о том, что даже к терминальной стадии заболевания в КМ не происходят сильные изменения в профиле экспрессии генов. Однако, учитывая невысокую концентрацию ЛСК в КМ больных мышей, даже незначительное, но достоверное увеличение экспрессии генов Мус, Мро, С1$к и П1г2 говорит об их важной роли в развитии данного лейкоза.

Несмотря на отсутствие угнетения кроветворения в КМ, у больных мышей наблюдались изменения в периферической крови (ПК). Мазки ПК делали на 8,14 и 18 сутки после введения 0,5 х 106 клеток КМ терминально больных мышей (5-ой ретрансплантации исходного лейкоза). Анализ формулы крови в этом эксперименте показал, что у мышей, доживших до 18-х суток, количество лейкоцитов увеличивается до (19,2 ± 2,0) х 106/мл к терминальной стадии и достоверно превышает количество лейкоцитов в ПК животных контрольной группы (13,4 ± 0,7) х 106/мл. В контрольной группе мышей доля зрелых гранулоцитов была постоянна и составляла 20 ± 5% всех лейкоцитов крови, в опытной группе происходило постепенное увеличение доли гранулоцитов. К 18-м суткам после введения клеток они составляли 47 ± 6% от общего числа ядерных клеток (Рис.3).

Кроме увеличения доли гранулоцитов было замечено, что уже на 8-е сутки в ПК появляются нетипичные клетки, охарактеризованные как бласгоподобные макрофаги с большим объемом цитоплазмы, вакуолями и увеличенным, часто 2-3-дольчатым ядром и атипичные миелобласты размером, сравнимым с крупными лимфоцитами, с базофильной цитоплазмой с редкой вакуолизацией. Зернистость цитоплазмы просматривается плохо. Ядро таких клеток крупное, с нежной сгрупурой хроматина, незрелое, свойственное миелобласгам. Античность выражена в различной степени дольчатости ядер. На 14-е сутки концентрация таких клеток достигает максимума и составляет 8 ± 2% всех лейкоцитов. Кроме того, на 14-е сутки выявляется еще один вид атипичных клеток. Это клетки, имеющие

вытянутую форму, серо-голубую однородную цитоплазму, большое, слегка вытянутое ядро, гомогенное по окраске. На 18-е сутки ни атипичные миелобласты, ни клетки вытянутой формы обнаружить в ПК не удается, но вместо них появляются так называемые бластные клетки. Это большие клетки с серо-голубой тонкопетлисгой цитоплазмой с очень рыхлой структурой. Ядро большое, светлое, нежной окраски. В ядре можно определить несколько ядрышек с более темной, плотной окраской. В большинстве таких клеток обнаруживается мелкодисперсная вакуолизация.

Рис.3. Динамика изменения доли зрелых гранулоцитов в ПК и появление атипичных клеток в ПК. «С+П» - сегментоядерные и палочкоядерные гранулоциты, «аМБ» - атипичные миелобласты, «АВК» - атипичные вытянутые клетки, «бласты» - бластные клетки.

Содержание различных популяций клеток периферической крови по мере развития заболевания

группы животных/время после введения клеток

Можно предположить, что наличие различных типов атипичных клеток в ПК в разное время свидетельствует о различных этапах развития изучаемого заболевания: переходная стадия характеризуется наличием в крови атипичных миелобластов и клеток вытянутой формы, а терминальная стадия - наличием бластных клеток.

Вероятно, источником атипичных клеток в ПК может служить печень больных мышей. Как уже было отмечено, лейкоз можно трансплантировать сингенным реципиентам, введя им клетки печени от больных мышей, то сстъ в печени присутствуют ЛСК изучаемого лейкоза. Для того чтобы установить концентрацию ЛСК в печени больных животных, несортированные клетки печени больных животных были введены внутривенно сингенным реципиентам в лимитирующих разведениях с шагом 10, начиная от 106 клеток/мышь, заканчивая 1 клеткой/мышь (Рис. 4).

Рис.4. Кривые выживания животных после введения клеток печени в лимитирующих разведениях от больных, находящихся в терминальной стадии животных. По оси абсцисс -время, дни (за 0 принят день введения клеток). По оси ординат - доля выживших животных. 1,0

0.8

о,s

0.4

0.2 0,0

Зная количество выживших мышей в каждой груше и количество введенных клеток, с помощью статистики Пуассона вычислили концентрацию ЛСК в печени больных мышей. Она оказалась на 2 порядка больше, чем в КМ, и составила 1 ЛСК на 45 клеток печени. Такая высокая концентрация ЛСК говорит о том, что печень является более предпочтительным местом локализации опухоли, чем КМ. Это дало реальную возможность выделигь популяцшо, максимально обогащенную лейкозными клетками, и изучать на молекулярном уровне их свойства, возможные причины возникновения данного лейкоза, динамику развития заболевания и вероятные механизмы заселения опухолевыми клетками печени.

Для того чтобы охарактеризовать опухолевые клетки, заселяющие печень в исследуемом заболевании, клетки го печени терминально больных и здоровых животаых были проанализированы при помощи проточной цитофлуориметрии (FACS). Клетки были окрашены антителами против поверхностных антигенов, которые экспрессируются в разных популяциях кроветворных клеток: CD45, CDllb (Мас-1 альфа-цепь), Ly-6D (Мас-3), CD117 (c-kit), CD135 (Flt3), CD3 (Табл.4).

Таблица 4. Процент положительных на различные поверхностные маркеры живых клеток в печени опытных и контрольных животных.

Больная печень Здоровая печень

CD45 29.2 ±5.2 1.2 ±0.2

CD3 2.0 ±0.8 0.3 ±0.1

c-kit 5.1 ± 1.2 0.1 ±0.1

CD135 4.3 ±1.9 0.1 ±0.1

МасЗ 6.1 ± 1.5 1.0 ±0.3

Macl 9.2 ±1.8 0.0 ±0.0

Среди клеток больной печени обнаружены все исследованные поверхностные маркеры, хотя и в небольшом количестве. Достоверные различия (Р < 0,05) между клетками здоровой и больной печени наблюдались среди CD45+, c-kit+ и Macl+ клеток. Можно утверждать, что

II

ь

-et-16» 109 Ч -С* 40» -О- 20 Ml ' -ôi 1« « К)

I I

0 20 40 СО 00 100 120 140 160 ISO 200

печень больных животных заселена кроветворными опухолевыми клетками, представляющими собой гетерогенную популяцию, в которой присутствуют как клетки, несущие на своей поверхности маркеры ранних кроветворных предшественников, так и зрелых дифференцированных клеток. Можно утверждать, что большинство лейкозных клеток несет на своей поверхности МасЗ и/или Macl, то есть является аналогом нормальных дифференцированных гранулоцитов и макрофагов.

Дня изучения генетических причин развития лейкоза исследовали экспрессию генов в CD45+ клетках, выделенных из печени мышей, которые находились на терминальной стадии болезни. Сравнение производили с экспрессией генов в CD45+ клетках, выделенных из печени контрольных животных. Было обнаружено, что в опухолевых клетках увеличена экспрессия многих генов, выполняющих различные функции, что говорит о значительной перестройке генетической программы, осуществляемой в этих клетках. В пользу этого свидетельствует увеличение экспрессии таких генов, как гистоновые деацетилазы Шас9, -4, -5 в 48,17 и 8 раз, соответственно.

О существенных нарушениях говорит увеличение экспрессии большого количества факторов транскрипции, играющих важную роль при дифференцировке кроветворных клеток, например генов СеЪрЬ и СеЬрг в 77 и 10 раз, соответственно, а также генов, регулирующих пролиферацию клеток, например Мус - в 25 раз. Также увеличена экспрессия факторов транскрипции семейства STAT, которые активируют экспрессию генов в ответ на связывание лигандов с рецепторами на поверхности клетки. Экспрессия гена р53, регулирующего апоптоз и активируемого в ответ на повреждение ДНК, увеличена в 53 раза Следует отметить увеличение экспрессии факторов транскрипции Rurtxl, Cbjb, Etv6, Vav!, Lmo2, Jun, Fos и других в 45, 51, 84, 69,24, 4 и 7 раз, соответственно. Поскольку некоторые из них необходимы для нормального кроветворения или являются онкосупрессорами, а другие являются онкогенами, активация экспрессии каждого из которых способна привести к трансформации клеток, можно предполагать одновременное осуществление, как генетических программ опухолевых клеток, так и компенсаторных механизмов защиты от трансформации.

Особое место среди факторов транскрипции занимает NF-KappaB. Во-первых, в CD45+ клетках печени больных мышей в 10 раз увеличена экспрессия Illa, который является одним из самых сильных активаторов NF-KappaB. Во-вторых, увеличена экспрессия гена Jkbkb, продукт которого активирует NF-KappaB. В то же время, наши результаты показывают, что увеличена экспрессия многих генов-мишеней NF-KappaB, а именно генов Ccndl (циклин D1), молекул адгезии Vcaml и Icaml, а также факторов транскрипции Мус и р53. Недавно было показано, что сигнальный путь NF-KappaB активирован в JICK, но не в СКК Наши

данные показывают, что в исследуемом лейкозе NF-KappaB действительно активирован в ЛСК.

Вероятно, как результат одновременной активации многих факторов транскрипции в десятки раз увеличивается экспрессия генов «домашнего хозяйства», генов, участвующих в различных сигнальных путях, и регулирующих такие жизненно важные процессы, как апоптоз и клеточный цикл.

Важные характеристики опухолевых клеток можно получить из анализа изменений в экспрессии поверхностных маркеров. Показано, что в CD45+ клетках печени больных мышей увеличена экспрессия нескольких генов кластера дифференцировки, а именно Cd45, Cdl4, Cd80, Cd86, Cdl64, Cd4 и CdSa в 28, 57, 4, 55, 20, 4 и 7 раз, соответственно. Также в этих клетках повышена экспрессия генов, кодирующих молекулы адгезии Cd44, Vcaml, leami, - в 46,7 и 5 раз, соответственно.

Отдельно стоит обсудить экспрессию хемокинов и их рецепторов в печени. Известно, что печень в норме секретирует ряд хемокинов, которые являются хемоатграктантами для различных популяций лейкоцитов. Нами было показано, что в CD45+ клетках печени терминально больных животных увеличена экспрессия хемокинов Ccl2 (Monocyte chemotactic protein 1 ,Mcpl) и Cxcl4 (PJ4) в 37 и 268 раз, соответственно.

Platelet factor 4 (P/4, Схс14) экспрессируеггся в созревающих мегакариоцитах и продукт этого гена упаковывается в альфа-гранулы тромбоцитов. Р/4 секретируется тромбоцитами в ответ на их активацию и связывает гепарин, что способствует коагуляции. Известно, что СхсМ является сильным хемоаттрактантам для нейтрофилов и моноцитов. Это свидетельствует о наличии среди CD45+ клеток больной печени мегакариоцитов и их предшественников, что является патологией, и возможно эти клетки принадлежат иерархии опухолевой популяции, свидетельствуя о том, что неопластическая трансформация произошла на уровне раннего (мультипотентного) кроветворного предшественника. С другой стороны, известно, что коагуляция способствует метаеггазированизо, особенно при адгезии опухолевых клеток к сосудистому эндотелию. Учитывая густую сеть сосудов в печени, можно предположить, что этот фактор играет важную роль в удержании основной массы опухоли в печени. Помимо прочего, Pf4 может способствовать постоянной локализации лейхозных клеток в печени за счет хемотаксиса.

Сс12 является хемокином, который вызывает хемотаксис моноцитов. Т.о., учитывая тот факт, что экспрессия этого гена активируется фактором транскрипции NF-KappaB, а также, принимая во внимание увеличение экспрессии рецептора этого хемокина Ссг2 в несортированных клетках печени терминально больных животных, можно утверждать, что пара Сс12-Ссг2 играет важную роль в привлечении опухолевых клеток в печень.

Однако хемокины экспрессируются печенью и в нормальных условиях, и это не приводит к массовому накоплению кроветворных клеток в паренхиме органа, но лишь регулирует то небольшое количество макрофагов и Т-клеток, которое постоянно присутствует в печени. Поэтому увеличение экспрессии рецепторов к хемокинам, секрстируемых в печени, на поверхности опухолевых клеток может способствовать их (клеток) адгезии на поверхности сосудистого эндотелия, выстилающего стенки печеночных капилляров и синусоидов и инвазии опухолевых клеток в паренхиму печени. С помощью традиционного ПЦР нами было показано, что в клетках печени терминально больных мышей экспрессируются рецепторы хемокинов, секретируемых печенью Ссг1-Ссг5, Схсг4. Больше других экспрессированы гены Ссг1, Ссг2 и Ссг5. Показано, что в популяции С045+ клеток печени больных мышей экспрессия Ссг1 увеличена в 149 раз, что говорит о важной роли этого рецептора для опухолевых клеток в печени. Поскольку продукты генов Ссг1, Ссг2 и Ссг5 являются рецепторами хемокинов МСР-1 (СсП), М1Р1а (Сс!3), М1Р1Ь (Сс!4), ИАМТЕБ (Сс15), то именно эти хемокины шрают роль в первоначальном задержании опухолевых клеток в синусоидах печени. Полученные результаты позволяют оценить природу опухолевых клеток, т.к. МСР1, М1Р1а и КАЫТЕБ, хоть и являются хемоатграктантами для различных популяций лейкоцитов, но в первую очередь привлекают моноцита. Так, процент МасЗ положительных клеток увеличивается в 6 раз по сравнению с контрольной тканью, а клетки, несущие маркер Мас1, отсутствующие в клетках контрольной печени, составляют 9% от всех клеток больной печени.

Вероятно, специфический набор хемокинов, секретируемых клетками печени, и экспрессированных на поверхности сосудистого эндотелия печени является элементом кроветворного микроокружения печени и входит в состав сосудистых кроветворных ниш печени. Активация рецепторов к этим хемокинам в лейкозных клетках способствует их локализации в этих нишах и последующей пролиферации в шк.

Для того чтобы проследить за динамикой заселения печени опухолевыми клетками, был поставлен эксперимент, в котором мышам в хвостовую вену вводили 106 клеток КМ от сингенных доноров, находившихся на терминальной стадии болезни. Каждые сутки после введения клеток двух мышей усыпляли, выделенные печень и селезенку взвешивали, делали гистологические срезы печени, сортировали клетки печени на СШ5+ и СВД5- популяции и определяли процентов соотношение этих фракций (Рис.5). Из обеих популяций выделяли РНК и исследовали экспрессию генов с помощью ПЦР.

Динамика увеличения веса печени и увеличения процента С045+ клеток в ней идентичны, что позволяет объяснить повышение веса печени именно за счет повышенного содержания СВ45+ клеток. Однако здесь нельзя исключить и другие факторы, такие как отёк.

Рис. 5. Динамика заселения печени опухолевыми клетками. А. Изменение веса печени по мере развития заболевания. Б. Сравнение относительного содержания С045+ клеток в печени мышей по мере развития лейкоза А. Б.

Дташаа «чммп* «аса мчми мышай поста ваадамм 10* «латак ЯЯ от

т И «ОПЫТ

0 КОНТРОЛЬ 1

2.0

......

и

1.« и

« 1 2 Э 4 I « 7 * • 10 1112 13 Сутст пчеле иедеим клетоа

По мере развития заболевания в популяции С045+ клеток печени была исследована генов, возможно, играющих роль в возникновении и развитии данного лейкоза (Рис.6).

Рис. 6. Изменение уровня экспрессии генов ВтИ, Мус и УияА в популяции СШ5+ клеток печени больных мышей. Анализ экспрессии генов ВтИ и ЗтЬ проведен с помощью ПЦР в режиме реального времени, гена Мус - с помощью традиционного ПЦР.

вючмеемя гам«, атмтстаанмыж и сан

Супш пасяа ааадеям олуаопааых ат

Увеличение экспрессии генов, отвечающих за самоподдержание и пролиферацию, позволяет утверждать, что увеличение содержания СШ5+ клеток в печени происходит именно за счет заселения этого органа и пролиферации в нем лейкозных С045+ клеток донора, а не за счет нормальных кроветворных клеток реципиента.

Таким образом, были изучены молекулярно биологические характеристики мышиного перевиваемого лейкоза. Были охарактеризованы ЛСК этого гемобластоза Показано, что стволовые клетки этой опухоли организуют иерархию, сходную с иерархией нормальных СКК. На каждой ступени иерархии опухолевые клетки сохраняют способность к самоподцержанию и переносу заболевания. По мере продвижения от ранних, к более поздним клеткам-предшественникам лейкоза частота встречаемости ЛСК в популяции увеличивается. Максимальная частота ЛСК наблюдается среди клеток, инвазирующих печень, которые несут специфические маркеры моноцитарного ростка Такое устройство

иерархии в отделе ЛСК описано впервые. Исследованное заболевание является уникальной моделью перевиваемого лейкоза, поражающего печень. Исследована динамика развития заболевания в печени и показано, что пролиферация опухолевых клеток в ней является причиной гибели животных от гепатотоксичиости. Выяснены возможные причины и механизмы заселения печени опухолевыми клетками, связанные с экспрессией специфических хемокинов и их рецепторов на опухолевых клетках.

Можно заключить, что это заболевание является важной и перспективной моделью для дальнейшего изучения процессов лейкозогенеза, свойств ЛСК, заселения и пролиферации опухолевыми клетками экстрамедуллярной ткани.

ВЫВОДЫ

1. Охарактеризован уникальный перевиваемый миелоидный лейкоз, сходный с миелопролиферахивным заболеванием, с элементами гисгиоцитарной саркомы.

2. Лейкоз переносится гетерогенной популяцией стволовых клеток, несущих на поверхности маркеры кроветворных клеток разной степени зрелости.

3. При этом заболевании происходит заселение костного мозга лейкозными клетками, но основная масса опухолевых клеток, представленная клетками, несущими поверхностные маркеры и экспрессирующими специфические гены моноцитов/макрофагов и гранулоцитов, локализуется экстрамедуллярно в печени заболевших животных.

4. По мере развития заболевания в печени нарастает количество СШ5 положительных опухолевых клеток, что приводит к быстрой гибели животных от печеночной недостаточности.

5. Опухолевые клетки несут на поверхности рецепторы к хемокинам и цигокинам, секретируемым печенью, что играет важную роль в заселении этого органа клетками данного лейкоза..

6. Концентрация лейкозных стволовых клеток среди клеток, инвазирующих печень, на 2 порядка выше, чем в костном мозге терминально больных животных.

7. В лейкозных клетках значительно повышена экспрессия многих онкогенов, генов, отвечающих за самоподдержание, пролиферацию, адгезию к субстрату и генов-рецепторов к хемокинам, которые синтезируются в печени.

8. Гены сигнального пути транскрипционного фактора МЧСарраВ, являющегося одним из важных маркеров, отличающих стволовые клетки опухоли от нормальных стволовых кроветворных клеток, активированы в лейкозных клетках данного

' заболевания.

9. Для изучения механизмов опухолевой трансформации получена хорошо охарактеризованная оригинальная модель, отличающаяся гетерогенностью лейкозных стволовых клеток и высоким сродством опухолевых клеток к печени.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Охарактеризованная модель перевиваемого мышиного лейкоза может использоваться для изучения механизмов возникновения и развития миелоидных гемобластозов. Для эффективного переноса заболевания сингенным реципиентам рекомендуется вводить внутривенно 106 клеток КМ или печени терминально больных животных.

Для получения популяции опухолевых клеток, обогащенной ЛСК, рекомендуется сортировать клетки печени терминально больных мышей по маркеру CD45 и использовать для исследования CD45+ клетки.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бигильдеев АЕ.. Характеристика перевиваемого мышиного миелопролиферативного заболевания, развившегося после многократных введений гранулоцитарного колониестимулирующего фактора. АЕ.Бигильдеев, НВ.Сац, АЛГрищук, И.Н.Нифонтова, Д.А.Свннарева, Н.И.Дризе. Бгалл.экспср.биол.мсд,, 2008, т. 145, №2, стр. 234-238.

2. Шипунова И.Н. Характеристики пейкозных стволовых клеток мышиного миелопролиферативного заболевания, поражающего печень. Шипунова И.Н., Бигильдеев А.Е., Свинарева Д.А., Дриэе Н.И. Бюлл.экспер.биол.мед., 2010, т. 148, №3, стр.265-270.

3. Шипунова И.Н. Влияние длительного воздействия гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (г-ксф) на кроветворение. И.Н.Шипунова, А.Е.Бигильдеев.,

H.В.Сац, ДА.Свинарева, Т.В.Тодрия, И.Л.Чертков, В.Г.Савченхо, Н.И.Дризе. Гематол. и трансфузиол., 2008, т.53, №5, стр. 63-67.

4. Бигильдеев А.Е. Изучение динамики развития перевиваемого миелопролиферативного заболевания мыши, развившегося после нескольких курсов введения гранулоцитарного колониестимулирующего фактора. А.Е. Бигильдеев, И.Н. Шипунова, Д.А. Свинарева, Т.В. Петрова, Т.В. Тодрия, ТВ. Васильева, Н.И. Дризе. Гематол. и трансфузиол., 2009, т.54, № 5, стр. 3-8.

5. Grishchuk A. Alterations in gene expression in murine leukemia cells developed afler G-CSF treatement Grishchuk A, A.Bigildeev, I.Nifontova, D.Svinareva, N.Drize, V.Savchenko. Hematologica/The hematology journal, 2006,vol.91(sl), p316, abst.0859.

6. Bigildeev A Analysis of gene expression pattern in bone marrow and liver of mice developed myeloproliferative disease after long-term G-CSF treatement. Bigildeev A, A.L. Grishchuk, N.V.Saz, IN.Nifontova, DASvinareva, NJ.Drize. Hematologica/The hematology journal, 2007, vol.92(sl), p489,abstl358.

7. Bigildeev AJE. Characteriazation of gene expression in malignant hematopoietic cells invading the liver of mice developed transplantable myeloproliferative disease. Bigildeev A.E., AL.Gnshchuk, N.V.Sats, IN.Nifontova, DASvinareva, NJ.Drize. Experimental Hematology, 2007, vol.35, number 9, suppl.2, p.70, abst P089.

8. Bigildeev A.E. Analysis of hematopoietic precursor cells and gene expression pattern in malignant cells of mice developed myeloproliferative disease after G-CSF treatment. Bigildeev A.E.,

I.N.Nifontova, DASvinareva, N.V.Sats, NJ.Drize, 2008. Experimental Hematology, 2008, vol.36, №7, suppl. 1, p.35 (P029).

9. Bigildeev A.E. Dynamics of leukemia development on murine model of myeloproliferative disorder. Bigildeev AE., IN.Nifontova, T.V.Todria, NJ.Drize. Mechanisms of early differentiation: embryogenesis, myogenesis and hematopoiesis/lymphopoiesis, September 1-5, 2008, Barsinghausen, Germany, p. 84, abs.2.

10. Bigildeev A.E. Murine myeloproliferative disorder with liver lesion: characteristics of leukemia stem cells and phenotype of cells invaded liver. Bigildeev A.E., I.N.Shipounova, DASvinareva, NJ.Drize. Hematologica/The hematology journal, June 2009, vol.94 (s2), p. 356 (abstr.884)

11. Bigildeev A.E. Cell Population Highly Enriched with LSCs Invades Liver in MPD-Like Myeloid Leukemia. Bigildeev A.E., I.N. Shipounova, DA Svinareva, NJ. Drize. Blood (ASH Annual Meeting Abstracts), Nov 2009; 114: abs. 4569.

12. Bigildeev AE. Characteristics of leukemia stem cells in murine myeloproliferative disorder with liver lesion. Bigildeev AE., NJ.Drize, I.N.Shipounova, D.A.Svinareva. Experimental Hematology, 2009, vol.37, №9. suppl. 1, p.50 (P063).

13. Bigildeev A The dynamics of the formation of extranodal leukemia metastasis in the liver leading to acute liver failure in mice. Bigildeev A., I. Shipounova, D. Svinareva, N. Drize. Cellular Oncology/Analytical cellular pathology, 2010, vol.32, №3, p.227.

14. Bigildeev A. Leukemia stem cells (LSCs) invading liver in the murine MPD-like myeloid leukemia with liver lesion: Molecular characteristics. Bigildeev A., N.Drize, Hemalologica/The hematology journal, 2010, voI.95(s2), p599, abst.1507.

Подписано в печать:

01.07.2010

Заказ № 3943 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

цель работы.8

Основные задачи.8

Научная новизна и практическое значение работы.8

Материалы и методы исследования.9

Основные положения, выносимые на защиту.9

Содержание работы по главам.10

Благодарности.10

выводы

1. Охарактеризован уникальный перевиваемый миелоидный лейкоз, сходный с миелопролиферативным заболеванием, с элементами гистиоцитарной саркомы.

2. Лейкоз переносится гетерогенной популяцией стволовых клеток, несущих на поверхности маркеры кроветворных клеток разной степени зрелости.

3. При этом заболевании происходит заселение костного мозга лейкозными клетками, но основная масса опухолевых клеток, представленная клетками, несущими поверхностные маркеры и экспрессирующими специфические гены моноцитов/макрофагов и гранулоцитов, локализуется экстрамедуллярно в печени заболевших животных.

4. По мере развития заболевания в печени нарастает количество CD45 положительных опухолевых клеток, что приводит к быстрой гибели животных от печеночной недостаточности.

5. Опухолевые клетки несут на поверхности рецепторы к хемокинам и цитокинам, секретируемым печенью, что играет важную роль в заселении этого органа клетками данного лейкоза.

6. Концентрация лейкозных стволовых клеток среди клеток, инвазирующих печень, на 2 порядка выше, чем в костном мозге терминально больных животных.

7. В лейкозных клетках значительно повышена экспрессия многих онкогенов, генов, отвечающих за самоподдержание, пролиферацию, адгезию к субстрату и генов-рецепторов к хемокинам, которые синтезируются в печени.

8. Гены сигнального пути транскрипционного фактора NF-KappaB, являющегося одним из важных маркеров, отличающих стволовые клетки опухоли от нормальных стволовых кроветворных клеток, активированы в лейкозных клетках данного заболевания.

9. Для изучения механизмов опухолевой трансформации получена хорошо ' охарактеризованная оригинальная модель, отличающаяся гетерогенностью лейкозных стволовых клеток и высоким сродством опухолевых клеток к печени.

По данной теме были опубликованы следующие печатные работы:

1. А Е. Бигильдеев, Н.В.Сац, А.Л.Грищук, И.Н.Нифонтова, Д.А.Свинарева, Н.И.Дризе, 2008. Характеристика перевиваемого мышиного миелопролиферативного заболевания, развившегося после многократных введений гранулоцитарного колониестимулирующего фактора. Бюлл.экспер.биол.мед., т.145, №2,—234-238.

2. И.Н.Шипунова, А.Е.Бигильдеев., Н.В.Сац, Д.А.Свинарева, Т.В.Тодрия, И.Л.Чертков, В.Г.Савченко, Н.И.Дризе, 2008. Влияние длительного воздействия гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (г-ксф) на кроветворение. Гематология и трансфузиология, т.53, №5, стр. 63-67.

3. А.Е. Бигильдеев, И.Н. Шипунова, Д.А. Свинарева, Т.В. Петрова, Т.В. Тодрия, Т.В. Васильева, Н.И. Дризе, 2009. Изучение динамики развития перевиваемого миелопролиферативного заболевания мыши, развившегося после нескольких курсов введения гранулоцитарного колониестимулирующего фактора. Гематол. и трансфузиол., т.54, № 5, стр. 3-8.

4. Шипунова (Нифонтова) И.Н., Бигильдеев А.Е., Свинарева Д.А., Дризе Н.И., 2010. Характеристики лейкозных стволовых клеток мышиного миелопролиферативного заболевания, поражающего печень. Бюлл.экспер.биол.мед., т.148, №3, стр.265-270.

5. A.Grishchuk, A.Bigildeev, LNifontova, D.Svinareva, N.Drize, V.Savchenko. Alterations in gene expression in murine leukemia cells developed after G-CSF treatement, 2006. Hematologica/The hematology journal,,vol.91 (si), p316, abst.0859.

6. A.Bigildeev, A.L.Grishchuk,N.V.Saz, I.N.Nifontova,D.A.Svinareva,N.J.Drize, 2007. Analysis of gene expression pattern in bone marrow and liver of mice developed myeloproliferative disease after long-term G-CSF treatement. Hematologica/The hematology journal, vol.92(sl), p489, abst.1358.

7. A.E.Bigildeev, A.L.Grishchuk, N.V.Sats, I.N.Nifontova, D.A.Svinareva, N.J.Drize, 2007. Characteriazation of gene expression in malignant hematopoietic cells invading the liver of mice developed transplantable myeloproliferative disease. Experimental Hematology, vol.35, number 9, suppl.2, p.70, abst. P089.

8. A.E.Bigildeev, I.N.Nifontova, D.A.Svinareva, N.V.Sats, N.J.Drize, 2008. Analysis of hematopoietic precursor cells and gene expression pattern in malignant cells of mice developed myeloproliferative disease after G-CSF treatment. Experimental Hematology, 2008, vol.36, №7, suppl.l, p.35 (P029).

9. A.E.Bigildeev, I.N.Nifontova, T.V.Todria, N.J.Drize, 2008. Dynamics of leukemia development on murine model of myeloproliferative disorder. Mechanisms of early differentiation: embryogenesis, myogenesis and hematopoiesis/lymphopoiesis, September 1-5,2008, Barsinghausen, Germany, p.84, abs.2.

10. A.E.Bigildeev, I.N.Shipounova, D.A.Svinareva, N.J.Drize, 2009. Murine myeloproliferative disorder with liver lesion: characteristics of leukemia stem cells and phenotype of cells invaded liver. Hematologica/The hematology journal, June 2009, vol.94 (s2), p. 356 (abstr.884)

11.A.E. Bigildeev, I.N. Shipounova, D.A. Svinareva, N.J. Drize, 2009. Cell Population Highly Enriched with LSCs Invades Liver in MPD-Like Myeloid Leukemia. Blood (ASH Annual Meeting Abstracts), Nov; 114: abs. 4569.

12. A.E.Bigildeev, N.J.Drize, I.N.Shipounova, D.A.Svinareva, 2009. Characteristics of leukemia stem cells in murine myeloproliferative disorder with liver lesion. Experimental Hematology, 2009, vol.37, №9, suppl.l, p.50 (P063).

13. A. Bigildeev, I. Shipounova, D. Svinareva, N. Drize, 2010. The dynamics of the formation of extranodal leukemia metastasis in the liver leading to acute liver failure in mice. Cellular Oncology/Analytical cellular pathology, vol.32, №3, p.227.

14. A. Bigildeev, N.Drize, 2010 Leukemia stem cells (LSCs) invading liver in the murine MPD-like myeloid leukemia with liver lesion: Molecular characteristics. Hematologica/The hematology journal, vol.95(s2), p599, abst.1507.

Заключение

Таким образом, были изучены молекулярно биологические характеристики мышиного перевиваемого лейкоза. Установлено, что развитие после многократного введения животным Г-КСФ лейкоза непосредственно не связано с введением этого ростового фактора. Рецептор Г-КСФ на клетках КМ и печени не содержит мутаций и не изменена экспрессия генов, кодирующих основные молекулы его сигнального пути.

Были охарактеризованы ЛСК этого гемобластоза. Показано, что стволовые клетки этой опухоли организуют иерархию, сходную с иерархией нормальных СКК. На каждой ступени иерархии опухолевые клетки сохраняют способность к самоподдержанию и переносу заболевания. По мере продвижения от ранних к более поздним клеткам-предшественникам лейкоза частота встречаемости ЛСК в популяции увеличивается. Максимальная частота ЛСК наблюдается среди клеток, инвазирующих печень, которые несут специфические маркеры моноцитарного ростка. Такое устройство иерархии в отделе ЛСК описано впервые при этом заболевании.

Исследованное заболевание является уникальной моделью перевиваемого лейкоза, поражающего печень. Исследована динамика развития заболевания в печени и показано, что пролиферация опухолевых клеток в ней является причиной гибели животных от гепатотоксичности. Подробно охарактеризованы резидентные опухолевые клетки в печени. Выяснены возможные причины и механизмы заселения печени опухолевыми клетками, связанные с экспрессией специфических хемокинов и их рецепторов на опухолевых клетках.

Изучение механизмов лейкозогенеза на уровне экспрессии генов выявило несколько групп генов с измененной экспрессией. К ним относятся: транскрипционные факторы, включая онкогены, молекулы адгезии, цитокины и, что особенно важно, гены «домашнего хозяйства». Полученные результаты демонстрируют принципиальные изменения в биологии опухолевых клеток, затрагивающие большинство их физиологических параметров.

Можно заключить, что это заболевание является важной и перспективной моделью для дальнейшего изучения процессов лейкозогенеза, свойств ЛСК и образования метастазов (заселения и пролиферации опухолевых клеток в экстрамедуллярной ткани).